JP2002514209A - 副溝における、キラルヘアピンポリアミドのｄｎａ結合親和性、配列特異性、および配向優先性の立体化学的制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＤＮＡ配列のプロモーター領域の副溝に結合する、γ−アミノ酪酸から誘導されたヘアピンループを含む改良ポリアミドを提供する。プロモーター領域のＤＮＡ配列にポリアミドが結合すると、必須遺伝子の発現が阻害される。改良は、Ｒ−２，４−ジアミノ酪酸およびその２−アミノ基の誘導体を用いてヘアピンループを形成することに関する。改良された非対称ヘアピンは、ポリアミドをより緊密にＤＮＡの副溝に結合させ、さらにたとえばアミド結合を形成することによりポリアミドを誘導体化するためのアミン官能基を提供する。そのような誘導体は検出可能な標識をポリアミドに結合させるのに役立ちうる。

Description

【発明の詳細な説明】 副溝における、キラルヘアピンポリアミドのＤＮＡ結合親和性、配列特異性、 および配向優先性の立体化学的制御 アメリカ合衆国政府は国立衛生研究所が与えた助成金Ｎｏ.ＧＭ ２６４５３ 、２７６８１および４７５３０に従った本発明に一定の権利をもつ。 関連出願の引照 本出願は、国際特許出願第ＵＳ９７／０３３３２号（１９９７年２月２０日出 願）、米国特許出願第０８／８５３，５２２号（１９９７年５月８日出願）およ び国際特許出願第ＵＳ９７／１２７２２号（１９９７年７月２１日出願）［これ らは米国特許出願第０８／８３７，５２４号（１９９７年４月２１日出願）およ び米国特許出願第０８／６０７，０７８号（１９９６年２月２６日出願）の一部 継続出願である］；ならびに米国仮特許出願第６０／０４２，０２２号（１９９ ７年４月１６日出願）および米国仮特許出願第６０／０４３，４４４号（１９９ ７年４月８日出願）の一部継続出願である。これらの出願明細書を本明細書に援 用する。 発明の背景 発明の分野 本発明は、二本鎖ＤＮＡの副溝の予め定められた部位に結合するポリアミドに 関する。関連技術の記述 当技術分野で、３〜６のカルボキシアミド塩基対、およびγ−アミノ酪酸由来 のヘアピンループ、ならびにＤＮＡのプロモーター領域の副溝に結合して遺伝子 発現を阻害する能力をもつ、多様なポリアミドが記載されている。たとえばＮ− メチルイミダゾール（Ｉｍ）、Ｎ−メチルピロール（Ｐｙ）ならびにβ−アラニ ンおよびγ−アミノ酪酸からなるポリアミド、ならびにそのようなポリアミドの 製造方法は周知である。 Ｎ−メチルピロールおよびＮ−メチルイミダゾールアミノ酸を含有するポリア ミドは、ＤＮＡに対し天然のＤＮＡ結合性タンパク質に匹敵する親和性および特 異性をもつ合成リガンドである（Ｔｒａｕｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １９９６， ３８２，５５９；Ｓｗａｌｌｅｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７， １１９，６９５３；Ｔｕｒｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７， １１９，７６３６）。ＤＮＡ認識は、副溝においてＤＮＡらせんの５’−３’方 向に対しＮ−Ｃに配向した並行アミノ酸対合に依存する（Ｗａｄｅ，Ｗ．Ｓ．ら ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，８７８３；Ｍｒｋｓｉｃｈ ら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９９２，８９，７５８ ６；Ｗａｄｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２，１１３８５；Ｍ ｒｋｓｉｃｈら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，２５７２； Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６６，６４６；Ｗ ｈｉｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，８７５６）。イ ミダゾール（Ｉｍ）逆ピロール（Ｐｙ）の逆対合はＧ・Ｃ塩基対を認識し、一方 Ｐｙ／Ｉｍの組合わせはＣ・Ｇ²を認識する。Ｐｙ／Ｐｙ対は縮重性であり、Ａ ・ＴまたはＴ・Ａ塩基対を認識する（Ｗａｄｅ，Ｗ．Ｓ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ ｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１１４，８７８３；Ｍｒｋｓｉｃｈら，Ｐｒｏ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９９２，８９，７５８６；Ｗａｄｅら，Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２，１１３８５；Ｍｒｋｓｉｃｈら，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，２５７２；Ｇｅｉｅｒｓｔａｎ ｇｅｒら，Ｓｃｉｅｎcｅ １９９４，２６６，６４６；Ｗｈｉｔｅら，Ｊ．Ａ ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，８７５６；Ｐｅｌｔｏｎら，Ｐｒｏ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９８９，８６，５７２３；Ｐｅｌ ｔｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９０，１１２，１３９３；Ｗｈｉ ｔｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，３５，１２５３２；Ｃｈｅｎら ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２６７，１１５７）。Ｉｍ／Ｉｍ対合は好 ましくなく、認識の潜在的縮重を破壊する（Ｓｉｎｇｈら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９９４，９１，７６７３；Ｗｈｉｔｅら，Ｃｈ ｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．１９９７，４，５６９）。 研究者らは、ポリアミドサブユニットの共有結合により滑り結合モチーフ（ｓ ｌｉｐｐｅｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ）を阻止し、かつＤＮＡ結合親和性 および配列特異性を高めることも試みた（Ｔｒａｕｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ ｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１６０；Ｇｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒら，Ｎａ ｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９６，３，３２１；Ｓｗａｌｌｅｙら ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１９９７，３，１６０８；Ｗｅｍｍｅｒら，Ｃｕｒｒ ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９７，７，３５５；Ｍｒｋｓｉｃｈ ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，３６６３；Ｄｗｙｅｒら ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，９９００；Ｃｈｅｎら，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，６９９５）。γ−アミノ酪酸（ γ）を含むヘアピンポリアミドモチーフをターン特異性インターナルガイド残基 （ｔｕｒｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｇｕｉｄｅ−ｒｅｓｉｄｕ ｅ）として利用し、合成により実施できるポリアミドサブユニットのＣ−Ｎ結合 方法が提供された（図１）。頭−尾結合したポリアミドは、結合していないサブ ユニットと比較して１００倍高い親和性で、指定ターゲット部位に特異的に結合 する（Ｍｒｋｓｉｃｈら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，７ ９８３；Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１ ４７；Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１５ ３；Ｔｒａｕｇｅｒら，Ｃｈeｍ．＆ Ｂｉｏｌ．１９９６，３，３６９；Ｓｗ ａｌｌｅｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，８１９８；Ｐ ｉｌｃｈら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９９６，９３ ，８３０６；ｄｅ Ｃｌａｉｒｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７， １１９，７９０９）。 Ｃ−末端に正に荷電した第三級アミン基１個を保有する８環ヘアピンポリアミ ドは、細胞透過性であること、および細胞培養において特定の遺伝子の転写を阻 害することが示された（Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄら，Ｎａｔｕｒｅ １９９７，３ ８７，２０２）。しかし、ポリアミドのサイズ制限に関する最近の研究は、５環 を越えるとリガンドの弯曲がＤＮＡらせんのピッチに合わず、特異的ポリアミド −ＤＮＡ複合体形成に関与する水素結合およびファンデルワールス相互作用を妨 げることを示唆している（Ｋｅｌｌｅｙら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃ ｉ．，ＵＳＡ １９９６，９３，６９８１；Ｋｉｅｌｋｏｐｆら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，印刷中）。５つの連続環対合を含む１０環ヘアピ ンポリアミドによる７塩基対の認識が、ヘアピンモチーフによりターゲッティン グできる結合部位サイズの上限である（Ｔｕｒｎｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１９９７，１１９，７６３６）。米国仮特許出願第６０／０４２，２２ ２号に示されるように、β−アラニンとβ−アラニン、ピロールまたはイミダゾ ールとの対合を加えると、ヘアピンモチーフが８−ｂｐ認識にまで延長された。 しかし、より長い部位サイズを認識するヘアピンモチーフの設計には著しい困難 が伴うことは、当業者が認めている。 本発明は、ヘアピンループを形成するγ−アミノ酪酸の代わりとしてＲ−２， ４−ジアミノ酪酸を使用する。さらに、既存のヘアピンモチーフを共有結合させ ることにより、ＤＮＡ結合特異性および配列特異性を損なうことなくヘアピンの ターゲッティング可能な結合部位サイズを拡張する方法が提供される。発明の概要 本発明は、γ−アミノ酪酸から誘導されたヘアピンループを含み、ＤＮＡ配列 のプロモーター領域の副溝に結合する、改良ポリアミドを提供する。ＤＮＡ配列 のプロモーター領域にポリアミドが結合すると、必須遺伝子の発現が阻害される 。この改良は、Ｒ−２，４−ジアミノ酪酸およびその２−アミノ基の誘導体を用 いてヘアピンモチーフを形成することに関する。改良された非対称ヘアピンは、 これらのポリアミドをより緊密にＤＮＡの副溝に結合させ、さらにたとえばアミ ド結合を形成することによりポリアミドを誘導体化するためのアミン官能性を付 与する。この改良された非対称ヘアピンは、親和性または選択性を損なうことな くより長い結合部位を得ることができる、縦列結合した改良ポリアミドの合成法 を提供する。この改良された非対称ヘアピンは、ポリアミドに官能基または検出 可能な基を結合させるのにも役立つ。図面の簡単な説明 図１．Ａ． ＤＮＡ配列５’−ＴＧＴＴＡ−３’へのポリアミド１−Ｒ、Ｉｍ ＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの水素結合モデル。Ｂ．ＤＮ Ａ配列５’−ＴＧＴＴＡ−３’へのポリアミド１−Ｓ、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^{H2 N} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの水素結合モデル。 図２．二本鎖ＤＮＡファンデルワールス表面の副溝に結合した（Ａ）ＩｍＰｙ Ｐｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐおよび（Ｂ）ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐのコンピューター作成モデル。 図３．６環ヘアピンポリアミドの構造。 図４．改良ポリアミドの固相合成経路。 図５．改良ポリアミドを用いたＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）のフットプリント法の結 果。 図６.１３５ｂｐ制限フラグメントへの特定の改良ポリアミドの結合パターン 。 図７．改良ポリアミドおよび３’−³²Ｐ−標識１３５ｂｐ制限フラグメントを 用いたアフィニティー開裂実験。 図８．１μＭ濃度および１０μＭ濃度の特定の改良ポリアミドのアフィニティ ー開裂パターン。 図９．パネルＡ−Ｃは、特定の改良ポリアミドのアフィニティー開裂パターン を示す。 図１０．特定の改良ポリアミドの定量ＤＮアーゼＩフットプリントタイトレー ション。 図１１．ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐの定量ＤＮア ーゼＩフットプリントタイトレーション。 図１２．改良ポリアミドのキラルヘアピン折りたたみモデル。 図１３．縦列結合ポリアミドの水素結合モデル。 図１４．１２環ポリアミド例の構造。 図１５．縦列結合ポリアミドの合成。 図１６.縦列結合ポリアミド例の定量ＤＮＡフットプリントタイトレーション 。 図１７．縦列結合ポリアミドの例。 図１８．プラスミドｐＤＨ１０、ｐＤＨ１１およびｐＤＨ１２の構造。 詳細な説明 本明細書中で別途記載しない限り、本出願の用語および技術説明の定義は幾つ かの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる：たとえばＳａｍｂｒｏｏ ｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１ ９８９）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．ら，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，アカ デミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９１）；“タンパク質 精製の指針”，Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，Ｍ．Ｐ．編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミック・プレス、カリフォルニア州サンディエゴ（１ ９８９）；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，アカデミック・プレス 、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａ１ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版、アラン・リス社、ニューヨーク州ニ ューヨーク（１９８７）；Ｍｕｒｒａｙら，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎ ｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８、ザ・ ヒューマン・プレス社；Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪおよびＬｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎ ｅｓ ＶＩ、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク（１ ９９７）。 本出願の目的に関し、“プロモーター”はＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝 子の転写を開始するのに関与するＤＮＡ調節配列である。