JP2002510707A

JP2002510707A - 環状並べ換えビオチン結合タンパク質

Info

Publication number: JP2002510707A
Application number: JP2000542353A
Authority: JP
Inventors: パトリックエス．ステイトン，
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1998-04-03
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2002-04-09
Also published as: AU3380099A; CA2324205A1; WO1999051632A1; US6492492B1; EP1066322A1

Abstract

(57)【要約】環状並べ換えタンパク質が記載され、ここでポリペプチドの天然の末端が連結され、そして生じた環状タンパク質が別の位置で開環して、新しいＣ末端およびＮ末端を生成する。生じるタンパク質は、例えば、基質結合の減少のような、いくつかの変化した特性を示す。融合タンパク質が、これらの新しく作製された末端に第２のポリペプチドを結合させることによって、この環状並べ換えタンパク質から作製され得る。この融合タンパク質は、天然の末端に第２のポリペプチドを結合させることによって作製した融合タンパク質から変化した特性を有する。例えば、第２のペプチドまたはタンパク質は、その基質または意図する標的により接近しやすい位置に結合され得る。好ましい実施態様において、基本となるポリペプチドは、ストレプトアビジンである。ストレプトアビジンの環状並べ換えは、環状並べ換えビオチン結合タンパク質を生じる。１つの実施態様において、ビオチンの結合のために重要な可撓性ポリペプチドループは、環状並べ換えタンパク質の作製によって開環された。もともとの末端（配列番号１の残基１３および１３９）は、リンカーによって連結された。ビオチン結合定数は、野生型ストレプトアビジンのビオチン結合定数よりもおよそ６桁低い１０⁷Ｍ^-1まで減少した。環状並べ換えストレプトアビジンの融合タンパク質は、第２のペプチド／タンパク質（例えば、ＩｇＧ結合プロテインＡまたは単鎖抗体）を用いて作製され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、改変されたストレプトアビジンの分野、より詳細には、ストレプト
アビジン融合タンパク質の分野に関し、ここで基本となるポリペプチドは、環状
並べ換え（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙｐｅｒｍｕｔｅｄ）ループを有する。

【０００２】（発明の背景）融合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖中にともに融合された２つ以上のポ
リペプチドからなるポリペプチド鎖である。例えば、ストレプトアビジンのビオ
チン結合能と第２のタンパク質（例えば、ＩｇＧ結合プロテインＡ（Ｓａｎｏお
よびＣａｎｔｏｒ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７７−１３８１（
１９９２）およびＳａｎｏらに与えられた米国特許第５，３２８，９８５号）、
メタロチオネイン（Ｓａｎｏら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ８９：１５３４−１
５３８（１９９２））、単鎖抗体（Ｄｕｂｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ．１７８：２０１−２０９（１９９５））およびヒト低密度リポタンパク質
（ＬＤＬ）レセプター（Ｃａｎｔｏｒらに与えられた米国特許第４，８３９，２
９３号））のビオチン結合能を合わせたストレプトアビジン融合タンパク質が報
告されている。これらのタンパク質は、第２のタンパク質に結合された野生型ス
トレプトアビジンを含む。ビオチンのストレプトアビジンへの強力な結合は、実
質的に維持されている。

【０００３】ストレプトアビジンの、ビオチンについての高アフィニティー（約２．５×１
０¹³Ｍ^-1のＫ_a）は、多くの現存する診断および分離技術、ならびに標的化された薬物／可視化剤送達系において有利に利用され得る。しかし、ビオチンに対す
るストレプトアビジンの極度に高いアフィニティーは、ストレプトアビジンまた
はビオチン化標的の可逆的な固定化が究極的に望ましい適用においては有害であ
り得る。１つの重要な実例はアフィニティー分離であり、ここでビオチン化標的
分子が、ストレプトアビジンを用いて捕獲され、そしてここで続くビオチン化標
的または捕獲剤（例えば、抗体）の放出および再利用が所望される。同様に、薬
物送達適用においては、ストレプトアビジン−ビオチン系は標的化および／また
は送達成分を形成し、例外的に遅いビオチン解離反応速度論が、治療標的へのビ
オチン化された可視化剤または薬剤の拡散を利用する可能な適用を制限し、そし
てまた、ビオチン化された可視化剤の遅いインビボのクリアランスを生じ得る。

【０００４】多くの他の高アフィニティータンパク質−リガンド系と共通して、ストレプト
アビジンは、以下の３つの鍵となる分子認識メカニズムをそのビオチンとの相互
作用において利用する：広範な水素結合ネットワーク、いくつかの直接的な芳香
族側鎖の接触、およびビオチン結合部位の近くの可撓性ループ。可撓性ループは
、レセプターおよび酵素の結合部位または活性部位の近くでしばしば見い出され
る、タンパク質構造エレメントである。多くの可撓性ループとともに、リガンド
結合は、非結合状態からリガンド結合状態に移る際のオープンからクローズドへ
の（または無秩序から秩序への）コンホメーションの変化を伴う（Ｎｏｂｌｅ
ＭＥＭら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１６：３１１−３２６；Ｗｉｅｒｅ
ｎｇａＲＫら、（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１０：３３−４９；Ｍｏｒｔ
ｏｎＡら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：８５７６−８５８
８；ＴａｎａｋａＴら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：２２
５９−２２６５；およびＦａｌｚｏｎｅＣＪら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ３３：４３９−４４２）。このループは、おそらくリガンドの結合
および解離の開閉において、重要な役割を果たしているが、その分子認識に対す
るエネルギー的な寄与については、未知のままである。結合の自由エネルギーは
、ループの秩序のエントロピー的な損失／利得のバランス、および埋もれている
非極性表面領域のエンタルピー的な利得を有する結合水の遊離、ならびに結合性
の接触の確立の結果である。タンパク質−リガンド相互作用は、タンパク質フォ
ールディングに関連するエネルギー性のサインに類似するエネルギー性のサイン
の原因となることが予想される。ＭｕｒｐｈｙＫＰら、（１９９３）Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ１５：１１３−１２０；ＳｐｏｌａｒＲＳら、（１９９４）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ２６３：７７７−７８４。

【０００５】ビオチン結合に伴う顕著な特色は、可撓性結合ループのコンホメーションの変
化である（ＨｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎＷＡら（１９８９）ＰｒｏｃＮａｔｌ
ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８６：２１９０−２１９４；ＷｅｂｅｒＰＣら（
１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：８５−８８）。コアストレプトアビジン中
の可撓性ループの結晶学的研究が報告された（ＦｒｅｉｔａｇＳら（１９９７
）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．６：１１５７−１１６６）。そのループ（配列番号
１の残基４５〜５２）は、ビオチンの存在下でクローズドコンホメーションにあ
り、そしてアポ−ストレプトアビジン中ではオープンコンホメーションにある。
残基４９〜５２（配列番号１）は、３₁₀ヘリックスにおいて見い出され、そして
オープンコンホメーションは、残基４５と５２（配列番号１）の間の水素結合相
互作用によって安定化されている。正方晶の結晶形において、これらの残基は、
オープンコンホメーションの秩序を乱す（ＷｅｂｅｒＰＣら（１９８９）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２４３：８５−８８）。Ｓｅｒ４５（配列番号１）は、β鎖を終端
させてループへと導き、そしてこの残基の側鎖の酸素は、ビオチンのウレイド−
酸素の１つと水素結合し、そしてＡｓｎ４９（配列番号１）の骨格アミド窒素は
、ビオチンのカルボン酸と水素結合する。このループの再配列および／または欠
失は、多くの変化、特に基質の結合の変化に導き得る。多くの酵素について、結
合特性を変化させること、例えば、結合アフィニティーを増大または減少させる
ことは有用であり得る。

【０００６】環状並べ換えは１つの技術であり、ここでポリペプチドの正常な末端が連結さ
れ、そして、バックボーンの他の場所を開裂することによって、新しい末端が作
製される。多くのポリペプチドにおいて、正常な末端は密接に近接しており、そ
して短いアミノ酸配列によって連結され得る。ポリペプチドバックボーンにおけ
る開裂は、任意の場所であり得、好ましくは天然の機能およびポリペプチドのホ
ールディングが破壊されない場所においてである。環状並べ換えは、新しいＣ末
端およびＮ末端を作製し、これは融合タンパク質の作製を可能にし、ここでその
融合ペプチドまたはタンパク質は、宿主タンパク質上の異なる場所で結合される
。例えば、天然の末端が、基本となるタンパク質の内部にある場合、この天然の
末端においてペプチドまたはタンパク質を結合することは、破壊的であり得る。
宿主タンパク質の外部に近い場所に結合位置を変更することによって、宿主タン
パク質の安定性は維持され得る。いくつかの状況において、結合部位の近くのル
ープの破壊は、有利に基質結合を破壊し得る。

【０００７】野生型ストレプトアビジンよりも、ビオチンに対して低い結合アフィニティー
を有するストレプトアビジン変異体を提供することは有利である。

【０００８】野生型ストレプトアビジンを含む融合タンパク質よりも、ビオチンに対して低
い結合アフィニティーを有するストレプトアビジン融合タンパク質を提供するこ
とは有利である。

