JP2002527077A

JP2002527077A - 染色体ペインティングのための蛍光プローブ

Info

Publication number: JP2002527077A
Application number: JP2000576054A
Authority: JP
Inventors: シェリフ，ドラ
Original assignee: ジェンセット
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2002-08-27
Also published as: ES2299259T3; PT1121461E; EP1121461A1; CY1107864T1; ATE382096T1; US7011942B1; AU6098199A; CA2345381A1; DE69937837D1; CA2345381C; DK1121461T3; US20030099989A1; FR2784683A1; WO2000022164A1; FR2784683B1; DE69937837T2; US6905828B2; AU769073B2; US6562959B1; EP1121461B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、多色in situ蛍光ハイブリダイゼーション法、主として染色体ペインティングに使用される蛍光プローブに関する。染色体をマーキングするために設計される該プローブは、特定の染色体バンドにおいてより多く表示されるDNAセグメントのセットから成り、反復および散在するDNA配列AluおよびLINEに特異的なPCRプライマーを使用して前記染色体からのIRS-PCR増幅により得られるようなものである。本発明はさらに、前記プローブの製造方法、前記プローブを使用し得る多色FISH法およびそれらを含む診断キットに関する。本発明はまた、発蛍光団および光学フィルターの組み合わせに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、染色体ペインティング、より詳細にはFISH（「蛍光in situハイブ
リダイゼーション」）法などの方法において使用することができる蛍光プローブ
に関する。本発明はまた、発蛍光団および光学フィルターの組み合わせに関する
。

【０００２】 in situハイブリダイゼーションは、研究対象の配列に相同な特異的配列を有
するプローブによるDNA（またはRNA）配列の検出を可能にする技術である。該技
術は、ヌクレオチド（Ａ／Ｔ、Ａ／Ｕ、Ｇ／Ｃ）の相補性に基づき、染色体また
は組織調整物に対し正確な生理化学条件下で行うことができる。in situハイブ
リダイゼーションプロセスの結果は、プローブと標的との間のハイブリッドの形
成である。in situハイブリダイゼーションは変性工程、およびまたハイブリッ
ドまたはプローブを検出工程であって、標的へのプローブのin situハイブリダ
イゼーション後に行われる工程を含む。サンプルは層の形でスライドの表面に付
着し得、このサンプルは、例えば、変性条件下で形態学を維持するために処置さ
れている個々の染色体もしくは染色体領域を含むかまたは含有し得る。蛍光in s
ituハイブリダイゼーションにおいて、プローブは発蛍光団により標識され、蛍
光標識によってハイブリダイゼーションが表される。

【０００３】最近開発されたこの技術により、同じサンプル上において異なる発蛍光団によ
ってそれぞれ表されるいくつかのプローブの同時可視化が可能である。多色FISH
またはマルチFISHと呼ばれるこの技術は、赤外線高解像度冷CCDカメラによって
行われるコンピュータ援用画像の助けによる標識を確実にするような異なる蛍光
分子の発光波長に特異的なフィルターの組み合わせにより可能になっている（Sc
hrockら、1996；Speicherら、1996）。

【０００４】多色蛍光標識の能力を伴う正確な染色体配列または染色体全体に相同な特異的配
列を有するプローブを使用すれば、いわゆる染色体ペインティング技術を開発し
、即ち、異なる色の染色体を得ることができ、所望であれば、多色の完全な核型
を得ることができる。核型とは、中期における細胞の染色体の特徴的配列を意味
することが理解される。

【０００５】用語の一般的意味の範囲内において、「標識」とは、放射性同位元素などの物
質または酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ギゴキシゲニン、発
光剤、染料、ハプテンなどの非同位元素物質を意味することが理解される。発光
薬剤は励起エネルギーの供給源に依存し、放射発光剤、化学発光剤、生物発光剤
および光ルミネセンス剤（蛍光剤およびリン光剤を含む）に分類され得る。用語
「蛍光」は、一般に、例えば、紫外線などのエネルギー源によって励起される場
合に光を生成する物質（発蛍光団など）の特性を指す。

【０００６】「染色体ペイントプローブ」とは、プローブまたは本発明のプローブ組成物な
どのプローブ組成物であり、ハイブリダイゼーション条件下でマルチ染色体ゲノ
ムの予め決定された染色体を含む標的とハイブリダイズするのに適切であること
を意味することが理解される。そのようなプローブ組成物とのそのようなハイブ
リダイゼーションに供されるサンプルにおいてそのような染色体の画分のみが示
される場合、この画分はハイブリダイズし、そして同定される。実際には、本発
明のペイントされたプローブは、第２、第３のものなどと混合され、そのように
して標識および２つ、３つなどの予め決定された染色体の検出が可能になる。

【０００７】蛍光色素の組み合わせで標識を行うことにより、24のすべてのヒト染色体を可
視化することが可能になっている。例えば、５つの異なる発蛍光団を使用する場
合、初蛍光団の31の組み合わせを得ることができる。この標識原理およびヒト染
色体のそれぞれに特異的な24のDNAプローブを使用することによって、染色体を
それぞれ区別して可視化することができる。従って、組合せ発蛍光団のそれぞれ
を人工的に着色し、コンピュータ処理することによって、24のヒト染色体を区別
して着色することができる。

【０００８】そのような多色標識の強力な能力により、バンド内の染色体を標識するための
従来の細胞遺伝学技術では現在まで検出することが困難であった染色体異常の分
析が急速に可能になっている（Summerら、1971；DutrillauxおよびLejeune、197
1）（Giema染色、BrdUによる標識など）。バンド内の染色体の標識の原理は、バ
ンド間の平均的な塩基対組成（GCの豊富さ）の差異および染色体バンド間におけ
るクロマチンのコンパクションの差異に基づく。染色体ペインティングは、転座
などの染色体間異常、HSR（均一染色領域に対するHSR）DNA配列またはマーカー
染色体もしくはDM染色体などの染色体物質の過剰を検出するのに極めて有効なツ
ールであることが明らかにされている。欠失および重複などの染色体内異常のみ
が異常のサイズの機能として検出される（後者が染色体の長さに影響を及ぼす場
合）が、この方法では染色体逆位は全く検出することができない。

【０００９】現在のスペクトル核型決定は使用する上で限界があるため、それにより染色体
間または染色体内再配列に関与する染色体バンドの性質を検出することができな
い。これを行うためには、例えば、DAPI対比染色、Giemsaまたはヨウ素プロピジ
ウム染色などの染色体バンド（ＲまたはＧ標識）のより従来の１つにこの技術を
合わせることが必須である。

