JP2002528464A

JP2002528464A - ｐ５３モルホリノに基づくアンチセンス

Info

Publication number: JP2002528464A
Application number: JP2000578439A
Authority: JP
Inventors: パトリックエル．イバーセン，
Original assignee: エイブイアイバイオファーマ，インコーポレイテッド
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2002-09-03
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: WO2000024885A3; AU771579B2; JP2011079865A; EP1124950B1; KR20010089904A; ATE332969T1; CA2347905A1; DE69932346T2; ES2268903T3; EP1124950A2; JP4777515B2; AU1221700A; KR100675123B1; US6365577B1; WO2000024885A2; CA2347905C; DE69932346D1

Abstract

(57)【要約】増殖性細胞障害（例えば、癌、または脳卒中のような虚血性の発作によって誘導される低酸素状態）のような、ｐ５３誘導によって特徴づけられる疾患状態を処置するのに有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドが記載される。このアンチセンス薬剤は、好ましくは、「立体的遮断剤」型オリゴヌクレオチドとして知られるクラスのものであり、このクラスとしては、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アリルもしくは２’−Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド、またはＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ｐ５３の誘導により特徴づけられる疾患状態の処置のためのアンチ
センス薬剤および方法に関する。このような状態としては、増殖性の細胞障害（
例えば、癌）、再狭窄、および乾癬、ならびに脳卒中のような虚血性の発作によ
り誘導される低酸素状態が挙げられる。

【０００２】（参考文献）

【０００３】

【表１】（発明の背景）細胞増殖におけるｐ５３の重要性は、すべてのヒト癌の半分以上がｐ５３変異
を提示するという知見から明白である（Ｌｅｖｉｎｅ、１９９７）。ｐ５３発現
における誘導は、ＤＮＡアルキル化剤、一酸化窒素（Ｍｅｓｓｍｅｒ、１９９４
）、電離放射線および紫外線照射（ｉｏｎｉｚｉｎｇａｎｄｕｌｔｒａｖｉ
ｏｌｅｔｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）（ＬｕおよびＬａｎｅ、１９９３）、染色
体損傷を誘導する制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＬｕおよびＬａｎｅ、１９９３）、なら
びにＤＮＡ鎖切断を誘導する能力のある他の因子（ＮｅｌｓｏｎおよびＫａｓｔ
ａｎ、１９９４）に曝される細胞において観察される。虚血／再灌流（Ｒａａｆ
ａｔ、１９９７）、てんかんのモデル（Ｘｉａｎｇ、１９９６）、および低酸素
血症（Ｇｒａｅｂｅｒ、１９９４）もまた、ｐ５３の誘導を示している。本明細
書および以前の研究（Ｒｉｎｉｎｇｅｒ、１９９７）において示されるように、
ｐ５３タンパク質レベルもまた、部分肝切除後の肝再生の過程の間に高度に上方
制御され、これは、内因性起源の損傷もまた、インビボでｐ５３の誘導を引き起
こし得ることを示している。

【０００４】ｐ５３の役割は、細胞周期チェックポイント活性、アポトーシス、分化および
ＤＮＡ修復において想定されている（Ｍａｇｎｅｌｌｉ、１９９７）。細胞周期
チェックポイントは、２つの重要な機能に役立っている。１つは、細胞周期にお
ける必須な事象が、引き続く現象の前に完了されることを保証することであり；
もう１つは、ＤＮＡ複製および有糸分裂が生じる前に、損傷を受けたＤＮＡの修
復のために、より多くの時間を提供することである（Ｈａｒｔｗｅｌｌ、１９９
４）。このｐ５３のチェックポイント活性は、細胞周期のＳ期（ＤＮＡ合成）に
入る細胞のレベルにおいて、主に生じる（Ｋａｓｔａｎ、１９９２）。Ｇ₂−Ｍ
チェックポイント活性もまた、ｐ２１^waf-1の上流の調節因子としての役割のた
めに、ｐ５３について報告されている。いずれか一方のタンパク質の非存在にお
いて、ＤＮＡ損傷細胞は、Ｇ₂様状態において阻止されるが、次いで、正常な有
糸分裂（Ｍ期）を介さずにさらなるＳ期を起こし、例えば、倍数性といった核の
異常を引き起こし、そしてアポトーシスに達する（Ｗａｌｄｍａｎ、１９９６）
。

【０００５】（発明の要旨）本発明は、一つの局面において、哺乳類の被験体におけるｐ５３の誘導によっ
て特徴づけられる疾患状態を処置するための方法および組成物を提供する。この
方法は、適切な薬学的キャリアにおいて、塩基配列配列番号１（５’−ＴＣＡ
ＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３として同定される）または塩基配
列配列番号２（５’−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣ
−３’として同定される）を有する薬学的に有効な量のアンチセンス薬剤を、被
験体へ投与する工程を包含する。ここで、このアンチセンス薬剤は、モルホリノ
オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アリルもしくは２’ −Ｏ−ア
ルキル改変オリゴヌクレオチド、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）オリゴヌクレオチド、またはＣ−５−プロピンピリミ
ジン改変オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態において、このアンチセ
ンス薬剤は、モルホリノオリゴヌクレオチド（好ましくは、ホスホロジアミデー
ト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ）骨格結合によって結合したモルホ
リノサブユニットを有する）である。別の好ましい実施形態において、このアン
チセンス薬剤は、Ｃ−５−プロピンピリミジン改変オリゴヌクレオチドである。

【０００６】本発明はまた、このような疾患状態の処置における使用のための組成物を含む
。これらの組成物は、適切な薬学的キャリアにおいて、上記のようなアンチセン
ス薬剤を含む。

【０００７】方法の好ましい適用において、被験体は、ヒト被験体である。この疾患状態は
、器官移植の発作（ｓｔｒｏｋｅ）または余波のような、虚血性または虚血／再
灌流障害に起因するものであり得る。あるいは、この疾患状態は癌であり得、こ
の場合に、好ましい実施形態は、細胞レベルでラジカル酸素種を増加させるのに
有効な因子を投与する工程をさらに包含する。このような因子としては、細胞レ
ベルでラジカル酸素種を増加させる、放射線増感剤（ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉ
ｚｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、電離放射線、高圧酸素環境および化学療法剤（例え
ば、特定のアントラサイクリンまたはアントラキノン）が挙げられる。

【０００８】癌の処置について、この方法はまた、細胞周期のＧ₂期からＭ期への進行を妨
げるのに有効な薬剤を投与する工程を包含し得る。このような薬剤としては、ホ
スホキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター、ビス（クロロエチル）ニトロソ尿素（
ＢＣＮＵ）、ペントキシフィリン、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）、スタウ
ロスポリン、フェニルアヒスチン（ｐｈｅｎｙｌａｈｉｓｔｉｎ）、パクリタキ
セル、レチノイン酸、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、メチル
−２，５−ジヒドロシンナマート、ハーボキシジエン（ｈｅｒｂｏｘｉｄｉｅｎ
ｅ）、９−ニトロカンプトセシン、マイトトキシン、アピゲニン、ノコダゾール
（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）およびコルセミドが挙げられる。

【０００９】別の局面においては、本発明は、配列番号１（５’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＡ
ＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’として同定される）および配列番号２（５’−
ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣ−３’として同定され
る）からなる群から選択される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する
。ここで、このオリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチ
ド核酸、２’−Ｏ−アリルまたは２’ −Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド
およびＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドからなる群から選
択される。１つの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、モルホリノオ
リゴヌクレオチド（好ましくは、ホスホロジアミデート骨格結合によって結合し
たモルホリノサブユニットを含有する）である。本発明はまた、配列番号１（５
’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’として同定される
）および配列番号２（５’−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴ
ＣＣ−３’として同定される）からなる群から選択される塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドも提供し、ここで、このオリゴヌクレオチドは、Ｃ−５−プロ
ピンピリミジン改変オリゴヌクレオチドである。

