JP2002515031A - タンパク質グリコシル化の阻害および血管疾患の予防 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アルブミン分子において生物活性アマドリグルコース付加物を生成するアルブミンの非酵素的グリコシル化を予防すること、ならびにアルブミンを非酵素的グリコシル化から保護する化合物を使用して血管疾患を予防する方法に関する。本発明はまた、アポＢ分子においてアマドリグルコース付加物を生成し、脂質酸化とＬＤＬ−コレステロール内在化に傾いて泡沫細胞に導く低密度リポプロテインのアポリポプロテインＢの非酵素的グリコシル化を予防すること、ならびにアポＢ／ＬＤＬを非酵素的グリコシル化から保護する化合物を使用してアテローム硬化症を予防し血清中コレステロール濃度を低下させる方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質グリコシル化の阻害および血管疾患の予防 発明の技術分野 本発明は、糖尿病性血管障害の予防のための、アルブミンおよび低密度リポタ ンパク質に対して結合する薬剤の新規用途に関する。本発明は、更に、アルブミ ンの非酵素的グリコシル化を阻害し且つそれによって有害な生体作用を有するグ リコアルブミンの形成を防ぐ、アルブミン結合性を有する化合物の能力に関する 。本発明は、低密度リポタンパク質の非酵素的グリコシル化を阻害し且つそれに よってコレステロール含有細胞の形成を促進する低密度グリコリポタンパク質の 形成を防ぎ、そしてＬＤＬ−コレステロールのクリアランスをより低い血清コレ ステロールレベルまで向上させる、低密度リポタンパク質結合性を有する化合物 の能力に関する。 発明の背景 非酵素的グリコシル化は、タンパク質中のリシン残基の反応性イプシロンアミ ノ基とグルコースとの縮合反応である。その反応は、非環状グルコースのアルデ ヒド基の求核付加による結合で開始して、シッフ塩基としても知られるアルジミ ンを形成する。この中間体はアマドリ転位してアミノデオキシフルクトース誘導 体（フルクトシルリシン）を安定なケトアミン結合で形成する。アマドリ産物は 、充分に定義されていない不均一な群の前進性グリコシル化最終産物（ＡＧＥ） を生じることがあり、その形成はグルコース非依存性であり、そして種々の転位 、脱水、酸化および重合反応によって生じると考えられる。先行技術は、ＡＧＥ 修飾タンパク質が、糖尿病および老化に関係した疾患において病態生理学的役割 を有すること、およびこのような疾患においてＡＧＥ架橋結合形成の阻害が有益 であるらしいことを示唆した(ブラウンリー（Brownlee）ら,Science 232:1629,1 986；New Engl J Med 318:1315,1988；ブラッサラ(Vlassara),J Lab Clin Med 1 24:19,1994)。しかしながら、最近の実験研究は、アマドリグルコース付加物に よって修飾されたある種のタンパク質が、特に、糖尿病に関係した血 管病の発症において重要な病原因子であることを示している。グリコタンパク質 は、主として、アマドリ産物としてin vivoで存在し、そしてタンパク質がその 循環の滞留時間中に受ける周囲グルコース濃度によって動くそれらの濃度は、高 血糖環境に対する暴露を伴う糖尿病患者において有意に増加する(コーエン（Coh en）およびハド(Hud),J Immunol Meth 122:279,1989；コーエンら,Eur J Clin C hem Clin Biochem 31:707,1993)。 実験研究は、アマドリ修飾グリコアルブミンが、非修飾アルブミンにはない独 特な生体作用を有することを示した。これらグリコアルブミンに誘導された作用 には、腎糸球体および網膜微小血管系における基質生産の刺激が含まれ、これら は、糖尿病合併症に特有な変化によく似ていて、グリコタンパク質中のグルコー ス修飾エピトープに特異的なリガンド−受容体系によって媒介されると考えられ 、そしてグリコアルブミン中のアマドリ産物と反応できる分子によって妨げられ うる(ズィヤデー（Ziyadeh）およびコーエン，Molec Cell Biochem 125:19,1993 ；コーエンら,Molec Cell Biochem 151:61,1995;コーエンおよびズィヤデー,Kid ney Int 45:475,1995；コーエンら,J Clin Invest 95:2338,1995；ウー（Wu）お よびコーエン,Biochem Biophys Res Comm 207:521,1995)。