【００１０】異なる技術を組み合わせるための要件は、もちろん、染色体異常の分析におい
て不利な条件となっており、さらに、FISHまたはマルチFISH法は高価な装置と染
色体に特異的な高価なプローブでの染色体ペインティングに必要な高価な装置お
よび器具を組み合わせるため、研究室または検査室にこの技術を普及させる可能
性が制限されている。

【００１１】現在市販されているペイントプローブ（GIBCO-BRL、Oncor、Boehringer Manhe
imなど）は、フローサイトメトリーもしくは染色体の顕微解剖による染色体選別
などの煩わしい技術により単離された染色体または染色体のフラグメントに対す
る変性PCRプライマーを使用するDOP-PCR増幅によって得られる。DOP-PCRによっ
て得られるプローブのハイブリダイゼーションでは染色体に対する染色体バンド
は作製されない。染色体バンドの作製は、染色体に沿った人口バンドの作製を解
して探索される。人工バンドのこの作製には、煩わしくかつ高価な技術を使用す
ることが必要である。さらに、このことにより細胞遺伝学の分野において不明な
参照マークであるバンドを生じる。

【００１２】他方では、AluおよびLINE配列などのゲノムにおいて反復および散在するDNA配
列に特異的なプライマーを使用するIRS-PCR（散在性反復配列）による染色体の
増幅によって得られる染色体ペイントプローブの使用が記載されている。IRS-PC
Rによるヒト染色体の増幅のためのAluおよびLINE PCRプライマーを組み合わせて
使用することは、Lichterら、1990によって先に提唱された。しかし、後者によ
って得られるＲバンドの標識では、ゲノムのすべての領域、特にテロメア領域お
よび特定のＧ染色体バンドを含む完全なペインティングを確実にすることはでき
ない。

【００１３】本発明の目的は、安価に得ることができ、さらに良質の染色体バンドが全体的
にペイントされた染色体上に直接出現することができる染色体プローブを提供す
ることである。

【００１４】これを行うため、本発明は、特定の染色体バンドにおいてより多く表示され、
AluおよびLINE DNA配列に特異的なプライマーの助けによりIRS-PCR増幅によって
得られるDNAセグメントのセットから成ることを特徴とする、染色体を標識する
ためのプローブに関する。

【００１５】用語「プローブ」は、DNAセグメントもしくはDNA配列が標識された個々の物質
と化学的に組み合わされるようなポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの混
合物に関する。プローブを構成するそれぞれのポリヌクレオチドは、標的へのハ
イブリダイゼーション時に単一鎖の形態にあるという特徴を有する。

【００１６】用語「DNAフラグメント」、「DNAセグメント」は、一般にポリヌクレオチドま
たは染色体もしくは染色体部分に存在する配列の一部のみを示す。例えば、ポリ
ヌクレオチドは、複数のセグメントもしくはフラグメントに切断または断片化さ
れ得る。染色体は、反復DNAセグメントを含有するDNA配列を有する領域を含有す
るという特徴を有する。用語「反復」は、特定のDNAセグメントが何倍もある（
少なくとも２倍）か、散在するか、そうでなければゲノム内に存在するという事
実を指す。いわゆるIRS-PCR法は、例えば、AluまたはLINE配列などのゲノムの散
在性の反復配列にハイブリダイズするプライマーを使用する。

【００１７】「ゲノム」は、生物のDNAによってコードされる該生物の遺伝子指令の完全か
つ独特なコピーを表す。本発明において、考慮される特定のゲノムは、DNAが細
胞においていくつかの個々の染色体間に分布するようなマルチ染色体性である。
ヒトのゲノムは23対の染色体から成り、そのうちXXまたはXYの対は性を決定する
。

【００１８】用語「染色体」は、クロマチンから誘導され、DNAおよびタンパク質成分（ヒ
ストンが必須である）を含む、生体細胞における遺伝を保持する遺伝子のための
支持体を指す。本明細書では、ヒトゲノムの染色体を同定し番号付けするための
従来の国際系を使用する。個々の染色体のサイズは、マルチ染色体ゲノム内、お
よびゲノムごとに変動し得る。ヒトのゲノムの場合、所定の染色体のDNAの長さ
の合計は、一般に５千万bpを超える。ちなみにヒトのゲノムの長さの合計は３×
10⁹bpである。

【００１９】哺乳動物のゲノムは、ゲノム全体に渡って散在する反復DNA配列を含有する。
ヒトにおいて、このタイプの配列の大部分は、Alu配列の異なるファミリーによ
って表示され、それらの数は約10⁶であり、一般に300 bpのコンセンサス配列を
有する。反復LINES（またはL1）配列は、Alu配列と同様にゲノム全体に渡って散
在する。それにもかかわらずそれらの数はそれ程多くない（約10⁴）。それらの
コンセンサス配列は約６kbである。好ましくは、それらは暗Ｇバンド（Ｇ陽性ま
たはＲ陰性）において適切であるが、その代わりAlu配列はＲバンド（Ｒ陽性）
において適切である（KorenbergおよびKirowski、1988）。

【００２０】本発明のIRS-PCRによって増幅されるDNAセグメントは、供給源として体細胞ハ
イブリッド、好ましくは、げっ歯類−ヒト体細胞ハイブリッド、染色体または染
色体のフラグメントを有し得る。染色体または染色体のフラグメントは、フロー
サイトメトリーもしくは染色体の顕微解剖による染色体選別によって得ることが
できる。本発明の好ましい実施態様の枠内において、IRS-PCRにより増幅されるD
NAセグメントは供給源としてモノ染色体性のげっ歯類−ヒト体細胞ハイブリッド
を有する。

【００２１】本発明のIRS-PCRによって増幅されるDNAセグメントは、細胞遺伝子のバンドの
１つのタイプにおいてより多く表示される。好ましい細胞遺伝的バンドは、Ｇバ
ンドまたはＲバンドである。本発明の好ましい実施態様において、IRS-PCRによ
って増幅されるDNAセグメントはＲバンドにおいてより多く表示される。

【００２２】ヒト反復配列に類似の反復配列はげっ歯類のゲノムにも見出される。しかし、
ヒトとげっ歯類との間におけるこのタイプの配列のダイバージェンスは、それら
の間にほとんどダイバージェンスが認められないことから非常に重要である。こ
のダイバージェンスにより、ヒト−げっ歯類ハイブリッドを使用する場合、ヒト
染色多に含有されるDNAセグメントの選択的増幅が可能である。従って、ヒト−
げっ歯類体細胞ハイブリッドのDNAから開始し、Aluおよび／またはL1コンセンサ
ス配列に特異的なプライマーを使用して、PCRにより、５kb未満の距離だけ離れ
ている２つの反復配列（「逆」位）の間のDNA配列を選択的に増幅することがで
きる。この様にして得られた増幅産物は、実際的に体細胞ハイブリッドのDNAに
含有されるヒト染色体全体を代表するフラグメント（そのサイズは約100 bp〜５
kbで変動する）のセットから成る。

