JP2002520057A

JP2002520057A - 新規な哺乳類ペプチダーゼのクローニング及び特性化

Info

Publication number: JP2002520057A
Application number: JP2000560255A
Authority: JP
Inventors: パンガロス，メンラス; ネーフス，ジヤン−マルク・エドモンド・フエルナンド・マリー; ペータース，ダニエル・セリーヌ・ジヨルジエツト
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-07-14
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2002-07-09
Also published as: IL140878A0; AU4920099A; WO2000004157A3; GB9815284D0; EP1095148A2; US7217555B1; CA2337362A1; WO2000004157A2; AU772292B2

Abstract

(57)【要約】本明細書においてＬ、II及びIVと称するヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼをコードし、図１、３、４及び５に例示するアミノ酸配列を有するｃＤＮＡ分子が開示される。これらのＮＡＡＬＡＤ−アーゼ自体もまた本発明の一部を形成する。さらに、細胞、組織または生物を形質転換するために適当なこれらのｃＤＮＡ分子を含む発現ベクターが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は新規な哺乳類ペプチダーゼ、より詳細には、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ（
Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ）と呼ばれるペプチダーゼ、該ペプ
チダーゼをコードするｃＤＮＡ配列及びそのようなペプチダーゼの活性または発
現を阻害するかまたは増大する化合物を同定する方法並びにそのようにして同定
された化合物に関する。

【０００２】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩは、カルボキシペプチダーゼ活性及びトランスフェリ
ン受容体に対する配列類似性を有するII型膜糖タンパク質として以前に同定され
ており、前立腺腫瘍において非常に発現されており、前立腺癌の進行において重
要である可能性がある。ＣＮＳでは、ニューロンのグルタミン酸作動活性を調節
することにおいて役割を有すると仮定されている。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩのヌ
クレオチド及びアミノ酸配列は以前に同定されている（ＵＳ５，５３８，６８
６）。

【０００３】今回、本発明者等は意外にも、タンパク質のこのファミリーの拡張に相当し、
そしてその酵素が以前に同定されるかまたは特性化されていないｃＤＮＡ分子を
同定し、クローン化した。

【０００４】従って、本発明の第一の態様として、図１に例示するアミノ酸配列を有するヒ
トＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬと称するペプチダーゼまたはその機能性同等物もしく
は誘導体もしくは生物学的前駆体をコードするｃＤＮＡ分子が提供される。好ま
しくは、このｃＤＮＡ分子は図１に例示するヌクレオチドの配列を含んでなる。
また本発明により提供されるものは、図３に例示するヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
Ｌタンパク質のスプライス変異体であり、好ましくは、これらのスプライス変異
体は図３に示すヌクレオチド欠失または挿入によりコードされる。

【０００５】本発明のさらなる態様として、図４及び５にそれぞれ例示したとおりのアミノ
酸配列を有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIまたはIVと称するペプチダーゼをコード
するｃＤＮＡ分子が提供される。好ましくは、このｃＤＮＡは図４及び５にそれ
ぞれ例示するヌクレオチドの配列を含んでなる。また本発明の範囲内に包含され
るものは、本発明のｃＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができる核酸分子で
ある。

【０００６】また本発明により提供されるものは、本発明のＤＮＡ配列によりコードされる
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質である。従って、本発明のさらなる態様として
、図１に例示するヌクレオチド配列または図３に例示する挿入もしくは欠失を含
む図１の配列によりコードされるアミノ酸配列を有するヒトＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼＬタンパク質が提供される。好ましくは、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質
はヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質を含んでなる。また本発明により提供
されるものは、図４及び５にそれぞれ例示するヌクレオチド配列によりコードさ
れるアミノ酸配列を有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びIVタンパク質またはその
機能性同等物、誘導体もしくは生物学的前駆体であり、このタンパク質は好まし
くはヒト起源のものである。好ましくは、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びIVタンパ
ク質は図４及び５にそれぞれ例示するアミノ酸配列を含んでなる。

【０００７】また、当業者に周知である高ストリンジェンシー条件下で、本発明の核酸配列
のいずれかにハイブリダイズすることができるアンチセンス分子も本発明により
提供される。

【０００８】本明細書において用いる場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
は、ポリ核酸が安定である条件をさす。ハイブリッドの安定性は、ハイブリッド
の融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは式：８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ⁺］＋０．４１（％Ｇ＆Ｃ）−６００
／ｌにより見積もることができ、ここで、ｌはヌクレオチド単位のハイブリッドの長
さである。Ｔｍは、配列相同性が１％減少するごとに約１〜１．５℃ずつ低下す
る。

【０００９】本発明のｃＤＮＡ分子は発現ベクター中に都合よく包含することができ、これ
はそれ自体、宿主細胞を形質転換するか、トランスフェクションするかまたは感
染させるために用いることができ、この細胞は起原が細菌または真核生物であっ
てもよい。従って発現ベクター中への適当なｃＤＮＡの包含後に一組の細胞、組
織または生物を都合よくトランスフェクションすることができる。ベクターは、
サイトメガロウイルスプロモーターのような適当なプロモーター及び場合により
例えばグリーン蛍光タンパク質のようなレポーター分子をコードする配列を含む
ことができる。

【００１０】発現のために必要とされる調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼに結合するため
のプロモーター配列及びリボソーム結合のための転写開始配列が包含される。例
えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーターのようなプロモーター及び転
写開始のためのシャイン・ダルガルノ配列及び開始コドンＡＵＧを含むことがで
きる。同様に、真核生物の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼIIのための異種
起原または同一源のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドン
ＡＵＧ及びリボソームの脱離のための終止コドンを含むことができる。そのよう
なベクターは市販されているか、または当該技術分野において周知の方法により
記述した配列から組み立てることができる。

【００１１】従って、発現ベクターは、適当な宿主細胞中への導入時にＤＮＡまたはＲＮＡ
フラグメントの発現をもたらすプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他
のベクターのような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物をさす。適当な発現ベクタ
ーは当業者に周知であり、真核細胞及び／もしくは原核細胞中で複製可能なもの
並びにエピソームのままであるものまたは宿主細胞ゲノム中に組込むものを包含
する。

【００１２】本発明の核酸にハイブリダイズすることができるアンチセンス分子は、プロー
ブとしてまたは薬剤としてまたは製薬学的組成物中に用いることができる。

【００１３】本発明の核酸分子は、アンチセンスＲＮＡの生産をもたらすためにアンチセン
スの向きに記述したベクター中に挿入することができる。アンチセンスＲＮＡま
たは他のアンチセンス核酸は、合成手段により製造することができる。

【００１４】本発明のさらなる態様は、本発明の発現ベクターで形質転換するか、トランス
フェクションするかまたは感染させた宿主細胞を含んでなり、この細胞は好まし
くは真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞を含んでなる。

【００１５】次の細胞の形質転換及び形質転換された細胞の次の選択のために適当な発現ベ
クターへのクローン化ＤＮＡの包含は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ（１９８
９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎ
ｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓに与えられるように当業者に周知である。

【００１６】本発明はまた、本発明のＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質を発現することがで
きる導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック細胞、組織または生物も含んで
なる。

【００１７】本発明のタンパク質を発現すること「ができる導入遺伝子」という用語は、本
明細書において用いる場合、本発明の該タンパク質または同じ機能もしくは活性
を有するタンパク質の発現を導く適当な核酸配列を意味するとみなされるべきで
ある。導入遺伝子には、例えば、ヒト供給源から単離されたゲノム核酸またはｃ
ＤＮＡを包含する合成核酸を含むことができる。「トランスジェニック生物、組
織または細胞」という用語は、本明細書において用いる場合、ゲノム中に安定に
組込まれるかまたは染色体外の状態のいずれかの外来核酸を含有するあらゆる適
当な生物及び／もしくは生物の一部、組織または細胞を意味する。トランスジェ
ニック細胞は好ましくはＣＯＳ細胞である。好ましくは、導入遺伝子は本発明の
発現ベクターを含んでなる。

【００１８】「機能性フラグメント」という用語は、本明細書において用いる場合、本発明
のＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを意味す
るとみなされるべきである。例えば、この遺伝子は、欠失または突然変異を含ん
でなることができるが、なお機能性ＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質をコードす
ることができる。

【００１９】本発明では、特定の核酸配列には、同一の核酸だけでなく、特に保存的アミノ
酸置換において縮重コードにより同義コドン（同じアミノ酸を特定する異なるコ
ドン）をもたらす塩基の置換を包含する、天然の核酸配列からのわずかな塩基変
異も含まれる。「核酸またはｃＤＮＡ配列」という用語にはまた、塩基変異に関
して上に示す定義を包含する定められたあらゆる一本鎖配列に対する相補的配列
も含まれる。

【００２０】さらに、本発明の特定のタンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸配列には、
同一のアミノ酸配列だけでなく、保存的アミノ酸置換（側鎖が同類のアミノ酸で
の置換）を包含する天然のアミノ酸配列からのわずかなアミノ酸変異も含まれる
。天然のアミノ酸と異なるが、天然に存在する配列によりコードされるポリペプ
チドと免疫学的に同じまたは類似するポリペプチドをもたらすアミノ酸配列もま
た含まれる。

【００２１】本発明のさらなる態様は、本発明の核酸の少なくとも１５ヌクレオチド、好ま
しくは１５〜５０ヌクレオチドの核酸配列を提供する。

【００２２】これらの配列は、プローブまたは複製を開始するためのプライマー等として都
合よく用いることができる。そのような核酸配列は、組換えまたは合成手段によ
るような、当該技術分野において周知の技術により製造することができる。それ
らはまた、本発明の核酸の存在を検出するための診断キット等においても用いる
ことができる。一般に、これらの試験は、ハイブリダイズする条件下でサンプル
とプローブとを接触させること及びプローブとサンプル中のいずれかの核酸間の
あらゆる二本鎖形成の存在を検出することを含んでなる。

【００２３】本発明の核酸配列はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８９）に
記述されたような組換えまたは合成手段を用いて製造することもできる。例えば
異なる集団の一組の個体からのＤＮＡライブラリーを例えば調べることにより、
本発明のＤＮＡのヒト対立遺伝子変異体または多型を都合よく同定することがで
きる。さらに、本発明の核酸及びプローブは、サンガージデオキシチェーンター
ミネーション法のような当該技術分野において周知の技術を用いて患者からのゲ
ノムＤＮＡを配列決定するために用いることができ、これによりある種の増殖性
疾患に対する患者のあらゆる素因を都合よく確かめることができる。

【００２４】本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドは顕示標識を保有することができる。
適当な標識には、³²Ｐもしくは³⁵Ｓのような放射性同位体、ビオチンのような酵
素標識もしくは他のタンパク質標識または蛍光マーカーが包含される。そのよう
な標識は、それ自体既知の技術を用いて、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチ
ドに付加することができ、検出することができる。

【００２５】例えば異なる集団の一組の個体からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを例
えば調べることにより、本発明のＤＮＡ分子のヒト対立遺伝子変異体または多型
を都合よく同定することができる。さらに、本発明の核酸及びプローブは、サン
ガージデオキシチェーンターミネーション法のような当該技術分野において周知
の技術を用いて患者からのゲノムＤＮＡを配列決定するために用いることができ
、これにより本発明のＮＡＡＬＡＤ−アーゼと関連するある種の疾患に対する患
者のあらゆる素因を都合よく確かめることができる。

【００２６】本発明により同定される核酸配列またはタンパク質は、薬剤としてあるいは癌
またはアルツハイマー病もしくはＡＬＳのような神経変性疾患及び本発明のペプ
チダーゼによりもたらされる他の疾患もしくは疾病を処置するための薬剤の調製
において都合よく用いることができる。本発明のｃＤＮＡ及びタンパク質並びに
このｃＤＮＡにハイブリダイズ可能な核酸はまた、その製薬学的に許容しうる担
体、希釈剤または賦形剤と一緒に製薬学的組成物中に都合よく含むことができる
。従って、この組成物は、例えば、遺伝子治療における使用のためのアンチセン
ス核酸を含んでなることができる。

【００２７】本発明はさらに、アンチセンス技術の使用によりインビボで本発明のＮＡＡＬ
ＡＤ−アーゼを阻害することに関する。アンチセンス技術は、三重らせん形成ま
たはアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するために用い
ることができ、これらの方法は両方ともＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチ
ドの結合に基づく。例えば、１０〜５０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリ
ゴヌクレオチドを設計するために本発明の成熟タンパク質をコードするＤＮＡ配
列の一部を用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅｅｔａｌ．Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙｅｔａｌ
．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；及びＤｅｒｖａｎｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照）、それにより
転写及びペプチダーゼの生産を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
は、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼへの翻訳を妨げる。

【００２８】本発明によりさらに提供されるものは、ある化合物がＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活
性のインヒビターまたはエンハンサーであるかどうかを決定する方法であり、こ
の方法は、該化合物を［³Ｈ］Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタメ
ート（ＮＡＡＧ）の存在下で接触させること及び該ＮＡＡＧの加水分解の量をモ
ニターすることを含んでなる。

【００２９】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼペプチドは、前立腺癌及び他の可能性がある癌において
役割を有することが以前に報告されており、その場合、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活
性のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして同定される化合物は、薬
剤としてあるいは癌またはアルツハイマー病もしくはＡＬＳのような神経変性疾
患を処置するための薬剤の調製において都合よく用いることができる。これらの
化合物はまた、その製薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に製
薬学的組成物中に含むこともできる。

【００３０】本発明のさらなる態様は、本発明のＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質の発現の
インヒビターまたはエンハンサーである化合物を同定する方法を含んでなり、こ
の方法は、該タンパク質を発現する宿主細胞、組織または生物を該化合物と接触
させること及び本発明の該ペプチダーゼを発現する細胞を含んでなるが該化合物
と接触していないコントロールと比較して該タンパク質の発現をモニターするこ
とを含んでなる。

【００３１】好ましくは、該ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現細胞は、本発明の宿主細胞または上
記のようなトランスジェニック細胞、組織もしくは生物を含んでなる。好ましく
は、該モニタリング工程は、該レポーター分子の発現をモニターすることを含ん
でなる。

【００３２】上記に同定した方法により同定される化合物はまた、薬剤としてまたはアルツ
ハイマー病、精神分裂病もしくはＡＬＳのような神経変性疾患を処置するための
薬剤の調製において用いることもできる。そのような化合物また、その製薬学的
に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に製薬学的組成物中に含むことも
できる。

【００３３】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼアンチセンス分子または実際に本発明のＮＡＡＬＡＤ−
アーゼのアゴニストもしくはアンタゴニストとして同定される化合物は、製薬学
的組成物の形態で用いることができ、当該技術分野において周知の方法によりそ
れを調製することができる。好ましい組成物には、例えば、生理的食塩水溶液の
ような製薬学的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤または賦形剤が含まれる。ま
た、他の無毒の塩、滅菌水等を包含する他の製薬学的に許容しうる担体も用いる
ことができる。適当なバッファーもまた存在することができ、次の投与のために
滅菌水の添加により再形成する前に組成物を滅菌状態で凍結乾燥し、保存するこ
とができる。固体または半固体の生物学的に適合するマトリックス中へのＮＡＡ
ＬＡＤ−アーゼの包含を実施することができ、処置を必要とする組織中にこれを
移植することができる。