このような分子は、 単クローン性抗体であってよいしまたは、グリコアルブミン上に存在するが非グ リコアルブミン上に存在しないフルクトシリルリシンエピトープに対して特異的 に結合し、そして米国特許第5,223,392号および米国特許第5,518,720号で開示さ れている他の化合物であってよい。 低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を運ぶコレステロールの主要タンパク質であ るアポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）の非酵素的グリコシル化は、そのアテローム 発生の可能性に影響を与えるＬＤＬの分泌後修飾である。アポＢは、高親和性Ｌ ＤＬ受容体によるＬＤＬの細胞認識および取込みのためのタンパク質決定因子で ある。ＬＤＬ受容体に対するアポＢの結合は、ＬＤＬのインターナリゼーション および分解を引き起こし、血漿からのＬＤＬのクリアランスを促進し、そして細 胞内コレステロールの処理および生合成を調節する。ＬＤＬのグリコシル化は、 この高親和性ＬＤＬ受容体に媒介された取込みおよび分解を減少させる(クライ ン（Klein）ら,Diabetes 44:1093,1995；Gugliucclら,Scand J Lab Clin Invest 53:125,1993)。もう一方で、アポＢ中のリシン残基のグリコシル化は、コレステ ロール含有泡沫細胞を生じる単球−マクロファージの別の受容体によるインター ナリゼーションを促進する(クラインら,Metabolism 38:1108,1989；クラインら, Diabetes 44:1093,1995；ブラウン（Brown）およびゴールドスタイン(Goldstein ),Nature 343:508,1990)。更に、グリコシル化は、in vivoでのＬＤＬのクリア ランス率を変化させ、そしてコレステロールの細胞内処理およびその合成の調節 の妨げになりうる(ロペス(Lopez)−ビレラ(Virella)ら,Diabetes 37:550,1988; スタインブレッヒャー(Steinbrecher)およびヴィッツム(Witztum),Diabetes 33: 130,1984；ライアンズ（Lyons）ら,Diabetologia 30:916,1987；クラインら,Dia betologia 33 299,1990)。更に、グリコシル化は、脂質過酸化を増加させ且つそ れによって、スカベンジャー受容体によって認識され且つインターナリゼーショ ンされる修飾アポＢ付加物の形成によるＬＤＬアテローム発生を促進しうるフリ ーラジカル生産を促進する(ジラリー(Gillery)ら,Diabete et Metabolism 14:25 ,1988；ムラルキー（Mullarkey）ら,Biochem Biophys Res Comm 183:932,1990； スタインバーグ（Steinberg）ら,New Engl J Med 320:915,1989)。グリコシル化 自体も酸化的損傷を促進する(ハント（Hunt）ら,Biochem J 291:529,1993)。 先行技術は、アテローム性動脈硬化症の発症におけるＡＧＥ修飾ＬＤＬの病態 生理学的役割、およびＡＧＥ架橋結合形成の阻害が、アテローム性動脈硬化心臓 血管病の治療において有益でありうることを示唆した(ブラウンリーら,Science 232:1629,1986；New Engl J Med 318:1315,1988；ブラッサラ,J Lab Clin Med 1 24:19,1994；ブカラ（Bucala）ら,Proc Natl Acad Sci 90:6434,1993；Proc Nat l Acad Sci 91:9441,1994)。しかしながら、上で引用された最近の実験研究は、 アマドリグルコース付加物によって修飾されたアポＢ／ＬＤＬが、アテローム発 生において重要な役割を果たすことを示している。更に、グリコＬＤＬは、主と して、アマドリ産物としてin vivoで存在し、そしてその濃度は、アテローム性 動脈硬化症の危険が増大した人々において上昇する(コーエンら,Eur J Clin Che m Clin Biochem 31:707,1993；テムズ（Tames）ら,Atherosclerosis 93:237,199 2)。 