【００２３】もちろん、本発明は一般にヒト染色体に特異的なプローブを製造することを特
に目的とするが、他の細胞タイプに対する染色体ペインティングを想定すること
ができる（Sabileら、1997）。

【００２４】本発明のプローブは、プローブが、 Alu DNA配列に特異的なプライマーを使用して得られるPCR増幅産物、 Alu DNA配列に特異的なプライマーおよびLINE DNA配列に特異的なプライマーを
使用して得られるPCR増幅産物から成る２つのIRS-PCR増幅産物の混合物から誘導されることを特徴とする。

【００２５】本発明は、一方ではAluおよびLINE DNA配列に特異的なPCRプライマー、他方で
はAlu DNA配列に特異的なプライマーを使用して、染色体から２つのIRS-PCR増幅
により得られる２つの増幅産物の混合を含むことを特徴とする、ヒト染色体を標
識するためのプローブの製造方法に関する。

【００２６】本発明では、AluまたはLINE配列に特異的な任意のプライマーを使用することが
できる。好ましくは、Alu DNA配列に特異的なプライマーは、配列が配列番号１
に記載されているSR1プライマーからなり、好ましくは、LINE DNA配列に特異的
なプライマーは、配列が配列番号２および３に記載されているL1Hプライマーで
ある。

【００２７】あるいは、本発明のプライマーはまた、 LINE DNA配列に特異的なプライマーを使用して得られるPCR増幅産物、 Alu DNA配列に特異的なプライマーおよびLINE DNA配列に特異的なプライマーを
使用して得られるPCR増幅産物、から成る２つのIRS-PCR増幅産物の混合物から誘導してもよい。

【００２８】本発明はまた、一方ではAluおよびLINE DNA配列に特異的なPCRプライマー、他
方ではLINE DNA配列に特異的なプライマーを使用して、染色体から２つのIRS-PC
R増幅により得られる２つの増幅産物の混合を含むことを特徴とする、ヒト染色
体を標識するためのプローブの製造方法に関する。

【００２９】本発明はまた、発発色団およびフィルターの使用を含み、それらの組み合わせ
により、極めて読み取り可能な核型を提供する染色体ペインティングを確実にす
ることができ、即ち、対比されかつ明確に規定された染色体ペイント着色を得る
ことができる。

【００３０】従って、上記のDNAプローブは、蛍光技法により直接的または間接的に標識さ
れる。ここに挙げるものがすべてではないが、標識に使用される発蛍光団は、シ
アニン、ローダミン、フルオレセイン、Bobipy、Texas Red、Oregon Green、Cas
cade Blueタイプから選択され得る。特に、「Handbook of fluorescent probes
and research chemicals」（Richard P Haugland、1996、Molecular Probes、MT
Z Spence編、より詳細には145〜146、153、155〜156、157〜158、161頁）に記載
のすべての発蛍光団を使用して、本発明のプローブを標識することができる。

【００３１】好ましくは、本発明のプローブは、次の群：フルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シア
ニン5.5（Cy5.5）、シアニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なく
とも１、２、３、４または５つの発蛍光団で標識される。

【００３２】 DNAプローブの好ましい標識方法は、「ニックトランスレーション」である。
しかし、標識は、ポリメラーゼによって触媒されるDNAの合成およびオリゴヌク
レオチドの標識のためのすべての標準的な反応によって行うこともできる。例え
ば、標識は、ランダムプライミング、増幅またはin situプライマー伸長によっ
て行うことができる。

【００３３】用語「直接的に標識されるプローブ」は、標的とハイブリッドを形成した後に
ハイブリッドの試薬処置を行うことなく標識を検出することができる核酸プロー
ブを表すかまたは記載する。本発明のFITC、Texas Red、Cy3およびCy5発蛍光団
を使用するプローブは直接的に標識される。

【００３４】用語「間接的に標識されるプローブ」は、標識とハイブリッドを形成した後に
標識は１以上の試薬によるさらなる試薬で処置されなければならず、それは１以
上の物質と組み合わされて、それにより最終的に検出可能な化合物が生じる。例
えば、プローブは、DNP、ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識することができ
、表示工程は、プローブを、発蛍光団もしくは発蛍光団に結合したアビジンで標
識された抗DNPまたは抗ジゴキシゲニン抗体と接触させることを含む。本発明の
発蛍光団Cy7、Bodipy 630/650、Cy5.5を使用するプローブは間接的に標識される
。

【００３５】好ましくは、本発明のプローブ組成物は、最大可能数の「直接標識される」プ
ローブを含む。直接標識されるプローブの方が使用し易いという事実に加えて、
それらはより良好な解像度を可能にする。このような良好な解像度は、染色体バ
ンドの良好な観察に重要である。好ましくは、本発明のプローブ組成物は、すべ
ての発蛍光団に対して「直接標識」型である。本発明の好ましいプローブ組成物
は、使用される５つの発蛍光団のうち４つに対して「直接標識」型である。もう
１つの好ましい組成物において、直接標識されるプローブは、使用される５また
は６つの発蛍光団のうち３つを前記プローブで使用する。

【００３６】本発明はまた、ヒト染色体の各々またはヒト染色体のいくつかに対する本発明
のプローブを含有することを特徴とする、ヒト染色体を標識するためのプローブ
のセットに関する。このプローブのセットにより、上記の可能な染色体異常をそ
こで検出し、そこで同定するように、１回の操作ですべての核型を分析すること
ができる。

【００３７】本発明はまた、DNAプローブが発蛍光段で標識されることおよび特定の吸収お
よび発光波長を有するそれぞれの発蛍光団が１対の光学フィルター（吸収用と発
光用）と組み合わされることを特徴とする、核型を研究することを目的とする多
色FISH法に関する。

【００３８】発蛍光団は、異なる発蛍光団間の吸収および発光スペクトルの重複が最小にな
るように選択される。より詳細には、異なる発蛍光団の吸収および発光最大間に
重複が認められないことが重要である。

