JP2002524084A - シアリル化オリゴ糖の精製方法 - Google Patents

シアリル化オリゴ糖の精製方法

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JP2002524084A
JP2002524084A JP2000569004A JP2000569004A JP2002524084A JP 2002524084 A JP2002524084 A JP 2002524084A JP 2000569004 A JP2000569004 A JP 2000569004A JP 2000569004 A JP2000569004 A JP 2000569004A JP 2002524084 A JP2002524084 A JP 2002524084A
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JP2000569004A
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モニカ マリジャ パルシック，
敬子 筋野
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シンソーブ バイオテック， インコーポレイテッド
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

(57)【要約】 α−シアリル化オリゴ糖配糖体の酵素合成方法が開示される。詳細には、開示された方法において、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて、そのＣＭＰヌクレオチド誘導体として用いられるシアル酸のアナログを、非還元糖末端から２番目の糖単位におけるフコシル基を有するオリゴ糖の非還元糖末端へと転移させる。本方法において用いられるシアル酸のアナログおよびオリゴ糖は、用いられるシアリルトランスフェラーゼと適合性であるように選択される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、１９９８年９月３
日に出願された、米国出願第０９／１４６，２８５号の一部継続出願である。
【０００２】 （発明の背景） （１．発明の分野） 本出願は、α−シアリル化オリゴ糖の酵素合成のための方法に関する。詳細に
は、本発明の方法では、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて、その
ＣＭＰ−ヌクレオチドとして用いた、シアル酸またはそのアナログを、オリゴ糖
の非還元末端に転移させる。このオリゴ糖は、このオリゴ糖の非還元糖末端から
２番目の位置にフコシル基を有する。
【０００３】 （２．参考文献） 以下の参考文献は、本出願において、本出願の関連部分にて上付文字として引
用され、そしてその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００４】
【表２】 （３．当該分野の状態） 炭水化物および／またはオリゴ糖は、種々の天然の糖結合体および病理学的な
糖結合体上に存在する1。特に興味深いのは、特に非還元糖末端にシアル酸残基
を含む炭水化物およびオリゴ糖である31。このようなシアル酸で終結した炭水化
物およびオリゴ糖は、部分的には、炭水化物構造によっておよび特異的リガンド
へのそれらの結合によって保有される認識シグナルの概念に基づく、広範な生物
学的現象に関与している多数の産物中に存在する。
【０００５】 詳細には、このようなシアル酸で終結した炭水化物およびオリゴ糖は、トキシ
ン4、ウイルスのような病原因子5の結合についてのレセプターであると考えられ
、そして種々のレクチン、特に細胞接着に関与するレクチン6,7などについての
認識部位であると考えられる。
【０００６】 同様に、シアル酸で終結したオリゴ糖を含む特定のオリゴ糖は、抗原への細胞
媒介免疫応答を抑制し得ると同定されている。このようなオリゴ糖が、抗原に対
する細胞媒介免疫応答を抑制する能力は、Ｖｅｎｏｔらによって記載される3。
【０００７】 さらに、腫瘍関連抗原における、特定のシアリルで終結したオリゴ糖の存在は
、当該分野で実証されており1、そして一般に、このような抗原上に存在するオ
リゴ糖の構造は、腫瘍関連抗原の発現を導くように、通常のオリゴ糖からいくつ
かの方法で修飾されている2。黒色腫患者における、シアリル化されたいくつか
の腫瘍関連抗原（例えば、ガングリオシドＧＤ2、ＧＤ3およびＧＭ2）に対する
モノクローナル抗体を用いての受動免疫治療の見込みが調査されている8,9。
【０００８】 このようなオリゴ糖の合成はしばしば、対応する低い収量での複雑な化学反応
を含む。従って、これらの分子の少なくとも一部を合成する際にグリコシルトラ
ンスフェラーゼを用いることに大きな興味が存在する。
【０００９】 グリコシルトランスフェラーゼは、小胞体およびゴルジ体の高度に多型の群の
膜結合性酵素であり、糖タンパク質および糖脂質のＮ−グリカン（Ａｓｎ−Ｇｌ
ｃＮＡｃ Ｎ−グリコシド結合；ＧｌｃＮＡｃ，Ｎ−アセチルグルコサミン）お
よびＯ−グリカン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ＧａｌＮＡｃ，Ｏ−グリコシド結合；Ｇａ
ｌＮＡｃ，Ｎ−アセチルガラクトサミン）部分の生合成におけるアクセプター糖
のヒドロキシル基へのヌクレオチドドナーからの単一の単糖単位の転移を触媒す
る。
【００１０】 真核生物シアリルトランスフェラーゼは、ＣＭＰ−ＳＡからの、糖結合体のオ
リゴ糖鎖の非還元末端へのＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）、シアル酸
（ＳＡ）の転移を触媒する、グリコシルトランスフェラーゼのファミリーを含む
。シアル酸の付加は、通常、神経細胞接着分子およびガングリオシド上に見出さ
れるポリシアル酸鎖以外についてのオリゴ糖鎖伸長を終結させる。
【００１１】 糖タンパク質および糖脂質のＮ−グリカン誘導体およびＯ−グリカン誘導体の
合成に関与する公知の真核生物シアリルトランスフェラーゼを、Ｐａｌｃｉｃ63 から改作して表１にまとめる。この表では、Ｒは、アクセプターである糖タンパ
ク質、糖脂質またはオリゴ糖鎖の残余部を示す。
【００１２】
【表１】 α２，３−シアリルトランスフェラーゼは、アクセプターの決定のための、な
らびに糖タンパク質の他の定性的調査および定量的調査のための、糖タンパク質
のＮ結合型およびＯ結合型のシアリル誘導体のインビトロでの合成のための有用
な真核生物酵素である。しかし、２，３−シアリルトランスフェラーゼが、糖タ
ンパク質または糖脂質のＮ結合型およびＯ結合型のシアリル誘導体を合成せず、
ここで、アクセプター糖タンパク質または糖脂質は、オリゴ糖の非還元糖末端に
対して２番目の位置にフコシル誘導体を保有したことが以前に報告された（米国
特許第５，３７４，６５５号67）。これは、特定のフコシル化およびシアリル化
オリゴ糖の合成において注意深い計画を必要とし、そしていくつかの場合は、酵
素合成ではなく、化学合成を用いて特定の工程が完了されることを必要とした。
【００１３】 上記を考慮して、オリゴ糖の非還元糖末端に対して２番目の位置にフコシル誘
導体を有するオリゴ糖からのα−シアリル化オリゴ糖の容易な調製方法を開発す
ることが特に有利である。本発明は、これを、α２，３−シアリルトランスフェ
ラーゼを用いて、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体（ドナー糖）として活性化さ
れたシアル酸の、糖部分（アクセプターオリゴ糖）の非還元末端から２番目の位
置にフコシル誘導体を有する糖またはオリゴ糖への効率的なカップリングをもた
らすことによって達成する。
【００１４】 本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸のアナログにより非還元糖末端において
終結した、オリゴ糖、糖タンパク質および糖脂質の合成方法に関する。詳細には
、本発明の方法は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて、それらの
ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体として活性化された、シアル酸またはそのアナログ
を、オリゴ糖アクセプターの非還元末端に転移させる。