グリコアルブミンの有害な生体作用は、アルブミン中のリシンアミノ基に対す るグルコースの結合を妨げ、それによってグリコアルブミン濃度を低下させる手 段を有することを望ましくする。このような手段は、上昇したグリコアルブミン 濃度の作用を中和するように設計されていて、先行技術で開示されたものとは異 なった機序によって糖尿病合併症の発症に有益に影響を及ぼすであろう。グリコ アルブミン濃度の低下を達成しうる一つの方法は、血中グルコースレベルの調節 のための集中的な管理法を用いることであろう。糖尿病管理および合併症試験( ＤＣＣＴ)は、集中的なインスリン療法を用いる循環グリコタンパク質レベルの 近規格化が、糖尿病性腎症および網膜症の発症の危険を低下させることを示した (New Engl J Med 329:977,1993)。しかしながら、ＤＣＣＴで用いられたような 集中的管理法の実施および維持が難しいこと、および大多数の糖尿病患者は、現 行の抗糖尿病療法で有意に高血糖状態のままであることは広く理解される。グリ ヒアルブミン濃度の低下を達成しうるもう一つの手段は、リシンアミノ基とグル コースの縮合を妨げる化合物を用いることである。アセチルサリチル酸（アスピ リン）は、イプシロンアミノリシン基の急速なアセチル化によって、この反応を 競合的に阻害できる(ラウ(Rao)およびコトリア(Cotlier),Biochem Biophys Res Comm 151:991,1988；レンデル（Rendell）ら，J Lab Clin Med 107:286,1986)。 しかしながら、広範なタンパク質アセチル化の影響はまだ知られていない。更に 、アスピリンのグリコシル化阻害活性は比較的弱く、そしてこの活性に起因する かもしれない可能な治療的利点は、血中のアセチルサリチル酸の急速な加水分解 および短い半減期によって、およびin vivoのグリコシル化を阻害するのに必要 とされる用量で予想される副作用によって制限される(コステロ（Costello）お よびグリーン(Green)，Arth Rheum 25:550,1982；ローランド（Rowland）および リーゲルメン(Riegelmen)，J Phram Sci 57:1313,1968)。アセチル基を欠いてい るが、遊離リシンアミノ基とグルコースの縮合を有効に妨げる方式でアルブミン に対して結合する他の化合物は、グリコシル化阻害剤として一層望ましいであろ う。 グリコアポＢ／ＬＤＬの有害な生体作用は、アポＢリシンアミノ基に対するグ ルコースの結合を妨げ、それによってグリコＬＤＬ濃度を低下させる手段を有す ることを望ましくする。グリコＬＤＬを低下させることによって血漿ＬＤＬコレ ステロールレベルを減少させ、それによってＬＤＬコレステロールクリアランス を促進することもまた望ましいであろう。このような手段は、胃腸吸収若しくは コレステロール合成を阻害することによってコレステロールレベルを低下させる 、または架橋ＡＧＥ修飾ＬＤＬ形成を妨げる薬剤に関する先行技術で開示された ものとは異なった機序によってアテローム性動脈硬化症の発症に有益に影響を与 えるであろう。このような手段は、遊離リシンアミノ基とグルコースの縮合を有 効に妨げる方式でアポＢ／ＬＤＬに対して結合し、それによって非酵素的グリコ シル化を阻害する化合物を用いて達成されうる。 発明の概要 本発明は、アルブミンの非酵素的グリコシル化を妨げる手段を提供する。 本発明はまた、アルブミン分子中の生物活性アマドリグルコース付加物の形成 を妨げる新規方法を提供する。 更に、本発明は、生物活性グリコアルブミンエピトープの発生を、それらの独 特な細胞結合受容体との相互作用のために制限する新規方法を提供する。 本発明は、タンパク質中のリシンアミノ基とグルコースの反応を阻害するよう な方法でアルブミンに対して結合できる化合物を用いて達成される。 本発明はまた、糖尿病性血管疾患、糖尿病性腎症および糖尿病性網膜症を予防 する方法を提供する。 本発明のもう一つの実施態様は、糖尿病患者の血管疾患等を予防する方法であ って、in vivoでアルブミンの非酵素的グリコシル化を妨げることができる治療 的分子を等尿病患者に対して投与する工程を含む上記方法を提供する。 本発明のもう一つの実施態様は、糖尿病の血管合併症を予防する方法であって 、アルブミン分子中の生物活性アマドリグルコース付加物の形成を妨げることが できる治療的分子を投与する工程を含む上記方法を提供する。 