JP2002518007A - アトピー性疾患および新生物細胞増殖を治療または予防するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、喘息、アトピー、または過好酸球増加症（hypereosinophilia）に存在する炎症性反応を阻害するためそして新生物細胞増殖を阻害するため、受容体を単独でまたは組み合わせてコードする特定の核酸配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、喘息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または癌を治療および／または予防するために使用される。本発明のオリゴヌクレオチドは、CCR3受容体、IL-4受容体およびIL-13受容体の共通サブユニット、またはIL-3受容体、IL-5受容体およびGM-CSF受容体の共通サブユニットをコードする核酸配列により特異的に対する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 （a）発明の属する分野 本発明は、喘息、過好酸球増加症、またはアトピー性疾患に存在する炎症性反
応を阻害し、そして新生物細胞増殖を阻害するため、特定の細胞受容体に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを単独であるいは組み合わせて使用することに
関する。

【０００２】 （b）先行技術の記載 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬品の新規分野である。一般的には、
アンチセンスとは、我々自身のDNA中に見出されるものと同一の構成を有し、一
本鎖DNAになぞらえる、小さな合成オリゴヌクレオチドを使用することをいう。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その標的とする遺伝子の一部の配列に接着
することができ、そして遺伝子発現を阻害することができるように、その標的と
する遺伝子の一部の鏡像配列として設計される。遺伝子発現は、アデノシンとチ
ミン、あるいはグアノシンとシトシンとが、水素結合を介して相互作用するワト
ソン-クリック塩基対合にしたがって、センスオリゴヌクレオチドが特定のメッ
センジャーRNA（mRNA）のセンス標的とハイブリダイゼーションすることにより
阻害する。これらの単純な塩基対合規則は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと
細胞RNAの相互作用を決定し、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチドの設
計が可能になる。この新規戦略の主要な利点は、副作用および毒性に対する可能
性が低く抑えられた作用の特異性である。この治療戦略は、潜在的には、1また
はいくつかの遺伝子の過剰発現が疾患の存在または残存を引き起こすと考えられ
ているいずれの疾患に対しても適用することが可能である。結果として、癌およ
びウィルス性疾患に対する治療剤として多数のアンチセンスオリゴヌクレオチド
の研究が行われてきた。

【０００３】 炎症性メディエーターに関する細胞表面上の受容体発現をアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが阻害できるかどうかについて評価するための研究は、ほとんど行
われていなかった。

【０００４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、インターロイキン（IL）-6受容
体の発現を阻害することができ、そしてその結果急性炎症メディエーターである
インターロイキン-6の細胞に対する効果を阻害することができる。アンチセンス
オリゴヌクレオチドを利用して喘息性炎症に関与する細胞上または癌性細胞上の
受容体を阻害することができるかどうかを評価した研究は、一つも行われていな
かった。

【０００５】 喘息は、最近25年間で罹患率が2倍になった、人口の5〜10％が罹患する疾患で
ある。この疾患は、気道のウィルス感染（細気管支炎）後の幼児、子供、そして
職業誘導性喘息において、特に注目されてきた。喘息の正確な原因は未だわかっ
ていない。しかしながら、ウィルスなどの剤が、喘息持ちの患者の気道に見られ
る異常な炎症の永続化、そして疾患の残存に関与していると考えられる。

【０００６】 この理由のため、喘息の第一に行われる治療として現在推奨されているのは、
コルチコステロイドや抗ロイコトリエンなどの強力な抗炎症性薬剤の投与である
。このような治療は多くの患者において有効であるが、患者の中にはコルチコス
テロイドに対して耐性のものがいる。この薬剤投与は、長期間の副作用を伴う強
力な免疫抑制性のものであってもよいが、アレルギーあるいは喘息の予防には効
果が示されなかった。

【０００７】 抗ロイコトリエンは、アレルギーおよび喘息に幾ばくか効果があるが、コルチ
コステロイドほど有効ではない。 いくつかの炎症性メディエーターが、喘息を伴う患者の気道における炎症の発
生および永続に機能を果たしている。いくつかのメディエーターは、好酸球の化
学走性を介して（ケモカイン類：CCR3と呼ばれる受容体を介するほとんどの喘息
性炎症に作用する、RANTES、エオタキシン1、2、MCP-3、4）あるいは内皮細胞の
活性化を介して（IL-4、IL-13）、気道中に炎症性細胞を引き寄せる。その他の
メディエーターは呼び水となり、気道中の炎症性細胞の生存の増大を引き起こす
（IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-4）。このように、これらのメディエーターは、好酸
球に特異的なケモカイン、またはヘルパーTリンパ球2型表現型のサイトカイン（
Th2：IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、およびGM-CSF）のいずれかからなる。

【０００８】 喘息の改善は、気道中のこれらの炎症性メディエーターが減少した場合に示さ
れた。 アレルギーは、非常に一般的なものであり、例えば人口の30％がアトピー性鼻
炎にかかっている。アレルギーは、異常なIgE産生とアレルゲンに対する炎症に
より特徴付けられる。IgEおよびアレルゲンの存在下では、マスト細胞などのエ
フェクター細胞が脱顆粒し炎症性メディエーターを放出し、喘息に見られるもの
と同一の炎症性細胞の補充を引き起こす。アトピー性鼻炎、鼻のポリポーシスお
よび慢性の副鼻腔炎（sinusitis）においては、喘息の際に見られると同様な過
剰な炎症性メディエーターが見出される。IL-4およびIL-13は、IgEの産生および
Th2表現型を有する細胞の誘導に必要である。

【０００９】 癌は、ヒトの死因の第二であり、不死化細胞の異常な増殖により特徴付けられ
る。これらの細胞の永続および増殖に関与する機構の一つは、受容体を介して機
能し、そして細胞増殖を導く成長因子の放出によるものである。これらの成長因
子の中でも、いくつかの腫瘍細胞に対してGM-CSFは重要な成長因子であることが
示されてきた。癌性細胞の増殖を成長因子に対する受容体をブロックすることに
より阻害することは、特定の癌の治療において重要でありうる。

【００１０】 喘息あるいはアトピーに存在する炎症性反応を阻害するため、そして新生物細
胞の増殖を阻害するため、Th2サイトカインあるいはTh2サイトカインに応答する
細胞を引き寄せるメディエーターのいずれかに対する受容体のいずれかに対する
少なくとも一つの特異的な共通受容体を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの使用を提供することが望ましい。

【００１１】 受容体をコードする核酸に対して指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを
提供し、これらの受容体を阻害することにより、これらのオリゴヌクレオチドを
喘息、アレルギー、一般的な炎症および癌の治療においておよび／または予防に
おいて利用することができるようにすることも非常に好ましい。

【００１２】 発明の概要 本発明の一つの目的は、喘息あるいはアトピーに見られる炎症性反応を阻害す
るため、および新生物細胞増殖を阻害するため、例えば、IL-3、IL-5およびGM-C
SFに対する共通βサブユニット、あるいはIL-4およびIL-13に対する少なくとも
一つの共通サブユニット、あるいは受容体CCR3などの、細胞受容体の少なくとも
一つの共通サブユニットを指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を提
供することである。

【００１３】 本発明の別の目的は、IL-4およびIL-13受容体の共通サブユニットをコードす
る核酸配列を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、これらの受容
体を阻害することにより、これらのオリゴヌクレオチドを喘息、アレルギー、一
般的炎症あるいは癌を治療および／または予防する際に利用することができるよ
うにすることである。

【００１４】 本発明の別の目的は、IL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に対する共通βサブユニ
ットをコードする核酸配列を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し
、これらの受容体を阻害することにより、これらのオリゴヌクレオチドを喘息、
アレルギー、一般的炎症あるいは癌の治療および予防に利用することができるよ
うにすることである。

【００１５】 本発明の別の目的は、ケモカインに対するCCR3受容体をコードする核酸配列を
指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、この受容体を阻害すること
により、これらのオリゴヌクレオチドを喘息、アレルギー、一般的炎症あるいは
癌の治療および予防に利用することができるようにすることである。

【００１６】 本発明の別の目的は、喘息、アレルギー、一般的炎症あるいは癌の治療および
／または予防においてより強力な効果を得るために、IL-4およびIL-13の共通サ
ブユニット、あるいはIL-3、IL-5およびGM-CSFの共通βサブユニット、あるいは
CCR3受容体をコードする核酸配列を指向する少なくとも2つのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを含む治療的に有効な組成物を提供することである。

【００１７】 発明の詳細な説明 細気管支炎は、喘息の発症に対して素因を有する幼児の気道のウィルス感染で
ある。この症状は、喘息、アトピーアレルギー性炎症の発症の前にヒトにおいて
得ることができるもっとも最初のものであるため、研究された。後述するように
、Th1対Th2サイトカイン比のアンバランス、すなわちTh2サイトカインの優勢、
が、喘息の発症の前に存在する。一態様において、本発明はこのアンバランスを
元に戻し、そしてその結果喘息およびアレルギーを予防しあるいは治療すること
を目的とする。