【０００９】第２のペプチドまたはタンパク質がより有用な位置において結合されている、
ストレプトアビジン融合タンパク質を提供することは有利である。

【００１０】（発明の要旨）環状並べ換えタンパク質が記載され、ここでポリペプチドの天然の末端が連結
され、そして生じた環状タンパク質が別の位置で開環して、新しいＣ末端および
Ｎ末端を生成する。生じるタンパク質は、例えば、基質結合性の低下のような、
いくつかの変化した特性を示す。融合タンパク質が、これらの新しく作製された
末端に第２のポリペプチドを結合させることによって、この環状並べ換えタンパ
ク質から作製され得る。これらの融合タンパク質は、天然の末端に第２のポリペ
プチドを結合させることによって作製した融合タンパク質に由来する変化した特
性を有する。例えば、第２のタンパク質またはペプチドは、その基質または意図
する標的により接近しやすい位置に結合され得る。好ましい実施態様において、
基本となるポリペプチドは、ストレプトアビジンである。ストレプトアビジンの
環状並べ換えは、環状並べ換えビオチン結合タンパク質を生じる。１つの実施態
様において、ビオチンの結合のために重要な可撓性ポリペプチドループは、環状
並べ換えタンパク質の作製によって開環された。もともとの末端（配列番号１の
残基１３および１３９）は、リンカーによって連結された。ビオチン結合定数は
、野生型ストレプトアビジンのビオチン結合定数よりもおよそ６桁低い１０⁷Ｍ^- ¹ まで減少した。環状並べ換えストレプトアビジンの融合タンパク質は、第２のペプチド／タンパク質（例えば、ＩｇＧ結合プロテインＡまたは単鎖抗体）を用
いて作製され得る。

【００１１】（発明の詳細な説明）（１．環状並べ換えタンパク質の設計）環状並べ換えタンパク質は、伝統的な欠失変異体を使用しても利用不可能な方
法で、ループ再配列またはリガンド結合の除去の生物物理学的な結果を研究する
ための実験的な手段を提供した。環状並べ換えタンパク質は、以前にタンパク質
のフォールディングの問題を研究するために使用され（ＹａｎｇＹら（１９９
３）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳ．９０：１１９８０−１１９
８４；ＧｒａｆＲら（１９９６）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵ
ＳＡ９３：１１５９１−１１５９６）、そして天然に存在する環状並べ換えタ
ンパク質および合成の環状並べ換えタンパク質が同定された（Ｈｅｉｎｅｍａｎ
ｎＵら（１９９５）ＰｒｏｇＢｉｏｐｈｙｓＭｏｌｅｃＢｉｏｌ６４
：１２２−１４３；ＬｉｎｄｑｖｉｓｔＹら（１９９７）ＣｕｒｒＯｐｉｎ
ｉｏｉｎＳｔｒｕｃＢｉｏｌ７：４２２−４２７；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ
ＤＰら（１９８３）ＪＭｏｌＢｉｏｌ１６４：４０７−４１３；Ｌｕｇ
ｅｒＫら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３−２０６−２０９）。Ｐａｓｔ
ａｎらに与えられた米国特許第５，６３５，５９９号は、環状並べ換えインター
ロイキン４（ＩＬ４）から作製された融合タンパク質を開示する。

【００１２】環状並べ換え体は、一般的に、選択された場所においてポリペプチド鎖を破壊
することによって作製され、新しい末端を作製し、そして直接的に、またはアミ
ノ酸リンカーのようなリンカーを通してのいずれかで、２つの天然の末端を架橋
する。従って、環状並べ換えは、タンパク質のアミノ酸の配列および同一性を本
質的に保存する効果を有する一方、異なる位置に新しい末端を生成する。さらに
、タンパク質の三次構造は、一般的に保存されている。環状並べ換えタンパク質
は、化学的に作製され得るが、好ましくは組換え技術によって作製される。

【００１３】ネイティブな生物学的活性を保持している環状並べ換えタンパク質の作製のた
めの２つの一般的な必要要件が存在する：１）ネイティブなタンパク質における
末端は、連結の作製が生物学的活性を破壊しないように好ましく配置されなけれ
ばならない；および２）新しい末端が、タンパク質フォールディングおよび所望
の生物学的活性に決定的な領域を破壊することなく形成され得る、「開裂部位」
が存在しなくてはならない。いくつかの場合（例えば、ストレプトアビジン）に
おいて、生物学的活性（例えば、ストレプトアビジンの場合におけるビオチン結
合）を改変することが所望される。

【００１４】（ネイティブ末端間のリンカー）一般的に、リンカーは、２つの反応性の部位を含む分子であり、その１つはカ
ルボキシル末端アミノ酸と共有結合を形成し、そしてもう１つはアミノ末端アミ
ノ酸と共有結合を形成する。適切なリンカーは当業者に周知であり、そしてそれ
らには、直鎖状炭素リンカー、分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、また
はペプチドリンカーが含まれる。最も一般的かつ単純な例は、ペプチド結合を通
して連結されたいくつかのアミノ酸からなる、ネイティブなタンパク質の末端に
結合するペプチドリンカーである。このリンカーはその側鎖基を通して（例えば
、システインに対するジスルフィド結合を通して）末端アミノ酸に連結され得る
。しかし、好ましい実施態様においては、リンカーは、ペプチド結合を通して、
末端アミノ酸のα炭素アミノ基およびカルボキシル基に連結される。リンカーの
長さは、リンカーを形成するアミノ酸の数によって決定される。一般的に、中性
アミノ酸および／または小さな側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラ
ニン、およびセリン）が好ましい。

【００１５】特に分子のネイティブな生物学的活性を維持または改善することが所望の場合
に、並び換えられていないか、またはネイティブな分子に比較し得る末端間の間
隔を保存するリンカーを使用することが好ましい。このことが重要でない場合に
は、リンカーの長さまたは特性は、重要でないかもしれない。リンカーの長さお
よび特性はまた、連結される末端が活性部位の近くに位置する場合に、おそらく
より重要である。

【００１６】環状並べ換えストレプトアビジンについては、リンカーは、好ましくは約１〜
６アミノ酸である。最も好ましくは、リンカーは３つのグリシン残基および１つ
のセリン残基からなるテトラペプチドであり、その順番はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）である。最初のグリシンは、ネイティブタンパク質の
カルボキシル末端アミノ酸Ｓｅｒ１３９（配列番号１）に結合されており、そし
てセリンは、ネイティブタンパク質のアミノ末端アミノ酸Ａｌａ１３（配列番号
１）に結合されている。

【００１７】本明細書中において、好ましい実施態様は、野生型ストレプトアビジン由来と
して記載されるが、本明細書中に記載される環状並べ換え体および融合タンパク
質が、ストレプトアビジン変異体のような野生型ストレプトアビジンの改変を伴
って作製され得ることは、当業者に当然明らかである。ストレプトアビジン（野
生型、変異体、または改変体を含む）の環状並べ換えに基づく、開示された環状
並べ換えタンパク質は、環状並べ換えビオチン結合タンパク質または環状並べ換
えストレプトアビジンと呼ばれ得る。他に示されない限り、または文脈から明ら
かでない限り、用語ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、変異型
ストレプトアビジン、または改変体ストレプトアビジンを含む、ストレプトアビ
ジンの全ての形態を含むように意図される。

【００１８】（開裂部位）開裂部位の選択は、多数の因子によって決定され得る。１つの因子は、生物学
的機能が保存されるべきであるかまたは変更されるべきであるかということであ
る。生物学的機能が変更されるべきである場合、開裂部位は、活性部位から離れ
れ、そして他の構造または機能的に重要な部位から離れるべきである。例えば、
好ましい開裂部位は、非常に規則的な三次元構造（例えば、αヘリックス、プリ
ーツシート、βバレル構造など）を示さない領域に位置する。しかし、目的が、
生物学的機能を変更することである場合、活性部位付近で分子を開裂することが
より有利であり得る。例えば、ストレプトアビジンのビオチン結合親和性を低下
させるために、開裂部位は、ビオチン結合に関与するアミノ酸を含むビオチン結
合部位の付近の可撓性ループ上に位置し得る。このループは、アミノ酸４５〜５
２（配列番号１）を含む。好ましい実施態様では、残基４７〜５０は、ループ（
配列番号３の残基１〜４）から除去される。

【００１９】（２．融合タンパク質の設計）本明細書中に記載される融合タンパク質は、別のポリペプチド（第２のポリペ
プチド）に連結された環状並べ換えポリペプチド（基本ポリペプチド）を含む。
この２つのタンパク質は、直接一緒に融合され得るか、またはスペーサー（例え
ば、ペプチドスペーサー）を用いて連結され得る。このペプチドスペーサーは、
約１〜約４０の残基長の範囲であり得る。基本ポリペプチドおよび第２のポリペ
プチドの両方の全てまたは一部の生物学的活性を保持することが望ましい。スペ
ーサーの長さおよび特徴は、この目的を達成する際に重要である。一般に、この
融合タンパク質は、他の融合タンパク質について当業者に公知の方法によって生
成され得る。例えば、ネイティブのストレプトアビジンに対するポリペプチドの
融合についての、Ｃａｎｔｏｒらに対する米国特許第４，８３９，２９３号およ
びＳａｎｏらに対する米国特許第５，３２８，９８５号に教示される方法が用い
られ得る。

【００２０】（第２のポリペプチド）第２のポリペプチドは、任意のポリペプチドであり得、そして好ましくは、生
物学的機能を有するポリペプチド（例えば、抗体、抗体フラグメント、ＩｇＧ結
合性プロテインＡ、ホルモン、酵素、放出因子、リガンド、増殖因子、レセプタ
ー（例えば、ＬＤＬレセプター）、またはメタロチオネイン）である。第２のポ
リペプチドはまた、所望される生物学的活性を提供するのに十分である、これら
または別のタンパク質のうちの１つの一部であり得る。

