JP2002524086A - ルシフェラーゼアッセイ、それに関連して使用するための組成物及びキット - Google Patents
ルシフェラーゼアッセイ、それに関連して使用するための組成物及びキットInfo
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
Abstract
(57)【要約】
生物学的サンプル中のルシフェラーゼの存在を求めるアッセイは、高められた感度、信号強さ及び持続性を提供する。アッセイは、５０fgのルシフェラーゼにまで感度を示す。生物学的サンプルは、不可欠な成分であるルシフェリン、ＡＤＰ、ミオキナーゼ及びＭｇ++と合わされる。ミオキナーゼがＡＤＰを、ルシフェラーゼ反応に必要なＡＴＰと、反応速度を遅らせるＡＭＰとに転換する。得られるアッセイは、自動化に適応することを可能にする持続的な発光を示す。
Description
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、アッセイにおけるレポータ分子又は標的分子としてのルシフェラー
ゼの存在を検出するためのアッセイフォーマットに関する。アッセイは、宿主細
胞中にレポータ遺伝子としてトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子の発
現産物として生物学的流体中に存在するルシフェラーゼを検出するためのアッセ
イで特に価値がある。さらには、アッセイ法に有用である組成物及びアッセイを
実施するためのキットを取り扱う。
ゼの存在を検出するためのアッセイフォーマットに関する。アッセイは、宿主細
胞中にレポータ遺伝子としてトランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子の発
現産物として生物学的流体中に存在するルシフェラーゼを検出するためのアッセ
イで特に価値がある。さらには、アッセイ法に有用である組成物及びアッセイを
実施するためのキットを取り扱う。
【０００２】 従来技術の背景 ルシフェラーゼを酵素として使用して生物学的系又はサンプル中のＡＴＰの存
在を示す化学発光アッセイが文献に広く記載されている。ルシフェラーゼは、以
下の反応系にしたがって化学発光的光放出を触媒する。
在を示す化学発光アッセイが文献に広く記載されている。ルシフェラーゼは、以
下の反応系にしたがって化学発光的光放出を触媒する。
【０００３】 １）ルシフェラーゼ＋ルシフェリン＋ＡＴＰ＋Ｍｇ++←→ルシフェラーゼ−ルシ
フェリン−ＡＭＰ＋ＰＰｉ ２）ルシフェラーゼ−ルシフェリン−ＡＭＰ＋Ｏ2→オキシルシフェリン＋ＡＭ
Ｐ＋ＣＯ2＋光（５６２nm）
フェリン−ＡＭＰ＋ＰＰｉ ２）ルシフェラーゼ−ルシフェリン−ＡＭＰ＋Ｏ2→オキシルシフェリン＋ＡＭ
Ｐ＋ＣＯ2＋光（５６２nm）
【０００４】 多様なルシフェラーゼ酵素が同定されており、ＡＴＰを使用する同様な反応を
触媒するすべてを本出願の発明とともに使用することができるが、最高の特性を
有するルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、すなわち、この他ならぬ甲虫
（P. pyralis）に特徴的な閃光を司る酵素である。このルシフェラーゼは、上記
光放出を０．８８の量子収率で触媒する６１〜６２kDの単量体酵素である。pH７
．８で自然に放出される光は、緑黄色の光（約５６２nm）である。
触媒するすべてを本出願の発明とともに使用することができるが、最高の特性を
有するルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ、すなわち、この他ならぬ甲虫
（P. pyralis）に特徴的な閃光を司る酵素である。このルシフェラーゼは、上記
光放出を０．８８の量子収率で触媒する６１〜６２kDの単量体酵素である。pH７
．８で自然に放出される光は、緑黄色の光（約５６２nm）である。
【０００５】 ルシフェラーゼ酵素の量化のためのルシフェラーゼアッセイが、Woodの米国特
許第５，６５２，２８９号及び第５，２８３，１７９号に記載されている。ルシ
フェラーゼアッセイを開発する際に遭遇する周知の難題は、非常に急速なピーク