【００１５】 従って、その１つの方法の局面では、本発明は、シアル酸またはそのアナログ
を含むα−シアリル化およびフコシル化されたオリゴ糖の酵素合成のための方法
に関する。この方法は、以下の工程： ａ）非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有するフコシル化オ
リゴ糖と適合性のシアリルトランスフェラーゼを選択する工程； ｂ）工程（ａ）において選択されたシアリルトランスフェラーゼと適合性であ
るＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを選択する工程； ｃ）上記ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを、シアル酸またはそのアナロ
グが、ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログからフコシル化オリゴ糖の非還元糖
末端に転移される条件下で上記工程（ａ）において選択されたシアリルトランス
フェラーゼの存在下で以下の式：
【００１６】
【化２】 のフコシル化オリゴ糖と接触させ、それにより、シアル酸またはそのアナログを
含むα−シアリル化フコシル化オリゴ糖を形成する工程であって、ここでＲ1が
糖残基を表し、Ｒ2が糖残基を表し、そしてＲ1およびＲ2が一緒に、選択された
シアリルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎは０〜約１０であり、Ｙ
はＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ3は、Ｈ、タンパク質、
脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン部分からなる群より選
択される、工程を包含する。
【００１７】 本発明はまた、フコシル化およびα−シアリル化されたオリゴ糖の酵素合成の
ための方法に関する。この方法は以下の工程： ａ）非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有するオリゴ糖をシ
アリル化し得るシアリルトランスフェラーゼを選択する工程； ｂ）フコシルトランスフェラーゼを選択する工程； ｃ）工程（ａ）において選択されるシアリルトランスフェラーゼと適合性であ
るＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを選択する工程； ｄ）工程（ｂ）において選択されるフコシルトランスフェラーゼと適合性であ
るＧＤＰ−フコースまたはそのアナログを選択する工程； ｅ）上記ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログおよび上記ＧＤＰ−フコースま
たはそのアナログを、シアル酸またはそのアナログおよびフコースまたはそのア
ナログが、それぞれ、ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログおよびＧＤＰ−フコ
ースまたはそのアナログからオリゴ糖の非還元糖末端に転移される条件下で上記
（ａ）および（ｂ）において選択された上記シアリルトランスフェラーゼおよび
上記フコシルトランスフェラーゼの存在下で式： Ｒ1−Ｒ2−（糖）n−Ｙ−Ｒ3 のオリゴ糖と接触させ、それにより、α−シアリル化フコシル化オリゴ糖を形成
する工程であって、ここでＲ1が糖残基を表し、Ｒ2が糖残基を表し、そしてＲ1
およびＲ2が一緒に、この選択されたシアリルトランスフェラーゼおよびこの選
択されたフコシルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎは０〜約１０で
あり、ＹはＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ3は、Ｈ、タン
パク質、脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン部分からなる
群より選択される、工程、 を包含する。
【００１８】 本発明はまた、未知のオリゴ糖アクセプターの非還元末端構造を決定するため
の方法に関する。この方法は、以下の工程： ａ）オリゴ糖アクセプターと、非還元末端から２番目の糖位置においてフコー
ス基を有するオリゴ糖の非還元末端をシアリル化し得ないシアリルトランスフェ
ラーゼとを接触させ、そしてオリゴ糖がシアリル化されたか否かを決定する工程
； ｂ）オリゴ糖と、非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有する
オリゴ糖の非還元末端をシアリル化し得るシアリルトランスフェラーゼとを接触
させ、そしてこのオリゴ糖がシアリル化されたか否かを決定する工程；および ｃ）結果を比較して、非還元末端がフコシル化されたか否かを決定する工程、
を包含する。未知のアクセプターの第１のアリコートが工程（ａ）においてシア
リル化されておらず、そしてアクセプターの第２のアリコートが工程（ｂ）にお
いてシアリル化されていた場合、このアクセプターは、非還元末端から２番目の
糖位置においてフコシル化されていた。
【００１９】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明は、特定のα２，３−シアリルトランスフェラーゼが、シアル酸の適合
性のアナログを、糖の非還元末端の末端から２番目の位置にフコシル基を有する
、特定のオリゴ糖、糖タンパク質、および糖脂質に対して転移させるという発見
に関する。この発見は、糖の非還元末端から２番目の位置にフコシル基を有する
オリゴ糖からの非還元末端でα−シアリル化されたオリゴ糖の合成を可能にする
。この方法はまた、フコシル化オリゴ糖へのシアル酸の適合性アナログの転移を
可能にする。本発明はまた、アクセプターの構造決定および糖タンパク質および
糖脂質の他の定性的および定量的な調査を可能にする。
【００２０】 しかし、本発明をより詳細に議論する前に、以下の用語をまず定義する。
【００２１】 （Ａ．定義） 本明細書中で使用する場合、以下の用語は以下に示した定義を有する。
【００２２】 用語「シアル酸」とは、５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセ
ロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロピラノシロン酸（「Ｎｅｕ５Ａｃ」）およびＮｅｕ５
Ａｃの天然に存在するアナログ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）
および９−Ｏ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５，９Ａｃ2）を含む）を含む天
然に存在する全ての構造のシアル酸であって、選択されたシアリルトランスフェ
ラーゼと適合性であるものを意味する。今日までに公知の天然に存在するシアル
酸の完全なリストは、Ｓｃｈａｕｅｒ31によって提供される。
【００２３】 特定のα２，３−シアリルトランスフェラーゼによって認識されて、その結果
酵素に結合、次いで適切なアクセプターオリゴ糖構造への転移に利用可能な、天
然に存在するシアル酸は、シアリルトランスフェラーゼと適合性であると呼ばれ
、そして本明細書中では時々、「適合性の天然に存在するシアル酸」と呼ばれる
。
【００２４】 用語「シアル酸のアナログ」とは、１以上の官能基をこのような構造に導入、
改変する、および／またはこのような構造から除去するようにシアル酸単位が化
学的に改変された場合のものを含む、シアル酸の天然に存在する構造のアナログ
をいう。例えば、このような改変は、ＯＨ官能基の除去、アミン官能基の導入、
ハロ官能基の導入などをもたらし得る。シアル酸アナログがシアリルトランスフ
ェラーゼと適合性である限り、これらは時々、本明細書中で「適合性シアル酸ア
ナログ」と呼ばれる。
【００２５】 シアル酸の特定のアナログは、当該分野で公知であり、そして例えば、９−ア
ジド−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−アミノ−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ
、９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−ブロモ−Ｎｅｕ５Ａｃ、８−デオキシ−Ｎ