【００１８】 細気管支炎に罹った幼児血液から単離したリンパ球において得られた結果から
、初期の喘鳴の発生の前にTh1およびTh2サイトカイン産生の間にアンバランスが
存在することが示唆されそして確認された。実際、図1は、細気管支炎後に喘鳴
を起こす幼児からのリンパ球で、ハウスダスト-ダニ抗原に暴露した後、IL-4（T
h2サイトカイン）の産生が増大したことを示す。図1において、リンパ球は、細
気管支炎の5ヶ月後の幼児血液から単離し、そしてハウスダスト-ダニ抗原の存在
下で培養した。培養3日後の培養上清中のIL-4を測定した。最近90日間のうちに
少なくとも1度喘鳴を起こした被検体と、細気管支炎後の最初の5ヶ月間のすべて
で喘鳴を起こさなかった被検体との結果を示す。アスタリスクは、IL-4レベルが
535 pg/mlである被検体を示す。さらに、細気管支炎後の最初の5ヶ月間のほとん
どで喘鳴を起こした幼児において、インターフェロンγ（(IFN、Th1サイトカイ
ン）産生がより低く、そしてIL-4産生がより高いことがわかった。

【００１９】 Delphiのコンセンサスにより喘息なし、喘息可能性あるいは喘息蓋然性である
かどうかについて決定することにより、これらの幼児の症状を、2年間にわたり
モニターした。両親あるいは兄弟姉妹（sibling）における喫煙歴およびアトピ
ーあるいは喘息の存在を記録し、そして細気管支炎を加療中の32人の幼児、そし
て4.9ヶ月後に肺機能テストを行ったサブグループ（n＝19）において、IL-2に応
答する血液単核細胞IFNおよびIL-4産生を評価した。

【００２０】 図2Aおよび2Bにおいて、リンパ球は、細気管支炎に罹っている被検体から単離
し、そしてIL-2の存在下で3日間培養した。上清を回収し、そしてサイトカイン
をELISAで測定した。20日間以上喘鳴を起こした被検体（喘鳴の多い群、n＝9）
と喘鳴を起こしたのが20日未満の被検体（喘鳴の少ない群、n＝6）についての結
果を示す。

【００２１】 喘息可能性および喘息蓋然性を有する幼児は、喘息を有さない幼児と比較した
場合、細気管支炎を起こしているときおよびその4.9ヶ月後において、IFN産生が
より低くなっていた（p＜0.05、図3Aおよび3B）。

【００２２】 図3Aおよび3Bにおいて、細気管支炎を起こしているとき（3A、n＝32）あるい
は4.9ヶ月後（3B、n＝19）の単核細胞から、単球を部分的に枯渇し、そしてIL-2
と共に3日間培養した。上清を回収し、IFN産生についてELISAにより測定した。
細気管支炎の後2年後に喘息なし（なし）、喘息可能性（可能性） および喘息蓋
然性（蓋然性）として評価された患者についての結果を示す。“*”で同定した
結果については、可能性群および蓋然性群対喘息なしについてのKruskall-Walli
s試験およびMann-Whitney U試験を使用して、p＜0.05の確率が見いだされた。“
**”で同定した結果については、Kruskall-Wallis試験を使用してp＝0.08の確率
が見いだされたものである。“++”で同定した結果については、可能性群および
蓋然性群対喘息なしについてのMann-Whitney U試験を用いてp＜0.05の確率が見
いだされたものである。

【００２３】 IL-4産生は、グループごとに異ならなかった。細気管支炎に罹っているときの
IFN産生と、細気管支炎4.9ヶ月後の異常気道機能のマーカー（機能的残留能力（
FRC）のVmax、図4A）および気道反応性の増大（PC40ヒスタミン、図4B）との間
には、顕著な正の相関が見いだされた。

【００２４】 図4Aおよび4Bにおいて、サイトカイン産生を細気管支炎に罹っているときに測
定し、そして肺機能を4.9ヶ月後に測定した。肺機能はアメリカ胸部学会（Ameri
can Thoracic Society）により推奨される方法により評価した。機能的残留能力
の最大呼気流量（Vmax FRC）を、次の手順を用いる迅速胸腹部圧迫技術（RTC）
により評価した。事前に抱水クロラール100 mg/Kg体重（最大用量1000 mg）で事
前に鎮痛された患者を、腹部および胸部を覆い圧力リザーバーに結合させた膨ら
ませることができるジャケット中で頚部を若干伸ばした状態で仰向けに静置した
。30 cm H20の圧力から開始し、5 cm H20ずつ増大させて使用して、FRCでの呼気
流量の測定を、Vmax FRCが達成されるまで得た。流量は、Fleisch No. 1の肺タ
コグラフに連結しそして組み込んだ軟クッションマスクを用いて測定した。最高
値を基線Vmax FRCを示すために選択したこの圧力で、3つの追加の技術的な修正
操作を行った。すべてのこれに引き続くVmax FRC操作を、同じ手順を使用して行
った。

【００２５】 ヒスタミンに対する細気管支の反応性を、8リットル／分で駆動するHudsonの
上昇気流＃2ネブライザー（updraft #2 nebuliser）を使用して評価し、5分間隔
で1分間の間にヒスタミンの倍濃度である0.0625 mg/mlから始めて最大8.0 mg/ml
を投与した。Vmax FRCをそれぞれの噴霧の後に測定した。チャレンジ試験は、Vm
ax FRCが少なくともベースライン値から40％の減少に至ったとき、あるいはヒス
タミンの最大濃度が達成されたときに終了した。心拍数および酸素飽和を、Ohme
da BIOX 3740パルス酸素メーターを使用して、研究の間ずっと継続的にモニター
した。

【００２６】 IFN産生の欠損は、幼児における喘息の発生の主要な一因である。興味深いこ
とに、この欠損は、喘息を有する成人およびアトピーを発症する前の新生児にお
いて存在する。したがって、喘息あるいはアレルギーを発症する前でさえも存在
するTh1（IFN）サイトカインに対する、Th2（IL-4、IL-13、IL-5など）の比産生
において、アンバランスが存在し、Th1サイトカインに対するTh2サイトカインの
比は、これらの疾患の発症前および疾患にかかっている間に増加する。

【００２７】 Th2サイトカインの産生または効果における異常な増大に依存するアレルギー
、喘息または新生物細胞増殖の発症を治療または予防するため、したがってTh2
サイトカインの効果を減少させることが好ましいことがわかった。

【００２８】 したがって、後述する事実を提供する。肺中に呼吸される本発明の一態様に従
うアンチセンスオリゴヌクレオチドをその中に残存させ、そして少なくとも24時
間の間非分解性でありそして強力な状態で活性でありそして残存する細胞に入る
（図5および実施例1を参照）。

【００２９】 本発明の好ましい態様に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-4および
IL-13受容体の少なくとも一つの共通サブユニットを指向する。これらのアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、実施例IIに示すように、これらの受容体の機能的
サブユニットを阻害する際に有効である。

【００３０】 本発明の一態様に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-3、IL-5および
GM-CSF受容体の共通βサブユニットを指向する。これらのアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、これらの受容体を阻害し、そしてしたがって生存のためのこれら
の増殖因子に依存する癌性細胞または炎症性細胞の増殖および機能を阻害するた
めに有効である（実施例IIIを参照）。

【００３１】 本発明の別の態様に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ケモカインのCC
R3受容体を指向する。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの受
容体を阻害し、そしてしたがって炎症細胞および癌性細胞、あるいは感染性生物
の、この受容体に依存する流入、生存、および増殖または機能を阻害するために
有効である（実施例IV参照）。

【００３２】 本発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解することがで
きるが、これらは次の発明を説明するためにあり、その範囲を限定するためのも
のではない。

