JP2002510650A - Ｈｉｖ特異的細胞傷害性ｔ細胞応答 - Google Patents
Ｈｉｖ特異的細胞傷害性ｔ細胞応答Info
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Abstract
(57)【要約】
宿主においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を生起する方法は、最初に、ヘルパーＴ分子を宿主に投与して宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的に刺激し、次いでヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物を宿主に投与して宿主においてＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を生起することを含む。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、免疫学に関し、詳細には、宿主においてＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を
生起することに関する。
生起することに関する。
【０００２】 （発明の背景） 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染
の究極的な結果である疾患である。現在、人類をＨＩＶ感染から防護できる有効
なワクチンはなく、したがって、有効なＨＩＶワクチンおよびＨＩＶワクチンを
投与するプロトコールの開発が緊急に必要とされている。これまで、化学的処理
により徹底的に不活化されたＨＩＶ−１粒子、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパ
ク質全体（ｇｐ１６０）をコードするワクシニアベクターおよび精製した組換え
ｇｐ１２０がＨＩＶワクチンの候補として評価されてきた。不活化ＨＩＶ−１ウ
ィルス製剤はヒトでＴ細胞を介した遅延型過敏症（ＤＴＨ）を引き起こし、ワク
シニア／ｇｐ１６０およびｇｐ１２０組換えワクチン候補物質はウィルス中和抗
体を誘導したが、これらの免疫原のいずれも有効なヒトＨＩＶワクチンであるこ
とは示されていない。本発明者らのＨＩＶワクチンにおける関心事は、合成ＨＩ
Ｖ−１ペプチドワクチンを開発することにあり、その単独使用または他のＨＩＶ
−１ワクチン候補物質との併用により、ＨＩＶ−１に対しより有効な免疫応答を
誘起できると考えている。
の究極的な結果である疾患である。現在、人類をＨＩＶ感染から防護できる有効
なワクチンはなく、したがって、有効なＨＩＶワクチンおよびＨＩＶワクチンを
投与するプロトコールの開発が緊急に必要とされている。これまで、化学的処理
により徹底的に不活化されたＨＩＶ−１粒子、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパ
ク質全体（ｇｐ１６０）をコードするワクシニアベクターおよび精製した組換え
ｇｐ１２０がＨＩＶワクチンの候補として評価されてきた。不活化ＨＩＶ−１ウ
ィルス製剤はヒトでＴ細胞を介した遅延型過敏症（ＤＴＨ）を引き起こし、ワク
シニア／ｇｐ１６０およびｇｐ１２０組換えワクチン候補物質はウィルス中和抗
体を誘導したが、これらの免疫原のいずれも有効なヒトＨＩＶワクチンであるこ
とは示されていない。本発明者らのＨＩＶワクチンにおける関心事は、合成ＨＩ
Ｖ−１ペプチドワクチンを開発することにあり、その単独使用または他のＨＩＶ
−１ワクチン候補物質との併用により、ＨＩＶ−１に対しより有効な免疫応答を
誘起できると考えている。
【０００３】 本発明者らは、許可された米国特許第５８１７３１８号（欧州特許第４７０９
８０号）および同第５６３９８５４号において、特に、ＨＩＶ−１のコアタンパ
ク質のＴ細胞エピトープ、ｐ２４Ｅ、の同定および特性付け、ならびにＨＩＶ−
１のエンベロープまたはコアタンパク質の様々なＢ細胞エピトープのアミノ酸配
列と連結したｐ２４Ｅを含む免疫原性の合成キメラペプチドの構築へのその利用
について既に記載しており、それらの開示は参照として本明細書に組み込むもの
とする。
８０号）および同第５６３９８５４号において、特に、ＨＩＶ−１のコアタンパ
ク質のＴ細胞エピトープ、ｐ２４Ｅ、の同定および特性付け、ならびにＨＩＶ−
１のエンベロープまたはコアタンパク質の様々なＢ細胞エピトープのアミノ酸配
列と連結したｐ２４Ｅを含む免疫原性の合成キメラペプチドの構築へのその利用
について既に記載しており、それらの開示は参照として本明細書に組み込むもの
とする。
【０００４】 現在の努力は、細胞性免疫（ＣＭＩ）を誘発することができるＨＩＶワクチン