【００３９】それぞれの初蛍光団は、１対の光学フィルター（吸収用と発光用）と共に使用
される。該フィルターにより、もう１つの発蛍光団との重複に対応する波長が消
失するように通過帯域を選択することができる。従って、本発明において使用さ
れるフィルターは、好ましくは狭い通過帯域の光学フィルター型である。フィル
ターは通過帯域以外の光を通過させないため、フィルターは上質のものが好まし
い。

【００４０】好ましくは、本発明はまた、本発明のDNAプローブが発蛍光団で標識され、特
定の吸収および発光波長を有するそれぞれの発蛍光団が吸収用に１つと発光用に
１つの１対の光学フィルターと組み合わされることを特徴とする、特に核型を研
究することを目的とする多色FISH法であって、以下の群：ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた494 nmの最大吸収波長および517
nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた554 nmの最大吸収波長および568
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた593 nmの最大吸収波長および613
nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた652 nmの最大吸収波長および670
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた743 nmの最大吸収波長および767
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた675 nmの最大吸収波長および694
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた632 nmの最大吸収波長および658
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される発蛍光団およびフィルター対を使用する方法に関する。

【００４１】本発明はまた、本発明のDNAプローブが発蛍光団で標識され、特定の吸収およ
び発光波長を有するそれぞれの発蛍光団が吸収用に１つと発光用に１つの１対の
光学フィルターと組み合わされることを特徴とする、多色FISH診断キットであっ
て、以下の群：ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた494 nmの最大吸収波長および517
nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた554 nmの最大吸収波長および568
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた593 nmの最大吸収波長および613
nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた652 nmの最大吸収波長および670
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた743 nmの最大吸収波長および767
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた675 nmの最大吸収波長および694
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた632 nmの最大吸収波長および658
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される発蛍光団およびフィルター対を使用するキットに関する。

【００４２】本発明のフィルターは、６空洞型であること、０°のADIを有すること、 λ₀±20％のFWHMの許容度を有すること、 FWHMの±20％のFWHMに対する許容度を有すること、 1200 nmにおいてUVのOD5通過阻止帯域を有すること、 λ₀においてＴ≧50％の透過曲線を有することが好ましい。

【００４３】好ましくは、フィルターはまた、21 mmを超える中心有効直径を有し、７mm以
下の厚さを有さなければならない。

【００４４】発蛍光団および上記のフィルターは、本発明のプローブ、あるいは、例えば、
染色体ペインティングまたは多色FISHのために使用される様々なプローブを標識
するために使用され得る。

【００４５】本発明において、「フィルター」とは、参照波長λ₀を中心とする極めて狭い
所定のスペクトルバンド内の光を透過させる狭い通過帯域の干渉フィルターを意
味することが理解される。それらは、それらの透過曲線：Ｔ＝f(λ)によって特
徴づけられる。バンドの幅は、半値全幅の透過（「半値全幅の透過」に対するFW
HM）によって規定される。

【００４６】通過帯域以外では、フィルターは残りのシグナルをできるだけ減衰させて通過
させる。

【００４７】干渉フィルターは、増加的および減殺的干渉の原理に基づいて機能する。干渉
フィルターの基本構成分は、空洞と呼ばれる。それは誘電固体の層で分離されて
いる２スタックの反射器を有する。空洞の数が多いほど、透過曲線の形状がより
直交に近づく（即ち、この曲線の勾配がより大きくなる）。さらに、空洞の数が
多いほど、通過帯域外の減衰係数が良好になる。

【００４８】多蛍光アプリケーションのために使用される蛍光色素の励起または発光スペク
トルは、相互に極めて近い。従って、通過帯域外で可能な最小量のシグナルを回
復することが必要である。従って、このレベルで最良の特徴を提供する６空洞フ
ィルターを選択した。

【００４９】使用されるフィルターは、以下の仕様：正常な光入射で使用されるように設計されていること、中心波長（λ₀）に対する許容度が通過帯域の±20％であること（例えば、10 nm
の通過帯域を有するフィルターに対して、λ₀は±２nmの許容度を有すると規定
される）、通過帯域の幅に対する許容度が±20％であること、これらのフィルターの通過係数が50％を超えること、これらのフィルターの通過阻止帯域が1200 nmにおいて紫外線に対しOD5であるこ
と（このことは、通過帯域外において通過係数が10^-5、即ち0.001％であること
を意味する）を有することが好ましい。標準的なフィルターの場合、0.8λ₀〜1.2λ₀の範囲の
波長に対する通過阻止帯域が確実にされる。例えば、λ₀＝620 nmのフィルター
の場合、通過阻止帯域は500〜740 nmの間にのみ生じる。しかし、多蛍光アプリ
ケーションの場合、スペクトルが350から800 nmまで伸長する蛍光色素が認めら
れる。従って、1200 nmにおいて紫外線に対する通過阻止帯域が確実にされるフ
ィルターを使用した。

【００５０】最後に、本発明は、少なくとも上記のプローブまたは上記のプローブのセット
を含むことを特徴とする標識キットに関する。

【００５１】本発明は、上記のプローブまたは上記のプローブのセットならびに上記のフィ
ルターおよび組合せ発蛍光団を含むことを特徴とする多色FISH診断キットに関す
る。

【００５２】本明細書において何度か参考にされるまたは参考にされるであろうFISHまたは
マルチFISH技術については、Speicherら、1996；Shrockら、1996に詳細に記載さ
れている。

【００５３】本発明の他の特徴および利点については、以下の実施例で述べるであろう。

【００５４】本明細書に記載される発蛍光団および光学フィルターの組み合わせを、蛍光顕
微鏡に関与する複数の技術において使用することができる。本明細書に記載され
る発蛍光団を使用して多くの分子または構造を標識することができる。ここに挙
げるものがすべてではないが、前記発蛍光団を使用して、ポリペプチド、抗体、
核酸、リン脂質、脂肪酸、ステロール誘導体、膜、オルガネラおよび他の生物学
的巨大分子を標識することができる。オルガネラはミトコンドリア、小胞体、ゴ
ルジ装置およびリソソームであってもよい。

【００５５】本発明の発蛍光団および光学フィルターの組み合わせを使用してFISHを行うこ
とができる。特に、これによりいくつかのプローブを同時に使用することができ
る。この組み合わせを使用して、細胞形態学、細胞骨格、細胞受容体、イオンチ
ャンネル、神経伝達物質、液体の循環、膜流動性、細胞生存率および増殖、アポ
トーシス、飲作用、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、エネルギー
変換、pHならびにイオン濃度（例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウムお
よび亜鉛濃度）などの多くの局面を研究することができる（Richard P Haugland
、1996、Molicular Probes、MTZ Spend編）。これにより発現および翻訳の研究
が可能であり得る。