光度、すなわち「閃光」を、非常に低いレベルまでの急速な減衰とともに生じさ
せる酵素反応速度であり、これらの特許で広範に論じられている。これらの特許
はまた、補酵素Ａ（ＣｏＡ）及び／又はスルフヒドリル化合物、たとえばジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）を添加してより大きな全体的光放出を支援することを含
め、この問題を解決するための従来技術の試みを取り扱う。
許第５，６５２，２８９号及び第５，２８３，１７９号に記載されている。ルシ
フェラーゼアッセイを開発する際に遭遇する周知の難題は、非常に急速なピーク
光度、すなわち「閃光」を、非常に低いレベルまでの急速な減衰とともに生じさ
せる酵素反応速度であり、これらの特許で広範に論じられている。これらの特許
はまた、補酵素Ａ（ＣｏＡ）及び／又はスルフヒドリル化合物、たとえばジチオ
トレイトール（ＤＴＴ）を添加してより大きな全体的光放出を支援することを含
め、この問題を解決するための従来技術の試みを取り扱う。
【０００６】 ルシフェラーゼアッセイならびにピーク光度及び全光放出の両方を増大する方
法に関して多様な文献が展開されている。研究されている種々の代替方法の中に
は、特定の溶媒の選択、Kricka. et al., Arch. Biochemistry and Biophysics
217, 674-681（1982）、他のＳＨ化合物、たとえばＮ−アセチルシステイン、Lu
ndin, Bioluminescence and Chemiluminescenceならびにヒ酸ナトリウム及び他
の塩の添加、DeLuca et al., Analytical Biochemistry 95, 194-198（1978）が
ある。
法に関して多様な文献が展開されている。研究されている種々の代替方法の中に
は、特定の溶媒の選択、Kricka. et al., Arch. Biochemistry and Biophysics
217, 674-681（1982）、他のＳＨ化合物、たとえばＮ−アセチルシステイン、Lu
ndin, Bioluminescence and Chemiluminescenceならびにヒ酸ナトリウム及び他
の塩の添加、DeLuca et al., Analytical Biochemistry 95, 194-198（1978）が
ある。
【０００７】 これらの配合物を使用してピコモル濃度しかない標的分子を検出する特定のア
ッセイが、Olsson. et al., Journal of Applied Biochemistry 5, 437-445(198
3)、Kimmich. et al., Analytical Biochemistry 69, 187-206(1975)、Brovko.
et al., Analytical Biochemistry 220, 410-414(1994)、Momsen, Biochemical
and Biophysical Research Communications 84, 816-822(1978)及びHolmsen. et
al., Analytical Biochemistry 46, 489-501(1972）に記載されている。これら
の参考文献の多くは、ルシフェラーゼ反応によってアデニンヌクレオチドを計測
するための、アデニル酸キナーゼとも知られるミオキナーゼの役割を記載してい
る（特に、上記Brovko、Momsen、Olson及びHolmsenを参照）。ミオキナーゼは、
原核細胞及び真核細胞の両方で見られる偏在酵素であり、分子量はその単量体形
で約２１kDaである。ミオキナーゼの重要な特徴は、アデニンヌクレオチドに対
するその高い基質特異性であり、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びＡＴＰと反応性である。ミ
オキナーゼは、両方向反応を触媒する。
ッセイが、Olsson. et al., Journal of Applied Biochemistry 5, 437-445(198
3)、Kimmich. et al., Analytical Biochemistry 69, 187-206(1975)、Brovko.