本発明は、アポリポタンパク質Ｂ／ＬＤＬの非酵素的グリコシル化を妨げる手 段を提供する。 本発明はまた、アポＢ／ＬＤＬ分子中の生物活性アマドリグルコース付加物の 形成を妨げる新規方法を提供する。 本発明は、タンパク質中のリシンアミノ基とグルコースの反応を阻害するよう な方法でアポＢ／ＬＤＬに対して結合できる化合物を用いて達成される。 本発明はまた、アテローム性動脈硬化心臓血管病を予防する方法を提供する。 本発明のもう一つの実施態様は、アテローム性動脈硬化症を予防する方法であ って、in vivoでアポＢ／ＬＤＬの非酵素的グリコシル化を妨げることができる 治療的分子を患者に対して投与する工程を含む上記方法を提供する。 本発明のもう一つの実施態様は、アテローム性動脈硬化症を予防する方法であ って、アポＢ／ＬＤＬ分子中の生物活性アマドリグルコース付加物の形成を妨げ ることができる治療的分子を投与する工程を含む上記方法を提供する。 本発明はまた、血中コレステロールレベルを減少させる方法であって、ＬＤＬ コレステロールを低下させることができる治療的分子を患者に対して投与するこ とを含む上記方法を提供する。 したがって、本発明は、ヒトアルブミン中の１個または複数のドメインと反応 性であり、そしてアルブミンの構造中のこれら部位に対して結合することによっ てそのタンパク質を非酵素的グリコシル化から保護する化合物の使用に関する。 これら化合物によって結合した部位は、タンパク質のリシンアミノ基のアセチル 化を引き起こさない。本発明はまた、ヒトアポＢ／ＬＤＬ中の１個または複数の ドメインと反応性であり、そしてアポＢ／ＬＤＬの構造中のこれら部位に対して 結合することによってそのタンパク質を非酵素的グリコシル化から保護する化合 物の使用に関する。 詳細な説明 本発明の知見は、ヒトアルブミンに対して結合する化合物がそのタンパク質を 非酵素的グリコシル化から保護するということである。この保護作用は、in vit roおよびin vivoでのグルコースに対するタンパク質の暴露で形成されるアマド リグルコース付加物を含有するグリコアルブミンの量を減少させる。これらの知 見に基づいて、糖尿病の患者で起こる血管疾患、腎症、網膜症等を予防する方法 を提供する。糖尿病患者は、血漿中で増加したグリコアルブミンレベルを示す。 この増加は、腎臓および眼などの組織中の微小血管系合併症の発症に病原的に関 与している。本発明は、グリコアルブミン濃度を低下させる。血漿グリコアルブ ミン濃度の減少は、腎臓および網膜における糖尿病に関係した病理学的変化の改 善、および腎機能の低下の予防をもたらす。非酵素的グリコシル化からのアルブ ミンの保護は、腎臓および他の細胞上に存在し且つ細胞外基質生産の刺激などの グルコアルブミンの生体作用を媒介する受容体に対する結合に利用可能なグリコ アルブミンリガンドの量を減少させる。 本発明の知見は、ヒトアポＢ／ＬＤＬに対して結合する化合物がそのタンパク 質を非酵素的グリコシル化から保護するということでもある。この保護作用は、 in vitroおよびin vivoでのグルコースに対するタンパク質の暴露で形成される アマドリグルコース付加物を含有するグリコアポＢ／ＬＤＬの量を減少させる。 グリコＬＤＬの減少は、ＬＤＬコレステロールのクリアランスを促進し且つ血中 コレステロール濃度を低下させる。この知見に基づいて、アテローム性動脈硬化 心臓血管病を予防する方法を提供する。アテローム性動脈硬化症の危険が増加し た状態にある糖尿病患者などの人々は、血漿中で増加したグリコアポＢ／ＬＤＬ レベルを示す。この増加は、アテローム性動脈硬化心臓血管病の発症に病原的に 関与している。上昇した血清コレステロールレベルを有する人々（上昇したグリ コアポＢ／ＬＤＬレベルを有することもある）は、アテローム性動脈硬化心臓血 管病の危険が増加した状態にある。本発明は、グリコアポＢ／ＬＤＬ濃度および 血清コレステロール濃度を低下させる。血漿グリコアポＢ／ＬＤＬ濃度の減少は 、血管におけるＬＤＬコレステロールに関係した病理学的変化の改善、およびア テローム性動脈硬化症病変の予防をもたらす。血清コレステロール濃度の減少は 、アテローム性動脈硬化心臓血管病の危険を低減させる。 本発明は、アルブミンまたはアポＢの三次構造中の部位に対して結合できる化 合物を開示する。開示された化合物の結合部位は、タンパク質の一次構造のいろ いろな部分を包含しうるし且つ非酵素的グリコシル化の優先的な部位であるリシ ン残基を包含しうる。