【００２１】第２のタンパク質は、当該分野で公知である通りに精製され得、そして以下で
さらに記載する通りに基本ポリペプチドへ化学的に付着され得る。あるいは、第
２のタンパク質は、基本ポリペプチドについてのポリヌクレオチドおよび第２の
ポリペプチドについてのポリヌクレオチドを含む融合ポリヌクレオチドから作製
され得る。抗体を環状並べ換えタンパク質に融合する手段は、当業者に周知であ
る。例えば、Ｂａｔｒａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２００−２２
０５（１９９１）、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ３３９：３９４−３
９７（１９８９）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８７：１０６６−１０７０（１９９０）；およびＢｒｉｎｋｍａ
ｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：８６１６−８
６２０（１９９１）を参照のこと。

【００２２】融合タンパク質の抗体成分は、特定の型の細胞（例えば、癌またはウイルス感
染細胞）に特有の抗原を特異的に結合し得る。融合タンパク質において用いられ
る抗体は、改変または変更された抗体の種々の形態（例えば、インタクトな免疫
グロブリン、軽鎖および／もしくは重鎖の可変領域のみを含むＦｖフラグメント
、ジスルフィド結合によって連結されるＦｖフラグメント、可変領域および定常
領域の一部を含むＦａｂもしくは（Ｆａｂ）’₂フラグメント、単鎖抗体、または抗体の単一のドメイン）を含み得る。抗体は、動物（特にマウスまたはラット
）またはヒト起源の抗体であり得るか、あるいはキメラ抗体もしくはヒト化抗体
であり得る。抗体を生成する方法は、当業者に周知であり、そしてＨａｒｌｏｗ
およびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８
８）、ならびにＡｓａｉ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ第
３７巻：ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）のような刊行物に
おいて記載されることが見出され得る。

【００２３】（スペーサー）一般に、基本ポリペプチドを第２のポリペプチドへ連結するスペーサーは、そ
れ自体は生物学的活性を有さず、そして融合タンパク質を形成する２つの活性な
タンパク質を連結するため、およびその活性なタンパク質間にいくらかの距離を
提供するためにのみ作用する。しかし、当業者は、スペーサーの残基が、融合タ
ンパク質の特性を最適化するために選択され得ることを認識する。例えば、親水
性アミノ酸を含有するスペーサーは、水溶液中での溶解度を増強し得る。同様に
、スペーサー残基は、融合タンパク質の折畳みに対するそれらの効果について選
択され得る。

【００２４】（３．環状並べ換えポリペプチドおよび融合タンパク質の作製方法）環状並べ換えタンパク質および融合タンパク質は、当業者に公知の方法を用い
て作製され得る。これらの方法には、化学的合成、既存のタンパク質の修飾、お
よび組換えＤＮＡ方法論を用いる、環状並べ換えタンパク質の発現が含まれる。
融合タンパク質は、単一のポリペプチドとして作製され得るか、または第２のペ
プチドが、２つの成分ポリペプチドの別個の合成の後に基本ポリペプチドに付着
され得る。

【００２５】タンパク質が比較的短い（すなわち、約５０アミノ酸未満の）場合、環状並べ
換えポリペプチドおよび／または融合タンパク質は、標準的な化学的ペプチド合
成技術を用いて合成され得る。リンカーおよび／またはスペーサーがペプチドで
ある場合、リンカーおよび／またはスペーサーは、合成の間に取り込まれ得る。
リンカーがペプチドでない場合、リンカーは、合成後にペプチドに対してカップ
リングされ得る。同様に、このスペーサーは、基本ポリペプチドおよび第２のポ
リペプチドを独立に生成した後に取り込まれて、基本ポリペプチドと第２のポリ
ペプチドとを連結し得る。配列のＣ末端アミノ酸が不溶性支持体へと付着され、
続いて配列における残りのアミノ酸が連続的に付加される固相合成は、本明細書
中に記載される環状並べ換えリガンドおよび融合タンパク質の化学合成の好まし
い方法である。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。この一本鎖
オリゴヌクレオチドは、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または
ＤＮＡポリメラーゼとの重合によって、この一本鎖をテンプレートとして用いて
二本鎖ＤＮＡへと変換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成についての現行の
方法は、約１００塩基の配列を調製することに限定されず、より長い配列が、よ
り短い配列の連結により獲得され得ることを認識する。固相合成についての技術
は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−ＰｈａｓｅＰｅ
ｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓの３−２８４頁；
Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻．Ｓｐｅｃｉ
ａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第Ａ部，
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１
５６：（１９６３）、およびＳｔｅｗａｒｔら，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅ
ｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）によって記載される。

【００２６】あるいは、環状並べ換えタンパク質および／または融合タンパク質は、ネイテ
ィブなまたは既存のタンパク質を化学的に改変することにより作製され得る。一
般に、これは、リンカーの存在下でネイティブなタンパク質を反応させて、リン
カーと、タンパク質のカルボキシル末端およびアミノ末端との間で共有結合を形
成し、従って環状のタンパク質を形成することを必要とする。次いで、新たな末
端は、アミノ酸を連結するペプチド結合を別の位置で開裂することにより形成さ
れる。このことは、例えば、ペプチダーゼを用いて化学的または酵素的に達成さ
れ得る。

【００２７】開裂反応が、１より多くのペプチド結合を加水分解する傾向がある場合、この
反応は短時間行われる。開裂された１より多くのペプチド結合を有する分子は、
全長の環状並べ換え分子よりも短い。これらは、サイズを選択する任意のタンパ
ク質精製技術によって（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたは電気泳動
によって）単離され得る。あるいは、環状タンパク質における種々の部位は、酵
素の結合を妨害し得るアミノ酸側鎖の化学修飾によって、またはペプチド結合に
関与する、攻撃されやすい基の化学的ブロッキングによって、加水分解から保護
され得る。

【００２８】好ましい実施態様では、環状並べ換えタンパク質、および／または環状並べ換
えタンパク質を含む融合タンパク質は、組換え方法論を用いて合成される。一般
に、これは、環状並べ換え基本ポリペプチド（またはこの基本ポリペプチドを含
む融合タンパク質全体）をコードするポリヌクレオチド配列を作製する工程、ポ
リヌクレオチドを、適切な発現プロモーターの制御下で発現カセット中に配置す
る工程、タンパク質を宿主中で発現する工程、発現されたタンパク質を単離する
工程、そして必要な場合には、このタンパク質を再生する工程を含む。第２のタ
ンパク質が別個に作製される場合、次いで、この第２のタンパク質は、この環状
並べ換え物に連結される。

【００２９】環状並べ換えポリペプチドまたは環状並べ換えポリペプチドを含む融合タンパ
ク質をコードするＤＮＡは、例えば、以下を含む任意の適切な方法によって調製
され得る：適切な配列のクローニングおよび制限処理、またはＮａｒａｎｇら
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９（１９７９）のホスホトリエステ
ル法；Ｂｒｏｗｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１（１９
７９）のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，
２２：１８５９−１８６２（１９８１）のジエチルホスホルアミダイト法；およ
び米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法のような方法による直接的な
化学合成。

【００３０】あるいは、部分的な長さの配列は、クローニングされ得、そして適切な部分的
な長さの配列は、適切な制限酵素を用いて切断され得る。次いで、このフラグメ
ントは連結されて、所望のＤＮＡ配列を生成し得る。

【００３１】好ましい実施態様では、環状並べ換えポリペプチドをコードするＤＮＡは、Ｄ
ＮＡ増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を用いて生成される
。

【００３２】環状並べ換えリガンドおよびそれらの融合タンパク質は、種々の宿主細胞（Ｅ
．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、ならびに種々の高等真核生物細胞（例えば、
ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、およびＨｅＬａ細胞株、昆虫細胞、およびミエロ
ーマ細胞株）を含む）において発現され得る。好ましい実施態様では、融合タン
パク質は、プラスミドまたはウイルスベクターによってコードされる。組換えタ
ンパク質遺伝子は、各宿主について適切な発現制御配列に作動可能に連結される
。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために、プラスミドは、プロモーター（例えば、
Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはλプロモーター）、およびリボ
ソーム結合部位を含むべきである。真核生物細胞における発現のために、ベクタ
ーは、好ましくは、宿主細胞に適切なプロモーター、エンハンサー（例えば、免
疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、またはサイトメガロルイスに由来する）、およ
びポリアデニル化配列を含み、そしてスプライスドナー配列およびスプライスア
クセプター配列を含む得る。

【００３３】融合タンパク質をコードするプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉについての塩化カル
シウム形質転換および哺乳動物細胞についてのリン酸カルシウム処理またはエレ
クトロポレーションのような周知の方法によって、選択された宿主細胞へ移入さ
れ得る。このプラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる
遺伝子（例えば、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝
子）によって付与される、抗生物質に対する耐性によって選択され得る。ウイル
ス細胞は、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターのようなベク
ターで感染され得る。

【００３４】一旦発現されると、組換えの基本の環状並べ換え物または融合タンパク質は、
当該分野の標準的な手順（硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティーカラム、カラ
ムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む）に従って精製され得る。少な
くとも約９０％〜約９５％均質な、実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９
８％〜９９％以上の均質性が薬学的使用に最も好ましい。一旦、（所望に応じて
、部分的に、または均質になるまで）精製されると、次いでこのポリペプチドが
所望に応じて用いられ得る。