【００５６】従って、本発明はまた、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas
Red（Texas Red に対してTR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シア
ニン5.5（Cy5.5）、シアニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される組合せ
発蛍光団に関する。

【００５７】好ましくは、組合せ発蛍光団は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）
、Texas Red（Texas Red に対してTR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5
）、シアニン5.5（Cy5.5）、シアニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択され
る少なくとも２、３、４、５、６または７つ発蛍光団を含む。

【００５８】本発明の好ましい組合せ発蛍光団は、次の５つの発蛍光団：フルオレセインイ
ソチオシアネート（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５
（Cy5）およびシアニン７（Cy7）を含む。

【００５９】本発明の発蛍光団のもう１つの好ましい組み合わせは、次の６つの発蛍光団：
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（C
y3）、Bodipy 630/650、シアニン５（Cy5）およびシアニン７（Cy7）を含む。

【００６０】本発明の発蛍光団のもう１つの好ましい組み合わせは、次の６つの発蛍光団：
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（C
y3）、Bodipy 630/650およびシアニン５（Cy5）を含む。

【００６１】本発明の組合せ発蛍光団は、多色FISH診断キットに含まれ得る。

【００６２】本発明の組合せ発蛍光団を使用して、ポリペプチド、抗体、核酸、リン脂質、
脂肪酸、ステロール誘導体、膜、オルガネラおよび生物学的巨大分子から選択さ
れる物質を標識することができる。

【００６３】さらに、本発明は、ａ．490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた494 nmの最大吸収波長および517
nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ．546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた554 nmの最大吸収波長および568
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ．590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた593 nmの最大吸収波長および613
nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ．650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた652 nmの最大吸収波長および670
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ．740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた743 nmの最大吸収波長および767
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ．680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた675 nmの最大吸収波長および694
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ．630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた632 nmの最大吸収波長および658
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される一対の光学フィルターと組み合わされる組合せ発蛍光団に関する
。

【００６４】好ましくは、一対の光学フィルターと組み合わされる組合せ発蛍光団は、ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた494 nmの最大吸収波長および517
nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた554 nmの最大吸収波長および568
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた593 nmの最大吸収波長および613
nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた652 nmの最大吸収波長および670
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた743 nmの最大吸収波長および767
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた675 nmの最大吸収波長および694
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた632 nmの最大吸収波長および658
nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される、少なくとも１、２、３、４、５、６または７つの発蛍光団およ
びフィルターを含む。

【００６５】本発明の光学フィルターの対と組み合わされる組合せ発蛍光団は、多色FISH診
断キットに含まれ得る。

【００６６】本発明による一対の光学フィルターと組み合わされる組合せ発蛍光団を使用し
て、ポリペプチド、抗体、核酸、リン脂質、脂肪酸、ステロール誘導体、膜、オ
ルガネラおよび生物学的巨大分子から選択される物質を標識することができる。

【００６７】本発明のプローブおよび組合せ発蛍光団は、任意のタイプの顕微鏡（モノクロ
メーター、レーザー、蛍光顕微鏡）と共に使用することができる。本発明は、蛍
光顕微鏡を使用するのが好ましい。

【００６８】様々な刊行物および特許が本明細書において引用されている。本出願において
参考文献によって確認される刊行物および特許に含まれる開示内容は、本発明の
内容をさらに詳細に説明するために参考として本出願に援用される。

【００６９】（実施例）（１．プローブの調製）様々なヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッド株（NIGMS Human genetic Mutant C
ell Repository、Coriell Institute for Medical Research、Camdem）（表１）
をPCRのテンプレートして使用した。

【００７０】

【表１】

【００７１】プライマーSR1（Aluコンセンサス配列、241位〜261位：5' CCACTGCACTCCAGCCT
GGG 3'（配列番号１）（Romanaら、1993）の3'末端に配置される）のみの存在下
またはプライマーSR1およびプライマーL1H：5' CATGGCACATGTATACATATGTAAC(A/T
)AACC 3'（配列番号２および３）（Ledbetterら、1990）の存在下のいずれかでP
CRを行った。PCRにおいてプライマーSR1を使用した場合、標識し、中期において
プローブとして使用した増幅産物を、Ｒ型バンドプロフィールを有するほぼ完全
な対応する染色体（動原体領域を除く）として染色した（他のタイプのAluプラ
イマーと共にLichterら、1990により記載されている）。しかし、陰性Ｒバンド
の表示を有するために、２つのプライマー：SR1およびL1を組み入れることによ
ってもPCRを行った。この様に２つの増幅産物（SR1およびSR1/L1）を混合して、
プローブとして使用した場合、陰性Ｒバンドを染色して、テロメア領域を完全に
限定した。

【００７２】（PCR条件） PCR反応は、500 ngのゲノムDNA（体細胞ハイブリッド）、１μMの各オリゴヌ
クレオチド（１μM SR1、または１μM SR1および１μM L1Hのいずれか）、10 mM
Tris-HCl、50 mM KCl、2.5 mM MgCl₂、0.01％ゼラチン、250μMの各デオキシヌ
クレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）ならびに2.5 UのThermophilus
aquaticus DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer-Cetus）を含有する50μlの最終容積
で行った。最初の変性を96℃で６分間行い、続いて94℃で１分間の変性、63℃で
１分間のアニーリング、72℃で10分間の伸長のサイクルを30回行った。サイクル
の終了時に、最後の伸長を72℃で10分間行った。

【００７３】２つの増幅産物（SR1およびSR1/L1H）を混合し、次いでエタノールで沈殿させ
た。DNAペレットを20μlの水中に取り、1.3％アガロースゲル上でDNAの濃度を見
積もった。

【００７４】（「ニックトランスレーション」によるプローブの標識） 15μgのPCR産物の混合物を１回のニックトランスレーション中に標識すること
ができた。20μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTP）、10
μMのdTTPおよび10μMの修飾dUTP、50 mM Tris-HCl、５μM MgCl₂、１μMのβメ
ルカプトエタノールならびに20 Uの酵素混合物（Dnase/Polymerase：Boehringer
-Mannheim）を含有する500μlの最終容積で反応を行った。蛍光においてプロー
ブを直接的に標識するための修飾ヌクレオチドはdUTP-12-FITC（Boehringer-Man
nheim）またはdUTP-12-Texas Red（Molecular Probes）またはdUTP-Cy3（Amersh
am）またはdUTP-Cy5（Amersham）のいずれかであった。一方、間接的標識のため
には、dUTP-16-ビオチン化（Boehringer-Mannheim）を使用した。標識は、Eppen
dorfチューブ（２ml）内で１晩、15〜16℃で行った。次いで、遊離のヌクレオチ
ドをエタノールによるプローブの沈殿により除去した。DNAペレットを500μlのT
E 10：１（10 mM Tris-HCl、１mM EDTA、pH８）に取り、プローブを約30 ng/μl
の濃度であるようにした。