【００１０】本発明のこれらおよび他の目的ならびに特徴は、添付の図面と組み合わせて、
本発明の以下の詳細な説明を読めば、より十分に明白になる。

【００１１】（発明の詳細な説明）（Ｉ．定義）「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス薬剤」は、標的核
酸配列において、対応する、近接した塩基との水素結合に有効な骨格によって支
持されたプリンおよびピリミジン複素環式塩基の配列を包含する分子をいう。こ
の骨格は、このような水素結合化を可能にする位置で、プリンおよびピリミジン
複素環式塩基を支持するサブユニット骨格部分から構成される。これらの骨格部
分は、１〜３原子長の亜リン酸含有結合により互いに連結される、長さにおいて
５〜７原子の環状部分である。

【００１２】「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図１に示される形態のモルホリノサブ
ユニット構造から構成され、ここで、（ｉ）この構造は、１〜３原子長の亜リン
酸含有結合により互いに連結し、１つのサブユニットのモルホリノ窒素が、隣接
するサブユニットの５’環外炭素に結合し、そして（ｉｉ）Ｂは、塩基特異的水
素結合化による、ポリヌクレオチドにおける塩基への結合に有効なプリンまたは
ピリミジン塩基対合部分である。図１は、ホスホロジアミデート結合により結合
した、２つのこのようなサブユニットを図示する。

【００１３】「Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート」オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｇｒ
ｙａｚｎｏｖらおよびＣｈｅｎらによって記載される通り、２’−デオキシリボ
ースの３’−酸素が、３’−アミンに置換されるものである。

【００１４】「２’−Ｏ−アリル（またはアルキル）改変オリゴヌクレオチド」は、２’−
ヒドロキシルが、アリルまたはアルキルエーテルに変換されたオリゴリボヌクレ
オチドである。このアルキルエーテルは、代表的には、メチルエーテルである。

【００１５】「Ｃ−５−プロピンピリミジン改変オリゴヌクレオチド」は、チミジン塩基の
Ｃ−５メチル基および／またはシチジン塩基のＣ−５水素がプロピン基で置換さ
れているオリゴヌクレオチドである。

【００１６】「ペプチド核酸」において、オリゴヌクレオチド骨格のデオキシリボースリン
酸ユニットは、ポリアミド結合で置換される。例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎらおよび
Ｈａｎｖｅｙらに記載される通り、適切な骨格間隔が、２−アミノエチルグリシ
ンユニットの使用によって獲得され、ヌクレオチド塩基が、メチレンカルボニル
基を介して各々の２−アミノ基に付着される。

【００１７】「ＲＮＡｓｅ−不活化」オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナロ
グは、ＲＮＡｓｅ−活性オリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート）と
異なり、ＲＮａｓｅ−非依存性メカニズムを介して作用するものである。これら
は、標的ＲＮＡ形成、核原形質輸送または翻訳の立体的遮断によって機能すると
考えられ、従って、また「立体的遮断剤」とも呼ばれる。このクラスは、例えば
、メチルホスホネート、モルホリノオリゴヌクレオチド（本明細書に記載の通り
）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリルまたは２’− Ｏ−アルキル改
変オリゴヌクレオチドおよびＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートを包含する。

【００１８】「ｐ５３の誘導により特徴づけられる」状態とは、罹患された細胞におけるｐ
５３タンパク質のレベルまたは発現が、非疾患状態に比例して増加する疾患状態
、および／またはｐ５３発現の抑制（時々他の処置と組み合わせて）が、有益な
治療効果を有する状態である。例としては、癌、脳卒中から生じるような虚血、
心筋梗塞またはてんかん発作、およびその結果の低酸素状態、ならびに器官移植
において起こり得るような虚血／再灌流障害である。略語：ＯＮ＝オリゴヌクレオチドＯＤＮ＝オリゴデオキシリボヌクレオチドＳ−ＯＤＮ＝ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＣ−５−Ｐ＝Ｃ−５−プロピンピリミジン改変オリゴヌクレオチド。

【００１９】（ＩＩ．アンチセンスオリゴヌクレオチド）（Ａ．配列）本発明のアンチセンス薬剤は、標的ＲＮＡ配列と共に、ハイブリダイゼーショ
ンのためのヌクレオチド塩基を示すヌクレオチド間の（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ）骨格結合によって結合される、ヌクレオチドサブユニットを包含する
。これらの薬剤の塩基配列は、ｐ５３ｍＲＮＡの一部分に相補的（アンチセン
ス）である。配列番号１に対応する第一の配列は、ラットｐ５３ｍＲＮＡの特
有の一部分（残基１１８２〜１１９９；Ｇｅｎｂａｎｋ登録＃Ｘ１３０５８）
と相補的であり、そして、本明細書において「ｐ５３Ｔ」と呼ばれる。この配列
は、ラット、マウス、サルおよびヒトのｍＲＮＡにおいて同じであり、従って、
理想的に、動物モデルにおけるインビボでの試験に適する。

【００２０】「ＯＬ（１）ｐ５３」と命名され、かつ配列番号２に対応する第二の配列は、
ヒトｐ５３に対するアンチセンスであり、従って、ヒトにおいてｐ５３発現の阻
害に有効である（Ｉｖｅｒｓｏｎ、米国特許第５，６４１，７５４号）。これは
、このラット配列との４つのミスマッチを有するため、ラットにおいてこのよう
な発現を変化させず、従って、ラットモデル研究において有用なコントロールを
提供する。

【００２１】（Ｂ．オリゴヌクレオチドの構造）当該分野において公知の種々のオリゴヌクレオチドアナログは、安定性、著し
いヌクレアーゼ耐性、非特異的結合の減少およびバイオアベイラビリティー（す
なわち、細胞を利用する機会）のような領域において、「天然の」ポリヌクレオ
チドを超える利点を示す。この構造は、骨格、糖部分または塩基それ自体で改変
され得る。このようなアナログとしては、例えば、ホスホロチオエート（本明細
書において、Ｓ−ＯＤＮと示される）、メチルホスホネート、ホスホトリエステ
ル、Ｃ−５−プロピンピリミジン改変オリゴヌクレオチド（Ｃ−５−Ｐ）、モル
ホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリルまたは
２’− Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチドおよびＮ３’→Ｐ５’ホスホロア
ミデートが挙げられる。

【００２２】このようなアンチセンス薬剤の調製は、当該分野において周知であり、そして
、しばしば簡便に、自動化合成機上で行われ得る。Ｓ−ＯＤＮ、Ｃ−５−Ｐおよ
び非荷電のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成のための一般的な
手順を、実施例１に示す。

【００２３】２つの一般的なメカニズムが、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の
阻害を説明するために、提唱されている（例えば、Ａｇｒａｗａｌ；Ｂｏｎｈａ
ｍ；Ｂｏｕｄｖｉｌｌａｉｎ；およびその中で引用される参考文献を参照のこと
）。第一に、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとの間に形成されるヘテロ二重鎖が
、ＲＮａｓｅＨの基質として働き、ｍＲＮＡの切断を導く。このクラスに属する
かまたは属すると提唱されているオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエ
ート、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル（すなわち、非改変「天然」
オリゴヌクレオチド）が挙げられる。このような化合物は、一般的には、高い活
性を示し、そして、ホスホロチオエートは、アンチセンスの適用において、現在
最も広く利用されるオリゴヌクレオチドである。しかしながら、これらの化合物
は、細胞性タンパク質への非特異的な結合（Ｇｅｅ）、ならびに非標的ＲＮＡヘ
テロ二重鎖の不適切なＲＮａｓｅ切断（Ｇｉｌｅｓ）に起因して、望まれない副
作用を生じる傾向がある。