“遺伝子”は、ペプチ ド、ポリペプチドまたはタンパク質の産生に関与するＤＮＡのセグメントであっ て、コーディング領域、コーディング領域の前にある非コーディング領域（“リ ーダー”）および後にある非コーディング領域（“トレイラー”）、ならびに個 々のコーディングセグメント(“エキソン”)間に介在する非コーディング配列( “イントロン”)を含む。コーディングとは、３塩基“トリプレット”コードの アミノ酸開始および終止シグナルの提示を表す。プロモーターは対応遺伝子の転 写開 始部位の上流（“５’側”）にある場合が多い。プロモーターのほか他のＤＮＡ 調節配列が知られている。誘導性因子が結合するＤＮＡ配列である応答エレメン トを含めた、転写因子の結合に関与する配列がこれに含まれる。エンハンサーは 、プロモーターの利用性を高めることができ、かつプロモーターに対しいずれの 方向にも（５’−３’または３’−５’）、またいかなる位置でも（上流または 下流）機能しうる、さらに他の一群のＤＮＡ調節配列を含む。好ましくは、調節 配列は正の活性をもつ。すなわち調節配列への内因性リガンド（たとえば転写因 子）の結合は転写を高め、これにより対応ターゲット遺伝子の発現が高まる。そ のような場合、調節配列へのポリペプチドの結合により転写が妨害されると、遺 伝子の発現が低下し、または損なわれるであろう。 プロモーターは当技術分野で“サイレンサー”として知られる調節配列を含む か、またはそれに隣接することもできる。サイレンサー配列は一般に遺伝子発現 に対し負の調節作用をもつ。そのような場合、サイレンサー調節配列への因子の 結合を阻止するポリアミドを用いることにより直接に、またはサイレンサー調節 配列に対する因子の転写を遮断するポリアミドを用いることにより間接的に、遺 伝子の発現を高めることができる。 本発明のポリアミドが二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合することを理解すべき である。特定の配列のＤＮＡセグメント、たとえば５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’の 機能は、ＤＮＡ配列中の他の機能領域に対するこのセグメントの位置に依存する 。この場合、ＤＮＡのコーディング鎖上の配列５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’が転写 開始部位の３０塩基対上流に位置するならば、その配列はプロモーター領域の一 部を形成する（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩ，ｐｐ．８３１−８３５）。他方 、配列５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’が転写開始部位の下流のコーデイング部位内に 、リーディングフレームと適正に合った位置にあるならば、その配列はチロシル およびリシルアミノ酸残基をコードする（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩ，ｐｐ ．２１３−２１５）。 １仮説に固執するのではないが、本発明のポリアミドが結合すると、ＤＮＡ結 合性タンパク質、たとえばＲＮＡポリメラーゼ、転写因子、ＴＢＦ、ＴＦＩＩＩ Ｂその他のタンパク質の結合が変化することにより遺伝子発現が調節されると考 えられる。二本鎖ＤＮＡセグメントへのポリアミド結合が遺伝子発現に与える影 響は、そのＤＮＡセグメントの機能（たとえばプロモーター）に関係すると考え られる。 本発明の改良ポリアミドは、前記のいかなるＤＮＡ配列にも、または遺伝子発 現に対し所期の効果をもつ他のいかなる配列にも結合しうることは、当業者に理 解される。さらに、米国特許第５，５７８，４４４号には、本発明の改良ポリア ミドがターゲッティングする塩基対配列をそれから同定できる多数のプロモータ ーターゲッティング配列が記載されている。 生細胞のＤＮＡの基本構造には主溝と副溝の両方が含まれることは、一般に当 業者に知られている。本発明を記述するにつき、副溝は一般的な分子生物学の参 考文献、たとえばＬｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ ＶＩ、オックスフォード・ユ ニバーシティー・プレス、ニューヨーク（１９９７）に示されるようにＤＮＡの 狭い溝である。 細胞の遺伝子発現に影響を与えるためには（遺伝子発現を高めること、または 低下させることを含みうる）、有効量の１またはそれ以上のポリアミドを細胞と 接触させて、細胞に取り込ませる。細胞をインビボまたはインビトロのいずれで 接触させてもよい。遺伝子発現を調節しうるポリアミドの細胞外有効濃度は、約 １０ｎＭ〜約１μＭである。Ｇｏｔｔｅｓｆｅｌｄ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ，３８７，２０２−２０５（１９９７）。インビトロでのポリアミドの有効量お よび有効濃度を決定するためには、適切な数の細胞を組織培養平板に接種し、種 々の量の１またはそれ以上のポリアミドを別個のウェルに添加する。特異的抗体 を用いた各種技術（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む）により測定し たタンパク質遺伝子産物の存在量を検出することにより、ポリアミド暴露後の遺 伝子発現を細胞または培地中において監視することができる。あるいは、ノーザ ンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲを含めた各種技術により測定したメッセンジャー ＲＮＡの存在量を検出することにより、ポリアミド暴露後の遺伝子発現を監視す ることができる。 同様にインビボ投与のためのポリアミドの有効量および有効濃度を決定するた めには、身体組織または体液、たとえば血漿、血液、尿、脳脊髄液、唾液、また は皮膚バイオプシー、筋肉、肝臓、脳その他の適切な組織源の試料を分析する。 特異的抗体を用いた各種技術（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを含む）に より測定したタンパク質遺伝子産物の存在量を検出することにより、ポリアミド 暴露後の遺伝子発現を監視することができる。あるいは、ノーザンブロットおよ びＲＴ−ＰＣＲを含めた各種技術により測定したメッセンジャーＲＮＡの存在量 を検出することにより、ポリアミド暴露後の遺伝子発現を監視することができる 。 本発明のポリアミドを、インビボまたはインビトロで使用するための診断用お よび療法用組成物中に配合することができる。代表的な配合方法は、Ｒｅｍｉｎ ｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａ ｒｍａｃｙ，第１９版、マック・パブリシング社、ペンシルベニア州イーストン （１９９５）中にみられる。 インビボで使用するためには、これらのポリアミドを生理学的に許容しうる薬 剤組成物中に配合し、処置を要する患者または動物に医療または研究の目的でこ れを投与することができる。これらのポリアミド組成物は、薬剤学的に許容しう るキャリヤー、賦形剤、佐剤、安定剤およびビヒクルを含む。組成物は固体、液 体、ゲルまたはエーロゾルの形であってよい。本発明のポリアミド組成物は、種 々の剤形で、経口、非経口、吸入スプレーにより、直腸に、または局所に投与で きる。本明細書中で用いる非経口という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨 内、注入法、または腹腔内が含まれる。 厳密な濃度、組成および送達方式の選択は、選択した特定の化合物に固有の薬 理学的特性、意図する用途、処置または診断する状態の性質および程度、意図す るレシピエントの年齢、体重、性別、身体条件および精神の明瞭度、ならびに投 与経路により影響される。そのような考慮は当業者が容易になしうる範囲のもの である。たとえば投与方式は広範に変更できるが、標準法によりルーティンに決 定できる。 本発明のポリアミドは、診断または調製の目的で特定の配列の二本鎖ＤＮＡの 存在を検出するのにも有用である。二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、固体支持体 に結合したポリアミドを接触させ、これにより目的配列を含むＤＮＡを単離でき る。あるいは、適切な検出可能なマーカー、たとえばビオチン、ハプテン、放射 性同位体または色素分子に結合したポリアミドに、二本鎖ＤＮＡを含有する試料 を接触させることができる。 二官能性の配列特異性ＤＮＡ結合分子の設計には、２つの別個の実体、すなわ ち認識活性と機能活性を統合する必要がある。ナノモル以下の親和性で予め定め た二本鎖ＤＮＡ配列の副溝に特異的に結合するポリアミドを一官能性分子に結合 させると、分子生物学、ゲノム配列決定、およびヒトの医薬として有用な、対応 する二官能性コンジュゲートが得られる。本発明のポリアミドを多様な官能性分 子に結合させることができ、これは以下のものから独立して選択できるが、これ らに限定されない：アリールボロン酸（ａｒｙｌｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、 ビオチン、アミノ酸２〜８個からなるポリヒスチジン、抗体が結合しうるハプテ ン、固相支持体、オリゴヌクレオチド、Ｎ−エチルニトロソ尿素、フルオレセイ ン、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、ＤＬ−α−リポ酸、アクリジン 、カプトテシン（ｃａｐｔｏｔｈｅｓｉｎ）、ピレン、マイトマイシン、テキサ ス・レツド、アントラセン、アントリニル酸（ａｎｔｈｒｉｎｉｌｉｃ ａｃｉ ｄ）、アビジン、ＤＡＰＩ、イソスルファン・ブルー、マラカイト・グリーン、 プソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）、エチル・レッド、４−（プソラエン−８−イ ルオキシ）−ブチラート、酒石酸、（＋）−α−トコフェラール、プソラレン、 ＥＤＴＡ、メチジウム、アクリジン、Ｎｉ（ＩＩ）・Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ、 チアゾール・オレンジ（ＴＯ）、ダンシル（Ｄａｎｓｙｌ）、ピレン、Ｎ−ブロ モアセトアミド、および金粒子。そのような二官能性ポリアミドは、ＤＮＡアフ ィニティー捕獲、共有ＤＮＡ修飾、酸化的ＤＮＡ開裂、ＤＮＡ光開裂に有用であ る。そのような二官能性ポリアミドは、検出可能な標識に結合したポリアミドを 提供することにより、ＤＮＡを検出するのに有用である。そのような二官能性ポ リアミドの合成に関する詳細な指示は、出願中の米国仮特許出願第６０／０４３ ，４４４号中にみられ、その教示を本明細書に援用する。 次いで、標識ポリアミドに複合体形成したＤＮＡを、当業者に周知の適切な検 出系により測定できる。たとえばビオチンに結合したポリアミドと結合したＤＮ Ａは、ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ系により検出できる。 本発明は、身体試料、たとえば脳組織、細胞懸濁液もしくは組織切片、または 体液試料、たとえばＣＳＦ、血液、血漿もしくは血清中における、本発明のポリ アミドが結合した二本鎖ＤＮＡ配列の存在をアッセイするための診断系（好まし くはキットの形のもの）をも記載する。その際、本明細書に記載した診断方法に 従ってこれらの試料中における本発明のポリアミドが結合した二本鎖ＤＮＡ配列 の存在、好ましくは量を検出することが望ましい。 この診断系には、少なくとも１回のアッセイを行うのに十分な量の特異的ポリ アミドが別個にパッケージされた試薬として含まれる。一般にこの（これらの） パッケージされた試薬の使用指示書も入れられる。本明細書中で用いる“パッケ ージ”という用語は、本発明のポリアミドを一定区域内に保持しうる固体マトリ ックスまたは材料、たとえばガラス、プラスチック（たとえばポリエチレン、ポ リプロピレンまたはポリカーボネート）、紙、箔などを表す。たとえばパッケー ジはミリグラム量の意図するポリアミドを収容するのに用いるガラスバイアルで あってもよく、マイクログラム量の意図するポリアミドを作動可能な状態で固定 した（すなわちターゲットＤＮＡ配列が結合しうるように結合した）マイクロタ イタープレートウェルであってもよい。“使用指示書”には一般に、試薬濃度、 または少なくとも１つのアッセイ方法パラメーター、たとえば試薬と混合すべき 試料との相対量、試薬または試料の混合物の保持期間、温度、緩衝液条件などを 記載した確実な表現が含まれる。本発明の診断系には好ましくは、検出可能な標 識、およびターゲットＤＮＡ配列への意図する本発明ポリアミドの結合をシグナ ル化しうる検出手段または指示手段も含まれる。前記のように、多数の検出可能 な標識、たとえばビオチン、および検出手段または指示手段、たとえば酵素結合 （直接または間接）ストレプトアビジンが当技術分野で知られている。 Ｔｒａｕｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，３８２：５５９−５６１）およびＳｗａｌ ｌｅｙら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９，６９５３−６９６１）は、 ナノモル以下の濃度の特定のポリアミドによるＤＮＡ認識につき記載している。 対合特異性カルボキシアミド基により、特異的ＤＮＡ配列を認識できる（Ｓｗａ ｌｌｅｙら、前掲）。Ｈｐ、ＩｍおよびＰｙを含むポリアミドは、予め定めたＤ ＮＡ配列を高い親和性および特異性でコード化ターゲッティングすることができ る。Ｈｐ、ＩｍおよびＰｙポリアミドを組み合わせて、４つのワトソン−クリッ ク塩基対Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに相補的なＩｍ／Ｐｙ、Ｐｙ／Ｉｍ、Ｈｐ／Ｐｙ、 およびＰｙ／Ｈｐ結合対を形成することができる。表１にそのような対合を示す 。 表 １ 塩基対認識のための対合コード^{* *}好まれる（＋）、好まれない（−） 本発明の改良３−、４−、５−または６環ポリアミドが共有結合して、それそ れ６−、８−、１０−または１２環構造を形成し、これらがナノモル以下の濃度 でそれぞれ４〜６塩基対ターゲットに特異的に結合する。したがって本発明の改 良ポリアミドは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴからなるいかなるＤＮＡ配列をも目標とす ることができる。 本発明の改良ポリアミドは、二本鎖遺伝子配列の調節配列の副溝においてＤＮ Ａを結合するための少なくとも３つの連続カルボキシアミド対合、および分子の キラルヘアピンターンのγ−位において２，４−ジアミノ酪酸のＲ−鏡像異性体 （Ｈ₂ＮＨＣＨＣＨ₂ＣＨＮＨ₂−ＣＯＯＨ；“（Ｒ）^H2Nγ”）で置換された立体 化学中心をもつキラルヘアピンターンを有するものを含む。さらに、本発明はＤ ＮＡ結合特異性および配列特異性を損なうことなく既存のヘアピンモチーフに共 有結合する方法を提供する。本発明は、ＤＮＡの副溝に結合して遺伝子発現に影 響を与える改良ポリアミドを提供する。好ましくは、結合したポリアミドは遺伝 子発現を阻害する。 本発明は、３−または４環ポリアミド構造が共有結合してそれぞれ６−、８− １０−または１２環ヘアピン構造を形成した一般式Ｉ〜ＶＩＩＩの改良ポリアミ ドを含む： これらの式中、Ｘ_{1 〜12}およびＸ’_{1 〜12}は独立してイミダゾール、たとえばＮ− メチルイミダゾール（Ｉｍ）、ピロール、たとえばＮ−メチルピロール（Ｐｙ） 、またはヒドロキシピロール、たとえば３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルピロール（ Ｈｐ）である。さらに、本発明の改良ポリアミドは脂肪族アミノ酸、たとえばβ −アラニン残基（β）、アミド基、たとえばジメチルアミノプロピルアミド（Ｄ ｐ）、アルコール類、たとえばＥｔＯＨ、酸、たとえばＥＤＴＡ、またはβ残基 に結合しうるそのいずれかの誘導体をさらに含むことができる。 式Ｉ〜ＶＩＩＩにおいて、ピロールアミノ酸の代わりにβ−アラニンを用いて もよい。この合成法においてピロールまたはヒドロキシピロールアミノ酸の代わ りにβ−アラニンを用いると、芳香族／脂肪族対合（Ｘｍ／β、β／Ｉｍ、Ｐｙ ／β、およびβ／Ｐｙ）および脂肪族／脂肪族対合（β／β）置換が得られる。 そのような置換は米国仮特許出願第６０／０４２，０２２号に記載されたものを 含むことができ、これを本明細書に援用する。γ−アミノ酪酸、または置換γ− アミノ酪酸、たとえば（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸を用いると、好ましいヘア ピンターンが得られる。本発明を実施するのに適した他の多数の基が当業者に周 知であり、広く入手できる。 前記のポリアミドサブユニット構造Ｉ〜ＶＩＩＩは、γ−アミノ酪酸から誘導 された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ−ヘアピン連結、またはＲ−２ ，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘアピン連結であるγ一残基を介して 共有結合する。本発明は、特定のポリアミドのγ−残基を（Ｒ）−２，４−ジア ミノ酪酸（（Ｒ）^H2Nγ）などの部分で置換するための試薬および方法を提供す る。