et al., Analytical Biochemistry 220, 410-414(1994)、Momsen, Biochemical
and Biophysical Research Communications 84, 816-822(1978)及びHolmsen. et
al., Analytical Biochemistry 46, 489-501(1972）に記載されている。これら
の参考文献の多くは、ルシフェラーゼ反応によってアデニンヌクレオチドを計測
するための、アデニル酸キナーゼとも知られるミオキナーゼの役割を記載してい
る（特に、上記Brovko、Momsen、Olson及びHolmsenを参照）。ミオキナーゼは、
原核細胞及び真核細胞の両方で見られる偏在酵素であり、分子量はその単量体形
で約２１kDaである。ミオキナーゼの重要な特徴は、アデニンヌクレオチドに対
するその高い基質特異性であり、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びＡＴＰと反応性である。ミ
オキナーゼは、両方向反応を触媒する。
【０００８】 ＭｇＡＤＰ＋ＡＤＰ←→ＭｇＡＴＰ＋ＡＭＰ
【０００９】 ＡＴＰ及びＭｇ++がルシフェラーゼ化学発光反応を進行させるのに不可欠な成
分であるように、ＡＭＰは、ルシフェラーゼ光生成反応の公知の阻害剤である。
分であるように、ＡＭＰは、ルシフェラーゼ光生成反応の公知の阻害剤である。
【００１０】 Scheirerの米国特許第５，６１８，６８２号は、８時間までの期間にわたって
光放出を提供すると記載されているルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に基づく
ルシフェラーゼアッセイを取り扱っている。このアッセイでは、ルシフェラーゼ
を含有する疑いのあるサンプルを、ルシフェラーゼ基質ルシフェリン、ＡＴＰ、
ＡＭＰ及び触媒活性を促進するための他の補因子と合わせる。この特許に不可欠
であるものは、ルシフェラーゼ触媒反応を支援するためのＡＴＰと、光放出を持
続させるため、酵素反応速度を遅らせるためのＡＭＰとの組み合わせである。
光放出を提供すると記載されているルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に基づく
ルシフェラーゼアッセイを取り扱っている。このアッセイでは、ルシフェラーゼ
を含有する疑いのあるサンプルを、ルシフェラーゼ基質ルシフェリン、ＡＴＰ、
ＡＭＰ及び触媒活性を促進するための他の補因子と合わせる。この特許に不可欠
であるものは、ルシフェラーゼ触媒反応を支援するためのＡＴＰと、光放出を持
続させるため、酵素反応速度を遅らせるためのＡＭＰとの組み合わせである。
【００１１】 Scheirerによって述べられたように、ルシフェラーゼは、従来のＡＴＰ計測環
境の外でのレポータ分子として、ＡＴＰ合成、代謝の指示薬として、又は細菌細
胞の存在の指示薬として重要になった。ルシフェラーゼのための多数の遺伝子が
同定され、トランスフェクトされたとき、異種宿主における発現に効果を示すこ
とが実証されている。したがって、容易な検出、重要には自動化検出を可能にす
るために光放出の光度及び期間を支持することができるならば、組換え細胞候補
におけるルシフェラーゼの存在の検出を多様な環境で使用することができるため
、ルシフェラーゼ遺伝子は重要なレポータ遺伝子となった。
境の外でのレポータ分子として、ＡＴＰ合成、代謝の指示薬として、又は細菌細
胞の存在の指示薬として重要になった。ルシフェラーゼのための多数の遺伝子が
同定され、トランスフェクトされたとき、異種宿主における発現に効果を示すこ
とが実証されている。したがって、容易な検出、重要には自動化検出を可能にす
るために光放出の光度及び期間を支持することができるならば、組換え細胞候補
におけるルシフェラーゼの存在の検出を多様な環境で使用することができるため
、ルシフェラーゼ遺伝子は重要なレポータ遺伝子となった。
【００１２】 したがって、サンプル中の、特に組換え細胞アッセイにおけるレポータ遺伝子
としてのルシフェラーゼの存在の自動化化学発光検出を可能にするのに十分な感