【００７５】（23染色体ペイントプローブの混合物の組成）染色体に特異的なそれぞれのプローブを様々な修飾dUTP（蛍光またはそれ以外
）で個々に標識した。各染色体のＲおよびＧバンドの豊富さに依存し、そしてそ
れらのサイズに依存して、異なる蛍光色素を有するかまたはそれらから成るもの
を理論的に確立した。例えば、Ｒバンドが豊富な染色体（例えば第19染色体）の
場合には、３または４つの蛍光色素の組み合わせを使用するのが好ましく、一方
、Ｒバンドが低い染色体の場合には僅か１または２つの蛍光色素を使用するのが
好ましかった（第８染色体）。この選択はまた、それぞれの蛍光色素について励
起および発光フィルターの組み合わせに基づいていた。プローブを異なる蛍光色
素で等価な割合で標識した場合、確かに異なる蛍光色素に対するシグナルの強度
は比較可能である必要はない。それは、それぞれの蛍光色素について励起および
発光フィルターの質に依存し、また蛍光色素により放射される蛍光の量に既存す
る。後者自体は励起光束の強度に依存し、従って光源（Mercury Lamp HBO 100 W
- OSRAM）のスペクトル出力に依存する。発光時にそれぞれの蛍光色素について
最も良好なシグナル／バックグランドノイズ比を得るためには、これらのすべて
のパラメータを、フィルターの組み合わせの分解能を最適にするように選択する
のが好ましかった。一方、確かに、カメラ（Hamamatsu C4880）による画像の獲
得中の露出時間を増減するだけではなく、使用する蛍光マーカーに依存するプロ
ーブの濃度を変更することによって、蛍光強度の差異を補整することができる。
最後に、所定の蛍光色素（従って所定のフィルターの組み合わせ）についてすべ
ての標識された染色体が等価な強度の蛍光を放出するようにプローブの濃度を調
整した。

【００７６】従って、23染色体ペイントプローブの組成は、多くの比較実験後に経験的およ
び正確に規定される（表２）。

【００７７】 400μg（約27倍）のCot1 DNA（ヒト競争者のDNA）をこれらの1470 ngの染色体
プローブの混合物（50の異なるプローブ）に添加した。次いで、DNA混合物をエ
タノールで沈殿させた。ペレットを10μlのハイブリダイゼーション混合物（50
％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、2×SSC（pH７）、１μg/μlの音波処
理ニシン精子DNA）中に取った。

【００７８】

【表２】

【００７９】（プローブ調製の別法）代替的に、それぞれの蛍光色素（表３）についてのニックトランスレーション
によるプローブの標識の前に、プローブの混合物の調製を行った。以下のプロト
コルに従い、修飾ヌクレオチドの助けによるニックトランスレーションによって
標識したプローブの５つの混合物を得た。

【００８０】 20μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dGTP、dCTP）、10μMのdTTP
および10μMの修飾dUTP、50 mM Tris-HCl、５μM MgCl₂、１μMのβメルカプト
エタノールならびに20 Uの酵素混合物（Dnase/Polymerase：Boehringer-Mannhei
m）を含有する500μlの最終容積中、ニックトランスレーションによって１〜２
μgのプローブ混合物を標識した。蛍光においてプローブを直接的に標識するた
めの修飾ヌクレオチドはdUTP-12-FITC（Boehringer-Mannheim）またはdUTP-12-T
exas Red（Molecular Probes）またはdUTP-Cy3（Amersham）またはdUTP-Cy5（Am
ersham）であった。一方、間接的標識のためには、dUTP-16-ビオチン化（Boehri
nger-Mannheim）を使用した。標識は、Eppendorfチューブ（２ml）内で１晩、15
〜16℃で行った。

【００８１】標識後、染色体プローブの５つの混合物（14.75μg）を、400μg（約27倍）の
Cot1 DNA（ヒト競争者のDNA）の存在下で（エタノールにより）共沈殿させた。
ペレットを10μlのハイブリダイゼーション混合物（50％ホルムアミド、10％硫
酸デキストラン、2×SSC（pH７）、１μg/μlの音波処理ニシン精子DNA）中に取
った。

【００８２】この標識の別法は、ニックトランスレーションによる標識の数を５０ではなく
５に減らし、２つではなく１つのプローブ混合物を調製することによって、プロ
ーブを調製するためのプロトコルの煩雑さを減らし、簡単にするという利点を有
する。

【００８３】（２．蛍光in situハイブリダイゼーション）手順はCherifら、1990に記載されているものであり、これに若干の変更を加え
た。

【００８４】（中期における染色体の調製）正常被験体の静脈穿刺により得られる循環リンパ球の培養から始めて、中期染
色体の調製を行った。フィトヘマグルチニン（PHA）（８mlの培養物あたり100μ
l）で刺激したリンパ球を、RPMI-1640培地中、37℃で72時間培養した。次いで、
メトトレキセート（10μM）を17時間添加することによって、細胞を同調させ、
次いで濯ぎ、5-ブロモデオキシウリジン（BrdU）（0.1 mM）の存在下で6時間再
培養した。15分間のコルヒチン（１mg/ml）の作用後、低張KCl溶液（75 mM）に
再懸濁することによって、細胞破砕物を得た。染色体をメタノール／酢酸混合物
（３容積／１容積）中に固定化し、１〜２滴の細胞懸濁液を各スライド上に広げ
た。スライドを室温で２〜３日間乾燥し、次いで-20℃で数ヶ月間保存した。

【００８５】

【表３】

【００８６】（スライドの調製）スライドを37℃で１時間RNase（100μg/ml）で処置し、次いで、２×SSC溶液
で３回（それぞれ５分間）濯いだ。次いで、上昇濃度（70％、80％、90％および
100％ならびに各浴につき2分間）のエタノール浴の系列に連続的に通過させるこ
とによってスライドを脱水し、乾燥した。スライドを70％ホルムアルデヒド／2
×SSC浴（pH７）中に70℃で2分間浸すことによって、染色体DNAを変性した。ス
ライドを、-20℃まで冷却した70％エタノールに浸す（２分間）ことによって変
性を中止し、氷浴中に保った。次いで、スライドを上昇濃度のエタノール浴の系
列に連続的に通過させることによって脱水し、乾燥した。次いで、スライドを、
プロテイナーゼＫ（100 ng/ml）を含有する溶液（20 mM Tris-HCl、pH 7.4、２m
M CaCl₂）37℃で８〜10分間インキュベートし、次いでエタノール系列中で脱水
し、乾燥した。