【００３３】

【実施例】

実施例I アンチセンス・オリゴヌクレオチドの効果的な投与 治療が効果的に行われるために、第1に投与された物質の、肺、およびそれが
効果を有する細胞への経路を見出し、第2に副作用を伴わずに無傷のままである
ことが必要である。肺に吸入されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドは肺およ
び気道に沈着し、その効果を有する細胞に進入し、少なくとも24時間の間、肺の
生理に影響を与えることなく未分解の状態を保持する。事前にFITCでタグをつけ
た本発明のアンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド、1マイク
ログラム（1μg）を噴霧によってラットの肺に投与した。ウレタンを用いてラッ
トに麻酔をした（1 g/kg、腹腔内）。加温パッドを使用して実験中、体温を一定
に保持し、直腸温度を電子体温計で連続的にモニタリングした。6 cmのPE-240ポ
リエチレン・カテーテルをblind経口挿管した後、自発的換気呼吸の際に仰臥体
位の動物で肺循環抵抗を測定した。小型のPlexiglas（登録商標）ボックス（容
量265 ml）内に気管内チューブの先端を配して流量を測定した。ピエゾ抵抗示差
圧変換器（piezoresistive differential pressure transducer）（Micro-Switc
h 163PCOID36, Honeywell, Scarborough Ont. Canada）に連結したフライシュno
.0呼吸気流計をボックスの反対側に接続して気流を測定した。肺内外圧差（Ptp
）の測定には、水を充填したカテーテルを下部第3食道に配したものを使用した
が、これを示差圧変換器（Transpac II, Abbott, Illinois）の一方の口に接続
し、他方の口はPlexiglasボックスに接続した。食道カテーテルは、ポリエチレ
ン・チューブ（PE-240, 長さ10 cm）並びにより小さい口径のチューブ（PE-160
）の先端（6 cm）からなる。

【００３４】 圧および流量シグナルを増幅し、8ポール・ベッセル・フィルター（eight-pol
e bessel filters）（9 モデル902LPF, Frequency Devices, Haverhill, MA）を
、カットオフ頻度を100 Hzにして通過させた。データをコンピューターに保存し
た。肺循環抵抗は1次多重回帰によって、市販のソフトウェア（RHT Infodat 社,
Montreal, PQ）で実施したような運動方程式に合わせて算出した。

【００３５】 器具を使用した後、1μgのタグをつけたホスホロチオエート・オリゴヌクレオ
チドを含有する食塩水の噴霧剤を5分間投与した。ボックスの片側の口に接続し
たハドソン噴霧器を使用して0.18 ml/分の排出量でこれを生成した。測定間に新
鮮な空気流でボックスを洗浄し、CO₂の蓄積を防止した。肺循環抵抗を攻撃感染
後、5、10、15、20、および30分後、そして続いて15分毎に計8時間測定した。肺
循環抵抗はこの時間にわたって変化しなかった。その後ラットを放血して殺し、
肺を回収してオリゴヌクレオチドがまだ存在するかどうかを測定した。肺をパラ
ホルムアルデヒドで固定し、アルカリホスファターゼでタグをつけた抗FITC抗体
を使用してオリゴヌクレオチドの位置を測定し、組織サンプルをファーストレッ
ドで染色し、細胞の核をヘキスト（Hoechst）で後染色した。図5Aにおいて留意
すべきことに、オリゴヌクレオチド（赤色）は全ての型の細胞に広く存在する。
オリゴヌクレオチドは細胞質まで浸透しており（5B）、炎症細胞にも観察された
（マクロファージ、5Cの中段）。

【００３６】 他の実験では、ラットをペントサルで麻酔し、アンチセンスの噴霧後に覚醒さ
せた。全身麻酔の24時間後、5 mlの食塩水を投与し、穏やかに吸引して気管支肺
胞洗浄（BAL）を行った。BALを400×gで10分間遠心分離し、上清を凍結し、分析
のために細胞をスライド上に遠心分離した。図6Aで留意すべきことに、マクロフ
ァージは主たる細胞型である。図6Bで、FITC標識したオリゴヌクレオチド（緑色
蛍光）が細胞質に存在する。FITC標識したオリゴヌクレオチドを洗浄液またはラ
ットの肺から、抗原の攻撃感染の24時間後に抽出した。図7で留意すべきことに
、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、その独自のコントロール（レーン3）
またはFITCでタグをつけた別のオリゴヌクレオチド（エオタキシン（eotaxin）
、レーン4）と比較した場合、投与の24時間後、BAL（レーン1）、肺（レーン2）
で無傷である。

【００３７】 図5から7に示されるように、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドは肺
に吸入され、細胞に浸透し、24時間以上の間、無傷のままである。 実施例II IL-4およびIL-13レセプターの共通サブユニットを阻害するアンチセンス・オ
リゴヌクレオチド インターロイキン-4はIgEの生成、喘息およびアトピーの発生および存続に関
与する。IL-4の作用に対して行われる療法は喘息、アレルギー、または腫瘍性細
胞の増殖の予防に効果的でありうるが（この媒介物に依存する）、最近明らかに
なったところによれば別のTh2サイトカイン（IL-13）はIL-4と同様の効果を有す
る。興味深いことに、IL-4およびIL-13は少なくとも2つの共通のサブユニットを
共有しており、これはメッセージのシグナル変換が起こるのに必要である。

【００３８】 実験を行って、IL-4およびIL-13レセプターの共通のサブユニットに対するア
ンチセンス・オリゴヌクレオチドがこれらのレセプターの発現を阻害するかどう
かを評価した。RAJI細胞はIL-4およびIL-13レセプターを高レベルに発現する。
これらの細胞を、10％熱不活性化ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン、およびl-グルタミンを補足したRPMI 1640中で5％CO₂中、37℃で培養した。1
2時間の間、細胞を培養液のみ、またはIL-4／IL-13の共通サブユニットに対する
センスもしくはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する培養液中で培養し
た。細胞を回収し、3回洗浄した後、抗ヒトIL-4レセプター抗体（R and D syste
ms、カタログ番号MAB230）で染色したが、これはIL-4またはIL-13によって誘引
されるヒト細胞表面レセプター介在型生理活性を阻害することが明らかになって
いる。図8において留意すべきことに、アンチセンス・オリゴヌクレオチドOD1：
5'-agaccttcat gttcccagag-3'（SEQ ID NO：1）、OD2：5'-gttcccagag cttgccac
ct-3'（SEQ ID NO：2）、またはOD3：5'-cctgcaagac cttcatgtt-3'（SEQ ID NO
：3）は、フローサイトメトリーで評価すると、生理活性型のIL-4レセプターの
発現を阻害する。1列目は、未染色（左）または非特異的モノクローナル抗体へ
の暴露（右）を行った細胞において、蛍光が存在しないことを示している。2列
目は、RAJI細胞がIL-4レセプターを発現し（92％）、蛍光強度が非常に高い（レ
セプターが多い）ことを示している。右側では、RAJI細胞を10μMolのアンチセ
ンス・オリゴヌクレオチドOD1と共に12時間インキュベートしたが、わずか66％
の細胞しかこのレセプターを発現せず、蛍光強度は非常に低い（各細胞でわずか
のレセプター）ことを示している。3列目は、アンチセンス・オリゴヌクレオチ
ドOD2（52％）およびOD3（58％）との12時間のインキュベート後、同様の結果を
示している。

【００３９】 更なる実験を行って、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（OD3、OD2、および
OD1）がRAJI細胞でIL-4レセプター発現を阻害するかどうかを免疫沈降およびウ
ェスタンブロットによって評価した。図9で留意すべきことに、3000万個のRAJI
細胞を前述のように、以下のいずれかを含有する完全培地中で12時間培養した：
20μMのセンス・オリゴヌクレオチドOD4（左から1番目のレーン）、10μMのOD4
（左から2番目のレーン）、10μMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD3（左
から3番目のレーン）、10μMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD2（左から4
番目のレーン）、10μMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD1（左から5番目
のレーン）、培養液のみ（左から6番目のレーンおよび第2のゲルの右端のレーン
）、20μMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD2（右側のゲルの左から1番目
のレーン）。総タンパク質を抽出し、2μgのIL-4と共に一晩インキュベートした
。10μg/mlの抗IL-4抗体（R and D systems）を50μlのプロテインAおよびプロ
テインG-セファロース^TMに結合させたものをその後20℃で2時間添加した。セフ
ァロース^TMビーズを10回洗浄し、アガロースゲルを使用して残存するタンパク質
を分離した。その後、残存タンパク質をImmobilon-P-millipore^TM膜上に転写し
、ウサギ・ポリクローナル抗IL-4-R-アルファ抗体（Santa Cruz biotechnology
社, カタログ番号sc-684）で染色してウェスタンを行った。結果が示すところに
よれば、センス・オリゴヌクレオチドはIL-4レセプター発現に影響せず、10μM
の有効な本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドはIL-4レセプター発現を阻
害し、そして20μMのアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD2はほとんど完全に有
効である。

