JP2002519311A - 細胞死を誘発するための組成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞死を誘発するために、tempo またはその機能的誘導体を該細胞に投与することを含む方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明の分野 本発明は、細胞死を誘発する組成物および方法、ならびに細胞死が有利となる
疾患および病態の処置に関係する。

【０００２】 序論 カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ
のような酵素およびグルタチオンから構成される細胞性抗酸化防御システムは、
毒性酸素代謝体から細胞を保護する。外来的に加えた遊離ラジラルスカベンジャ
ーもまた、酸素遊離ラジカルの有害な使用の軽減を示す(van Asbeck, B. S. et
al., 1985, Science 227, 756-759; Halliwell, B. 1989, Free Radical Biol.
Med. 7, 645-651: Myers, M. L. et al., 1985 Circulation 72, 915-921; Quin
tanilha, A. T. and Packer, L., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,
570-574)。tempolおよびtempo(図１)を含むニトロオキシド化合物は、低分子量
であり、膜浸透性であり、電子常磁性共鳴を検出し得る安定な遊離ラジカル(Ber
liner, L. J., 1976 Spin Labeling: Theory and Application, Academic Press
, New York)であり、かつ、生物物理学的および生物化学的工程用のプローブと
して典型的に使用されている：それらは、ＮＭＲイメージングにおける常磁性対
照試薬(Bennett, H. F. et al., 1987, Magn. Reson. Med. 4, 93-111; Bennett
, H. F. et al., 1987, Invest. Radiol. 22. 502-507)として、膜構造のプロー
ブ(Berliner, L. J. 1979, Spin Labeling II: Theory and Applications, Acad
emic Press, New York)として、および生物学的システムにおける酸素のセンサ
ー(Strzalka, K. et al., 1990, Arch. Biochem. Biophys 281:312-318)として
使用されている。

【０００３】 しかし、過去数年以上に渡り、ニトロキシドの新規応用が解説されている。ニ
トロキシドは、抗酸化活性があり、スーパーオキシド、過酸化水素、およびイオ
ン化照射を含む酸化ストレスを与える種々の物質から細胞を防御する(Mitchell,
J. B. et al., 1990, Biochemistry 29, 2802-2807; Smuni, A. et al., 1990,
Adv. Exp. Med. Biol. 264. 85-92; Samuni, A. et al., 1990, Free Radical
Res. Commun. 9, 241-249; Mitchell, J. B. et al., 1991, Arch. Biochem. Bi
ophys. 289, 62-70; Samuni, A. et al., 1991, Biochemistry 30, 555-561; Ha
hn, S. M. et al., 1992, Cancer Res. 52, 1750-1753; Hahn, S. M. et al., 1
992, Radiat. Res. 132, 87-93; Hahn, S. M. et al., 1995, Can. J. Physiol.
Pharmacol. 73, 399-403; Samuni, A. et al., 1991, J. Clin. Invest. 87, 1
526-1530; Gelvan, D. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 468
0-4684; Goffman, T. et al., 1992, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 22,
803-806)。種々の化学機構が、スーパーオキシドジスムターゼ擬似活性を含む
ニトロキシド抗酸化剤活性(Samuni, A. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 17
921-17924)、還元された金属の酸化(酸化されなければヒドロキシル基の形成を
触媒する)(Krishna, M. C. et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 26018-26025)
、ラジカル−ラジカル相互作用(Mitchell et al., 1990, 上述)を説明すると提
唱されている。重要な研究が、全細胞レベルおよびニトロキシドを有する動物に
おいて行われているが、この新規クラスの抗酸化物がどのように信号伝達経路に
影響するか、分子レベルでは殆ど知られていない。

【０００４】 細胞外信号調節キナーゼ(ＥＲＫ)(ｐ４２／４４ＭＡＰＫ)を含む有糸分裂促進
物質活性化タンパク質キナーゼ(ＭＡＰＫ)ファミリー、ストレス活性化タンパク
質キナーゼ(ＳＡＰＫ)(ｃ−ＪｕｎＮＨ２−末端キナーゼとも呼ばれている(ｐ４
６／５４ ＪＮＫ／ＳＡＰＫ１))、およびｐ３８ ＭＡＰＫ(反応活性化キナーゼ
とも呼ばれている(ｐ３８ＲＫ))のメンバーは、浸透性および代謝の変化のよう
な種々の細胞ストレス、ＤＮＡ損傷、心臓ショック、虚血、ＵＶ照射、イオン化
照射または炎症性サイトカインへの応答によって活性化される(Cuenda, A. et a
l., 1995, FEBS Lett. 364, 229-233; Beyaert, R. et al., 1996, EMBO J. 1
5. 1914-1923; Bogoyevitch, M. A. et al., 1996, Circ. Res. 79, 162-173; V
erheij, C. et al., 1996, Nature 380, 75-79; Mendelson, K. G. et al., 199
6, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12908-12913; Rosette, C. and Karin,
M. 1996, Science 274, 1194-1197; Kasid, U. et al., 1996, Nature 382, 81
3-816; Wu, J. et al., 1994, in Insulin Action Effects on Gene Expression
and Regulation and Glucose Transport(Draznin, B. and Le Roith, D., eds)
pp. 151-177, Humana Press, Totowa, NJ; Xia, Z. et al., 1995, Science 27
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24313-24316; Devary, Y. et al., 1992, Cell 71, 1081-1091; Derijard, B.
et al., 1995, Science 267, 682-685; Sanchez, I. et al., 1994, Nature 372
, 794-798; Hannun, Y., 1994, J. Biol. Chem. 269, 3125-3128; Kharbanda, S
. et al., 1995, Nature 376, 785-788; Johnson, N. L. et al., 1996, J. Bio
l. Chem. 271, 3229-3237; Hibi, M. et al., 1993, Genes Dev. 7, 2135-2148;
Kyriakis, J. M. et al., 1994, Nature 369, 156-160; Minden, A. et al., 1
994, Science 266, 1719-1723; Pombo, C. M. et al., 1994, J. Biol. Chem. 2
69, 26546-26551; Suy, S. et al., 1997, Oncogene 15, 53-61; Westwick, J.
K. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 22689-22692)。

【０００５】 多くのこれらの例において、遊離ラジカルおよび誘導体は、細胞性信号伝達応
答の開始に重要な役割をする(Lander, H. M., 1997, FASEB J. 11, 118-124)。
成長および増殖／生存を最初に促進するＥＲＫ信号経路とは異なり、ＳＡＰＫお
よびｐ３８ ＭＡＰＫ経路は、増殖停止およびアポトーシスまたは壊死細胞死を
生じる。ニトロキシドは、多様な酸化性傷害を防ぎ、臨床的生体医学研究に有用
と成り得るため、我々は、ＭＡＰＫ信号伝達経路における、当該作用機構をより
理解するためにtempolおよびtempoの効果を検討した。明細書で示す証拠から判
るのは、tempolおよびtempoがＭＡＰＫ信号カスケードの明確な経路を刺激する
ことである。tempolはＥＲＫ活性を刺激し、非細胞毒性であり、その一方、temp
oは、セラミド生成、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性およびＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌
細胞のアポトーシス死を誘発する。tempoの細胞毒性効果は、他の癌細胞型、Ｐ
ＣＩ−０４Ａ喉頭扁平癌細胞、アンドロゲン非依存性(ＤＵ１４５、ＰＣ−３)お
よびアンドロゲン依存性(ＬＮＣａＰ)前立腺癌細胞系においても観察された。te
mpoは、カスパーゼ−３の活性化の原因となった。そのカスパーゼ−３は、ＬＮ
Ｃａｐ細胞の電子顕微鏡により証明されたようにアポトーシスおよびクロマチン
断片化の原因となるプロテアーゼとして知られている。加えて、tempo−処理は
、無胸腺症マウスのＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌異種移植片の腫瘍増殖調節を生じる
ことから、tempoまたはその誘導体ならびにその製剤の治療適用を示唆している
。

【０００６】 本発明は、細胞死の誘発に使用する tempo について記載する。tempo は細胞
の酸化による損傷を防ぐために以前から使用されている。本出願で記載する tem
po の細胞毒性作用は、新規であり、かつ予測できないものである。

【０００７】 従って、本発明の１つの目的は、細胞死を誘発するための方法の提供である。
この方法は、tempo または細胞死を誘発するような tempo 誘導体を含む組成物
を、該細胞、組織または癌塊に導入することにより行う。

【０００８】 本発明の他の目的は、細胞死を誘発するために tempo を含む組成物の提供で
ある。この組成物は、医療用組成物として単独であるか、または癌処置のための
他の抗癌剤との組合せである。

【０００９】 さらに、本発明の他の目的は、癌を処置するための方法の提供である。この方
法は、上記のような tempo を含む組成物、例えば tempo のリポソーム製剤を、
患者に投与することにより行う。

【００１０】 （図面の簡単な説明） 本発明の上記および他の特徴、態様、利点は、下記の説明、請求項、添付図面
を参照にして、さらによく理解されるであろう。

【００１１】 図１は、ニトロオキシド化合物 tempol (４−ヒドロキシ−tempo）および tem
po の化学構造についての模式図である。

【００１２】 図２は、tempol および tempo のタンパク質チロシン加リン化反応に対する作
用を示す。半密集細胞を無血清培地で１夜培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）
または tempo（１０ｍＭ）で、表示の時間処理し、溶解した。正常にしたタンパ
ク質含有物（１ｍｇ）をアガロース結合アンチＰＹ Ｍａｂで免疫沈降し、アン
チＰＹ Ｍａｂで免疫ブロットした。示したデータは、２つの独立の実験につい
ての代表例である。ＵＴ：無血清培地で１夜生育した未処置細胞。

【００１３】 図３。 tempol およびtempo がインビボでチロシン加リン化反応およびＲａｆ
−１タンパク質キナーゼの酵素活性を促進する。図Ａ。細胞を無血清培地で１夜
培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）または tempo（１０ｍＭ）で、１５分間処
置し、溶解した。正常にしたタンパク質含有物（１ｍｇ）をアガロース結合アン
チＲａｆ−１ポリクローナル抗体で免疫沈降（ＩＰ）し、アンチＰＹ Ｍａｂで
免疫ブロット（ＩＢ）した（上図）。同じブロットを剥がし、アンチＲａｆ−１
Ｍａｂで再プローブした（下図）。示したデータは、２−３の独立の実験につい
ての代表例である。ＵＴ：無血清培地で１夜生育し、１％エタノール処理の未処
置細胞。