５’−ＴＧＴＴＡ−３’ターゲット部位と複合体形成した配列組成ＩｍＰｙ Ｐｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙのヘアピンポリアミドのＮＭＲ構造は、ヘアピン−ＤＮ Ａ複合体内のγ−アミノ酪酸残基のα−位が置換可能であることを示した（ｄｅ Ｃｌａｉｒｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，７９０９ ）。モデル形成により、α−炭素にＲ−立体配置を与えうるアミノ酸によりγの α−Ｈを交換すると、図１および２のＡに示すように副溝の床と壁の中に収容で きることが示された。これに対し、（Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸（（Ｓ）^H2N γ）結合ヘアピンは、図１および２のＢに示すようにＤＮＡらせんの副溝の壁と ぶつかると推定される。 式Ｖ〜ＶＩＩＩにおいて、Ｌは第１ポリアミドのγ−残基および第２ポリアミ ドのカルボキシテイルに結合したアミノ酸連結基、たとえばβ−アラニンまたは ５−アミノ吉草酸（δ）を表す。このように２以上のポリアミドが結合して縦列 結合ポリアミドを形成することができる。そのようなポリアミドを縦列結合（ｔ ａｎｄｅｍｌｙ−ｌｉｎｋｅｄ、ｔａｎｄｅｍ−ｌｉｎｋｅｄ）ポリアミドとい う。 Ｐは、第２ポリアミドに縦列結合しうる式Ｉ〜ＶＩＩＩのポリアミド０〜１０ 個を表す。好ましくは、Ｐは式Ｉ〜ＶＩＩＩのポリアミド０〜８個を表す。より 好ましくはＰは式Ｉ〜ＶＸＩＩのポリアミド０〜６個を表す。より好ましくはＰ は式Ｉ〜ＶＩＩＩのポリアミド０〜４個を表す。最も好ましくはＰは式Ｉ〜ＶＩ ＩＩのポリアミド０〜２個を表す。ポリアミドの縦列結合により、選択性を損な うことなく結合部位サイズが拡大し、かつ結合親和性が高まる。本発明を実施す るのに適した他の多数の基が当業者に周知であり、広く入手できる。 Ｂａｉｒｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：６１４１−６１４６ ）および国際特許出願第ＵＳ９７／００３３３２号には、本発明のポリアミドを 製造するのに適したポリアミド合成法が記載されている。本発明のポリアミドは 、Ｂｏｃ-保護された３−メトキシピロール、イミダゾールおよびピロール芳香 族アミノ酸などの化合物を用いる固相法により合成し、支持体からアミノリシス により開裂させ、ナトリウムチオフェノキシドで脱保護し、逆相ＨＰＬＣにより 精製することができる。ポリアミドの同一性および純度は、当業者が利用できる 多様な分析法、たとえば¹Ｈ−ＮＭＲ、分析用ＨＰＬＣ、および／またはマトリ ックス介助レーザーデソープションイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ ＭＳ−モノアイソトロピック）により確認できる。 本明細書に記載するのは、新規な一群のキラルヘアピンポリアミドの合成、な らびにＤＮＡ結合親和性および配列特異性に関するそれらの特性の解明である。 本発明は、プロキラル（ｐｒｏｃｈｉｒａｌ）γーターンを２，４−ジアミノ酪 酸のいずれかの鏡像異性体で置換するための試薬および方法を当業者に提供する 。さらに本発明は、固相法で合成できるジカチオン６環鏡像異性体ポリアミド（ ＋）−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｒ）、およ び（−）−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）を 提供する。特定の実験においては、Ｃ−末端に電荷をもたないモノカチオンポリ アミド（＋）−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−ＥｔＯＨ（２ −Ｒ）を製造し、対照として使用できる。立体効果をさらに調べるために、γ− アセトアミドポリアミド（＋）−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ−β −Ｄｐ（３−Ｒ）、および（−）−ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ− β−Ｄｐ（３ −Ｓ）を使用できる（図３；Ｂａｉｒｄら，１９９６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ ｏｃ．，１１８：６１４１）。本発明はさらに、特異的ＤＮＡ結合部位で修飾さ れたヘアピンの結合配向性を確認するのに利用できるＥＤＴＡ類似体ＩｍＰｙＰ ｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）（４−Ｒ ・Ｆｅ（ＩＩ））、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−Ｅ ＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）（４−Ｓ・Ｆｅ（ＩＩ））、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^{EDTA・F e(II)} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（５−Ｒ−Ｆｅ（ＩＩ））、およびＩｍＰｙ Ｐｙ−（Ｓ）^{EDTA・Fe(II)}γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（５−Ｓ−Ｆｅ（ＩＩ） ）を提供する（図３）。 本発明の縦列結合ポリアミドも本発明により提供される。第一級ターンアミノ 基は、２つのヘアピンを共有束縛するのに有効な部位を提供する。１つの可能な 結合様式では、第１ヘアピンのＣ−末端が第２アミノ酸リンカーのγーターンの α−アミノ基に結合する。本発明は、１２環ポリアミド、たとえばＩｍＰｙＰｙ −（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2NγＰｙＰｙＰｙ−β］^HNγＰｙＰｙＰｙ− β-Ｄｐ、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2NγＰｙＰｙＰ ｙ−δ］^HNγＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを提供する（図１４）。本発明の特定のポ リアミドのＤＮＡ結合特性を、１０、１１および１２塩基対ターゲット部位を含 む一連のＤＮＡフラグメントにつき測定した。本発明はさらに、親和性開裂誘導 体の一例ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^EDTAγＰｙＰｙＰｙ−δ ］^HNγＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを提供し、これは、縦列結合ポリアミドにつき推 定される単一の結合配向を確認するのに用いられる。改良された縦列ポリアミド のＤＮＡ結合親和性および配列選択性を測定する方法も提供される。 本発明は、より効率的なポリアミドを設計する際の指針として利用できるキラ ル構造エレメントの特性を当業者に明らかにする。たとえば本発明は、（Ｒ）^{H2 N} γターンアミノ酸上に、非置換−親ヘアピンと比較してＤＮＡ結合親和性およ び配列選択性を高めるアミン置換基を付与し、最適な一群のヘアピンポリアミド を提供する。また（Ｒ）^H2Nγに、親ヘアピンと比較して親和性または選択性を 損なわないアセトアミド置換基を付与し、分子の‘キャップ付き’末端に好都合 な合成結合点を提供する。さらに本明細書に記載する発明は、親ヘアピンと比較 して高い親和性で逆配向部位に結合する（Ｓ）^H2Nγ−結合ヘアピン、および親 ヘアピンと比較して高い特異性で結合する（Ｒ）^H2Nγ−結合ヘアピンを提供し 、これはγ−ターン置換基がヘアピンポリアミド結合配向の優先性を調節しうる ことを示す。本発明はさらに、配列選択性を損なうことなくポリアミド結合部位 数を高め、かつ親和性を高めるために、縦列結合ポリアミドの開発に必要な道具 および方法を当業者に提供する。 以上に挙げた例および以下に示す例は本発明の特定の態様を表すにすぎず、本 明細書および請求の範囲を限定するものでは決してない。 実施例 実施例１ 改良ポリアミドの合成 ２種類のポリアミド樹脂ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐ ａｍ−樹脂およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹 脂を、Ｂｏｃ−β−アラニン−Ｐａｍ−樹脂（樹脂１ｇ、置換度０．２ｍｍｏｌ ／ｇ）から、先に記載されたＢｏｃ−化学−機械介助（ｍａｃｈｉｎｅ−ａｓｓ ｉｓｔｅｄ）プロトコールにより１４工程で合成した（図４；Ｂａｉｒｄら，Ｊ ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：６１４１）。（Ｒ）−および （Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸残基を、直交保護（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）Ｎ−γ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−γ−Ｂｏｃ誘導体（ＨＢＴＵ，Ｄ ＩＥＡ）として導入した。Ｆｍｏｃ保護ポリアミド樹脂ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^{Fm oc} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Fmocγ−Ｐ ｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂を、１：４ ＤＭＦ：ピペリジンで処理して（２ ２℃、３０分）、それぞれＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐ ａｍ−樹脂およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂 を得た。この樹脂エステル結合の１工程アミノリシスにより、ポリアミドを固体 支持体から開裂させた。樹脂（２４０ｍｇ）の試料をジメチルアミノプロピルア ミンで処理して（５５℃、１８時間）１−Ｒ、１−Ｓ、３−Ｒおよび３−Ｓを、 またはエタノールアミンで処理して（５５℃、１８時間）２−Ｒを得た。樹脂開 裂生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰ ｙＰｙ− β−Ｄｐ（１−Ｒ）、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（ １−Ｓ）、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−ＥｔＯＨ（ ２−Ｒ）を得た。１−Ｒの立体化学的純度は＞９８％であることがモッシャー（ Ｍｏｓｈｅｒ）アミド分析により判定された（Ｄａｌｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ ．Ｓｏｃ．，１９７３，９５：５１２；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，Ａｓｙｍｍｅｔ ｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｖｏｌ．１），Ａｎａ１ｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈ ｏｄｓ，ｐ．１２５−１５２，Ｊ．Ｄ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（編）アカデミック・ プレス（１９８３））。１−Ｒ，Ｒおよび１−Ｒ，Ｓモッシャーアミドは、１− Ｒと、系内で（Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸 および（Ｓ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸から形 成したＨＯＢｔ活性化エステルとの反応により製造された。カルボキシ末端がＥ ＤＴＡで修飾された類似体を合成するために、アミン−樹脂をＢｏｃ−無水物で 処理して（ＤＭＦ、ＤＩＥＡ、５５℃、３０分）、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ −ｐｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−ＰｙＰ ｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂を得た（図４）。次いでＢｏｃ−樹脂の試料を３，３ ’−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンで開裂させ（５５℃、１８時間）、 逆相ＨＰＬＣで精製して、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄ ｐ−ＮＨ₂（１−Ｒ−Ｂｏｃ−ＮＨ₂）またはＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＮＨ₂（１−Ｓ−Ｂｏｃ−ＮＨ₂）を得た。これらはＣ−末 端に合成後修飾に適した遊離第一級アミン基を与える。これらのポリアミドアミ ン１−Ｒ−Ｂｏｃ−ＮＨ₂および１−Ｓ−Ｂｏｃ−ＮＨ₂を過剰のＥＤＴＡ−二無 水物で処理し（ＤＭＳＯ／ＮＭＰ、ＤＩＥＡ、５５℃、１５分）、残留する無水 物を加水分解した（０．１Ｍ ＮａＯＨ、５５℃、１０分）。Ｂｏｃで保護され たＥＤＴＡ修飾ポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄ ｐ−ＥＤＴＡ（４−Ｒ−Ｂｏｃ）およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−ＰｙＰｙ Ｐｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ（４−Ｓ−Ｂｏｃ）をＨＰＬＣにより単離した。各Ｂ ｏｃ−ＥＤＴＡ−ポリアミドを生のＴＦＡで脱保護して（２２℃、１時間）、各 Ｃ−末端ＥＤＴＡ誘導体ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ −ＥＤＴＡ（４−Ｒ）、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β −Ｄｐ−ＥＤＴＡ（４−Ｓ）を得た。アセトアミド−ターンまたはＥＤＴＡ−タ ーン誘導体を合成するために、、γ−アミノポリアミドの試料ＩｍＰｙＰｙ−（ Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｒ）、またはＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^{H 2N} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）を過剰の無水酢酸またはＥＤＴＡ−二 無水物で処理し（ＤＭＳＯ／ＮＭＰ、ＤＩＥＡ、５５℃、３０分）、残留する無 水物を加水分解した（０．１Ｍ ＮａＯＨ、５５℃、１０分）。次いでポリアミ ドＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（３−Ｒ）、ＩｍＰｙＰ ｙ−（Ｓ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（３−Ｓ）、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^{ED TA} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（５−Ｒ）、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^EDTAγ −ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（５−Ｓ）を、逆相ＨＰＬＣにより単離した。本明細 書に記載する６環ヘアピンポリアミドは、３７℃において１０ｍＭ濃度で水溶液 中に溶解する。 Ａ．材料 ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール （ＨＯＢｔ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３ −テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）および０． ２ｍｍｏｌ／ｇ Ｂｏｃ−β−アラニン−（４−カルボキシアミドメチル）−ベ ンジル−エステル−コポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）樹脂（Ｂｏｃ−γ− Ｐａｍ−樹脂）はペプタイズ・インターナショナルから、（０．２ｍｍｏｌ／ｇ ）（Ｒ）−２−Ｆｍｏｃ−４−Ｂｏｃ−ジアミノ酪酸、（Ｓ）−２−Ｆｍｏｃ− ４−Ｂｏｃ−ジアミノ酪酸、および（Ｒ）−２−アミノ−４−Ｂｏｃ−ジアミノ 酪酸はバケムから、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ，Ｎ −ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ＤＭＳ Ｏ／ＮＭＰ、無水酢酸（Ａｃ₂Ｏ）および０．