【００４０】 IL-4およびIL-13レセプターに共通のサブユニットが少なくとも2つ存在するの
で、更なる実験を実施して、IL-13レセプターのアルファ'鎖に対するアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドがRAJI細胞においてIL-4／13レセプター発現も阻害する
かどうかを測定した。図10で留意すべきことに、アンチセンス・オリゴヌクレオ
チドA1.3：5'-CGCCCACAGC CCGCAGAGCC-3'（SEQ ID NO：4）はRAJI細胞でアルフ
ァ'レセプター発現を阻害した。RAJI細胞をアンチセンス（10または20μM）また
はセンス・オリゴヌクレオチド（10μM）を含有する培養液中で3時間、その後、
完全培地中で9時間インキュベートした。この後、mRNAを抽出した。IL-13Rアル
ファ'鎖、そしてコントロールのIL-2Rガンマ鎖およびG3PDH転写物を半定量性RT-
PCRで評価した。結果を左から右へ、以下のように示す：未処理の抹消血単核細
胞（PBMNC、レーン2）、完全培地中のRAJI細胞（レーン3、4）、10μMのA1.3を
含有するRAJI細胞（レーン5）、10μMのA1.3およびそのセンス相対物を含有する
RAJI細胞（S1.3、レーン6）、20μMのA1.3を含有するRAJI細胞（レーン7）、お
よびcDNA未含有（レーン8）。in vitroでも有効な他のアンチセンス・オリゴヌ
クレオチドの配列には以下がある：A1.1：5'-CTCCATGCAG CCTCTCGCCT-3'（SEQ I
D NO：5）；A1.4：5'-CCGCCGGCGC AGAGCAGCAG-3'（SEQ ID NO：6）；およびA1.5
：5'-CGCCCCCGCC CCCGCCCCCG-3'（SEQ ID NO：7）。

【００４１】 用量応答試験をアンチセンス・オリゴヌクレオチドOD2を使用して実施し、RAJ
I細胞におけるIL-4／IL-13レセプター発現を阻害するのに最適な濃度を決定した
。図10は免疫染色実験を示すが、ここで留意すべきことに、OD2も免疫染色試験
で評価したところレセプター発現を阻害した。RAJI細胞を以下を含有する完全培
地中で12時間培養した：5μM OD2（上段左）、10μM OD2（中段左）、20μM OD2
（下段左）、オリゴヌクレオチド未含有（上段右）、10μMのOD2と同じ配列に対
するセンス・オリゴヌクレオチド（中段右）、または30μMのOD2と同じ配列に対
するセンス・オリゴヌクレオチド（下段右）。スライドをメタノール-アセトン
中、-20℃で10分間固定した。ユニバーサル・ブロッキング溶液（DAKO）を含有
するトリス-バッファーで15分間処理した後、スライドを抗IL-4レセプター血清
（Santa Cruz biotechnology社, カタログ番号sc-684）と共に最終希釈1/200で
一晩4℃でインキュベートし、その後5μg/mlのアルカリホスファターゼ標識した
ヤギ抗ウサギIgGと共にインキュベートした。細胞の核をヘマトキシリンで1分間
染色した。これらの実験条件下で20μMのOD2はほとんど完全にIL-4レセプター発
現を阻害した。

【００４２】 IgE抗体の生成はアレルギー、喘息、およびある種の腫瘍性症状の重要な要素
である。実験を実施してIL-4およびIL-13レセプターの共通のサブユニットであ
るアルファ（OD2）およびアルファ'（A1.3）に対するアンチセンス・ホスホロチ
オエート・オリゴヌクレオチドの、IgE生成に対する影響を評価した。ヒトBリン
パ球を種々の指標（indication）から外科的に除去した口蓋扁桃から単離した。
単核細胞をFicoll-Hypaque^TM（Pharmacia）密度遠心分離で精製した。E-ロゼッ
トにより、ノイラミニダーゼ処理した（Calbiochem. La Jolla, CA）ヒツジ赤血
球を用いてBリンパ球をT細胞から分離した。単球を2時間、プラスチック製ペト
リ皿に付着させて除去した。Bリンパ球の純度は慣例的に98％であった。B細胞（
2×10⁵/200μl/ウェル）を、10％FCS、10 mg/ml L-グルタミン、50 U/ml ペニシ
リン、および50 ng/ml ストレプトマイシンを補足したRPMI 1640から成る完全培
地中で培養した。200 U/mlのIL-4（R&D Systems）および0.1μg/mlの抗CD40 mAb
（Pharmingen）を併用して、アンチセンスまたはセンス・オリゴヌクレオチド（
10μM）の存在下または非存在下で14日間、細胞を刺激した。上清を回収し、IgE
をELISA（Kallestad, Sanofi Diagnostics, Chaska, Minn.）で、製造者の説明
書に従って測定した。表1で留意すべきことに、A1.3およびOD2アンチセンス・ホ
スホロチオエート・オリゴヌクレオチドはいずれも、それらのセンス相対物に比
較した場合、ヒトIgEの生成を阻害する。

【００４３】 表1 抗CD40＋IL-4刺激したヒトB細胞におけるアンチセンス・オリゴヌクレオチド
によるIgE生成の阻害

【００４４】

【表１】

【００４５】 前述のように、Th-2サイトカインであるインターロイキン-4とTh-1サイトカイ
ンであるIFN-γの生成の間の不均衡についてはアレルギーおよび喘息で既に記載
した。実験を実施してIL-4およびIL-13レセプターの共通のサブユニットである
アルファ（OD2）およびアルファ'（A1.3）に対するアンチセンス・ホスホロチオ
エート・オリゴヌクレオチドの、IL-4およびIFN-γ生成に対する影響を評価した
。ヒト単核細胞懸濁液を臍帯血（UCB）から得るために、Ficoll-Hypaque^TMグラ
ジエントで、400 g、30分間遠心分離した。単核球を、7.5％ウシ胎仔血清（FCS
）を補足したRPMI 1640中、5％CO₂インキュベーター内で37℃で2時間、プラスチ
ック製フラスコに付着させて除去した。PHA（1μg/ml）での臍帯血T細胞の刺激
を、TH1極性化条件［ヒトrIL-12（2 ng/ml；R&D Systems）プラスIL-4に対する
中和mAb（200 ng/ml；R&D Systems）］またはTH2極性化条件［ヒト組み換えIL-4
（200 U/ml）プラス ヒトIL-12に対する中和mAb（2μg/ml；R&D Systems）］下
で、10μMのアンチセンスまたはセンス・オリゴヌクレオチドの存在下または非
存在下で行った。バッチのオリゴヌクレオチドを、サイトカインの添加の3時間
前に培養液に添加した。IL-2を3日目に添加した。1週間後および2週間後、同じ
極性化条件下でオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下で培養液を再び刺激
し、10日後の培養液を分析した。細胞を回収し、3回洗浄し、PMA（50 ng/ml）プ
ラスイオノマイシン（500 ng/ml）を用いて37℃で48時間、再刺激し、上清中のI
L-4およびIFN-γの生成をELISA（R&D Systems）で、製造者の説明書に従って分
析した。図12において留意すべきことに、IL-4／13レセプターの共通のサブユニ
ットに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドはIL-4の生成を阻害し、IFN-γ
の生成を増加させた。左から右に、精製したUBCを以下の条件で培養した：Th-2
刺激条件；Th-2刺激条件でOD2に対するセンス・オリゴヌクレオチドの存在下；T
h-2刺激条件でOD2に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドの存在下；そして
Th-2刺激条件でアンチセンス・オリゴヌクレオチドA1.3の存在下。

【００４６】 図8から12に示すように、IL-4／IL-13レセプターの共通サブユニット、アルフ
ァおよびアルファ'に対する本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドはIL-4
／13レセプター発現、その機能性要素、IgE生成、および前駆体からTh-2型細胞
へのスイッチングの阻害に有効である。

【００４７】 実施例III IL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に共通のベータサブユニットを阻害するアンチ センスオリゴヌクレオチド インターロイキン-3、5およびGM-CSFは、好酸球増殖および生存に関与する重
要なサイトカインである。これらのサイトカインは、喘息およびアトピー性疾患
で増加し、そしてまた特定の腫瘍性疾患の不定性増殖にも関与する。興味深いこ
とに、IL-3、IL-5およびGM-CSFは、情報伝達に関与する共通のベータサブユニッ
トを共有する。