【００２４】「立体的遮断剤」または、あるいは、「ＲＮａｓｅ不活化」もしくは「ＲＮａ
ｓｅ耐性」と呼ばれるオリゴヌクレオチドアナログの第二のクラスは、ＲＮａｓ
ｅＨの活性化が観察されず、そして、標的ＲＮＡ形成、核原形質輸送または翻訳
の立体的遮断によって作用すると考えられる。このクラスとしては、メチルホス
ホネート（Ｔｏｕｌｍｅ）ならびにモルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核
酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリルまたは２’− Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレ
オチド（Ｂｏｎｈａｍ）およびＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート（Ｇｅｅ）が
挙げられる。これらは、ＡＵＧ開始コドン、５’−スプライス部位またはｍＲＮ
Ａの５’−非翻訳領域で標的される場合、最も有効であると報告されている。今
日まで、これらは、コード領域で下流に標的される場合、比較的弱い活性（Ｂｏ
ｎｈａｍ）またはよりしばしば、活性がないことが示された（例えば、メチルホ
スホネートに関して、Ｔｏｕｌｍｅ；ＰＮＡに関して、Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ；
二重鎖形成化ＰＮＡに関して、Ｋｎｕｄｓｅｎ；ならびにＰＮＡおよびＮ３’→
Ｐ５’ホスホロアミデートに関して、Ｇｅｅを参照のこと）。これらのＯＮによ
って形成されたハイブリッドは、コード領域に指向される場合、翻訳の間のリボ
ソーム複合体の巻き戻し作用による置換を回避するのに十分に安定ではないこと
が提唱されている（Ｂｏｕｄｖｉｌｌａｉｎ、Ｇｅｅ）。この問題に取り組むた
めの１つのアプローチは、ＯＮの、その標的配列への共有結合的連結または挿入
であった（Ｇｅｅ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）。しかしながら、このような改変がな
ければ、ＯＮの立体的遮断の活性は、一般的には、上記の開始領域に限定されて
いる。

【００２５】（ＩＩＩ．増殖性細胞におけるｐ５３の誘導およびアンチセンスｐ５３によ
る抑制）以前に報告された研究（Ａｒｏｒａ、１９９８）において、上記のアンチセン
ス薬剤ｐ５３ＴおよびＯＮ（１）ｐ５３を、図２に記載の通り、部分肝切除手術
の直後に、ラットに投与した。この再生ラット肝臓は、天然の組織環境における
増殖制御および細胞増殖のメカニズムを研究するのに良好なインビボモデル系で
ある。再生肝臓において急速に増殖する細胞は、発癌に対して非常に感受性であ
る。それは、ＤＮＡ修復のための細胞周期の間に利用可能な時間が最小であるた
めである（Ｇｒｉｓｈａｍ、１９８３）。上記の通り、ＯＮ（１）ｐ５３は、ラ
ットにおいてｐ５３発現を変化させず、そして、コントロールとして用いられた
。

【００２６】大量のｐ５３の誘導が、ＰＨ（肝切除後）ラットにおいて、再生のプロセスの
間に観察された。アンチセンスＯＮ投与の以下の効果を、測定した：再生肝臓の
重量増加；ｐ５３、ＰＣＮＡ、ｐ２１およびＮＡＤＰＨのレベル；単離された細
胞のＤＮＡ含量；ミクロソームのタンパク質含量；種々のミクロソームの酵素ア
ッセイ；脂質過酸化により明白に示されたような酸化ストレス；および有糸分裂
指数。

【００２７】アンチセンスｐ５３Ｔ（配列番号１）で処置した場合、肝臓は、重量増加にお
ける増大（コントロールと比較して）、有糸分裂指数およびＰＣＮＡ発現（これ
は、細胞増殖の正確なマーカーである）（Ａｓｓｙ、１９９８）、ならびにＧ₁
細胞集団における５倍の減少によって明白に示されるように、そのＧ₁−Ｓ細胞
周期チェックポイント活性を失った。このｐ５３Ｔで処置したＰＨラット肝臓は
また、より多数の多核細胞を示した。酵素アッセイによって決定されるように、
再生肝臓の機能的回復もまた、ｐ５３阻害によって増加した。

【００２８】要約すれば、このデータは、ｐ５３発現が、アンチセンスｐ５３Ｔ（配列番号
１）で処置した肝切除後のラットの再生肝臓において阻害されること、ならびに
、この阻害が、高められた有糸分裂、高められたＰＣＮＡ発現および細胞周期の
Ｇ₁期における減少した細胞数を生じることを示した。この結果は、ｐ５３のＧ₁ −Ｓ細胞周期チェックポイント活性と合致する。

【００２９】（ＩＶ．Ｓ−ＯＤＮ、Ｃ−５−Ｐおよびモルホリノアンチセンス薬剤の比較
効果）配列番号１および配列番号２として与えられる塩基配列を有する中性骨格モル
ホリノアンチセンス薬剤を、実施例１に記載される通りに調製した。このような
モルホリノオリゴマーは、ＲＮＡ標的に対して高い結合親和性を示し、そして、
ホスホロチオエートのような荷電したアナログに関連して、非荷電骨格は細胞へ
の取り込みを助け、そして、非特異的結合相互作用を減少させる。対応するＣ−
５−プロピンシトシン改変（Ｃ−５−Ｐ）ホスホロチオエートもまた、調製され
る。上記で議論した通り、このモルホリノアナログは、「立体的遮断剤」として
作用すると考えられる。Ｃ−５−Ｐホスホロチオエートは、ＲＮａｓｅ−Ｈ依存
メカニズムによって作用すると報告され（Ｗａｇｎｅｒ）、これは、一般に、ホ
スホロチオエートによるものである。

【００３０】これらのアンチセンス薬剤の腹腔内投与の効果を、第ＩＩＩ節および実施例２
に記載される通り、ＰＨ２４時間後の残留再生肝臓の湿重量増加に関して、非改
変ホスホロチオエート（Ｓ−ＯＤＮ）の効果と比較した。図２に示されるデータ
は、ｐ５３Ｔ配列が、肝臓再生モデルにおいて、試験される代替のアナログの両
方について活性であることを示し、そしてＯＬ（１）ｐ５３配列は、試験される
用量で、代替のアナログと共に、（予測されるように）不活性なままであったこ
とを示す。

【００３１】Ｓ−ＯＤＮｐ５３Ｔの１ｍｇ／２００ｇｍ用量と類似した有効性が、Ｃ−５
−Ｐ改変Ｓ−ＯＤＮの１００μｇ／２００ｇｍおよびモルホリノ抗ｐ５３Ｔオリ
ゴヌクレオチド（配列番号１を有する）の５０ｎＭ／２００ｇｍ（約３．７ｍｇ
／２００ｇ）を用いて観察された。モルホリノアンチセンスオリゴマーが、遺伝
子のコード領域のエキソン１０を標的される場合、５’−非翻訳領域またはＡＵ
Ｇ開始コドンを標的されるよりもむしろ活性であることは、特に注目すべきであ
る。上記のように、「立体的遮断剤」アンチセンス薬剤は、一般的には、ＡＵＧ
翻訳開始部位から下流に標的される場合、有意な活性を示さなかった。このコー
ド配列は、特に、アンチセンスＯＮ結合に適し得、翻訳を立体的遮断するに十分
に安定な二重鎖を形成する。加えて、上記のように、モルホリノオリゴマーは、
特に有効なＲＮＡ結合分子であることが証明された。本発明は、特定のメカニズ
ムに限定されないが、ＲＮＡヘリックスが、モルホリノオリゴヌクレオチドの結
合によって歪み、そして、この歪みがリボソーム結合を妨げることが推論される
。

【００３２】本発明の支持における研究は、Ｃ−５−Ｐプロピン改変ＯＤＮのプロピン基が
、ＲＮＡ二重鎖の深いほうの溝に突出し、従って、リボソーム結合もまた立体的
に妨げ得ることを示唆している。従って、プロピン基の代わりに他の立体的にか
さ高い基（ｔ−ブチルのような異なる電子的構造を有する基を含む）を用いるこ
とは、類似の阻害効果を生じ得る。