ｅｕ５Ａｃ、８−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ、７−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ、７−エピ
−Ｎｅｕ５Ａｃ、７，８−ビス−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ、４−Ｏ−メチル−Ｎｅｕ
５Ａｃ、４−Ｎ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、４，７−ジ−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａ
ｃ、４−オキソ−Ｎｅｕ５Ａｃ、３−ヒドロキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ、３−フルオロ
−Ｎｅｕ５Ａｃ酸、ならびにＮｅｕ５Ａｃの６−チオアナログを含む。シアル酸
のアナログを記載する際に本明細書中で用いられる命名法は、Ｒｅｕｔｅｒら20 によって示される。
【００２６】 シアリルトランスフェラーゼが、適合性の天然に存在するシアル酸を転移させ
るかまたは与えるように設計される限り、Ｎｅｕ５Ａｃのアナログは時々、本明
細書中で「人工ドナー」といわれ、一方、適合性の天然に存在するシアル酸は時
々、本明細書中で「天然ドナー」と呼ばれる。
【００２７】 用語「シアリルトランスフェラーゼ」とは、そのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）
誘導体として活性化された、適合性の天然に存在するシアル酸を、糖脂質または
糖タンパク質（集合的に糖結合体）の末端のオリゴ糖構造へと転移させる酵素を
いい、そして哺乳動物供給源を含む別の供給源から得られたシアリルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の全てまたは一部を取り込み、そして発現するように遺伝的に改
変された微生物から生成された酵素を含む。多数のシアリルトランスフェラーゼ
は文献において同定されており、異なるシアリルトランスフェラーゼは一般に、
そのトランスフェラーゼに受け入れられる糖結合体上の末端糖単位によって互い
に区別される64。例えば、糖結合体上に以下の末端オリゴ糖構造を構築するシア
リルトランスフェラーゼが特徴付けられている：
【００２８】
【化３】 種々の特異性を有する他のシアリルトランスフェラーゼは、種々の供給源から単
離された。
【００２９】 「非還元末端から２番目の糖位置にフコース基を有するフコシル化オリゴ糖と
適合性のシアリルトランスフェラーゼ」とは、シアリルトランスフェラーゼが、
非還元性の末端から２番目の糖位置においてフコース基またはそのアナログを有
するオリゴ糖をシアリル化し得ることを意味する。粘液腫ウイルスα２，３−シ
アリルトランスフェラーゼが、国際特許出願第ＷＯ９７／１８３０２号65に開示
されるように、この能力を有することが見出されている。
【００３０】 Ｃｈｏｒｏｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅの
亜科の他の属、およびＰｏｘｖｉｒｉｄａｅのファミリーの分類されていないウ
イルスによってもコードされる関連するシアリルトランスフェラーゼが、フコシ
ル化オリゴ糖と適合性であることが意図される。
【００３１】 特定のシアリルトランスフェラーゼによって認識され、その結果、この酵素に
結合し、次いで適切なアクセプターオリゴ糖構造に転移させるために利用され得
るそれらのシチジン一リン酸誘導体として活性化されたシアル酸のアナログは、
シアリルトランスフェラーゼと適合性であると呼ばれ、そして時々、本明細書中
で「シアル酸の適合性アナログ」といわれる。転移反応は、シアリルトランスフ
ェラーゼを用いるので、これは、このような反応において用いられるシアル酸の
アナログは、シアル酸の適合性アナログでなければならないといわれることなし
で済む。
【００３２】 Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体は、この化合物をいう： シアル酸のアナログのＣＭＰ誘導体は、Ｎｅｕ５Ａｃ残基がシアル酸のアナロ
グで置換されること以外は、上記の構造と類似する構造を有する化合物をいう。
【００３３】 用語「フコシルトランスフェラーゼ」とは、そのグアノシン二リン酸（ＧＤＰ
）誘導体として活性化された適合性の天然に存在するフコースを、糖脂質または
糖タンパク質（集合的に糖結合体）の末端オリゴ糖構造に転移させる酵素をいい
、そして遺伝子改変されており、その結果、哺乳動物供給源を含む別の供給源か
ら得られたフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全てまたは一部を組み込み、そ
して発現する微生物から生成される酵素を含む。多数のフコシルトランスフェラ
ーゼは、文献において同定されている。
【００３４】 用語「フコースのアナログ」とは、天然に存在する構造のフコースのアナログ
をいい、ここでフコース単位は化学的に改変されており、その結果、１以上の官
能基をこのような構造に導入、改変および／または除去された、アナログを含む
。例えば、このような改変は、ＯＨ官能基の除去、アミン官能基の導入、ハロ官
能基の導入、硫酸部分またはリン酸部分の導入などを生じ得る。フコースの特定
のアナログは当該分野で公知であり、そして例えば、３−デオキシ−フコース68 、アラビノース、Ｃ−６改変フコース69（すなわち、６−Ｏ−プロピルフコース
）および３，６ジデオキシ−Ｌ−ガラクトース70を含む。
【００３５】 フコースまたはそのアナログが、アデノシン−５’−ジホスホフコース、キサ
ントシン−５’−ジホスホ−フコース、イノシン−５’−ジホスホ−フコースな
ど71を含む他のプリン二リン酸から転移され得ることもまた意図される。
【００３６】 特定のフコシルトランスフェラーゼによって認識され、その結果、この酵素に
結合し、次いで適切なアクセプターオリゴ糖構造への転移に利用可能である、そ
れらの二リン酸誘導体として活性化されたフコースのアナログは、このフコシル
トランスフェラーゼと適合性であると呼ばれる。フコースアナログがフコシルト
ランスフェラーゼと適合性である限り、これらは時々、本明細書中で「適合性の
フコースアナログ」と呼ぶ。
【００３７】 用語「オリゴ糖」とは、式 Ｒ1−Ｒ2−（糖）n−Ｙ−Ｒ3 の化合物をいい、ここで、Ｒ1は、糖残基を表し、Ｒ2は糖残基を表し、そしてＲ 1 およびＲ2は一緒に、選択されたシアリルトランスフェラーゼおよび選択された
フコシルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎは０〜約１０であり、Ｙ
はＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ3は、Ｈ、タンパク質、
脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン部分からなる群より選
択される。
【００３８】 用語「フコシル化オリゴ糖」とは、以下の式の化合物：
【００３９】
【化４】 をいい、ここでＲ1は、糖残基を表し、Ｒ2が糖残基を表し、そしてＲ1およびＲ2 が一緒に、該選択されたシアリルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎ
は０〜約１０であり、ＹはＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ 3 は、Ｈ、タンパク質、脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコ
ン部分からなる群より選択される。
【００４０】 天然に存在するオリゴ糖およびフコシル化オリゴ糖は、特定のα２，３−シア
リルトランスフェラーゼについてのアクセプターであり、そしてインビボでの特
定のシアリルトランスフェラーゼのアクセプターであると考えられるので、これ
らのオリゴ糖およびフコシル化オリゴ糖は時々、本明細書中で「天然アクセプタ
ー」と呼ばれる。対照的に、本発明において用いられたオリゴ糖およびフコシル
化オリゴ糖は、時々、このような「天然アクセプター」とは異なり、これらはし