０００２Ｍシアン化カリウム／ピ リジンはアプライド・バイオシステムズから購入された。ジクロロメタン（ＤＣ Ｍ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）はＥＭから、チオフェノール（ＰｈＳＨ ）、ジメチルアミノプロピルアミン（Ｄｐ）、（Ｒ）−α−メトキシ−α−（ト リフルオロメチル）フェニル酢酸（（Ｒ）ＭＰＴＡ）および（Ｓ）−α−メトキ シ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸（（Ｓ）ＭＰＴＡ）はアルドリッ チか ら得た試薬用であり、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はハロカーボンから、フェノ ールはフィッシャーから、ニンヒドリンはパースから得た生物用であった。試薬 はすべてそれ以上精製せずに使用された。 クイック−セプ（Ｑｕｉｋ−Ｓｅｐ）ポリプロピレン製使い捨てフィルターは アイソラボ社から購入された。手動による固相合成のための振とう器はセント・ ジョーン・アソシエーツ社から購入された。＃２焼結ガラスフリットを備えたス クリュー・キャップ付きガラス製ペプチド合成反応器（５ｍＬおよび２０ｍＬ） はＫｅｎｔ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８，５７，９５７）の 記載に従って作成された。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルはゼネラル・エレクトリック ＱＥ ＮＭＲ分光計により３００ＭＨｚで記録され、化学シフトを残留溶剤に対 するｐｐｍで報告する。ＵＶスペクトルは水中でヒューレット・パッカード、モ デル８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計により測定された。旋光度はＪＡＳ ＣＯ Ｄｉｐ １０００ディジタル・ポラリメーター（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｏｌ ａｒｉｍｅｔｅｒ）により記録された。マトリックス介助レーザーデソープショ ンイオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、カリフォルニア・イ ンスティチユート・オブ・テクノロジーの蛋白質およびペプチド微量分析施設で 行われた。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰ １０９０Ｍ分析用ＨＰＬＣまたはベックマン ・ゴールド・システムにより、ＲＡｆＮＥＮ Ｃ₁₈、マイクロソルブ（Ｍｉｃｒ ｏｓｏｒｂ）ＭＶ、５μｍ、３００×４．６ｍｍ逆相カラムを用いて、溶離剤と してのアセトニトリルを含む０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ中、流速１．０ｍL／分 、濃度勾配溶離１．２５％アセトニトリル／分で行われた。調製用逆相ＨＰＬＣ はベックマンＨＰＬＣにより、ウォーターズ、デルタパック（ＤｅｌｔａＰａｋ ）２５×１００ｍｍ、１００μｍ Ｃ１８カラム（ガード付き）、０．１％（ｗ ／ｖ）ＴＦＡ、０．２５％アセトニトリル／分で行われた。蒸留水はミリポア、 ミリキュー（ＭｉｌｌｉＱ）水精製システムから得た。緩衝液はすべて０．２μ ｍでろ過された。 酵素はベーリンガー・マンハイムから購入され、それらの供給された緩衝液と 共に使用された。デオキシアデノシンおよびチミジン５’−［γ³²Ｐ］トリホス フェート類をアマシャムから入手し、デオキシアデノシン５’−［γ³²Ｐ］トリ ホスフェートをＩ．Ｃ．Ｎ．から購入した。超音波処理した脱イオン仔ウシ胸腺 ＤＮＡはファルマシアから入手された。ＲＮアーゼを含まない水をＵＳＢから入 手し、すべてのフットプリント反応に用いた。他の試薬および材料はすべて受け 取ったままの状態で使用された。ＤＮＡ操作はすべて標準プロトコールに従って 行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．；Ｍａｎｉａｔ ｉｓ，Ｔ．，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎｇ，コールド・スプリング・ハ ーバー・ラボラトリー、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９ ８９）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂を機械介助固 相法で段階的に合成した（Ｂａｉｒｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９ ９６，１１８：６１４１）。Ｂｏｃ−γ−アミノ酪酸につき先に記録したように 、（Ｒ）−２−Ｆｍｏｃ−４−Ｂｏｃ−ジアミノ酪酸（０．７ｍｍｏｌ）を取り 込ませた。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をガ ラス製２０ｍＬペプチド合成反応器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）、続いてピペリジ ン（８ｍＬ）で処理し、撹拌した（２２℃、３０分）。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^{H2 N} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をろ過により単離し、過剰のＤＭＦ、Ｄ ＣＭ、ＭｅＯＨおよびエチルエーテルで順に洗浄し、このアミン樹脂を真空中で 乾燥させた。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂の 試料（２４０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を生のジメチルアミノプロピルアミ ン（２ｍＬ）で処理し、定期的に撹拌しながら１６時間加熱した（５５℃）。樹 脂置換度は、Ｌ_new（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｌ_old／（１＋Ｌ_old（Ｗ_new−Ｗ_old）× １０^-3）として計算できる。式中、Ｌは負荷量（アミンｍｍｏｌ／樹脂ｇ）、Ｗ は樹脂に結合した成長しつつあるポリアミドの重量（ｇ ｍｏｌ^-1）である（Ｂ ａｒｌｏｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９ ９１，３７：５１３）。反応混合物をオーブンに入れ、定期的に撹拌した（５５ ℃、１６時間）。次いで反応混合物をろ過して樹脂を除き、０．１％（ｗ／ｖ） ＴＦＡを添加し（６ｍＬ）、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製した。適切 な画 分を凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐが 白色粉末（３２ｍｇ，回収率６６％）として回収される。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），９９２．５（計算値９９２ ．５；Ｃ₄₇Ｈ₆₂Ｎ₁₇Ｏ₈につき）。 ヘアピンポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（ １−Ｒ）と５’−ＴＧＴＴＡ−３’部位の間に形成された１：１ ポリアミド： ＤＮＡ複合体の水素結合モデルを図１Ａに示す。プリンのＮ₃とピリミジンのＯ₂ の孤立電子対を点付き円として示す。グアニンのＮ₂水素を“Ｈ”入り円として 示し、推定水素結合を点線で示す。模式結合モデルも示し、ここではイミダゾー ル環とピロール環をそれぞれ黒丸と白丸で表し、β−アラニン残基を白ひし形と して表す。図２はインサイトＩＩ（ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ）ソフトウェアを用いた ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ・５’−ＴＧＴＴＡ−３’のＮＭＲ 構造配位体から求めたモデルを示す。図３には２−Ｒポリアミドの構造を示す。 （Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸（１１７ｍ ｇ，０．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（７０ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ １ ｍＬ）に溶解し、ＤＣＣ（１００ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を ２２℃で３０分間撹拌した。この活性化エステル溶液の試料（１００μＬ，０． ０５ｍｍｏｌ）をＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ １− Ｒ（１０ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）に添加し、ＤＩＥＡ（５０μＬ）を添加し、 この溶液を３時間（２２℃）撹拌した。次いでＤＭＦ（１ｍＬ）、続いて０．１ ％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ（６ｍＬ）を反応混合物に添加し、得られた溶液を逆相ＨＰ ＬＣ（１％アセトニトリル／分）により、ジアステレオマーを分離すると判定さ れた条件下で精製した。適切な画分を凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^{(R )MTPA} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐが白色粉末（６ｍｇ，回収率５３％）として 回収される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１２０８．５（計算値１２ ０８．５；Ｃ₅₇Ｈ₆₈Ｆ₃Ｎ₁₇Ｏ₁₀につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^(S)MTPAγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを（Ｓ）−α−メ トキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニル酢酸から、１−Ｒ，Ｒにつき記載 したように製造した（５ｍｇ，回収率４５％）。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１２０９．０（計算値１２ ０８．５；Ｃ₅₇Ｈ₆₈Ｆ₃Ｎ₁₇Ｏ₁₀につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを、１−Ｒにつき記載 したように製造した（２３ｍｇ，回収率４９％）。［α］²⁰ _D−１４．２（ｃ０ ．０４，Ｈ₂Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）は１−Ｒに一致；ＭＡＬＤＩ −ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），９９２．５（計算値９９２．５；Ｃ₄₇ Ｈ₆₂Ｎ₁₇Ｏ₈につき）。図２Ｂに、ＤＮＡ配列５’−ＴＧＴＴＡ−３’に対する ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）ポリアミドの 水素結合モデルを示す。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂の試料（２４０ ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を生のエタノールアミン（２ｍＬ）で処理し、定 期的に撹拌しながら１６時間加熱した（５５℃）。次いで反応混合物をろ過して 樹脂を除き、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ（６ｍＬ）を添加し、得られた溶液を逆 相ＨＰＬＣにより精製し、適切な画分を凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2N γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−ＥｔＯＨが白色粉末（２１ｍｇ，回収率４６％）と して回収された。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），９５１．４（計算値９５１ ．４；Ｃ₄₄Ｈ₅₅Ｎ₁₆Ｏ₉につき）。この２−Ｒポリアミドを図３に示す。 ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中におけるＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ− β−Ｄｐの試料（４ｍｇ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中における無水酢酸（１ｍＬ） およびＤＩＥＡ（１ｍＬ）の溶液で処理し、定期的に撹拌しながら３０分間加熱 した（５５℃）。残留する無水酢酸を加水分解し（０．１Ｍ ＮａＯＨ，１ｍＬ ，５５℃，１０分）、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ（６ｍＬ）を添加し、得られた 溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製し、適切な固分を凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ −（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐが白色粉末（２ｍｇ，回収率５０％） として回収された。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（平均），１０３５．１（計算値１０３５．２；Ｍ＋ Ｈにつき）。この３−Ｒポリアミドを図３に示す。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Axγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを、３−Ｒにつき記載し たように製造した（２ｍｇ，回収率５０％）。［α］²⁰ _D−１６．４（ｃ０．０ ７，Ｈ₂Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）は３−Ｒに一致；ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１０３４．６（計算値１０３４．５；Ｃ₄₉ Ｈ₆₄Ｎ₁₇Ｏ₉につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂の試料（３０ ０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を、ＤＭＦ（４ｍＬ）中におけるＢｏｃ−無水 物（５００ｍｇ）およびＤＩＥＡ（１ｍＬ）の溶液で処理し、定期的に撹拌しな がら３０分間加熱した（５５℃）。樹脂置換度は、Ｌ_new（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ｌ_{o ld} ／（１＋Ｌ_old（Ｗ_new−Ｗ_old）×１０^-3）として計算できる。式中、Ｌは負 荷量（アミンｍｍｏｌ／樹脂ｇ）、Ｗは樹脂に結合した成長しつつあるポリアミ ドの重量（ｇ ｍｏｌ^-1）である（Ｂａｒｌｏｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄ ｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９１，３７：５１３参照）。ＩｍＰｙＰｙ −（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をろ過により単離し、過剰の ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨおよびエチルエーテルで順に洗浄し、真空中で乾燥さ せた。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂の試料（ ２４０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）を生の３，３’−ジアミノ−Ｎ−メチルジ プロピルアミン（２ｍＬ）で処理し、定期的に撹拌しながら１６時間加熱した（ ５５℃）。次いで反応混合物をろ過して樹脂を除き、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ を添加し（６ｍＬ）、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製し、適切な画分を 凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＮＨ₂ が白色粉末（１８ｍｇ，回収率３６％）として回収された。