【００１４】 Ｂ図。Ｒａｆ−１タンパク質キナーゼ活性を、キナーゼ・カスケードＡ「読み
出し」アッセイ（上図）または Syntide 2 加リン化反応アッセイ（下図）で測
定した。細胞を無血清培地で１夜培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）または te
mpo（１０ｍＭ）で、表示した時間処置し、溶解した。ＷＣＬ（１ｍｇ）をアガ
ロース結合アンチＲａｆ−１抗体で免疫沈降した。カップル−キナーゼ・カスケ
ード反応のために、Ｒａｆ−１免疫複合体を最初に３０℃で３０分間、［γ³²Ｐ
］−ＡＴＰ５ｎモル、不活ＭＡＰＫキナーゼ０.４μｇ、不活ＭＡＰＫ１μｇと
ともにキナーゼ反応緩衝液４０ｍｌ中でインキュベートした。ＭＢＰ２０μｇを
第１反応混合物８μｌに加え、反応を３０℃で１０分間、キナーゼ反応緩衝液３
０μｌ中で続けた。ＭＢＰ加リン化反応の定量を、材料および方法において記載
したフィルター結合アッセイで行った。Syntide 2 加リン化反応アッセイのため
に、Ｒａｆ−１免疫複合体を３０℃で２０分間、［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ５ｎモル、
Syntide 2 ５μｇとともにキナーゼ反応緩衝液４０ｍｌ中でインキュベートした
。Syntide 2 加リン化反応の定量を、フィルター結合アッセイで行った。示した
データは、２−３の独立の実験からの平均±標準偏差である。対照：細胞を無血
清培地で１夜生育し、１％エタノールで１時間（上図）または２時間（下図）処
理した。

【００１５】 図４。tempol がＥＲＫ１活性を促進する。細胞を無血清培地で１夜培養し、
ついで tempol（１０ｍＭ）または tempo（１０ｍＭ）で、２時間処理し、溶解
した。ＷＣＬ（１ｍｇ）をアガロース結合アンチＥＲＫ１抗体で免疫沈降した。
インビトロＭＢＰ加リン化反応の定量を実験方法で記載したように行った。ＭＢ
Ｐへのγ³²Ｐの取り込みをフィルター結合アッセイで行った（図Ａ）。別の独立
の実験において、反応産物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ＭＢＰ（
〜１８ｋＤａで）をオートラジオグラフィーで可視化した（図Ｂ）。対照／対照
：細胞を無血清培地で１夜培養し、１％エタノールで２時間処置した。

【００１６】 図５。tempo がチロシン加リン化反応およびＳＡＰＫの活性を促進する。細胞
を無血清培地で１夜培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）または tempo（１０ｍ
Ｍ）で、表示の時間処理し、溶解した。図Ａ。ＷＣＬ（１ｍｇ）をアガロース結
合アンチＳＡＰＫ抗体で免疫沈降し、アンチＰＹ ＭＡｂで免疫ブロットした。
図Ｂ。別の独立の実験において、アンチＳＡＰＫ免疫沈降物を最初にアンチＰＹ
ＭＡｂでプローブし（上図）、次いでブロットをアンチＳＡＰＫ抗体で再プロ
ーブした（下図）。図Ｃ。細胞を無血清培地で１夜培養し、ついで tempol（１
０ｍＭ）または tempo（１０ｍＭ）で、２時間処置した。ＷＣＬ（１ｍｇ）をア
ンチＪＮＫ１抗体で免疫沈降し、免疫沈降物中のＪＮＫ１活性の測定をＧＳＴ−
ｃＪｕｎ（〜４１ｋＤａで）基質で行った。ＵＴ：無血清培地で１夜培養した細
胞。対照／対照：細胞を無血清培地で１夜培養し、１％エタノールで２時間処理
した。

【００１７】 図６。細胞生存能に対する tempol および tempo の作用。細胞を無血清培地
で１夜９６ウエルプレートで培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）または tempo
（１０ｍＭ）で、表示の時間処置し、ニトロオキシド化合物を含有する培地を除
去した。対照細胞を無血清培地で１夜で培養し、１％エタノールで種々の回数処
理した。新鮮な無血清培地１００μｌを、対照を含むすべてのプレート中の各ウ
エルに加え、さらにＷＳＴ−１の１０μｌを加えた。プレートを２時間３７℃で
インキュベートし、ＷＳＴ−１による着色溶液の定量を、ＭＲ７００マイクロプ
レートリーダーを用いＯＤ＝４５０／６００で行った。示す値は、代表的実験の
処置条件ごとの６測定についての平均±標準偏差であり、実験は３回繰り返した
。

【００１８】 図７。tempo がアポトーシス性細胞死を誘発する。細胞を無血清培地で１夜Ｔ
−２５フラスコ中で培養し、ついで tempol（１０ｍＭ）または tempo（１０ｍ
Ｍ）で種々の時間処置し、トリプシン処理し、実験方法で記載のような１ｘ結合
緩衝液２００μｌ中に再懸濁した。細胞懸濁液をアネクシンＶ−ＦＩＴＣおよび
ヨウ化プロピジウムにより二重に着色して、フローサイトメトリーで分析した。
背景の信号を、二重着色、単一着色、非着色対照の細胞で比較して決定した。図
Ａ、図Ｃ、図Ｅは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（図Ａ）、ＰＣＩ−０４Ａ細胞（Ｃ
）、ＰＣ−３細胞（Ｅ）の tempol または tempo による処置２時間後での、生
存（Ｖ）、アポトーシス性（Ａ）、壊死性（Ｎ）の細胞の相対的分布を示す。図
Ｂ、Ｄ、Ｆは、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞（Ｂ）、ＰＣＩ−０４Ａ細胞（Ｄ）、Ｐ
Ｃ−３細胞（Ｆ）についての時間経過での解析である。１０万の細胞を各時点で
３回（Ｂ）または４回（ＤおよびＦ）解析した。黒棒：１％エタノール、灰色棒
：１０ｍＭ tempol、白棒：１０ｍＭ tempo。

【００１９】 図Ａにおいて、各四分でのＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の％は、対照がＶ：９２.
８８％、Ａ：６.０５％、Ｎ：１.０６％；tempol がＶ：９２.２９％、Ａ：６.
３２％、Ｎ：１.３１％；tempo がＶ：３５.８３％、Ａ：５２.４２％、Ｎ：１
０.９０％である。示したデータは、３から４の独立した実験の代表例である。

【００２０】 図Ｂは、アポトーシス（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ着色）または壊死（ヨウ化プ
ロピジウム着色）を起こすＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞についての時間経過での解析
である。示した値は、各処置での時点での３回測定の平均±標準偏差、および３
から４の独立した実験の代表例である。

【００２１】 図Ｃにおいて、ＰＣＩ−０４Ａ細胞の％は、対照がＶ：８７.６４％、Ａ：３.
４２％、Ｎ：８.４５％；tempol がＶ：８９.７９％、Ａ：５.４４％、Ｎ：４.
５７％；tempo がＶ：１８.６１％、Ａ：４８.３５％、Ｎ：３１.６２％である
。

【００２２】 図Ｄは、アポトーシス（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ着色）または壊死（ヨウ化プ
ロピジウム着色）を起こすＰＣＩ−０４Ａ細胞についての時間経過での解析であ
る。示した値は、各処置での時点ごとの４回測定の平均±標準偏差である。

【００２３】 図Ｅにおいて、各４回のＰＣ−３細胞の％は、対照がＶ：９６.６１％、Ａ：
１.１２％、Ｎ：１.９５％；tempol がＶ：９５.７６％、Ａ：１.２０％、Ｎ：
２.８６％；tempo がＶ：１０.７６％、Ａ：２.５７％、Ｎ：８３.５２％である
。

【００２４】 図Ｆは、アポトーシス（アネキシンＶ−ＦＩＴＣ着色）または壊死（ヨウ化プ
ロピジウム着色）を起こすＰＣ−３細胞についての時間経過での解析である。示
した値は、各処置での時点ごとの４回測定の平均±標準偏差である。対照／Ｃ：
細胞を１％エタノールで２時間処理した。

【００２５】 図８は、tempo 処置ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるセラミド産生を示す。対
数的に増加する細胞を６０ｍｍ皿で無血清培地において１夜培養し、ついで tem
pol（１０ｍＭ）または tempo（１０ｍＭ）で、表示の時間処理し、脂質の抽出
を行い、実験手法で記載したＤＡＧキナーゼ・アッセイによりセラミドの定量を
行った。［γ³²Ｐ］標識セラミドを含有する有機層抽出物を定量した。対照細胞
を無血清培地で培養し、０.５から２時間の種々の時間１％エタノールで処置し
た。示した tempol ／ tempo 処置値は３回測定の平均±標準偏差であり、各時
点での値を対照を１００％として表示する。

【００２６】 図９は、前立腺癌細胞（図Ａおよび図Ｂ：ＤＵ１４５、図Ｃ：ＰＣ−３、図Ｄ
：ＬＮＣａＰ）における tempo 誘発アポトーシスについての時間経過および用
量対応実験を示す。細胞をＴ−２５フラスコ中の１０％ＢＣＳ含有の培地で培養
し、５％ＢＣＳ含有の培地に移し、tempo で処置した。処置後、細胞を洗い、ト
リプシン処理し、上記した１Ｘ結合緩衝液２００ｍｌに再懸濁した。細胞懸濁液
をアネクシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウムにより二重に着色して、フ
ローサイトメトリーで分析した。背景信号を、二重着色、単一着色、非着色対照
の細胞で比較して決定した。

【００２７】 図Ａは、非処置（左図）；０.１％エタノール処置（２４時間）（中図）；tem
po 処置（２.５ｍＭ、２４時間）（右図）を示す。各図は生存細胞（下左四分）
、アポトーシス細胞（下右四分）、壊死細胞（上右四分）を示す。図Ｂ−Ｄは、
tempo で処置した細胞におけるアポトーシス（右図）および壊死（左図）を示す
（図Ｂ：２.ｍＭ、図Ｃ：２４時間、図Ｄ：用量および時間は表示の通り)。示し
た値は、各処置での時点ごとの３回測定の平均±標準偏差である。

【００２８】 図１０は、前立腺癌細胞系における tempo のカスターゼ−３活性に対する作
用を示す。細胞を tempo ２.５ｍＭで表示の時間、２−３回、図２についての記
載のように処置した。１つの実験からの代表的例を示す。実験を２−３回繰り返
した。

【００２９】 図１１は、ＬＮＣａＰ細胞の位相差光顕微鏡図である。ＬＮＣａＰ細胞（１ｘ
１０６）を２５ｃｍ²組織培養フラスコの１０％ＢＣＳ含有のＲＰＭＩ培地に入
れて１夜置き、５％ＢＣＳ含有のＲＰＭＩ培地に変えて、表示の時間、０.１％
エタノール（対照、左図）または tempo（２.５ｍＭ、右図）で刺激した。