【００３３】（Ｖ．治療方法）本発明は、特に、ｐ５３誘導によって特徴づけられる細胞において、ｐ５３発
現を阻害する方法を提供し、そして、ここで、ｐ５３の阻害が、治療的利点を生
じる。この方法は、ｐ５３誘導によって特徴づけられる疾患状態の処置のために
用いられ得る。この方法は、このような状態を有する被験体またはこのような被
験体から収集した細胞に、配列番号１または配列番号２に対応する配列を有する
オリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。好ましくは、この被験体は、ヒ
ト被験体である。（上記のように、配列番号２は、ラットモデルにおいて、有効
ではない。）このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、モルホリノオリゴヌクレ
オチド、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アリルもしくは２’− Ｏ−アルキル改変オ
リゴヌクレオチド、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドまた
はＣ−５−プロピンピリミジン改変ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであ
る。モルホリノオリゴヌクレオチドは、特に、両方の配列にとって好ましい。Ｃ
−５−Ｐ改変モルホリノオリゴヌクレオチドもまた、意図される。

【００３４】本明細書で示され、およびＡｒｏｒａ，１９９８において報告されたデータに
よって実証されるように、抗ｐ５３ＯＮは、肝切除後のラットにおいて、ｐ５３
の発現を抑制する。モルホリノおよびＣ−５−ＰＯＮは、再生肝臓の重量増加
によって測定されたように、非改変ホスホロチオエート（Ｓ−ＯＤＮ）の等価量
よりも有効であることが見出された。このモルホリノオリゴマーは、驚くほど有
効であるが、これは、コード領域（エキソン１０）、ＡＵＧ開始領域の十分に下
流に標的されるという事実を考慮したものであり、これらの後者は、ＲＮＡｓｅ
不活化（「立体的遮断剤」）アンチセンスオリゴヌクレオチドについての、従来
の標的である。

【００３５】（Ａ．抗増殖治療）上記の通り、ｐ５３発現における誘導は、種々のＤＮＡ損傷化因子に曝された
細胞において観察される。この損傷を受けたＤＮＡは、予定外のＤＮＡ合成によ
って、最も一般に修復される。このような修復は、通常、Ｓ（合成）期に先行す
るＧ₁細胞周期の間に生じる。しかしながら、この改変されたＤＮＡ塩基が修復
されないままであると（例えば、Ｇ₁−Ｓ細胞周期チェックポイントを排除する
ことにより、従って、未成熟細胞をＳ期へ送る）、結果は、損傷を受けたＤＮＡ
ヌクレオチド塩基鋳型の誤った複製に起因する変異誘発および／または損傷を受
けたＤＮＡ部位を通り過ぎて、細胞がそのゲノムを複製できないことに起因する
細胞死を含み得る。

【００３６】ｐ５３の発現の阻害は、この細胞周期チェックポイントを抑制し、従って、選
択的にＤＮＡ損傷細胞を殺傷するために用いられ得る。配列ＯＬ（１）ｐ５３（
配列番号２）を有するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの投
与が、ヒト肝臓細胞において、エキソビボおよびインビボでアポトーシスを生じ
たことが、米国特許第５，６４１，７６４号（Ｉｖｅｒｓｏｎ）において示され
た。この効果は、細胞を、細胞における正味の反応酸素含量を増加する条件に曝
すことによって、増加した。このような処置は、正常組織に、ほとんどまたはま
ったく悪影響を生じない。これは、正常な組織が、癌細胞よりも高い酸素除去活
性を有するためである。ほとんどの細胞は、例えば、通常、ＳＯＤ、カタラーゼ
またはグルタチオンペルオキシダーゼ（非常に急速に、過剰な反応性酸素種と結
合し、そして不活化する）のような１つ以上の酵素を含む。上記の通り、ｐ５３
の阻害によるＧ₁−Ｓチェックポイントの抑制は、損傷を受けたＤＮＡの修復を
妨げ、変異誘発および細胞死を導くと考えられる。

【００３７】従って、好ましい方法（特に癌細胞に対して有用な方法）において、ＯＮは、
細胞傷害を誘導するラジカル酸素を増加し得る因子と組み合わせて投与される。
オリゴヌクレオチドおよび因子は、実質的に、同時にまたは経時的に投与され得
、いずれかの治療因子が、最初に与えられる。しかしながら、オリゴヌクレオチ
ドが、達成されるべき治療血液レベルを可能にするために、あらかじめ十分に投
与される場合に、最良の結果が達成される。

【００３８】例えば、増加したラジカル酸素レベルは、放射線、またはラジカル酸素誘導細
胞傷害を可能にする薬剤（例えば、アントラサイクリン細胞傷害性抗生物質（例
えば、ドキソルビシン）、ＢＣＮＵ、ＢＳＯ（ブチオニンスルホキサミン）（ｂ
ｕｔｈｉｏｎｉｎｅｓｕｌｆｏｘａｍｉｎｅ）、過酸化水素、またはＳＯＤ（
スーパーオキシドジスムターゼ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドインヒビタ
ー、カタラーゼ、ＧＳＨシンテターゼ、ＧＳＨレダクターゼ、もしくはＧＳＨペ
ルオキシダーゼのような薬剤）に細胞を曝すことによって生成される。

【００３９】ラジカル酸素誘導細胞傷害を可能にする薬剤は、例えば、放射線増感剤、ラジ
カル酸素を発生する化学療法剤、またはヒドロキシラジカルの形成を引き起こす
宿主の細胞との相互作用を可能にするオリゴヌクレオチドであり得る（例えば、
１９９１年７月２５日に出願され、「ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＭｕｔａｇ
ｅｎｉｃｉｔｙＩｎｄｕｃｅｄｂｙＢｉｎｄｉｎｇｏｆＯｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｔｏＣｅｌｌｓ」と題された、Ｉｖｅｒｓｅｎ、米国
出願番号０７／７３５，０６７（この内容は、本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと）。患者において標的細胞に対する致死性の効果を有する多く
の細胞傷害性因子（ここで、この致死性の効果は、１つ以上の感作因子（ｓｅｎ
ｓｉｔｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ）によって高められ得る）が、本発明の方法に用
いられ得る。挙げられるものとしては、放射線（放射線治療が、経口で送達され
るにしろ外用の手段により投与されるにしろ）および細胞傷害性薬物である。多
くのこのような薬物のいくつかの例は、Ｌ−フェニルアラニンナイトロジェンマ
スタード（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒ
ｄ）（メルファラン）のようなナイトロジェンマスタード、ダウノルビシンおよ
びドキソルビシンのようなアントラサイクリン化学療法剤、ならびにシス−ジア
ミノジクロロ白金（シス−プラチン）のような白金化合物である。

【００４０】経口的に送達された放射線としては、患者に注射される治療的に有効な放射性
同位体が挙げられる。このような放射性同位体としては、放射性核種金属¹⁸⁶Ｒ
ｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、¹⁰⁹Ｐｄ、²¹²Ｂｉ、²⁰³Ｐｂ、²¹²Ｐｂ、²¹¹Ａｔ
、⁹⁷Ｒｕ、¹⁰⁵Ｒｈ、¹⁹⁸Ａｕ、¹⁹⁹Ａｇおよび¹³¹Ｉが挙げられるが、これらに限
定されない。これらの放射性同位体は、一般的に、患者に投与した場合、キャリ
ア分子に（例えば、キレート−抗体結合体の形態で）に結合する。経口的に送達
される適切な放射線療法剤の例は、例えば、欧州特許公開第１８８，２５６号に
記載されるような、抗体に結合体化される金属放射性核種キレートである。外用
の手段により投与される放射線としては、コバルト治療のような外用ビーム放射
線が挙げられる。

【００４１】増感剤の選択は、処置されるべき特定の型の腫瘍および投与されるべき細胞傷
害性因子のような因子に依存する。好ましくは、この化合物は、インビボで癌細
胞のような、特定の標的部位にとって選択的である。例えば、米国特許第４，６
２８，０４７号は、ジルチアゼムを使用し、ドキソルビシンのような細胞傷害性
因子に対する種々の型の癌細胞の感受性を高めることを報告する。増感剤の細胞
傷害性因子との他の組み合わせ、ならびにこれらの薬剤を用いる処置に対する異
なる型の癌細胞の感受性における予期される相違は、ＩｍｐｏｒｔａｎｔＡｄ
ｖａｎｃｅｓｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ（ＤｅＶｉｔａら、編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐ
ｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８６）、１４５−１
５７頁）で議論される。