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１１３５．３（計算値１１ ３５．６；Ｃ₅₄Ｈ₇₅Ｎ₁₈Ｏ₁₀につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＮＨ₂を、４−Ｒにつ き記載したように製造した（１６ｍｇ，回収率３２％）。［α］²⁰ _D−３０（ｃ ０．０５，Ｈ₂Ｏ）；¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）は４−Ｒ−Ｂｏｃ−ＮＨ₂に 一致；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１１３５．４（計算 値１１３５．６；Ｃ₅₄Ｈ₇₅Ｎ₁₈Ｏ₁₀につき）。 過剰のＥＤＴＡ−二無水物（５０ｍｇ）をＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１ｍＬ）および ＤＩＥＡ（１ｍＬ）に、５５℃で５分間加熱することにより溶解した。二無水物 溶液を、ＤＭＳＯ（７５０μＬ）に溶解したＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＮＨ₂（１０．４ｍｇ，１０μｍｏｌ）に添加した。混合 物を加熱し（５５℃、２５分）、残留するＥＤＴＡ−無水物を加水分解した（０ ．１Ｍ ＮａＯＨ，３ｍＬ，５５℃，１０分）。ＴＦA水溶液（０．１％ ｗ／ ｖ）を添加して全容量を８ｍＬに調整し、この溶液をそのまま逆相ＨＰＬＣによ り精製し、適切な画分を凍結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰ ｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ（４−Ｒ−Ｂｏｃ）が白色粉末（４ｍｇ，回収率４ ０％）として回収された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック）， １４０９．６（計算値１４０９．７；Ｃ₆₄Ｈ₈₉Ｎ₂₀Ｏ₁₇につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＮＨ₂（１２．０ｍｇ ，１２μｍｏｌ）を、４−Ｒ−Ｂｏｃにつき記載したように４−Ｓ−Ｂｏｃに変 換した（４ｍｇ，回収率３３％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピ ック），１４０９．７（計算値１４０９．７；Ｃ₆₄Ｈ₈₉Ｎ₂₀Ｏ₁₇につき）。 ＤＭＳＯ（７５０μＬ）中における工ｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰ ｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ（２．１ｍｇ）を５０ｍＬのフラスコに入れ、ＴＦＡで 処理した（１５ｍＬ，２２℃，２時間）。過剰のＴＦＡを真空中で除去し、水（ ６ｍＬ）を添加し、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製し、適切な画分を凍 結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴ Ａが白色粉末（１．３ｍｇ，回収率５０％）として回収された。ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１３０９．５（計算値１３０９．６；Ｃ₅₉ Ｈ₈₁Ｎ₂₀Ｏ₁₅につき）。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Bocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ−ＥＤＴＡ（３．０ｍ ｇ）を、４−Ｒにつき記載したように４−Ｓに変換した（１ｍｇ，回収率３３％ ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１３０９．５（計算値 １３０９．６；Ｃ₅₉Ｈ₈₁Ｎ₂₀Ｏ₁₅につき）。 過剰のＥＤＴＡ−二無水物（５０ｍｇ）をＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１ｍＬ）および ＤＩＥＡ（１ｍＬ）に、５５℃で５分間加熱することにより溶解した。二無水物 溶液を、ＤＭＳＯ（７５０μＬ）に溶解したＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１．０ｍｇ，１μｍｏｌ）に添加した。混合物を加熱し（ ５５℃、２５分）、残留するＥＤＴＡ−無水物を加水分解した（０．１Ｍ Ｎａ ＯＨ，３ｍＬ，５５℃，１０分）。ＴＦＡ水溶液（０．１％ ｗ／ｖ）を添加し て 全容量を８ｍＬに調整し、この溶液をそのまま逆相ＨＰＬＣにより精製し、適切 な画分を凍結乾燥すると、５−Ｒが白色粉末（０．６ｍｇ，回収率６０％）とし て回収された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１２６６． ４（計算値１２６６．６；Ｃ₅₇Ｈ₇₆Ｎ₁₉Ｏ₁₅につき）。この５−Ｒポリアミドを 図３に示す。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^EDTAγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐを１−Ｓから、５−Ｒ につき記載したように製造した（６．８ｍｇ，回収率１６％）。ＭＡＬＤＩ−Ｔ ＯＦ−ＭＳ（モノアイソトピック），１２６６．５（計算値１２６６．６；Ｃ₅₇ Ｈ₇₆Ｎ₁₉Ｏ₁₅にｐき）。 実施例２ ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）フットプリント法による結合部位サイズおよび位置 Ａ． ３’−および５’−末端標識制限フラグメントの調製 プラスミドｐＭＭ５をＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＢＩで線状にし、次いで３’− 標識のためにシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）酵素、デオキシアデノシン５ ’−［γ−³²Ｐ］トリホスフェートおよびチミジン５’−［γ−³²Ｐ］トリホス フェートで処理した。あるいは、ｐＭＭ５をＥｃｏＲＩで線状にし、仔ウシアル カリホスファターゼで処理し、次いでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびデオ キシアデノシン５’−［γ−³²Ｐ］トリホスフェートで５’−標識した。次いで ５’−標識フラグメントをＢｓｒＢＩで消化した。標識フラグメント（３’また は５’）を６％非変性性ポリアクリルアミドゲルに装填し、目的の１３５塩基対 のバンドをオートラジオグラフィーにより視覚化し、単離した。文献記載の方法 で化学的配列決定反応を行った（Ｉｖｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．，１９８７，１５，７８２３；Ｍａｘａｍら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ ｍｏｌ．，１９８０，６５，４９９）。 Ｂ． ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）フットプリント法 すべての反応を４０μＬ容量で実施した。ポリアミド原液または水（参照列に つき）をアッセイ緩衝液に添加した。最終濃度：２５ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ ｐ Ｈ７．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、お よび３０ｋｃｐｍ ３’−または５７−放射性標識ＤＮＡ。これらの溶液を４時 間平衡化させた。１００μＭ ＭＰＥ溶液１００μＬおよび１００μＭ硫酸鉄（ ＩＩ）アンモニウム（Ｆｅ（ＮＨ₄）₂（ＳＯ₄）₂・６Ｈ₂Ｏ）溶液１００μＬか ら、新鮮な５０μＭ ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）溶液を調製した。ＭＰＥ・Ｆｅ（Ｉ Ｉ）溶液（５μＭ）を平衡化ＤＮＡに添加し、反応物を５分間平衡化させた。ジ チオトレイトール（５ｍＭ）の添加により開裂を開始し、１４分間進行させた。 エタノール沈殿により反応を停止し、１００ｍＭ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ／ ８０％ホルムアミド−装填用緩衝液に再懸濁し、８５℃で６分間変性させ、５μ Ｌの試料（約１５ｋｃｐｍ）を直ちに８％変性性ポリアクリルアミドゲル（５％ 架橋、７Ｍ尿素）に２０００Ｖで装填した。 Ｃ． 結果 ３’−および５’−³²Ｐ末端標識１３５塩基対制限フラグメントのＭＰＥ・Ｆ ｅ（ＩＩ）フットプリント法（Ｖａｎ Ｄｙｋｅら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９８２，７９，５４７０；Ｖａｎ Ｄｙｋｅら，Ｓｃ ｉｅｎｃｅ １９８４，２２５，１１２２）により、これらのポリアミドはそれ ぞれ１μＭ濃度で５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合部位に結合することが分 かる（２５ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ／塩基対 仔ウ シ胸腺ＤＮＡ、ｐＨ７．０および２２℃）（図５および６）。化合物１−Ｒおよ び３−Ｒはそれぞれ１．２５Ｍでコグネイト５’−ＴＧＴＴＡ−３’部位および １塩基対不適正対合配列５’−ＴＧＴＣＡ−３’の両方を保護する。明らかに、 ポリアミドの結合配列優先性はアミン置換基の立体化学に応じて異なる。ポリア ミド１−Ｓおよび３−Ｓはそれぞれ１．２５Ｍおよび２．５Ｍ濃度で、ターゲッ ト適正塩基対合部位５’−ＴＧＴＴＡ−３’のほか、５’−ＡＣＡＴＴ−３’逆 配向適正塩基対合部位に結合する。これらのポリアミドの非対称３’−シフトフ ットプリント開裂保護パターンのサイズは、５塩基対結合部位と一致する。 実施例３ アフィニテイー開裂による結合配向性決定 Ｃ−末端またはγ−ターンのいずれかにおいてＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）で修飾 されたヘアピンポリアミドを用いたアフィニティー開裂実験（Ｔａｙｌｏｒら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９８４，４０，４５７；Ｄｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６，２３２，４６４）を利用して、ポリアミド結合配向 性および化学量論的特性を調べた。すべての反応を４０μＬの容量で実施した。 ポリアミド原液または水（参照列につき）をアッセイ緩衝液に添加した。最終濃 度：２５ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、および２０ｋｃｐｍ ３’−または５’−放 射性標識ＤＮＡ。これらの溶液を８時間平衡化させた。新鮮な硫酸鉄（ＩＩ）ア ンモニウム（Ｆｅ（ＮＨ₄）₂（ＳＯ₄）₂・６Ｈ₂Ｏ）溶液（１０μＭ）を平衡化 ＤＮＡに添加し、反応物を１５分間平衡化させた。ジチオトレイトール（１０ｍ Ｍ）の添加により開裂を開始し、３０分間進行させた。エタノール沈殿により反 応を停止し、１００ｍＭ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ／８０％ホルムアミド−装 填用緩衝液に再懸濁し、８５℃で６分間変性させ、試料全体を直ちに８％変性性 ポリアクリルアミドゲル（５％架橋、７Ｍ尿素）に２０００Ｖで装填した。 同じ３’−および５’−³²Ｐ末端標識１３５塩基対制限フラグメントにつきア フィニティー開裂実験を行った（２５ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、 １００μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、ｐＨ７．０および２２℃）。 につきみられた開裂パターン（図７、８および９）はすべての場合３’−シフト しており、これは副溝占有と一致する。Ｃ−末端にＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）部分 をもつ３．３μＭの４−Ｒ・Ｆｅ（ＩＩ）および１０μＭの４−Ｓ−Ｆｅ（ＩＩ ）の存在下では、５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合配列の５’側に近接した １個の開裂座（ｃｌｅａｖａｇｅ ｌｏｃｕｓ）が認められる。γ−ターンに付 加されたＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）部分をもつ３．３μＭの５−Ｒ・Ｆｅ（ＩＩ） および１０μＭの５−Ｓ・Ｆｅ（ＩＩ）の存在下では、５’−ＴＧＴＴＡ−３’ 適正塩基対合配列の３’側に近接して１個の開裂座が認められる。開裂座は、γ − ターンにＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）がある場合の方か、Ｃ−末端にある場合より簡 潔であり、これは束縛（ｔｅｔｈｅｒ）がより短いのと一致する。１０μＭの４ −Ｒ・Ｆｅ（ＩＩ）の存在下では、５’−ＴＧＴＣＡ−３’１塩基対不適正対合 部位の５’側と３’側の両方に開裂座がみられる。３’側部位にみられる開裂パ ターンは、５’側の開裂より約３倍以上強い。１０μＭ濃度のポリアミド４−Ｓ ・Ｆｅ（ＩＩ）については、５’−ＡＣＡＴＴ−３’逆配向適正塩基対合部位の ５’側に近接して１個の開裂座が認められる。 実施例４ 定量ＤＮアーゼＩフットプリント法によるエネルギー論 Ａ． ＤＮアーゼＩフットプリント法 すべての反応を４００μＬの容量で実施した。これらの反応では、ＤＮアーゼ 開裂後までキャリヤーＤＮＡを用いなかった。ポリアミド原液または水（参照列 につき）をアッセイ緩衝液に添加した。最終濃度：１０ｍＭトリス・ＨＣｌ緩衝 液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ Ｃａ Ｃｌ₂、および３０ｋｃｐｍ ３’−放射性標識ＤＮＡ。これらの溶液を２２℃ で最低１２時間平衡化させた。ＤＮアーゼＩ原液（１ｍＭ ＤＴＴで希釈して１ ．８７５ｕ／ｍＬの原液濃度にした）１０μＬの添加により開裂を開始し、２２ ℃で７分間進行させた。２．２５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６ ｍｇ／ｍＬグリコーゲンおよび３０μＭ塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡを含有する溶 液５０μＬの添加により反応を停止し、次いでエタノール沈殿させた。開裂生成 物を１００ｍＭ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ／８０％ホルムアミド−装填用緩衝 液に再懸濁し、８５℃で６分間変性させ、直ちに８％変性性ポリアクリルアミド ゲル（５％架橋、７Ｍ尿素）に２０００Ｖで１時間装填した。ゲルを真空下に８ ０℃で乾燥させ、次いで記憶型リン（ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ）法に より定量した。 平衡会合定数は先の記載に従って決定された（Ｍｒｋｓｉｃｈら，Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，７９８３）。５’−ＴＧＴＴＡ−３’お よび５’−ＴＧＡＣＡ−３’部位および参照部位の容量積分を行って、データを 分析した。各濃度のポリアミドにつき、見掛けのＤＮＡターゲット部位飽和値θ_app を下記の方程式により計算した：式中、Ｉ_tot、およびＩ_refはそれぞれターゲット部位および参照部位の積分容量 であり、Ｉ_tot ^OおよびＩ_ref ^Oはポリアミドを添加しなかったＤＮアーゼＩ対照列 に関するそれらの数値に相当する。（［Ｌ］_tot、θ_app）データ点は、下記の改 変ヒル（Ｈｉｌｌ）方程式を用いてθ_appとθ_fitの差を最小にすることにより、 ラングミュアー結合等温式にフィットさせた（たとえばポリアミド１〜３につい てはｎ＝１、ポリアミド４および５についてはｎ＝２）： 式中、［Ｌ］_totは全ポリアミド濃度に相当し、Ｋ_aは平衡会合定数に相当し、θ_min およびθ_maxはそれぞれ部位が占有されていない場合または飽相している場合 の、実験により測定した部位飽和値を表す。データを、カレイダグラフ（Ｋａｌ ｅｉｄａＧｒａｐｈ）ソフトウェア（バージョン２．１、エイベルベックのソフ トウェア）の非線形最小２乗フィッティング法により、可変パラメーターとして のＫ_a、θ_maxおよびθ_maxとフィットさせた。許容できるフィットはすべてＲ＞ ０．９７の相関係数をもっていた。それぞれの会合定数を決定するのに少なくと も３組の許容できるデータを用いた。