【００８７】（ハイブリダイゼーションおよびシグナルの検出）プローブおよび競争者DNA（10μl）の混合物を70℃で10分間変性し、次いで、
氷中に浸し、37℃で少なくとも３時間プリハイブリダイズさせた。次いで、この
混合物をスライド上に置き、カバーガラス（18×22 mm）で覆った。湿式チャン
バ中、37℃で２〜３日間、ハイブリダイゼーションを行った。

【００８８】次いで、スライドを、50％ホルムアミド、２×SSC、pH７の３つの浴の系列（
各３分間）中、42〜45℃の温度で洗浄し、続いて、２×SSC、pH７（各２分間）
中で５回、続いて、１×BN溶液（0.1 M重炭酸ナトリウム、0.05％nonidet P-40
）中で１分間洗浄した。シアニン７（Amersham）に結合したアビジン（Vector L
aboratories Biosys）（アビジン−Cy7）（５μg/ml）を添加することによって
、ビオチン化プローブを検出した。アビジンのシアニン７への結合は、カップリ
ングキット（Amersham）を用いて行った。アビジンの非特異的結合に伴うバック
グランドノイズの問題を低減するために、５％脱脂乳粉を含有する１×BN溶液中
で予め10分間インキュベートした。次いで、スライドを、アビジン−Cy7を含有
する溶液（５μg/ml１×BN＋５％脱脂乳粉）中37℃で１／２時間インキュベート
し、次いで、１×BN溶液中、45℃で連続的に３回（２分間）洗浄した。Pinkelら
、1986により記載のプロトコルに従い、ビオチン化抗アビジン抗体の層（５μl/
ml）（Vector laboratories、Biosys France）を添加し、続いてアビジン−Cy7
（５μl/ml）の層を添加することによって蛍光シグナルを増幅した。それぞれの
層について、スライドを37℃で30分間インキュベートし、そして１×BN溶液で３
回洗浄した。dUTP-FITC、dUTP-TR、dUTP-Cy3およびdUTP-Cy5で標識されたプロー
ブは、さらなる表示工程を必要としなかった。

【００８９】スライドを、上記のフィルターの組み合わせを備えた外蛍光（epifluorescenc
e）顕微鏡写真機（DMRX B、LEICA）の助けにより検査した。２つの独立したホイ
ールを使用して、８つのフィルターをそれぞれ担持した。Hgランプおよび励起フ
ィルターを担持するホイールを対物レンズおよび光束分離フィルターの上部に配
置した直後、励起フィルターを担持するホイールを挿入した。画像を獲得する前
に、20μlのフェード防止溶液（Johnsonら、1981）を各スライド上に置き、カバ
ーガラスで覆った（フェード防止溶液：10 mlのPBSおよび90 mlのグリセロール
から成る溶液中の100 mgのPPD（p-フェニルエチレンジアミン、Sigma）；0.1 M
NaOHで溶液のpHを8.0に調整した）。フェード防止溶液により、蛍光式を強力な
照射に供する場合に、異なる蛍光色素により放射される蛍光の迅速な消光を回避
することができる。

【００９０】（３．６つの組合せ発蛍光団の使用例）シアニン７は比較的不安定な蛍光色素であるため、もう１つの蛍光色素、例え
ば、Bodipy 630/650（Molecular Probes）と置き換える努力が行われた。抗体ま
たはアビジンの分子に結合させたBodipyは、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはジ
ニトロフェノール（DNP）で標識したプローブを間接的に表示することが可能で
ある。この場合、シアニン５およびBodipy 630/650の吸収および発光スペクトル
は非常に近すぎてこれらの２つの蛍光色素を良好に識別することができないため
、マルチ蛍光のための５つの蛍光色素の選択を同じように行うことはできない。
選択は以下のようにする：フルオレセインイソチオシアネート（FITC） Texas Red（TR）シアニン３（Cy3） Bodipy 630/650 シアニン5.5（Cy5.5）。

【００９１】この選択はまた、必要であれば（例えば、コンビナトリアルプローブ標識を行
うことができないアプリケーション、および最大の異なる蛍光色素を識別するこ
とができる異なるプローブを有することが利点であるアプリケーションの場合）
第６の蛍光色素としてシアニン７を使用することができるという利点を有する。

【００９２】この場合、Cy5.5はまた、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくはDNPで標識された
プローブを表示可能であるためには、抗体またはアビジンの分子に結合されるべ
きである。

【００９３】例えば、マルチ蛍光核型のためのプローブを標識および表示する異なる系とし
ては、以下のものがあろう。

【００９４】

【表４】

【００９５】６つの蛍光色素の使用を同時に所望する場合、以下の選択がある。

【００９６】

【表５】

【００９７】本発明の好ましい実施態様について例示および記載してきたが、本発明の趣旨
および範囲を逸脱することなく当業者は多くの変更を加えることができることを
考慮すべきである。