【００４８】 IL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に共通のベータサブユニットに対して向けられ
る、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本受容体の発現および機能を
阻害することが可能であるかどうか評価する実験を行った。TF-1およびU937細胞
は高レベルのGM-CSF受容体を発現する。さらに、TF-1細胞は、生存に関し、GM-C
SFに依存している。これらの細胞を、10％の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリ
ン、ストレプトマイシンおよびl-グルタミンを補ったRPMI 1640中で、37℃で5％
CO₂中で培養した（TF-1細胞には、GM-CSFを補った）。これらを12時間、培地単
独で、またはIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に共通のベータサブユニットに対す
るセンス（107S：5'-ACCATCCCGC TGCAGACCC-3'（SEQ ID NO:8））またはアンチ
センス（107A：5'-GGGTCTGCAG CGGGATGGT-3'（SEQ ID NO:9））オリゴヌクレオ
チドを含む培地で培養した。細胞を回収し、そして3回洗浄した。その後RNAを回
収し、そして受容体のベータ鎖の存在を、半定量的RT-PCRにより評価した。図13
において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、TF1細胞（13A）およびU937細胞
（13B）において、共通のベータ受容体のmRNA発現を阻害したことに注目すべき
である。図13Aにおいて、左から右に読むと、コントロール、センス、およびア
ンチセンス処理細胞におけるベータアクチンのmRNA発現が示され（レーン2、3、
4）；コントロール、センス、およびアンチセンス処理細胞における共通の受容
体のmRNA発現が示される（レーン5、6、7）。レーン7でバンドが存在しないこと
は、TF1細胞において、共通のベータサブユニットのmRNA発現を阻害するのに、
アンチセンスオリゴヌクレオチドが有効であることを示す。図13Bにおいて、右
から左に読むと、ミスマッチ、アンチセンス、センスおよびコントロール（未処
理）細胞における共通のベータサブユニットのmRNA発現が示され（レーン1、2、
3、4）；ミスマッチ、アンチセンス、センスおよびコントロール（未処理）細胞
におけるG3PDHのmRNA発現が示される（レーン6、7、8、9）。レーン2でバンドが
存在しないことは、U937細胞において、共通のベータサブユニットのmRNA発現を
阻害するのに、アンチセンスオリゴヌクレオチドが有効であることを示す。

【００４９】 さらなる実験を行い、TF1細胞において、アンチセンスオリゴヌクレオチド（1
07A）がIL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に共通のベータサブユニットを阻害した
かどうか、免疫沈降およびウェスタンブロッティングにより評価した。図14にお
いて、3000万のTF1細胞を、10μMのセンスオリゴヌクレオチド107Sまたはアンチ
センスオリゴヌクレオチド107A（一番右のレーン）のいずれかを含む完全培地中
で、先に記載されるように12時間培養した。GM-CSFベータ鎖受容体に対するモノ
クローナル抗体を用いた免疫沈降により、タンパク質を抽出した。その後、ポリ
アクリルアミドゲル上の電気泳動の後、抽出物をImmobilon-P-millipore膜上に
移し、そしてその後、ウサギポリクローナル抗GM-CSF-R-ベータ抗体により、受
容体のGM-CSFベータ鎖を明らかにした。結果は、同じ濃度（10μM）で、センス
オリゴヌクレオチドは共通のベータ鎖発現に影響を及ぼさないのに対し、本発明
のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、IL-3、IL-5およびGM-CSF受容体に共通の
ベータサブユニットを阻害することを示す。

【００５０】 アンチセンスオリゴヌクレオチド107Aを用い、用量反応実験を行い、TF1細胞
増殖を遮断するであろう最適濃度を決定した。図15に見られるように、本発明の
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用い、細胞増殖を阻害することが可能である
。TF1細胞を、血清不含培地中で増加する濃度のオリゴヌクレオチドの存在下で
培養し、そしてその後、ウシ胎児血清およびGM-CSFを、それぞれ最終濃度10％お
よび1 ng/mlになるよう添加した。培養をさらに2日間行い、そしてその後、4時
間に渡り、細胞生存および増殖の指標として、MTT色素を有色ホルマザン産物に
還元する能力に関し、細胞をアッセイした。結果は未処理細胞により得られたMT
T由来ホルマザンの吸光度のパーセンテージとして表される。ドット＝平均±標
準偏差。実験は三つ組で行った。吸光度は、570-595 nmで読み取った。

【００５１】 図16において、アンチセンスオリゴヌクレオチド107Aは、センスプローブまた
はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まないコントロールと比較した際、細胞
増殖を有意に阻害することが可能であることに注目すべきである。TF1細胞を、
アンチセンスオリゴヌクレオチド（一番右）、センスオリゴヌクレオチド（右か
ら二番目）、コントロール培地（GM-CSFを含む、右から三番目）またはGM-CSFを
含まない培地（右から4番目）の存在下で2日間培養し、そしてその後、上述のよ
うなMTT色素を還元する能力に関し、細胞をアッセイした。

【００５２】 本発明に一致する他のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、20μモルの濃度で
有効であることが示されてきている。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、例えば、限定ではなく、オリゴヌクレオチド106：5'-ggtctgcagc gggatggtt
-3'（SEQ ID NO:10）；108：5'-agggtctgca gcgggatgg-3'（SEQ ID NO:11）；11
0：5'-gcagggtctg cagcgggat-3'（SEQ ID NO:12）；101：5'-gcagcgggat ggtttc
ttc-3'（SEQ ID NO:13）；100：5'-cagcgggatg gtttcttct-3'（SEQ ID NO:14）
；および105：5'-gtctgcagcg ggatggttt-3'（SEQ ID NO:15）である。

【００５３】 GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータ鎖に対して向けられるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが、in vivoで、好酸球の流入を阻害することが可能で
あるか決定する実験を行った。図17において、アンチセンスオリゴヌクレオチド
RB141A：5'-TGGCACTTTA GGTGGCTG-3'（SEQ ID NO:16）が、in vitroで、GM-CSF
、IL-3およびIL-5受容体に共通のラットベータ鎖のmRNA発現を阻害するのに有効
であることに注目すべきである。左にあるのは、コントロール、RB141Aおよびセ
ンス処理SS141骨髄細胞におけるG3PDH遺伝子に関する半定量的RT-PCRの結果であ
る。右にあるのは、右から左に、GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータ
サブユニットの半定量的RT-PCRの結果であり；レーン2はRB141Aを用いた遺伝子
発現の阻害を示す（AS 141）。ブラウンノルウェイ（Brown Norway）ラットをペ
ントタール（65 mg/kg、i.p.）で麻酔した。これらをその後、屠殺し、下肢を回
収し、そして大腿を単離した。骨を70％エタノール中で10分間インキュベーショ
ンした。骨の両端を切断し、そして15 mlのRPMI 1640の注入および吸引により、
骨髄を得た。細胞を2回洗浄し、そして培地単独で、10μM RB141Aまたは10μMの
センスオリゴヌクレオチドRB141S：5'-CAGCCACCTA AAGTGCCA-3'（SEQ ID NO:17
）を含む、RPMI 1640中で、37℃で5％CO₂中で6時間、インキュベーションした。

【００５４】 さらなる実験において、200 mgの水酸化アルミニウムと混合した1.25 mgの卵
白アルブミンを皮下注射することにより、ブラウンノルウェイラットを卵白アル
ブミンに対し能動的に感作した。第14日目に、ラットに500μlの0.9％NaCl中の5
00μgのRB141Aを腹腔内投与した。翌日、65 mg/kgペントタールでの全身麻酔お
よび気管内挿管後、50μlの0.9％NaCl中の200μgのアンチセンスを気管内または
腹腔内いずれかに投与する。20分後、50μl中の200μgの卵白アルブミンを気管
内または腹腔内いずれかに注入することにより、卵白アルブミン攻撃を行う。8
時間後、全身麻酔後、ラットに再び挿管し、そして5回の5 ml点滴注入からなる
肺洗浄または8 mlでの腹腔洗浄を行う。細胞を洗浄し、計数し、そしてCytospin
III中でスライド上に遠心分離する。差別的細胞計数を行う。図Aにおいて、GM-
CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータ鎖に対して向けられるアンチセンス
オリゴヌクレオチドRB141Aは、肺または腹腔への好酸球流入をおよそ50％阻害す
ることに注目すべきである。図18Aに、RB141の効果を示す腹腔液から得られた結
果を示す（AS141）。図18Bに、RB141の効果を示す肺BALからの結果を示す（AS14
1）。

【００５５】 これらの結果は、GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータ鎖に対して向
けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、異なるアレルギー性疾患で起こる
、好酸球流入および／または生存の阻止に重要であることを示す。

【００５６】 図15ないし18から示すことが可能であるように、IL-3、IL-5およびGM-CSF受容
体に共通のベータサブユニットに対して向けられる、本発明のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、受容体発現、細胞増殖、好酸球補充および生存を阻害するの
に有効である。