ばしば本明細書中で「人工アクセプター」と呼ばれる。すなわち、人工アクセプ
ターは、還元糖のアノマー性炭素原子に置換基を含むオリゴ糖およびフコシル化
されたオリゴ糖である。この置換基は、ミセルまたは他のより大きな分子量の凝
集物を生成し得るヒドロキシル、タンパク質、または脂質以外である。従って、
そのアグリコン部分を介した、オリゴ糖またはフコシル化オリゴ糖の還元糖のア
ノマー性炭素原子に連結されたタンパク質は、人工的なアクセプターである。な
ぜなら、このアクセプターは、「人工」単位、すなわち、アグリコン連結基を含
むからである。
【００４１】 本発明のフコシル化オリゴ糖は、オリゴ糖の１以上の糖単位への化学的改変に
よって天然のアクセプターからさらに区別され得る。このような化学的改変は、
１以上の糖単位における１以上の官能基の導入および／または除去を含み得る。
例えば、このような改変は、ＯＨ官能基の除去、糖単位の除去、アミン官能基の
導入、ハロ官能基の導入、１以上の糖単位の導入などをもたらし得る。
【００４２】 好ましい実施態様では、アグリコン部分は、１〜２０個の炭素原子を有し、そ
してより好ましくは、−−（Ａ）−−Ｚ’からなる群より選択、ここでＡが結合
、２〜１０個の炭素原子のアルキレン基、および−−（ＣＨ2ＣＲ4Ｒ5Ｇ）n（Ｃ
Ｈ2ＣＲ4Ｒ5）−−の形態の部分を表し、ここでｎが０〜５に等しい整数であり
；Ｒ4およびＲ5が、水素；フェニル；アミン、ヒドロキシル、ハロゲン、１〜４
個の炭素原子のアルキルおよび１〜４個の炭素原子のアルコキシからなる群より
選択される１〜３個の置換基によって置換されたフェニル；メチルまたはエチル
からなる群より独立して選択され；そしてＧが、結合、酸素、硫黄、ＮＨからな
る群より選択され；そしてＺ’が、水素、メチル、−−ＯＨ、−−ＳＨ、−−Ｎ
Ｈ2、−−ＮＨＲ6、−−Ｎ（Ｒ6）2、−−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ6、
−−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ6、−−Ｃ（
Ｏ）Ｎ（Ｒ6）2、および−−ＯＲ7からなる群より選択され、ここで各Ｒ6が独立
して１〜４個の炭素原子のアルキルであり、そしてＲ7が３〜１０個の炭素原子
のアルケニル基である。好ましくは、−（Ａ）−Ｚ’基は、キャリアに連結され
得る基、またはキャリアに連結され得る基へと誘導体化され得る基を規定する。
【００４３】 好ましくは、アグリコン基は、少なくとも２炭素原子の、そしてより好ましく
は少なくとも４炭素原子の疎水性基である。最も好ましくは、アグリコン基は、
−−（ＣＨ2）8ＣＯＯＭｅである。
【００４４】 アグリコン基が、抗原性キャリアのようなキャリアに連結し得る基である場合
、本発明の方法は、その基が抗原に付属している、シアル酸のアナログを含む、
１以上のα−シアリル化オリゴ糖基を有する人工抗原のような人工結合体を調製
する際に有用である。
【００４５】 キャリアは、蛍光標識、放射性標識、ビオチンまたは光不安定性連結アームま
たは標的されるべき部分への連結を含む、低分子量または高分子量の、非免疫原
性または抗原性のキャリアである。好ましくは、キャリアは、抗原性キャリアで
あり、従って、人工結合体は、人工抗原である。いくつかの場合、非免疫原性キ
ャリアを用いることが有利であり得る。
【００４６】 一方、キャリアは、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、トリス（２
−アミノエチル）アミン、Ｌリシリジン（ｌｙｓｉｌｙｓｉｎｅ）、ポリ−Ｌ−
リジン、および種々の分子量のポリマーのような低分子量キャリアであり得る。
【００４７】 上記のオリゴ糖において有用な糖単位（すなわち、糖）は、例えば、グルコー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミ
ン、フコース、シアル酸、３−デオキシ−Ｄ，Ｌ−オクツロソン酸などの天然お
よび合成の誘導体の全てを含む。それらのピラノース形態であることに加えて、
オリゴ糖における全ての糖単位は、Ｌ形態にあるフコース以外はそのＤ形態にあ
る。
【００４８】 上記のように、本明細書中に開示されるプロセスにおいて有用なオリゴ糖は、
選択されたシアリルトランスフェラーゼと適合性である末端単位を含む。すなわ
ち、このような適合性末端単位は、特定のシアリルトランスフェラーゼによるオ
リゴ糖の認識を可能にし、その結果、このシアリルトランスフェラーゼはこのオ
リゴ糖に結合し、そしてオリゴ糖上へのシアル酸の適合性アナログの転移をさら
に可能にする。
【００４９】 （Ｂ．合成および方法論） （オリゴ糖の調製） シアル酸アナログが酵素的にカップリングされるオリゴ糖は、完全に化学的な
合成によって、またはグリコシルトランスフェラーゼ（シアリルトランスフェラ
ーゼ以外）が用いられて、糖またはオリゴ糖への１以上の糖単位の連続付加をも
たらす、化学的／酵素的合成によって容易に調製され得る。このような方法は、
当該分野で周知である。例えば、化学合成は、完全なオリゴ糖配糖体を調製する
ため；糖単位を化学的に改変し、次いでこれをオリゴ糖配糖体に化学的もしくは
酵素的にカップリングし得るため；または１以上の糖単位が酵素的にカップリン
グされ得るオリゴ糖配糖体を化学的に調製するためのいずれでも便利な方法であ
る。
【００５０】 糖単位の化学的改変は、当該分野で周知であり、この方法は、合成されるべき
各個々の構造について一般的に適合され、そして最適化される。一般に、オリゴ
糖の全てまたは一部の化学合成は、まず、還元糖のアノマー炭素原子上でのグリ
コシド結合の形成を含む。詳細には、適切に保護された形態の天然に存在するか
または化学的に改変した糖構造（グリコシルドナー）は、還元単位のアノマー中
心で選択的に改変され、その結果、ハライド、トリクロロアセチミデート、チオ
グリコシドなどを含む脱離基が導入される。次いで、このドナーを、触媒条件下
（例えば、トリフルオロメタンスルホン酸銀のような可溶性銀塩、三フッ化ホウ
素エーテレートもしくはトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートのよ
うなルイス酸、またはトリフルオロメタンスルホン酸メチルもしくはジメチル（
メチルチオ）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネートのようなチオグリコ
シドプロモーター）で、１つの遊離のヒドロキシル基をグリコシル結合が樹立さ
れるべき位置に保有する、アグリコンまたは適切な形態の炭水化物アクセプター
と反応させる。広範な種々のアグリコン部分が当該分野で公知であり、そして還
元単位のアノマー性中心に対して適切な立体配置で結合され得る。適合性保護基
の適切な使用は、炭水化物合成の分野で周知であり、これは、合成された構造の
選択的改変またはさらなる糖単位または糖ブロックの、アクセプター構造に対す
るさらなる結合を可能にする。
【００５１】 グリコシド結合の形成後、オリゴ糖は、さらなる糖単位のカップリングを達成
するために用いられ得るか、または選択された位置で化学的に改変され得るか、
または従来の脱保護の後で酵素合成において用いられ得る。一般に、天然に存在
するかまたは化学的に改変された糖単位の、糖配糖体への化学的カップリングは
、文献において充分に証明されている樹立された化学反応を用いて達成される。
例えば、Ｏｋａｍｏｔｏら32、Ｒａｔｃｌｉｆｆｅら33、Ａｂｂａｓら34、Ｐａ
ｕｌｓｅｎ35、Ｓｃｈｍｉｄｔ36、Ｆｕｇｅｄｉら37、およびＫａｍｅｙａｍａ
ら38を参照のこと。これらの参考文献の各々の開示は、その全体が本明細書中で
参考として援用される。
【００５２】 一方、酵素的カップリングは、それらの適切なヌクレオチドドナーとして活性
化された糖単位を、一般的には特定の糖またはオリゴ糖の非還元糖部分でこの糖
またはオリゴ糖アクセプターへと転移させるグリコシルトランスフェラーゼの使
用によって達成される。例えば、Ｔｏｏｎｅら62および米国特許第５，３７４，
６５５号67を参照のこと。さらに、糖もしくはオリゴ糖アクセプターの、糖ドナ
ーの、または酵素反応産物の、選択された化学的改変を達成し、その結果、構造
の中に改変またはさらなる改変を導入することが可能である。
【００５３】 （シアル酸のアナログの調製） シアル酸の特定のアナログは当該分野で周知であり、そして当該分野で充分に
実証された手順を用いるシアル酸の化学的改変によって調製される。例えば、以