【００３０】 図１２は、ＬＮＣａＰ細胞の伝播電子顕微鏡図である。図Ａ１：非処置、４,
０００ｘ；図Ａ２：Ａ１で示した部分の拡大図、２０,０００ｘ；図Ｂ１：０.１
％エタノール、２４時間、４,０００ｘ；図Ｂ２：Ｂ１で示した部分の拡大図、
２０,０００ｘ；図Ｃ１：tempo５ｍＭ、４,０００ｘ；図Ｃ２：Ｃ１で示した部
分の拡大図、２０,０００ｘ；図Ｄ：tempo５ｍＭ、２４時間、他の細胞の拡大図
、２０,０００ｘ。Ｍ：ミトコンドリア、Ｇ：ゴルジ体、ＲＥＲ：網状質内質、
Ｃｙ：細胞質、Ｎ：核。図Ｃ２の矢印は核膜中の肥大を示す。

【００３１】 図１３は、無胸腺マウスにおけるヒト乳房腫瘍異種移植片の生長に対する tem
po の作用を示す。図Ａ：tempo（２００ｍｇ／ｋｇ）を１日１回、全８日間、腫
瘍内に投与した（＊）。対照群を同量のエタノール（１０％）で同時に処置した
。対照の腫瘍容積が推奨の腫瘍値を超えたときに、実験を終えた。各時点は平均
±標準偏差（ｎ＝４）を表す。実験を対応結果について２回繰り返した。図Ｂ：
代表的腫瘍保持マウス。マウスを１０％エタノール（左図）または tempo（右図
）で上記のように処置した。

【００３２】 tempoは、安定なニトロキシドフリーラジカルであって、スーパーオキシドジ
スムターゼに似た抗酸化触媒活性が見られ、インビボで存在するとき他の物質と
相互作用し得、カタラーゼ擬似活性を有するラジカルである。従来、tempoを含
むニトロキシドは、生体巨大分子の構造的および運動的特性解析の研究のため、
“スピン標識”として電子スピン共鳴分光分析に使用されている。ニトロキシド
は、反応性フリーラジカル中間体の検出にも使用されている。化学構造によって
、安定した非対電子が、よく知られている超微細相互作用に供されるからである
。加えて、ニトロキシドが擬似酵素として作用することが観察されている：ある
低分子量のニトロキシドがスーパーオキシドジスムターゼ(Samuni, A et al., 1
988, J. Biol Chem. 263, 17921)およびカタラーゼ(Mehlhorn, R. J. et al., 1
992, Free Rad. Res. Comm. 17, 157)の活性に似ている。また多数の研究により
示されるのは、細胞膜を浸透するニトロキシドによって、哺乳類細胞が、ヒポキ
サンチン／キサンチンオキシダーゼから生ずるスーパーオキシド陰イオンおよび
過酸化水素にさらされても、短期間保護され得ることである。インビトロおよび
インビボにおけるtempoの細胞死誘発能は、新規であり、予期し得ない。所望の
細胞へのtempoの送達は、所望の細胞に特異的であるマーカーにtempoを結合させ
ることにより行い得る。そのマーカーには、当該細胞に特異的な抗体、当該細胞
が受容体を有する成長因子、または当該細胞の因子に特異的に結合するリガンド
が含まれる。例えば、ＨＥＲ／２ｎｅｕリガンドは、乳癌細胞に対し選択性を有
する。

【００３３】 “tempo”が意味するのは、安定なニトロキシドフリーラジカル、その前駆体(
例えばＮ−−Ｈ型)、およびその誘導体であって、その相当するヒドロキシルア
ミン誘導体(Ｎ−−ＯＨ)を含み、その場合、酸素原子は、ヒドロキシル基と置換
され、ハロゲン化水素型およびヒドロキシルアミン誘導体の塩化物塩型中に存在
する。

【００３４】 “tempoの機能的誘導体”が意味するのは、tempoの細胞毒性を保持または含有
するtempoの、天然のまたは合成の置換体、類似体または誘導体である。tempoは
、リポソームのような適当な担体によって送達され得る。tempoはまた、抗体ま
たはリガンドのような標的の組織−または細胞−特異的マーカーと結合し得る。
加えて、tempo構造の修飾は、標的の細胞または組織における安定性を改善し、
それによって、tempoの投与濃度を低下せしめ得る。置換体、誘導体または合成
類似体の形成は、当分野に知られており、生ずる化合物の当該細胞毒性能は、下
記実施例に記載のアッセイを含む当分野で既知の方法により試験される。

【００３５】 tempoは、６員複素環構造を有しており、２,２,６,６−テトラメチル−１−ピ
ペリジニルオキシ、すなわち２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキ
シルの形である。当該置換基は、通常、メチル基またはエチル基であるが、他の
長鎖炭素鎖も使用することができる。tempoは、典型的には４位を置換すること
ができ、例えば、４−アミノ、４−(２−ブロモアセトアミド)、４−(エトキシ
フルオロホスホニルオキシ)、４−(２−ヨードアセトアミド)、４−イソチオシ
アネート、４−マレイミド、４−(４−ニトロベンゾイルオキシル)、４−オキソ
、４−ホスホノオキシ等である。tempoの他の天然または合成の誘導体および前
駆体は、細胞死を効果的に誘発する化合物を生じ、それは本発明の一部を為す。
下記のような方法および他の方法は、化合物の細胞毒性を試験する分野で既知で
ある。当業者は、ニトロキシドの種々の官能基を置換することにより、可溶性、
生体分布、インビボ安定性および耐性を含む性質を操作することができる。

【００３６】 本発明は、細胞死を誘発するための方法を記載し、当該細胞死の誘発に十分量
のtempoまたはその機能的誘導体を含む組成物を細胞に投与することを含む。当
該組成物は、賦形剤または希釈剤などの医薬用剤、またはtempoまたはその機能
的誘導体の部位特異的局在化用の分子または担体を更に含み得る。担体は、デキ
ストランのような生体分子または合成分子であり得る。

【００３７】 下記の実験の結果は、ＳＡＰＫまたはカスパーゼ−３信号カスケードを活性化
することにより、tempoは細胞死を誘発すること示す。従って、本発明の他の実
施態様は、細胞中のＳＡＰＫ信号カスケードまたはキャスパーゼ−３カスケード
を活性化する方法に関する。当該方法には、tempoを含む組成物を細胞に投与す
ることが含まれ、その投与は、当該細胞中のＳＡＰＫ信号カスケードまたはカス
パーゼ−３信号カスケードの活性化に有効な量で行う。

【００３８】 ヘモグロビン、アルブミン、免疫グロブリンおよびリポソームを含む生体分子
にニトロキシドを共有結合させることについては、種々の技術が発表されている
。例えば、McConnell et al., 1970, Quart. Rev. Biophys. 3, 91; Hamilton e
t al., 1968. Structural Chemistry and Molecular Biology. A Rich et al.,
eds. W. H. Freeman, San Francisco, p. 115; Griggith et al., 1969, Acc. C
hem. REs. 2, 17参照。本発明によって、治療的なアポトーシス活性を局在化す
る手段として体内の特定部位にtempoを送達し得る担体を選択または設計するこ
とができる。担体には、以下に限らないが、tempoの脂肪親和性によりリポソー
ムが含まれる。標的には、以下に限らないが、特異的リガンドを含む腫瘍細胞、
受容体分子、例えば、上皮細胞増殖因子、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｗ、繊維芽細胞成長
因子のような成長因子の受容体；またはインターロイキン、インターフェロン、
および腫瘍壊死因子のようなサイトカインが含まれる。

【００３９】 選択的細胞死が有利となるかまたは疾患の処置の一部を為し得る疾患には、イ
ボ、アザ(mole)等のような異常細胞増殖を伴う疾患、癌、例えば、前立腺、乳房
、卵巣、頭部および頚部、腎臓、肺、骨、脳、膵臓、肝臓、または疾患細胞の死
が利点となる任意の他の疾患が含まれる。

【００４０】 本発明に準じ投与され得るtempoのレベルでは、動物においては十分耐性があ
り、ヒトにおいても十分耐性があると予測される。例えば、マウスにおけるtemp
oの耐性腹膜内用量は、５ｍｇ／ｋｇないし１０００ｍｇ／ｋｇである。腫瘍内
耐性は、２００ｍｇ／ｋｇを超え得る。更に、tempoを担体に結合し、静脈注射
するならば、当該担体は、tempoを血管内部に閉じ込める役割をし得る。その利
用は、当該担体の膜不浸透性のために最適化される。

【００４１】 tempoを注射すると、細胞内空間に急速に拡散する。その場合、オキソアンモ
ニウム中間体からのヒドロキシルアミン型に還元される。ヒドロキシルアミンに
はtempoの触媒活性を有しない。当該ヒドロキシルアミンは、化学的に安定であ
り、体内に比較的維持され、本発明の教授に従うと、ニトロキシドの元の活性型
に化学的に変換され得る。このインビボの変換により、tempoの安全な臨床的使
用が可能となり、活性が維持される。ヒドロキシルアミンの変換が選択的である
とき、選択的細胞死が可能である。

【００４２】 加えて、本発明は、静脈使用の液体や局所的薬剤などの医薬の保存または投与
用のコンテナーに関連するtempo含有化合物を記載する。tempoの安定な化学的性
質からして、tempo含有組成物が種々の経路により投与され得る。tempoを非経口
的または経口的に投与し得る。還元型において、ヒドロキシルアミンは、消化器
系で局所的に作用し得るか、または血中に取り込まれ得る。こうして、持続性の
活性が体内全体において供され得る。巨大分子に複合したtempoは、非経口的に
投与され、その場合、細胞外空間に局在したままとなり、それによって、局在化
した効果が得られる。

【００４３】 本発明による特定の製剤および投与方法に関し、当該製剤および投与方法を特
定の適用により示す。tempoに基づく化合物の選択は、活性が望ましい部位によ
る。特異活性が胃腸管において望ましい場合、tempo−デキストラン複合体が好
ましい。当該化合物は、胃腸管中において酵素的に消化される可能性が少ないた
めである。当該適用において、経口または直腸投与が好ましい。特異活性を、心
臓血管系のような静脈内または血管領域で求める場合、tempo−アルブミン複合
体が好ましい。アルブミンが、主要な血漿タンパク質であるからであり、十分な
耐性を有し、投与容易であり、血漿の半減時間が長いからである。同じ理論が、
腹膜内または皮内投与に応用される。肺における特異活性が望ましい場合、temp
o−アルブミン複合体のtempoのエアロゾル型が好ましい。当業者に明らかなよう
に、これら好ましい製剤は、特定の適用に応じて変り得る。tempoは腫瘍内に投
与され得る。当該用量は、適用疾患および投与経路に依存するが、体重／ｄａｙ
を５−２０００ｍｇ／ｋｇの間である。処置期間を疾患状態にしたがって延長し
、可能ならば、連続的に徐放性のポンプまたは製剤、または単一または複数ボラ
ス腫瘍内注入を用いる。複数の用量が必要であり、多数の用量が、臨床試験から
得られる疾患伝達媒体および効力についてのデータによって変ってくる。