【００５７】 実施例IV ケモカインのCCR3受容体を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド CCR3受容体に関し考慮すべき事柄が2つある：1）該受容体はTh2上に発現され
、そしてTh1リンパ球上に発現されない、2）CCR3受容体は、アレルギー性または
喘息性炎症の部位への好酸球の補充に重要である。ケモカインであるエオタキシ
ン（Eotaxin）、MCP-4およびRANTESは、それらのほとんどの影響を、CCR3受容体
を通じ伝える。これらのケモカインは、アレルギーおよび喘息患者の肺に存在し
、そして該患者の肺で増加する（Lamkhiouedら、Journal of Immunology, 159：
4593-4601, 1997）。図19は、エオタキシンがアレルギーおよび喘息患者の肺の
上皮細胞および炎症細胞で増加していることを示す。喘息患者および正常コント
ロールの、気道（19A、19B、19E）およびBAL細胞における（19C、19D、19Fない
し19H）、エオタキシンmRNA（19Aないし19D）およびタンパク質（19Eないし19H
）の発現および細胞分布を評価した。エオタキシンmRNA発現は、正常（19B）気
道に比べ、喘息（19A）のもので増加している。目立った染色は、アレルギー喘
息気道の上皮細胞（Ep）で、そして多くの炎症細胞（矢じり）で観察される。図
19Cおよび19Dは、それぞれ、喘息患者および正常コントロールから得られたBAL
細胞のサイトスピン調製のin situハイブリダイゼーションの代表的な例である
。生検細胞試料および生検切片に、エオタキシンmRNAに相補的なFITC標識アンチ
センスリボプローブをハイブリダイズさせた。BAL中で陽性にハイブリダイズし
ている細胞の大部分は、マクロファージと一致する形態を示した（矢じり）。図
19Eは、喘息患者の各生検切片中のエオタキシンの免疫組織化学検出を示す。エ
オタキシン免疫反応性は、ファーストレッド（fast red）色原体で視覚化し、そ
して上皮および炎症細胞に位置決定された（矢じり）。図19Fは、二重免疫組織
化学により、喘息患者由来のBAL細胞におけるCD-68陽性マクロファージ（茶色）
とエオタキシン免疫反応性（赤）が共に局在していることを示す。二重陽性細胞
の例は、矢じりで示されている。図19Gおよび19Hは、それぞれ、喘息患者および
正常コントロールから得られたBAL細胞のエオタキシン免疫蛍光染色を示す。好
酸球中のエオタキシン免疫染色に注目されたい（矢じり）。

【００５８】 喘息のアレルギー患者の肺に存在する異なるケモカインの、精製好酸球の走化
性に対する寄与もまた、評価した。したがって、喘息患者で肺気管支肺胞洗浄を
行った。centricon^TMカラムを用い、上清を10倍に濃縮した。異なるケモカイン
に対して向けられる抗体の、BAL液に反応した好酸球移動に対する阻害性効果を
表2に評価する。走化性アッセイを行う前に、BAL液を、緩衝液、コントロールAb
、ポリクローナルウサギ抗エオタキシン、抗MCP-4、抗RANTES Abまたはこれらの
Abの混合物と、1時間プレインキュベーションした。各アッセイにおいて、BAL中
に用いたエオタキシンの濃度が示されている。実験は48ウェル微量走化性チャン
バー（NeuroProbe）を用い、行った。ポリカーボネートフィルター（5μm孔サイ
ズ）上でヒト好酸球の移動を行った。好酸球（2×10⁶細胞／ml）をRPMI培地に再
懸濁し、チャンバーに装填し、37℃、5％CO₂で60分間インキュベーションし、そ
してフィルターを固定し、そしてRALキット（Labonord、フランス）で染色した
。5つの選択した高倍率視野（倍率×400）で、顕微鏡により好酸球を計数した。
異なる走化性アッセイからの結果を比較するため、走化性指数（CI）を以下のよ
うに計算した：CI＝（試験試料の計数）／（コントロール培地の計数）。該式に
おいて、試験試料の計数は、BALまたはエオタキシンに向かって移動した細胞の
数を表し、コントロール計数は、RPMIに反応した細胞の移動の平均である。3人
の個人から得た好酸球に対して行った実験に関し、移動阻害パーセンテージおよ
び信頼区間を示す。阻害パーセンテージは、式：100-（（Ab処理液中の移動細胞
数の平均）／（未処理液中の移動細胞数の平均））×100により計算した。

【００５９】 表2 気管支肺胞洗浄（BAL）液に反応した好酸球移動に対する抗体（Ab）の阻害性効
果

【００６０】

【表２】

【００６１】^a BAL試料単独と比較し、信頼区間に関しp＜0.05；および^b BAL試料単独と比較し、信頼区間に関しp＜0.01 NRS：正常ウサギ血清。

【００６２】 表2において、大部分CCR3受容体を通じ作用する3つのケモカインは、喘息BAL
中の好酸球の走化作用のおよそ50％の原因である。 これらの結果は、（CCR3受容体を通じて作用する）ケモカインは、アレルギー
性喘息で増加しそして重要であり、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用
いたCCR3受容体の阻害は、したがって、アレルギーおよび喘息の治療において重
要であることを示す。

【００６３】 CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本受容体
のmRNA発現を阻害することが可能であるかどうか決定する実験を行った。図20に
おいて、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチド（CCR3
AS 86（RC86A）：5'-CTGGGCCATC AGTGCTCTG-3'、SEQ ID NO:18）が、好酸球経路
へと分化しているHL60細胞において、CCR3のmRNAの発現を阻害するのに有効であ
ることに注目すべきである。mRNA調製を標準化するのに用いたハウスキーピング
遺伝子はG3PDH（451 bpのバンド、右のゲル）であった。左のゲルは、センスオ
リゴヌクレオチド（CCR3SS 86：5'-CAGAGCACTG ATGGCCCAG-3'；SEQ ID NO:19）
に比べ、RC86AがCCR3のmRNAを阻害することを示す（中央のレーン）。HL60細胞
（クローン15）は、10％の熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマ
イシン、l-グルタミンおよび0.5モルの酢酸を補ったRPMI 1640中で、37℃で5％C
O₂中で10日間培養することにより、好酸球様細胞に分化させ、培地単独で、10μ
M CCCR3AS1または10μM CCR3SSと6時間培養した。トライゾールを用いmRNAを単
離し、そしてmRNAの量をG3PDHで標準化した後、CCR3のmRNAの発現を、培地中で
（コントロール）、CCR3AS 86（中央のレーン）とまたはCCR3SS 86（右のレーン
）と培養した細胞から得たmRNAで評価した。

【００６４】 CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、CCR3受容
体でトランスフェクションされているGhost細胞上の本受容体のmRNA発現を阻害
することが可能であるか評価する実験もまた、行った。これらの細胞をNIHから
得て、そしてMLV BABE-puroベクターを用いたレトロウイルス感染を介し、CCR3
遺伝子を導入した。図21、右のゲルにおいて、CCR3受容体に対して向けられるア
ンチセンスオリゴヌクレオチド（RC86A）が、10μモルのアンチセンスとインキ
ュベーションされていないコントロールに比べ、CCR3受容体のmRNA発現を阻害す
るのに有効であることに注目すべきである。左のゲルは、ハウスキーピング遺伝
子G3PDHに関し得られた結果を示す。

【００６５】 CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本受容体
の機能を阻害することが可能かどうか評価するさらなる実験を行った。図22にお
いて、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチド（RC269A
S：5'-CCCTGACATA GTGGATC-3'、SEQ ID NO:20）およびRC86Aが、好酸球における
カルシウム流動（走化作用の徴候）を阻害するのに有効であることに注目された
い。Ficoll Hypaque遠心分離、赤血球溶解に続き、MACS細胞選別装置上の抗CD16
被覆磁気ビーズを用いた陰性選択（好中球を除くため）により、喘息患者から得
た血液から、ヒト好酸球を精製した。好酸球をその後、洗浄し、そして10％の熱
不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびl-グルタミンを
補ったRPMI 1640中の組換えヒトIL-5（1.6 ng/ml）と、37℃で5％CO₂中で一晩イ
ンキュベーションした。細胞を洗浄し、そしてその後、10μMのRC269ASまたは10
μMのRC269S 5'-GATCCACTAT GTCAGGG-3'（SEQ ID NO:21）の存在下または非存在
下で、4時間、RPMI 1640中でインキュベーションし、洗浄し、そしてRPMI 1640
中に2.5×10⁶細胞／mlで再懸濁し、そして3μMの濃度のFura-2Mと45分間インキ
ュベーションした。細胞をPBSで2回洗浄し、そしてカルシウム緩衝液（PBS、1 m
M HEPES、1 mM Ca＋＋）に再懸濁した。エオタキシン刺激直後のカルシウム流出
を、Perkin Elmer L50B分光光度計で測定した（励起340 nm、スリット5 nmおよ
び発光492 nm、スリット5 nm）。