このような化合物は、ヘテロアリール酸、エノール酸、ア ントラニル酸、アリールプロピオン酸およびインドール酢酸として知られる化合 物の化学的種類から選択されたが、更に、ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸 、メチルトルオイルピロール酢酸、ヒドロキシメチルピリジルカルバモイルベン ゾチアジンジオキシド、ジクロロメチルフェニルアミノ安息香酸、メチルメチル プロピルベンゼン酢酸、クロロベンゾイルメトキシメチルインドール酢酸および フ ルオロメチルメチルスルフィニルフェニルメチレンインデン酢酸の群より選択さ れる。これら化合物は、非ステロイド系抗炎症薬として用いられてきた。好まし い化合物は、２−［(２，６−ジクロロフェニル)アミノ］ベンゼン酢酸である。 ２−［(２，６−ジクロロフェニル)アミノ］ベンゼン酢酸（ＤＣＰＢ）の通常 提示される用量は、分割量で約１００〜２００ｍｇ／日である。本発明の目的に は、この範囲より下および上の他の用量を用いることができる。ＤＣＰＢは弱酸 （ｐＫａ＝４）であり、胃腸管からほぼ完全に吸収されて、投与から３０〜１５ ０分後に約２μｇ／ｍｌのピークレベルに達する。吸収されたＤＣＰＢの大部分 は循環アルブミンに対して結合し、そして少量がリポタンパク質に対して結合し ている(チャン（Chan）ら,J Pharm Sci 76:105,1987)。それは、通常、炎症状態 には１０〜１４日間与えられる。本発明の目的には、それは何週間も、何か月間 もまたは何年間も与えられうる。 蛍光標識置換分析は、アルブミン中のHis 146およびLys 195残基がＤＣＰＢに 対する高親和性結合部位に関与していること、およびその化合物にはアルブミン の一次構造の別の部分を包含するもう一つの結合部位が存在し、そこにおいてLy s 199がある役割を果たすことを示している(シャムアード（Chamouard）ら,Bioc hem Pharmacol 34:1695,1985)。Lys 199は脂肪酸結合部位であり、アルブミンか らの脂肪酸の解離が、ＤＣＰＢ結合に関してこの部位を利用可能にすることが示 唆される。Lys 199は、in vitroおよびin vivoの非酵素的グリコシル化に優先的 な部位としても役立つ(ガーリック（Garlick）ら,J Biol Chem 258:6142,1983) 。in vivoのアルブミングリコシル化の主要部位はリシン525であり、これは、こ のタンパク質の全グリコシル化の約３３％を占め(フラッキガー(Fluckiger),Mon ographs in Atherosclerosis 13:53,1985；イバーグ（Iberg）ら,J Biol Chem 2 61;13542,1986)、しかもＤＣＰＢを結合することもできる。アマドリグルコース 付加物で修飾されたリシン525は、グリコアルブミン細胞受容体によって認識さ れたエピトープを含み、そしてこの残基のグリコシル化のＤＣＰＢによる保護は 、このリガンド‐受容体結合を阻害する。 予防および治療のために、上述の治療用分子を投与してアルブミンおよびアポ Ｂ／ＬＤＬのグリコシル化可能な部位をブロックすることができる。そのような 部位に結合することによって、治療用分子はアルブミンおよびアポＢ／ＬＤＬの アマドリグルコース付加物の形成を阻止でき、循環している過剰のグリコシル化 アルブミンおよびグリコシル化アポ／ＬＤＬによっておよびこれらのグリコシル 化タンパク質の細胞認識部位への結合によって引き起こされる組織損傷に対して 保護でき、循環系からのＬＤＬコレステロールクリアランスを促進する。 本発明の方法による投与は、循環系または治療的に有用であるべき体の標的領 域に十分な濃度の治療用分子を達成できる方法である。典型的にはそのような投 与は経口であるが、非経口である注射も使用できる。治療用分子の典型的投与量 により有効濃度のアルブミン−結合およびリポプロテイン−結合力を達成できよ う。本発明の方法による投与は、生理塩溶液のような治療上許容し得るキャリア ーとの組成物中またはリン酸カルシウム、でんぷん、蔗糖、ポリエチレングリコ ール、タルクおよび他の物のような補助剤を含む錠剤中に治療用分子を含むこと ができる。 上記開示は一般的に本発明を説明するものである。より完全な理解は下記特定 の実施例を参照して得られる。下記実施例はここに説明のためのみ提供され、本 発明の範囲を限定するものではない。