【００４２】好ましい増感剤は、ＢＳＯ（ブチオニンスルホキサミン、Ｃｈｅｍｉｃａｌ
ＤｙｎａｍｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌ
ｄ、Ｎ．Ｊ．から入手可能）であり、これは、γ−グルタミルシステインシンテ
ターゼを阻害し、そして、細胞中で、グルタチオン（ＧＳＨ）の顕著な減少を導
く合成アミノ酸である。従って、ＢＳＯは、細胞のグルタチオンレベルの減少に
よって高められた細胞傷害性効果を有する薬物についての増感剤として機能する
と考えられる。特に好ましいものは、細胞中でグルタチオンの枯渇において有用
性を有する、ＢＳＯのＳ−異性体である（米国特許第５，１７１，８８５号およ
び同第５，２４５，０７７号を参照のこと）。

【００４３】増感剤および細胞傷害性因子のさらなる組み合わせは、所望の標的細胞に対応
する培養細胞（例えば、特定の癌細胞株）を使用するインビトロアッセイのよう
な方法を通して同定され得る。例えば、Ｒｕｓｓｏらは、ＢＳＯが、特定の型の
細胞株において、グルタチオンシンテターゼレベルを低下させるのに有効である
か否かを決定するためのアッセイを記載する。

【００４４】ラジカル酸素産生種、細胞傷害性因子および増感剤についての上記の議論は、
主に、好ましい標的細胞、すなわち、ｐ５３発現により特徴づけられる癌細胞に
指向される。このような癌としては、膀胱、脳、乳房、頸部、結腸、食道、咽頭
、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃および甲状腺の癌が挙げられる。

【００４５】別の好ましい方法においては、アンチセンスＯＮの投与は、細胞周期のＧ₂期
からＭ（有糸分裂）期への進行を妨げるのに有効な薬剤の投与に随伴する。こ
のような薬剤としては、例えば、ペントキシフィリン（Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９９
６）、シリマリン（Ａｈｍａｄ、１９９８）、スタウロスポリン（Ｓｗｅ、１９
９７）、フェニルアヒスチン（Ｋａｎｏｈ、１９９７）、パクリタキセル（Ｓｈ
ｕ、１９９７）、レチノイン酸（Ｚｈｕ、１９９７）、フラボピリドール（Ｓｅ
ｄｌａｃｅｋ、１９９６）、メチル−２，５−ジヒドロシンナマート（Ｋｏｃｈ
、１９９６）、ハーボキシジエン（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ、１９９６）、９−ニト
ロカンプトセシン（Ｋｈｏｏｕｓｔｏｖ、１９９５）、マイトトキシン（Ｖａｎ
Ｄｏｌａｈ、１９９６）、アピゲニン（Ｓａｔｏ、１９９４）、ノコダゾール、
およびコルセミド（Ｚｈａｎｇ、１９９８）が挙げられる。最近の論文（Ｃｒｏ
ｓｓ、１９９５）は、ｐ５３が紡錘体チェックポイント（細胞周期の有糸分裂（
Ｍ）期の間、紡錘体装置の完全な集合体を確実にする）において役立つことを示
唆している。本発明を裏付ける研究において、ｐ２１−欠損マウスは、上記に列
挙したようなＧ₂−Ｍインヒビターで処置した場合、罹患された細胞において、
高度の異数性を示した。このインヒビターは、細胞が、有糸分裂期を通して正常
な進行を受けること、そして、有糸分裂の（およびＧ₁−Ｓ期）チェックポイン
トを欠くことを妨げ、細胞が連続的な合成（Ｓ）期を受け、結果として異数性に
なることが仮定される。ｐ５３は、ｐ２１の転写活性化に必要であるので、ｐ５
３が、本発明のアンチセンス薬剤により阻害される細胞は、同様の効果を示すは
ずである。

【００４６】ノコダゾールまたはコルセミド（Ｃｒｏｓｓ、Ｚｈａｎｇ）のような紡錘体イ
ンヒビターはまた、抗ｐ５３アンチセンス薬剤と組み合わせて用いられ得る。ｐ
５３依存性紡錘体チェックポイントの非存在において、このような細胞は、異常
なまたは不完全な有糸分裂期を有する連続的な細胞周期を受けると予測され、ま
た、倍数性または異数性を導く。

【００４７】他の過剰増殖性疾患もまた、処置され得る。過剰増殖性の皮膚障害の例とし
ては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染細胞（一般に、いぼに関連する）
、黒色腫のような皮膚の表層性新生物形成、前悪性（ｐｒｅ−ｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ）および悪性の癌腫、光線性角化症、紅斑性狼瘡、皮膚炎ならびに乾癬が挙げ
られる。他の上皮組織（例えば、内皮、中皮）の過剰増殖性疾患としては、喘息
および気管支炎のような可逆的閉塞性気道疾患が挙げられる。眼の種々の過剰増
殖性疾患（円錐角膜、角結膜炎、春季結膜炎および角膜炎角膜白斑、（ｋｅｒａ
ｔｉｔｉｓｌｅｕｋｏｍａ）を含む）もまた、処置され得る。この方法はまた
、内膜平滑筋細胞過形成（ｉｎｔｉｍａｌｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅ
ｌｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、血管閉塞および再狭窄のような過剰増殖性血
管疾患を処置するために用いられ得る。

【００４８】（Ｂ．低酸素または虚血状態の処置）ｐ５３誘導によって特徴づけられる他の疾患状態としては、脳卒中のような虚
血性の発作が続くといったような低酸素状態が挙げられる。例えば、ｐ５３は、
大脳における虚血後のアポトーシス細胞において（Ｌｉ）、ならびに虚血および
てんかんのモデルにおける損傷を受けたニューロンにおいて（Ｘｉａｎｇ）、優
先的に発現されることが観察された。Ｒａａｆａｔは、腎臓における虚血／再灌
流に続くｐ５３の増加したレベルを観察し、そして、この増加が、アポトーシス
を容易にし得ることを提唱した。熱ショックもまた、ｐ５３を誘導することが報
告されている（Ｇｒａｅｂｅｒ）。従って、別の局面において、本発明は、本明
細書において記載される抗ｐ５３アンチセンス薬剤と共に、このようなストレス
、例えば、熱ショック、てんかん発作、脳卒中、ならびに虚血および／または再
灌流の他の発生（例えば、以下の器官移植）に供される組織の処置を含む。

【００４９】（ＶＩ．処方物および投与）（Ａ．治療処方物）本発明の処置方法に従った投与について、このアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、適切な液体ビヒクル
または賦形剤）および必要に応じた補助添加剤と組み合わされる。この液体ビヒ
クルおよび賦形剤は、通常および市販のものである。その例示としては、蒸留水
、生理食塩水、ブドウ糖水溶液などである。

【００５０】一般に、活性化合物に加えて、本発明の薬学的組成物は、薬学的に用いられ得
る調製物への活性化合物の処理を容易にする、適切な賦形剤および補助物を含み
得る。適切な賦形剤は、特に、糖のようなフィラー、例えば、乳糖またはショ糖
、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カ
ルシウム、ならびに結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、ガムトラガカント、
メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセ
ルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン）である。所望であ
れば、上記のデンプンならびにカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロ
リドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩のような崩壊化剤（ｄｉｓｉｎｔ
ｅｇｒａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）が、添加され得る。補助物としては、流量調節
化薬剤および潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、お
よび／またはポリエチレングリコールが挙げられる。

【００５１】糖剤のコア（ｄｒａｇｅｅｃｏｒｅ）は、適切なコーティング（所望であれ
ば、これは胃液耐性であり得る）とともに提供され得る。この目的のために、濃
縮された糖溶液が用いられ得、これは、必要に応じて、アラビアゴム、タルク、
ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン
、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る。胃液
耐性コーティングを生成するために、アセチルセルロースフタラートまたはヒド
ロキシプロピルメチルセルロースフタラートのような適切なセルロース調製物の
溶液が用いられる。染料および顔料が、同定のため、または活性化合物用量の異
なる組み合わせを特徴づけるために、糖剤コーティングの錠剤に添加され得る。