ならびにその利用のためのプロトコールのデザインに向けられている。この観点
で、本発明者らは、カルボキシ末端部分はヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）モチ
ーフに富むことから、ＨＩＶウィルスの生活環の初期に発現されるウィルス・タ
ンパク質Ｒｅｖに着目した。従って、Ｒｅｖタンパク質を含む適切に構築された
ワクチンを用いた免疫により生成されるペプチドは、主要組織抗原複合体（ＭＨ
Ｃ）クラス１分子の一部として提示され、早期にウィルスに感染した細胞を殺す
ことができるＣＴＬエフェクター応答を誘導し、ウィルスの蔓延を制限すること
ができる。しかし、ここに提供する免疫プロトコールは、他のＨＩＶタンパク質
由来のペプチドを含むＴ細胞エピトープにも適用できる。
ならびにその利用のためのプロトコールのデザインに向けられている。この観点
で、本発明者らは、カルボキシ末端部分はヒト細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）モチ
ーフに富むことから、ＨＩＶウィルスの生活環の初期に発現されるウィルス・タ
ンパク質Ｒｅｖに着目した。従って、Ｒｅｖタンパク質を含む適切に構築された
ワクチンを用いた免疫により生成されるペプチドは、主要組織抗原複合体（ＭＨ
Ｃ）クラス１分子の一部として提示され、早期にウィルスに感染した細胞を殺す
ことができるＣＴＬエフェクター応答を誘導し、ウィルスの蔓延を制限すること
ができる。しかし、ここに提供する免疫プロトコールは、他のＨＩＶタンパク質
由来のペプチドを含むＴ細胞エピトープにも適用できる。
【０００５】 （発明の概要） 本発明の１つの形態において、宿主でＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ
）応答を生起する方法であって、 宿主にヘルパーＴ分子を投与して、宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺
激することと、 続いて、宿主に、前記ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物
を投与して、宿主でＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を生起することと を含む方法を提供する。
）応答を生起する方法であって、 宿主にヘルパーＴ分子を投与して、宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺
激することと、 続いて、宿主に、前記ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物
を投与して、宿主でＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を生起することと を含む方法を提供する。
【０００６】 したがって、ヒト宿主とすることができる宿主の免疫系を任意の簡便なヘルパ
ーＴ分子で予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子をＴ細胞誘導性分子と共に投
与する。このようにして、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を得る。
ーＴ分子で予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子をＴ細胞誘導性分子と共に投
与する。このようにして、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を得る。
【０００７】 ヘルパーＴ分子は、Ｔ細胞ヒトＤＰ、ＤＲ、ＤＱ特異的Ｔ細胞エピトープを含
む、免疫系でこのようなＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供することがよく知
られている物質のいずれでもよい。本明細書に記載の実験でヘルパーＴ分子とし
て使用する物質は、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）として同定される、Ｂ型肝
炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原の一部に対応するペプチドである。所望であ
れば、ヘルパーＴ分子はアジュバントと共に投与することができる。
む、免疫系でこのようなＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供することがよく知
られている物質のいずれでもよい。本明細書に記載の実験でヘルパーＴ分子とし
て使用する物質は、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）として同定される、Ｂ型肝