【００６６】 その後、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、
in vivoで、好酸球の流入を阻害することが可能であるか決定する実験を行った
。図23において、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドRCC3A4 5
'-ACTCATATTC ATAGGGTG-3'（SEQ ID NO:22）が、in vitroで、ラットCCR3のmRNA
発現を阻害するのに有効であることに注目されたい。左に、アンチセンスを含ま
ないコントロール培地、CCR3受容体発現に対し有効でないことが証明されている
アンチセンスであるCCR3A2（5'-GCCAACACAG CATGAACG-3'、SEQ ID NO:23）を含
む培地、およびRCC3A4（10μモル）を含む培地で処理した骨髄細胞における、G3
PDH遺伝子に関する半定量的RT-PCRの結果を示す。右には、右から左へ、ラットC
CR3受容体の半定量的RT-PCRの結果を示し；レーン1はRCC3A4を用いた遺伝子発現
の阻害を示す。ブラウンノルウェイラットをペントタール（65 mg/kg、i.p.）で
麻酔した。これらをその後、屠殺し、下肢を回収し、そして大腿を単離した。骨
を70％エタノール中で10分間インキュベーションした。骨の両端を切断し、そし
て15 mlのRPMI 1640の注入および吸引により、骨髄を得た。細胞を2回洗浄し、
そして培地単独で、10μMのRC3A2または10μMのRCC3A4を含む培地で、RPMI 1640
中で、37℃で5％CO₂中で6時間、インキュベーションした。

【００６７】 さらなる実験は、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが、in vivoで、腹腔へのそして肺への好酸球流入を阻害するのに有効であ
ることを示す。200 mgの水酸化アルミニウムと混合した1.25 mgの卵白アルブミ
ンを皮下注射することにより、ブラウンノルウェイラットを卵白アルブミンに対
し能動的に感作した。第14日目に、ラットに500μlの0.9％NaCl中の500μgのRCC
3A4または0.9％NaClを腹腔内投与した。翌日、1.25 mgの卵白アルブミンを腹腔
内投与することにより、ラットを攻撃する。8時間後、ラットを65 mg/kgのペン
トタールで麻酔し、腹腔を開き、そして8 mlのRPMI 1640で洗浄する。洗浄溶液
を回収し、細胞を洗浄し、計数し、そしてCytospin III中でスライド上に遠心分
離する。差別的細胞計数を行う。図18Aにおいて、CCR3受容体に対して向けられ
るアンチセンスオリゴヌクレオチドRCC3A4は、腹腔への好酸球流入をおよそ60％
阻害することに注目すべきである。

【００６８】 さらなる実験において、200 mgの水酸化アルミニウムと混合した1.25 mgの卵
白アルブミンを皮下注射することにより、ブラウンノルウェイラットを卵白アル
ブミンに対し能動的に感作した。第14日目に、ラットに500μlの0.9％NaCl中の5
00μgのRCC3A4または0.9％NaClを腹腔内投与した。翌日、65 mg/kgペントタール
での全身麻酔および気管内挿管後、50μlの0.9％NaCl中の200μgのアンチセンス
を気管内投与する。20分後、50μl中の200μgの卵白アルブミンを気管内注入す
ることにより、卵白アルブミン攻撃を行う。8時間後、全身麻酔後、ラットに再
び挿管し、そして5回の5 ml点滴注入からなる肺洗浄を行う。細胞を洗浄し、計
数し、そしてCytospin III中でスライド上に遠心分離する。差別的細胞計数を行
う。図18Bにおいて、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレ
オチドRCC3A4は、肺への好酸球流入をおよそ66％阻害することに注目すべきであ
る。

【００６９】 これらの結果は、CCR3受容体に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが、異なるアレルギー性疾患で起こる好酸球流入およびしたがってそれらの
影響の阻止において、重要であることを示す。

【００７０】 さらに、サイトカインIL-5（IL-5受容体を通じて作用する）でのプライミング
は、細胞が刺激された際、細胞の走化作用を増加させるかまたはケモカインを放
出させることが可能である。

【００７１】 図24は、IL-5での好酸球のプライミングが、好酸球をエオタキシンで刺激した
際の該細胞の走化作用を増加させることを示す。IL-5（IL-5受容体を通じて作用
する）と好酸球をプレインキュベーションすると、試験したすべての用量で、エ
オタキシンにより誘導される走化作用が増加する。走化作用のピークは、プライ
ミングしたものでより高く、これはエオタキシンの効果に対するIL-5の相乗効果
を示唆する。用量反応曲線は、エオタキシンに対する精製ヒト好酸球の走化活性
（黒い四角）およびIL-5とのプレインキュベーション後のポリカーボネートフィ
ルターを通じた移動（閉じた円）を示す。Ficoll-Paque（Pharmacia）密度遠心
分離により、末梢血から単核細胞および顆粒球を精製した。デキストラン沈降に
より顆粒球を得た。磁気細胞選別系（Miltenyi Biotec）を用い、抗CD16および
抗CD13被覆免疫磁気微小ビーズにより、4℃でヒト好酸球をさらに精製した。ギ
ムザで染色した後に概算した好酸球集団の純度の度合いは、92および100％の間
であった。結果を、5つの高倍率視野の平均±SDとして示している。コントロー
ル血清は走化性にまったく影響を及ぼさなかった。「^*」で同定される結果は、
各濃度のエオタキシンで、プライミングしていない好酸球と比べ、p＜0.01で異
なる可能性を表す。

【００７２】 図25aないし25Iは、IL-5での好酸球のプライミングが、細胞におけるケモカイ
ンの量を増加させ、そして免疫グロブリンでの刺激後、その放出を増加させるこ
とを示す。IL-5で好酸球を一晩プレインキュベーションすると、コントロール（
図25F）と比較した際、エオタキシン（図25A）およびMCP-4（図25B）の発現が増
加した。好酸球をIgE-抗IgEで刺激すると、やはりエオタキシン（図25C、25D、2
5E）またはMCP-4（図25G、25H、25I）を放出するであろう。好酸球は上述のよう
に精製し、そして組換えヒトIL-5（1 ng/ml）と一晩インキュベーションした。
このインキュベーションは、培地単独でインキュベーションしたコントロール細
胞（図25F）と比べ、細胞におけるエオタキシン（図25A）およびMCP-4（図25B）
を増加させた。IgEと15分間のプレインキュベーションした後、抗IgEに曝露する
ことによる好酸球の刺激は、15分（図25C、25G）、2時間（図25D、25H）または1
2時間（図25E、25I）で進行性にエオタキシン（図25C、25D、25E）またはMCP-4
（図25G、25H、25I）を放出させる。

【００７３】 したがって、異なる受容体（例えばIL-5およびCCR3受容体）に対して向けられ
る、本発明と一致したアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせは、アレル
ギー、喘息または腫瘍性細胞増殖の治療において相乗効果を有する。

【００７４】 GM-CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータ鎖に対して向けられるアンチセ
ンスホスホロチオエートRB141A並びにCCR3受容体に対して向けられるアンチセン
スホスホロチオエートRCC3A4の組み合わせが、どちらか単独の場合と比較して、
抗原攻撃後の肺への好酸球補充に対し相乗効果を持つかどうか評価するため、ブ
ラウンノルウェイラットで実験を行った。200 mgの水酸化アルミニウムと混合し
た1.25 mgの卵白アルブミンを皮下注射することにより、ブラウンノルウェイラ
ットを卵白アルブミンに対し能動的に感作した。第14日目に、ラットに500μlの
0.9％NaCl中の500μgのRCC3A4および500μgのRB141Aまたは0.9％NaClを腹腔内投
与した。翌日、65 mg/kgペントタールでの全身麻酔および気管内挿管後、60μl
の0.9％NaCl中の180μgの各アンチセンスを気管内投与する。20分後、60μl中の
200μgの卵白アルブミンを気管内投与することにより、卵白アルブミン攻撃を行
う。8時間後、全身麻酔後、ラットに再び挿管し、そして5回の5 ml点滴注入から
なる肺洗浄を行う。細胞を洗浄し、計数し、そしてCytospin III中でスライド上
に遠心分離する。差別的細胞計数を行う。図18Bにおいて、CCR3受容体並びにGM-
CSF、IL-3およびIL-5受容体に共通のベータサブユニットに対して向けられるア
ンチセンスオリゴヌクレオチドRCC3A4およびRB141Aは、肺への好酸球流入に対す
る相乗効果を持つことに注目すべきである。好酸球流入の阻害は、およそ90％で
あった。

【００７５】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アレルギーおよび喘息における
可溶性IL-4受容体の使用に比べ、以下の利点を有する：a）実施例1に示されるよ
うに、これらの分子の大きさがはるかに小さいため、組織中に分散し、そして受
容体を発現している細胞（上皮細胞、平滑筋細胞）に浸透することが可能になり
；b）IL-13もまたアレルギーおよび喘息で増加しているため、IL-4およびIL-13
受容体に共通のサブユニットに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に
より、IgE産生の多くの観点でIL-4の効果と類似のIL-13の効果を遮断することに
より、より広い効果が可能になり；そしてc）多くのサイトカイン（IL-3、IL-5
およびGM-CSFまたはIL-4およびIL-13またはCCR3（エオタキシン、RANTESおよびM
CP-4））の受容体に対する抗受容体オリゴヌクレオチドの組み合わせは、炎症性
カスケードにおける特定の個体の異種性が存在する疾患において、より広い効果
を可能にするであろう。