【００５２】経口的に用いられ得る他の薬学的調製物としては、ゼラチンから作製されたプ
ッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤
（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製された密封された軟性カ
プセルが挙げられる。このプッシュフィットカプセルは、乳糖のようなフィラー
、デンプンのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、ならびに、必要に応じて、安定剤と共に混合され得る顆
粒の形態で活性化合物を含み得る。軟性カプセルにおいて、この活性化合物は、
好ましくは、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのよ
うな適切な液体に溶解または懸濁される。さらに、安定剤が添加され得る。

【００５３】直腸に用いられ得る薬学的調製物としては、例えば、活性化合物の坐剤基剤（
ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙｂａｓｅ）との組み合わせからなる坐剤が挙げられる
。適切な坐剤基剤としては、天然または合成のトリグリセリド、パラフィン炭化
水素、ポリエチレングリコールまたは高級アルカノールが挙げられる。さらに、
活性化合物の基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルの使用が可能で
ある。可能な基剤材料としては、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール
またはパラフィン炭化水素が挙げられる。

【００５４】非経口投与のための適切な液体処方物としては、水溶性形態または水分散性形
態における活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油性の注入懸濁液
として活性化合物の懸濁液が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルと
しては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレ
イン酸エチルもしくはトリグリセリド）が挙げられる。水性注入懸濁液は、懸濁
液の粘性を高める物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソル
ビトールおよび／またはデキストラン）を含み得る。この懸濁液はまた、安定剤
を含み得る。

【００５５】従来のキャリアを用いる投与に加えて、活性成分は、種々の特別な送達技術に
より投与され得る。例えば、本発明の化合物は、リポソーム中で被包されて投与
され得る。この活性成分（その溶解度に依存する）は、水相においても脂質層に
おいても、または、一般的に、リポソームの懸濁液と称されるものにおいて存在
し得る。この脂質層は、一般的に、レシチンもしくはスフィンゴミエリンのよう
なリン脂質、コレステロールのようなステロイド、ジアセチルホスフェート（ｄ
ｉａｃｅｔｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍ
ｉｎｅ）もしくはホスファチジン酸のようなイオン性界面活性剤、および／また
は他の疎水性材料を含む。リポソームの直径は、一般的に、約１５ｎｍ〜約５ミ
クロンの範囲である。

【００５６】このような投薬形態の調製方法は、公知であるか、または、当業者に明らかで
ある；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅ（第１９版、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、１９９５）を
参照のこと。薬学的調製物は、当該分野において周知の手順に従って製造される
。例えば、これらは、従来の混合化、顆粒化、糖剤形成化、溶解化または凍結乾
燥化のプロセスにより作製され得る。この用いられるべきプロセスは、究極的に
は、用いられる活性成分の物理的性質に依存する。

【００５７】（Ｂ．腫瘍の処置）組成物は、経口的、経皮的または非経口的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内
または筋肉内の注射によって）に、被験体に投与され得る。インビボ抗腫瘍性の
使用について、ｐ５３ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましく
は、静脈内に投与される。

【００５８】本発明に従って、ｐ５３の発現を阻害し、従って、酸化的修復経路の下方制御
因子として作用するオリゴヌクレオチドが、ラジカル酸素誘導細胞傷害性を可能
にする薬剤の投与の前にまたはそれに随伴して、患者に投与される。同時に投与
される場合、この２つの活性薬剤は、結合体化または非結合体化の形態であり得
る。結合体化形態における場合、この結合体は、オリゴヌクレオチドおよび細胞
傷害性因子が標的部位で放出されるように、切断可能な結合を含むことが好まし
い。

【００５９】投与される各々の薬剤の量は、２つの型の薬剤の組み合わせが、治療的に、有
効であるようなものである。投薬は、患者の年齢、健康、性別、大きさおよび体
重、投与経路、薬物の毒性ならびにオリゴヌクレオチドおよび細胞傷害性因子に
対する癌の相対的感受性のような因子に一致して変動する。細胞傷害性因子の大
部分について推奨される投薬量および投薬形態は、確立されており、そして、Ｍ
ｅｄｉｃａｌＥｃｏｎｏｍｉｃｓＣｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｏｒａｄｅｌ
ｌ、Ｎ．Ｊ．より出版されているＰｈｙｓｉｃｉａｎｓＤｅｓｋＲｅｆｅｒ
ｅｎｃｅのような従来の出典から得られ得る。必要であれば、これらのパラメー
ターは、十分に確立された手順および分析によって、例えば、臨床試験において
、各々の系について決定され得る。

【００６０】インビボでの使用については、本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい投薬量
は、代表的に、約０．０１〜約１μｍｏｌ／ｌの血中濃度を達成することが必要
である。この濃度は、種々の方法で達成され得る；連続的ＩＶ注入による約０．
０５ｍｇ／ｋｇ／時間と約０．２ｍｇ／ｋｇ／時間との間の用量が、受容可能で
あることが見出された。より多量またはより少量のオリゴヌクレオチドが、要求
に応じ、投与され得る。

【００６１】以下の実施例３は、ヒトＢ細胞リンパ種の処置における本発明の適用を示す。

【００６２】（Ｃ．虚血障害の処置）虚血状態は、心不全、または、脳への血液供給の広範な損失もしくは血液洪水
における局在的妨害（例えば、脳出血または局所的血栓性もしくは塞栓性の事象
、あるいは頭部外傷に起因する）を導く他の状態によって引き起こされるような
脳循環における妨害に起因し得る。処置されるべきこの虚血状態は、一般的に、
脳卒中（脳における血管の閉塞または破裂によって引き起こされる、神経学的機
能の突然の減少または損失として定義される）に関連する。最初の虚血事象に起
因する二次的な脳の損傷は、代表的には、限局的な虚血の場合における虚血障害
の周辺領域において、および広範な虚血の場合における、損傷における選択的脆
弱性の領域（例えば、海馬または基底核）においてもまた、大脳の細胞破壊また
は損傷を含む。この二次的な損傷は、しばしば、機能障害（例えば、短期または
長期の記憶の損失）によって明らかになり得る。

【００６３】ＯＮは、滅菌生理食塩水溶液のような適切な不活性のキャリアにおいて、非経
口投与のために処方される。投与される用量は、投与の経路によって決定される
。１つの適切な経路は、用量レベルが、体重１ｋｇ当たり、約５０μｇ〜５ｍｇ
ＯＮでの、脳室内（ＩＣＶ）である。薬学的に有効な用量、すなわち、解剖学
的および／または機能的損傷における有意な減少を生じるのに有効な用量は、虚
血および脳卒中損傷についてのモデル系において見られる、用量／反応から見積
もられ得る。このようなモデル系としては、頸部の頸動脈の一過性の閉塞によっ
て生じる広範な虚血のスナネズミのモデル、およびラットの４つの血管閉塞モデ
ルが挙げられる。組織は、解剖学的損傷について試験され、そして機能的損傷は
、機能亢進、動物における大脳虚血の共通の結果、または短期記憶の効果の観察
によって評価され得る。これらの手順は、当該分野において公知である；例えば
、米国特許第５，０５１，４０３号を参照のこと。

【００６４】（Ｄ．再狭窄の処置）首尾良い抗再狭窄治療の重要な局面（特に、アンチセンス薬剤に関して）は、
罹患された細胞へのアンチセンスオリゴマーの有効な送達である。全身的に投与
された抗再狭窄薬物は、代表的には、受容できない高濃度の薬物を用いずに、血
管障害部位で、有効な濃度を達成できない。送達デバイス（例えば、共同所有さ
れ、かつ同時係属中の、「ＭｅｔｈｏｄｏｆＴｒｅａｔｉｎｇＲｅｓｔｅ
ｎｏｓｉｓｂｙＡｎｔｉｓｅｎｓｅＴａｒｇｅｔｉｎｇｏｆＣＭＶ」
という題名の米国出願番号０９／０６２，１６０に記載される）は、患者におけ
る血管形成部位へオリゴマーを送達するのに用いられ得る。このオリゴマーは、
好ましくは、モルホリノオリゴマーであり、そして、好ましくは、薬学的に受容
可能なキャリアに含まれる。このオリゴマーはまた、生体適合性のポリマーキャ
リアに含まれ得、また、上記に参照される出願に記載され得る。