炎ウィルス・ヌクレオカプシド抗原の一部に対応するペプチドである。所望であ
れば、ヘルパーＴ分子はアジュバントと共に投与することができる。
【０００８】 Ｔ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子は一般に、ＨＩＶ−１抗原の一部に対応し、少な
くとも１つのＴ細胞エピトープを含有するペプチドを含む。特に、ペプチドは、
ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質の配列、特に、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ（Ｃ
ＬＰ−１６４）のアミノ酸５２から１１６（配列番号９）（表２）に対応するこ
とができる。Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸配列はＬＡＩ分離株のアミノ酸配列で
ある。本発明は、一次分離株を含む他のＨＩＶ−１分離株からのＲｅｖタンパク
質からの対応のペプチド配列の使用も含む。
くとも１つのＴ細胞エピトープを含有するペプチドを含む。特に、ペプチドは、
ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質の配列、特に、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ（Ｃ
ＬＰ−１６４）のアミノ酸５２から１１６（配列番号９）（表２）に対応するこ
とができる。Ｒｅｖタンパク質のアミノ酸配列はＬＡＩ分離株のアミノ酸配列で
ある。本発明は、一次分離株を含む他のＨＩＶ−１分離株からのＲｅｖタンパク
質からの対応のペプチド配列の使用も含む。
【０００９】 本明細書に記載の実験では、ペプチドは、リポペプチドの形で提供されたとき
、特に脂質がパルミトイルまたはコレステロールであるときに、本明細書に記載
のプロトコールで有効であった。本発明に使用する２つの特定のリポペプチドは
、ＣＬＰ−１６４のそれぞれパルミトイルおよびコレステロール誘導体であるＣ
ＬＰ−１７５およびＣＬＰ−１７６である。
、特に脂質がパルミトイルまたはコレステロールであるときに、本明細書に記載
のプロトコールで有効であった。本発明に使用する２つの特定のリポペプチドは
、ＣＬＰ−１６４のそれぞれパルミトイルおよびコレステロール誘導体であるＣ
ＬＰ−１７５およびＣＬＰ−１７６である。
【００１０】 ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物は適切なアジュバント
と共に投与することができる。
と共に投与することができる。
【００１１】 本発明はさらに、別の形態で、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質由来のある種の
新規なペプチドも提供する。したがって、本発明のこの形態では、ＨＩＶのＲｅ
ｖタンパク質の配列のアミノ酸５２〜１１６（配列番号９）に対応するアミノ酸
配列を有し、アミノ酸６５〜７５（配列番号３）、７８〜８７（配列番号５）お
よび１０２〜１１０（配列番号８）（表１）内にＴ細胞エピトープを含むペプチ
ドが提供される。このようなペプチドは、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６
を含むリポペプチドの形態で提供することができる。配列番号９を有するペプチ
ドの具体的なアミノ酸配列はＨＩＶ−１のＬＡＩ分離株のものである。一次分離
株を含む、他のＨＩＶ−１分離株に由来するＲｅｖタンパク質の対応のペプチド
配列および対応のＴ細胞エピトープの利用も、本発明の範囲に含まれる。
新規なペプチドも提供する。したがって、本発明のこの形態では、ＨＩＶのＲｅ
ｖタンパク質の配列のアミノ酸５２〜１１６（配列番号９）に対応するアミノ酸
配列を有し、アミノ酸６５〜７５（配列番号３）、７８〜８７（配列番号５）お
よび１０２〜１１０（配列番号８）（表１）内にＴ細胞エピトープを含むペプチ
ドが提供される。このようなペプチドは、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６
を含むリポペプチドの形態で提供することができる。配列番号９を有するペプチ
ドの具体的なアミノ酸配列はＨＩＶ−１のＬＡＩ分離株のものである。一次分離
株を含む、他のＨＩＶ−１分離株に由来するＲｅｖタンパク質の対応のペプチド
配列および対応のＴ細胞エピトープの利用も、本発明の範囲に含まれる。
【００１２】 本発明の利点には、 宿主でＴ細胞応答を誘導するための免疫手順、 このような手順に使用する免疫原性ペプチド を含む。