【００７６】 さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の利点を有する：
a）アンチセンス抗受容体オリゴヌクレオチドは（サイトカイン自体に向けられ
た場合）、投与部位に存在する組織または炎症細胞に直接作用し、そして媒介体
の放出を潜在的に遮断することにより間接的に作用するのではないであろうし；
b）アンチセンス抗受容体オリゴヌクレオチドは、アレルギーおよび喘息の患者
の血液中で産生されそして増加するサイトカインの分散により影響を受けないで
あろうし；そしてc）本発明の1つのアンチセンス抗受容体オリゴヌクレオチドは
、アレルギーまたは喘息で増加していることが示されている2つまたは3つの媒介
体の影響を遮断し、したがって1つの媒介体または受容体に対してのみ向けられ
る1つのアンチセンスオリゴヌクレオチドより広い影響を有し、そしてしたがっ
て利点を有するであろう。

【００７７】 本発明は、特定の態様と関連して記載されてきているが、さらなる修飾が可能
であり、そして本出願は、一般的に本発明の原理にしたがった本発明のいかなる
変形、使用または適応も含むよう意図されることが理解されるであろうし、そし
て本発明が関連する当業内に既知のまたは習慣的な実施に由来するような、そし
て先に示される本質的な特徴および付随する請求項の範囲に適用してもよいよう
な、本開示からの逸脱を含む。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1は、初期の喘鳴を有する被検体における、ハウスダスト-ダニ
抗原に対する応答におけるIL-4産生が増加することを示す。

【図２】 図2Aおよび2Bは、喘鳴の重症度の予想として、細気管支炎に罹っ
ているときのサイトカイン産生を示す。

【図３】 図3Aおよび3Bは、IL-2に応答する際の血液単核細胞によるいIFN
産生と、幼児における細気管支炎後2年の喘息の発生との関連を示す。

【図４】 図4Aおよび4Bは、幼児における細気管支炎時にIL-2に応答する際
のインターフェロンγ産生と、Vmax FRC（4A）またはPC40ヒスタミン（4B）との
相関を示す。

【図５】 図5Aから5Cは、ラット肺中に噴霧若しくは呼吸させた8時間後の
、FITC標識アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの分布を示す。

【図６】 図6Aおよび6Bは、投与24時間後のラットの肺洗浄中で回収された
、炎症性細胞（図6A）および炎症性細胞（緑色蛍光）中への道筋を見いだしたFI
TC-標識アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（図6B）を示す。

【図７】 図7は、投与後24時間後のラットの気管支肺胞洗浄（BAL）および
肺（バイオプシー）から回収された場合に、対照アンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（Eot.FITC）と比較して、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドが依然として正常であることを示すゲルを示す。

【図８】 図8は、フローサイトメトリーにより検出する場合に、アンチセ
ンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドOD1、OD2およびOD3がRAJI細胞にお
けるIL-4およびIL-13産生を阻害することを示す。

【図９】 図9Aおよび9Bは、免疫沈降およびウェスタンにより検出する場合
に、本発明の一態様に従うアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
OD1、OD2およびOD3が、RAJI細胞におけるIL-4受容体のタンパク質発現を阻害す
ることを示す。

【図１０】 図10は、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
A1.3がIL-4／IL-13受容体のαサブユニットのmRNA発現を阻害することを示す。

【図１１】 図11Aから11Fは、免疫化学により検出する場合に、RAJI細胞に
おけるIL-4およびIL-13受容体のタンパク質発現を阻害する場合の、アンチセン
スオリゴヌクレオチドOD2の用量反応を示す。

【図１２】 図12は、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
OD2およびA1.3がヒト臍帯血Th-2前駆細胞におけるIL-4産生の阻害とIFN-γ産生
の増大を示す。

【図１３】 図13Aおよび13Bは、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチド107Aが、TF1（図13A）およびU937（図13B）細胞におけるIL-3、IL-5
およびGM-CSF受容体の共通βサブユニットのmRNA発現（半定量的RT-PCR）を阻害
することを示す。

【図１４】 図14は、免疫沈降およびウェスタンにより検出する場合に、ア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド107Aが、TF1細胞におけるIL-
3、IL-5およびGM-CSF受容体の共通βサブユニットのタンパク質発現を阻害する
ことを示す。

【図１５】 図15は、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
107Aが、用量反応としてTF1細胞増殖を阻害することを示す。

【図１６】 図16は、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
107Aが、TF1細胞成長を阻害することを示す。

【図１７】 図17は、ラット骨髄細胞中のGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体の
mRNA発現を阻害することを示す。

【図１８】 図18Aおよび18Bは、アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドRB141A（ラットGM-CSF、IL-3およびIL-5受容体のβサブユニットを指
向する）、RCC3A4（ラットCCR3受容体を指向する）、あるいは両方の組合せが、
卵白アルブミンチャレンジ後の腹腔（左）または肺（右）中で好酸球の流入を阻
害することを示す。

【図１９】 図19Aから19Hは、エオタキシンmRNA（図19Aから19D）およびタ
ンパク質（図19Eから19H）の発現および細胞分布を、アレルギー性喘息の患者（
図19A、19C、19E、19F、19G）および正常対照（図19B、19D、19 H）の、気道中
（図19A、19B、19E）およびBAL細胞（図19C、19D、19Fから19H）について示す。

【図２０】 図20は、CCR3受容体を指向するアンチセンス（RC86A、図中で
はCCR3AS 86と呼ばれる）の、好酸球経路中に分化したHL60細胞（クローン15）
におけるCCR3 mRNA発現に対する影響を示す。

【図２１】 図21は、CCR3受容体を指向するアンチセンスRC86Aの、CCR3受
容体をトランスフェクトしたGhost細胞中でのCCR3 mRNA発現に対する影響を示す
。

【図２２】 図22は、CCR3受容体を指向するホスホロチオエートアンチセン
スRC86AおよびホスホロチオエートアンチセンスRC 269の、精製ヒト好酸球にお
けるカルシウム移動に対する影響を示す。

【図２３】 図23は、CCR3受容体を指向するホスホロチオエートアンチセン
スオリゴヌクレオチドRCC3A4の、ラット骨髄細胞におけるCCR3 mRNA発現に対す
る影響を示す。

【図２４】 図24は、IL-5を用いてあらかじめインキュベーションすること
の、エオタキシンにより誘導される化学走性に対する影響を示す。

【図２５】 図25Aから25Iは、IL-5を用いて一晩あらかじめインキュベーシ
ョンすることの、ケモカイン産生に対する影響を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 37/08 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA01 HA17 4C084 AA13 BA44 NA14 ZA592 ZA892 ZB112 ZB132 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZA89 ZB11 ZB13 ZB26

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 CCR3受容体、IL-4受容体およびIL-13受容体の共通サブユニ
   ット、およびIL-3受容体、IL-5受容体およびGM-CSF受容体の共通サブユニット、
   からなる群から選択される受容体をコードする核酸配列を指向する、喘息、アレ
   ルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または癌を治療および／または予防す
   るためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 受容体をコードする核酸配列がIL-4受容体およびIL-13受容
   体の共通サブユニットをコードする核酸である、請求項１に記載のオリゴヌクレ
   オチド。
3. 【請求項３】 受容体をコードする核酸配列がIL-3受容体、IL-5受容体およ
   びGM-CSF受容体の共通βサブユニットをコードする核酸である、請求項１に記載
   のオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 受容体をコードする核酸配列がCCR3受容体のサブユニットを
   コードする核酸である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SE
   Q ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID N
   O:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:
   16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、そしてSEQ ID NO:23からなる
   群から選択される配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に定義した少なくとも一つのア
   ンチセンスオリゴヌクレオチドを、医薬的に許容可能な担体と共同して含む、喘
   息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または癌を治療および／また
   は予防するための医薬組成物。
7. 【請求項７】 喘息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または
   癌を治療および／または予防するための、請求項１〜５のいずれか１項に定義し
   たアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
8. 【請求項８】 喘息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または
   癌を治療および／または予防するための、請求項６に定義した医薬組成物の使用
   。
9. 【請求項９】 喘息、アレルギー、過好酸球増加症、一般的な炎症、または
   癌を治療および／または予防するための方法であって、そのような治療が必要な
   患者に対して、請求項１〜５のいずれか１項に定義したアンチセンスオリゴヌク
   レオチドを投与することを含む、前記方法。