【００４４】 製剤または投与の方法によって、処置すべき疾患または領域に応じて、全身ま
たは組織の具体的な分布が達成されるべきである。

【００４５】 本発明の製剤はまた、付加的な溶媒および／または担体物質および／または希
釈剤、例えばエタノールなどのアルコール、水、塩化ナトリウムまたはブドウ糖
、または経口または非経口を含む全身投与に使用する医薬的に許容される他の溶
媒を含み得る。

【００４６】 本発明の方法の実施において、溶媒または担体または所望によりその付加的な
医薬と組合せたtempo、またはtempo単独を、サル、イヌ、ネコ、ラット、ヒト等
のような哺乳類種に投与し得る。投与の方法には、以下に限らないが、経口的、
皮内的、経皮的、静脈的、皮下的、筋内的、腹膜内、および鼻腔内的経路が含ま
れる。当該投与は、ボラスまたは反復の投与、または例えば点滴による連続投与
の何れかにより行い得る。

【００４７】 tempo単独、または本発明の製剤の任意の他の成分との組合せを、血管造影ま
たは冠状動脈内の注射により投与する場合、それ(または組合せ)は、蒸留水、生
理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ溶液、または他の通常の担体のような通常の媒体で
製剤化される。

【００４８】 tempoは単独または本発明の製剤の任意の他の成分と組合せて、錠剤、カプセ
ルまたはエリクシルまたは注射剤のような通常の用量型に組込まれ得る。上記用
量型にはまた、必要な担体物質、賦形剤、滑沢剤、緩衝剤、抗菌剤、バルキング
剤(例えばマンニトール)、抗酸化剤(重亜硫酸ナトリウムのアスコルビン酸)等が
含まれる。非経口的投与型が好ましいが、経口型であっても同様に十分満足し得
る。

【００４９】 １以上のtempo組成物で満たした１以上のコンテナーを含む医薬キットは、溶
媒または担体を含み、かつキットの任意成分の混合または溶解に必要な試薬また
は試薬群を含むコンテナーと共に含まれ得る。

【００５０】 上記および下記のすべての引用文献を出典明示により本明細書の一部とする。

【００５１】 本発明は、下記実施例を参照することにより、さらに理解され得る。実施例は
、解説を目的とするのみであり、本発明の限定を目的とするものではない。

【００５２】 以下の物質および方法を下記の実施例に使用した。

【００５３】 抗体および試薬 下記抗体を本研究に使用した：抗−ＳＡＰＫポリクローナル抗体(α−ＮＴ)、
抗−ホスホチロシンモノクローナル(ＭＡｂ)抗体(α−ＰＹ、４Ｇ１０)、および
アガロース結合α−ＰＹ(UBI, Lake Placid, NY)；アガロース結合抗−ＥＲＫ−
１(Ｃ−１６、ｓｃ−９３ａｃ)、抗−ＪＮＫ１(Ｃ−１７、ｓｃ−４７４ａｃ)、
および抗−Ｒａｆ−１(Ｃ−１２)ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnolog
y, Inc., Santa Cruz, CA)；抗−Ｒａｆ−１ ＭＡｂ(ｃ−Ｒａｆ−１)および抗
−ＥＲＫ−１ ＭＡｂ(ＭＫ１２)(Transduction Laboratories, Lexington, Kent
ucky)。タンパク質Ａ−アガロースおよびＳｙｎｔｉｄｅ−２は、Santa Cruz Bi
otechnology, Inc.(Santa Cruz, CA)から得た。当該ニトロキシド化合物tempo(
２,２,６,６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシル)およびtempol(４−ヒド
ロキシ−tempo)はAldrich Chemical Co(Milwaukee, WI)から得た。ドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)試薬および５×
ＴＧＳ電気泳動緩衝液はGibco BRL(Grand Island, NY)から購入し、プレミック
スの１０×トリスグリシン転移緩衝液は、BioRad Laboratories(Hercules, CA)
から得た。すべて他の試薬は、特記しない限りSigma(St. Louis, Missouri)から
得た。

【００５４】 細胞培養、TempolおよびTempoによる処理および細胞ライゼートの調製 ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞を、５％ＣＯ₂の湿度９５％：３７℃におい
て、１０％胎児ウシ血清(ＦＢＳ)を含むImproved Minimum Essential Medium(Ｉ
ＭＥＭ)(Cellgro)の７５ｃｍ²組織培養フラスコ中において密集するぐらいまで
増殖させた。細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＢＳを含む培地において１５０
ｍｍ組織培養ディッシュ(フラスコあたりディッシュ２つ)で一夜静置した。その
後、リン酸緩衝液生理食塩水(ＰＢＳ)で二度洗浄した。培地を無血清培地で一夜
静置した後、tempol(１０ｍＭ)またはtempo(１０ｍＭ)処置した。両ニトロキシ
ドラジカルを使用前にエタノール中に溶解した。全細胞ライゼート(ＷＣＬ)抽出
のために、ニトロキシド処理した細胞または処理していない細胞を、０．５μＭ
オルトバナジウム酸(Ｎａ₃ＶＯ₄)を含む氷冷ＰＢＳで三度洗浄し、リシス緩衝
液(５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０(ＮＰ−４
０)、１０％ グリセロール, ４μｇ／ｍｌ各ロイペプチン、アプロチニンおよび
ペプスタチンＡ、１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオ
リド(ＰＭＳＦ), ２５ｍＭ フッ素ナトリウム(ＮａＦ), および０.５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ)中で溶菌させた。ＷＣＬを１時間４℃で振盪し、マイクロ遠心分離機によ
り１５，０００×ｇ、４℃、１５分間遠心分離し、細胞破砕物を除去した。上清
をアリコートし、使用するまで−７０℃で保存した。

【００５５】 免疫沈降および免疫ブロッティング 全細胞ライゼート(１ｍｇ)を、一夜４℃、定常的に振盪しつつ、適当なアガロ
ース結合抗体(１μｇ／ｍｌ リシス緩衝液)で免疫沈降させた。ＳＡＰＫ免疫沈
降の場合、ＷＣＬ(１ｍｇ)を一夜、抗−ＳＡＰＫ抗体(５μｇ／ｍｌ)で免疫沈降
させ、その後プロテインＡ−アガロース(２５０μｌ／ｍｌストックの５０μｌ)
を加え、２時間４℃にインキュベーションした。１５，０００×ｇ、５分間マイ
クロ遠心分離を行い、その後、リシス緩衝液で三度洗浄することによって、免疫
複合ビーズを回収した。当該ビーズを２×電気泳動サンプル緩衝液中に再懸濁し
、５分間煮沸し、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで再溶解し、Immobilon-
Pメンブレンに転移させた。当該メンブレンを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ(０.２５％)
中の４％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)でブロッキングし、所望の１：２０００の
一次抗体で免疫ブロットし、その後、１：１０，０００希釈の適当なセイヨウワ
サビペルオキシダーゼ−結合二次抗体で免疫ブロットした。当該免疫反応タンパ
ク質バンドは、ＥＣＬ検出システム(Amersham, Arlington Heights, IL)により
みられた。当該目的のバンドは、ImageQuant software version 3.3(Molecular
Dynamics Personal Densitometer, Sunnyvale, CA)により定量した。再プローブ
化前に、ブロットを、従来述べられている(Suy, S. et al., 1997, Oncogene 15
, 53-61)ようにＥＣＬキットプロトコール(NEN, Boston, MA)に従いストリップ
した。

【００５６】 Ｒａｆ−１キナーゼアッセイ Ｒａｆ−１プロテインキナーゼ活性を、下記の修飾を伴う製造者手順(UBI, La
ke Placid, NY)に従いキナーゼカスケードアッセイにより、測定した。簡単には
、Ｒａｆ−１免疫複合体をリシス緩衝液で三度洗浄し、キナーゼ結合緩衝液(Ｋ
ＢＢ)(２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７.２、２５ｍＭ リン酸グリセロール、５ｍＭ
ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ₃ＶＯ₄、１ｍＭ ＤＴＴ)で一度洗浄した。この後、免疫
複合体を３０分間３０℃で、ＫＢＢ２０μＬ、０．５ｍＭ ＡＴＰ／Ｍｇカクテ
ル(ＫＢＢ中の７５ｍＭ 塩化マグネシウムおよび５００μＭ ＡＴＰ)１０μｌ、
不活性ＭＡＰＫキナーゼ１．６μｌ(０．４μｇ)および不活性ＭＡＰＫ４μｌ(
１μｇ)を含む反応混合物中でインキュベーションした。当該反応の最後には、
サンプル混合物８μｌを新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移し、その後
、ＫＢＢ１０μｌ、ＭＢＰ基質(２ｍｇ／ｍｌストック)１０μｌ、およびＡＴＰ
／Ｍｇ²⁺中の[γ-³²Ｐ]ＡＴＰ(ストック３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ(Dupont NEN,
Boston, MA)の１：１０希釈により生ずる１μＣｉ／μｌ)１０μｌを加えた。
この反応混合物を１０分間３０℃でインキュベーションした。次いで、免疫複合
体を、ベンチ−トップマイクロ遠心分離機において短時間の遠心分離を行うこと
によりペレットとし、サンプル５μｌを３つづつ、Ｐ８１ペーパーにプロットし
た。放射活性フィルターを５０ｍｌコニカルチューブ(チューブあたり２０フィ
ルター)に移し、０．７５％リン酸４０ｍｌで四度洗浄し(それぞれ１５分間)し
、その後、簡単にアセトン洗浄し、Beckman LS 1801シンチレーションカウンタ
ーでカウントした。

【００５７】 更に、免疫複合体−付随Ｒａｆ−１活性は、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ−２を
測定した。この反応は、ＫＢＢ１５μｌ、ＡＴＰ／Ｍｇ²⁺カクテル１０μｌ、Ｓ
ｙｎｔｉｄｅ−２ ５μｌ(５μｇ)、希釈[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ１０μｌを連続的に
添加することにより開始し、その後、３０℃２０分間反応をインキュベーション
した。インキュベーションの最後には、反応混合物をベンチ−トップマイクロ遠
心分離機で短時間遠心分離し、上清５μｌを３つづつ、Ｐ８１フィルターペーパ
ーにスポットし、風乾させ、洗浄し、上記のようにカウントした。