度及び光度を持続的な期間にわたって同時に提供するルシフェラーゼアッセイを
開発することはなおも当業者の目的である。
としてのルシフェラーゼの存在の自動化化学発光検出を可能にするのに十分な感
度及び光度を持続的な期間にわたって同時に提供するルシフェラーゼアッセイを
開発することはなおも当業者の目的である。
【００１３】 発明の概要 上記目的及び以下より完全に展開する他の目的は、ルシフェラーゼ検出の信号
強さを既存の方法よりも増大させ、延長される光放出を考慮して、改善された自
動化検出を達成することができるようにする、ルシフェラーゼの存在に関するア
ッセイによって満たされる。本発明のアッセイは、ＡＭＰを使用して光信号の減
衰を阻止し、初期ＡＴＰチャージを使用してルシフェラーゼ反応を促進する従来
技術の配合物とは対照的に、ルシフェリンに加えてＡＤＰ及びミオキナーゼを使
用する。アッセイ組成物はまた、ルシフェラーゼ及びミオキナーゼ反応に不可欠
な成分であるマグネシウムを含み、有利には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又
は他のスルフヒドリル化合物又は化合物の混合物を使用して、サンプル中に存在
するかもしれないルシフェラーゼの安定性を高める。
強さを既存の方法よりも増大させ、延長される光放出を考慮して、改善された自
動化検出を達成することができるようにする、ルシフェラーゼの存在に関するア
ッセイによって満たされる。本発明のアッセイは、ＡＭＰを使用して光信号の減
衰を阻止し、初期ＡＴＰチャージを使用してルシフェラーゼ反応を促進する従来
技術の配合物とは対照的に、ルシフェリンに加えてＡＤＰ及びミオキナーゼを使
用する。アッセイ組成物はまた、ルシフェラーゼ及びミオキナーゼ反応に不可欠
な成分であるマグネシウムを含み、有利には、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）又
は他のスルフヒドリル化合物又は化合物の混合物を使用して、サンプル中に存在
するかもしれないルシフェラーゼの安定性を高める。
【００１４】 第一の緩衝剤（緩衝剤Ａ）は、不可欠な成分ミオキナーゼを含む。より大きな
信号強さを提供することができる任意の成分は、マグネシウム及びスルフヒドリ
ル還元化合物、たとえばＤＴＴ又はβ−メルカプトエタノールを含む。この緩衝
剤はまた、従来の緩衝剤、たとえばＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕
グリシン（トリシン）又は他の両性イオン緩衝剤、ＥＤＴＡ、他の界面活性剤、
たとえばTriton X-100を含み、支持物質、たとえばグリセロールを含むこともで
きる。
信号強さを提供することができる任意の成分は、マグネシウム及びスルフヒドリ
ル還元化合物、たとえばＤＴＴ又はβ−メルカプトエタノールを含む。この緩衝
剤はまた、従来の緩衝剤、たとえばＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕
グリシン（トリシン）又は他の両性イオン緩衝剤、ＥＤＴＡ、他の界面活性剤、
たとえばTriton X-100を含み、支持物質、たとえばグリセロールを含むこともで
きる。
【００１５】 アッセイを実施する際、２種類の反応緩衝剤を調製し、第二の反応緩衝剤は、
ＡＤＰ及びＤ−ルシフェリンを不可欠な成分として含む。この反応緩衝剤はさら
に、ルシフェラーゼ反応に影響しない従来の安定化成分、たとえばデキストラン
を含むこともできる。
ＡＤＰ及びＤ−ルシフェリンを不可欠な成分として含む。この反応緩衝剤はさら
に、ルシフェラーゼ反応に影響しない従来の安定化成分、たとえばデキストラン
を含むこともできる。
【００１６】 ミオキナーゼ及び場合によっては好ましくはＭｇＳＯ4の形態のマグネシウム
を不可欠な成分として含む緩衝剤Ａは、試験される生物学的サンプル、通常は培
地中の細胞を含む反応容器に加えるが、細胞溶菌調製物もまた、従来どおりに使
用される。その後、緩衝剤Ｂを反応容器に加え、容器を周囲条件で短期間、約１
０分間インキュベートする。その後、容器を発光計測装置、たとえばルミノメー