【００６５】好ましくは、このオリゴマーは、血管形成手順と同時に送達される。Ｆａｒｒ
ｅｌｌによって報告されたように、細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みは
、化合物が、バルーンで傷ついた動脈に投与される場合に、正常な動脈による取
り込みと比較して、顕著に増加し得る。本発明の組成物を用いる薬物治療は、放
射線または光力学的治療と組み合わせられ得る。

【００６６】投薬量は、標準的薬学的操作に従って、被験体の大きさ、投与経路および罹患
された組織の範囲に従って、決定される。薬物の好ましいレベルは、受容可能で
ない副作用なしに、ｐ５３発現を阻害し、そして再狭窄を減少または阻止するの
に有効であるものである。成人ヒトについて、推奨される投薬量は、アンチセン
スオリゴマー１〜２５μｍｏｌ、そして好ましくは２〜１５μｍｏｌの範囲であ
る。所定の経路の最適投薬量は、当該分野において公知の方法に従って、慣用的
な実験法によって決定され得る。例えば、血管障害の部位への送達について、Ｅ
ｄｅｌｍａｎおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに記載されるようなインビボモデルが用
いられ得る。

【００６７】オリゴマーが、薬物送達デバイスに取り込まれる場合、上記のように、このデ
バイスは、適切な薬物投薬量を送達するのに有効である。処置されるべき組織の
表面積に関しては、有効な用量は、代表的には、血管壁１ｃｍ²当たり、３０〜
３０００μｇオリゴマーの範囲であり、そしてより好ましくは、１ｃｍ²当たり
、約３００〜１５００μｇである。患者はまた、血管形成術後に、再狭窄をさら
に阻害するために十分な投薬量レベルで、周期性基底（ｐｅｒｉｏｄｉｃｂａ
ｓｉｓ）上の組成物を与えられ得る。

【００６８】本発明は、特定の方法および実施形態に関連して記載されているが、種々の改
変が、本発明から逸脱することなくなされ得ることが明らかである。

【００６９】（実施例）（実施例１）（オリゴヌクレオチド合成）すべての鎖伸長合成を、ＡＢＩＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ、Ｎｏ．５８、
１９９１によって記載されるように、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ３８０ＢＤＮＡ合成機（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）上で、
１μモルのカラム支持体およびホスホラミダイト化学を利用するシアノエチルア
プローチを使用して、行った。この合成機を、ユーザー用マニュアルにおけるプ
ロトコルを用いてプログラ化した。

【００７０】代表的な合成の概要は、以下の通りである：３’ヒドロキシル基によって連結
されたＯＤＮ（すなわち、非改変ヌクレオチド、Ｃ−５−プロピンヌクレオチド
またはモルホリノヌクレオチドアナログ）の３’塩基を有する１μモルのシリカ
ゲル支持体カラムを挿入し、そして合成を、３’から５’方向への塩基様式によ
って、塩基中で行う。すべての液体試薬は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．より供給する。アルゴンガスは、ＡｉｒＰｒｏｄｕｃｔｓ（Ｏ
ｍａｈａ）より供給する。第一段階は、カラムの、アセトニトリル、次いでアル
ゴンガスによる洗い流し（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）（カラム中のあらゆる残留物を除
去する）である。次に、トリクロロ酢酸で、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基（
ＯＤＮ合成の間に、ヌクレオチドの５’酸素をキャップする）をプロトン化する
。次いで、プロトン化されたＤＭＴを、塩基から除く。このカラムを、アセトニ
トリルおよびアルゴンで、再び洗い流す。ＤＭＴ廃棄物を、ＤＭＴ廃棄口によっ
て試験管へ収集し、そして、明橙（ｂｒｉｇｈｔｏｒａｎｇｅ）色かどうかを
検査する。この色の検査は、脱トリチル化（ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）が成
功したかを保証するために行う。ＤＭＴ基を、４９８ｎｍでの吸光度を読み取る
ことにより、分光光度的に定量化し得る。この色が明橙色ではない場合、塩基の
脱トリチル化は、首尾良く行われ得ず、そして、不純物を含んだＯＤＮの合成が
生じ得る。合成の次の段階は、ＯＤＮ配列における次の塩基のカップリングであ
る。シアノエチルホスホラミダイトに改変された適切なヌクレオチド塩基を、ア
セトニトリルに溶解し、そしてテトラゾールを用いてカラムに送達する。この塩
基は、ヌクレオチド間ホスファイト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）結合を形成するよう
に反応する。カラムを、アセトニトリルおよびアルゴンで洗い流す。あらゆるカ
ップリングしていない５’ヒドロキシル基を、無水酢酸および１−メチルイミダ
ゾールを用いてカラムを洗い流すことによって、アセチル基でキャップする。こ
のキャップは、合成において、これらのカップリングしていない塩基のあらゆる
存続を妨げ、そして、不純物の長さを減少させる。このカラムを再び洗い流し、
そして、３価のホスファイトをテトラエチルチウラムジスルフィドおよびアセト
ニトリルを用いて、５価のホスホロチオエートトリエステルに酸化する。このカ
ラムを、アセトニトリルおよびアルゴンで洗い流す。次いで、この合成を、脱ト
リチル化段階で始まる配列において、次の塩基について再び繰り返す。Ｓ−ＯＤ
Ｎを、水酸化アンモニウムをカラムに通し、そして、溶出液を収集することによ
って、カラムから切断する。この水酸化アンモニウムおよびシアノエチル（リン
酸連結から）を、一晩、減圧遠心機において、Ｓ−ＯＤＮ溶液のエバポレーショ
ンによって除く。この乾燥したＯＤＮを、滅菌生理食塩水で希釈する。Ｓ−ＯＤ
Ｎの純度を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で、水で希釈したＳ−ＯＤＮのサ
ンプルを、電気泳動することによって検査する。Ｓ−ＯＤＮの濃度を、２６０ｎ
ｍでの吸光度の読み取り、そしてその吸光度に吸光係数を掛けることによって、
決定する。

【００７１】モルホリノオリゴヌクレオチドアナログの調製についてのさらなる詳細が、例
えば、ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．７：１８７−１９５（１９９７）におい
て見出され得る。

【００７２】（実施例２）（部分肝切除）部分肝切除研究を、体重２００〜２２０グラムの雄性ＳｐｒａｇｕｅＤａｗ
ｌｅｙラット（Ｓａｓｃｏ、ＯｍａｈａＮＥ）で行った。動物を、１２時間の
明／暗サイクルで、ＵＮＭＣ’ｓＡＡＡＬＡＣ認可施設において透明なプラス
チックのケージに収容し、そしてＰｕｒｉｎａラット固形飼料および水道水を任
意に入手できるようにした。すべての動物プロトコルは、大学の「Ｉｎｓｔｉｔ
ｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅ
ｅ」によって承認された。

【００７３】手順を、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９３１）によって記載さ
れるように行った。無菌的外科技術を利用した。ラットを、メトキシフルラン（
ＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬ
）を用いて麻酔し、そして、その腹部の表面を曝すように置いた。３〜４ｃｍ長
の領域を、剣状突起からすぐ後方、中線に沿って剃毛し、そしてベタジン（ｂｅ
ｔａｄｉｎｅ）を塗布した。切開を、肝臓を曝すために、中線に沿らせた。この
内側および左の外側の葉（ｌｏｂｅ）を、しっかりと結紮し、次いで、切除した
。これは、肝臓全体の約６５〜７０％の除去という結果になった。腹部切開を、
２層において閉じた。部分肝切除を受けなかったコントロールラットは、同じだ
が偽の手術を受けた；これらの肝臓は、単に曝されただけであり、そして、部分
切除されなかった。