【００１３】 （発明の詳細な説明） 本発明者らは、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖタンパク質のＣＬＰ−１７７（配
列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番号８）と表す２つのナノマーペプチド、
ＣＬＰ−１７８（配列番号３）と表すヘキサマー、ＣＬＰ−１８２（配列番号７
）と表す１２マー（各ペプチドのアミノ酸配列は表１に示す）はそれぞれ、白人
で見られる主要なＨＬＡクラス１サブタイプである、膜結合型ヒト主要組織適合
性複合体（ＨＬＡ）クラス１分子であるＨＬＡ−Ａ２に結合し、これを安定化さ
せることができることを発見した。本発明者らはまた、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒ
ｅｖタンパク質のアミノ酸残基５２から１１６を含み、ＫＳＳリンカーを介して
そのアミノ（Ｎ）末端に１つのコレステロールまたはパルミトイル部分を結合さ
せて、それぞれリポペプチド、ＣＬＰ−１７６およびＣＬＰ−１７５を形成する
よう構築した長鎖ペプチド（配列番号９）は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェックマ
ウスでＣＴＬおよび抗体応答を誘発できることを発見した。
列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番号８）と表す２つのナノマーペプチド、
ＣＬＰ−１７８（配列番号３）と表すヘキサマー、ＣＬＰ−１８２（配列番号７
）と表す１２マー（各ペプチドのアミノ酸配列は表１に示す）はそれぞれ、白人
で見られる主要なＨＬＡクラス１サブタイプである、膜結合型ヒト主要組織適合
性複合体（ＨＬＡ）クラス１分子であるＨＬＡ−Ａ２に結合し、これを安定化さ
せることができることを発見した。本発明者らはまた、ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒ
ｅｖタンパク質のアミノ酸残基５２から１１６を含み、ＫＳＳリンカーを介して
そのアミノ（Ｎ）末端に１つのコレステロールまたはパルミトイル部分を結合さ
せて、それぞれリポペプチド、ＣＬＰ−１７６およびＣＬＰ−１７５を形成する
よう構築した長鎖ペプチド（配列番号９）は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェックマ
ウスでＣＴＬおよび抗体応答を誘発できることを発見した。
【００１４】 本明細書に提供された実験をベースとして、本発明により、最初にヘルパーＴ
分子を投与して、宿主の免疫系を予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子とＨＩ
Ｖ抗原の一部に対応するＴ細胞エピトープ含有ペプチドの混合物を投与すること
により、宿主でＨＩＶ特的な胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための新規な免疫プ
ロトコールが提供される。
分子を投与して、宿主の免疫系を予備的刺激し、次いで、ヘルパーＴ分子とＨＩ
Ｖ抗原の一部に対応するＴ細胞エピトープ含有ペプチドの混合物を投与すること
により、宿主でＨＩＶ特的な胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための新規な免疫プ
ロトコールが提供される。
【００１５】 本明細書では、ヘルパーＴ分子として、Ｂ型肝炎ウィルス・ヌクレオカプシド
抗原の一部に対応するペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、免疫系で
ＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供するものなどの他のヘルパーＴ分子も使用
できる。
抗原の一部に対応するペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、免疫系で
ＭＨＣクラスＩＩヘルパー活性を提供するものなどの他のヘルパーＴ分子も使用
できる。
【００１６】 本明細書では、ＨＩＶ Ｔ細胞エピトープ含有ペプチドとして、Ｒｅｖタンパ
ク質由来のある種のリポペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、任意の
他のＨＩＶタンパク質由来のペプチドを含有するＨＩＶ Ｔ細胞エピトープも使
用することができる。
ク質由来のある種のリポペプチドを使用して本発明を説明する。しかし、任意の
他のＨＩＶタンパク質由来のペプチドを含有するＨＩＶ Ｔ細胞エピトープも使
用することができる。
【００１７】 最近、一次配列に基づいてヒトＣＴＬ抗原決定基を予想するために１つのモデ