下を含む化学的に改変されたＮｅｕ５Ａｃ誘導体が文献に報告される：９−アジ
ド−Ｎｅｕ５Ａｃ39、種々の９−アミノ−Ｎｅｕ５Ａｃ誘導体40、９−デオキシ
−Ｎｅｕ５Ａｃ41、９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ42、９−ブロモ−Ｎｅｕ５Ａｃ 43 、８−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ41、８−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ44、７−デオキシ
−Ｎｅｕ５Ａｃ47、７−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ45、７，８−ビス−エピ−Ｎｅｕ５
Ａｃ45、４−Ｏ−メチル−Ｎｅｕ５Ａｃ53、４−Ｎ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ48 、４−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ47、４，７−ジ−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ41、４−オ
キソ−Ｎｅｕ５Ａｃ49、４−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ52、３−ヒドロキシ−Ｎｅ
ｕ５Ａｃ50、３−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ51酸、Ｎｅｕ５ＡｃのＣ−８またはＣ
−７での側鎖の切断生成物46ならびに６−チオアナログ54。他のシアル酸アナロ
グは、米国特許第５，３５２，６７０号3に開示される。他のシアル酸アナログ
をもたらす化学的改変は、このような樹立された手順に従う。
【００５４】 （それらのＣＭＰ−−ヌクレオチド誘導体へのシアル酸のアナログの活性化） シアル酸のアナログの酵素的転移は、それらのヌクレオチド（ＣＭＰ）誘導体
の事前合成（すわなち、活性化）を必要とする。シアル酸のアナログの活性は通
常、容易に入手可能な酵素ＣＭＰ−−シアル酸シンターゼを用いることにより行
われ、そして文献は、９−置換Ｎｅｕ５Ａｃ28、39、40、55〜57、７−エピＮｅｕ
５Ａｃ58、７，８−ビス−エピ−Ｎｅｕ５Ａｃ58、４−Ｏ−メチル−Ｎｅｕ５Ａ
ｃ59、４−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ60、４−アセタミド−Ｎｅｕ５Ａｃ48、７−
デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ56、４，７−ジデオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ56、Ｎｅｕ５Ａ
ｃの６−チオ誘導体61およびＮｅｕ５ＯＨ（ＫＤＮ）ようなシアル酸の種々のア
ナログの活性化の例を提供する。活性化シアル酸アナログのなお他の例は、米国
特許第５，３５２，６７０号3に開示される。
【００５５】 （オリゴ糖アクセプターへのシアル酸のアナログの転移） シアル酸の適合性アナログのヌクレオチド誘導体および適合性アクセプター（
すなわち、フコシル化オリゴ糖または選択されたシアリルトランスフェラーゼに
よって認識される非還元末端上に末端糖単位を有するオリゴ糖）は、フコシル化
オリゴ糖と適合性の、選択されたシアリルトランスフェラーゼの存在下で、シア
ル酸またはそのアナログがアクセプターに転移される条件下で互いに合わされる
。明白なように、用いられる糖またはオリゴ糖アクセプターは、用いられる特定
のシアリルトランスフェラーゼの基質として機能するものでなければならない。
【００５６】 このことについて、当該分野は、特に、人工アクセプターが、改変がその構造
のアグリコン部分における場合、シアリルトランスフェラーゼにいくつかの場合
に耐性であることを認識する。
【００５７】 同様に、シアル酸のアナログ（すなわち、人工ドナー）が酵素的に転移される
べきである場合、このアナログのＣＭＰ誘導体もまた、このシアリルトランスフ
ェラーゼによって認識されることが必要である。このことについて、当該分野で
は、特定のシアリルトランスフェラーゼが、天然に存在するシアル酸に対するい
くつかの改変を耐え得、そして依然としてシアル酸のこれらのアナログを、適切
な末端アクセプター構造を保有する糖タンパク質または糖脂質に転移し得ること
が理解されている。
【００５８】 シアリルトランスフェラーゼが、充分な認識柔軟性を保有し、その結果、人工
ドナーを人工アクセプターに転移させることが見出されている3。このような柔
軟性は、オリゴ糖の非還元糖末端に、シアル酸の異なるアナログを含むオリゴ糖
のパネルの容易な合成を可能にする。
【００５９】 上記のように、適合性シアル酸のヌクレオチド誘導体またはその適合性アナロ
グは、シアル酸またはそのアナログがそのアクセプターに転移される条件下でシ
アリルトランスフェラーゼの存在下で、適合性アクセプター（すなわち、選択さ
れたシアリルトランスフェラーゼによって認識される末端糖単位を、その非還元
性末端に保有する糖またはオリゴ糖）と合わされる。適切な条件は、当該分野で
公知であり、このような条件としては、適切なｐＨ条件および温度条件（例えば
、６．５〜７．５のｐＨおよび２５°と４５°との間の温度、好ましくは３５°
〜４０℃にて１２時間〜４日間）における適切な緩衝液（例えば、０．１Ｍ カ
コジル酸ナトリウム）中での、適合性アクセプターと適合性シアル酸アナログの
ＣＭＰ誘導体との混合物への適切なシアリルトランスフェラーゼの付加が挙げら
れる。得られるオリゴ糖は、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたは吸着クロマトグラフィーを含
む従来の方法論を用いて単離および精製され得る。
【００６０】 一旦形成されると、α−シアリル化オリゴ糖配糖体は、化学的および／または
酵素的な手順によってさらに改変されて、この化合物がさらに誘導体化され得る
。例えば、他のグリコシルトランスフェラーゼを用いて、このシアリルトランス
フェラーゼによって認識されるα−シアリル化オリゴ糖に対してグリコシル基を
付加し得る。この後者の局面は、このオリゴ糖に対して行われる改変が、所望の
酵素転移と適合性でなければならない限り、重要である。
【００６１】 さらに、αシアリル化オリゴ糖は、化学的に改変されて、これらの化合物のさ
らなる誘導体化を提供し得る。このような化学的改変としては、別の誘導体（例
えば９−アセタミド誘導体）へと依然さらに官能化され得るシアル酸のアナログ
上での９−アジド基のアミン基への還元が挙げられる。同様に、シアル酸のアナ
ログ上に見出されるカルボキシル基は、αシアリル化オリゴ糖配糖体上で、ラク
トン化、還元またはアミドへの変換を介して選択的に変換され得る。
【００６２】 上記の１以上の酵素工程では、この酵素は、固体支持体上に結合されて、その
結果、試薬の反応および酵素からの生成物の回収を促進し得る。
【００６３】 （Ｃ．有用性） 本発明の方法は、オリゴ糖の非還元糖末端へのα結合を介して結合したシアル
酸またはそのアナログを含むオリゴ糖を調製する際に有用である。このようなオ
リゴ糖は、当該分野において、医薬品として有用であると、ならびにこれらの構
造への抗体（この抗体は、診断アッセイにおいて有用である）の生成において認
識される。
【００６４】 さらに、本発明の方法は、抗原性キャリアにカップリングされ得、その結果、
人工抗原を生成する、オリゴ糖の非還元糖末端へのα結合を介したシアル酸のア
ナログを含むオリゴ糖を調製する際に有用である。従って、このようなオリゴ糖
は、人工抗原の調製において中間体として作用する。
【００６５】 さらに、本発明の方法は、未知のオリゴ糖の非還元性末端の決定において有用
である。詳細には、未知のオリゴ糖アクセプターの第１のアリコートを、非還元
性末端から２番目の糖位置にフコース基を有するオリゴ糖の非還元性末端をシア
リル化できないシアリルトランスフェラーゼと接触させ得、そこのオリゴ糖がシ
アリル化されたか否かが決定される；未知のオリゴ糖の第２のアリコートをまた
、このオリゴ糖と、非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有する