タ又は他の光検出装置に入れて光度を測定する。代替態様では、２種の反応緩衝
剤を、短期間合わせるか、プレミックスしたのち、生物学的サンプルに加える。
を不可欠な成分として含む緩衝剤Ａは、試験される生物学的サンプル、通常は培
地中の細胞を含む反応容器に加えるが、細胞溶菌調製物もまた、従来どおりに使
用される。その後、緩衝剤Ｂを反応容器に加え、容器を周囲条件で短期間、約１
０分間インキュベートする。その後、容器を発光計測装置、たとえばルミノメー
タ又は他の光検出装置に入れて光度を測定する。代替態様では、２種の反応緩衝
剤を、短期間合わせるか、プレミックスしたのち、生物学的サンプルに加える。
【００１７】 発明の詳細な説明 ミオキナーゼ及びＡＤＰの添加に基づく本発明のルシフェラーゼアッセイは、
従来技術で利用可能なアッセイとは対照的に、放出光度の増大及び持続的な放出
を提供することが実証された。広く使用されているルシフェラーゼアッセイは、
商標LucLiteの下で市販されている。Luc-Screen（商標）と呼ばれる本発明のア
ッセイが、図１でこの市販のルシフェラーゼアッセイと比較されている。広い範
囲の酵素濃度にわたって２種のアッセイの信号／雑音値が提供されている図１に
明白に反映されているように、請求項に係わる発明は、改善された性能を示す。
以下に記載する手順にしたがってこのアッセイを実施し、感度を増大させる。図
２に示すように、このアッセイは、市販のアッセイに比較して信号強さにおいて
約５倍の増大を示す。増大した信号強さは、一般的な培地添加物フェノールレッ
ドを含有するサンプルとでのその使用を許す改善されたアッセイ性能を提供する
。同時に、従来技術で見られる閃光とは違い、アッセイの自動化に好都合である
持続的な発光が長期間持続し、９６個、３８４個又はそれより多いウェルを含む
ことができるマイクロタイタプレートを使用して通常は達成される高い検査処理
能力が得られる。このように、アッセイは、高い信号強さを大きな感度とともに
提供する。このタイプのアッセイでは、本発明のルシフェラーゼアッセイ（Luc-
Screen（商標）と呼ばれる）は、５０フェムトグラムしかないルシフェラーゼ酵
素の検出を可能にする。
従来技術で利用可能なアッセイとは対照的に、放出光度の増大及び持続的な放出
を提供することが実証された。広く使用されているルシフェラーゼアッセイは、
商標LucLiteの下で市販されている。Luc-Screen（商標）と呼ばれる本発明のア
ッセイが、図１でこの市販のルシフェラーゼアッセイと比較されている。広い範
囲の酵素濃度にわたって２種のアッセイの信号／雑音値が提供されている図１に
明白に反映されているように、請求項に係わる発明は、改善された性能を示す。
以下に記載する手順にしたがってこのアッセイを実施し、感度を増大させる。図
２に示すように、このアッセイは、市販のアッセイに比較して信号強さにおいて
約５倍の増大を示す。増大した信号強さは、一般的な培地添加物フェノールレッ
ドを含有するサンプルとでのその使用を許す改善されたアッセイ性能を提供する
。同時に、従来技術で見られる閃光とは違い、アッセイの自動化に好都合である
持続的な発光が長期間持続し、９６個、３８４個又はそれより多いウェルを含む
ことができるマイクロタイタプレートを使用して通常は達成される高い検査処理
能力が得られる。このように、アッセイは、高い信号強さを大きな感度とともに
提供する。このタイプのアッセイでは、本発明のルシフェラーゼアッセイ（Luc-
Screen（商標）と呼ばれる）は、５０フェムトグラムしかないルシフェラーゼ酵
素の検出を可能にする。
【００１８】 アッセイは、２種の反応緩衝剤の使用を要する。反応緩衝剤Ｂは、ＡＤＰ及び
Ｄ−ルシフェリンを不可欠な成分として使用する。ＡＤＰは、反応体ＡＴＰ及び
遅延剤ＡＭＰの究極的な供給源である。ＡＤＰ濃度は、０．２μM〜５０mM、好
ましくは２μM〜１０mMの範囲であり、例では５mMで使用される。Ｄ−ルシフェ
リンは、より少ない量０．２μM〜２mM、好ましくは２μM〜１mM、一例として０
．５mMで存在する。この緩衝剤は、緩衝剤組成物質、たとえばデキストランを含