【００３５】当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製の後、環状並べ換えポリペプ
チドおよび／または融合タンパク質が、ネイティブなタンパク質とは実質的に異
なるコンホメーションを保有し得ることを認識する。この場合、このタンパク質
を変性および還元し、次いでこのタンパク質に好ましいコンホメーションへの再
折畳みを生じさせることが必要であり得る。タンパク質を還元および変性する方
法、ならびに再折畳みを誘導する方法は、当業者に周知である。例えば、発現さ
れた精製タンパク質は、尿素または塩化グアニジウム中で変性され得、そして緩
慢な透析によって再生され得る。

【００３６】環状並べ換えポリペプチドまたは融合タンパク質のうちのどれが好ましいかを
決定するために、このタンパク質は、生物学的活性についてアッセイされるべき
である。このようなアッセイは、当業者に周知であり、一般に、２つのカテゴリ
ーに分類される；特定の標的に対するタンパク質の結合親和性を測定するアッセ
イ、およびタンパク質の生物学的活性を測定するアッセイ。

【００３７】（４．環状並べ換えポリペプチドおよび融合タンパク質の使用方法）環状並べ換えポリペプチドは、融合タンパク質を作製するために有用である。
例えば、環状並べ換えストレプトアビジンを用いて、以前の融合タンパク質ほど
強くはビオチンに結合しないことから、より有用である融合タンパク質を作製し
得る。

【００３８】融合タンパク質は、種々の適用（例えば、分離、薬物送達、標的化として、お
よび診断アッセイにおいて）のために有用である。例えば、ストレプトアビジン
融合タンパク質は、ビオチン化基質に結合され得る。次いで、第２の分子の生物
学的活性は、例えば、不純な溶液から特定の分子を捕捉および分離するために用
いられ得る。次いで、精製された分子は、融合タンパク質から解離される。野生
型ストレプトアビジンのビオチン親和性と比較して、より低いビオチン親和性の
融合タンパク質は、基質からの融合タンパク質の放出、および融合タンパク質の
再利用を可能にする。融合タンパク質の２つのプロング（ｐｒｏｎｇ）特異性は
、他の適用において同様に用いられ得る。

【００３９】本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに記載される。

【００４０】（実施例）（環状並べ換えストレプトアビジンの調製および特徴付け）環状並べ換えストレプトアビジン（ＣＰ５１／４６と命名される）を調製した
。元の末端（配列番号１の残基１３および残基１３９）を、テトラペプチドリン
カー（ＧＧＧＳ）（配列番号２）によって連結した。４つのループ残基（４７〜
５０）（配列番号１）を除去し、Ｇｌｕ５１およびＡｌａ４６で新たなＮ末端お
よびＣ末端（配列番号４の残基Ｇｌｕ２および残基Ａｌａ１２８）を生成した。
開始メチオニンは翻訳後プロセシングによって除去されず、そしてＧｌｕ５１（
配列番号４のＧｌｕ２）よりむしろ新たなＮ末端（配列番号４のＭｅｔ１）とな
った。

【００４１】（材料および特徴付け方法）他に示されない限り、全てのオリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ
ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）から入手し
、プラスミドおよび細胞をＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手し
、ＰＣＲ試薬をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手し、制限酵素
およびリガーゼはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，
ＭＡ）によって供給され、そして化学的試薬をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）から入手した。

【００４２】Ｎ末端配列決定を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４
７７ＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒで行った。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析を、調製済みの（
ｐｒｅｃａｓｔ）Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ１０〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて行った。ＣＰ５１／４６の濃度を、
このサブユニットについての３４０００Ｍ^-1ｃｍ^-1の吸光係数（ε₂₈₀）（ＳａｎｏＴら（１９９０）ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ８７
：１４２−１４６）を用いて２８０ｎｍの吸光度によって決定した。エレクトロ
スプレー質量分析法を、ＶＧＱｕａｔｔｒｏＩＩＴａｎｄｅｍＱｕａｄ
ｒｕｐｏｌｅＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで行った。

【００４３】（環状並べ換え遺伝子の構築）環状並べ換え改変体を、ＣｈｉｌｋｏｔｉＡ．ら，（１９９５）Ｐｒｏｃ
ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ９２：１７５４−１７５８）に教示され
る通りにコアストレプトアビジンについての合成遺伝子から構築した。Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーを用いて、元の末端を連結した。ストレプトア
ビジンのタンデムな遺伝子（ＨｏｒｌｉｃｋＲＡら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＥｎｇ５：４２７−４３１）を、所望の環状置換の生成のための「テンプ
レート」として最初に供して構築した。このタンデムなストレプトアビジンの遺
伝子を、ＰＣＲ変異誘発を用いて野生型遺伝子由来の半分２つにおいて構築した
。４つのプライマーを対になるように用いて、各半分を生成した。最初の半分は
、３’末端に付加される新たなリンカー配列を有する野生型遺伝子をコードする
。このリンカー配列は、ストレプトアビジンの元の末端を架橋するＧｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒセグメントをコードする。第２の半分は、このリンカー配列
を、ストレプトアビジン遺伝子の５’末端に付着させる。両方のフラグメントを
、別個のＰＣＲ反応において生成し、そしてｐＴ７Ｂｌｕｅプラスミド中にサブ
クローニングした。両方のフラグメントのリンカー領域における独特の部位でＮ
ｈｅＩ制限酵素を用いて切断した後、この半分２つを一緒に連結して、タンデム
なストレプトアビジン遺伝子を作製した。各セットのフラグメントの配列、なら
びに最終的なアセンブリの配列を、ダイターミネート（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｅｄ）ＤＮＡ配列決定を用いて誤りについてチェックした。

【００４４】ＰＣＲ変異誘発によってＣＰ５１／４６変異体を作製するために、２つのさら
なるプライマーを設計および合成した。センスのプライマーは、このタンデム遺
伝子の第１の半分において残基５１でアニーリングし、そしてこの遺伝子の開始
部にＮｄｅＩ部位を付加する。アンチセンスプライマーは、このタンデム遺伝子
の第２の半分において残基４６にアニーリングし、そして停止コドン、続いてＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位を付加する。３５サイクルのＰＣＲ変異誘発（９０℃×２分間
；５０℃×２分間；７２℃×２分間）は、環状に変異された遺伝子を生成し、こ
の遺伝子はＮｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ｐＴ７Ｂｌｕｅプラスミド
に連結され、そしてＮｏｖａＢｌｕｅ維持宿主へ形質転換された。この遺伝子を
、後に、発現のためのＢＬ２１（ＤＥ３）宿主におけるＮｏｖａｇｅｎｐＥＴ
−２１ａプラスミド中にサブクローニングした。名称ＣＰ５１／４６は、元の野
生型配列の残基５１へのＮ末端の再配置、および残基４６へのＣ末端の再配置を
反映する。ＤＮＡ配列決定を用いて、変異遺伝子の完全性を確認した。

【００４５】（Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣＰ５１／４６の発現）ｐＥＴ−２１ａにおいてＣＰ５１／４６遺伝子を含有するＢＬ２１（ＤＥ３）
細胞を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３７℃にて一晩培養した
。細胞ペレットを洗浄し、そして新鮮なＬＢ中に再懸濁し、その後、１００μｇ
／ｍＬアンピシリンを補充した２×ＹＴ培地５リットルを接種するために用いた
。この培養物を、Ａ₆₀₀が１．０に到達するまで振盪しながら３７℃にてインキュベートし、この時点で、タンパク質発現を、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。細胞を、さらに３時間培
養し、その後遠心分離によって収集した。

【００４６】（ＣＰ５１／４６の単離および精製）細胞ペレットを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、５ｍ
ＭＥＤＴＡ、８％スクロース、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および１ｍ
Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）中にｐＨ８．０で再懸濁し
た。細胞を超音波処理により溶解し、そして１７７００ｇにて２０分間遠心分離
した。不溶性画分を超音波処理し、そしてさらに２回遠心分離し、次いでペレッ
トを超音波処置し、そしてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない同じ緩衝液中で
３回遠心分離した。ＣＰ５１／４６タンパク質を含む、残存する不溶性封入体を
、１０ｍｇ／ｍＬを超えない濃度になるまで６Ｍグアニジン、５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に溶解し、そして４℃にて数時間平衡化させた。
次いで、可溶化したタンパク質を、５０×容量の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
１００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＰＭＳＦ（ｐＨ７．５
）中で４℃にて攪拌しながら滴下して希釈し、そして一晩平衡化させた。得られ
る溶液を遠心分離して、不溶性物質を除去し、そして攪拌したＡｍｉｃｏｎ（Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）限外濾過セルにおいて濃縮した。

【００４７】ＣＰ５１／４６を、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）イミノビオチン
−アガロース（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗｏｏｄ，Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｍｏｎｔｉｂｅｌ
ｌｅｒ＆Ｆｉｎｎ，１９８０）でのアフィニティークロマトグラフィーによ
って精製した。タンパク質含有画分をプールし、そして５０ｍＭホスフェート、
１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．７５）の貯蔵緩衝液に交換した。