オリゴ糖の非還元末端をシアリル化し得るα−２，３シアリルトランスフェラー
ゼとを接触させ、そしてオリゴ糖がシアリル化されたか否かが決定される；結果
を比較して、非還元末端がフコシル化されたか否かが決定されるを包含する。未
知のアクセプターの第１のアリコートがシアリル化されず、そしてアクセプター
の第２のアリコートがシアリル化された場合、このアクセプターは、非還元末端
から２番目の糖位置においてフコシル化された。
【００６６】 （実施例） 以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そして本発明の範囲を限
定するとは決して解釈されない。
【００６７】 これらの実施例では、以下で他に定義しない限り、用いられる略号は、それら
の一般的に受け入れられた意味を有する：
【００６８】
【表３】 市販の成分は、製造業者によって列挙される。記載した製造業者のいくつかは
以下の通りである：
【００６９】
【表４】 （実施例１：ウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼ細胞溶解産物の
調製） 粘液腫ウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼ細胞溶解産物を、本明
細書中に参考として援用される、国際特許出願第ＷＯ９７／１８３０２号に示さ
れる方法と類似の方法によって調製した。
【００７０】 ヨーロッパウサギ腎臓細胞（ＲＫ１３）細胞のコンフルエントな層の１０個の
Ｔ１８０フラスコを、１９４９年にブラジルのカンピナスで単離されたブラジル
粘液腫ウイルス株Ｌａｕｓａｎｎｅ（Ｌｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１５）および
１９５３年にオーストラリアの首都地域で単離されたＵｒｉａｒｒａ（Ｕｒ）（
Ｍｏｓｅｓ株の誘導体（ＡＴＣＣ ＶＲ−１１６））に感染させた。これらの細
胞を、３７℃にて２４時間保持した。感染２４時間後、掻き取ることにより細胞
を剥離し、そしてＰＢＳで洗浄した。細胞溶解産物を、２０ｍＬの抽出緩衝液（
５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．１、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍ
ｌアプロチニン）における、４℃にて４５分間の懸濁によって調製した。この溶
解産物を、２，０００ｇで４℃にて１５分間の遠心分離によって清澄化した。
【００７１】 上清を回収し、そしてローディング緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６、０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＣＦ５４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５％グリセロール）
中で５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙクロマトグラフィーカ
ラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）にアプライした。α
２，３−シアリルトランスフェラーゼを、段階的ＮａＣｌ溶出（０．５Ｍ、１．
０Ｍ、１．５Ｍ、および２．０ＭのＮａＣｌ）を用いてカラムから溶出した。α
２，３−シアリルトランスフェラーゼを、溶出液を、カラム緩衝液（５０ｍＭ
ＭＥＳ、ｐＨ６．１、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−ＣＦ５４、２５％グリセロール
）中でＰＤ−１０カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を通して脱
塩した。
【００７２】 総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｂｉｏ−Ｒａｄを用い、そして製造
業者の説明書に従い、タンパク質標準としてＩｇＧを用いて測定した。
【００７３】 （実施例２：ＬｅｗｉｓaおよびＬｅｗｉｓxオリゴ糖アクセプターへのシアル
酸の転移） アクセプター（５４ｎｍｏｌ）、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（４０ｎｍｏｌ）およびＣ
ＭＰ−3Ｈ−ＮＡＮＡ（１５０，０００〜１８０，０００ｄｐｍ）を、０．５ｍ
Ｌ微量遠心チューブ中で細胞溶解産物（１６μＬ）、水（３μＬ）および１μＬ
のアッセイ緩衝液（２５０ｍＭ ＭＥＳ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ５４、
ｐＨ７．０）の混合物に添加した。反応混合物を、３７℃にてインキュベートし
、水で２００μＬになるまで希釈し、そして２０ｍＬのＭｅＯＨおよび２０ｍＬ
の水で予め平衡化したＣ18 Ｓｅｐ−Ｐａｋ逆相カートリッジにロードした。こ
のカートリッジを、５０ｍＬの水で洗浄し、そして生成物を４ｍＬのＭｅＯＨで
シンチレーションバイアル中に溶出させた。ＭｅＯＨ溶出物の放射能を、Ｂｅｃ
ｋｍａｎ液体シンチレーションカウンター（ＬＳ１８０１）中での１０ｍＬのＥ
ｃｏＬｉｆｅ（＋）シンチレーションカクテル（ＩＣＮ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑ
ｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）中での液体シンチレーションによって定量した。
【００７４】 二連の実験での異なるアクセプターに対する放射能転移の結果は以下の通りで
あった：
【００７５】
【表５】 （実施例３：種々のオリゴ糖アクセプターに対するシアル酸の転移） 単離されたウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼがシアル酸を種々
のアクセプターに転移する能力を試験した。
【００７６】 アクセプター（５４ｎｍｏｌ）、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（４０ｎｍｏｌ）およびＣ
ＭＰ−3Ｈ−ＮＡＮＡ（１５０，０００〜１８０，０００ｄｐｍ）を、０．５ｍ
Ｌ微量遠心チューブ中で細胞溶解産物（１６μＬ）、水（３μＬ）およびアッセ
イ緩衝液（２５０ｍＭ ＭＥＳ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ５４、ｐＨ６．
１）の混合物に添加した。反応混合物を、３７℃にてインキュベートし、水で希
釈し、そして上記実施例２に示す方法によって測定して、転移の相対速度を得た
。反応速度を、アクセプター濃度を約０．２×Ｋｍ〜３×Ｋｍに変化させること
によって類似の方法で行った。
【００７７】
【表６】 ｇｒ＝（ＣＨ2）8ＣＯＯＭｅ ＣＭＰ−ＮＡＮＡ＝シチジン５’−モノホスホ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸1 これらの化合物は、ウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼについて
のアクセプターとして作用するが、これらの化合物は以前に公知の哺乳動物α−
２，３シアリルトランスフェラーゼについてのアクセプターではない。
【００７８】 これは、ウイルスα２，３−シアリルトランスフェラーゼが、多数の異なるオ
リゴ糖構造を、シアル酸の転移に関してアクセプターとして用い得ることを示す
。
【００７９】 （実施例４：Ｌｅｗｉｓaオリゴ糖アクセプターおよびＬｅｗｉｓxオリゴ糖ア
クセプターに対するシアル酸のα２，３結合の確認） Ｌｅa−ＴＭＲ（３５ｎｍｏｌ）およびＣＭＰ−ＮＡＮＡ（２００ｎｍｏｌ）
を、ウイルス細胞溶解産物（４．９μＬ）およびアルカリホスファターゼ溶液（
０．１μＬ）（５μＬのアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ）１０００Ｕ／ｍｌおよび１μＬ ＢＳＡ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ
））とともにインキュベートした。室温（２５℃）にて４２時間の穏やかな回転
後、さらなるアルカリホスファターゼ溶液（０．２μＬ）およびＣＭＰ−ＮＡＮ
Ａ溶液（１００ｍＭ、０．２μＬ）を混合物に添加し、これを室温にてさらに２