【００３４】本発明のＮＡＡＬＡＤ−アーゼペプチダーゼに対する抗体は、当該技術分野に
おいて既知の技術により都合よく製造することができる。これらのペプチドに対
するポリクローナル抗体は、選択したペプチドを用いて動物を免疫感作すること
により製造することができる。モノクローナル抗体は、免疫感作した動物からの
抗体産生Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させ、所望する抗体を産生する得られたハイ
ブリドーマ細胞系を選択することによりハイブリドーマ技術を用いて製造される
。あるいはまた、モノクローナル抗体は、当業者に既知のインビトロ技術におい
て製造することができる。

【００３５】製造した抗体は、試験するサンプルと該抗体とを接触させ、それに結合するあ
らゆるタンパク質を同定することにより本発明の該ＮＡＡＬＡＤ−アーゼペプチ
ダーゼの存在を検出する方法において用いることができる。そのような方法のた
めのキットもまた提供することができ、これは上記の本発明の態様による抗体及
び該抗体を該サンプルと反応させるための手段を含んでなる。

【００３６】担体にはまた、ｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、滅菌、親油性、可溶性等のよう
な他の条件を改変するための他の製薬学的に許容しうる賦形剤も含むことができ
る。また、投与後に持続性または遅延放出を与える製薬学的に許容しうる賦形剤
も包含することができる。

【００３７】本発明のＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質または核酸分子もしくは化合物は、
経口的に投与することができる。この態様において、これらを当業者に周知であ
る固形剤形で包膜化し、適当な担体と組み合わせることができる。

【００３８】当業者に周知であるように、特定の投薬計画は、用いる特定の投与経路により
、患者の体表面積または占められる体の空間の体積に従って計算することができ
る。しかしながら、実際に投与する組成物の量は、症状の重さ、投与する組成物
、個々の患者の年齢、体重及び応答並びに選択した投与経路のような処置する疾
患に関する状況に基づいて、医師により決定される。

【００３９】本発明のそのような化合物の機能的に有効な用量は、ラットにおいて３００ｎ
ｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇを含んでなる。前記のように、熟練した医師は、説
明した関係のある因子に基づいてヒト被験者に適当な投薬量に到達すると思われ
る。

【００４０】本発明は、以下の実施例によりさらに明確に理解することができ、それらは添
付の図面に関する単なる実例である。

【００４１】天然のＴａｑポリメラーゼ及びＭｇＣｌ₂を含むＰＣＲバッファー、Ｅｘｐａ
ｎｄ^TM ＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲシステム、アンピシリン、ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）並びに用いた全ての
制限酵素は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）からであった。スーパーＴａｑポリメラーゼは、ＨＴＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からであった。１０ｍＭｄ
ＮＴＰミックスは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。オリジナルＴＡクローニングキット及び
発現ベクターｐｃＤＮＡ−３は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ（Ｌｅｅｋ，Ｔｈ
ｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニ−及
びマキシ−ＤＮＡ精製キット、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット及びＱｉａｑｕ
ｉｃｋＰＣＲ精製キットは、ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒ
ｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｍａｒａｔｈｏｎ^TM ＲｅａｄｙｃＤＮ
Ａキット、ＭＴＮｃＤＮＡパネル及びＭＴＮノーザンブロットは、Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から
入手した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ^TM部位特異的突然変異誘発キットは、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入
した。全てのＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム９６００サイクラ
ー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実
施した。ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地は、１０ｇ／ｌのトリプトン
、５ｇ／ｌの酵母エキス及び１０ｇ／ｌのＮａＣｌからなる。２ｘＹＴ／アン
ピシリンプレートは、１６ｇ／ｌのトリプトン、１０ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ
／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンからなる
。発現配列標識クローン．クローン番号４１９０７４６、１５４７６４９、３４４８８７２、３６０８６
３９、２６１５３８９及び１３３３９６５は、ＬｉｆｅＳｅｑ^TM発現配列標識（
ＥＳＴ）データベース（ＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎ
ｃ．，Ｐａｌｏａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から取り寄せた。サンプルは、形質
転換された細菌クローンとして送付された。ＰＣＲ及びＤＮＡシークエンシングのためのオリゴヌクレオチド合成．全てのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）ＥｘｐｅｄｉｔｅＭｏｓ
ｓ合成機でβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学法により合成するかまたは
Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に注文した。インサ
ート特異的シークエンシングプライマー（１５及び１６ｍｅｒｓ）は手動で設計
した。ＤＮＡはＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ−２０もしくは−１００陰イオン交換また
はＱｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄ
ｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製し、カラムから３０μｌのＴＥバッファー（１
０ｍＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．０）
中に回収した。シークエンシング反応は、ＡＢＩｐｒｉｓｍＢｉｇＤｙｅ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒサイクルシークエンシングキットを用いて両方の鎖に対し
て行い、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７７ＸＬシーケンサー（Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；ＡＢＩＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ
，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ^TMソフトウェアを配列の組
み立て及び手動編集のために用いた（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ
，ＭＩ，ＵＳＡ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVのクローニング及び配列分析．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ様分子の配列類似性検索。

【００４２】完全なヒト（受託番号Ｍ９９４８７）、ラット（受託番号ＲＮＵ７５９７３）
及びマウス（受託番号ＡＦ０２６３８０）ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩタンパク質配
列、完全なラットＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ（ＧｅｎＢａｎｋ^TM受託番号ＡＦ００
９９２１）タンパク質配列並びに部分ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質配
列（ＧｅｎＢａｎｋ^TM受託番号ＡＦ０１０１４１）を問い合わせ配列として用い
て、ＢＬＡＳＴ（基本局所整列検索手段（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎ
ｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９
９０）検索をＷａｓｈＵＭｅｒｃｋ発現配列標識（ＥＳＴ）データベース及び
製造販売の独占権を持つＬｉｆｅＳｅｑ^TMヒトＥＳＴデータベース（Ｉｎｃｙｔ
ｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）に対して実施した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬに相同性を有する６個
のＥＳＴクローンをＩｎｃｙｔｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから取り寄
せた。ＩｎｃｙｔｅクローンからのプラスミドＤＮＡ調製及びシークエンシング．１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した１００ｍｌのＬＢ培地中で各Ｉｎ
ｃｙｔｅ細菌クローンを３７℃で一晩増やした。Ｑｉａｇｅｎプラスミドミディ
またはマキシキットを製造業者の説明書に従って用いてプラスミドＤＮＡを調製
した。全てのクローンのＤＮＡインサートを両方の鎖に対して完全に配列決定し
た。クローン４１９０７４６は、ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬに対応する配列を
含有し、またイントロンと思われる配列も含み、クローン１３３９６５、１５４
７６４９、３４４８８７２、３６０８６３９は、他のＮＡＡＬＡＤ−アーゼにい
くらかの類似性を有する新規なタンパク質をコードする重複するＤＮＡ配列を含
有し、そしてクローン２６１５３８９は、以前に同定されたＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼにいくらかの類似性を有するさらに別の新規なタンパク質に相当するＤＮＡ配
列を含有した。これらのクローンから得られた新規なタンパク質配列をそれぞれ
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVと称した。ＰＣＲによるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩのクローニング．ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（受託番号Ｍ９９４８７）からの配列データを用
いてＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩの完全なコーディング配列をＰＣＲにより増幅する
ためのプライマーを設計した。用いたプライマーは、ＮＡＡＬＤ１Ｓ２（Ｂａｍ
ＨＩ）＝５’−ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＣＴＣＣ
ＴＴＣＡＣＧＡＡＡＣ−３’及びＮＡＡＬＤ１ＡＳ２（ＸｈｏＩ）＝５’−
ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＴＣ
ＴＣＴＧＣ−３’（導入される制限部位に下線を引く）であった。１ＸＥｘｐ
ａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅ^TM ＰＣＲバッファー２、０．２ｍＭの各
ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプライマーＮＡＡＬＤ１Ｓ１（
ＢａｍＨＩ）及びＮＡＡＬＤ１ＡＳ１（ＸｈｏＩ）、１μｌのＭａｒａｔｈｏｎ
−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡ並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐ
ｌａｔｅＰＣＲミックスを含有する５０μｌの全反応容量で前立腺からのヒト
Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅を実施した。酵
素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリングは９４℃
で４５秒、５５℃で１分、そして６８℃で１分４８秒を３０サイクルであり、７
２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッファー（４０ｍ
ＭＴｒｉｓ−酢酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ（ナトリウム塩）、ｐＨ８．３）中で
１％アガロースゲル（ｗｔ／ｖｏｌ）上で分析し、最も顕著なＤＮＡバンドをゲ
ルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ，
Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。得られた２３０３塩基
対（ｂｐ）フラグメントをオリジナルＴＡクローニングキットを製造業者の説明
書に従って用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１中にクローン化した。約２０
ｎｇの精製したフラグメントを５０ｎｇのｐＣＲ２．１プラスミドＤＮＡに１０
μｌの全容量で４ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。ライゲーション
を１４℃で一晩インキュベートした。２μｌのライゲーション反応をＴＯＰ１０
Ｆ’コンピテント細胞中に熱ショック形質転換を用いて形質転換し、青色−白色
スクリーニングのためにＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを補足した２ｘＹＴ／アミピ
シリンプレート上で平板培養した。コロニースクリーニングを１０個の白色コロ
ニーに対して実施し、ＱｉａｇｅｎプラスミドミニＤＮＡ精製キットを用いてこ
れらからプラスミドＤＮＡを調製し、次に、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化した
。適当な大きさのインサートを含有する４個のクローンを完全に配列決定した。
全てのクローンは少なくとも１個のミスセンスＰＣＲエラーを有した。位置１１
８３で単一のＰＣＲエラーを有するクローン１０．０をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ^TM ＳＤＭキットを用いる部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）反応の鋳型として
用いた。製造業者の説明書に従って反応を実施した。増幅反応のために設計した
プライマーは、ＮＡＡＬＤ１−ＳＤＭ−Ｓ１＝５’−ＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴ
ＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＧ−
３’及びＮＡＡＬＤ１−ＳＤＭ−ＡＳ１＝５’−ＣＣＴＣＡＣＡＡＴＴＴＣ
ＡＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧ−３’
であった。ＳＤＭ形質転換からの３個の白色クローンをスクリーニングした。Ｑ
ｉａｇｅｎプラスミドミニＤＮＡ精製キットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し
、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、突然変異部位の周りを配列決定した。完全
な誤りのないＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ配列を確かめるために１個のクローン（ｃ
ｌ．２．０）を両方の鎖に対して完全に配列決定した。ＰＣＲ及びｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲによるＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＬのクローニング．部分ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ（ジーンバンク受託番号ＡＦ１０１４１）か
らの配列データを用いてＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの３’末端をＰＣＲにより増幅
するためのプライマーを設計した。用いたプライマーは、ＮＡＡＬＤ２Ｓ１＝５
’−ＧＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＧ−３’及びＮ
ＡＡＬＤ２ＡＳ１（ＸｈｏＩ）＝５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＧＧＡＧ
ＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧ−３’であった。脳、胎児脳、前立
腺、小腸、結腸からのヒトＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡを増幅反
応に用いた。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバッ
ファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプライ
マーＮＡＡＬＤ２Ｓ１及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ１、１μｌのＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒ
ｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡ並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉ
ｔｙＰＣＲミックスを含有する５０μｌの全反応容量で１回目のＰＣＲ増幅を
実施した。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリ
ングは９４℃で４５秒、５８℃で１分、そして７２℃で１分を３０サイクルであ
り、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッファー中
で１％アガロースゲル上で分析した。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅ
ｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオ
リゴヌクレオチドプライマーＮＡＡＬＤ２Ｓ２及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ２並びに２
．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲミックスを含有す
る５０μｌの全容量でネスティッドプライマーＮＡＡＬＤ２Ｓ２＝５’−ＧＧＣ
ＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＡＣ−３’及びＮＡＡＬＤ２
ＡＳ２（ＸｈｏＩ）＝５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡＧ
ＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧ−３’、１μｌの１回目の増幅反応を用いて２回目
のＰＣＲ増幅を実施した。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱
した。サイクリングは９４℃で４５秒、５７℃で１分、そして７２℃で１分を３
０サイクルであり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡ
Ｅバッファー中で１％アガロースゲル上で分析し、最も顕著なＤＮＡバンドをゲ
ルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製した。得られたフラグ
メント６００−８００ｂｐを前記のようにＣＲ２．１中にクローン化した。ライ
ゲーションを１４℃で一晩インキュベートし、ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞
中に形質転換し、青色−白色スクリーニングのためにＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを
補足した２ｘＹＴ／アンピシリンプレート上で平板培養した。各形質転換から
５個の白色コロニーに対してコロニースクリーニングを実施した。Ｑｉａｇｅｎ
プラスミドミニＤＮＡ精製キットを用いてこれらのコロニーからプラスミドＤＮ
Ａを調製し、次にＥｃｏＲＩで消化した。適当な大きさのインサートを含有する
プラスミドをベクタープライマーを用いて末端配列決定し、次に、推定されるＮ
ＡＡＬＡＤ−アーゼＬクローンの両方の鎖に対する完全なシークエンシングを実
施した。小腸から得られたクローン６．９は翻訳終止コドンまで達した。

【００４３】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの未知の５’コーディング配列を得るために、２
個のアンチセンスプライマーをｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）の
ために設計した。これらのプライマーは、ＮＡＡＬＤ２ＡＳ３＝５’−ＧＣＣ
ＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧ−３’及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ４
＝５’−ＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣ−３’であっ
た。脳、胎児脳、前立腺、小腸及び結腸からのヒトＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄ
ｙ^TM ｃＤＮＡを製造業者の説明書に従って５’ＲＡＣＥに用いた。オリゴ−ｄ
Ｔプライミング及びｃＤＮＡの５’末端に連結したＭａｒａｔｈｏｎｃＤＮＡ
アダプター（２つの異なるアダプター−プライマーアニーリング部位を含む）を
用いてＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡを調製した。アダプター−プ
ライマーＡＰ１（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ
ＴＡＧＧＧＣ−３’）及びネスティッドアダプター−プライマーＡＰ２（５’
−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’）はキット
中に含まれた。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバ
ッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプラ
イマーＡＰ１及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ３、５μｌのＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ^TM ｃＤＮＡ並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰ
ＣＲミックスを含有する５０μｌの全反応容量で１回目のＰＣＲ増幅を実施した
。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリングは９
４℃で３０秒、５８℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイクルであり、７
２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッファー中で１％
アガロースゲル上で分析した。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔ
ｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌ
クレオチドプライマーＡＰ２及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ４並びに２．５ＵのＥｘｐａ
ｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲミックスを含有する５０μｌの全容
量で１μｌの１回目の増幅反応を用いて２回目の５’ＲＡＣＥを実施した。酵素
の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリングは９４℃で
３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で１分を３０サイクルであり、７２℃で
７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、前記のようにベクタ
ーｐＣＲ２．１中にクローン化した。ＭｇＣｌ₂を含む１ＸＰＣＲバッファー、
０．２ｍＭｄＮＴＰ、各々０．５μＭのベクタープライマーＭ１３ＦＯＲ（５
’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’）及びＭ１３ＲＥＶ（
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ−３’）並びに０．３５Ｕ
のスーパーＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含有する４５μｌのＰＣＲミックス中
でＰＣＲによるコロニースクリーニングを６０個の白色コロニーに対して実施し
た。コロニーをプレートから取り、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した
１００μｌのＬＢ培地中に接種し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、
５μｌのインキュベートした培養物を４５μｌのＰＣＲミックスに加えた。ＰＣ
Ｒを３０サイクル（９５℃で４５秒、４８℃で１分、そして７２℃で５０秒）実
施した。２０μｌのＰＣＲ反応を１ｘＴＡＥバッファー中で１％アガロースゲ
ル上で分析した。インサートを含有するクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを補足した３ｍｌのＬＢ培地中で一晩増やし、Ｑｉａｇｅｎプラスミドミニ
ＤＮＡ精製キットを用いてプラスミドＤＮＡを調製した。配列決定した５１個の
クローンから１個のクローン４．１０がＮＡＡＬＤ２ＡＳ４の５’の２５８ｂｐ
の配列を含有し、その７０ｂｐは新規であった。