【００４８】（等温滴定熱量測定）野生型ストレプトアビジンについての等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）実験を、Ｍ
ｉｃｒｏＣａｌＯｍｅｇａ装置で行った。ＣＰ５１／４６についてのＩＴＣ実
験を、ＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ４
２００Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｖｏ，ＵＴ）を用いて行った。３０〜
４０μＭ濃度のＣＰ５１／４６溶液を、タンパク質と同じ緩衝液に溶解した７５
０μＭビオチンの２０×５μＬアリコートの添加によって滴定した。全てのＩＴ
Ｃ実験を、リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ
、ｐＨ７．７５）またはＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、１００
ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．７５）のいずれかにおいて行った。ビオチンの濃度を
、重量測定によって決定した。

【００４９】データを、ＣａｌｏｒｉｍｅｔｒｙＳｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎによって供給された、著作権を有するソフトウェアを用いて、機器で分析した
。各注射についての希釈熱を、データ分析の前に反応熱から差し引いた。データ
の非線形適合は、非協同的な結合および１サブユニットあたり１部位を仮定して
、結合部位の数（ｎ）、結合定数（Ｋ_a）、および結合エンタルピー（ΔＨ°）を決定することを可能にした。

【００５０】野生型ストレプトアビジンは、２．５×１０¹³Ｍ^-1と推測されるＫ_aを示す（ＧｒｅｅｎＮＭ（１９９０））。アビジンおよびストレプトアビジン（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１８４：５１−６７）、および野生型ストレプトア
ビジンの標準結合エンタルピーは、２５℃で、−２４．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであ
る（ＣｈｉｌｋｏｔｉＡ，ら（１９９５）ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ１１
７：１０６２２−１０６２８）。次いで、推測Ｋａおよび関連づけられた標準ギ
ブス自由エネルギーを用いると、野生型ストレプトアビジンのＴΔＳ°項は、２
５℃で、−６．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。ＣＰ５１／４６変異体では、ビオ
チンのＫ_aは、２５℃で、２．２８（±０．４４）×１０⁷Ｍ^-1（ΔＧ°＝−１０
．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）まで約６桁の規模で減少される（図２を参照のこと）。
ビオチンの結合は、２５℃で、−１３．８（±０．８）ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＨ
°および−３．８（±０．８）ｋｃａｌ／ｍｏｌのＴΔＳ°項で依然としてエン
タルピー的に駆動される。リン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液の両方のエンタル
ピー値は、互いに実験誤差内であり、このことは、プロトン化効果が変異体では
有意でないことを示唆する（以下の表１を参照のこと）。

【００５１】熱容量の変化もまた、ループの役割に熱力学的洞察をさらに提供するためにＣ
Ｐ５１／４６について測定した（図２ｂを参照のこと）。ΔＣｐは、野生型スト
レプトアビジン（−３４５ｃａｌ／ｍｏｌ℃（標準偏差＝１２ｃａｌ／ｍｏｌ℃
））の値と比較して、有意に少なく負（−９５ｃａｌ／ｍｏｌ℃（標準偏差＝２
９ｃａｌ／ｍｏｌ℃））であった。この変化は、ループの欠失後のＣＰ５１／４
６結合状態において埋没した表面積の予測された減少と定性的に一致する。Ｓｐ
ｏｌａｒＲＳ，ら（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：７７７−７８４によ
るアビジン−ビオチン系の以前の分析によって、ビオチン結合のΔＣｐがループ
残基の折り畳みが優勢であることが示唆された。ΔＣｐに関連する算出の結果お
よび接近可能な表面積の変化を、表１ｂに示す。

【００５２】

【表１】（結晶化および回折のデータ収集）３０ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＣＰ５１／４６タンパク質水溶液を、結晶化実
験のために用いた（ハンギングドロップ蒸気拡散法）。変異体を、５２％ＭＰ
Ｄ（２−メチル−ペンタン−２，４−ジオール）含有溶液から棒状の形態で結晶
化した。０．０５×０．０５×０．５ｍｍの寸法の結晶を、ガラスキャピラリー
にマウントし、そしてＲｉｇａｋｕＲＵ−２００回転アノード（ＣｕＫα＝１
．５４１７８Å）を取り付けたＲ−ＡＸＩＳＩＩイメージプレート検出器シス
テムで、回折データを２９３Ｋで収集した。結晶は、２．０Å解像度まで回折し
、そしてデータを、５．２の平均Ｉ／σで、９４％の完全性まで収集した。斜方
ユニットセルの寸法は、ａ＝６０．３、ｂ＝７８．６、ｃ＝９３．５Åであり、
そして空間群は、Ｐ２₁２₁２₁（Ｚ＝４）である。タンパク質の１つのテトラマーは、非対称ユニットで見出される。データ処理を、ＤＥＮＺＯ（Ｏｔｗｉｎｏ
ｗｓｋｉＺ，ら（１９９４）、ＤＥＮＺＯ：Ａｆｉｌｍｐｒｏｃｅｓｓｉ
ｎｇｐｒｏｇｒａｍｆｏｒｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒａｐｈｙ、ＮｅｗＨａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ：Ｙａｌｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して行った。全体のＲ（Ｉ）_mergeは、０．０６９であった。以下の表２は、収集したデータの概要を示す。ＣＰ５１／４６の
ビオチン複合体の結晶を、ハンギングドロップ実験から、ビオチンおよび変異ス
トレプトアビジンの共結晶化により得た。このタンパク質溶液は、１２ｍｇ／ｍ
ｌのＣＰ５１／４６、１０ｍＭビオチンであった。リザーバー溶液は、５２％
ＭＰＤであった。結晶は、０．１×０．３×０．７ｍｍの寸法を有する長い板
状であった。回折データを、ＳｔａｎｆｏｒｄＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＲａ
ｄｉａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙで、１００Ｋ（λ＝０．９８Å）、ビー
ムライン９−１で収集した。Ｒ−ＡＸＩＳＩＩでの室温データを収集する以前
の試みは、より低い解像度のデータセットを生じた（２．３Åおよび２．６Å）
。衝撃凍結結晶（ｓｈｏｃｋｆｒｏｚｅｎｃｒｙｓｔａｌ）は、１．８Å解
像度まで回折し、平均Ｉ／σは、１５．８であった。このデータセットの全体的
な完全性は、９８％である。ユニットセルのパラメーターは、ａ＝７１．９Å、
ｂ＝７８．６Å、ｃ＝９０．８Åである。斜方空間群は、Ｐ２₁２₁２₁である。タンパク質−ビオチン複合体の１つのテトラマーは、この結晶形態では非対称ユ
ニットである。データ処理およびスケーリングを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥ
ＰＡＣＫ（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉＺ，ら（１９９４）、ＤＥＮＺＯ：Ａｆｉ
ｌｍｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｐｒｏｇｒａｍｆｏｒｍａｃｒｏｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、ＮｅｗＨａｖｅｎ，Ｃｏｎｎｅ
ｃｔｉｃｕｔ：ＹａｌｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して行った。全体のＲ
（Ｉ）_mergeは、０．０３７であった（表２）。

【００５３】

【表２】（構造解析および細分）テトラマーの野生型コア−ストレプトアビジンモデル（残基１６〜４４および
５２〜１３３、ＰＤＢエントリーＩＳＷＡ（ＦｒｅｉｔａｇＳ，ら（１９９７
）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ６：１１５７−１１６６）を、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｂｒ
ｕｎｇｅｒＡＴ（１９９２）Ｘ−ＰＬＯＲ、ＡＳｙｓｔｅｍｆｏｒＣｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙａｎｄＮＭＲ、ｖ．３．１、ＹａｌｅＵｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＨａｖａｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）
を使用するＣＰ５１／４６の分子置換構造解析における検索モデルとして使用し
た。交差回転（ｃｒｏｓｓ−ｒｏｔａｔｉｏｎ）関数および並進（ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎ）関数の結果の適用後では、Ｒ値は、０．４５７であった。テトラマ
ーの２つの折り畳み（ｆｏｌｄ）の対称軸は、結晶軸と整列せず、このことによ
って、非対称ユニットでテトラマーが存在することが確認された。

【００５４】得られたモデルは、ＳＨＥＬＸＬ−９７（ＳｈｅｌｄｒｉｃｋＧＭ（１９９
７）ＳＨＥＬＸＬ、ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅＲｅｆｉｎ
ｅｍｅｎｔ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｅｔｔ
ｉｎｇｅｎ）のβ版を用いて、完全行列、最小二乗剛体細分（ｌｅａｓｔｓｑ
ｕａｒｅｓｒｉｇｉｄｂｏｄｙｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）に供され、これに
よって、データについてＩ＞２σ（Ｉ）でＲ値＝０．３８４が与えられた。細分
の間中を通して、全てのデータには、１０Åの解像度から最も高い限界（２．０
Å）までを含めた。反射データの１０％を、別個のファイルに保持し、そしてＲ _free の算出のために使用した（ＢｒｕｎｇｅｒＡＴ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ
３５５：４７２−４７５）。この段階で、Ｒ_freeの値（Ｉ＞２σ（Ｉ））は、
０．４２２であった。ＳＨＥＬＸＬにおいて実行されたように、結合体勾配法（
ＫｏｎｎｅｒｔＪＨ，ら（１９８０）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ
３６：３４４−３５０）を用いる引き続く位置細分およびＢ因子細分は、Ｒ値（
Ｉ＞２σ（Ｉ））が０．２６５まで、およびＲ_free（Ｉ＞２σ（Ｉ））が０．３
３５まで低下した。新たな操作ループ（残基１３３〜１８）の電子密度を、第１
の細分工程後の｜Ｆ_O｜−｜Ｆ_C｜マップにおけるサブユニット２および３におい
て観察した。これらの２つのループのモデリングおよび細分における３１水の位
置の付加によって、Ｒ値が０．２１３まで減少し、そしてＲ_freeが０．３００ま
で減少した（両データともＩ＞２σ（Ｉ））。最後のモデルは、サブユニット１
および４において残基５２〜１３３および１４３〜１４５、そしてサブユニット
２および３において残基５２〜４５、ならびに２１４水分子を含む。最終的なＲ
値（Ｉ＞２σ（Ｉ））は０．１４５であり（全てのデータについて０．１９５）
、そしてＲ_free（Ｉ＞２σ（Ｉ））は０．２２９（全てのデータについて０．２
８８）である。