むことができるが、必ずしも含むわけではない。含まれるならば、０〜１０mg/m
l、好ましくは１〜５mg/ml、一例として２mg/mlの量で含まれる。
Ｄ−ルシフェリンを不可欠な成分として使用する。ＡＤＰは、反応体ＡＴＰ及び
遅延剤ＡＭＰの究極的な供給源である。ＡＤＰ濃度は、０．２μM〜５０mM、好
ましくは２μM〜１０mMの範囲であり、例では５mMで使用される。Ｄ−ルシフェ
リンは、より少ない量０．２μM〜２mM、好ましくは２μM〜１mM、一例として０
．５mMで存在する。この緩衝剤は、緩衝剤組成物質、たとえばデキストランを含
むことができるが、必ずしも含むわけではない。含まれるならば、０〜１０mg/m
l、好ましくは１〜５mg/ml、一例として２mg/mlの量で含まれる。
【００１９】 緩衝剤Ａは、不可欠な成分としてミオキナーゼを含み、トリシン又は当業者に
周知である同様な緩衝剤を含むことができる。反応緩衝剤は、ミオキナーゼを０
．０１〜５０単位／ml含む。
周知である同様な緩衝剤を含むことができる。反応緩衝剤は、ミオキナーゼを０
．０１〜５０単位／ml含む。
【００２０】 ＭｇＳＯ4として存在するマグネシウムは、０〜１００mM、好ましくは０．０
８〜２０mMの範囲の量で存在することができる。値の一例は、ＭｇＳＯ4として
１mMである。
８〜２０mMの範囲の量で存在することができる。値の一例は、ＭｇＳＯ4として
１mMである。
【００２１】 有利には、存在するルシフェラーゼを安定化するため、ＤＴＴ、β−メルカプ
トエタノール又は他の技術的に認められたスルフヒドリル化合物をはじめとする
還元化合物が存在してもよい。ＳＨルシフェラーゼ安定剤は、０〜１００mM、好
ましくは５〜７５mMの広い範囲で、一例として６０mMで存在することができる。
さらなる成分、たとえばＥＤＴＡ及びTriton X-100もまた存在することができる
。場合によってはグリセロールが広い範囲０〜２０％で存在する。反応緩衝剤の
例を以下に記す。
トエタノール又は他の技術的に認められたスルフヒドリル化合物をはじめとする
還元化合物が存在してもよい。ＳＨルシフェラーゼ安定剤は、０〜１００mM、好
ましくは５〜７５mMの広い範囲で、一例として６０mMで存在することができる。
さらなる成分、たとえばＥＤＴＡ及びTriton X-100もまた存在することができる
。場合によってはグリセロールが広い範囲０〜２０％で存在する。反応緩衝剤の
例を以下に記す。
【００２２】
【表１】
【００２３】 多くの細胞培地調製物はフェノールレッドをpH指示薬又はモニタとして含むこ
とに留意すべきである。培地がフェノールレッドを含むとき、フェノールレッド
の存在が通常、信号強さを２〜４倍低下させる。
とに留意すべきである。培地がフェノールレッドを含むとき、フェノールレッド
の存在が通常、信号強さを２〜４倍低下させる。
【００２４】 この反応の信号は通常、ルミノメータ又は同様な感光計器を使用して読みとら
れるが、他の従来計器を使用することもできる。安定した光放出を維持するため
には、アッセイ及び計測段階における温度は、約２５〜２７℃に維持すべきであ
る。
れるが、他の従来計器を使用することもできる。安定した光放出を維持するため
には、アッセイ及び計測段階における温度は、約２５〜２７℃に維持すべきであ
る。
【００２５】 上述したように、アッセイは、培地の存在において細胞中のルシフェラーゼの
存在を検出するように設計される。しかし、必要であるか、望まれるならば、Ｍ
ｇ++０．５〜２mM及びＣａ++１mMを含有するＰＢＳを培地の代わりに使用するこ
ともできる。
存在を検出するように設計される。しかし、必要であるか、望まれるならば、Ｍ
ｇ++０．５〜２mM及びＣａ++１mMを含有するＰＢＳを培地の代わりに使用するこ
ともできる。
【００２６】 標準的な試験プロトコルを以下に記す。
【００２７】 Luc-Screen（商標）アッセイ試験プロトコル １．反応緩衝剤Ａ及びＢを室温まで暖める。 ２．緩衝剤Ａ５０μlを、フェノールレッドを含むか含まない培地１００μl中に
細胞を含有する各ウェルに加える。 ３．緩衝剤Ｂ５０μlを各ウェルに加える（緩衝剤Ａ及びＢの添加の間のタイミ