【００４４】５’ＲＡＣＥクローン（ｃｌ．４．１０）及び３’ＰＣＲクローン（ｃｌ．６
．９）を両方ともＢａｍＨＩで消化した。消化した材料を１ＸＴＡＥバッファ
ー中で１％アガロースゲル上で泳動した。全ての付加的な５’ＲＡＣＥＤＮＡ
配列を含有するｃｌ．４．１０からの３３６ｂｐバンド並びにｃｌ．６．９から
の残りの３’ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ及びベクター配列を含有する^〜４７００ｂ
ｐフラグメントの２本のバンドを切り出した。ゲル切片をＱｉａｑｕｉｃｋゲル
抽出キットで精製した。フラグメントのそれ自体との自己連結を防ぐために、２
個のフラグメントのうち大きい方を１．５Ｕの仔ウシ腸アルカリホスファターゼ
で３７℃で１時間脱リン酸化し、次に７５℃で２０分間熱不活性化した。前記の
ようにライゲーションを実施し、２μｌの反応混合物を３５μｌのＤＨ１０ｂ電
気コンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞中に電気穿孔（単一
パルス；２５００Ｖ、２５μＦ２０１Ｗ、５ｍｓ）により形質転換した。電気
穿孔したサンプルを１ｍｌのＳＯＣ培地に加え、３７℃で１時間インキュベート
し、その後、１００μｌの培養物を２ｘＹＴ／アンピシリンプレート上で平板
培養した。翌日コロニーを選び、プラスミドＤＮＡを調製し、制限消化により試
験した。１個のクローン（ｃｌ．２．０）を両方の鎖に対して完全に配列決定し
、完全な３’コーディング配列及び最初の５’ＲＡＣＥ反応からの付加的配列を
含有することが判明した。ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのさらなる５’コーディ
ング配列を得るために、Ｉｎｃｙｔｅクローン番号４１９０７４６からの配列に
対応する２個の新しいアンチセンスプライマーを合成した。用いたプライマーは
、ＮＡＡＬＤ２ＡＳ５＝５’−ＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＣＴ
ＴＣＴＧＴＧ−３’及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ６＝５’−ＣＡＡＡＣＡＣＧＡ
ＴＴＧＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣ−３’であった。脳、胎児脳、前立腺、小
腸、結腸及び心臓からのヒトＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡを製造
業者の説明書に従ってｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）に用いた。
１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．
２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプライマーＡＰ１及
びＮＡＡＬＤ２ＡＳ５、５μｌのＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡ並
びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲミックスを
含有する５０ＭＧの全反応容量で１回目のＰＣＲ増幅を実施した。酵素の添加前
にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリングは９４℃で３０秒、
５８℃で３０秒、そして７２℃で１分を３０サイクルであり、７２℃で７分の最
終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−酢
酸塩、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中で１％アガロースゲル上で分析した。
１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．
２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌクレオチドプライマーＡＰ２及
びＮＡＡＬＤ２ＡＳ６並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉ
ｔｙＰＣＲミックスを含有する５０μｌの全容量で１μｌの１回目の増幅反応
を用いて２回目のＰＣＲ増幅を実施した。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５
分間前以て加熱した。サイクリングは９４℃で３０秒、７５℃で３０秒、そして
７２℃で１分を３０サイクルであり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ
産物を１ＸＴＡＥバッファー中で１％アガロースゲル上で分析し、８本の最も
顕著なＤＮＡバンドをゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精
製した。得られたフラグメント（４００〜１３００ｂｐ）をオリジナルＴＡクロ
ーニングキットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１中にクローン化した。
ライゲーション及び形質転換を前記のように実施し、その後、青色−白色スクリ
ーニングのためにＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを補足した２ｘＹＴ／アンピシリン
プレート上で平板培養した。各形質転換から５個の白色コロニーに対してコロニ
ースクリーニングを実施した。ＱｉａｇｅｎプラスミドミニＤＮＡキットを用い
てこれらのコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで消化した。適
当な大きさのインサートを含有するプラスミドをベクタープライマーを用いて末
端配列決定し、次に、推定されるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬクローンの完全な配列
をプライマー歩行を用いて決定した。小腸ｃＤＮＡからの５個のクローンのＤＮ
Ａ配列は、推定される翻訳開始コドンを越えて５’方向にＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
Ｌのコーディング配列を伸ばし、そして５’非翻訳領域の一部を含んだ。これら
のクローンのうち１個（ｃｌ．２．２）をさらなる実験のために用いた。