本発明の新規性は意図された治療にあり、 下記特定の実施例は該治療が試みられ試験されたことを明確に示している。 実施例1．DCPBによる血漿アルブミンのグリコシル化の阻害 ヒト血漿（各々0.5ml）の試料を、様々な濃度のグルコースと共に、様々な濃 度のDCPBの不在下又は存在下において、25℃で４日間インキュベートした。透析 して未結合の反応体を除去した後、アマドリ（Amadori）グルコース付加物とし てアルブミンに結合したグルコースの量を酵素結合免疫吸着検定（ELISA）にお ける分析により決定した。この検定においては、グリコシル化アルブミンには見 出されるものの非グリコシル化アルブミンには見出されないエピトープと特異的 に反応することが知られるモノクローナル抗体を用いた。表１に示されるように 、DCPBは、ヒト血漿におけるグルコース修飾アルブミンの形成の用量応答性阻害 を生じた。 実施例2．DCPBによる血漿LDLグリコシル化の阻害 ヒト血漿（各々0.5ml）を、様々な濃度のグルコースと共に、様々な濃度のDCP Bの不在下又は存在下において、25℃で４日間インキュベートした。透析して未 結合の反応体を除去した後、アマドリグルコース付加物として低密度リポタンパ ク質に結合したグルコースの量を酵素結合免疫吸着検定（ELISA）における分析 により決定した。この検定においては、グリコシル化アポB／LDLには見出される ものの非グリコシル化アポB／LDLには見出されないエピトープと特異的に反応す ることが知られるモノクローナル抗体を用いた。表２に示されるように、DCPBは 、ヒト血漿におけるグルコース修飾LDLの形成の用量応答性阻害を生じた。実施例3．DCPBは糖尿病患者におけるグリコシル化アルブミンを減少させる 糖尿病を患う個人から、DCPB、200mg／日を経口により分割用量で用いる14日 の治療の開始時（第０日）及び終了時（第14日）に血液を得た。これらの試料に おけるグリコシル化アルブミンの血漿濃度を酵素結合免疫検定により決定した。 この検定においては、アマドリグルコース付加物を含むアルブミンと特異的に反 応し、非グリコシル化アルブミンとは反応せず、かつアルブミンのリジン525の フラクトシリシンエピトープとの最も高い反応性を有することが知られるモノク ローナル抗体を用いた。表３に示されるように、DCPBの投与により循環グリコシ ル化アルブミンの量が30−40％減少した。実施例4．DCPBによるLDLのグリコシル化のイン・ビボ防御 ヒト被験者から、DCPB、200mg／日を経口により分割用量で用いる14日の治療 の開始時（第０日）及び終了時（第14日）に血液を得た。これらの試料における グリコシル化LDLの血漿濃度を酵素結合免疫検定により決定した。この検定にお いては、アマドリグルコース付加物を含むLDLと特異的に反応し、かつ非グリ コシル化LDLもしくは他の血漿タンパク質とは反応しないことが知られるモノク ローナル抗体を用いた。表４に示されるように、DCPBの投与により循環グリコシ ル化LDLの量が10-20％減少した。実施例5．DCPBは血清コレステロールを減少させる ヒト被験者から、DCPB、200mg／日を経口により分割用量で用いる14日の治療 の開始時（第０日）及び終了時（第14日）に血清試料を得た。コレステロールエ ステラーゼ／コレステロールオキシダーゼ法(シグマ・ケム社(Sigma Chem Co.) 、セントルイス、MO)によりコレステロール濃度を測定した。表５に示されるよ うに、DCPBの投与により血清コレステロール濃度が17％減少した。 実施例6．血漿アルブミンのグリコシル化における異なる薬品種の化合物の相対 効力 ヒト血漿の試料（各々0.5ml）を、40mMグルコースと共に、様々な濃度の異な る薬品種の化合物の存在下において、25℃で４日間インキュベートした。透析し て未結合の反応体を除去した後、アマドリグルコース付加物としてアルブミンに 結合したグルコースの量を実施例１に説明されるELISAにおける分析により決定 した。表６に示されるように、これらの化合物がグリコシル化アルブミンの50％ 阻害（IC50）を生じる濃度は、DCPBを1〜10倍のオーダーで上回るものであった 。 実施例7．血漿LDLのグリコシル化の阻害における異なる薬品種の化合物の相対効 力 ヒト血漿の試料（各々0.5ml）を、40mMグルコースと共に、様々な濃度の異な る薬品種の化合物の存在下において、25℃で４日間インキュベートした。