【００５８】 ＥＲＫおよびＳＡＰＫ／ＪＮＫ活性 上記のように調製した全細胞ライゼートを、アガロース結合抗−ＥＲＫ１抗体
またはアガロース結合抗−ＪＮＫ１抗体で２時間４℃で定常的に振盪しつつ、免
疫沈降(１ｍｇ)させた。当該免疫複合体を前記したようにリシス緩衝液で三度洗
浄し、ＫＢＢで一度洗浄した。ＥＲＫまたはＪＮＫ活性アッセイは製造者手順に
従い実施した(ＵＢＩ)。簡単には、ＥＲＫ１免疫沈降を、基質としてＭＢＰ(ミ
エリン塩基性タンパク質)(２ｍｇ／ｍｌストック)１０μｌ、阻害剤カクテル(２
０μＭ ＰＫＣ阻害剤ペプチド、２μＭ プロテインＡ阻害剤ペプチド、および２
０μＭ 化合物Ｒ２４５７１)１０μｌ、およびマグネシウム−ＡＴＰカクテル(
７５ｍＭ 塩化マグネシウムおよび５００μｍ コールドＡＴＰ中のストック(３
０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ)の１：１０希釈により生ずる１μｃｉ[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ
)１０μｌを含むキナーゼ反応中で１０分間３０℃でインキュベーションした。
免疫複合体をベンチトップ遠心分離機で短時間遠心分離し、上清のアリコート５
μｌをＰ８１フィルターペーパーに３つづつスポットした。放射活性フィルター
を洗浄し、上記のようにカウントした。さらに、[γ−³²Ｐ]によるＭＢＰへの組
込みを視覚化するため、当該キナーゼ反応を、２×電気泳動サンプル緩衝液の添
加により停止し、５分間煮沸し、そしてタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
再溶解し、その後、放射能写真を撮った。ＪＮＫ活性アッセイの場合、ＪＮＫ１
免疫沈降を、ＫＢＢ１０μｌ、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ融合タンパク質(０．２μｇ／
μｌストック)２０μｌ、および上記のような希釈[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ１０μｌを
含むキナーゼ反応混合物４０μｌ中３０分間３０℃でインキュベーションした。
キナーゼ反応は、２×電気泳動サンプル緩衝液で停止させ、５分間煮沸し、そし
て上清を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した。放射標識ＧＳＴ−ｃＪｕ
ｎ融合タンパク質を放射能写真で検出した。

【００５９】 細胞生存能アッセイ 細胞の生存能および増殖におけるニトロキシド化合物の効果を、製造者指示書
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)に従い、細胞生存能検出キット(４−
[３−(４−ヨードフェニル)−２−(４−ニトロフェニル)−２Ｈ−５−テトラゾ
リオ]−１,３−ベンゼンジスルホネート、ＷＳＴ−１)を用い検出した。簡単に
述べると、ＭＤＡ−ＭＢ２３ｌ細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の密度で
９６ウェルプレートに接種し、培地を含む１０％ＦＢＳ中で一夜静置した。次い
で、当該細胞をリン酸緩衝性生理食塩水で二度洗浄し、無血清培地中に再接種し
た。翌日、細胞を、tempol(１０ｍＭ)またはtempo(１０ｍＭ)で数回処理し、処
理条件あたり６つのウェルを用い処理した。処理の最後には、ニトロキシド化合
物を含む培地を除去し、新しい無血清培地(１００μｌ)で置換し、その後、ＷＳ
Ｔ−１(１０μｌ)を添加した。プレートを２時間３７℃でインキュベーションし
、ＭＲ７００マイクロプレートリーダーを用いＯＤ＝４５０／６００で分析した
。

【００６０】 アポトーシスアッセイ ApoAlert Annexin V アポトーシス検出システム(Clontech Lab Inc., Palo Al
to, CA)を用い、アポトーシスおよび壊死細胞の相対的分布を測定した。簡単に
述べると、細胞を、２５ｃｍ²組織培養フラスコあたり１×１０⁶細胞の密度で接
種し、１０％ＦＢＳを含む培地中で一夜静置した後、無血清培地で二度洗浄した
。細胞を無血清培地中で一夜静置し、何度かtempol(１０ｍＭ)またはtempo(１０
ｍＭ)にさらした。この後、無血清培地で二度リンスし、その後トリプシン処理
し、２容積の無血清培地で希釈し、１０，０００×ｇで遠心分離した。当該細胞
ペレットをＰＢＳで一度洗浄し、１×結合緩衝液２００μｌに再懸濁した。当該
細胞懸濁液を、製造者指示書に従い、蛍光イソチオシアネート(ＦＩＴＣ)−標識
アネキシンＶ(１０μｌ)およびヨウ化プロピジウム(ＰＩ)(１０μｌ)で二重標識
した。ＦＩＴＣ−アネキシンＶまたはＰＩの何れかで標識した非標識細胞または
非処理細胞、または二重標識されたものは、バックグラウンド信号の内部対照の
役割をした。細胞により取込まれた色素強度を、FACStar plus Flow Cytometer(
Becton Dickerson, Lincoln Park, NJ)を用い検出し、データはReproman True F
acts softoware(Seattle, Washington)を用い分析した。生存能のある細胞はＦ
ＩＴＣ−／ＰＩ−であり、アポトーシス細胞はＦＩＴＣ＋／ＰＩ−であり、そし
て壊死細胞はＦＩＴＣ＋／ＰＩ＋であった。

【００６１】 セラミド生成アッセイ ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるセラミド産生を、従来の手順(Haimovitz-Fri
edman, A. et al., 1994, J. Exp. Med. 180, 525-535; Dressler, K. A. およ
びKolesnick, R. N., 1990, J. Biol. Chem. 265, 14917-14921)に従うジアシル
グリセロール(ＤＡＧ)キナーゼアッセイにより検出した。簡単には、ＭＤＡ−Ｍ
Ｂ２３１細胞をスプリット(１：２)し、２４時間後、当該細胞をＰＢＳで二度洗
浄し、無血清培地を添加し、その後、更に２４時間インキュベーションした。当
該細胞(−２×１０⁶／６０ｍｍディッシュ)をtempo(１０ｍＭ)またはtempol(１
０ｍＭ)で数回処理した。処理後、浮遊する細胞を回収し、１２００ｒｐｍの１
０分間の遠心分離によりペレットとし、付着細胞をスクラッピングにより回収し
た。脂質を、１００％氷冷メタノール１ｍｌ中でインキュベーションすることに
より全細胞(浮遊しているおよび付着している細胞)から抽出した。クロロホルム
による部分的精製後、有機相中の抽出脂質をＮ₂存在下で乾燥し、弱いアルカリ
性溶液(メタノール中０．１Ｎ ＫＯＨ)で１時間３７℃で処理し、グリセロール
ホスホ脂質を除去した。当該有機相抽出物を、７．５％ｎ-オクチル−β−Ｄ−
グルコピラノシド、５ｍＭ カルジオリピン、１ｍＭ ＥＤＴＡの２０μｌ中に再
懸濁し、その後、ＤＡＧキナーゼ緩衝液(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ ７.
４)、１０ｍＭ ＤＴＴ、１.５Ｍ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ シュクロース、１５％
グリセロール)中の精製ＤＡＧキナーゼ４０μｌを添加した。当該キナーゼ反応
は、希釈[γ−³²Ｐ]ＡＴＰ(ＤＡＧキナーゼ緩衝液中、１,０００ ｄｐｍ／ｐｍ
ｏｌの１０ｍＭ)２０μｌの添加により開始し、３０分間２２℃でインキュベー
ションした。この反応は、１ｍｌＣＨＣｌ₃：ＣＨ₃ＯＨ：ＨＣｌ(１００：１０
０：１)、生理食塩緩衝液(１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．
５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５．６ｍＭ グルコース, および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７.２)１７０μｌおよび１００ｍＭ ＥＤＴＡ３０μｌで脂質を抽出することに
より終了した。セラミド−１−ホスフェートを含む低級有機相を回収し、Ｎ₂存
在下乾燥させ、その後、スポッティングし、４０μｌ(80%)を薄相クロマトグラ
フィー(ＴＬＣ)(Whatman silica gel 150A)プレートに適用(run)し、溶媒として
ＣＨＣｌ₃：ＣＨ₃ＯＨ：ＨＡｃ(６５：１５：５ ｖｏｌ／ｖｏｌ)を含むチャン
バー内で展開した。セラミド−１−ホスフェートを含むスポットを放射能写真に
より視覚化し、当該組込まれた³²Ｐをスクラッピングにより除去し、Ｃｅｒｅｎ
ｋｏｖカウンティングにより定量した。既知量のセラミドからなる標準曲線を、
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に生ずる観察されるセラミドのレベルに対する比較とし
て使用した。

【００６２】 カスパーゼ−３活性アッセイ： ＡｐｏＡｌｅｒｔ ＣＰＰ３２活性／カスパーゼ−３アッセイキットを用い、
製造者指示書(Clontech)に従う細胞におけるカスパーゼ−３活性を測定した。簡
単には、tempo処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで三度洗浄し、氷上で１０分間、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ細胞リシス緩衝液中で溶菌させ、その後、１５，０００×ｇで５分
間マイクロ遠心分離を行った。全細胞ライゼート(50μg)を、２×反応緩衝液中
１０ｍＭ ＤＴＴ、５０μＭ ＣＰＰ３２基質、ＤＥＶＤ−ＡＦＣを含むキャスパ
ーゼ−３反応混合物中で１時間３７℃でインキュベーションした。放出される７
−アミノ−４トリフルオロメチルクマリン(ＡＦＣ)を、４００ｎｍの励起および
５０５ｎｍの放出の分光蛍光計(Hitachi F4500)で検出した。

【００６３】 透過型電子顕微鏡： ＬＮＣａＰ細胞を、図２の説明に記載のようにtempoで処理した。処理後、単
層の細胞を、ＰＢＳで三度洗浄し、ＰＢＳ中の２．５％グルタルアルデヒド／３
％パラホルムアルデヒドに固定した。固定後、当該細胞単層をＰＢＳで洗浄した
。当該細胞を、ラバーポリスマンを用い穏やかにスクラッピングすることにより
回収し、遠心分離した。当該ペレットを１％アガロースで固定し扱いやすくした
。後−固定(post-fixation)を、蒸留水中の１％四酸化オスミウム中１時間行い
、その後、蒸留水で三度洗浄し、暗室で３０分間、２％酢酸ウラニルで一括して
染色し、蒸留水で三度洗浄した。この後、通常の極薄切片電子顕微鏡用に処理し
た。切片を２００メッシュ-ニッケルグリッドにマウントし、クエン酸鉛で後-染
色(post-stain)し、６０ｋＶで操作するＪＥＯＬ １２００ＥＸ−透過電子顕微
鏡で撮影した。