【００４５】全長ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬクローンを構築するために、アミノ酸配列の変化
またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のフレームシフトをもたらさず
にＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのＤＮＡ配列中に独特な制限部位（ＭｕｎＩ）を導入
するように２つの新しいプライマー組を設計した。第一のプライマー組は、ＮＡ
ＡＬＤ２Ｓ３（ＥｃｏＲＶ）＝５’−ＣＧＧＡＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴ
ＧＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＡＧ−３’及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ８（ＭｕｎＩ）＝
５’−ＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＧＣ−３’
であり、第二のプライマー組は、ＮＡＡＬＤ２Ｓ８（ＭｕｎＩ）＝５’−ＧＣＧ
ＴＣＣＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧ−３’及びＮＡＡＬ
Ｄ２ＡＳ１（ＸｈｏＩ）であった。プライマーＮＡＡＬＤ２Ｓ３（ＥｃｏＲＶ）
及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ８（ＭｕｎＩ）を用いて１μｌのｃｌ．２．０プラスミド
ＤＮＡに対してまたはプライマーＮＡＡＬＤ２Ｓ８（ＭｕｎＩ）及びＮＡＡＬＤ
２ＡＳ１（ＸｈｏＩ）を用いて１μｌのｃｌ．２．２プラスミドＤＮＡに対して
ＰＣＲ増幅を実施した。全反応容量は前記のとおりであった。ＥｘｐａｎｄＨ
ｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱
した。サイクリングは９５℃で４５秒、５７℃で１分、そして７２℃で１分を３
０サイクルであり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡ
Ｅバッファー中で１％アガロースゲル上で分析し、前記のようにｐＣＲ２．１中
にＴＡクローン化した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのスプライス変異体分析．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ特異的プライマーを用いたＰＣＲ反応において、予期
しない大きさの多数の増幅ＰＣＲ産物が認められた。多数の異なるｃＤＮＡを用
いてこれらのＰＣＲ反応を繰り返し、前記のように、バンドを切り出し、精製し
、その後でオリジナルＴＡクローン化した。これらのクローンからプラスミドＤ
ＮＡを調製し、可能性があるスプライス変異体を同定するためにインサートを両
方の鎖に対して完全に配列決定した。ＰＣＲ及びｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲによるＮＡＡＬＡＤ
−アーゼIIのクローニング．Ｉｎｃｙｔｅクローン３６０８６３９からのシークエンシング結果は、このク
ローンが、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬに類似した配列を有するＮＡＡＬＡＤ
−アーゼ様分子（ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII）と推定される、２２２０ｂｐの大き
さの、完全なコーディング配列にまたがるＤＮＡ配列を含有することを示唆した
。すでに決定した開始コドンの上流に可能性がある開始コドンがないことを確か
めるために５’ＲＡＣＥＰＣＲを実施した。クローン３６０８６３９から得ら
れた配列に基づいて５’ＲＡＣＥのために２個のアンチセンスプライマー、ＮＡ
ＡＬＤ３ＡＳ１＝５’−ＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＧＣＧＣＡＣＡＧＡＡ
ＧＴＧＧ−３’及びＮＡＡＬＤ３ＡＳ２＝５’−ＧＧＡＡＡＧＡＴＧＣＣＡ
ＧＣＧＣＡＧＧＡＣ−３’を設計した。脳、胎児脳、前立腺、小腸及び結腸
からのヒトＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡを製造業者の説明書に従
って５’ＲＡＣＥに用いた。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^T ^M ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌク
レオチドプライマーＡＰ１及びＮＡＡＬＤ３ＡＳ１、５μｌのＭａｒａｔｈｏｎ
−Ｒｅａｄｙ^TM ｃＤＮＡ並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅ
ｌｉｔｙＰＣＲミックスを含有する５０μｌの全反応容量で１回目のＰＣＲ増
幅を実施した。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイ
クリングは９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、そして７２℃で２分を３０サイク
ルであり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈ
Ｆｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２
μＭのオリゴヌクレオチドプライマーＡＰ２及びＮＡＡＬＤ３ＡＳ２並びに２．
５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲミックスを含有する
５０μｌの全容量で１μｌの１回目の増幅反応を用いて２回目の５’ＲＡＣＥを
実施した。酵素の添加前にサンプルを９４℃で５分間前以て加熱した。サイクリ
ングは９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、そして７２℃で１分を３０サイクルで
あり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッファー
中で１％アガロースゲル上で分析し、最も顕著なＤＮＡバンドをゲルから切り出
し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製した。得られたフラグメント（２５
０−６００ｂｐ）を前記のようにプラスミドｐＣＲ２．１中にクローン化した。
３２個の白色コロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補足した３ｍｌのＬ
Ｂ培地中で一晩増やし、ＱｉａｇｅｎプラスミドミニＤＮＡ精製キットを用いて
プラスミドＤＮＡを調製した。分析した３２個のクローンのいずれからも上流の
開始コドンは同定されなかった。ＰＣＲによるＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVのクローニング．Ｉｎｃｙｔｅクローン２６１５３８９からのシークエンシング結果は、このク
ローンがＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ及びIIに配列が関係する別のＮＡＡＬＡＤ
−アーゼ様分子（ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV）と推定される部分コーディング配列
及び３’ＵＴＲを含有することを示した。得られたＤＮＡ配列をＩｎｃｙｔｅ
ＬｉｆｅＳｅｑ^TM ＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索において用いた
。１５０の重複するＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列から１個のコンティグ（２５１９
８４１）が組み立てられ、それは１８８１ｂｐにまたがり、１４１９ｂｐのコー
ディング領域を含有した。ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVコンティグ２５１９８４
１からの配列データを用いて完全なコーディング配列をＰＣＲにより増幅するた
めのプライマーを設計した。用いたプライマーは、ＮＡＡＬＤ４ＳＰ２＝５’−
ＣＧＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＴＡＴＣＡＧＡＴＴＡＴＣ−３’及びＮ
ＡＡＬＤ４ＡＰ４＝５’−ＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＴＧＣＡ
ＧＡＣＣＣ−３’であった。１ＸＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔ
ｙ^TM ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各々０．２μＭのオリゴヌ
クレオチドプライマーＮＡＡＬＤ４ＳＰ２及びＮＡＡＬＤ４ＡＰＡ４、１μｌの
ｃＤＮＡ並びに２．５ＵのＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙ^TM ＰＣ
Ｒミックスを含有する５０μｌの全反応容量でヒト海馬ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ
増幅を実施した。酵素の添加前にサンプルを９５℃で５分間前以て加熱した。サ
イクリングは９４℃で４５秒、５８℃で１分、そして７２℃で３５秒を３０サイ
クルであり、７２℃で７分の最終工程を含んだ。ＰＣＲ産物を１ＸＴＡＥバッ
ファー中で１％アガロースゲル上で分析し、最も顕著なＤＮＡバンドをゲルから
切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製した。得られた１５４４ｂｐ
のＤＮＡフラグメントをＴＡＴＯＰＯクローニングキットを製造業者の説明書
に従って用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にサブクローン化
した。約１０ｎｇの精製したフラグメントを１０ｎｇのｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ
プラスミドＤＮＡに連結した。ライゲーションを２５℃で５分間インキュベート
した。ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテント細胞中への形質転換及びコロニースクリーニ
ングを前記のように実施した。適切な大きさのインサートを含有する３個のクロ
ーンを完全に配列決定し、２個のクローンがいかなるＰＣＲエラーも含有しない
ことが判明した（ｃｌ．２８．０及びｃｌ．１．０）。ＣＯＳ細胞において一過性発現させたＮＡＡＬＡＤ−アーゼの活性測定．発現ベクター中へのＮＡＡＬＡＤ−アーゼのサブクローニング．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに基づくプラスミドベクターｐ
ｃＤＮＡ−３中にＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVクローンを各々サブク
ローン化した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２．０）をＢａ
ｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化して完全なＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ配列を切り出した。
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ−５’／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２．０）をＥｃｏＲＶ／
ＭｕｎＩ消化し、そしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼII−３’／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．
２．２）をＭｕｎＩ／ＸｈｏＩで消化して完全なＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ配列の
２つの半分を切り出した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII／ｐＩＮＣＹＴＥをＥｃｏＲ
Ｉで消化して完全なＮＡＡＬＡＤ−アーゼII配列を切り出した。ＮＡＡＬＡＤ−
アーゼIV／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２８．０）をＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで消化し
て完全なＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV配列を切り出した。フラグメントをゲル精製し
、適当な制限酵素で前以て消化した脱リン酸化したｐｃＤＮＡ３中にサブクロー
ン化した。得られた発現構築物を前記のような完全な配列分析により確かめた。
ＣＯＳ細胞中への一過性トランスフェクション．ＣＯＳ細胞を完全培地（１０％ウシ胎仔血清、１Ｘ非必須アミノ酸及び１Ｘス
トレプトマイシン／ペニシリン／グルタミンミックスを補足したＤＭＥＭ）中で
維持した。トランスフェクションの前に、３７℃に前以て温めたＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺ を含まないＰＢＳで細胞を２回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を１〜２分間
加えることにより培養プレートから離した。１６００ｒｐｍで１０分回転後に細
胞を集め、１〜２ｍｌの平衡化した（５％ＣＯ₂／９５％空気）前以て温めた培
地中に再懸濁した。細胞力価をＣｏｕｌｔｅｒ計数器で測定し、細胞を１５００
０細胞／ｃｍ²の密度で６ウェルプレート中に接種し、約８０％融合に到達させ
た（〜２日の生育）。各トランスフェクションのために６μｌのＦｕＧＥＮＥ６
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を９６μｌの無
血清培地に加え、２０℃で５分間インキュベートした。１μｇのＮＡＡＬＡＤ−
アーゼ／ｐｃＤＮＡ３ＤＮＡを含有する別のチューブにこの調製物を加え、穏
やかに混合し、室温で１５分間静置させた。２ｍｌの新しい完全培地を含有する
ウェル中にＤＮＡ／ＦｕＧＥＮＥ６／無血清培地ミックスをピペットで移した。
細胞を３７℃のインキュベーター中で７２時間インキュベートし、その後集めた
。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ相同物の生物学的活性の測定．以前に記述されたように（Ｂｌａｋｅｌｅｙｅｔａｌ．，１９８８）Ｎ−
アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−（３，４−［³Ｈ］）−グルタメートの加水
分解の量の測定によりＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性を定量した。トランスフェクシ
ョンしたＣＯＳ細胞ペレットを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０
．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とインキュベートし、ボルテックスした。アッ
セイに用いる前にホモジネートを液体Ｎ₂中で少なくとも１回の凍結／融解サイ
クルに供した。３μＭのキスカル酸塩／１％ＤＭＳＯ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の存
在下または非存在下で５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭＺ
ｎ²⁺Ｃｌ₂、５００ｎＭＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−（３，４−［³
Ｈ］）−グルタメート（［³Ｈ］−ＮＡＡＧ）及び１０〜２００μｇの膜タンパ
ク質を含有する２００μｌの全容量で全てのアッセイを構成した。３７℃で前以
てインキュベートしたアッセイ混合物に膜ホモジネートを加えることによりアッ
セイを開始した。アッセイ混合物をボルテックスし、様々な時間３７℃でインキ
ュベートした。２００μｌのよく冷えた２５０ｍＭリン酸カリウムを加え、反応
チューブを氷水中に置くことにより反応を止めた。１４０００ｒｐｍで５分の遠
心分離工程後、ＭｉｌｌｉＱ水で前以て洗浄した４ｃｍの陰イオン交換ミニカラ
ム（Ｂｉｏ−ＲａｄＡｇｌ−Ｘ８）上にアッセイサンプルを載せた。カラム
を２ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水で２回、次に２ｍｌの０．５Ｍギ酸で２回すすいで［ ³ Ｈ］−グルタメートを選択的に溶出した。残っている基質は、７．５Ｍギ酸で
溶出することができた。アッセイ溶出液をシンチレーションカクテル（１６ｍｌ
ＵｌｔｉｍａＧｌｏｄＸＲ）で希釈し、シンチレーションカウンター（Ｐ
ａｃｋａｒｄ）で計数した。（膜にさらされていない）ブランクをいつも差し引
いた。３００μＭまでの範囲のキスカル酸塩（ＱＡ）の濃度を用いて同様の条件
下で阻害曲線を実施した。反応の停止前にＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩでは３０分間
、そしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ及びIIでは６０分間反応を続けた。高処理量スクリーニングのためのＳＰＡ開発．１ｍＭＺｎＣｌ₂を含有する５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４の存在
下でＮＡＡＬＡＤ−アーゼアッセイを３７℃または２５℃で１０分間実施した。
４０ｎＭ ³［Ｈ］−ＮＡＡＧ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１
ｍＭＺｎ²⁺Ｃｌ₂及び１０μｇの組換えＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩまたはＬＮＣａ
Ｐ細胞膜調製物のいずれかを含有する１００μｌの反応容量で各アッセイを実施
した。１００μｌのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）及び１ｍｇの裸のＹＳ
−ＳＰＡビーズの添加により反応を止めた。ビーズを３０分間沈降させた後、ア
ッセイ混合物をマイクロタイタープレートシンチレーションカウンターで計数し
た。ＦＩＳＨによるＮＡＡＬＡＤ−アーゼの染色体位置確認．染色体マッピング研究は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩ
ＳＨ）分析を用いてＳｉｄｎｅｙＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ（ＮｏｒｔｈＹｏ
ｒｋ，ＯｎｔａｒｉｏＣａｎａｄａ）により実施された。スライド調製．ヒト血液から単離したリンパ球を１０％ウシ胎仔血清及びフィトヘマグルチニ
ンを補足したα−最少必須培地（ＭＥＭ）中で３７℃で６８〜７２時間培養した
。リンパ球培養物をＢｒｄＵ（０．１８ｍｇ／ｍｌ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理して細胞集団
を同調させた。同調した細胞を無血清培地で３回洗浄してブロックを外し、チミ
ジン（２．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を含むα−ＭＥＭ中で３７℃で６時間再
培養した。細胞を集め、低張処理、固定及び風乾を包含する標準的な方法を用い
てスライドを調製した。ＦＩＳＨ検出：ＢｉｏＮｉｃｋ標識システム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いてプローブ（ＢａｍＨ
Ｉ／ＸｈｏＩで切断したＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２．０
）；ＸｈｏＩで切断したＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２．０
）；ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで切断したＮＡＡＬＡＤ−アーゼII／ｐｃＤＮＡ３
（ｃｌ．３．０）；ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩで切断したＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV
／ｐＣＲ２．１（ｃｌ．２８．０））を１５０℃で１時間ｄＡＴＰでビオチニル
化した。以前に記述されたように（Ｈｅｎｇｅｔａｌ，１９９２；Ｈｅｎｇ
＆Ｔｓｕｉ，１９９３）ＦＩＳＨ検出の方法を実施した。スライドを５５℃
で１時間焼いた。ＲＮアーゼ処理後、スライドを２ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣは
３ＭＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０である）中７０％の
ホルムアミド中で７０℃で２分間変性させ、続いてエタノールで脱水した。５０
％のホルムアミド及び１０％のデキストラン硫酸からなるハイブリダイゼーショ
ンミックス中でプローブを７５℃で５分間変性させた。次に、変性させた染色体
スライド上にプローブを載せた。一晩のハイブリダイゼーション後、スライドを
洗浄し、検出した。写真を撮ることによりＦＩＳＨシグナルとＤＡＰＩバンディ
ングパターンを別個に記録し、ＤＡＰＩバンドのついた染色体とＦＩＳＨシグナ
ルを重ね合わすことにより染色体バンドとＦＩＳＨマッピングデータとの割り当
てを実施した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼの組織分布．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びIVのノーザンブロット分析．非神経組織由来の２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含有するヒトＭＴＮノーザン
ブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TMハイブリダイゼーション溶液中で製造業者の
説明書に従って６８℃で２〜３時間ハイブリダイズさせた。ＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼII／ｐｃＤＮＡ３（ｃｌ．３．０）からＥｃｏＲＩ及びＢｇｌIIでの消化後に
５４６ｂｐのＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIフラグメントを単離し、そしてＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼIV／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ｃｌ．２８．０）からＰｓｔＩでの消
化後にＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV ５２６ｂｐフラグメントを単離した。Ｒａｐｉ
ｄＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＬａｂｅｌｌｉｎｇキット及び［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ
を標識として用いてこれらのＤＮＡフラグメントで放射性標識したプローブを作
製した。ＭｉｃｒｏｓｐｉｎＳ−２００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
を用いて取り込まれなかった標識を除いた後、６ｍｌのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ^TM ハイブリダイゼーション溶液中５０μｌの放射性の変性したプローブを６８℃で
回転振盪機中で一晩インキュベートした。洗浄は、２ＸＳＳＣ／０．０５％Ｓ
ＤＳ中ＲＴで４Ｘ１５分、０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５０℃で１
Ｘ２０分の洗浄及び０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中５５℃で２Ｘ２０
分及び２Ｘ２０分であった。ブロットを乾燥させずにラップ中に包み、２枚の
増感紙と共にＸ−ｏｍａｔＡＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＦ
ｉｌｍ（ＫｏｄａｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ
，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に−７０℃で２〜４日間感光させた。ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVの遺伝子発現．各ＮＡＡＬＡＤ−アーゼのＰＣＲフラグメントの特異的増幅のために設計した
オリゴヌクレオチドプライマー；ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩプライマーはＮＡＡＬ
ＡＤ１Ｓ３５’−ＧＧＧＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣ
−３’及びＮＡＡＬＤ１ＡＳ３５’−ＧＴＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧ
ＴＣＴＣＴＣＡＣＴＧＡＡＣ−３’であり、３４１ｂｐの産物を生成せしめ
、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬプライマーはＮＡＡＬＤ２Ｓ７５’−ＧＡＣＣＧ
ＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧ−３’及びＮＡＡＬＤ２ＡＳ７
５’−ＧＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧＣＣＣＡＡＧ−３’であり
、３３０ｂｐの産物を生成せしめ、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIプライマーはＮＡＡ
ＬＤ３Ｓ４５’−ＣＡＣＴＡＡＧＡＡＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡ
ＡＧＴＡＣＡＧＣ−３’及びＮＡＡＬＤ３ＡＳ４５’−ＧＡＴＣＡＡＣ
ＴＴＧＴＡＴＡＡＧＴＣＧＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧ−３’であり
、３５３ｂｐの産物を生成せしめ、そしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVプライマーは
ＮＡＡＬＤ４Ｓ１５’−ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＴ
ＧＧＴＧ−３’及びＮＡＡＬＤ４ＡＳ１５’−ＧＣＴＴＴＧＧＡＴＣＣ
ＡＴＧＡＣＡＧＴＣＡＴＧＧ −３’であり、３３６ｂｐの産物を生成せし
めた。各ＮＡＡＬＡＤ−アーゼの各プライマー組をそのＮＡＡＬＡＤ−アーゼを
特異的に増幅し且つ増幅反応において他の３形態と交差反応しないその能力に関
して試験した。陽性コントロールとして同じｃＤＮＡサンプルに対してヒトＧＡ
ＰＤＨのＰＣＲ増幅をＧＡＰＤＨ特異的プライマー５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧ
ＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ −３’（センスプライマー）及び
５’−ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ −３’（ア
ンチセンスプライマー）を用いて実施し、１０００ｂｐフラグメントを生成せし
めた。６個の異なるハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに対して正規
化したヒト複数組織ｃＤＮＡ（ＭＴＣ^TM）パネルに対するＰＣＲ増幅にこれらの
プライマー組を用いた。また、１５の脳領域からのヒトｃＤＮＡもｍＲＮＡから
調製し、３個の異なるハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、クラスリン及びア
クチンのｍＲＮＡ発現レベルに対して正規化した。ＦａｓｔＴｒａｃｋＲ２．
０キット（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＢＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を製造業者
の説明書に従って用いて、注意深く切断した組織サンプルから出発して脳領域ｍ
ＲＮＡを調製した。プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）１５及び５０ＵのＥｘｐａ
ｎｄ^TM逆転写酵素（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ
）を製造業者の説明書に従って用いて１μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを逆転写した
。最後に、３種のトランスフォームした前立腺腫瘍細胞系及び前立腺腫瘍から正
規化したｃＤＮＡを同様に調製した。２または５μｌのｃＤＮＡに対してＮＡＡ
ＬＡＤ−アーゼまたはＧＡＰＤＨ特異的プライマーでのＰＣＲ反応を実施した。
１ＸＡｄｖａｎｔａｇｅＰＣＲバッファー、０．２ｍＭｄＮＴＰ及び０．５
μＭの各ＰＣＲプライマー及び１μｌのＡｄｖａｎｔａｇｅＴａｑポリメラー
ゼミックス中５０μｌの全容量でＰＣＲ反応を実施した（９５℃−３０秒、６８
℃−１分３０秒を３５サイクル）。２５サイクルの完了時にＰＣＲ機械を８０℃
で中断し、反応チューブを取り出し、各ＰＣＲチューブから１５μｌを取り除い
た。次に、チューブを機械に戻し、サイクリング方法を続けた。３０及び３５サ
イクル後にアリコートを同様に取り除いた。取った各サンプルを前記のように１
．０％アガロースゲル電気泳動により分析し、ＥａｇｌｅＥｙｅ II Ｖｉｄ
ｅｏシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用
いて臭化エチジウム染色したゲルの画像を得た。結果ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII、Ｌ及びIVの分子クローニング及び配列分析．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ；ヒト、ラット及びマウスＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ配列
並びにラット及び部分ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質配列とＩｎｃｙｔ
ｅＬｉｆｅＳｅｑ^TMデータベースとの類似性検索により１３個のＥＳＴ配列が
得られ、これらのいくつかは重複し、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬに類似する
推定上新規なタンパク質配列をコードしていた。６個の最も５’のクローンから
得られたＤＮＡを配列決定した。

【００４６】小脳ｃＤＮＡライブラリーからのＩｎｃｙｔｅクローン４１９０７４６は、Ｎ
ＡＡＬＡＤ−アーゼＬに相当する配列を含有した。しかしながら、このクローン
は２セグメントのイントロン配列も含有したので、さらなるクローニング実験の
ために適当でなかった。小腸ｃＤＮＡからＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬコーディング
領域の３’の半分を含有するＰＣＲ産物を増幅するためにＰＣＲ反応を実施した
。これまで未知のヒト５’ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ配列として残りを同定するた
めに、５’ＲＡＣＥＰＣＲを多数のｃＤＮＡに対して実施した。小腸ｃＤＮＡ
を用いた反応から得られた増幅産物のシークエンシングにより、ＮＡＡＬＡＤ−
アーゼＬの完全なコーディング配列を含むさらなる１３４４ｂｐのフラグメント
が得られた。完全なｃＤＮＡ配列は、８０．６ｋＤａの計算分子量及び５．２６
の等電点を有する７４０アミノ酸残基のタンパク質をコードする２２２３ｂｐの
オープンリーディングフレームを含有した（図１）。推定されるＡＴＧ翻訳開始
コドンは、上流にいかなるＡＴＧコドンも検出されずに翻訳開始のために適した
状況にある（Ｋｏｚａｋ，１９８９）。ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬＯＲＦの
分析により、（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２の方法により決定され
た）可能性がある膜にまたがるドメインのいずれかの側にリシン残基が隣接する
、アミノ酸残基６〜２７に及ぶ単一の疎水性の膜にまたがるドメインを含有する
II型内在性膜タンパク質が予測された。図１に示す７個の可能性があるＮ−グリ
コシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）がある。整列プログラムＧｅｎｅｄｏｃを用いて
ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの予測されるタンパク質配列をラットのものと比較
した。ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ配列はラットＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬに７８
％同一であり、８７％類似した。ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラム（ＥＭＢＬ，
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；図２）を用いてこれら２つのタンパク
質配列を整列させた。

【００４７】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII；Ｉｎｃｙｔｅクローン１５４７６４９、３４４８８
７２、３６０８６３９及び１３３３９６５は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩまたはＬ
に類似するが同一ではない同じ遺伝子に由来する配列を含有した。肺癌ｃＤＮＡ
ライブラリーからのクローン３６０８６３９は、７４０アミノ酸残基のタンパク
質をコードする２２２３ｂｐのＯＲＦを含む３１１０ｂｐのＤＮＡ配列を含有し
、これをＮＡＡＬＡＤ−アーゼII（図４）と称した。このオープンリーディング
フレームの分析により、８３．６ｋＤａの計算分子量及び８．５３の等電点が予
測された。推定されるＡＴＧ翻訳開始コドンは、翻訳開始のために適した状況に
あり（Ｋｏｚａｋ，１９８９）、いかなるＡＴＧコドンも上流に検出されなかっ
た。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIは、（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｅｌ，１９８２
の方法により決定された）アミノ酸残基８〜３１に及ぶ疎水性の膜にまたがるド
メインを含有するII型内在性膜タンパク質であると予測された。また、図４に示
す７個の可能性があるＮ−グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）もある。