ルが使用されている（参考文献１から３参照のこと。本明細書を通じ、本発明が
属する技術分野の状況をより完全に記述するためにカッコ内に様々な参考文献を
引用する。各引用文献についての完全な書誌的情報は、本明細書の最後、特許請
求の範囲の直後に示す。これらの参考文献の開示は参照して本明細書の開示に含
むものとする）。ＨＬＡ−Ａ２などのヒトＭＨＣクラス１分子のペプチド結合グ
ルーブに最も好ましく結合し、収まりやすいＣＴＬエピトープは一般に９アミノ
酸長であることが提案されている。しかし、ＨＬＡクラス１分子と相互作用でき
る８から１３個のアミノ酸を含むペプチドも報告されている。多くの場合、これ
らのペプチドは２位にロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）残基を含み、カル
ボキシ末端にＬまたはバリン（Ｖ）を含むことが知られている。
ルが使用されている（参考文献１から３参照のこと。本明細書を通じ、本発明が
属する技術分野の状況をより完全に記述するためにカッコ内に様々な参考文献を
引用する。各引用文献についての完全な書誌的情報は、本明細書の最後、特許請
求の範囲の直後に示す。これらの参考文献の開示は参照して本明細書の開示に含
むものとする）。ＨＬＡ−Ａ２などのヒトＭＨＣクラス１分子のペプチド結合グ
ルーブに最も好ましく結合し、収まりやすいＣＴＬエピトープは一般に９アミノ
酸長であることが提案されている。しかし、ＨＬＡクラス１分子と相互作用でき
る８から１３個のアミノ酸を含むペプチドも報告されている。多くの場合、これ
らのペプチドは２位にロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）残基を含み、カル
ボキシ末端にＬまたはバリン（Ｖ）を含むことが知られている。
【００１８】 ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖタンパク質の潜在的なＣＴＬ含有モチーフの部位
は、報告されたペプチド結合モチーフアルゴリズムで予想してきた。表１は、こ
のように予想したペプチドのアミノ酸配列を示している（配列番号１から８）。
これらのモチーフを含むペプチドの膜結合型合ＨＬＡ−Ａ２分子への結合能およ
びその安定化能はＴ２細胞株を使用して評価した。この細胞株は、欠陥のあるＴ
ＡＰトランスポータ機能を有しており、その結果、新たに合成されたＨＬＡクラ
ス１分子、すなわちＨＬＡ−Ａ２との会合するため、細胞内で生成されたペプチ
ドの大部分が小胞体に運搬されることが不可能になることが十分立証されている
（参考文献４、５参照）。したがって、Ｔ２細胞の表面に提示されたＨＬＡ−Ａ
２分子の大部分はからであり（すなわち、ペプチドを含んでおらず）、不安定で
ある。外部から導入された適切なペプチドと相互作用すると、ＨＬＡ−Ａ２分子
の安定性は回復される。
は、報告されたペプチド結合モチーフアルゴリズムで予想してきた。表１は、こ
のように予想したペプチドのアミノ酸配列を示している（配列番号１から８）。
これらのモチーフを含むペプチドの膜結合型合ＨＬＡ−Ａ２分子への結合能およ
びその安定化能はＴ２細胞株を使用して評価した。この細胞株は、欠陥のあるＴ
ＡＰトランスポータ機能を有しており、その結果、新たに合成されたＨＬＡクラ
ス１分子、すなわちＨＬＡ−Ａ２との会合するため、細胞内で生成されたペプチ
ドの大部分が小胞体に運搬されることが不可能になることが十分立証されている
（参考文献４、５参照）。したがって、Ｔ２細胞の表面に提示されたＨＬＡ−Ａ
２分子の大部分はからであり（すなわち、ペプチドを含んでおらず）、不安定で
ある。外部から導入された適切なペプチドと相互作用すると、ＨＬＡ−Ａ２分子
の安定性は回復される。
【００１９】 ここで実施したｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−Ａ２安定化実験の結果は、２つの
ナノマー、すなわちＣＬＰ−１７７（配列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番
号８）；ならびに、すなわちＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１８
２（配列番号４）でそれぞれ表される１１マーおよび１２マーは、Ｔ２細胞上の
ＨＬＡ−Ａ２に結合することができることを示した。この結果は、添付の図１に
示されるように、細胞上に提示されたクラス１分子の密度が高いために、それぞ
れの蛍光ピークが右側に移動していることにより示された。各蛍光係数の比較か
ら、ペプチドの強度はＣＬＰ−１７７＞ＣＬＰ−７２＞ＣＬＰ−１７８＞ＣＬＰ
−１８２の順であることが明らかとなった。
ナノマー、すなわちＣＬＰ−１７７（配列番号２）およびＣＬＰ−７２（配列番