【００７４】オリゴヌクレオチド投与：ＯＤＮを、１ｍｇ／２００グラム／日Ｓ−ＯＤＮ
、０．１ｍｇ／２２０グラム／日Ｃ−５−ＰＳ−ＯＤＮ、および５０ｎＭ（
約３．４ｍｇ）／２００グラム／日モルホリノの用量で、腹腔内に注射した。
すべてのラットに、手術後意識を回復して直ちに、そしてその後２４時間おきに
（実験の長さに依存する）、それぞれのＯＤＮを投与した。次いで、手術時から
１、２、５または７日間、ラットが、回復できるようにした。湿重量増加を、Ｏ
ＤＮの投与の２４時間後に測定し、図１に示すデータを作製した。

【００７５】（実施例３）（ヒトＢ細胞リンパ種の処置）薬物処置レジメン：０日目から開始、患者は、０．２ｍｇ／ｋｇ／時間の用量
で、７日間連続ＩＶ注入として、静脈アクセスデバイスを通して、配列番号１を
有するモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを受ける。ＭＩＮＥ化学療法
を、以下の一覧表に従って、開始４日目で与える：・ＭｅｓｎａＩｎｊｅｃｔｉｏｎ（ＭＥＳＮＥＸ^TM、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙ
ｅｒｓＯｎｃｏｌｏｇｙ）：５００ｍｇ／Ｍ² ＩＶ（イホスファミドより３
０分前）、２５０ｍｇ／Ｍ² ＩＶ（イホスファミド４時間後）、および経口的
に２５０ｍｇ／Ｍ²（イホスファミド８時間後）（４〜７日目の各々において）
。・イホスファミド（ＩＦＥＸ^TM、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ＭｅｙｅｒｓＯｎｃｏｌｏ
ｇｙ）：１．３３ｇ／Ｍ² ＩＶ（４〜７日目の各々において）。・塩酸ミトザントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ^TM、ＬｅｄｅｒｌｅＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）１０ｍｇ／Ｍ² ＩＶ（４日目においてのみ）。・エトポシド（ＶＥＰＥＳＩＤ^TM、Ｂｒｉｓｔｏｌ−ｍｅｙｅｒｓＯｎｃｏｌ
ｏｇｙ）８０ｍｇ／Ｍ² ＩＶ（４〜７日目の各々において）。

【００７６】患者を、定期的に、その疾患の毒性および応答について評価する。患者は、毎
週、ＣＢＣ（完全な血球算定）および血小板算定を受ける。サイクルを、４週間
ごとに、最大６サイクルの間、反復する。患者を、サイクルごとの応答に関して
、身体検査によって測定可能な疾患について評価する。患者を、応答（完全な応
答、部分的な応答、安定な応答または進行性の疾患）に関して、分類する。

【００７７】患者は、伝統的なＭＩＮＥ治療（これは、アンチセンスオリゴヌクレオチド配
列番号１（ＯＬ（１）ｐ５３）の使用を含まない）とは対照的に、この治療と共
に、高められた臨床応答を示すことが予測される。ＯＬ（１）ｐ５３は、細胞周
期修復メカニズムを阻害し、それによって、優先的に、ｐ５３非依存性アポトー
シスを介して癌細胞を殺傷することによって、癌細胞を、ＭＩＮＥの効果に敏感
にすることが予測される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ホスホロジアミデート連結モルホリノオリゴヌクレオチドアナログの
構造を示す。

【図２】図２は、ラットにおける残留再生肝臓の湿重量（グラム）、２４時間後の部分
肝切除ならびに以下のアンチセンスオリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号１お
よび２を有する）の投与を示す：ホスホロチオエート（Ｓ−ＯＤＮ、１ｍｇ／２
００ｇ）；Ｃ−５−Ｐ改変ホスホロチオエート（Ｃ−５−Ｐ、０．１ｍｇ／２０
０ｇ）；および中性骨格（ホスホロジアミデート）モルホリノオリゴヌクレオチ
ド（３．４ｍｇ／２００ｇ）。エラーバーは、各々それぞれの群の生理食塩水処
置コントロールに関しては、ｐ＜０．０５の統計差を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/4745 Ａ６１Ｋ 31/4745 31/522 31/522 31/553 31/553 31/65 31/65 31/7125 31/7125 45/00 45/00 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 9/10 35/00 35/00 43/00 １０１ 43/00 １０１Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＦターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4C084 AA19 AA23 ZA541 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 ZC202 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 BA02 CB07 CB22 DA29 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 ZA54 ZB21 ZB26 4C206 AA01 AA02 AA03 DA12 DB20 DB43 HA26 KA04 MA01 MA02 MA03 MA04 MA23 MA28 ZA54 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被験体においてｐ５３誘導によって特徴づけられる疾患状態
の処置における使用のための組成物であって、以下：５’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ−３’として同定さ
れる配列番号１および５’−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴ
ＣＣ−３’として同定される配列番号２からなる群から選択される塩基配列を
有する、アンチセンス薬剤であって、該アンチセンス薬剤が、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、２’
−Ｏ−アリルもしくは２’ −Ｏ−アルキル改変オリゴリボヌクレオチドまたは
Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドである、アンチセンス薬
剤、および適切な薬学的キャリアを含む、組成物。
【請求項２】前記アンチセンス薬剤がモルホリノオリゴヌクレオチドであ
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】前記モルホリノオリゴヌクレオチドが、ホスホロジアミデー
ト骨格結合によって結合されるモルホリノサブユニットを含む、請求項２に記載
の組成物。
【請求項４】前記アンチセンス薬剤が前記配列番号１の配列を有する、請
求項１に記載の組成物。
【請求項５】前記アンチセンス薬剤が前記配列番号２の配列を有する、請
求項１に記載の組成物。
【請求項６】前記疾患状態が、虚血または虚血／再灌流障害から生じる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項７】前記疾患状態が癌である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】細胞レベルでラジカル酸素種を増加させるのに有効な因子を
さらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】前記因子が、細胞レベルでラジカル酸素種を増加させる、放
射線増感剤、電離放射線、高圧酸素環境および化学療法剤から選択される、請求
項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記化学療法剤が、アントラサイクリンまたはアントラキ
ノンである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】細胞周期のＧ₂期からＭ期への進行を妨げるのに有効な薬
剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】前記薬剤が、ホスホキナーゼＣ（ＰＫＣ）インヒビター、
ビス（クロロエチル）ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、ペントキシフィリン、シリマ
リン、スタウロスポリン、フェニルアヒスチン、パクリタキセル、レチノイン酸
、フラボピリドール、メチル−２，５−ジヒドロシンナマート、ハーボキシジエ
ン、９−ニトロカンプトセシン、マイトトキシン、アピゲニン、ノコダゾールお
よびコルセミドからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】５’−ＣＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣ−３’ として同定される塩基配列番号２を有するオリゴヌクレオチドで
あって、該オリゴヌクレオチドが、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、２
’−Ｏ−アリルまたは２’ −Ｏ−アルキル改変オリゴリボヌクレオチド、およ
びＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチドからなる群から選択さ
れる、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】前記オリゴヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチド
である、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】ホスホロジアミデート骨格結合によって結合されるモルホ
リノサブユニットを含む、請求項１４に記載のモルホリノオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】５’−ＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣ
−３’として同定される塩基配列番号１を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】前記オリゴヌクレオチドが、モルホリノオリゴヌクレオチ
ド、ペプチド核酸、２’−Ｏ−アリルまたは２’ −Ｏ−アルキル改変オリゴリ
ボヌクレオチド、およびＮ３’→Ｐ５’ホスホロアミデートオリゴヌクレオチド
からなる群から選択されるものである、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド
。
【請求項１８】前記オリゴヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチド
である、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】ホスホロジアミデート骨格結合によって結合されるモルホ
リノサブユニットを含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。