【００４８】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV；胆嚢ｃＤＮＡライブラリー由来のＩｎｃｙｔｅクロ
ーン２６１５３８９のシークエンシングにより、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬ
にいくらかの類似性を有する遺伝子に由来する配列が同定された。この新規な配
列情報を用いたＩｎｃｙｔｅＥＳＴデータベースにおける相同性検索により、
１８８４ｂｐにまたがり且つ５’及び３’ＵＴＲに加えて１４１９ｂｐのＯＲＦ
を含有する１５０以上の重複するＥＳＴ配列のコンティグが同定された。このＯ
ＲＦの翻訳により、５１．９ｋＤａの計算分子量及び５．９９の等電点を有する
４７２アミノ酸のタンパク質が予測された（図５）。このタンパク質をＮＡＡＬ
ＡＤ−アーゼIVと命名した。推定されるＡＴＧ翻訳開始コドンは、上流にいかな
るＡＴＧコドンも検出されずに翻訳開始のために適した状況にある。ＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼIV配列の分析により、（Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｅｌ，１９８２
の方法により決定された）可能性がある膜にまたがるドメインのいずれかの側に
リシン残基が存在する、アミノ酸３〜約２４に及ぶ疎水性の膜にまたがるドメイ
ンを含有するII型内在性膜タンパク質が予測された。図５に示す５個の可能性が
あるＮ−グリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）がある。

【００４９】整列プログラムＢＥＳＴＦＩＴ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ、Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を用いてＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIV
の予測されるタンパク質配列を相互に比較した。Ｇｅｎｅｄｏｃプログラムによ
り計算された配列の各対間の同一性％及び類似性％を表１に示す。ＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＩ配列は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIに６７％同一であり、ＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＬに３５％同一であり、そしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVに１０％同一で
あった。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ及びIIは３７％同一であった。ＮＡＡＬＡＤ−
アーゼＩ、II、Ｌ及びIVの４個のタンパク質配列をＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログ
ラム（ＥＭＢＬ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて整列させ、
図６に示す。これらのタンパク質間の最も高い保存領域は、２個の予測される触
媒ドメイン中に存在する。標準的パラメーターでＧＣＧ’Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ’
プログラムを、そしてＵＰＧＭＡ法で’Ｇｒｏｗｔｒｅｅ’プログラムを用いて
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、II、Ｌ及びIVの系統図（ｐｈｙｌｏｇｒａｍ）を構築
し、図７に示す。この系統図から、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びIIが最も近縁の
タンパク質であり、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVは遠縁であることが明らかである。

【００５０】他のペプチダーゼとの比較によりＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬにおいて２個
の推定される触媒ドメインが同定されている（Ｂｚｅｇｄａｅｔａｌ．，１
９９７；Ｓｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
Ｉ、II、Ｌ及びIVの複数配列整列を用いて、ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼII、Ｌ及
びIVにおいて同様の推定される触媒ドメインを同定した（図６及び８を参照）。
第一の触媒ドメインは、細菌及び酵母のＺｎ²⁺依存性ペプチダーゼドメイン（Ｂ
ｚｅｇｄａｅｔａｌ．，１９９７）と関係がある。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ
、II、Ｌ及びIVとこれらのペプチダーゼとの整列を図８に示す。Ｚｎ²⁺結合に重
要な５個全ての残基は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼファミリーにおいて保存されてい
る。さらに、触媒作用において役割を果たすと考えられるＧｌｕ残基も存在する
。また、より遠縁であるが、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV配列も、Ｂｌａｓｔｐアル
ゴリズムにより決定した場合に細菌及び酵母のアミノ−ペプチドＺｎ²⁺結合ドメ
インに統計学的に有意な類似性を示す（〜６０％類似する、ｐ＝１０−５）。第
二の触媒ドメインは、タンパク質のα／β加水分解酵素フォールドファミリー（
Ｓｈｎｅｉｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７）のメンバーと関係がある。興味深
いことに、酵素触媒活性において重要である可能性がある（Ｇｏｏｓｓｅｎｓ
ｅｔａｌ．，１９９５）保存された求核試薬−酸−塩基の整列がＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＩ、II及びＬ中にある。ラットＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬは、ジペプチジ
ルペプチダーゼIV（ＤＰＰIV）に類似して、ペプチダーゼのα／β加水分解酵素
フォールドファミリーに属することが示唆されている。それに反して、他のＮＡ
ＡＬＡＤ−アーゼタンパク質より約２７０残基短いＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVはこ
のドメインを欠いている。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの選択的スプライシング．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのクローニング及びＲＴ−ＰＣＲ遺伝子発現分析の間
に多数の増幅ＰＣＲ産物が認められ、それらを単離し、可能性があるスプライス
変異体を同定するために配列決定した。推定されるエキソン配列のスプライシン
グ除去及びＧＴ／ＡＧ供与／受容部位の存在により判断されるようなイントロン
配列の存在の両方が見いだされ、これらは我々のｃＤＮＡ調製物から繰り返し増
幅された（図３）。５’ＲＡＣＥ増幅を実施した場合、塩基４９７〜６１９及び
９０３〜１００７の欠失が小腸及び結腸において同定され、これらは２つのイン
フレームのアミノ酸欠失をもたらした。さらに、１５３ｂｐのイントロンが塩基
１０９４で挿入されていることが見いだされ、５１アミノ酸残基のインフレーム
のアミノ酸挿入をもたらした。この挿入は、その５’及び３’末端にそれぞれ共
通のＧＴ／ＡＧ供与受容部位を有するのでイントロンであると最も思われる。３
’ＲＡＣＥ増幅反応においてもいくつかの変異体が小腸、結腸、脳及び胎児脳か
らの増幅において同定された。これらは塩基１５２５〜１６１５の欠失または塩
基１５２５〜１６９７間のより大きい欠失のいずれかからなった。これらの欠失
は両方とも、フレームシフト及びタンパク質配列の早すぎる終結をもたらした。
最後に、調べたどのｃＤＮＡサンプルにおいても、２つのイントロン配列が塩基
１６９７及び／または塩基１８７０のいずれかで挿入されていることが見いださ
れた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのＯＲＦ中にこれらのイントロン配列の一方また
は両方が含まれることにより、ＲＴ−ＰＣＲ実験において４２０及び５００ｂｐ
に移動する予期しない増幅ＰＣＲ産物が説明された。一方または両方のこれらの
配列の導入は、アミノ酸コーディング配列のフレームシフトをもたらす（図３）
。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼの発現及び機能活性．新たに同定されたＮＡＡＬＡＤ−アーゼがペプチダーゼ活性を有するかどうか
を決定するために、哺乳類発現構築物をＣＯＳ細胞中に一過性トランスフェクシ
ョンした。擬似（ｍｏｃｋ）トランスフェクションからの膜を陰性コントロール
としていつも同時に調製した。アッセイの操作条件を確立するためにＣＯＳ細胞
におけるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩの発現を陽性コントロールとして実施した。図
９Ａは、組換えＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩと［³Ｈ］−ＮＡＡＧとのインキュベー
ション後にミニカラムから溶出されるｄｐｍ単位の［³Ｈ］−グルタメートの量
を示す。増加する［³Ｈ］−グルタメートが時間に依存してカラムから溶出され
る。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ（データは示されない）及びＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
II（図９Ｂ）の両方で活性が認められ、これらの酵素がこのアッセイにおいてＮ
ＡＡＬＡＤ−アーゼＩと同様のジペプチダーゼ活性を有することを示唆した。こ
れらのアッセイ条件下ではいかなるＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVジペプチダーゼ活性
も認められなかった。反応への３０μＭキスカル酸の添加は、この活性を６０分
後に５０％以上阻害した（図９Ａ及び９Ｂ）。増加する濃度のＱＡでの阻害曲線
も実施し（図９Ｃ）、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIに対し
てそれぞれ１．２ｘ１０^-5Ｍ及び１．７ｘ１０^-5ＭのＩＣ₅₀値であった。

【００５１】また、組換えタンパク質またはＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性を含有することが既
知の供給源からの膜調製物のいずれかを用いるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ型活性のス
クリーニングを容易にするためにシンチレーション近接アッセイ（Ｓｃｉｎｔｉ
ｌｌａｔｉｏｎｐｒｏｘｉｍｉｔｙａｓｓａｙ）（ＳＡＰ）も開発した。最
初に、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ含有量が多いＬＮＣａＰ膜調製物を用いて［³Ｈ
］−ＮＡＡＧ加水分解の時間経過を実施した（図１０Ａ）。グリシンバッファー
で反応を停止することにより、残っている［³Ｈ］−ＮＡＡＧ基質のＳＰＡビー
ズへの結合がもたらされ、一方、加水分解された［³Ｈ］−グルタメートは結合
しないままであった。従って、反応が進み、基質が加水分解されるにつれて、ビ
ーズに結合するシグナルの減少が見られる。これらのＳＰＡ条件下で、増加する
濃度のＱＡを用いてＬＮＣａＰ膜または組換えＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ膜調製物
に対して阻害曲線を実施した（図１０Ｂ）。ＩＣ₅₀値は、ＬＮＣａＰ調製物では
９．１ｘ１０^-7Ｍ、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ調製物では１ｘ１０^-6Ｍであっ
た。染色体位置確認．ＦＩＳＨ分析のためのプローブとしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩの完全なコーデ
ィング配列を用いた。用いた条件下で、このプローブのハイブリダイゼーション
効率は約７１％であった（１００の調べた有糸分裂像（Ｆｉｇｕｒｅｓ）の中で
、それらの７１が染色体の１対上にシグナルを示した）。特定の染色体を同定す
るためにＤＡＰＩバンディングを用い、プローブからのシグナルと第１１染色体
の短腕の割り当てが得られた。１０枚の写真からの要約データに基づいて詳細な
位置をさらに決定した（図１１）。弱いハイブリダイゼーションシグナルが１１
ｑ１４．３の領域においても低い頻度で検出された。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIか
ら得られたマッピングデータを用いて、この弱いシグナルは交差ハイブリダイゼ
ーションの結果であること（以下参照）及びＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩがヒト第１
１染色体、領域ｐ１１．２１にのみ位置することが結論づけられた。マッピング
結果の例を図１１に示す。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬには、（位置１２０４〜２２
６２ｂｐからの）１０５９ｂｐフラグメントをＦＩＳＨ分析のプローブとして用
いた。ハイブリダイゼーション効率は約７１％であり、ＤＡＰＩバンディングを
用いてシグナルを第１１染色体の長腕に同定した。１０枚の写真から決定した詳
細な位置は、ヒト第１１染色体、領域ｑ１２上であった（図１１）。ＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼIIには、（位置１〜２５５２ｂｐからの）２．５ｋｂフラグメントを
ＦＩＳＨ分析のプローブとして用いた。このプローブのハイブリダイゼーション
効率は約７４％であった。ＤＡＰＩバンディングを用いてシグナルを第１１染色
体の長腕に同定した。１０枚の写真から決定した詳細な位置は、ヒト第１１染色
体、領域ｑ１４．３〜ｑ２１上であった（図１１）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVに
は、（位置１〜１５３９ｂｐからの）１５３９ｂｐフラグメントをＦＩＳＨ分析
のプローブとして用いた。このプローブのハイブリダイゼーション効率は約７２
％であった。ＤＡＰＩバンディングを用いてシグナルを第８染色体の長腕に同定
した。１０枚の写真から決定した詳細な位置（図１１）は、ヒト第８染色体、領
域ｑ２１．３上であった。ノーザンブロットにより決定した場合のＮＡＡＬＡＤ−アーゼIII及びIVの組織
分布．異なる脳領域及び非神経組織におけるＴｒｎＲ３の組織分布をＲＴ−ＰＣＲ、
ノーザンブロット分析及びインサイチューハイブリダイゼーションを用いて調べ
た。異なるヒト組織由来のｍＲＮＡに対してノーザンブロット分析を実施した（
図１２Ａ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII特異的プローブにより、精巣＞＞＞卵巣、
脾臓＞前立腺、心臓及び胎盤における転写産物の存在が示され、他の組織ではい
かなるシグナルも認められなかった。精巣では、４種の転写産物が示された。最
も顕著な転写産物は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIメッセージのおおよその予想され
る大きさと一致する約３．４ｋｂのものであった。それぞれ２．４及び４．４ｋ
ｂの２つの転写産物並びに約７．５ｋｂのより弱い転写産物も存在した。他の組
織では、弱い７．５ｋｂのシグナルも認めることができた卵巣は別として、３．
４ｋｂの転写産物が検出される唯一のシグナルであった。これらの転写産物の明
確な性質はさらなる解明を待つが、メッセージの選択的スプライシングのためで
ある可能性がある。これらのメッセージの性質ははっきしない。ＮＡＡＬＡＤ−
アーゼIV特異的プローブにより、調べた全ての組織における転写産物の遍在する
存在が示され、脳、胸腺及び精巣においてわずかにより少ないシグナルが認めら
れた（図１２Ｂ）。最も顕著な転写産物は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVメッセージ
のおおよその予想される大きさと一致する約２．２ｋｂのものであり、いくつか
の組織では４．４ｋｂで弱いバンドが検出された。ＲＴ−ＰＣＲによるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ遺伝子発現の分析．全てのＮＡＡＬＡＤ−アーゼの詳細な組織分布をさらに調べるために、１６の
異なる組織からの正規化したｃＤＮＡに対してＰＣＲを実施した。図１３Ａは、
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ特異的プライマーで実施したＰＣＲ反応からの結果を示
し、予想される大きさ（〜３４１ｂｐ）の増幅産物が得られた。ＮＡＡＬＡＤ−
アーゼＩの最高発現は前立腺においてであるようであった。２５サイクル後の発
現のランク順は、前立腺＞＞＞肝臓及び腎臓＞小腸＞脳、脾臓であり、他の組織
ではいかなる産物増幅も認められなかった。３０サイクルで増幅産物は、３５サ
イクルの増幅後に初めて産物を認めることができた筋肉、血液及び胸腺を除いて
大部分の他の組織において認めることができた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ特異的
プライマーにより、予想される大きさの３３０ｂｐの増幅産物並びに４２０ｂｐ
及び５００ｂｐのわずかにより大きい大きさで移動する２つの産物が得られた（
図１３Ｂ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ発現は小腸、脾臓及び精巣において最も高
く、２５サイクルの増幅後にＰＣＲ産物が検出され、一方、心臓、卵巣、結腸、
血液及び前立腺における産物は３０サイクル後に認めることができた。全ての組
織は３５サイクル後にいくらかの増幅産物を示し、脳及び筋肉は最も低いレベル
を示した。４２０及び５００ｂｐのバンドは、全ての我々の増幅反応において一
般的に存在する１または２個のイントロン配列を含有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
Ｌ配列の増幅のためであった（前記参照）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII特異的プラ
イマーにより、予想される大きさの３５３ｂｐの増幅産物が得られた（図１３Ｃ
）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII発現は、卵巣、精巣及び脾臓において最も高く、２
５サイクルの増幅後にＰＣＲ産物が検出された。３０サイクル後に増幅産物は、
３５サイクル後に初めて産物を認めることができた肺、筋肉、血液及び胸腺は別
として全ての組織のｃＤＮＡから検出することができた。これらの結果は、ＭＴ
Ｎノーザンブロットで得られた発現データとよく一致する。ＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼIV特異的プライマーにより、予想される大きさの３３６ｂｐの増幅産物が得ら
れた（図１３Ｄ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV発現は全ての組織において低く、３
５サイクル後に初めて増幅産物が検出された。発現レベルは、いかなる発現産物
も明確に認識できなかった脳、肺、筋肉及び胸腺は別として全てのｃＤＮＡにお
いて類似した。ＧＡＰＤＨ特異的プライマーを用いたコントロール増幅反応は、
各ｃＤＮＡに対して類似したレベルの増幅産物を示した（図１３Ｅ）。同じｃＤ
ＮＡを各組の増幅に用いたので、４種のメッセージ間の相対量の比較もこれらの
実験から可能であった。２５及び３０サイクルで検出される増幅産物の相対量に
より判断した場合、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩメッセージの量はＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼIIより多く、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIはＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬより多かっ
た。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVは最も低いレベルで発現され、ＰＣＲ産物は３５サ
イクルの増幅後に初めて検出された。