データ点が目視検査により隣接点と比較し て明らかに不完全であると認められない限り、各ゲルのすべての列を採用した。 これらのデータを下記の方程式により正規化した： 光刺激性記憶型リンイメージングプレート（ｐｈｏｔｏｓｔｉｍｕｌａｂｌｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ）（コダック記 憶型リンスクリーン（Ｋｏｄａｋ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｃｒ ｅｅｎ）Ｓ０２３０、モレキュラー・ダイナミックスから入手）をゲル試料に平 らに押し付け、暗所で２２℃、１２〜２０時間露光した。モレキュラー・ダイナ ミックス４００Ｓホスファーイメージャー（Ｐｈｏｓｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用 いて、記憶スクリーンからすべてのデータを求めた。イメージクアント（Ｉｍａ ｇｅＱｕａｎｔ）バージョン３．２を用いてすべてのバンドの容量積分を行うこ とにより、これらのデータを分析した。 Ｂ． 結果 定量ＤＮアーゼＩフットプリントタイトレーション法（Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚら ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８６，１３０，１３２； Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚら，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．，ＵＳＡ １９ ８６，８３，８４６２；Ｓｅｎｅａｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６ ，２５，７３４４）（１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および５ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．０および２２℃）を行って、各６ 環ヘアピンポリアミドの平衡会合定数（Ｋ_a）を、解像された３部位につき決定 した（図１０および１１）。 ５’−ＴＧＴＴＡ−３’部位にはポリアミドが下記の順序で結合する： ５’−ＴＧＡＣＴ−３’ １塩基対不適正対合部位の認識に関する平衡会合定数 は下記のとおりである： ポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）お よびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Axγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（３−Ｓ）は、５’− ＡＣＡＴＴ−３’逆配向配列を、それぞれＫ_a＝４．６×１０₆Ｍ^-1およびＫ_a＜ ５×１０⁶Ｍ^-1で認識する。５’−ＴＧＡＣＡ−３’結合部位と５’−ＡＣＡＴ Ｔ−３’結合部位は重なるので、相対不適正塩基対結合エネルギーの詳細な比較 ができないことを留意すべきである。５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合部位 の結合の相対親和性は、γ−ターン置換の立体化学性に応じて１００〜５倍変動 する（表２）。 表 ２ 平衡会合定数（Ｍ^-1）^{a,b a} 報告した会合定数は、３回のＤＮアーゼＩフットプリントタイトレーショ ン実験で得た平均値である。各データの標準偏差をかっこ内に示す。アッセイは 、２２℃、ｐＨ７.０で、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂および５ｍＭ ＣａＣｌ₂の存在下に実施された。 ^b ５塩基対結合部位を大文字で示す。 ^c 特異性はＫ_a（適正塩基対合部位）／Ｋ_a（不適正塩基対合部位）により計 算される。 ^d ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）フットプリント法およびアフィニティー開裂法によ り判定した不適正塩基対合部位は、ポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−Ｐ ｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Acγ−ＰｙＰｙＰ ｙ−β−Ｄｐ（３−Ｓ）については５’−ＡＣＡＴＴ−３’である。 ＮＤ＝測定しなかった。 実施例５ 結合部位サイズおよび配向 ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）フットプリント法により、ポリアミド１−Ｒおよび３− Ｒについては５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合部位、５’−ＴＧＡＣＡ−３ ’１塩基対不適正対合部位、ポリアミド１−Ｓおよび３−Ｓについては５’−Ａ ＣＡＴＴ−３’逆配向適正塩基対合部位に、最も高い親和性で結合することが認 められる（図６）。カルボキシ末端またはγ−ターンにＥＤＴＡ・Ｆｅ（エＩ） を配置したポリアミドを用いるアフィニティー開裂実験により、（Ｒ）および（ Ｓ）−２，４−ジアミノ酪酸の両方から誘導されたポリアミドが５’−ＴＧＴＴ Ａ−３’ターゲット部位に単一配向で結合することが確認される（図１０）。単 一開裂部位という所見は、副溝に配向した１：１ ポリアミド：ＤＮＡ複合体の みと一致し、二量体型のオーバーラップまたは伸長結合モチーフをいずれも排除 する。ヘアピン結合モデルは、それぞれカルボキシ末端またはγ−ターンのＥＤ ＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）配置に対応して５’−ＴＧＴＴＡ−３’ターゲット部位の５ ’側または３’側に開裂座があることにより、さらに支持される（図１０）。（ Ｒ）^H2Nγγにより連結されたポリアミドサブユニットは、対称１塩基対不適正 対合配列５’−ＴＧＡＣＡ−３’に２つの異なる配向で結合する。（Ｓ）^H2Nγ により連結されたポリアミドは５’−ＡＣＡＴＴ−３’逆配向適正塩基対合配列 に結合する。これはこの部位の５’側に唯一の開裂座があることにより明らかで ある。 実施例６ 結合親和性 ６種類すべてのポリアミドが５’−ＴＧＴＴＡ−３’ターゲット部位に、分子 内ヘアピンとしての結合に一致する結合等温式（方程式２、ｎ＝１）で結合する 。しかし相対的な適正塩基対合部位結合親和性は、γ−ターンの立体化学および サブユニットの性質に応じて、約１０００倍変動する。６種類のポリアミドのう ち ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｒ）が最も高い親 和性で５’−ＴＧＴＴＡ−３’部位に結合する。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ− ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは平衡会合定数（Ｋ_a＝３×１０⁹Ｍ^-1；Ｐａｒｋｓら， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８，６１４７）、すなわち親ポリ アミドＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐのもの（Ｋ_a＝３×１０⁸Ｍ^-1 ）より１０倍高い平衡会合定数で結合する。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−ＥｔＯＨ（２−Ｒ）のように、１−ＲのＣ−末端ジメチルアミノ プロピルアミド基をエトキシアミド基で置換しても、結合親和性は低下しない（ Ｋ_a＝３×１０⁹Ｍ^-1）。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（ ３−Ｒ）のように、γ−ターンアミノ基をアシル化すると、１−Ｒと比較して結 合親和性が１０倍低下する（Ｋ_a＝３×１０⁸Ｍ^-1）。 Ｃ−末端ジメチルアミノプロピルアミド基（１−Ｒ）がエトキシアミド基（２ −Ｒ）で置換された点のみ異なるポリアミドが同様な親和性で結合するという所 見は、カチオン性ジメチルアミノプロピルテイル基とアニオン性ホスフェート残 基または副溝の床の負の静電位との相互作用が実質的にヘアピン−ＤＮＡ結合の エネルギーに関与しないらしいことを示す（Ｚｉｍｍｅｒら，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏ ｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９８６，４７，３１；Ｐｕｌｌｍａｎ，Ｂ ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１９９０，１８，１；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｖｏｌ．２），ＤＮＡ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，ｐ．２７３−２８９，Ｒ．Ｈ ．ＳａｒｍａおよびＭ．Ｈ．Ｓａｒｍａ（編）、アカデミック・プレス（１９８ ８））。さらに、これらの結果は、ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ と対比して１−Ｒにみられた結合増強は、単にポリカチオン性ＤＮＡらせんへの モノカチオンリガンド結合とジカチオンリガンド結合の間の差ではないことを示 す（Ｚｉｍｍｅｒら，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１９ ８６，４７，３１；Ｐｕｌｌｍａｎ，Ｂ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．１９９ ０，１８，１；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ（Ｖｏｌ．２），ＤＮＡ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｄｒｕｇ Ｃｏｍｐｌ ｅｘｅｓ，ｐ．２７３−２８９，Ｒ．Ｈ．ＳａｒｍａおよびＭ．Ｈ．Ｓａｒｍａ （編）、ア カデミック・プレス（１９８８））。ポリアミド１−Ｒの適度の結合親和性増大 は、適確に配置されたアミン基と副溝の床との静電相互作用の結果であろう。あ るいは親和性増大は、溶液中で立体効果により生じる遊離ヘアピンへの到達自由 度の低下、または正に荷電したアミン基とγ−カルボニル基の負の電位との静電 相互作用を示す可能性がある。 （Ｓ）^H2Nγで連結したポリアミド、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰ ｙ−β−Ｄｐ（１−Ｓ）およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｓ）^Acγ−ＰｙＰｙＰｙ−β− Ｄｐ（３−Ｓ）は、（Ｒ）^H2Nγ連結したポリアミド１−Ｒと比較して、５’− ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合部位に１００倍（Ｋ_a＝２×１０⁷Ｍ^-1）および１ ０００倍（Ｋ_a＜５×１０⁶Ｍ^-1）低い親和性で結合する。これらの結果は、キラ ルヘアピンポリアミドのＤＮＡ結合親和性をターン残基の立体化学の関数として 予測的に調節できることを証明する。 実施例７ 配列特異性 γ−ターンに種々の置換基をもつポリアミドは、５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正 塩基対対合部位に優先的に結合し、一方、逆配向部位および不適正塩基対合部位 に対する全体的特異性は変動する。ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ のγ−残基のα−プロトンを、キラルα−水素（Ｒ）立体配置を与えるアミノ基 で交換すると、最も特異性の高いポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（１−Ｒ）が得られる。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−Ｄｐ・５’−ＴＧＴＴＡ−３’複合体は、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2N γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ・５’−ＴＧＴＣＡ−３’不適正塩基対合複合 体と比較して１００倍高い優先性で形成される。荷電したジメチルアミノプロピ ルテイル基を（２−Ｒ）の場合のように、エトキシアミド基で置換しても、結合 特異性は変化しない。非置換親ヘアピンポリアミド（６０倍）と比較して、ポリ アミド１−Ｒおよび２−Ｒにつき１塩基不適正対合配列に対する特異性が適度に 増大するのは（１００倍）、キラルヘアピンポリアミドがＤＮＡ副溝認識に最適 な一群の小分子であることを示唆する。実施例８ 結合配向 原則として、ポリアミド:ＤＮＡ複合体はポリアミド(Ｎ−Ｃ)と副溝の壁(５’ −３’；Ｗｈｉｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，８７ ５６)とのアラインメントに応じて、２つの異なるＤＮＡ配列の場で形成するこ とかできる。各３環ポリアミドサブユニットのＮ−末端をそれぞれの認識ＤＮＡ 鎖の５’側に置いたコア配列組成ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙの６環ヘアピ ンポリアミドは、‘前進適正塩基対合（ｆｏｒｅｗａｒｄ ｍａｔｃｈ）’５’ −ＷＧＷＷＷ−３’配列（Ｗ＝ＡまたはＴ）に結合するであろう。ポリアミドサ ブユニットのＮ−末端をそれぞれの認識鎖の３’側に置くと、ターゲッティング ‘逆適正塩基対合’５’−ＷＣＷＷＷ−３’配列が生じるであろう。ヘアピンポ リアミドについては、ＤＮＡ二重らせんの主鎖（５’−３’）に対する各ポリア ミドサブユニット（Ｎ−Ｃ）の‘前進’アラインメントにエネルギー優先性があ る（Ｗｈｉｔｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，８７５６ ）。 ＩｍＰｙＰｙ−γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐのγ−ターンのα−プロトンを（ Ｓ）^H2Nγで交換すると、５’−ＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合部位に対する親 和性が低下するほか、不適正配列優先性が（Ｒ）^H2Nγ−連結ポリアミドにより 結合される５’−ＴＧＡＣＡ−３’部位から５’−ＡＣＡＴＴ−３’逆適正塩基 対合部位に変化する。逆適正塩基対合部位への結合は、副溝の床に立体的に嵩高 いアミノまたはアセトアミド基があることにより生じ、特異的ＤＮＡ認識に必要 な深いポリアミド結合が阻止されるであろう。しかし‘前進’および‘逆’結合 に必要なヘアピンフォールディングの要件を分析すると、さらに他のモデルが明 らかになる。 原則として、重ね合わせられない鏡面対称に関連する２つのヘアピンフォール ドがある(図１２)。一方のヘアピンフォールドは好ましい５’から３’へのＮ− Ｃ配向に関与し、他方のフォールドは３’から５’へのＮ−Ｃ逆配向結合に対応 する。ＤＮＡ不在下でのアキラルヘアピンポリアミドについては、重ね合わせら れない各フォールドはエネルギー論的に同等のはずである。しかしキラル置換基 をもつ非対称フォールディングしたヘアピンポリアミドは、配向結合につき異な るエネルギー状態を示す可能性がある(図１２)。前進フォールディングしたヘア ピン（５’から３’へのＮ−Ｃ）においては、（Ｒ）^H2Nγがアミン官能基をＤ ＮＡらせんから遠ざかる方向に向け、これに対し（Ｓ）鏡像異性体はアミンを副 溝の床内へ向けると推定される。‘逆’フォールドヘアピン（Ｓ）^H2Nγはアミ ン官能基をＤＮＡらせんの床から遠ざかる方向に向け、これに対し（Ｒ）鏡像異 性体はらせんの床にぶつかると推定される。非置換親ヘアピンに対比して適度に 高い特異性をもつキラルポリアミド１−Ｒおよび２−Ｒは、前進結合モードの安 定化および／または逆結合ヘアピンフォールドの脱安定化により生じると思われ る。 実施例９ 縦列連結ポリアミド Ａ． 合成 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β一］^{H N} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（６）、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙ Ｐｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（７ ）を、Ｂｏｃ−β−アラニン−Ｐａｍ−樹脂(樹脂０．６ｇ，置換度０．６ｍｍ ｏｌ／ｇ)からＢｏｃ−化学−機械介助プロトコールにより３１工程で合成した( 図３)^[12]。