日間反応させた。反応混合物を上昇させ、そして３７℃にて４８時間維持し、次
いでこの混合物を、１０ｍＬのＭｅＯＨおよび１０ｍＬの水で予め平衡化したＣ 18 −Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）にロードした。このカートリ
ッジを、５ｍＬの水で洗浄し、次いでＴＭＲ標識化合物を５ｍＬのＭｅＯＨで溶
出させた。この溶液を減圧下で乾燥させ、フィルター（Ｍｉｌｌｉｅｘ−ＧＶフ
ィルター、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に通し、そして凍
結乾燥させた。水を乾燥物質に添加して、１００μＭ ＴＭＲ濃度にした。この
溶液（０．５μＬ）を、キャピラリー電気泳動泳動緩衝液（１０ｍＭホスフェー
ト、１０ｍＭホウ酸ナトリウム、１０ｍＭドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍＭフ
ェニルボロン酸（ｐＨ９．０、４９９．５μＬ）と混合した。この溶液を、Ｌｅ
ら66に示される方法によるレーザー誘導蛍光検出を用いたキャピラリー電気泳動
による分離および分析のために用いた。酵素反応において生成された新たな生成
物のピークは、確実なシアリル化Ｌｅx−ＴＭＲと同じ移動時間を有し、そして
新たな生成物のピークは、ノイラミニダーゼを用いた処理によって変換されてＬ
ｅx−ＴＭＲに戻った。
【００８０】 （実施例５：シアリルＬｅx−ｇｒの分取合成） 細胞溶解産物（１４ｍＬ）を、ＢＳＡ溶液（５μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ）と混
合した。この溶液を、Ｓｌｉｄｅ Ａレーザー（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）中で１．８ｍＬま
で濃縮した。Ｌｅx−ｇｒ（４．７ｍｇ、６．７μｍｏｌ）およびＣＭＰ−ＮＡ
ＮＡ（６．８ｍｇ、１０．３μｍｏｌ）を、２００μＬの濃縮された細胞溶解産
物に添加した。アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ，１０００Ｕ／ｍＬ，１０μＬ）を添加した。この反応混合物を、室温にて
２４時間反転させた。このインキュベーションの間に、ＣＭＰ−ＮＡＮＡを添加
した（６回（各々３．０ｍｇで３日後、７日後、１１日後、各々２．０ｍｇで１
４日後、１８日後、２１日後））。この混合物を、１０ｍＬのＭｅＯＨおよび１
０ｍＬの水で予め平衡化したＣ18−Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
）にロードした。このカートリッジを、４０ｍＬの水で洗浄し、次いでこの生成
物を５０ｍＬの１０％ ＭｅＯＨで溶出させた。この溶出物を、減圧下で乾燥さ
せ、そして１０ｍＬのＭｅＯＨおよび１０ｍＬの水で予め平衡化したＣ18−Ｓｅ
ｐ−Ｐａｋカートリッジに再度ロードした。水（１０ｍＬ）；１％ ＭｅＯＨ（
１０ｍＬ）次いで５％ ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で洗浄した後、所望の生成物を１
０％ ＭｅＯＨ（１７ｍＬ）で溶出させた。この溶液を、減圧下で乾燥させ、フ
ィルター（Ｍｉｌｌｉｅｘ−ＧＶフィルター、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ Ｃｏｒｐ．）に通し、そして凍結乾燥させて、シアリル化Ｌｅx−ｇｒ（２
．１９ｍｇ、３３％）を得た。生成物シアリルＬｅx−ｇｒの構造を、ＮＭＲ分
光法および質量分析の両方によって確認した。
【００８１】
【数１】 シアリル化Ｌｅa−ｇｒをまた、同様の様式でＬｅa−ｇｒから合成した。その
構造を、ＮＭＲ分光法および質量分析の両方によって確認した。
【００８２】
【数２】 （実施例６：ＧｌｃＮＡｃ−ＴＭＲからのシアリルＬｅx−ＴＭＲの合成） ＧｌｃＮＡｃ−ＴＭＲ（３５ｎｍｏｌ）、ＵＤＰ−ガラクトース（７０ｎｍｏ
ｌ）、０．５μＬの単離したウシ乳β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ
（０．３ｍＵ）、ＧＤＰ−フコース（７０ｎｍｏｌ）、０．５μＬの単離したヒ
ト乳α１，３，４−フコシルトランスフェラーゼ（０．０３ｍＵ）、ＣＭＰ−Ｎ
ＡＮＡ（１００ｎｍｏｌ）、０．１μＬの１Ｍ ＭｎＣｌ2および０．１μＬの
アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，１０ｍＵ
）を、５．７μＬの濃縮ウイルス細胞溶解産物溶液とともにインキュベートした
。室温での２４時間の穏やかな回転の後、０．２μＬのアリコートを取り出し、
そしてシリカゲル６０Ｆ254薄層クロマトグラフィープレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄ
ａｒｍｓｔａｄｔ Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。このプレートを、イソプ
ロパノール：Ｈ2Ｏ：ＮＨ4ＯＨ（７：２：１）を用いて展開した。Ｌｅx−ＴＭ
Ｒ（Ｒｆ＝０．１８）およびシアリルＬｅx−ＴＭＲ（Ｒｆ＝０．３０）は、ピ
ンクの発色団ＴＭＲに起因して可視であった。これらのＲｆは、確実な物質のＲ
ｆに対応する。そして酵素反応混合物中で形成されたシアリルＬｅx−ＴＭＲは
、シアリルＬｅx−ＴＭＲと同等に移動した。出発物質ＧｌｃＮＡｃ−ＴＭＲ（
Ｒｆ＝０．３９）および反応中間体ＬａｃＮＡｃ−ＴＭＲ（Ｒｆ＝０．２５）は
検出されなかった。
【００８３】 （実施例７：Ｌｅc−ＴＭＲからのシアリルＬｅa−ＴＭＲの合成） Ｌｅc−ＴＭＲ（１５ｎｍｏｌ）、ＧＤＰ−フコース（７０ｎｍｏｌ）、０．
５μＬの単離したヒト乳α１，３，４−フコシルトランスフェラーゼ（０．０３
ｍＵ）、ＣＭＰ−ＮＡＮＡ（１００ｎｍｏｌ）、０．１μＬの１Ｍ ＭｎＣｌ2
および０．１μＬのアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ，１０ｍＵ）を、５．１μＬの濃縮ウイルス細胞溶解産物溶液とともに
インキュベートした。室温での７２時間の穏やかな回転の後、０．２μＬのアリ
コートを取り出し、そしてシリカゲル６０Ｆ254薄層クロマトグラフィープレー
ト（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ Ｇｅｒｍａｎｙ）にスポットした。この
プレートを、イソプロパノール：Ｈ2Ｏ：ＮＨ4ＯＨ（７：２：１）を用いて展開
した。Ｌｅa−ＴＭＲ（Ｒｆ＝０．１８）およびシアリルＬｅa−ＴＭＲ（Ｒｆ＝
０．２５）は、ピンクの発色団ＴＭＲに起因して可視であった。これらのＲｆは
、確実な物質のＲｆに対応する。そして酵素反応混合物中で形成されたシアリル
Ｌｅa−ＴＭＲは、シアリルＬｅa−ＴＭＲと同等に移動した。出発物質Ｌｅc−
ＴＭＲ（Ｒｆ＝０．３１）は検出されなかった。 3
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 201， 1204 Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ Ｒ ｏａｄ Ｎ．Ｗ．， Ｃａｌｇａｒｙ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ Ｔ２Ｎ ３Ｐ５ (72)発明者 筋野 敬子 カナダ国 アルバータ ティー６イー ４ エス６， エドモントン， サスカッチェ ワン ドライブ 1902 10883 Ｆターム(参考） 4B064 AF04 CA21 CB30 CC01 CE10 CE17 DA01

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 シアル酸またはそのアナログを含むα−２，３シアリル化フ
    コシル化オリゴ糖の酵素合成のための方法であって、該方法は以下の工程： ａ）非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有するフコシル化オ
    リゴ糖と適合性のα−２，３シアリルトランスフェラーゼを選択する工程； ｂ）工程（ａ）において選択された該シアリルトランスフェラーゼと適合性で
    あるＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを選択する工程； ｃ）該ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを、該シアル酸またはそのアナロ
    グが、該ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログから該フコシル化オリゴ糖の非還
    元糖末端に転移される条件下で上記（ａ）において選択された該シアリルトラン
    スフェラーゼの存在下で以下の式： 【化１】 のフコシル化オリゴ糖と接触させ、それにより、シアル酸またはそのアナログを
    含むα−２，３シアリル化フコシル化オリゴ糖を形成する工程であって、ここで
    Ｒ1が糖残基を表し、Ｒ2が糖残基を表し、そしてＲ1およびＲ2が一緒に、該選択
    されたシアリルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎは０〜約１０であ
    り、ＹはＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ3は、Ｈ、タンパ
    ク質、脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン部分からなる群
    より選択される、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記アグリコン部分が、−−（Ａ）−−Ｚ’からなる群より
    選択され、ここでＡが結合、２〜１０個の炭素原子のアルキレン基、および−−
    （ＣＨ2ＣＲ4Ｒ5Ｇ）n（ＣＨ2ＣＲ4Ｒ5）−−の形態の部分を表し、ここでｎが
    ０〜５に等しい整数であり；Ｒ4およびＲ5が、水素；フェニル；アミン、ヒドロ
    キシル、ハロゲン、１〜４個の炭素原子のアルキルおよび１〜４個の炭素原子の
    アルコキシからなる群より選択される１〜３個の置換基によって置換されたフェ
    ニル；メチルまたはエチルからなる群より独立して選択され；そしてＧが、結合
    、酸素、硫黄、ＮＨからなる群より選択され；そしてＺ’が、水素、メチル、−
    −ＯＨ、−−ＳＨ、−−ＮＨ2、−−ＮＨＲ6、−−Ｎ（Ｒ6）2、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ
    Ｈ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ6、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−−Ｃ
    （Ｏ）ＮＨＲ6、−−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ6）2、および−−ＯＲ7からなる群より選択
    され、ここで各Ｒ6が独立して１〜４個の炭素原子のアルキルであり、そしてＲ7 が３〜１０個の炭素原子のアルケニル基である、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 フコシル化およびα−２，３シアリル化されたオリゴ糖の酵
    素合成のための方法であって、該方法は以下の工程： ａ）非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有するオリゴ糖をシ
    アリル化し得るα−２，３シアリルトランスフェラーゼを選択する工程； ｂ）フコシルトランスフェラーゼを選択する工程； ｃ）工程（ａ）において選択される該シアリルトランスフェラーゼと適合性で
    あるＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログを選択する工程； ｄ）工程（ｂ）において選択される該フコシルトランスフェラーゼと適合性で
    あるＧＤＰ−フコースまたはそのアナログを選択する工程； ｅ）該ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログおよび該ＧＤＰ−フコースまたは
    そのアナログを、該シアル酸またはそのアナログおよび該フコースまたはそのア
    ナログが、それぞれ、該ＣＭＰ−シアル酸またはそのアナログおよび該ＧＤＰ−
    フコースまたはそのアナログから該オリゴ糖の非還元糖末端に転移される条件下
    で上記（ａ）および（ｂ）において選択された該シアリルトランスフェラーゼお
    よび該フコシルトランスフェラーゼの存在下で式： Ｒ1−Ｒ2−（糖）n−Ｙ−Ｒ3 のオリゴ糖と接触させ、それにより、α−２，３シアリル化フコシル化オリゴ糖
    を形成する工程であって、ここでＲ1が糖残基を表し、Ｒ2が糖残基を表し、そし
    てＲ1およびＲ2が一緒に、該選択されたシアリルトランスフェラーゼおよび該選
    択されたフコシルトランスフェラーゼのアクセプターを表し；ｎは０〜約１０で
    あり、ＹはＯ、ＮＨおよびＳからなる群より選択され、そしてＲ3は、Ｈ、タン
    パク質、脂質または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン部分からなる
    群より選択される、工程、 を包含する、方法。
  4. 【請求項４】 前記アグリコン部分が、−−（Ａ）−−Ｚ’からなる群より
    選択され、ここでＡが結合、２〜１０個の炭素原子のアルキレン基、および−−
    （ＣＨ2ＣＲ4Ｒ5Ｇ）n（ＣＨ2ＣＲ4Ｒ5）−−の形態の部分を表し、ここでｎが
    ０〜５に等しい整数であり；Ｒ4およびＲ5が、水素；フェニル；アミン、ヒドロ
    キシル、ハロゲン、１〜４個の炭素原子のアルキルおよび１〜４個の炭素原子の
    アルコキシからなる群より選択される１〜３個の置換基によって置換されたフェ
    ニル；メチルまたはエチルからなる群より独立して選択され；そしてＧが、結合
    、酸素、硫黄、ＮＨからなる群より選択され；そしてＺ’が、水素、メチル、−
    −ＯＨ、−−ＳＨ、−−ＮＨ2、−−ＮＨＲ6、−−Ｎ（Ｒ6）2、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ
    Ｈ、−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ6、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2、−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、−−Ｃ
    （Ｏ）ＮＨＲ6、−−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ6）2、および−−ＯＲ7からなる群より選択
    され、ここで各Ｒ6が独立して１〜４個の炭素原子のアルキルであり、そしてＲ7 が３〜１０個の炭素原子のアルケニル基である、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 未知のオリゴ糖アクセプターの非還元末端構造を決定するた
    めの方法であって、該方法は、以下の工程： ａ）該オリゴ糖アクセプターと、非還元末端から２番目の糖位置においてフコ
    ース基を有するオリゴ糖の非還元末端をシアリル化し得ないシアリルトランスフ
    ェラーゼとを接触させ、そして該オリゴ糖がシアリル化されたか否かを決定する
    工程； ｂ）該オリゴ糖と、非還元末端から２番目の糖位置においてフコース基を有す
    るオリゴ糖の非還元末端をシアリル化し得るα−２，３シアリルトランスフェラ
    ーゼとを接触させ、そして該オリゴ糖がシアリル化されたか否かを決定する工程
    ；および ｃ）結果を比較して、該非還元末端がフコシル化されたか否かを決定する工程
    、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 工程（ｃ）が、前記未知のアクセプターが、前記非還元末端
    からの２番目の糖位置においてフコシル化されたか否かを決定することを含み、
    ここで該アクセプターが、請求項５に記載の工程（ａ）においてシアリル化され
    ておらず、そして請求項５に記載の工程（ｂ）においてシアリル化されていた、
    請求項５に記載の方法。
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