【００６４】 腫瘍増殖の研究： ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞(１×１０⁶)を、生後４−６週間のメスの無胸腺症マ
ウスの右わき腹に皮下接種した。腫瘍増殖を隔週でモニターした。８０−１００
ｍｍ³の範囲の容積の腫瘍を生じているマウスを処置用にランダムに選択した。t
empo処置を開始し(腫瘍内に５０ｍｇ／ｋｇ−２００ｍｇ／ｋｇ、１日１度、合
計８日)、腫瘍容積は処置から始めて合計２５日間測定した。

【００６５】 実施例１ タンパク質チロシン加リン化反応に対する tempol および tempo の作用 図２は、１０ｍＭ の tempo にＭＤＡ−ＡＢ２３１細胞を暴露した後１５分以
内における幾つかのまだ同定されていないタンパク質バンドのチロシン加リン化
反応の顕著な増加を示す。これらのレベルは、試験期間中（２時間）増加したま
まであった。並行実験において、最小のタンパク質チロシン加リン化反応が、等
モル濃度の tempol による細胞処理後の様々な時点（１５分〜２時間）で観察さ
れた。これらのデータによると、両ニトロキシドがタンパク質チロシン加リン化
反応を誘発し、この応答の大きさは tempo 処理細胞における場合の方が明らか
に高かった。

【００６６】 実施例２ tempol および tempo はインビボでＲａｆ−１のチロシン加リン化反応およ
び活性を刺激する。 以前、我々は、電離放射線、すなわち周知のストレス誘発因子がＭＤＡ−ＭＢ
２３１乳癌細胞におけるＲａｆ−１のチロシン加リン化反応を誘発することを立
証した（Suy,S.ら、１９９７、前出）。本発明では、 tempol または tempo に
応答するＲａｆ−１プロテインキナーゼのチロシン加リン化反応および活性化の
可能性について調べた。興味深いことに、 tempol および tempo による両処理
は、チロシン加リン化Ｒａｆ−１（Ｒａｆ^P）のレベルの増加を招いた（図３Ａ
、上図）。全Ｒａｆ−１タンパク質のレベルは不変のままであった（図３Ａ、下
図）。免疫反応性ＲａｆＰバンドを定量した。デンシトメーター分析によると、
１５分後に検出されたＲａｆＰレベルの増加が〜５−８倍であり、Ｒａｆ^P含有
量は〜６０分−１２０分までは基底レベルと同等である（データは示さず）。Ｒ
ａｆ−１プロテインキナーゼの活性については、キナーゼカスケード検定または
シンチド−２加リン化反応検定により測定した（図３Ｂ）。Ｒａｆ−１の高いチ
ロシン加リン化反応に一致して、tempol または tempo による処理の結果、Ｒａ
ｆ−１プロテインキナーゼ活性が２−３倍増加した。

【００６７】 実施例３ tempol はＥＲＫ活性を刺激する。 Ｒａｆ−１活性化は一般にＥＲＫ（ｐ４２／４４ＭＡＰＫ）活性化を誘導する
ので、ＥＲＫ１酵素活性に対する tempol および tempo の作用を調べた。代表
的実験を図４に示す（図ＡおよびＢ）。ＥＲＫ１の酵素活性における約３倍増加
が tempol で処理した細胞において２時間までに検出された（図４Ａ）。しかし
ながら、興味深いことに、対照細胞と比べて tempo 処理後におけるＥＲＫ１活
性の変化は全くみとめられなかった（図４Ａ）。さらに、ＥＲＫ１加リン化反応
は、 tempol 暴露（１０ｍＭ ）の２時間後でのＥＲＫ１免疫沈降物を用いた免
疫ブロットにおいて、さらに緩慢に移動している加リン化形態（ＥＲＫ１^P）へ
のシフトとして見られたが、tempo 処理細胞におけるＥＲＫ１の運動性でのシフ
トを確認することはできなかった（データは示さず）。

【００６８】 実施例４ tempo 処理の結果、インビボでＳＡＰＫの加リン化反応および活性化が高ま
る。 次に、我々は、ストレス誘発信号伝達経路の周知成分であるＳＡＰＫ／ＪＮＫ
に対する tempol および tempo の作用を測定した。時間経過実験は、tempo 処
理の結果、加リン化ＳＡＰＫ（〜５４kDa、ＳＡＰＫ^P）のレベルが、tempol 処
理または非処理対照と比べて顕著に増加することを示した（図５Ａおよび５Ｂ）
。これらのデータと一致して、ＳＡＰＫ酵素活性は、加リン化ＧＳＴ−ｃＪｕｎ
のレベルにより示された通り tempo 処理細胞において顕著に誘発された（図５
Ｃ）。３つの独立して行なわれた実験のデンシトメーター分析は、tempol（１０
ｍＭ、２時間）または対照（１％エタノール、２時間）処理と比べて tempo 暴
露（１０ｍＭ、２時間）後に検出され得る加リン化ＧＳＴ−ｃＪｕｎ融合タンパ
ク質の３−７倍増加を示した。

【００６９】 実施例５ tempo はアポトーシス細胞死を誘発する 幾つかの試験についての報告によると、ＳＡＰＫ信号伝達カスケードの活性化
は、アポトーシス細胞死の誘発に伴う（Kyriakis,J.M.および Avruch,J.、１９
９６、前出）。 tempo の可能な細胞傷害作用を調べるため、まず、比色検定法
を用いて細胞の生存能および増殖を測定した。細胞を１０ｍＭ の tempo で処理
することにより、２時間以内に生存細胞の数が＞５０％の率で減少した。並行実
験において、１０ｍＭの tempol で処理した培養における生存細胞の数は、１％
エタノールで処理した対照細胞と同等であった（図６）。これらの観察結果から
、tempo 処理後における生存細胞数の減少がアポトーシスおよび／または壊死に
よる細胞死に起因するか否かを調べた。

【００７０】 アポトーシスは、細胞質収縮、核凝縮およびＤＮＡ断片化を特徴とする細胞死
のプロセスである（Kerr,J.F.R.ら、１９７２、Br. J. Cancer ２６、２３９−
２５７）。幾つかの報告は、アポトーシスに至る初期事象に、細胞膜は無傷のま
までありながら、細胞内膜から細胞外膜へホスファチジルセリン（ＰＳ）が転移
した結果として細胞膜リン脂質非対称の喪失が伴うことを示唆している（Fadok,
V.A.ら、１９９２、J. Immunol. １４８、２２０７−２２１６）。ＰＳ−結合
性タンパク質、アネキシンＶは、アポトーシスを起こしている様々なネズミおよ
びヒト細胞型におけるこのリン脂質の外面化を検出するための特異的プローブと
して使用されている（Martin,S.J.ら、１９９５、J. Exp. Med. １８２、１５４
５−１５５６、Koopman,G.ら、１９９４、Blood、８４、１４１５−１４２０）
。他方、細胞壊死は、外部細胞表面へのＰＳの転移および膜完全性の喪失の両方
と関連している（Vermes,I.ら、１９９５、J. Immunol. Methods １８４、３９
−５１）。アポトーシス細胞の細胞膜完全性は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を
用いる色素排除試験で確認し得る。下記実験において、アポトーシスおよび壊死
評価用マーカーとしてＦＩＴＣ−結合アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（
ＰＩ）を使用した。 tempol または tempo で処理したＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞
を、ＦＩＴＣ結合アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により二重標
識し、次いで、フローサイトメトリー分析にかけた。ニトロキシド化合物を使用
または使用しないＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の代表的サイトグラム分析を図７Ａに
示す。下方左の四分は、アネキシンＶおよびＰＩについて陰性であった生存細胞
（Ｖ）を表す。下方右の四分は、アネキシンＶ染色において陽性であったアポト
ーシス細胞（Ａ）を表す。上方右の四分は、アネキシンＶおよびＰＩ染色の両方
において陽性であった壊死細胞（Ｎ）を表す。tempo 処理（１０ｍＭ、２時間）
の結果、 tempol（１０ｍＭ、２時間）（６.３２％アポトーシス細胞、１.３１
％壊死細胞）および対照細胞（１％エタノール、２時間）（６.０５％アポトー
シス細胞、１.０６％壊死細胞）と比べてアネキシンＶ取り込み（５２.４２％ア
ポトーシス細胞）およびアネキシンＶプラスＰＩ取り込み（１０.９０％壊死細
胞）の両場合が顕著に増加した。時間経過分析は、tempo 処理の結果、２時間ま
でアポトーシス細胞数が安定して増加した後、３時間までは壊死細胞数がかなり
増加することを示していた（図７Ｂ）。tempol 処理は、試験期間（３時間）中
アポトーシスまたは壊死を誘発することは無かった（図７Ｂ）。これらのデータ
は、tempo 刺激ＳＡＰＫ加リン化反応および活性化がＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞に
おけるアポトーシス細胞死に伴い得ることを示唆している。

【００７１】 癌細胞における tempo の細胞傷害作用の普遍性を測定するため、２種の他の
癌細胞系：ＰＣＩ−０４Ａ、すなわちヒト咽頭扁平上皮癌由来の細胞系（Heo,D.
S.ら、１９８９、Cancer Res. ４９、５１６７−５１７５）、およびＰＣ−３、
すなわちヒト前立腺癌細胞系を調べた。図７Ｃおよび７Ｄに示されたデータは、
ＰＣＩ−０４Ａ細胞における tempo 処理（１０ｍＭ）２時間後での顕著なレベ
ルのアポトーシスおよび壊死を立証している。ＰＣ−３細胞において、１０ｍＭ
の tempo 処理は、２時間までに〜８４％の壊死細胞をもたらしたことから、こ
の処理条件は傷害性が高いことを意味していた（図７Ｅおよび７Ｆ）。tempo は
また、前に発表されているビスベンザミド三塩酸塩／ヘキスト−３３２５８染色
方法（Haimovitz-Friedman,A.ら、１９９４、J. Exp. Med. １８０、５２５−５
３５）により測定したところ（対照：４時間、１.５５±０.０２％、８時間、１
.９９±０.４３％、tempo（５ｍＭ ）：４時間、３.９７±０.３３％、８時間、
３８.８５±１.６９％）、牛大動脈内皮細胞においてアポトーシス細胞死を誘発
した（Suy,S.ら、１９９８、J.Biol.Chem.）。これらの結果は、tempol ではな
く tempo が、異なるタイプの癌細胞において細胞死を誘発することを明らかに
立証している。