ングは、アッセイの性能にとって重要ではない）。 ４．マイクロプレートを室温で１０分間インキュベートする。 ５．マイクロプレートをルミノメータに入れ、信号強さを計測する。
細胞を含有する各ウェルに加える。 ３．緩衝剤Ｂ５０μlを各ウェルに加える（緩衝剤Ａ及びＢの添加の間のタイミ
ングは、アッセイの性能にとって重要ではない）。 ４．マイクロプレートを室温で１０分間インキュベートする。 ５．マイクロプレートをルミノメータに入れ、信号強さを計測する。
【００２８】 ルシフェラーゼを検出する際のこのアッセイの有効性は図５に反映されている
。上記プロトコルは、ルシフェラーゼを、P. pyralisルシフェラーゼの遺伝子を
トランスフェクトされたＳＫ−ＮＳＨ細胞とともに、発放出によって検出するた
めに使用される。フェノールレッドの存在でさえ、信号強さは非常に強く、延長
された光放出が自動化を可能にする。図５は、２種の緩衝剤を細胞培地に添加す
る前にプレミックス、すなわち合わせる効果を示す。図示するように、プレミッ
クスは、信号強さを適度に改善するが、アッセイ性能に対して全体的な実質的影
響を及ぼさない。
。上記プロトコルは、ルシフェラーゼを、P. pyralisルシフェラーゼの遺伝子を
トランスフェクトされたＳＫ−ＮＳＨ細胞とともに、発放出によって検出するた
めに使用される。フェノールレッドの存在でさえ、信号強さは非常に強く、延長
された光放出が自動化を可能にする。図５は、２種の緩衝剤を細胞培地に添加す
る前にプレミックス、すなわち合わせる効果を示す。図示するように、プレミッ
クスは、信号強さを適度に改善するが、アッセイ性能に対して全体的な実質的影
響を及ぼさない。
【００２９】 本明細書に記載するアッセイは、高感度であり、強い持続的な信号を生成し、
自動化に適応可能である。系は、主要な市販の系よりも高感度であり、より高い
光信号強さを有し、非自動化変動、たとえば濃度、工程のタイミングなどには比
較的感度が低い。
自動化に適応可能である。系は、主要な市販の系よりも高感度であり、より高い
光信号強さを有し、非自動化変動、たとえば濃度、工程のタイミングなどには比
較的感度が低い。
【００３０】 本発明を一般的に、また具体的な実施態様を参照して上記で説明した。具体的
な実施態様は、限定的であることを意図せず、発明的才を行使するまでもなく、
特に、非決定的な反応緩衝剤含量、濃度、タイミング、温度などの点での変更が
当業者によって察知されよう。そのような変更は、請求の範囲によって別段除外
されない限り、本発明の範囲内にとどまる。
な実施態様は、限定的であることを意図せず、発明的才を行使するまでもなく、
特に、非決定的な反応緩衝剤含量、濃度、タイミング、温度などの点での変更が
当業者によって察知されよう。そのような変更は、請求の範囲によって別段除外
されない限り、本発明の範囲内にとどまる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明アッセイを市販のアッセイLucLite（商標）と比較する。一定範囲の酵
素濃度にわたってアッセイのＳ／Ｎ値を記す。
素濃度にわたってアッセイのＳ／Ｎ値を記す。
【図２】 トランスフェクトしたHela細胞に対して実施した、反応によって達成される反
応速度及び信号強さを市販のアッセイに比較して示す。
応速度及び信号強さを市販のアッセイに比較して示す。
【図３】 一定のルシフェラーゼ濃度を使用して、ミオキナーゼ（緩衝剤Ａ中）の添加量
を変更した効果を相対光単位でグラフに表す。
を変更した効果を相対光単位でグラフに表す。
【図４】 ＭｇＳＯ4（緩衝剤Ａ中）の濃度を変化させた効果を時間的に示す同様なグラ
フを示す。アッセイ中に存在する培地がさらなるＭｇ++を寄与することに留意す
べきである。
フを示す。アッセイ中に存在する培地がさらなるＭｇ++を寄与することに留意す
べきである。
【図５】 細胞培養物（ルシフェラーゼ遺伝子を有するトランスフェクトされたＳＫ−Ｎ
ＳＨ細胞）と組み合わせる前に２種の緩衝剤をプレミックスする効果を示す。