【００５２】３個の異なるハウスキーピング遺伝子の発現レベルに正規化した１３の異なる
脳ｃＤＮＡに対しても、上記の実験と同じＮＡＡＬＡＤ−アーゼプライマーでＰ
ＣＲ反応を実施した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ特異的増幅産物は、３０サイクル
後に腹側線条及び脳幹の最高レベルで検出された。３５サイクル後にＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼＩ特異的増幅産物は、調べた全ての脳領域において明確に検出するこ
とができた（図１４Ａ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ特異的プライマーにより、予
測される大きさの３３０ｂｐの増幅産物並びに５００ｂｐのより大きい大きさで
移動する産物が得られた（図１４Ｂ）。５００ｂｐの産物の増幅は、３５サイク
ル後に脳幹、扁桃、視床、腹側線条において、そしてより少ない程度で線条及び
海馬において認められ、一方、予想される大きさの３３０ｂｐの産物は、脳幹及
び腹側線条においてのみ認められた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII特異的プライマー
により、予想される大きさの３５３ｂｐの増幅産物が得られた（図１４Ｃ）。増
幅産物は３０サイクル後に線条、頭頂皮質及び腹側線条において認められ、より
低いレベルの増幅産物が海馬、脳幹、被殻及び上丘において検出された。３５サ
イクル後にＮＡＡＬＡＤ−アーゼII特異的産物の存在は、下丘は別として全ての
ｃＤＮＡにおいて検出することができた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV特異的産物は
、３０サイクル後に調べた全ての脳ｃＤＮＡにおいて検出することができ、発現
パターンのわずかな違いが認められた。増幅産物のレベルは、線条、海馬、脳幹
及び腹側線条においてわずかに高かった（図１４Ｄ）。ＧＡＰＤＨ特異的プライ
マーを用いたコントロール増幅反応は、比較的より多くのＧＡＰＤＨ特異的産物
が得られた脳幹は別として各ｃＤＮＡに対して類似したレベルの増幅産物を示し
た（図１４Ｅ）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの全体的な発現は、ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＩ、II及びIVに対してこれらの脳領域ではより低いようである。

【００５３】最後に、３個の異なるハウスキーピング遺伝子に対して正規化した、前立腺腫
瘍細胞系または前立腺腫瘍のいずれかから調製したｃＤＮＡにおいてＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼ発現を調べた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ発現は、ＬｎＣａＰ及び前立
腺腫瘍において最も高かった（図１５Ａ）。増幅産物は３０及び３５サイクル後
にＰＣ−３ｃＤＮＡにおいても検出されたが、ＤＵ１４５ｃＤＮＡでは検出さ
れなかった。３３０ｂｐのＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ産物は、３５サイクル後に前
立腺腫瘍からのｃＤＮＡにおいて最も多量に、そしてＰＣ−３及びＤＵ１４５サ
ンプルではより少なく検出された（図１５Ｂ）。興味深いことに、前立腺腫瘍は
別として全てのサンプルにおいて、より大きい５００ｂｐの増幅産物を検出する
ことができた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII発現は、前立腺腫瘍よりＬｎＣａＰにお
いて高かった。また、３５サイクル後にＰＣ−３では弱い増幅産物も検出するこ
とができたが、ＤＵ１４５ｃＤＮＡではできかった（図１５Ｃ）。ＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼIV発現は、ＬｎＣａＰ及び前立腺腫瘍において最も高かった（図１５
Ｄ）。ＧＡＰＤＨプライマーでの典型的な増幅も示す（図１５Ｅ）．ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩは、カルボキシペプチダーゼ活性及びトランスフェリ
ン受容体に対する配列類似性（５４％同一である、Ｉｓｒａｅｌｉｅｔａｌ
．，１９９３）を有するII型膜糖タンパク質である。それは前立腺腫瘍において
非常に発現されるので、前立腺癌の進行において重要である可能性があり、そし
てＣＮＳでは、ニューロンのグルタミン酸作動活性を調節することにおいて重要
な役割を有する可能性がある。本報告では、タンパク質のこのファミリーの拡張
に相当する、異なるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ酵素をコードするヒトｃＤＮＡの同定
及びクローニングを記述する。本報告において、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ酵素ファ
ミリーの２つの新規なメンバー、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼIVを同定し、ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの完全なコーディング配列を決定
した。アミノ酸配列レベルでのＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ、II及びIVの相違の程度
は、これらが存在する既知の遺伝子の変異体ではなく、このファミリーの新規で
且つ異なるメンバーであることを示す。

【００５４】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩに対して決定されているように、３種全ての受容体に
共通の特徴には、分泌のために適当なアミノ末端の疎水性リーダー配列及びいく
つかの可能性があるＮ−グリコシル化部位の存在が包含される。３種の新規なＮ
ＡＡＬＡＤ−アーゼは全て、膜にまたがっていると思われるそれらのアミノ末端
の約２１〜２４アミノ酸残基の単一の疎水性領域、短い細胞内ドメイン及び大き
い球状の細胞外ドメインを含有する。この構造はII型内在性膜タンパク質に特有
であり、膜結合型加水分解酵素間で共通する（Ｋｅｎｎｙｅｔａｌ．，１９
８２）。これら４個のタンパク質の配列整列比較により、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
IIがＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩに最も近縁であり（アミノ酸レベルで８１％類似す
る）、一方、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬはＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びIIの両方に
同等に類似する（両方に５４％類似する）ことが示唆される。ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼIVは、このファミリーの他のメンバーに遠縁である。

【００５５】異なるＰＣＲプライマー組を用いたＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ配列の分析により
、複数のスプライス変異体及びアイソフォームの存在が示された。ＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＬの生物学的重要性または選択的にスプライスされたアイソフォーム（
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの選択的にスプライスされたアイソフォームの生物学的
重要性）はさらなる解明を待つ。しかしながら、スプライシングされて除かれる
残基はグリコシル化のレベル、より重要なことにはタンパク質の構造及び活性に
影響を及ぼす可能性がある。さらに、多数のｃＤＮＡからの増幅反応において同
定される３つの異なるイントロン配列の包含は、推定される触媒性亜鉛結合ドメ
インの近くのプロリンに富んだ５１アミノ酸残基の配列のインフレーム付加また
はＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質のフレームシフト及び続いて起こる早すぎ
る終結のいずれかをもたらす。これらの早すぎる終結は、α／β加水分解酵素に
おいて見いだされる推定される触媒部位の予測される求核試薬−酸−塩基配置の
除去をもたらし、そしてタンパク質構造の著しい変化をもたらす（図３参照）。
フレームシフト及び早すぎるタンパク質終結をもたらすイントロンＤＮＡ配列の
２つの包含は、調べたほとんど全てのｃＤＮＡにおいて同定され、これらの配列
の発現が活性タンパク質のレベルを調節するために用いられる可能性があること
を示唆する。これらの異なるスプライス変異体の発現研究は、ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＬの構造／活性の関係を理解するために役立ち、そしてタンパク質内のどの
アミノ酸残基が酵素活性のために重要であるかの同定を容易にする。膜にまたが
るドメインを包含する最初の４０アミノ酸残基を欠いているＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼＩの可溶性スプライス変異体が報告されている（Ｓｕｅｔａｌ．，１９９
５）。悪性の前立腺組織では欠失したタンパク質に対する全長タンパク質の増加
した割合が認められ、選択的スプライス変異体の発現が腫瘍の進行と相関する可
能性があることを示唆する。さらなる研究により、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬが腫
瘍形成に関与するかどうか及びこれらのスプライス変異体が異なる程度に腫瘍の
進行をもたらすかどうかが決定される。

【００５６】ヒト組織において、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩｍＲＮＡは前立腺において非常
に並びに肝臓、腎臓及び小腸において、そして脳及び脾臓ではより少ない程度に
発現された。これは、最も高いレベルの発現が脳及び腎臓においてであり、肝臓
または脾臓ではないことが見いだされた（前立腺は調べられなかった；Ｂｚｅｄ
ｇａｅｔａｌ．１９９７；Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９８）ラット
において得られたノーザンブロット結果とこれは部分的に一致する。ＲＴ−ＰＣ
ＲによるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ発現は、脾臓、小腸及び精巣において最も高か
った。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等（１９９７）は、ノーザンブロットにより調べた場
合にラット回腸及びヒト小腸において発現されるが、精巣または脾臓では発現さ
れないラット回腸１００ｋＤタンパク質（Ｉ−１００；ラットＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＬ）を同定した。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ及びＬの発現パターンの相違は、
種の違いまたはノーザンブロットハイブリダイゼーションに比較してＲＴ−ＰＣ
ＲによるｍＲＮＡ検出の増加した感度のいずれかに起因する可能性があった。Ｎ
ＡＡＬＡＤ−アーゼII ｍＲＮＡ発現をノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ実験
の両方により調べた。これらの方法を用いた発現実験は類似した結果をもたらし
、最も高いレベルのｍＲＮＡ発現は精巣及び卵巣において認められ、脾臓、胎盤
及び心臓ではより少ないメッセージが認められた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIプロ
ーブにハイブリダイズする多数の異なる大きさの転写産物が認められ、複数のア
イソフォームの存在を示唆した。これらが生理学的に関係のあるより小さい転写
産物のためであるかまたはｍＲＮＡの完全な状態に関する問題のためであるかど
うかは決定されないままである。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV ｍＲＮＡ発現もまた
両方の技術を用いて調べられ、発現データはこれらの実験間で一致した。ＮＡＡ
ＬＡＤ−アーゼIV発現は、組織間でより均一に分布しているようであり、最も高
い発現は卵巣においてであり、脳、肺、胸腺及び精巣ではほとんどまたは全く発
現されなかった。ＲＴ−ＰＣＲによる異なるヒト脳領域におけるＮＡＡＬＡＤ−
アーゼ発現の分析により、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬがこれらの脳領域において最
も低いレベルで発現されることが示唆される。５００ｂｐに移動する（腹側線条
からのものを除いた）増幅産物は、予測される大きさより大きいものであり、イ
ントロンＤＮＡ配列を含有することが見いだされた（前記参照）。ＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＩ、II及びIVは、調べたほとんど全ての脳領域において異なる程度にｍ
ＲＮＡレベルで発現され、最も高い発現は脳幹、線条、腹側線条及び被殻におい
て認められた。さらに、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII発現は、前頭及び頭頂皮質にお
いて比較的より多量であるようであった。様々な前立腺腫瘍細胞系及び前立腺腫
瘍サンプルに対して実施したＲＴ−ＰＣＲ実験は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩがア
ンドロゲン受容体陽性のＬＮＣａＰ細胞系において最も多量に発現されることを
示す報告（Ｉｓｒａｅｌｉｅｔａｌ．，１９９３）と一致した。また、３０
及び３５サイクルの増幅後にＰＣ−３細胞においてもいくらかの増幅産物が認め
られ、ノーザンブロッティングによりアンドロゲン受容体陰性の細胞ＤＵ−１４
５及びＰＣ−３においていかなるメッセージも検出しない以前の研究（Ｉｓｒａ
ｅｌｉｅｔａｌ．，１９９３）に反した。これらの後者の２つの細胞系では
低レベルのＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性が認められているので、ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＩを包含するこれらの酵素のいくらかの発現が存在する可能性がある（Ｐｉ
ｎｔｏｅｔａｌ．，１９９６）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIもまたＬｎＣａＰ
細胞において最も高いレベルで発現され、一方、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIV発現は
ＰＣ−３細胞において最も高かった。興味深いことに、ＬｎＣａＰ細胞からのＮ
ＡＡＬＡＤ−アーゼＬ増幅産物は、前立腺腫瘍から認められた産物と異なり、予
想される大きさより大きいものであり、イントロン配列を含有した。ＰＣ−３及
びＤＵ−１４５細胞は、大きい及び小さい大きさの両方の増幅産物をもたらした
。