【００５５】分子置換法を再び使用し、同じ野生型ストレプトアビジンモデルで開始してビ
オチン複合体の構造を解明した。ＡＭｏＲｅプログラムパッケージ（Ｎａｖａｚ
ａＪ（１９９４）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ５０：１５７−１６
３）を解法のために使用し、そして回転関数からの最良の解に関する相関係数は
、０．２９８であった。８つの最良の回転の解に関して並進関数を算出した後の
最良な解は、０．５２３の相関係数を有し、そして０．４１１のＲ値を有した。
完全なテトラマーおよび全ての４つのサブユニット別々についての剛体細分（ｒ
ｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）後、ＳＨＥＬＸＬ−９７（ＳｈｅｌｄｒｉｃｋＧＭ（１
９９７）ＳＨＥＬＸＬ、ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅＲｅｆ
ｉｎｅｍｅｎｔ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｅ
ｔｔｉｎｇｅｎ）での座標細分は、Ｉ＞２σ（Ｉ）を有するデータについて０．
４１２のＲ値および０．４４２のＲ_free値を生じた。１０〜１．８Åの解像度の
範囲の全てのデータを、非結合状態について上記のように、細分を通して使用し
た。Ｒ_freeデータセットは、この範囲におけるデータの１０％を含んだ。ビオチ
ンを、ＳｉｇｍａＡ加重｜Ｆ_O｜−｜Ｆ_C｜電子密度マップ（ＳｉｇｍａＡｗａ
ｉｇｈｔｅｄ｜Ｆ_O｜−｜Ｆ_C｜ｅｌｅｃｔｒｏｎｄｅｎｓｉｔｙｍａｐ）
（ＲｅａｄＲＪ（１９８６）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ４２：１
４０−１４９）において４つのサブユニット全ての結合部位においてはっきりと
同定した。また、サブユニット３において、操作されたループの残基を、非結合
構造におけるコンホメーションとは異なるコンホメーションでモデリングした。
ビオチン複合体についての最終的なモデルは、サブユニット１および２において
残基５２〜１３２および残基１６〜４６；サブユニット３において残基５２〜４
６ならびにサブユニット４において残基５１〜１３３および１６〜４５；ならび
に４つのビオチンリガンドおよび３３５の水分子を含む。最終的なＲ値は、Ｉ＞
２σ（Ｉ）を有するデータについては０．１８１であり、全てのデータについて
は、０．１９２である。最終的なＲ_free値は、０．２３１（Ｉ＞２σ（Ｉ））お
よび０．２４５（全てのデータ）である。

【００５６】両方の分子モデルは、構造因子振幅の平方に対して細分される。全てのパラメ
ーター、座標および等方性置換パラメーターは、ともに細分される。１，２−お
よび１，３−距離の拘束（ｄｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｔｒａｉｎｔ）について標
的値は、ＥｎｇｈＲＡ，ら（１９９１）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
Ａ４７：３９２−４００の研究に基づく。非結合原子が標的距離より近くにくる
場合、平面性（ｐｌａｎａｒｉｔｙ）およびキラル容積拘束（ｃｈｉｒａｌｖ
ｏｌｕｍｅｒｅｓｔｒａｉｎｔ）を、等方性置換パラメーターおよび抗衝突拘
束についての類似性拘束のように適用した。拡散溶媒領域は、Ｂａｂｉｎｅｔの
原理（ＭｏｅｗｓＰＣ，ら（１９７５）ＪＭｏｌＢｉｏｌ９１：２０１
−２２８）を使用してモデリングした。ＳＨＥＬＸＬにおいて実行されたように
、観察された構造因子の異方性スケーリング（ＰａｒｋｉｎＳ，ら（１９９５
）ＪＡｐｐｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ２８：５３−５６）を、細分に適用
した。水素原子を、幾何学的に理想化し、そして最後のサイクルにおいて操作モ
デル（ｒｉｄｉｎｇｍｏｄｅｌ）で細分した。

【００５７】ＸｔａｌＶｉｅｗ（ＭｃＲｅｅＤＥ（１９９２）ＪＭｏｌＧｒａｐｈ
１０：４４−４６）を細分の間にモデルの立体評価（ｇｒａｐｈｉｃａｌｅｖ
ａｌｕａｔｉｏｎ）のために使用した。ＳｉｇｍａＡ加重｜Ｆ_O｜−｜Ｆ_C｜およ
び２｜Ｆ_O｜−｜Ｆ_C｜電子密度マップ（ＲｅａｄＲＪ（１９８６）Ａｃｔａ
ＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒＡ４２：１４０−１４９）をインタラクティブインタ
ーフェースプログラムＳＨＥＬＸＰＲＯ（ＳｈｅｌｄｒｉｃｋＧＭ（１９９７
）ＳＨＥＬＸＬ、ＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅＲｅｆｉｎｅ
ｍｅｎｔ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｏｅｔｔｉ
ｎｇｅｎ）を用いて算出した。さらに、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（Ｌａｓｋ
ｏｗｓｋｉＲＡ，ら（１９９３）ＪＡｐｐｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ２
６：２８３−２９１）およびＷＨＡＴＩＦ（ＶｒｉｅｎｄＧ，ら（１９９３）
ＪＡｐｐｌＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ２６：４７−６０）を利用して、細分
プロセスの間に立体化学をチェックした。大部分の細分した水の位置は、ＳＨＥ
ＬＸＷＡＴ（水の位置の自動化検索のためのＳＨＥＬＸＬの補助プログラム）に
よって見出された。最小二乗適合のための全ての平方二乗平均は、βシート領域
における残基１９〜２３、２８〜３３、３８〜４２、５４〜６０、７１〜８０、
８５〜９７、１０３〜１１２、１２３〜１３１（配列番号１）を使用し、Ｘ−Ｐ
ＬＯＲを用いて算出した。図３、４および５は、ＸｔａｌＶｉｅｗプロット（Ｍ
ｃＲｅｅＤＥ（１９９２）ＪＭｏｌＧｒａｐｈ１０：４４−４６）であ
る。

【００５８】ＣＰ５１／４６の結晶構造を、２．０Åの解像度で決定し、そして０．１４５
のＲ値に細分した。データ収集およびモデル細分の結果を、表２および３にまと
める。他のコア−ストレプトアビジン構造を有するＣＰ５１／４６テトラマーの
全体的な折り畳みの比較は、それらの間の大きな差異を示さない。単斜晶系野生
型構造（ＰＤＢエントリー１ＳＷＡ、１ＳＷＢ、１ＳＷＣ）におけるＣＰ５１／
４６の４×６５βシートＣα原子の最小二乗適合は、適合させたサブユニットに
ついて０．２Åのｒｍｓ距離ＲＭＳＤを生じ、そして他の３つのサブユニットに
ついて０．２〜１．０Åの範囲の値を生じた。この４つの個々のＣＰ５１／４６
サブユニットの互いの最小二乗重ね合わせは、全く有意差を示さず（それぞれ、
ＴＭＳＤ＝０．２Å）、βバレル構造において系統的な変化を示さなかった。

【００５９】

【表３】ＣＰ５１／４６のビオチン複合体の結晶構造を、１．８Åの解像度で決定し、
そして細分した。最終的なＲ値は、０．１８１である。ビオチンの電子密度は、
低分子リガンドにおける全ての分子についてはっきりと規定された（図３）。野
生型ビオチン複合体構造に対するＣＰ５１／４６ビオチン複合体の４×６５Ｃα
原子を重ね合わせた後のＲＭＳＤは、０．３Åであった。野生型テトラマー複合
体のＣＰ５１／４６の複合体への重ね合わせ（しかし、１つのサブユニットのみ
の重ね合わせに基づく）は、適合させたサブユニットについては０．２〜０．３
ÅのＲＭＳＤおよび他の３つのサブユニットについては０．３〜０．７ÅのＲＭ
ＳＤを与える。