ＳＨ細胞）と組み合わせる前に２種の緩衝剤をプレミックスする効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 オルセン，コリーン・イー・エム アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01730、ベッドフォード、ノース・ロード 81エー (72)発明者 ヴォイタ，ジョン・シー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01776、サッドベリー、メイナード・ファ ーム・ロード 99 (72)発明者 ヤン，ユ−シン アメリカ合衆国、マサチューセッツ 01803、バーリントン、ガンレイ・ドライ ブ 17 Ｆターム(参考） 4B029 AA07 BB16 FA13 4B063 QA01 QQ22 QR07 QR42 QR43 QR46 QR50 QR67 QX02
Claims (16)
- 【請求項１】 生物学的サンプル中のルシフェラーゼの存在を検定する方法
であって、 該サンプルを、ルシフェリン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びミオキナー
ゼを含む反応組成物と合わせることと、 該反応組成物を該生物学的サンプルとともにインキュベートすることと、 該インキュベートした生物学的サンプル及び反応組成物を検査して、光が放出
されているかどうかを決定することとを含み、該光放出が該生物学的サンプル中
のルシフェラーゼの存在を示す方法。 - 【請求項２】 該反応組成物がスルフヒドリルルシフェラーゼ安定剤をさら
に含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該反応組成物がＭｇ++イオンの供給源をさらに含む、請求項
１記載の方法。 - 【請求項４】 該反応組成物がＭｇ++イオンの供給源をさらに含む、請求項
２記載の方法。 - 【請求項５】 該反応組成物が少なくとも１種の緩衝剤を含む、請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】 該反応組成物がデキストラン及びグリセロールの少なくとも
一方を含む、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 該反応組成物が、２種の反応緩衝剤を合わせることによって
形成され、該第一の緩衝剤がミオキナーゼを含み、該第二の緩衝剤がＡＤＰ及び
ルシフェリンを含み、該第一及び第二の反応緩衝剤を合わせて該反応組成物を形
成する、請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 該第一の反応緩衝剤が、Ｍｇ++イオンの供給源及びスルフヒ
ドリル（ＳＨ）ルシフェラーゼ安定化還元性化合物をさらに含む、請求項７記載
の方法。 - 【請求項９】 該ＳＨ化合物が、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタ
ノール又はそれらの混合物である、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 該第一の反応緩衝剤が両性イオン緩衝剤及びグリセロール
を含み、該第二の反応緩衝剤がデキストランを含む、請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】 ミオキナーゼを含む第一の反応緩衝剤と、ＡＤＰ及びルシ
フェリンを含む第二の反応緩衝剤とを含む、ルシフェラーゼアッセイを実施する
ためのキット。 - 【請求項１２】 該第一の反応緩衝剤がマグネシウム塩を含む、請求項１１
記載のキット。 - 【請求項１３】 該第一の反応緩衝剤がＳＨ化合物を含む、請求項１１記載
のキット。 - 【請求項１４】 該第一の反応緩衝剤がＳＨ化合物を含む、請求項１２記載
のキット。 - 【請求項１５】 該第一の反応緩衝剤がグリセロールを含み、該第二の反応
緩衝剤がデキストランを含む、請求項１１記載のキット。 - 【請求項１６】 該第一の反応緩衝剤が両性イオン緩衝剤を含む、請求項１
１記載のキット。
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