【００９８】参考文献 Cherif D., Julier C., Delattre O., Derre J., Lathrop GM., Berger R., (
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【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月６日（２０００．１１．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 DA12 DA13 FA25 FA26 FA29 FB07 FB12 GC15 2G054 CA22 CE02 EA03 4B024 AA11 BA80 CA01 CA09 CA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QS03 QS25 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の染色体バンドにおいてより多く表示され、AluおよびL
INE DNA配列に特異的なプライマーの助けにより該染色体からIRS-PCR増幅によっ
て得られるDNAセグメントのセットから成ることを特徴とする、染色体を標識す
るためのプローブ。
【請求項２】 IRS-PCRによって増幅される前記DNAセグメントは、供給源と
してモノ染色体性のげっ歯類−ヒト体細胞ハイブリッドを有することを特徴とす
る、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】前記プローブはヒト染色体に特異的であることを特徴とする
、請求項１および２のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項４】前記DNAセグメントは、１つのタイプの細胞遺伝的バンドに
おいてより多く表示されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記
載のプローブ。
【請求項５】前記DNAセグメントはＲバンドにおいてより多く表示される
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項６】使用される特異的プライマーは、 Alu DNA配列に特異的なプライマーについては配列番号１、 LINE DNA配列に特異的なプライマーについては配列番号２および３、の配列を含むかまたは前記配列を有するプライマーであることを特徴とする、請
求項１〜５のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項７】前記プローブは、 Alu DNA配列に特異的なプライマーを用いて得られるPCR増幅産物、 Alu DNA配列に特異的なプライマーおよびLINE DNA配列に特異的なプライマー
を用いて得られるPCR増幅産物、から成る２つのIRS-PCR増幅産物の混合物から誘導されることを特徴とする、請
求項１〜６のいずれか１項に記載のプローブ。
【請求項８】前記DNAセグメントは、蛍光技法により直接的または間接的
に標識されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプローブ
。
【請求項９】前記DNAセグメントは、フルオレセインイソチオシアネート
（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニ
ン5.5（Cy5.5）、シアニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なくと
も１つの発蛍光団で標識されることを特徴とする、請求項８に記載のDNAプロー
ブ。
【請求項１０】ヒト染色体の各々またはヒト染色体のいくつかに対する請
求項１〜９のいずれか１項に記載のプローブを含有することを特徴とする、ヒト
染色体を標識するためのプローブのセット。
【請求項１１】一方ではAluおよびLINE DNA配列に特異的なPCRプライマー
、他方ではAlu DNA配列に特異的なPCRプライマーを使用して、ヒト染色体から２
つのIRS-PCR増幅により得られる２つの増幅産物の混合を含むことを特徴とする
、ヒト染色体を標識するためのプローブの製造方法。
【請求項１２】請求項１１に記載の方法によって得られるヒト染色体を標
識するためのプローブ。
【請求項１３】下記方法の実施のために請求項１〜９のいずれか１項もし
くは請求項１２に記載のプローブまたは請求項１０に記載のプローブのセットを
使用することを特徴とする、多色FISH法。
【請求項１４】前記DNAプローブは発蛍光団で標識され、特定の吸収および
発光波長を有するそれぞれの発蛍光団は吸収用に１つと発光用に１つの１対の光
学フィルターと組み合わされ、以下の群：ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、494 nmの最大吸収波長および51
7 nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、554 nmの最大吸収波長および56
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、593 nmの最大吸収波長および61
3 nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、652 nmの最大吸収波長および67
0 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、743 nmの最大吸収波長および76
7 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、675 nmの最大吸収波長および69
4 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、632 nmの最大吸収波長および65
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される発蛍光団およびフィルター対を使用することを特徴とする、請求
項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記光学フィルターは以下の特性：６空洞型であること、０°のADIを有すること、 λ₀±20％のFWHMの許容度を有すること、 FWHMの±20％のFWHMに対する許容度を有すること、 1200 nmにおいてUVのOD5通過阻止帯域を有すること、 λ₀においてＴ≧50％の透過曲線を有すること、を示すことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】前記光学フィルターは、さらに以下の特徴： 21 mmを超える中心有効直径を有すること、７mm以下の厚さを有すること、を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記プローブは、核型および染色体再配列の核型の研究の
ために使用されることを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の
方法。
【請求項１８】請求項１〜９もしくは１２に記載のDNAプローブの少なく
とも１つまたは請求項１０に記載のプローブのセットを含むことを特徴とする、
診断キット。
【請求項１９】前記DNAプローブは発蛍光団で標識され、特定の吸収およ
び発光波長を有するそれぞれの発蛍光団は吸収用に１つと発光用に１つの１対の
光学フィルターと組み合わされ、以下の群：ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならびに530DF30型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、494 nmの最大吸収波長および51
7 nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、554 nmの最大吸収波長および56
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、593 nmの最大吸収波長および61
3 nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、652 nmの最大吸収波長および67
0 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、743 nmの最大吸収波長および76
7 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、675 nmの最大吸収波長および69
4 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、632 nmの最大吸収波長および65
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される発蛍光団およびフィルター対を使用することを特徴とする、請求
項１８に記載のキット。
【請求項２０】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red
（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニン5.5（Cy5.5）、シア
ニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なくとも３つの発蛍光団を含
むことを特徴とする、組合せ発蛍光団。
【請求項２１】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red
（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニン5.5（Cy5.5）、シア
ニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なくとも４つの発蛍光団を含
むことを特徴とする、請求項２０に記載の組合せ発蛍光団。
【請求項２２】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red
（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニン5.5（Cy5.5）、シア
ニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なくとも５つの発蛍光団を含
むことを特徴とする、請求項２０に記載の組合せ発蛍光団。
【請求項２３】フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Texas Red
（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニン5.5（Cy5.5）、シア
ニン７（Cy7）、Bodipy 630/650から選択される少なくとも６つの発蛍光団を含
むことを特徴とする、請求項２０に記載の組合せ発蛍光団。
【請求項２４】次の５つの発蛍光団：フルオレセインイソチオシアネート
（FITC）、Texas Red（TR）、シアニン３（Cy3）、シアニン５（Cy5）、シアニ
ン７（Cy7）を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の組合せ発蛍光団。
【請求項２５】ａ）490DF30型（Omega Optical）の励起フィルターならび
に530DF30型（Omega Optical）の発光フィルターと組み合わされた、494 nmの最
大吸収波長および517 nmの最大発光波長を有する発蛍光団FITC、ｂ）546DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに570DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、554 nmの最大吸収波長および56
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy3、ｃ）590DF10型（Omega Optical）の励起フィルターならびに615DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、593 nmの最大吸収波長および61
3 nmの最大発光波長を有する発蛍光団TR、ｄ）650DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに670DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、652 nmの最大吸収波長および67
0 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5、ｅ）740DF25型（Omega Optical）の励起フィルターならびに780EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、743 nmの最大吸収波長および76
7 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy7、ｆ）680DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに700EFLP型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、675 nmの最大吸収波長および69
4 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Cy5.5、ｇ）630DF20型（Omega Optical）の励起フィルターならびに650DF10型（Omega
Optical）の発光フィルターと組み合わされた、632 nmの最大吸収波長および65
8 nmの最大発光波長を有する発蛍光団Bodipy 630/650、から選択される光学フィルターの対と組み合わされた、少なくとも１つの発蛍光
団を含むことを特徴とする、１対の光学フィルターと組み合わされた組合せ発蛍
光団。
【請求項２６】多色FISH診断キットに含まれることを特徴とする、請求項
２０〜２５のいずれか１項に記載の組合せ発蛍光団。
【請求項２７】ポリペプチド、抗体、核酸、リン脂質、脂肪酸、ステロー
ル誘導体、膜、オルガネラおよび生物学的巨大分子から選択される物質を標識す
るために使用されることを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載
の組合せ発蛍光団。