号８）；ならびに、すなわちＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１８
２（配列番号４）でそれぞれ表される１１マーおよび１２マーは、Ｔ２細胞上の
ＨＬＡ−Ａ２に結合することができることを示した。この結果は、添付の図１に
示されるように、細胞上に提示されたクラス１分子の密度が高いために、それぞ
れの蛍光ピークが右側に移動していることにより示された。各蛍光係数の比較か
ら、ペプチドの強度はＣＬＰ−１７７＞ＣＬＰ−７２＞ＣＬＰ−１７８＞ＣＬＰ
−１８２の順であることが明らかとなった。
【００２０】 調べた脂質化Ｒｅｖペプチドの構築を表２に示す。図２に示す結果は、脂質化
したＲｅｖの５２〜１１６（配列番号９）ペプチド、ＣＬＰ−１７５およびＣＬ
Ｐ−１７６ならびにその非脂質化対象物であるＣＬＰ−１６４は、Ａ２Ｋｂトラ
ンスジェニックマウスに１００．０μｇ投与量で３回注射したときに、ＩｇＧタ
イターで判定して免疫原性であったことを示している（参考文献６）。不完全フ
ロインドアジュバント（ＩＦＡ）で製剤化したＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１
７６またはＣＬＰ−１６４を投与した動物では、Ｒｅｖの５２〜１１６ペプチド
（ＣＬＰ−１６４）に対する高いＩｇＧ抗体が検出された（パネルＡ、Ｂおよび
Ｃ）。ＩＦＡに入れたＣＬＰ−２４３の投与により予備的刺激した後、ＩＦＡで
製剤化したＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１
７６またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１６４の混合物で２回追加免役することに
より、別な実験条件で試験したマウスは、同様に高い抗ＣＬＰ−１６４抗体応答
を誘発した（パネルＤからＦ）。ＣＬＰ−２４３はＢ型肝炎ウィルス・ヌクレオ
カプシド抗原のアミン酸残基１２８〜１４０（ＴＰＲＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ、配
列番号１０）を含むＩ−Ａb結合ペプチドである（参考文献６）。
したＲｅｖの５２〜１１６（配列番号９）ペプチド、ＣＬＰ−１７５およびＣＬ
Ｐ−１７６ならびにその非脂質化対象物であるＣＬＰ−１６４は、Ａ２Ｋｂトラ
ンスジェニックマウスに１００．０μｇ投与量で３回注射したときに、ＩｇＧタ
イターで判定して免疫原性であったことを示している（参考文献６）。不完全フ
ロインドアジュバント（ＩＦＡ）で製剤化したＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１
７６またはＣＬＰ−１６４を投与した動物では、Ｒｅｖの５２〜１１６ペプチド
（ＣＬＰ−１６４）に対する高いＩｇＧ抗体が検出された（パネルＡ、Ｂおよび
Ｃ）。ＩＦＡに入れたＣＬＰ−２４３の投与により予備的刺激した後、ＩＦＡで
製剤化したＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１
７６またはＣＬＰ−２４３＋ＣＬＰ−１６４の混合物で２回追加免役することに
より、別な実験条件で試験したマウスは、同様に高い抗ＣＬＰ−１６４抗体応答
を誘発した（パネルＤからＦ）。ＣＬＰ−２４３はＢ型肝炎ウィルス・ヌクレオ
カプシド抗原のアミン酸残基１２８〜１４０（ＴＰＲＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ、配
列番号１０）を含むＩ−Ａb結合ペプチドである（参考文献６）。
【００２１】 リポペプチドＣＬＰ−１７６およびＣＬＰ−１７５がＣＴＬ誘導性であること
を示す免疫原性実験の結果は図３に示す。Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３ の投与により皮下的に予備的刺激し、同じ免疫経路を使用し、ＩＦＡ中にプライ
ム用量のＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５を１００．０μ
ｇを含む混合物で追加免疫したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスは、ナノマー
ＣＬＰ−１７７で惹起されたＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ標的細胞を殺すエフェクタ
ー細胞を生成することが判った（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）。ＣＬＰ−１７７を負
荷しなかったＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ細胞は殺されなかったことから、このエフ