【００５７】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩのカルボキシペプチダーゼ活性は、インビトロで２種
類の基質に対して示されている。第一のものは、Ｎ−アセチルアスパルチルグル
タメート（ＮＡＡＧ）またはｘ−グルタミルグルタメートのようなｘ−結合した
酸性ペプチドを加水分解する酵素の能力に基づき、そして第二のものはホリル−
ポリ−γ−グルタメートまたは−γ−グルタミルグルタメートのようなγ−結合
したペプチドを加水分解するその能力に基づく。本研究では、ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼII、Ｌ及びIVをＣＯＳ細胞において発現させ、ＮＡＡＧを加水分解するこれ
らの組換え調製物の能力を調べた。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、II及びＬは全てこ
の基質に対する活性を示し、それはＱＡにより阻害された。ＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼＩ及びIIのＱＡＩＣ₅₀は、両方のタンパク質に対して約１０μＭであると決定
され、溶解したシナプトソーム膜におけるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性に関して記
述されたもの（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９８７）に匹敵した。ＮＡ
ＡＧのＸ−結合ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ加水分解は、脳からの膜調製物において最
初に特性化され、ＱＡ感受性であることが示された。活性は、二価の陽イオンに
より高められ、そして二価の金属キレート化剤または一般的な金属プロテアーゼ
インヒビターにより阻害された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９８７；
Ｂｌａｋｅｌｙｅｔａｌ，１９８８）。続いて、トランスフェクション実験
後に前立腺特異的マーカー（ＰＳＭ、Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９６）
及びラット脳カルボキシペプチダーゼII（Ｌｕｔｈｉ−Ｃａｒｔｅｒｅｔａ
ｌ．，１９９８）と関連する酵素活性が、ＱＡ感受性ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性
に対して認められたものと同様の酵素特性を表すことが示された。酵母及び細菌
からの亜鉛アミノペプチダーゼとＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩとの整列により触媒部
位中に位置する２個の亜鉛イオンの配位に関与する保存配列のドメインが同定さ
れることが以前に示されている（Ｂｚｅｄｇａｅｔａｌ．，１９９７；Ｒａ
ｗｌｉｎｇｓｅｔａｌ．．１９９７）。これらの結果の根拠は、アエロモナ
ス・プロテオリチカ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａ）亜鉛ア
ミノペプチダーゼの三次元結晶構造に由来し、ここで、残基Ｈｉｓ３７９、Ａ
ｓｐ３８９、Ｇｌｕ４２７、Ａｓｐ４５５、Ｈｉｓ５５５は２個の亜鉛イオ
ンの結合に関与すると考えられ、そしてＧｌｕ４２６は触媒作用において重要な
基本残基であると提示されている（Ｃｈｅｖｒｉｅｒｅｔａｌ．，１９９４
，１９９６）。これらのアミノペプチダーゼと新たに同定されたＮＡＡＬＡＤ−
アーゼとの整列（図８）により、これらの亜鉛結合ドメインが保存されているこ
とが示され、それらが全て同じ触媒機構を共有する可能性があることを示唆する
。Ｂｚｅｄｇａ等（１９９７）は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩが、そのジペプチジ
ルIV及びアシルアミノアシルペプチダーゼ活性のためにα／β加水分解酵素フォ
ールドファミリーのメンバーである可能性があることをさらに示唆しているが、
配列相同性整列はこれらのタンパク質が明らかに異なることを示している。しか
しながら、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ及びIIには求核試薬、酸及び塩基（Ｓｅ
ｒ６２３、Ａｓｐ６６３及びＨｉｓ６８６）の仮定された触媒部位配置が含
まれ、存在するが、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVにはない（図６参照）。プテロイル
−γ−グルタメートのようなペプチドに対するＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩの第二の
γ−結合酵素活性（葉酸加水分解酵素活性）は、ヒト小腸の刷子縁において高レ
ベルで見いだされている（Ｃｈａｎｄｌｅｒｅｔａｌ．，１９８６；Ｐｉｎ
ｔｏｅｔａｌ．，１９９６）。さらに、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩでトランス
フェクションした癌細胞は、増加した葉酸加水分解酵素活性及びγ−グルタミル
結合の加水分解によりメトトレキセートトリグルタメートからグルタメートを累
進的に遊離する能力を示す（Ｐｉｎｔｏｅｔａｌ．，１９９６）。実際、腫
瘍における増加したプテロイル加水分解酵素活性とメトトレキセート抵抗性の間
に相関関係が認められており（Ｂａｎｅｒｊｅｅｅｔａｌ．，１９８６）、
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性を調節することが改善されたまたは新規な癌処置を開
発することにおいて重要である可能性があることを示唆する。共通の二次構造を
有するこれらの新規なＮＡＡＬＡＤ−アーゼ酵素もまた、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
Ｉが記述されているように二重のペプチダーゼ活性を有するかどうか及びそれら
の構造の関係がどのようにそれらの活性を反映するかを決定することは興味深い
。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、II及びＬの染色体位置配置を決定するためにＦＩＳ
Ｈ分析を用いて、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩではｐ１１．２１、ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＬではｑ１２、そしてＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIではｑ１４．３−ｑ２１間で
第１１染色体上に対称的な蛍光シグナルが認められた。我々のＦＩＳＨ研究にお
いて、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩプローブは、１１ｐ１１．２１でハイブリダイズ
するものと１１ｑ１４．３で弱くハイブリダイズするものの２つのハイブリダイ
ゼーションシグナルを示した。これは、１１ｐ１１．２及び１１ｑ１３．５で２
つのハイブリダイゼーションシグナルを認めたＬｅｅｋ等（１９９５）により得
られた結果と類似する。今回、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIが１１ｑ１４．３−ｑ２
１に位置決定されたので、第二のシグナルはＮＡＡＬＡＤ−アーゼII遺伝子座と
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩプローブとの交差ハイブリダイゼーションのためである
ことが明らかである。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVの染色体確認により、ｑ．２１．
３でヒト第８染色体上の対称的な蛍光シグナルが示され、この遺伝子が第１１染
色体上に位置する他の３個の遺伝子と遠縁であることを示唆した。第１１染色体
は、硝子体網膜症（１１ｑ１３−ｑ２３）、色素性乾皮症（１１ｑ１２−ｑ１３
）、アトピー（１１ｑ１２−ｑ１３）及びおそらくより興味深いことにはラット
前立腺癌に関与する腫瘍抑制遺伝子座（１１ｐ１１．２−ｐ１１．１３）を包含
する多数の遺伝病遺伝子座をこれらの領域中に含有する。高い転移率（ｈｉｇｈ
ｌｙｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒａｔｅ）の前立腺細胞中に染色体のこの部分を
導入することにより、これらの細胞のインビボ増殖速度または腫瘍形成を抑制せ
ずに癌転移を抑制することができた（Ｉｃｈｉｋａｗａｅｔａｌ．，１９９
２）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ発現は、減少するアンドロゲンレベルに対応して
増加することが示されているので、アンドロゲンレベルの減少を伴う現在の前立
腺癌処置（例えば、精巣摘除）は少なくとも一つにはＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現
の改変により効くことができる可能性がある（Ｉｓｒａｅｌｉｅｔａｌ．，
１９９４）。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩの酵素活性は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及
びＬのものに類似し、従って、これらの酵素もまた腫瘍抑制において果たす役割
を有する可能性があると同様に考えられる。興味深いことに、領域１１ｑ１３−
ｑ２３は、腫瘍形成ＨｅＬａ／繊維芽細胞ハイブリッドを用いて腫瘍サプレッサ
ー活性を有する領域としても同定されている（Ｍｉｓｒａ及びＳｒｉｖａｔｓａ
ｎ、１９８９）。さらに、原発性子宮頸癌の体系的分析において、領域１１ｑ２
２−ｑ２４は腫瘍サプレッサー活性を含有することが示された（Ｈａｍｐｔｏｎ
ｅｔａｌ．，１９９４）。第１１染色体の長腕上のこれらの後者の２つの腫
瘍抑制領域は、本研究において同定されたＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ及びＮＡＡＬ
ＡＤ−アーゼIIの遺伝子座を含む。しかしながら、これら３つの染色体領域への
これらの腫瘍抑制活性のマッピングは、同定されたＮＡＡＬＡＤ−アーゼのいず
れかが腫瘍または転移抑制活性を有することができるかどうかを決して確定しな
いことに留意すべきである。α−ＮＡＡＧは、脳において最も豊富なペプチドの
一つであり、ある脳領域ではミリモル濃度で存在する（Ｃｏｙｌｅ，１９９７を
参照）。ＮＡＡＧはＬ−グルタメートと同じ場所に位置するのでその生理学的役
割の解明は困難であったが、それは神経伝達物質の規準のいくつかを満たす。そ
れはシナプス小胞中に位置し、神経終末からＣａ²⁺に依存して放出され、そして
脳膜調製物において最初に同定されたＱＡ感受性酵素活性により迅速に不活性化
される（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９８６，１９８７）。クローニン
グ実験により、この酵素活性の配列の正体が以前に同定されたタンパク質ＰＳＭ
（またはＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ，Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９６）に
由来することが示された。本研究において、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ及びIIは、
以前にＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩで示されているように［³Ｈ］−ＮＡＡＧをＮ−
アセチルアスパルテートとグルタメートに加水分解できることが示されたが、Ｎ
ＡＡＬＡＤ−アーゼIVは示されなかった。前立腺及び卵巣並びに他の末梢組織に
おけるこれらのＮＡＡＬＡＤ−アーゼの配置を考えれば、これらの酵素がこれら
の組織において局所的細胞外グルタメートレベルを調節できることは全く可能で
ある。例えば、かなりの量のグルタメートが精液中に存在することが知られてい
る。ＣＮＳにおいて、ＮＡＡＧは、ＮＭＤＡ受容体で部分アゴニストとして作用
するが、ＡＭＰＡまたはカイニン酸受容体ではそうせず（Ｖａｌｌｉｖｕｌｌａ
ｈｅｔａｌ．，１９９４；Ｐｕｔｔｆａｒｃｋｅｎｅｔａｌ．，１９９
３；Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，１９９２）、そしてＮＭＤＡまたはグ
ルタメートにより引き起こされる神経変性を減じる（Ｂｒｕｎｏｅｔａｌ．
，１９９８）ことが示されている。さらに、海馬切片または混合皮質培養物への
ＮＡＡＧの添加が、ＮＭＤＡ受容体のその作用と異なる機構により興奮毒の添加
後の神経防御をもたらすことも示されている。この場合、十分に輸送されないか
または能動的に取り込まれるＮＡＡＧがシナプス間隙から拡散し、ｍＧｌｕＲ３
のようなII型代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）にアゴニストとして結合
し、減少したグルタミン酸作動性神経伝達を導くと仮定される（Ｗｒｏｂｌｅｗ
ｓｋａｅｔａｌ．，１９９３及び１９９７）。この仮説は、ｍＧｌｕＲ３ア
ンタゴニストのエチルグルタメートを用いてさらに試験されており、それはＮＡ
ＡＧの神経防御作用を除いた（Ｂｒｕｎｏｅｔａｌ．１９９８）。完全なペ
プチドは顕著に阻害作用を有するが、興奮毒により誘導される細胞死の別の可能
な機構は、ＮＡＡＬＡＤ−アーゼによるＮＡＡＧの異常な異化作用から生じる可
能性がある。ＮＡＡＧの内在性レベルは脳において非常に高いので、ＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼによるＮＡＡＧの異化作用は、理論的にグルタメートの豊富な供給源
であるはずであり、それは適切に調節されない場合に興奮毒作用をもたらす可能
性がある。実際、ＮＡＡＧまたはＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性の異常なレベルは、
癲癇（Ｍｙｅｒｈｏｏｆｅｔａｌ．，１９８５及び１９９２）、精神分裂病
（Ｔｓａｉｅｔａｌ．，１９９５）、ＡＬＳ（Ｔｓａｉｅｔａｌ．，１
９９１）、アルツハイマー病（Ｐａｓｓａｎｉｅｔａｌ．，１９９７ａ；Ｊ
ａａｒｓｍａｅｔａｌ．，１９９４）及び脳卒中（Ｓａｇｅｒｅｔａｌ
．，１９９５）において報告されている。特定のインヒビターでのＮＡＡＬＡＤ
−アーゼ活性の阻害は、アルツハイマー病、精神分裂病またはＡＬＳのような、
虚血により引き起こされる神経変性またはグルタミン酸神経伝達における異常を
伴う他の神経変性疾患を処置することにおいて有用である可能性がある（Ｐａｓ
ｓａｎｉｅｔａｌ．，１９９７ｂ）。少なくともインビトロにおいて、ＮＡ
ＡＬＡＤ−アーゼ（カルボキシペプチダーゼ）インヒビターの２−（ホスホンメ
チル）グルタル酸（２−（ｐｈｏｓｐｈｏｎｅｍｅｔｈｙｌ）ｐｅｎｔａｎｅｄ
ｏｉｃａｃｉｄ）は、葉酸ヘキサグルタメートのカルボキシペプチダーゼ切断
により誘導される毒性を阻害した（Ｓｌｕｓｈｅｒｅｔａｌ．，１９９７）
。

【００５８】

【表１】

【００５９】

【表２】

【００６０】

【表３】

【００６１】

【表４】

【００６２】

【表５】

【００６３】

【表６】

【００６４】

【表７】

【００６５】

【表８】

【００６６】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVの予測されるタンパク質配列の比較。
整列プログラムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧパッケージ）を用いて配列を２つずつ比
較した。同一性％（表の上の方の部分）及び類似性％（表の下の方の部分）の得
られた値を示す。用いた略語の一覧表ＢＬＡＳＴ基本局所配列検索手段ｂｐ塩基対ＣＭＶサイトメガロウイルスＤＭＥＭ限定最少必須培地ＥＳＴ発現配列標識ＦＩＳＨ蛍光インサイチューハイブリダイゼーションＧＡＰＤＨグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼＩ１００回腸１００ｋＤａタンパク質ＩＰＴＧイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドＭＥＭ最少必須培地ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＮ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼＮＡＡＧＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−（３，４）− グルタメートＯＲＦオープンリーディングフレームＰＢＳリン酸緩衝食塩水ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＰＳＭ前立腺特異的マーカーＱＡキスカル酸塩ＲＡＣＥｃＤＮＡ末端の迅速増幅ＲＴ−ＰＣＲ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応ＳＤＭ部位特異的突然変異誘発ＳＰＡシンチレーション近接アッセイＳＳＣ塩化ナトリウムクエン酸ナトリウムＴＡＥＴｒｉｓ酢酸塩ＥＤＴＡＸ−Ｇａｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ− ガラクトピラノシド

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのヌクレオチド及びアミノ酸配列の実例である。
ヌクレオチド及び予測される１文字コードアミノ酸配列を示す。親水性プロット
から推測される推定の膜にまたがるドメインを線で示す。可能性があるＮ−グリ
コシル化部位に陰影をつける。

【図２】ヒト及びラットＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの予測されるタンパク質配列の整列で
ある。ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラム（ＥＭＢＬ，ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＧ
ｅｒｍａｎｙ）を用いてこれらのアミノ酸配列を整列させた。両方のタンパク質
において同一であるアミノ酸残基を黒で強調する。右側の余白においてアミノ酸
残基に番号をつける。

【図３】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬの選択的スプライシングの実例である。ＮＡＡＬＡＤ
−アーゼＬのアミノ酸配列を示す。推定されるＤＮＡ配列がスプライシングされ
て除かれる位置を矢印で示し、結果として生じる（インフレーム）アミノ酸欠失
を肉太のイタリック体文字で強調する。推定されるイントロンＤＮＡ挿入の位置
を三角で示し、イントロンＤＮＡ配列を上に示す。結果として生じるアミノ酸配
列に対する変化を肉太のイタリック体文字で強調する。アミノ酸残基の番号付け
は右側である。

【図４】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。ヌクレ
オチド及び予測される１文字コードアミノ酸配列を示す。親水性プロットから推
測される推定の膜にまたがるドメインを線で示す。可能性があるＮ−グリコシル
化部位に陰影をつける。

【図５】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVのヌクレオチド及びアミノ酸配列である。ヌクレ
オチド及び予測される１文字コードアミノ酸配列を示す。親水性プロットから推
測される推定の膜にまたがるドメインを線で示す。可能性があるＮ−グリコシル
化部位に陰影をつける。

【図６】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVの予測されるタンパク質配列の整
列である。ＣｌｕｓｔａｌＷ整列プログラムを用いてこれらのアミノ酸配列を整
列させた。４個全てのタンパク質で同一であるアミノ酸残基に黒で陰影をつける
。４個のうち３個のタンパク質で同一であるアミノ酸残基に灰色で陰影をつける
。右側にアミノ酸残基に番号をつける。推定されるＺｎ²⁺ペプチダーゼドメイン
を矢印間で強調し、酵母及び細菌のアミノペプチダーゼとの比較により同定した
。タンパク質のα／β加水分解酵素フォールドファミリーの触媒部位に関与する
推定される残基を３本の矢印で示す（求核試薬−酸−塩基）。

【図７】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ、Ｌ、II及びIVの系統図である。ヒト及びラット配列
を用い、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムで整列を実施した。標準的なパラメーター
でＧＣＧ’Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ’プログラムを、そしてＵＰＧＭＡ法で’Ｇｒｏ
ｗｔｒｅｅ’プログラムを用いて系統樹を構築した。

【図８】関係のあるペプチダーゼとＮＡＡＬＡＤ−アーゼペプチダーゼドメインの整列
である。ＣＬＵＳＴＡＬＷ整列プログラムの標準的な設定を用いてアミノ酸配列
を整列させた。タンパク質において保存される類似したアミノ酸残基に黒で陰影
をつける。タンパク質の８０％において保存される類似したアミノ酸残基に濃い
灰色で陰影をつける。タンパク質の６０−７９％において保存される類似したア
ミノ酸残基に薄い灰色で陰影をつける。右側にアミノ酸残基に番号をつける。亜
鉛結合に関与する推定される残基を星印で示す。触媒作用おいて重要であると考
えられる基本残基を矢印で示す。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ以外の配列名は、Ｓｗｉ
ｓｓ−Ｐｒｏｔ及びＳＰＴＲＥＭＢＬにおける配列受託番号に対応する；Ａｐｅ
３ｙｅａｓｔ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）アミノペプチダーゼＹ；Ｐ９６１５２、ビブリオ・コレ
ラ（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）アミノペプチダーゼ；．Ａｍｐｘｖｉ
ｂｐｒ、アエロモナス・プロテオリチカアミノペプチダーゼ；Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓｔｒｇｒ、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｇｒｉｓｅｕｓ）アミノペプチダーゼ。亜鉛結合に関与する推定される残基
を星印で示す。触媒作用において重要であると考えられる一般的な基本残基を矢
印で示す。