【００６０】（接続残基の特徴付け）アポ−ＣＰ５１／４６の全体的な構造が野生型ストレプトアビジンの構造と同
じである一方で、タンパク質が特異的に改変された２つの領域に構造的変化が存
在する。非結合ＣＰ５１／４６の構造の特徴は、元のＮ末端およびＣ末端を接続
する、順序づけられ、操作されたポリペプチドの（結晶の４つのサブユニットの
うち２つでの）知見である。この構造のこの部分（１７残基を含む）は、サブユ
ニット２および３において十分順序づけられている。この領域における電子密度
差を図４（ａ）に示す。残基１３〜１５および１３４〜１３９（配列番号１）は
、ＣＰ５１／４６結晶ではなく、他の単斜系野生型構造において乱れており（Ｆ
ｒｅｉｔａｇＳ，ら（１９９７）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ６：１１５７−１
１６６）、それらは、４つの挿入された残基Ｇｌｙ１４０、Ｇｌｙ１４１、Ｇｌ
ｙ１４２、およびＳｅｒ１４３とともに明らかに同定され得る（配列番号１）。
元のＮ末端とＣ末端との間のコネクタのアミノ酸配列は、［．．．Ｖａｌ１３３
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ１４０−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ１４３−Ａｌａ１３−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ１６．．．］であ
る（配列番号４の残基Ｖａｌ１８４〜Ｇｌｙ１０８）。

【００６１】２つの観察されたコネクタ（残基１３３〜１６）（配列番号４の残基８４〜１
０８）は、この結晶形態において主要な充填相互作用の領域を形成する（図５）
。各テトラマーからの２つのコネクタは、２つの隣り合うテトラマーと相互作用
を形成し、このテトラマーはまた、第１のテトラマーと、それらの接続領域のう
ちの１つと相互作用する。タンパク質の他のループ領域と比較して、サブユニッ
ト２および３の連結残基の剛性は、これらの充填相互作用によって説明すること
ができ、そしてそれらの低い温度因子によって示される。サブユニット２におけ
る残基１３３〜１８（配列番号４の残基８４〜１１０）の原子についての平均Ｂ
値は、２５Å²であり、サブユニット３においては２４Å²である（テトラマーの
全ての原子についての平均Ｂ値：２９Å²）。

【００６２】操作されたリンカーを含むＣＰ５１／４６構造のＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプ
ロットは、アウトライアーを示さず、そしてこれらの領域におけるφΨ分布は、
正規である。サブユニット２および３における接続領域は、非常に類似している
。残基１３３〜１８（配列番号４の残基８４〜１１０）のＣα原子間の構造の重
なり合いは、０．１６ÅのＲＭＳＤを生じる。プログラムＰＲＯＭＯＴＩＦ（Ｈ
ｕｔｃｈｉｎｓｏｎＥＧ，ら（１９９６）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ５：２１
２−２００）によって、残基Ａｌａ１３７、Ａｌａ１３８およびＳｅｒ１３９（
配列番号４の残基Ａｌａ８８、Ａｌａ８９、Ｓｅｒ９０）によって形成された３ ₁₀ −らせん部分以外の二次構造要素がないことが見出された。他のサブユニット
（１および４）において、残基１４３、１３、１４および１５のみ（配列番号４
の残基Ｓｅｒ９４、Ａｌａ９５、Ｇｌｕ９６、Ａｌａ９７）が、野生型構造で見
出された電子密度を超える電子密度で観察される。残基１３〜１７（配列番号４
の残基９５〜９９）を、ＰＲＯＭＯＴＩＦによって、両方のサブユニットにおけ
るαヘリックスを形成すると同定した。サブユニットに対するサブユニット２お
よび３の重なり合い（完全なコネクタが観察される）。サブユニット１および４
上でサブユニット２および３の重なり合い（完全なコネクタが観察される場合）
は、リンカーの剛性コンホメーションが後者のサブユニットの結晶充填に適合し
ない。接続残基１３４〜１４２（配列番号４の残基８５〜９３）はサブユニット
１および４において乱されている。ＣＰ５１／４６における元のＣ末端残基の異
なる配向のために、隣接するＴｙｒ２２（配列番号４のＴｙｒ１０４）側鎖は、
１つのコンホメーション（χ１が４つ全てのサブユニットにおいて約１８０℃回
転している）と適合する。他の側鎖の変化は、非結合形態においては検出されな
かった。

【００６３】ＣＰ５１／４６のビオチン複合体を、非複合体化変異体の結晶形態とは異なる
結晶形態で結晶化し、そして接続ポリペプチドをサブユニット３のみについて順
序づける（図４（ｂ））。リンカーのコンホメーションは、非結合構造で見出さ
れるコンホメーションとは異なり、そしてαヘリックス（残基１４から１７）（
配列番号４の残基９６〜９９）の短いセグメントを含む。

【００６４】ビオチン複合体の結晶構造において順序づけられたリンカーは、隣り合うテト
ラマーのサブユニット２で結合したビオチン分子と接触する。水素結合（３．０
Å）は、Ｓｅｒ１３９（配列番号４のＳｅｒ９０）（関連する対称分子）のアミ
ド窒素原子と、ビオチンの脂肪鎖上のカルボキシル基の酸素（Ｏ１）のうちの１
つとの間に形成される。カルボキシル酸素（Ｏ１に対して３．４ÅおよびＯ２に
対して２．５Å）の両方を有する対称関連分子のＳｅｒ１３９Ｏγ間に２つの相
互作用がまた存在する。これらは、このサブユニットにおいて結合したビオチン
におけるコンホメーション変化を引き起こすには不十分であるが、ビオチン温度
因子は他のサブユニットよりもこのサブユニットにおいてより低く、リガンドと
接続ループとの間のさらなる相互作用と一致する。

【００６５】（アポ−ＣＰ５１／４６における結合部位およびＣＰ５１／４６−ビオチン複
合体の特徴付け）ビオチン結合部位近傍の新たなＮ末端およびＣ末端の導入は、タンパク質構造
を有意に変化させ得、従ってビオチンに対するその結合親和性を変化させ得る。
新たなＮ末端およびＣ末端の３つの残基は、非結合構造において乱されており、
そして電子密度マップにおいて観察されない。Ｎ末端メチオニンは電子密度にお
いて見られない。残基Ｇｌｕ５１（配列番号４のＧｌｕ２）もまた、Ｃ末端残基
Ａｌａ４６（配列番号４のＡｌａ１２８）のように、電子密度マップにおいて移
動性であり、そして見られない。観察された末端残基は、Ｓｅｒ５２およびＳｅ
ｒ４５（配列番号４のＳｅｒ３およびＳｅｒ１２７）であり、これは、この構造
の残りの部分において見出されたＢ値よりも主鎖および側鎖の原子について明確
により高いＢ値を示す。非結合およびビオチン結合の野生型構造と、この領域に
おけるＣＰ５１／４６との比較は、非結合構造により類似していることを明らか
にする。ここでこの結合ループは、複合体におけるコンホメーションより、より
移動性の開放性のコンホメーションをとる。野生型の非結合状態における最後の
βシート水素結合は、Ｓｅｒ４５のＮ原子（配列番号４のＳｅｒ１２７）とＳｅ
ｒ５２のＯ原子（配列番号４のＳｅｒ３）との間に存在する。この相互作用はま
た、４つのサブユニットの距離が３．０〜３．４Åの範囲であるＣＰ５１／４６
において観察される。

【００６６】ＣＰ５１／４６のビオチン複合体の４つのサブユニットにおける末端を、野生
型構造におけるそれらの残基と十分に整列する。サブユニット１、２および３に
おいて、残基４６（配列番号４のＡｌａ１２８）は、電子密度マップにおいて観
察された。サブユニット４において、さらなる残基５１（配列番号４のＧｌｕ２
）はＮ末端で細分されたが、Ｎ末端メチオニンは全く観察されなかった。Ｓｅｒ
４５（配列番号４のＳｅｒ１２７）の窒素とＳｅｒ５２（配列番号４のＳｅｒ３
）の酸素との間の水素結合の切断を生じる、互いからのわずかな末端の分離が存
在する。このことはまた、野生型ストレプトアビジンの構造において観察された
（ＦｒｅｉｔａｇＳ，ら（１９９７）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ６：１１５７
−１１６６）。その水素結合の切断は、Ｓｅｒ４５のＯγと結合ビオチンのウレ
イド窒素原子との間の水素結合の形成に付随する。

【００６７】ＣＰ５１／４６−ビオチン複合体の４つのサブユニット全てにおいて、ビオチ
ンの電子密度は、野生型ビオチン複合体と同じ配向で検出された（図３）。野生
型とＣＰ５１／４６との間のビオチンについての水素結合パターンにおける差異
のみが、カルボキシルＯ１原子に関与する。この野生型複合体において、この酸
素原子は、Ａｓｎ４９（配列番号１）のアミドに水素結合されるが、結合ループ
の欠失は、この相互作用を取り除く。結晶充填相互作用は、（上記のように）サ
ブユニット２のループ相互作用を置換する。他の第１殻の水素結合全ては、野生
型複合体において見出されたものに非常に類似している（ＦｒｅｉｔａｇＳ，
ら（１９９７）ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ６：１１５７−１１６６）。第２殻の
水素結合は、野生型タンパク質のＳｅｒ４５（配列番号４のＳｅｒ１２７）と相
互作用する残基Ｖａｌ１４７の欠失によって破壊される。

【００６８】ビオチン部位にわたって接近するループの欠失が、ＣＰ５１／４６のビオチン
リガンドに溶媒が接近可能な有意により大きな表面を生じることが予測される。
事実、変化は全てではないが、大きく変化する。野生型複合体におけるビオチン
に溶媒が接近可能な表面の平均は、１８．３Å²であり、このことは、ストレプトアビジンに結合した場合、ビオチンのほぼ完全な埋没を示す。（溶媒が接近可
能な、ビオチンの「自由な」表面は、４０７．２Å²である）。露出されたビオチンの原子のみがカルボキシ酸素原子である。接近可能な表面は、ＣＰ５１／４
６複合体について５６．６Å²に増加する。酸素原子は、脂肪鎖の部分が露出されるにつれて、より露出される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、野生型コアストレプトアビジンのアミノ酸配列と環状並べ換えストレ
プトアビジンの好ましい実施態様である、ＣＰ５１／４６と名付けられたものの
アミノ酸配列との間の関係を示す模式図である。野生型タンパク質のループ残基
４７〜５０（配列番号１）は除去され、そして古いＮ末端およびＣ末端は、４ア
ミノ酸残基リンカー（配列番号２の残基１〜４）によって連結されている。