【００７２】 実施例６ tempo 処理ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるセラミド生成 セラミド、すなわち原形質膜リン脂質スフィンゴミエリンの加水分解の結果ま
たは新規合成により生成される第２メッセンジャー分子は、環境キューに対する
様々な生物学的応答に関与している（Kolesnick,R.N.、１９９２、Trends Cell
Biol. ２、２３２）。セラミドの増加は、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ活性の増加と相互に
関係があり、セラミドおよびＳＡＰＫ／ＪＮＫは細胞死に至る信号伝達経路に関
与することが示された（Verheij,C.ら、１９９６、前出、Westwick,J.K.ら、１
９９５、前出、Yan,M.ら、１９９４、Nature ３７２、７９８−８００、Zanke,B
.W.ら、１９９６、Curr.Biol. ６、６０６−６１３）。tempo 誘発ＳＡＰＫおよ
びアポトーシスにおけるセラミドの役割の可能性を調べるため、ＤＡＧキナーゼ
検定を用いて、ニトロキシド化合物での処理または無処理のＭＤＡ−ＭＤ２３１
細胞におけるセラミドレベルを定量した。セラミドレベルにおいて対照（１００
％を標準）に対する５４％増加が３０分で観察され、セラミドレベルは tempo
処理１時間後に対照に対し７１％に達した（図８）。tempol 処置細胞で生成さ
れたセラミドのレベルは、どの時点においても対照細胞と比べてあまり高くはな
かった。セラミド生成は、ＪＮＫ／ＳＡＰＫおよびアポトーシスの最大刺激に先
行することから、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞における tempo 誘発信号伝達への関
与を意味する。

【００７３】 実施例７ 前立腺癌細胞に対する tempo の作用を調べるため、ヒトアンドロゲン依存性
前立腺癌由来の細胞系（ＤＵ１４５およびＰＣ３）を、３７℃で５％ＣＯ₂：９
５％空気の加湿雰囲気中２ｍＭのＬ−グルタミンおよび２００ＩＵ／mlのペニシ
リンおよびストレプトマイシン混合物を補った１０％胎児牛血清（ＢＣＳ）含有
改良最少必須培地（ＩＭＥＭ）（セルグロ）中において７５cm²組織フラスコで
ほぼ密集状態まで増殖させた。ヒトアンドロゲン依存性前立腺癌由来の細胞系（
ＬＮＣａＰ）を、１０％ＢＣＳおよび２ｍＭ Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６
４０培地で培養した。細胞をトリプシン処理し、１５０mm²組織培養皿（１フラ
スコに対し２皿）または２５cm²フラスコ（１フラスコに対し１×１０⁶細胞）中
で一夜同数で播種した。細胞を、様々な時間で所望濃度の tempo により５％Ｂ
ＣＳ含有培地中で処置した。tempo を使用前エタノール（０.１％）に溶解した
。対照培養物を様々な時間でエタノール（０.１％）処理した。処理後、細胞を
ＰＢＳで３回洗浄した。上述のように、アポアラート（ApoAlert）アネキシンＶ
アポトーシス検出システム（Clontech）を用いて、tempo に応答したアポトーシ
スおよび壊死細胞の相対分布を測定した。ＦＩＴＣ結合アネキシンＶまたはヨウ
化プロピジウムで標識した細胞のフローサイトメトリー分析の結果は、tempo 処
置により、これらの前立腺癌細胞系において顕著なレベルのアポトーシスが誘発
されることを示した。ＤＵ１４５細胞およびＰＣ−３細胞において、２４時間２
.５ｍＭ の tempo 処置により、アポトーシス細胞数はそれぞれ約３、４倍およ
び６、７倍増加した。ＬＮＣａＰ細胞では、相対的に高いレベルのアポトーシス
が観察された（１ｍＭのtempo、２４時間、約１２倍、５ｍＭのtempo、４時間、
約１５倍）（図９）。

【００７４】 実施例８ システインプロテアーゼのカスパーゼ群（ファミリー）の活性化は、プログラ
ム細胞死の重要な分子の特徴である。カスパーゼ−３は、様々な作用因子により
誘発されるアポトーシス信号伝達経路の周知の下流エフェクターである。前立腺
癌細胞において tempo がカスパーゼ−３活性を活性化するか否かを調べた。図
１０に示されている通り、異なる前立腺癌細胞系における様々なレベルもかかわ
らず、tempo はカスパーゼ−３の活性化を誘発した。ＤＵ１４５およびＰＣ３細
胞では、tempo（２.５ｍＭ）によってカスパーゼ−３活性のレベルにおける中程
度の増加しか観察しなかった（ＤＵ１４５、２時間、〜１７０％、ＰＣ３、２４
時間、〜２００％）。ＬＮＣａＰ細胞における顕著な tempo 誘発アポトーシス
と一致して、カスパーゼ活性の〜１２倍増加を tempo 処理ＬＮＣａＰ細胞（２.
５ｍＭ、２４時間）において認めた。

【００７５】 実施例９ 光学顕微鏡レベルでは、紡錘状の高度屈折力のある外見からより平らな外見へ
の細胞形態の明確な変化をＬＮＣａＰ細胞の tempo 処置後に認めた（図１１）
。

【００７６】 実施例１０ 次に、tempo がアポトーシスの形態学的特徴を誘発するか否かを調べるため、
超微細構造分析を企画した。電子顕微鏡は、多数の tempo 処理ＬＮＣａＰ細胞
の核におけるクロマチンの凝集および周辺化（マージナリゼーション）を示した
。核膜は本質的に無傷のままであった。細胞質において、ゴルジ体および粗面小
胞体は消滅するかまたは崩壊し、ミトコンドリアは大多数の tempo 処理細胞に
おいて認識できなかった。興味深いことに、０.１％エタノール処理細胞におけ
るミトコンドリアは、非処置対照と比べて膨張していた。恐らく膨張した小胞体
またはゴルジ小胞に起因すると思われる明白な空胞形成が、９０％を越える tem
po 処置細胞における細胞質全体で見られたことから、膜質細胞小器官を確認す
ることは非常に困難である。最近の発表によると、膜小気泡形成およびカスパー
ゼ活性化がアポトーシスの同じ系統のカスケードにはない（Huot,J.ら、１９９
８、J.Cell Biol.１４３，１３６１−１３７３）。この情報と一致して、小気泡
形成が tempo 処理細胞ではみとめられなかった。同時に、このことは、ＬＮＣ
ａＰ細胞における tempo 誘発アポトーシスに関する見解を裏付けている。

【００７７】 実施例１１ 腫瘍成長速度の顕著な下降は、対照賦形剤群（１０％エタノール）と比べて t
empo 処置群の方が目立っていた。これらのインビボデータは、tempo の抗腫瘍
活性の可能性を示唆している（図１３）。

【００７８】 考察 本試験は、我々の知る限りでは初めて、抗酸化特性で知られている２種のニト
ロキシド、tempol および tempo に対する細胞応答の信号伝達機構についての報
告である。最初、ＥＲＫ経路が生存または増殖信号を伝達するため多様な細胞型
により使用されているので、tempol および tempo の抗酸化作用は、ＥＲＫ信号
伝達経路の刺激により補われ得るという仮説を立てた。以前のインビトロ試験は
、放射線防護には少なくとも５−１０ｍＭの tempol が要求され、２.２程度の
高い防護係数は１００ｍＭの tempol により達成されることを示唆していた（１
５）。tempol（１０ｍＭ）によるＥＲＫ１の活性化を示す我々のデータは、放射
線誘導突然変異誘発および二本鎖切断、および過酸化水素誘導変異誘発に対する
tempol の防護的役割に関して、これらおよび他の報告と一致している（Hahn,S
.M.１９９２、前出、Hahn,S.M.ら、１９９４、Cancer Res. ５４（補遺）２００
６ｓ−２０１０ｓ、DeGraff,W.G.ら、１９９２、Environ. Mol. Mutagen. １９
、２１−２６、DeGraff,W.G.ら、１９９２、Free Radical Biol. Med. １３、４
７９−４８７）。しかしながら、驚くべきことに、 tempo（１０ｍＭ）が、ＥＲ
Ｋ１活性に対する検出可能な作用を有していなかったことは、ある種のニトロキ
シドのＥＲＫ信号伝達および抗酸化活性間にも解離が存在し得ることを示唆する
。

【００７９】 tempo によるタンパク質チロシン加リン化反応の増強、セラミドの生成、ＳＡ
ＰＫの活性化およびアポトーシスの誘発は、予想外で新規な観察結果である。さ
らに評価するための一つの可能性は、 tempol 対 tempo の互いに異なる細胞内
還元速度が存在し得ることである。この状況において、tempo 処置細胞は、高い
tempo 遊離基濃度を有し得る。次に遊離基は、第２メッセンジャーとして、適
当な細胞標的を見出し、信号伝達経路を始動させる。この明細書において、血小
板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を血管平滑筋細胞に加えると、過酸化水素および反
応性酸素化学種（ＲＯＳ）の細胞内レベルが増加することは注目すべきことであ
る。これらの事象は、ＰＤＧＦ誘発チロシン加リン化反応、ＭＡＰＫ刺激および
ＤＮＡ合成と相互に関係している（Sundaresan,M.ら、１９９５、Science ２７
０、２６−２９９）。他の報告では、好中球におけるタンパク質チロシン加リン
化反応の誘発は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化に依存的であり（Fialkow,L.ら
、１９９３、J.Biol.Chem.２６８、１７１３１−１７１３７）、まだ同定されて
いないタンパク質チロシンキナーゼの刺激は、Ｂリンパ球のアポトーシス死に結
び付けられている（Uckun, F. M.ら、１９９２、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
. ８９、９００５−９００９）。アポトーシスの観察が短時間（２時間）で十分
ということは（図７）、細胞周期、ＤＮＡ合成または顕著な転写／翻訳が tempo
始動の細胞死にとっての先行必要条件ではあり得ないことを示唆している。ア
ポトーシスの誘発に要求される既存タンパク質の翻訳後修飾は、ＳＡＰＫを含む
遊離基伝達プロテインキナーゼ経路（複数も可）により調節されることが可能で
あると思われる。

【００８０】 内在性スフィンゴ脂質代謝物、例えばセラミドおよびスフィンゴシンは、細胞
の生長、分化およびアポトーシスの脂質伝達物質として認識されている（Haimov
itz-Friedman, A.ら、１９９４、前出、Obeid, L.M.ら、１９９３、Science ２
５９、１７６９−１７７１、Kolesnick, R.および Golde, D.W.、１９９４、Cel
l ７７、３２５−３２８、Bose, R.ら、１９９５、Cell ８２、４０５−４１４
、Jarvis, W.D.ら、１９９４、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９１、７３−７
７、Pushkareva, M.ら、１９９５、Immunol. Today １６、２９４−２９７）。
アポトーシスは、セラミド放出に依存的または無関係であると示唆されており（
Verheij, C.ら、１９９６、前出、Westwick, J.K.ら、１９９５、前出、Shiraka
be, K.ら、１９９７、J. Biol. Chem. ２７２、８１４１−８１４４、Watts, J.
D.ら、１９９７、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ９４、７２９２−７２９６）
、そしてさらに最近では、セラミドは、ミトコンドリアと相互作用して、反応性
酸素種の発生を誘発することが示されている（Garcia-Ruis, C.ら、１９９７、J
. Biol. Chem. ２７２、１１２６９−１１３７７）。他の試験では、カスパーゼ
としても知られている、アスパラギン酸残基に対する特異性を有する一群のシス
テインプロテアーゼの活性化は、アポトーシス細胞死と密接に関係しれており、
この経路はミトコンドリアからのシトクロムＣの放出を伴う（Liu, X.ら、１９
９６、Cell ８６、１４７−１５７、Salvesen, G.S. および Dixit, V.M.、１９
９７、Cell ９１、４４３−４４６）。 tempo 処理細胞におけるセラミド生成が
スフィンゴミエリナーゼおよび／またはセラミドシンターゼの活性化に起因する
のか、または tempo 処理の結果カスパーゼが活性化されるのかは、我々の研究
室で目下検討中の重要な論争点である。