【図９】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性の時間経過の実例である。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ
（Ａ）またはＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬ（Ｂ）のいずれかで一過性トランスフェク
ションしたＣＯＳ細胞からの膜調製物の活性。１ｍＭＺｎＣｌ₂、５０ｍＭＴ
ｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中５００ｎＭの³［Ｈ］−ＮＡＡＧの加水分解を
３０μＭのキスカル酸塩の存在下（開いた丸）または非存在下（閉じた丸）で３
７℃で０、１５、３０及び６０分間アッセイした。２５０ｍＭのよく冷えたリン
酸ナトリウムで反応を止め、遊離した³［Ｈ］−グルタメートを測定した。（Ｃ
）コントロール（あらゆるインヒビターの非存在下での活性）の％として表され
る増加する濃度のキスカル酸によるＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（開いた丸）及びＮ
ＡＡＬＡＤ−アーゼII（閉じた丸）活性の阻害。

【図１０】ＳＰＡビーズを用いるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性測定の実例である。（Ａ）高
処理量アッセイＮＡＡＬＡＤ−アーゼアッセイを開発するために反応当たりＬＮ
ＣａＰ細胞膜調製物からの１０μｇのタンパク質を用いた。１ｍＭＺｎＣｌ₂、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中４０ｎＭの³［Ｈ］−ＮＡＡＧの
加水分解を１００μｌの反応容量で２５℃で異なるインキュベーション時間の間
測定した。１００μｌのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）及び裸のＹＳ−Ｓ
ＰＡビーズの添加により反応を止めた。（Ｃ）コントロール（あらゆるインヒビ
ターの非存在下での活性）の％として表される増加する濃度のキスカル酸による
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（開いた丸）またはＬＮＣａＰ膜ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
（閉じた丸）活性の阻害。

【図１１】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼの染色体位置確認の実例である。ＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＩ（Ａ）、Ｌ（Ｃ）、II（Ｅ）及びIV（Ｇ）のＦＩＳＨマッピング結果の図
。各図において、点は同定された染色体上に検出される二重のＦＩＳＨシグナル
を表す。ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（Ｂ）、Ｌ（Ｄ）、II（Ｆ）及びIV（Ｈ）のＦ
ＩＳＨマッピングの例。左側のパネルは、白い矢印により示す同定された染色体
上のＦＩＳＨシグナルを示し、右側のパネルは染色体を同定するためにＤＡＩで
染色した同じ有糸分裂像を示す。

【図１２】ＮＡＡＬＡＤ−アーゼII及びIV発現のノーザンブロット分析の実例である。レ
ーン当たり２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含有するヒト複数組織ノーザンブロッ
ト（Ｋｌｏｎｄｉｋｅ）に³²ｐで標識したＮＡＡＬＡＤ−アーゼII（Ａ）または
IV（Ｂ）プローブを６８℃でハイブリダイズさせ、高ストリンジェンシー（ＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳの１／１０希釈で５０℃での最終洗浄）で洗浄した。２枚
の増感紙と共に−７０℃で３〜７日後にオートラジオグラフィー感光を実施した
。分子量マーカーを各オートラジオグラムの左側にｂｐ単位で示す。

【図１３】異なる組織におけるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の実例であ
る。正規化したヒトＭＴＣｃＤＮＡ^TMに対してヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（
Ａ）、Ｌ（Ｂ）、II（Ｃ）及びIV（Ｄ）またはＧＡＰＤＨ（Ｅ）に特異的なプラ
イマーでのＰＣＲ増幅を２５、３０及び３５サイクル実施した。ＥａｇｌｅＥｙ
ｅシステム及びＥａｇｌｅＳｉｇｈｔソフトウェア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を
用いて臭化エチジウム染色した１．５％アガロースゲルからの画像を記録した。
適当なＮＡＡＬＡＤ−アーゼＤＮＡ構築物を用いて陽性コントロール増幅を実施
した。陰性コントロール増幅は反応ミックス、酵素を含有し、ＤＮＡ鋳型を含有
しなかった。陽性及び陰性コントロール反応を３５サイクル実施した。矢印は１
００ｂｐラダーを用いて決定したｂｐ単位の特定の大きさを強調する。

【図１４】脳領域におけるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の実例である。
ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（Ａ）、Ｌ（Ｂ）、II（Ｃ）及びIV（Ｄ）またはＧ
ＡＰＤＨ（Ｅ）に特異的なプライマーで、２５、３０及び３５サイクルのＰＣＲ
増幅を切断した脳領域から調製した正規化したヒトｃＤＮＡに対して実施した。
ＥａｇｌｅＥｙｅシステム及びＥａｇｌｅＳｉｇｈｔソフトウェア（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）を用いて臭化エチジウム染色した１１．５％アガロースゲルからの
画像を記録した。３０及び３５サイクルの増幅からの結果を示す。適当なＮＡＡ
ＬＡＤ−アーゼＤＮＡ構築物を用いて陽性コントロール増幅を実施した。陰性コ
ントロール増幅は反応ミックス及び酵素を含有し、ＤＮＡ鋳型を含有しなかった
。全てのコントロール反応を３５サイクル実施した。矢印は１００ｂｐラダーを
用いて決定したｂｐ単位の特定の大きさを強調する。

【図１５】前立腺腫瘍細胞におけるＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の実例
である。ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＩ（Ａ）、Ｌ（Ｂ）、II（Ｃ）及びIV（Ｄ）
またはＧＡＰＤＨ（Ｅ）に特異的なプライマーでのＰＣＲ増幅を前立腺腫瘍由来
の細胞系から調製した正規化したｃＤＮＡまたは前立腺腫瘍に対して実施した。
ＥａｇｌｅＥｙｅシステム及びＥａｇｌｅＳｉｇｈｔソフトウェア（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）を用いて臭化エチジウム染色した１．５％アガロースゲルからの画
像を記録した。２５、３０及び３５サイクルの増幅からの結果を示した。適当な
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼＤＮＡ構築物を用いて陽性コントロール増幅を実施した。
陰性コントロール増幅は、反応ミックス及び酵素を含有し、ＤＮＡ鋳型を含有し
なかった。全てのコントロール反応を３５サイクル実施した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/02 Ａ６１Ｐ 25/00 25/14 25/02 25/18 25/14 25/28 25/18 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 25/28 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ネーフス，ジヤン−マルク・エドモンド・フエルナンド・マリーベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルンホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (72)発明者ペータース，ダニエル・セリーヌ・ジヨルジエツトベルギー・ビー−2340ビールセ・トウルンホウトセベーク30・ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図１に例示するアミノ酸配列を有するヒトＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＬタンパク質またはその機能性同等物、誘導体もしくは生物学的前駆体をコ
ードするｃＤＮＡ分子。
【請求項２】図１に例示するヌクレオチドの配列を含んでなる請求項１に
記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項３】図３に例示するアミノ酸配列を有するヒトＮＡＡＬＡＤ−ア
ーゼＬタンパク質のスプライス変異体のいずれかをコードするｃＤＮＡ分子。
【請求項４】図３に例示するヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬのそれぞれのス
プライス変異体をコードするそれぞれのヌクレオチド欠失または挿入を有する図
１に例示するヌクレオチドの配列を含んでなる請求項３に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項５】図４に例示するアミノ酸配列を有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
IIタンパク質またはその機能性同等物、誘導体もしくは生物学的前駆体をコード
するｃＤＮＡ分子。
【請求項６】図４に例示するヌクレオチド配列を含んでなる請求項５に記
載のｃＤＮＡ分子。
【請求項７】図５に例示するアミノ酸配列を有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
IVタンパク質またはその機能性同等物、誘導体もしくは生物学的前駆体をコード
するｃＤＮＡ分子。
【請求項８】図５に例示するヌクレオチド配列を有する請求項７に記載の
ｃＤＮＡ分子。
【請求項９】高ストリンジェンシー条件下で請求項１及び８のいずれかに
記載のｃＤＮＡ分子にハイブリダイズすることができる核酸分子。
【請求項１０】図１に例示するヌクレオチド配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を有するヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼＬタンパク質またはその機能性同等
物もしくは誘導体。
【請求項１１】図１に例示するアミノ酸配列を有するかまたは図３に例示
するアミノ酸配列の挿入もしくは欠失を含む請求項１０に記載のヒトＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼＬタンパク質。
【請求項１２】図４に例示するヌクレオチド配列によりコードされるＮＡ
ＡＬＡＤ−アーゼIIタンパク質またはその機能性同等物、誘導体もしくは生物学
的前駆体。
【請求項１３】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼIIタンパク質である請求項１２
に記載のタンパク質。
【請求項１４】図４に例示するアミノ酸配列を有する請求項１２または１
３に記載のタンパク質。
【請求項１５】図５に例示するヌクレオチド配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を有するＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVタンパク質またはその機能性同等物、
誘導体もしくは生物学的前駆体。
【請求項１６】ヒトＮＡＡＬＡＤ−アーゼIVタンパク質である請求項１５
に記載のタンパク質。
【請求項１７】図５に例示するアミノ酸配列を有する請求項１５または１
６に記載のタンパク質。
【請求項１８】請求項１〜８のいずれかに記載のｃＤＮＡ分子を含んでな
るＤＮＡ発現ベクター。
【請求項１９】サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなる請求項１
８に記載のベクター。
【請求項２０】レポーター分子をコードする配列を含んでなる請求項１８
または１９に記載のベクター。
【請求項２１】請求項１８〜２０のいずれかに記載のベクターで形質転換
するかまたはトランスフェクションした宿主細胞。
【請求項２２】原核細胞または真核細胞を含んでなる請求項２１に記載の
宿主細胞。
【請求項２３】ＣＯＳ細胞である請求項２１または２２に記載の宿主細胞
。
【請求項２４】請求項１０〜１７のいずれかに記載のタンパク質を発現す
ることができる導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック細胞、組織または生
物。
【請求項２５】該導入遺伝子が請求項１８〜２０のいずれかに記載のベク
ターを含んでなる請求項２４に記載のトランスジェニック細胞、組織または生物
。
【請求項２６】薬剤としての使用のための請求項１〜９のいずれかに記載
のｃＤＮＡもしくは核酸分子またはその機能性同等物。
【請求項２７】アルツハイマー病、精神分裂病、ＡＬＳ、パーキンソン病
、末梢ニューロパシー、ハンチントン病、急性脳損傷、多発性硬化症、神経毒暴
露、末梢神経損傷、虚血または痴呆症を包含する神経疾患の処置の薬剤の調製に
おける請求項１〜９のいずれかに記載のｃＤＮＡもしくは核酸分子またはその機
能性フラグメントの使用。
【請求項２８】請求項１〜８のいずれかに記載の核酸もしくはｃＤＮＡ分
子または請求項１０〜１７のいずれかに記載のタンパク質をその製薬学的に許容
しうる担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２９】化合物が請求項１０〜１７のいずれかに記載のＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼタンパク質の活性のインヒビターまたはエンハンサーであるかどうか
を決定する方法であって、該化合物を［³Ｈ］Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−グルタメート（ＮＡＡＧ）の存在下でＮＡＡＬＡＤ−アーゼタンパク質と
接触させること並びに該化合物と接触していない該ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ及びＮ
ＡＡＧのコントロールと比較してＮＡＡＧの加水分解の量をモニターすることを
含んでなる方法。
【請求項３０】請求項２９に記載のＮＡＡＬＡＤ−アーゼ活性のインヒビ
ターまたはエンハンサーとして同定できる化合物。
【請求項３１】薬剤としての使用のための請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】アルツハイマー病、精神分裂病、ＡＬＳ、パーキンソン病
、末梢ニューロパシー、ハンチントン病、急性脳損傷、多発性硬化症、神経毒暴
露、末梢神経損傷、虚血または痴呆症のような神経疾患または疾病の処置のため
の薬剤の調製における請求項３０に記載の化合物の使用。
【請求項３３】請求項３０に記載の化合物をその製薬学的に許容しうる担
体、希釈剤または賦形剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３４】請求項１０〜１７のいずれかに記載のＮＡＡＬＡＤ−アー
ゼタンパク質の発現または活性のインヒビターまたはエンハンサーである化合物
を同定する方法であって、該タンパク質を発現する宿主細胞、組織または生物を
試験する化合物と接触させること及び該タンパク質を発現する該細胞を含んでな
るが該化合物と接触していないコントロールと比較して該タンパク質の発現また
は活性をモニターすることを含んでなる方法。
【請求項３５】該ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ発現細胞が、請求項２１〜２３の
いずれかに記載の宿主細胞または請求項２４もしくは２５に記載のトランスジェ
ニック細胞、組織もしくは生物を含んでなる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】該モニタリング工程が該レポーター分子の発現をモニター
することを含んでなる請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】請求項３４〜３６のいずれかの方法により発現または活性
のインヒビターまたはエンハンサーとして同定できる化合物。
【請求項３８】薬剤としての使用のための請求項３７に記載の化合物。
【請求項３９】アルツハイマー病、精神分裂病、ＡＬＳ、パーキンソン病
、末梢ニューロパシー、ハンチントン病、急性脳損傷、多発性硬化症、神経毒暴
露、末梢神経損傷、虚血または痴呆症のような神経疾患を処置するための薬剤の
調製における請求項３７に記載の化合物の使用。
【請求項４０】請求項３７に記載の化合物をその製薬学的に許容しうる担
体、希釈剤または賦形剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４１】（ａ）ＳＰＡビーズの存在下で目的の酵素をその放射性標
識した加水分解可能な基質と接触させること；（ｂ）グリシンバッファーを加えることにより該反応を止めること；及び（ｃ）該ビーズに結合した該基質からのシグナルをモニターすることを含んでなる酵素活性を定量する方法。
【請求項４２】（ａ）ＳＰＡビーズ及び試験する化合物の存在下で目的の
酵素をその放射性標識した加水分解可能な基質と接触させること；（ｂ）グリシンバッファーを加えることにより該反応を止めること；及び（ｃ）該化合物と接触していないコントロールと比較して該ビーズに結合した基
質からのシグナルをモニターすることを含んでなる、酵素の活性のインヒビターまたはエンハンサーである化合物を同
定する方法。
【請求項４３】該基質が［³Ｈ］ＮＡＡＧを含んでなり、そして該酵素が
ＮＡＡＬＡＤ−アーゼ酵素を含んでなる請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】該酵素が請求項１０〜１７のいずれかに記載のＮＡＡＬＡ
Ｄ−アーゼを含んでなる請求項４１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】請求項４３または４４の方法によりＮＡＡＬＡＤ−アーゼ
活性のインヒビターまたはエンハンサーとして同定できる化合物。
【請求項４６】請求項４５に記載の化合物をその製薬学的に許容しうる担
体、希釈剤または賦形剤と一緒に含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４７】薬剤としての使用のための請求項４５に記載の化合物。
【請求項４８】アルツハイマー病、精神分裂病、ＡＬＳ、パーキンソン病
、末梢ニューロパシー、ハンチントン病、急性脳損傷、多発性硬化症、神経毒暴
露、末梢神経損傷、虚血または痴呆症のような神経疾患を処置するための薬剤の
製造における請求項４５に記載の化合物の使用。