【図２】図２Ａは、２５℃におけるＣＰ５１／４６についての代表的な結合等温線を図
示する、注入対熱（μＪ）のグラフである。各々の注入についての熱を、黒い記
号（黒ひし形）で示し、そして混合の熱について調整した。パラメーターで表し
た適合度を、点線として示す。図２Ｂは、ＣＰ５１／４６の熱容量変化（ΔＣ_p）についての直線適合度を示すエンタルピー変化（ΔＨ、ｋｃａｌ／モル）に対する温度（Ｔ、℃）のグラフ
である。黒い記号（黒丸）は、３回の実験についての標準エンタルピー変化（Δ
Ｈ⁰）変化を示す。エラーバーは、１つの標準偏差を示す。点線は、データの直線適合度を示す。

【図３】図３は、環状並べ換えストレプトアビジン−ビオチン複合体のサブユニットの
１つにおけるビオチンの領域における、２．４σで輪郭化された（ｃｏｎｔｏｕ
ｒｅｄ）不偏電子の差分マップである。上書きは、精製されたビオチンである。

【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、ＣＰ５１／４６構造のサブユニット２および３におい
て（１．５σで輪郭化した）（図４Ａ）、およびＣＰ５１／４６変異体−ビオチ
ン複合体のサブユニット３において（１．５σ輪郭レベル）（図４Ｂ）観察され
るような、新しく操作された連結ループ（残基１３３〜１５を含む）の領域にお
ける電子密度マップである。

【図５】図５は、隣接するＣＰ５１／４６テトラマー間の充填相互作用を模式化した図
である。隣接するテトラマーの操作されたループは、結晶中の次のテトラマーと
の相互作用に高度に関与する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ【要約の続き】リンカーによって連結された。ビオチン結合定数は、野生型ストレプトアビジンのビオチン結合定数よりもおよそ６桁低い１０⁷Ｍ^-1まで減少した。環状並べ換えストレプトアビジンの融合タンパク質は、第２のペプチド／タンパク質（例えば、ＩｇＧ結合プロテインＡまたは単鎖抗体）を用いて作製され得る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】環状並べ換えビオチン結合タンパク質であって、ストレプトアビジンポリペプチドを含み、ここで該ストレプトアビジンポリペ
プチドのカルボキシル末端アミノ酸およびアミノ末端アミノ酸が連結され、そし
て新しいカルボキシル末端およびアミノ末端が、該ストレプトアビジンポリペプ
チドの開裂によって作製された、タンパク質。
【請求項２】前記ストレプトアビジンのカルボキシル末端アミノ酸および
アミノ末端アミノ酸が、１つ以上のアミノ酸を含むリンカーによって連結されて
いる、請求項１に記載の環状並べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項３】前記リンカーが、３つのグリシンおよび１つのセリンを含む
テトラペプチドであり、ここで１つのグリシンはカルボキシル末端アミノ酸に連
結され、そして該セリンはアミノ末端アミノ酸に連結されている、請求項２に記
載の環状並べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項４】前記ストレプトアビジンポリペプチドの一部が除去されて、
新しいカルボキシル末端およびアミノ末端を形成する、請求項１に記載の環状並
べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項５】前記除去されるストレプトアビジンポリペプチドの一部が、
ビオチン結合に関与する可撓性ループの全てまたは一部である、請求項４に記載
の環状並べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項６】前記除去されるストレプトアビジンポリペプチドの一部が、
アミノ酸残基４７〜５０である、請求項５に記載の環状並べ換えビオチン結合タ
ンパク質。
【請求項７】前記環状並べ換えビオチン結合タンパク質のビオチン結合ア
フィニティーが、少なくとも野生型ストレプトアビジン結合アフィニティーの２
５％である、請求項１に記載の環状並べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項８】前記環状並べ換えビオチン結合タンパク質のビオチン結合ア
フィニティーが、１０⁷Ｍ^-1と野生型ストレプトアビジンのビオチン結合アフィニティーとの間である、請求項１に記載の環状並べ換えビオチン結合タンパク質
。
【請求項９】環状並べ換えビオチン結合タンパク質の作製方法であって、
以下の工程：化学合成、存在するタンパク質の改変、または組換えＤＮＡ方法論を使用する
タンパク質の発現によって、請求項１に規定されるような環状並べ換えビオチン
結合タンパク質を作製する工程、を包含する、方法。
【請求項１０】請求項９に記載の方法であって、以下の工程：ストレプトアビジンポリペプチドを、リンカーの存在下で反応させて、該リン
カーと該ストレプトアビジンポリペプチドのカルボキシル末端およびアミノ末端
との間に共有結合を形成する工程であって、従って環状タンパク質を形成する工
程；および、別の位置で、アミノ酸を連結しているペプチド結合を開裂させることによって
、新しい末端を形成する工程、を包含する、方法。
【請求項１１】請求項９に記載の方法であって、以下の工程：前記環状並べ換えビオチン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
を作製する工程；該ポリヌクレオチドを、適切な発現プロモーターの制御下にある発現カセット
中に配置する工程；宿主中で該タンパク質を発現する工程；および該発現したタンパク質を単離する工程、を包含する、方法。
【請求項１２】環状並べ換えビオチン結合タンパク質および第２のポリペ
プチドを含む融合タンパク質の作製方法であって、以下の工程：請求項１に規定されるような環状並べ換えビオチン結合タンパク質を作製する
工程；および第２のポリペプチドを、該環状並べ換えビオチン結合タンパク質のカルボキシ
ル末端アミノ酸またはアミノ末端アミノ酸のいずれかに連結する工程、を包含する、方法。
【請求項１３】前記環状並べ換えビオチン結合タンパク質と前記第２のタ
ンパク質との間にスペーサーを連結する工程をさらに含む、請求項１２に記載の
方法。
【請求項１４】前記ストレプトアビジンポリペプチドが野生型ストレプト
アビジンである、請求項１に記載の環状並べ換えビオチン結合タンパク質。
【請求項１５】融合タンパク質であって、以下：環状並べ換えビオチン結合タンパク質であって、該タンパク質はストレプトア
ビジンポリペプチドを含み、ここで該ストレプトアビジンポリペプチドのカルボ
キシル末端アミノ酸およびアミノ末端アミノ酸が連結され、そして新しいカルボ
キシル末端およびアミノ末端が該ストレプトアビジンポリペプチドの開裂によっ
て作製される、ポリペプチド；および該新しいカルボキシル末端または該新しいアミノ末端のいずれかにおいて、該
環状並べ換えビオチン結合タンパク質に連結された第２のポリペプチド、を含む、融合タンパク質。
【請求項１６】前記ストレプトアビジンカルボキシル末端アミノ酸および
アミノ末端アミノ酸が、１つ以上のアミノ酸を含むリンカーによって連結されて
いる、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】請求項１６に記載の融合タンパク質であって、ここで前記
リンカーが３つのグリシンおよび１つのセリンを含むテトラペプチドであり、そ
してここで１つのグリシンが前記カルボキシル末端アミノ酸に連結され、そして
該セリンが前記アミノ末端アミノ酸に連結されている、融合タンパク質。
【請求項１８】前記ストレプトアビジンポリペプチドの一部が除去されて
、新しいＣ末端およびＮ末端を形成する、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】前記ストレプトアビジンポリペプチドの一部が除去されて
、前記新しいカルボキシル末端およびアミノ末端を形成する、請求項１５に記載
の融合タンパク質。
【請求項２０】前記除去されるストレプトアビジンポリペプチドの一部が
、アミノ酸残基４７〜５０である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】前記環状並べ換えビオチン結合タンパク質および前記第２
のタンパク質がスペーサーによって連結されている、請求項１５に記載の融合タ
ンパク質。
【請求項２２】前記融合タンパク質のビオチン結合アフィニティーが１０ ⁷ Ｍ^-1と野生型ストレプトアビジンの結合アフィニティーとの間である、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】前記結合する第２のポリペプチドが、抗体、抗体フラグメ
ント、ＩｇＧ結合プロテインＡ、ホルモン、酵素、放出因子、リガンド、成長因
子、レセプター、およびメタロチオネインからなる群より選択される、請求項１
５に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】前記第２のポリペプチドが、ストレプトアビジンポリペプ
チドの外部にあるようにスペーサーによって連結される、請求項１５に記載の融
合タンパク質。
【請求項２５】前記ストレプトアビジンポリペプチドが野生型ストレプト
アビジンである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】環状並べ換えビオチン結合タンパク質および第２のポリペ
プチドを含む融合タンパク質の作製方法であって、以下の工程：請求項１５に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作製
する工程；該ポリヌクレオチドを、適切な発現プロモーターの制御下にある発現カセット
中に配置する工程；宿主中で該タンパク質を発現する工程；および該発現したタンパク質を単離する工程、を包含する、方法。