【００８１】 何の成分が、それぞれ tempol および tempo のそれぞれの始動信号伝達にお
いてＥＲＫおよびＳＡＰＫの上流にあるのか？ tempol および tempo は生理学
的ｐＨ範囲では非電荷ニトロキシドであり、容易に細胞膜を横切る。しかしなが
ら、細胞下区画におけるそれらの濃度は異なる。tempo は tempol より約２００
倍親油性が高いため（Kocherginsky, N.ら、１９９５、Nitroxide Spin Labels,
Reactions in Biology and Chemistry中、１５−２６頁、ＣＲＣプレス、ボカ
レートン、フロリダ）、tempo は tempol よりかなりの程度まで細胞膜に蓄積す
ると予想される。すなわち、細胞膜に局在し、レドックス反応に関与し得る tem
po のような作用因子（安定した遊離基）を有すると、水溶性が高く、細胞全体
により均一に分布している tempol とは異なる信号伝達カスケードが開始され得
る。tempol および tempo は両方ともＲａｆ−１を刺激したが、ＥＲＫ１活性は
tempol 処置細胞でのみ増強された。Ｒａｆ活性化は、ＥＲＫ１と比べて一時的
であった。Ｒａｆ−１活性は３０分でピークに達し、ＥＲＫ活性は１５分で上昇
し始め、少なくとも１２０分までは上昇し続けた。

【００８２】 このように、Ｒａｆ−１活性化とＥＲＫ活性化との速度論的相関関係の欠如に
ついては、早くから観察されており（Kasid, U.ら、１９９６、Nature ３８２、
８１３−８１６、Suy, S.ら、１９９７、前出）、ＥＲＫの上流におけるＲａｆ
−１を含む多重エフェクターに起因し得る。現時点で、ニトロキシド誘発応答に
おけるＲａｆ−１活性の重要性は不明である。ＭＥＫすなわちＲａｆ−１の既知
生理的基質、およびＥＲＫの活性化因子（Dent, P.ら、１９９２、Science ２５
７、１４０４−１４０７、Howe, L.R.ら、１９９２、Cell ７１、３３５−３４
２、Kyriakis, J.M.ら、１９９２、Nature ３５８、４１７−４２１、Avruch, J
.ら、１９９４、Trends Biochem. Sci. １９、２７９−２８３、Crews, C.W.ら
、１９９２、Science ２５８、４７８−４８０、Marshall, C.J.,１９９４、Cur
r. Opin. Genet. Dev. ４、８２−８９）、およびＳＥＫ１すなわちＳＡＰＫの
強力な活性化因子（Derijard, B. ら、１９９５、前出、Sanchez, I.ら、１９９
４、前出、Johnson, N.L.ら、１９９６、前出、Minden, A.ら、１９９４、前出
、Lin, A.ら、１９９５、Science ２６８、２８６−２９０）は、他の強力な上
流標的である。ＥＲＫおよびＪＮＫ／ＳＡＰＫを含むＭＡＰＫの調節には逐次加
リン化反応が含まれ、受容体または非受容体タンパク質チロシンキナーゼ（複数
も可）により細胞表面で開始されることが多い。他の報告は、細胞生存または細
胞死の決定因子としてＥＲＫ活性およびＳＡＰＫ活性の間のバランスを示唆して
いる（Xia, Z.ら、１９９５、前出）。tempol と比べて tempo 処置後１５分以
内のタンパク質チロシン加リン化反応における顕著な増加に基くと、tempo 処置
細胞におけるプロアポトーシス・タンパク質チロシンキナーゼ（複数も可）を含
む脂質伝達信号経路の活性化を推測することは妥当と思われる。

【００８３】 結論として、この試験により、（ａ） tempo は、tempol と比較すると、幾つ
かのまだ同定されていないタンパク質の顕著なチロシン加リン化反応を誘発する
、（ｂ）tempol および tempo は、Ｒａｆ−１プロテインキナーゼのチロシン加
リン化反応および活性を刺激する、（ｃ）tempol は、ＭＡＰＫ（ＥＲＫ）活性
を刺激し、tempo はＳＡＰＫ加リン化反応および活性の強力な誘発因子である、
（ｄ）tempol ではなく tempo はアポトーシス細胞死を誘発する、および（ｅ）
tempo 誘発細胞死はＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるセラミド生成と関連し得る
という証拠が提供される。我々の発見によると、環境的酸化ストレス、例えば電
離放射線により誘導されるものが存在しない場合、ニトロキシド、tempol およ
び tempo が異なる信号伝達経路を刺激することを意味する。この伝達経路は、
恐らく細胞代謝に伴う二次基により誘発され、早期事象、例えばタンパク質チロ
シン加リン化反応およびセラミドの生成の制御により差別的に調節される。

【００８４】 ＭＡＰキナーゼ経路は、増殖を開始する信号伝達機構であり、広範に使用され
ている。ＭＡＰキナーゼの過剰発現は、乳癌患者の悪性胸部上皮および転移細胞
に局在している（Sivaraman, V.S.ら、１９９７、J. Clin. Invest.９９、１４
７８−１４８３）。次に、細胞死経路（複数も可）を活性化する化合物が同定さ
れたからには、当然癌治療におけるそれらの合理的使用が期待される。tempo が
異なる細胞型においてアポトーシスを誘発するという発見により、さらに進んだ
試験の実施が確約される。また抗酸化活性を発揮する作用因子がアポトーシスに
よる細胞毒性を誘発し得ることは非常に興味深い。ヒト腫瘍対正常細胞における
アポトーシスの選択的誘発が存在する場合、tempo の使用は臨床用途を有し得る
。この可能性を探求すべく、我々の研究室では試験が現在も進行中である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ニトロオキシド化合物 tempol (４−ヒドロキシ−tempo
）および tempo の化学構造についての模式図である。

【図２】 図２は、tempol および tempo のタンパク質チロシン加リン化反
応に対する作用を示す。

【図３】 図３は、 tempol およびtempo がインビボでチロシン加リン化反
応およびＲａｆ−１タンパク質キナーゼの酵素活性を促進することを示す。

【図４】 図４は、tempol がＥＲＫ１活性を促進することを示す。

【図５】 図５は、tempo がチロシン加リン化反応およびＳＡＰＫの活性を
促進することを示す。

【図６】 図６は、細胞生存能に対する tempol および tempo の作用を示
す。

【図７】 図７は、tempo がアポトーシス性細胞死を誘発することを示す。

【図８】 図８は、tempo 処置ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるセラミド産
生を示す。

【図９】 図９は、前立腺癌細胞（図Ａおよび図Ｂ：ＤＵ１４５、図Ｃ：Ｐ
Ｃ−３、図Ｄ：ＬＮＣａＰ）における tempo 誘発アポトーシスについての時間
経過および用量対応実験を示す。

【図１０】 図１０は、前立腺癌細胞系における tempo のカスターゼ−３
活性に対する作用を示す。

【図１１】 図１１は、ＬＮＣａＰ細胞の位相差光顕微鏡図である。

【図１２】 図１２は、ＬＮＣａＰ細胞の伝播電子顕微鏡図である。

【図１３】 図１３は、無胸腺マウスにおけるヒト乳房腫瘍異種移植片の生
長に対する tempo の作用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ // Ｃ０７Ｄ 211/94 Ｃ０７Ｄ 211/94 (72)発明者 サイメン・スイ アメリカ合衆国23229バージニア州リッチ モンド、ウィンザーデイル・ドライブ1807 番 Ｆターム(参考） 4C054 AA02 BB03 CC07 DD04 DD08 EE01 FF01 FF24 4C076 AA19 BB21 BB27 BB32 CC27 EE41 EE59 FF02 4C086 AA01 AA02 BC21 MA01 MA04 MA24 MA65 NA13 NA14 ZA01 ZA66 ZA75 ZA81 ZA96 ZB21 ZB26

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞死を誘発するための方法であって、tempo またはその機
   能的誘導体を該細胞死の誘発に十分な量で含有する組成物を、該細胞に投与する
   ことを含む方法。
2. 【請求項２】 該細胞が癌細胞または病的細胞である、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 該 tempo を癌に対する他の処置と組み合わせて投与する、
   請求項１の方法。
4. 【請求項４】 腫瘍を縮小するための医薬組成物であって、tempo またはそ
   の機能的誘導体を医薬としての有効量で医薬稀釈剤中に含む医薬組成物。
5. 【請求項５】 該腫瘍が前立腺、乳房、卵巣、頭頚部、腎、肺、骨、脳、膵
   臓、肝臓に関する、請求項４の医薬組成物。
6. 【請求項６】 カスパーゼ信号伝達カスケードを活性化するための方法であ
   って、tempo またはその機能的誘導体をカスパーゼ・カスケードの活性化に十分
   な量で含有する組成物を、該細胞に投与することを含む方法。
7. 【請求項７】 該カスパーゼがカスパーゼ−３である、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 細胞中のＳＡＰＫ信号伝達カスケードを活性化するための方
   法であって、tempo またはその機能的誘導体をＳＡＰＫカスケードの活性化に十
   分な量で含有する組成物を、該細胞に投与することを含む方法。
9. 【請求項９】 細胞中のアポトーシス信号伝達カスケードを活性化するため
   の方法であって、tempo またはその機能的誘導体を該カスケードの活性化に十分
   な量で含有する組成物を、該細胞に投与することを含む方法。
10. 【請求項１０】 該 tempo が担体に結合している、請求項１の方法。
11. 【請求項１１】 tempo を含む、細胞死を誘発するための組成物。
12. 【請求項１２】 該 tempo が担体に結合している、請求項１１の組成物。
13. 【請求項１３】 該担体がリガンド、生長因子、サイトカイン、リポソーム
    よりなる群から選ばれる、請求項１２の組成物。