透析し て未結合の反応体を除去した後、アマドリグルコース付加物として低密度リポタ ンパク質に結合したグルコースの量を実施例２に説明されるELISAにおける分析 により決定した。表７に示されるように、これらの化合物がグリコシル化アポB ／LDLの形成を8−15％減少させる濃度はDCPBの濃度を1,000倍上回るものであっ た。 実施例8．アルブミンのグリコシル化の阻害は、リガンドがフラクトシリシン− 修飾アルブミンに特異的な細胞受容体に結合するのを妨げる 腎糸球体間質細胞を、10mM HEPES、pH7.4、137mM NaCl、11mMグルコース、4mM KCl及び5mM CaCl2並びに20μgのフルオレセイン結合（FITC）グリコシル化アル ブミンを含む緩衝液中で２時間インキュベートした(Wu及びCohen，Biochem Biop hys Res Comm 207:521，1995)。485nmで励起し、530nmで発光する蛍光によって 測定される、糸球体間質細胞受容体へのFITC−グリコシル化アルブミンの特異的 結合を、過剰の非結合グリコシル化アルブミンの不在下（総結合）及び存在下（ 非特異的結合）における結合の相違として決定した。DCPBの不在下又は存在下に おいて予めグルコースと共にインキュベートした血漿アルブミンの、FITC−グリ コシル化アルブミンの特異的結合に対する効果を決定した。40mMグルコースに４ 日間晒すことによりグリコシル化されたアルブミンは糸球体間質細胞受容体への 特異的結合についてFITC−グリコシル化アルブミンと効率的に競合し、これに対 して、40mMグルコースに加えて10mM DCPBに４日間晒したアルブミンはこの特異 的結合については競合しなかった。 実施例9．グリコシル化アルブミンの減少は糖尿病性腎障害を寛解させる 血漿グリコシル化アルブミン濃度が非糖尿病対照において測定されるもののほ ぼ２倍である糖尿病動物を、グリコシル化アルブミンの濃度を正常にまで減少さ せるものの血液グルコース濃度には影響を与えない措置で８週間治療した。腎機 能を検査するために治療の開始時及び終了時に尿及び血液試料を得、血清クレア チニン濃度及びクレアチニンクリアランスにより評価した。表８に示されるよう に、糖尿病動物においてグリコシル化アルブミンを減少させることにより、未処 置糖尿病動物において観察される腎機能の低下が防止された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 3/10 3/10 9/00 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 13/12 13/12 25/00 25/00 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｄ 209/18 Ｃ０７Ｄ 209/18 209/28 209/28 417/12 417/12 //(Ｃ０７Ｄ 417/12 (Ｃ０７Ｄ 417/12 213:74 213:74 279:02） 279:02）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロール酢酸、ヒ ドロキシメチル−ピリジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシド、ジクロロ メチルフェニルアミノ安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン酢酸、クロロ ベンゾイルメトキシ−メチルインドール酢酸およびフルオロメチル−メチルスル フィニル−フェニルメチレン−インデン酢酸の群から選択された抗−非酵素的グ リコシル化アルブミン化合物の、糖尿病性血管疾患、糖尿病性神経疾患、糖尿病 性腎臓疾患および同様の疾患の予防および治療用医薬の製造のための用途。 ２．医薬がアルブミン分子におけるアマドリグルコース付加物の形成を阻害する 請求項１の方法。 ３．アルブミンのアマドリグルコース付加物修飾がリジン１９５、リジン１９９ 、リジン２８１、リジン４３９およびリジン５２５からなる群から選択される１ つ以上の残基において生じる請求項２の方法。 ４．医薬が、生物学的に活性である糖結合アルブミンエピトープであってそれら の細胞関連受容体に結合するエピトープの形成を阻害する請求項１の方法。 ５．ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロール酢酸、ヒ ドロキシメチル−ピリジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシド、ジクロロ メチルフェニルアミノ安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン酢酸、クロロ ベンゾイルメトキシ−メチルインドール酢酸およびフルオロメチル−メチルスル フィニル−フェニルメチレン−インデン酢酸の群から選択された抗−非酵素的グ リコシル化アポＢ／ＬＤＬ化合物の、アテローム硬化性心臓血管疾患の予防およ び治療用医薬の製造のための用途。 ６．ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロール酢酸、ヒ ドロキシメチル−ピリジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシド、ジクロロ メチルフェニルアミノ安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン酢酸、クロロ ベンゾイルメトキシ−メチルインドール酢酸およびフルオロメチル−メチルスル フィニル−フェニルメチレン−インデン酢酸の群から選択された抗−非酵素的グ リコシル化アポＢ／ＬＤＬ化合物の、高コレステロール血症の予防および治療用 医薬の製造のための用途。 ７．医薬がアポＢ／ＬＤＬ分子におけるアマドリグルコース付加物の形成を阻害 する請求項５の方法。 ８．医薬がアポＢ／ＬＤＬ分子におけるアマドリグルコース付加物の形成を阻害 する請求項６の方法。 ９．グリコシル化アルブミンによって生じる糖尿病性血管疾患を予防するための 組成物であって、アルブミンの非酵素的グリコシル化に対して保護する治療上の 分子および治療上許容し得るキャリアーを含む組成物。 １０．治療上の分子が、糖尿病性血管疾患、糖尿病性神経疾患、糖尿病性腎臓疾 患および同様の疾患の予防および治療用医薬の製造のための、ジクロロフェニル アミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロール酢酸、ヒドロキシメチル−ピリ ジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシド、ジクロロメチルフェニルアミノ 安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン酢酸、クロロベンゾイルメトキシ− メチルインドール酢酸およびフルオロメチル−メチルスルフィニル−フェニルメ チレン−インデン酢酸からなる群から選択される請求項９の組成物。 １１．アテローム硬化性心臓血管疾患の予防および治療用組成物であって、アポ Ｂ／ＬＤＬ分子の非酵素的グリコシル化に対して保護する治療上の分子および治 療上許容し得るキャリアーを含む組成物。 １２．治療上の分子が、アテローム硬化性心臓血管疾患の予防および治療用医薬 の製造のための、ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロ ール酢酸、ヒドロキシメチル−ピリジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシ ド、ジクロロメチルフェニルアミノ安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン 酢酸、クロロベンゾイルメトキシ−メチルインドール酢酸およびフルオロメチル −メチルスルフィニル−フェニルメチレン−インデン酢酸からなる群から選択さ れる請求項１１の組成物。 １３．高コレステロール血症の予防および治療用組成物であって、アポＢ／ＬＤ Ｌ分子の非酵素的グリコシル化に対して保護する治療上の分子および治療上許容 し得るキャリアーを含む組成物。 １４．治療上の分子が、アテローム硬化性心臓血管疾患の予防および治療用医薬 の製造のための、ジクロロフェニルアミノベンゼン酢酸、メチルトルイル−ピロ ール酢酸、ヒドロキシメチル−ピリジルカルバモイル−ベンゾチアジンジオキシ ド、ジクロロメチルフェニルアミノ安息香酸、メチル−メチルプロピルベンゼン 酢酸、クロロベンゾイルメトキシ−メチルインドール酢酸およびフルオロメチル −メチルスルフィニル−フェニルメチレン−インデン酢酸からなる群から選択さ れる請求項１３の組成物。