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^FmocHNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−Ｐａ ｍ樹脂を文献記載に従って製造した^[10]。次いでＦｍｏｃ保護基を（４：１）ピ ペリジン／ＤＭＦ処理により除去した。次いで残りのアミノ酸配列をＢｏｃ−化 学−機械介助プロトコールにより段階的に合成して、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［１ ｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^FmocHNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β− Ｐａｍ−樹脂、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^FmocHNγ− ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂を得た。Ｆｍｏｃ 基を（４：１）ピペリジン／ＤＭＦにより除去した。次いで樹脂試料を（ジメチ ルアミノ）プロピルアミンとの１工程アミノリシス反応で開裂させ（５５℃，１ ８時間）、次いで反応混合物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、ＩｍＰｙＰｙ−（ Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ −β−Ｄｐ（６）、およびＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ −ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（７）を得た。ＥＤＴ Ａターン誘導体７−Ｅについては、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（７）を過剰の ＥＤＴＡ−二無水物で処理し（ＤＭＳＯ／ＮＭＰ，ＤＩＥＡ，５５℃，３０分） 、残留する無水物を加水分解した（０．１Ｍ ＮａＯＨ，５５℃，３０分）。次 いでポリアミドＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^EDTAγ−ＰｙＰｙ Ｐｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（７−Ｅ）を逆相ＨＰＬＣにより単 離した。これらのジカチオン１２環縦列ヘアピンは、最高１ｍＭ濃度で溶解する 。これら縦列ヘアピンの溶解度は、伸長またはヘアピン１２環ポリアミドにつき みられる溶解度より１０〜１００倍大きい。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂をＢｏｃ−β −Ｐａｍ−樹脂（０．６ｍｍｏｌ／ｇ）から、機械介助固相法で段階的に合成し た。（Ｒ）−２−Ｆｍｏｃ−４−Ｂｏｃ−ジアミノ酪酸（０．７ｍｍｏｌ）を、 先にＢｏｃ−γ−アミノ酪酸につき記載されたように取り込ませた。ＩｍＰｙＰ ｙ−（Ｒ）^Fmocγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をガラス製２０ｍＬペプチ ド合成反応器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）、続いてピペリジン（８ｍＬ）で処理し 、撹拌した（２２℃，３０分）。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ− β−Ｐａｍ−樹脂をろ過により単離し、過剰のＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨおよび エチルエーテルで順に洗浄し、このアミン−樹脂を真空中で乾燥させた。次いで ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^FmocHNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HN γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰ ｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ）から、機械介助固相法で段 階的に合成した。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^FmocHNγ−Ｐｙ ＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂をガラス製２０ｍＬペ プチド合成反応器に入れ、ＤＭＦ（２ｍＬ）、続いてピペリジン（８ｍＬ）で処 理し、撹拌した（２２℃，３０分）。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（ Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂を濾 過により単離し、過剰のＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨおよびエチルエーテルで順に 洗浄 し、このアミン−樹脂を真空中で乾燥させた。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙ Ｐｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ− 樹脂の試料（２４０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ／ｇ）を生のジメチルアミノプロピ ルアミン（２ｍＬ）で処理し、定期的に撹拌しながら１６時間加熱した（５５℃ ）。次いで反応混合物をろ過して樹脂を除去し、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ（６ ｍＬ）を添加し、得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製した。適切な画分を凍 結乾燥すると、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙ Ｐｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐが白色粉末（２８ｍｇ，回収率２２ ％）として回収される。ＵＶ（Ｈ２Ｏ）λ_max 246,306(100,000)；ＭＡＬＤＩ− ＴＯＦ−ＭＳ［Ｍ⁺−Ｈ］（モノアイソトピツク），１８８１．９：計算値１８ ８１．９；Ｃ₈₉Ｈ₁₀₉Ｎ₃₂Ｏ₁₆につき。 ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^{H N} γ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ-樹脂を、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ −（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂 につき記載したように製造した。ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2N γ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｐａｍ−樹脂（２４０ ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ／ｇ¹⁹）を生のジメチルアミノプロピルアミン（２ｍＬ ）で処理し、定期的に撹拌しながら１６時間加熱した（５５℃）。次いで反応混 合物をろ過して樹脂を除去し、０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡ（６ｍＬ）を添加し、 得られた溶液を逆相ＨＰＬＣにより精製した。適切な画分を凍結乾燥すると、Ｉ ｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ −ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐが白色粉末（３２ｍｇ，回収率２５％）として回収さ れる。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ［Ｍ⁺−Ｈ］（モノアイソトピック），１９１０．２ ：計算値１９０９．９；Ｃ₉₁Ｈ₁₁₃Ｎ₃₂Ｏ₁₆につき。 過剰のＥＤＴＡ−二無水物（５０ｍｇ）をＤＭＳＯ／ＮＭＰ（１ｍＬ）および ＤＩＥＡ（１ｍＬ）に、５５℃に５分間加熱することにより溶解した。この二無 水物溶液を、ＤＭＳＯ（７５０μＬ）に溶解したＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰ ｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ−］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（ １０ｍｇ，５μｍｏｌ）に添加した。混合物を加熱し（５５℃，２５分）、残留 するＥＤＴＡ−無水物を加水分解した（０．１Ｍ ＮａＯＨ，３ｍＬ，５５℃， １０分）。ＴＦＡ水溶液（０．１％ ｗ／ｖ）を添加して全容量を８ｍＬに調整 し、この溶液をそのまま逆相ＨＰＬＣにより精製した。適切な画分を凍結乾燥し て、ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）［ＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^EDTAγ−ＰｙＰｙＰｙ−δ− ］^HNγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐ（７−Ｅ）を白色粉末（２ｍｇ，回収率２０％ ）として得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ［Ｍ⁺−Ｈ］（モノアイソトピック） ，２１８４．３：計算値２１８４．０；Ｃ₁₀₁Ｈ₁₂₇Ｎ₃₄Ｏ₂₃につき。 Ｂ． プラスミドおよび制限フラグメントの調製 図１８に挙げた挿入配列のハイブリダイゼーションにより、プラスミドｐＤＨ １０、ｐＤＨ１１およびｐＤＨ１２を構築した。ハイブリダイズした各挿入配列 を、線状にしたｐＵＣ１９ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプラスミド中へ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより別個にライゲートさせた。得られた構築体を用いて、Ｔｏ ｐ１０Ｆ‘ＯｎｅＳｈｏｔコンピテント細胞（インビトロゲンから）を形質転換 した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ− Ｂｅｒｔａｎｉ）培地寒天平板２５ｍＬから、アンピシリン耐性白色コロニーを 選択し、ＸＧＡＬおよびＩＰＴＧ溶液で処理した。キアゲン・マキシ（Ｑｕｉａ ｇｅｎ Ｍａｘｉ）精製キットにより、大規模プラスミド精製を行った。ジデオ キシ配列決定法により、目的とする挿入配列の存在を確認した。調製したプラス ミドの濃度を２６０ｎｍにおいて、１ＯＤ単位＝二本鎖ＤＮＡ ５０μｇ／ｍＬ の関係で測定した。 プラスミドｐＤＨ（１１〜１２）をＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＢＩで線状にし、 次いで３’−標識のためにシーケナーゼ酵素、デオキシアデノシン５’−［α−³² Ｐ］トリホスフェートおよびチミジン５’−［α−³²Ｐ］トリホスフェートで 処理した。あるいは、これらのプラスミドをＥｃｏＲＩで線状にし、仔ウシアル カリホスファターゼで処理し、次いでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびデオ キシアデノシン５’−［γ−³²Ｐ］トリホスフェートで５’−標識した。次いで ５’−標識フラグメントをＢｓｒＢＩで消化した。標識フラグメント（３’また は５’）を６％非変性性ポリアクリルアミドゲルに装填し、目的の１４７塩基対 のバンドをオートラジオグラフィーにより視覚化し、単離した。文献記載の方法 で化学的配列決定反応を行った。 Ｃ． 結合部位サイズ すべての反応を４０μＬ容量で実施した。ポリアミド原液または水（参照列に つき）をアッセイ緩衝液に添加した。最終濃度:２５ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、 および３０ｋｃｐｍ ３’−または５’−放射性標識ＤＮＡ。これらの溶液を４ 時間平衡化させた。１００μＭ ＭＰＥ溶液１００μＬおよび１００μＭ硫酸鉄 （ＩＩ）アンモニウム（Ｆｅ（ＮＨ₄）₂（ＳＯ₄）₂・６Ｈ₂Ｏ）溶液１００μＬ から、新鮮な５０μＭ ＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）溶液を調製した。ＭＰＥ・Ｆｅ（ ＩＩ）溶液（５μＭ）を平衡化ＤＮＡに添加し、反応物を５分間平衡化させた。 ジチオトレイトール（５ｍＭ）の添加により開裂を開始し、１４分間進行させた 。エタ ノール沈殿により反応を停止し、１００ｍＭ トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ／８０ ％ホルムアミド−装填用緩衝液に再懸濁し、８５℃で６分間変性させ、５μＬの 試料（約１５ｋｃｐｍ）を直ちに８％変性性ポリアクリルアミドゲル（５％架橋 、７Ｍ尿素）に２０００Ｖで装填した。 プラスミドｐＤＨ１１からの３’−または５’−³²Ｐ末端標識１３５塩基対Ｅ ｃｏＲＩ／ＢｓｒＢＩ制限フラグメントについてのＭＰＥ・Ｆｅ（ＩＩ）フット プリント法により、ポリアミド７は１００ｐＭ濃度で、表示した１１ｂｐ適正塩 基対合部位５’−ＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡ−３’に結合することが認められる（ ２５ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０および２２℃）（図５ ａおよび５ｃ）。不適正塩基対合部位５’−ＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡ−３’の結 合は、これよりはるかに高いポリアミド濃度でようやくみられる（図５ａ）。表 示した適正塩基対合部位５’−ＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡ−３’におけるポリアミ ド７の非対称３’−シフト開裂保護パターンのサイズは、予想したヘアピン−δ −ヘアピン・ＤＮＡ複合体の形成と一致する。 Ｄ． 結合配向 すべての反応を４０μＬ容量で実施した。ポリアミド原液または水（参照列に つき）をアッセイ緩衝液に添加した。最終濃度：２５ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ ｐＨ７．０）、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、 および２０ｋｃｐｍ ３’−または５’−放射性標識ＤＮＡ。これらの溶液を８ 時間平衡化させた。新鮮な硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム（Ｆｅ（ＮＨ₄）₂（ＳＯ₄ ）₂・６Ｈ₂Ｏ）溶液（１０μＭ）を平衡化ＤＮＡに添加し、反応物を１５分間 平衡化させた。ジチオトレイトール（１０ｍＭ）の添加により開裂を開始し、３ ０分間進行させた。エタノール沈殿により反応を停止し、１００ｍＭ トリス− ホウ酸−ＥＤＴＡ／８０％ホルムアミド−装填用緩衝液に再懸濁し、８５℃で６ 分間変性させ、試料全体を直ちに８％変性性ポリアクリルアミドゲル（５％架橋 、７Ｍ尿素）に２０００Ｖで装填した。 ＥＤＴＡ・Ｆｅ（ＩＩ）部分がγ−ターンに付加された７−Ｅを用いたアフィ ニティー開裂実験により、ポリアミドの結合配向および化学量論的特性を確認し た。プラスミドｐＤＨ１１からの同じ３’−または５’−³²Ｐ末端標識１３５塩 基対ＤＮＡ制限フラグメントにつき、アフィニティー開裂実験を行った（２５ｍ Ｍトリス−酢酸、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ／塩基対 仔ウシ胸腺ＤＮＡ 、ｐＨ７．０および２２℃）。７−Ｅにつきみられた開裂パターン（図５ｂおよ び５ｄ）は３’−シフトしており、副溝占有と一致する。１μＭ ７−Ｅの存在 下では、５’−ＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡ−３’適正塩基対合配列の３’側に近接 した単一開裂座が認められ、これは配向１：１ ヘアピン−δ−ヘアピン・ＤＮ Ａ複合体の形成と一致する。 Ｅ． 平衡会合定数 定量ＤＮアーゼＩフットプリント法および関連の数学的計算を、下記に特に指 示しない限り前記実施例４に記載したように実施した。定量ＤＮアーゼフットプ リントタイトレーション（１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、および５ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ７．０および２２℃）を行って 、６および７の１０−、１１−および１２−ｂｐ適正および不適正塩基対合部位 に対する平衡会合定数（Ｋ_a）を決定した。ポリアミド７は１１−ｂｐ ５’−ＴＧＴＴＡ ＴＴＧＴＴＡ−３’ターゲット配列に、Ｋ_a＞１×１０¹¹Ｍ^-1で優先 的に結合する。対応する１１−ｂｐ不適正塩基対合５’−ＴＧＴＣＡＴＴＧＴＣ Ａ−３’部位には、７は４５００倍以上低い親和性で結合する（Ｋ_a＝２．２× １０⁸Ｍ^-1）。ポリアミド７は、１０−ｂｐ部位５’−ＴＧＴＴＡＴＧＴＴＡ− ３’（Ｋ_a＝１．５×１０¹⁰Ｍ^-1）および１２−ｂｐ部位５’−ＴＧＴＴＡＴＡＴＧＴＴＡ −３’（Ｋ_a＝１．０×１０⁹Ｍ^-1）を、それぞれ７０倍および１００ ０倍低い親和性で結合する。ポリアミド６は、１０−ｂｐ ５’−ＴＧＴＴＡＴ ＧＴＴＡ −３’および１１−ｂｐ ５’−ＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＡ−３’部位を Ｋ_a＝２×１０¹⁰Ｍ^-1で結合し、同様に１２−ｂｐ ５’−ＴＧＴＴＡＴＡＴＧ ＴＴＡ −３’部位を１６倍低い親和性で結合する（Ｋ_a＝９．０×１０⁹Ｍ^-1）。 親ヘアピンＩｍＰｙＰｙ−（Ｒ）^H2Nγ−ＰｙＰｙＰｙ−β−Ｄｐは５’−ＴＧ ＴＴＡ−３’適正塩基対合部位にＫ_a＝５×１０⁹Ｍ^-1で結合することが認められ た。 外見上、ポリアミド７のサブユニットは親−アセチル化親−縦列ヘアピンの組 合わせである。親ヘアピンおよびアセチル化ヘアピンは、それぞれ結合エネルギ ー−１３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび−１１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌでＩを占有す る。これから、親−δ−アセチル化の共有結合は会合定数（Ｋ_a）＝２．２×１ ０¹⁸Ｍ^-1で同じ部位に結合すると推定される。これは観察した縦列ヘアピン７よ り６桁高い（−１６．３ｋｃａｌ／ｍｏｌで結合）。親の５’−ＴＧＴＴＡ−３ ’半部位認識と比較して、それぞれ１０−ｂｐおよび１２−ｂｐ部位の結合認識 の２倍増大および５倍低下がみられたにすぎない。部位ＩＶでは、１塩基対不適 正対合により、非連結ヘアピンおよび連結ヘアピンの両方につき結合エネルギー が低下する。連結していない親およびアセチル化親は、それぞれ１０．５ｋｃａ ｌ／ｍｏｌおよび９．２ｋｃａｌ／ｍｏｌで結合する。これから、連結ポリアミ ドは（Ｋ_a）＝２．４×１０¹⁴Ｍ^-1で結合すると推定される。観察した縦列ヘア ピンは、エネルギー−１１．３５ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび（Ｋ_a）＝２．２×１ ０⁸Ｍ^-1で結合する。 表２ 平衡会合定数（Ｍ^-1）^{a,b a} 報告した会合定数は、３回のＤＮアーゼＩフットプリントタイトレーショ ン実験で得た平均値である。アッセイは、２２℃、ｐＨ７．０で、１０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および５ｍＭ ＣａＣｌ₂ の存在下に実施された。^b １０、１１および１２塩基対結合部位を大文字で、フランキング配列を小 文字で示す。適正塩基対合部位の会合定数を太字で示す。特異性はＫ_a（適正塩 基対合）／Ｋ_a（不適正塩基対合）により計算される。 Ｆ． リンカー依存性 ポリアミド６および７の部位サイズ優先性は、頭−尾リンカーの長さに対する 修飾により生じる。モデル作成により、βおよびδリンカーは１０または１１− ｂｐを認識するのに十分な長さをもつが、１２−ｂｐ結合部位を覆うには短かす ぎることが示された。ポリアミド７は１１−ｂｐ部位の最適認識を示し、５’−ＴＧＴＴＡ ＴＴＧＴＴＡ−３’部位をＫ_a＝１×１０¹²Ｍ^-1で結合する。７のδ リンカーを、６において２炭素短いβ−アラニン残基で交換すると、１１−ｂｐ 部位における親和性が６倍以上低下する（Ｋ_a＝１．５×１０¹⁰Ｍ^-1）。１２− ｂｐ部位における６および７の著しい親和性低下は、リンカーサブユニットの共 有束縛がそれらの結合部位に対するヘアピンサブユニットのアラインメントを阻 害することを示す。表 ３ １１−ｂｐ適正塩基対合部位Ｉおよび一連の不適正塩基対合部位ＩＩ〜ＶＩ における６環ヘアピンおよびδ−結合縦列ヘアピンの結合親和性 本明細書に記載したように、本発明はＤＮＡ副溝を特異的に認識するための多様 な新規キラルヘアピンポリアミド構造体を製造および使用するための試薬および 方法を提供する。図面には本発明の好ましい態様を示し、記述したが、好ましい 態様の変更は当業者が容易になしうるので、本発明が図示および記述された特定 の態様に限定されると解すべきではなく、請求の範囲に記載したものであると解 すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０４２，０２２ (32)優先日 平成９年４月16日(1997．4．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／８３７，５２４ (32)優先日 平成９年４月21日(1997．4．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／８５３，５２２ (32)優先日 平成９年５月８日(1997．5．8) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７２２ (32)優先日 平成９年７月21日(1997．7．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ダーヴァン，ピーター・ビー アメリカ合衆国カリフォルニア州91108, サン・マリノ，セント・アルバンズ・ロー ド 1235

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＤＮＡ分子の副溝における塩基対に特異的に結合する、γ−アミノ酪酸か ら誘導されたヘアピンターンを有するポリアミドであって、ヘアピンのγ−アミ ノ酪酸残基を（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸で置換することにより改良されたポ リアミド。 ２．Ｒ−２−アミノが誘導体化されて酸アミドを形成した、請求項１記載のポ リアミド。 ３．ポリアミドが３または４つのカルボキシアミド結合対を有する、請求項１ 記載のポリアミド。 ４．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃γＸ₄Ｘ₅Ｘ₆ （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₂、Ｘ₃／Ｘ₄、およびＸ₅／Ｘ₆はＤＮＡ塩基対を結合する３つのカルボ キシアミド結合対を表し、その際少なくとも１つの結合対はＨｐ／ＰｙまたはＰ ｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙよりなる群か ら選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ塩基対に対応する） を有する、請求項１記載のポリアミド。 ５．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄γＸ₅Ｘ₆Ｘ₇Ｘ₈ （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₈、Ｘ₂／Ｘ₇、Ｘ₃／Ｘ₆、およびＸ₄／Ｘ₅はＤＮＡ塩基対を結合する４ つのカルボキシアミド結合対を表し、その際少なくとも１つの結合対はＨｐ／Ｐ ｙまたはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙよ りなる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ塩基対に対応する） を有する、請求項１記載のポリアミド。 ６．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅γＸ₆Ｘ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀ （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり： Ｘ₁／Ｘ₁₀、Ｘ₂／Ｘ₉、Ｘ₃／Ｘ₈、Ｘ₄／Ｘ₇、Ｘ₅／Ｘ₆はＤＮＡ塩基対を結合 する５つのカルボキシアミド結合対を表し、その際少なくとも１つの結合対はＨ ｐ／ＰｙまたはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ、およびＰｙ／ Ｐｙよりなる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮA塩基対に対応する） を有する、請求項１記載のポリアミド。 ７．式： Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆γＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁Ｘ₁₂ （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₁₂、Ｘ₂／Ｘ₁₁、Ｘ₃／Ｘ₁₀、Ｘ₄／Ｘ₉、Ｘ₅／Ｘ₈、Ｘ₆／Ｘ₇はＤＮＡ 塩基対を結合する３または４つのカルボキシアミド結合対を表し、その際少なく とも１つの結合対はＨｐ／ＰｙまたはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙよりなる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ 塩基対に対応する） を有する、請求項１記載のポリアミド。 ８．式： （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₆、Ｘ₂／Ｘ₅、Ｘ₃／Ｘ₄、Ｘ’₁／Ｘ’₆、Ｘ’₂／Ｘ’₅、Ｘ’₃／Ｘ’₄ はＤＮＡ塩基対を結合するカルボキシアミド結合対を表し、その際少なくとも１ つの結合対はＨｐ／ＰｙまたはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ 、およびＰｙ／Ｐｙよりなる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ塩基対 に対応し； Ｌはβ−アラニンおよび５−アミノ吉草酸（δ）よりなる群から選択されるア ミノ酸連結基を表し； Ｐは０〜１０個の請求項１記載の改良ポリアミドを表す） を有する、請求項１記載の縦列連結ポリアミド。 ９．式： （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₈、Ｘ₂／Ｘ₇、Ｘ₃／Ｘ₆、Ｘ₄／Ｘ₅、Ｘ’₁／Ｘ’₈、Ｘ’₂／Ｘ’₇、Ｘ ’₃／Ｘ’₆、Ｘ’₄／Ｘ’₅はＤＮＡ塩基対を結合するカルボキシアミド結合対を 表し、その際少なくとも１つの結合対はＨｐ／ＰｙまたはPｙ／Ｈｐであり、他 はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙよりなる群から選択されて、結合 すべき副溝のＤＮＡ塩基対に対応し； Ｌはβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（δ）およびその誘導体よりなる群から 選択されるアミノ酸連結基を表し； Ｐは０〜１０個の請求項１記載の改良ポリアミドを表す） を有する、請求項１記載の縦列連結ポリアミド。 １０．式：（式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₁₀、Ｘ₂／Ｘ₉、Ｘ₃／Ｘ₈、Ｘ₄／Ｘ₇、Ｘ₅／Ｘ₆、Ｘ’₁／Ｘ’₁₀、Ｘ’₂ ／Ｘ’₉、Ｘ’₃／Ｘ’₈、Ｘ’₄／Ｘ’₇、Ｘ’₅／Ｘ’₆はＤＮＡ塩基対を結合す るカルボキシアミド結合対を表し、その際少なくとも１つの結合対はＨｐ／Ｐｙ またはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙより なる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ塩基対に対応し； Ｌはβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（δ）およびその誘導体よりなる群から 選択されるアミノ酸連結基を表し； Ｐは０〜１０個の請求項１記載の改良ポリアミドを表す） を有する、請求項１記載の縦列連結ポリアミド。 １１．式： （式中、γはγ−アミノ酪酸から誘導された−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ ＯＮＨ−ヘアピン連結またはＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導されたキラルヘ アピン連結であり； Ｘ₁／Ｘ₁₂、Ｘ₂／Ｘ₁₁、Ｘ₃／Ｘ₁₀、Ｘ₄／Ｘ₉、Ｘ₅／Ｘ₈、Ｘ₆／Ｘ₇、Ｘ’₁／ Ｘ’₁₂、Ｘ’₂／Ｘ’₁₁、Ｘ’₃／Ｘ’₁₀、Ｘ’₄／Ｘ’₉、Ｘ’₅／Ｘ’₈、Ｘ’₆ ／Ｘ’₇はDＮA塩基対を結合するカルボキシアミド結合対を表し、その際少なく とも１つの結合対はＨｐ／ＰｙまたはＰｙ／Ｈｐであり、他はＰｙ／Ｉｍ、Ｉｍ ／Ｐｙ、およびＰｙ／Ｐｙよりなる群から選択されて、結合すべき副溝のＤＮＡ 塩基対に対応し； Ｌはβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（δ）およびその誘導体よりなる群から 選択されるアミノ酸連結基を表し； Ｐは０〜１０個の請求項１記載の改良ポリアミドを表す） を有する、請求項１記載の縦列連結ポリアミド。 １２．第１および第２ポリアミドを含み、第１ポリアミドが請求項４記載のポ リアミドであり、第２ポリアミドが請求項５、６および７のポリアミドよりなる 群から選択され；第１および第２ポリアミドが、第１ポリアミドのγ−残基と第 ２ポリアミドのカルボキシテイルに結合したβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（ δ）およびその誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸連結基で連結されてい る、縦列連結ポリアミド。 １３．第１および第２ポリアミドを含み、第１ポリアミドが請求項５記載のポ リアミドであり、第２ポリアミドが請求項４、６および７のポリアミドよりなる 群から選択され；第１および第２ポリアミドが、第１ポリアミドのγ−残基と第 ２ポリアミドのカルボキシテイルに結合したβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（ δ）およびその誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸連結基で連結されてい る、縦列連結ポリアミド。 １４．第１および第２ポリアミドを含み、第１ポリアミドが請求項６記載のポ リアミドであり、第２ポリアミドが請求項４、５および７のポリアミドよりなる 群から選択され；第１および第２ポリアミドが、第１ポリアミドのγ−残基と第 ２ポリアミドのカルボキシテイルに結合したβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（ δ）およびその誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸連結基で連結されてい る、縦列連結ポリアミド。 １５．第１および第２ポリアミドを含み、第１ポリアミドが請求項７記載のポ リアミドであり、第２ポリアミドが請求項４、５および６のポリアミドよりなる 群から選択され；第１および第２ポリアミドが、第１ポリアミドのγ−残基と第 ２ポリアミドのカルボキシテイルに結合したβ−アラニン、５−アミノ吉草酸（ δ）およびその誘導体よりなる群から選択されるアミノ酸連結基で連結されてい る、縦列連結ポリアミド。 １６．Ｐが０〜８個の請求項１記載のポリアミドを表す、請求項８、９、１０ または１１記載の縦列連結ポリアミド。 １７．Ｐが０〜６個の請求項１記載のポリアミドを表す、請求項８、９、１０ または１１記載の縦列連結ポリアミド。 １８．Ｐが０〜４個の請求項１記載のポリアミドを表す、請求項８、９、１０ または１１記載の縦列連結ポリアミド。 １９．Ｐが０〜２個の請求項１記載のポリアミドを表す、請求項８、９、１０ または１１記載の縦列連結ポリアミド。 ２０．キラルヘアビン連結がＲ−２，４−ジアミノ酪酸から誘導された、請求 項１記載のポリアミド。 ２１．下記のもの： およびその薬剤学的に許容しうる塩類よりなる群から選択される、請求項１記載 のポリアミド。 ２２．さらに、検出可能な標識に結合したＲ−２アミノ基を含む、請求項１記 載のポリアミド。 ２３．γ−アミノ酪酸のα−位を（Ｒ）−２，４−ジアミノ酪酸で置換するこ とを含む、ＤＮＡ配列を結合するためのヘアピンターンを有するポリアミドの親 和性を高める方法。 ２４．ヘアピンのγ−アミノ酪酸残基のα−位をアミノ酪酸のアセチル化Ｒ− 鏡像異性体で置換する、請求項８記載の方法。 ２５.遺伝子の調節配列と請求項１記載のポリアミドを接触させることを含む 、遺伝子発現を阻害する方法。