ェクターの細胞傷害性活性は特異的であった（パネルＣ、Ｄ、ＧおよびＨ）。対
照的に、同様にＣＬＰ−２４３／ＩＦＡ接種物を１回、ついでＩＦＡに溶かした
ＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１６４を２回注射したＡ２Ｋｂトランスジェニックマ
ウスでは、有意なＣＬＰ−１７７特異的エフェクター応答は誘発しなかった（パ
ネルＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。
を示す免疫原性実験の結果は図３に示す。Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３ の投与により皮下的に予備的刺激し、同じ免疫経路を使用し、ＩＦＡ中にプライ
ム用量のＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５を１００．０μ
ｇを含む混合物で追加免疫したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスは、ナノマー
ＣＬＰ−１７７で惹起されたＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ標的細胞を殺すエフェクタ
ー細胞を生成することが判った（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）。ＣＬＰ−１７７を負
荷しなかったＪｕｒｋａｔ−Ａ２ｋＢ細胞は殺されなかったことから、このエフ
ェクターの細胞傷害性活性は特異的であった（パネルＣ、Ｄ、ＧおよびＨ）。対
照的に、同様にＣＬＰ−２４３／ＩＦＡ接種物を１回、ついでＩＦＡに溶かした
ＣＬＰ−２４３とＣＬＰ−１６４を２回注射したＡ２Ｋｂトランスジェニックマ
ウスでは、有意なＣＬＰ−１７７特異的エフェクター応答は誘発しなかった（パ
ネルＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）。
【００２２】 Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３で予備的刺激し、次いでＣＬＰ−２４３ とＣＬＰ−１７６またはＣＬＰ−１７５の混合物で追加免役すると、各リポペプ
チド単独で免役したときに比べ、ＣＴＬ応答の誘導に対してより効果的であった
ことを示す免役実験の結果は、図３に示す。ＩＦＡに溶かしたＣＬＰ−１７６ま
たはＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１６４（非脂質化Ｒｅｖ５２〜１１６）を１
００．０μｇ投与量で３回皮下注射し、ＣＬＰ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａ
ｔ Ａ２ｋｂ細胞および１５．０μｇ/ｍｌの濃度で外部から添加したＣＬＰ− １７５により再刺激したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスの脾細胞は、ＣＬＰ
−１７７ペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ細胞を殺すことができるエフェクター
は生成しなかった（パネルＭからＸ）。
チド単独で免役したときに比べ、ＣＴＬ応答の誘導に対してより効果的であった
ことを示す免役実験の結果は、図３に示す。ＩＦＡに溶かしたＣＬＰ−１７６ま
たはＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１６４（非脂質化Ｒｅｖ５２〜１１６）を１
００．０μｇ投与量で３回皮下注射し、ＣＬＰ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａ
ｔ Ａ２ｋｂ細胞および１５．０μｇ/ｍｌの濃度で外部から添加したＣＬＰ− １７５により再刺激したＡ２Ｋｂトランスジェニックマウスの脾細胞は、ＣＬＰ
−１７７ペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ細胞を殺すことができるエフェクター
は生成しなかった（パネルＭからＸ）。
【００２３】 ｉｎ ｖｉｔｒｏの再刺激実験の結果は、ＣＬＰ−２４３ペプチドを加えるこ
とにより達成されたＣＬＰ−２４３特異的Ｉ−Ａb結合ヘルパーＴ細胞と、ＣＬ Ｐ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａｔ Ａ２ｋｂ細胞との共存培養により達成さ
れたＣＬＰ−１７７特的エフェクターの同時再刺激は、ＣＬＰ−１７７特異的エ
フェクターの増加を高めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＴＬアッセイで検出できるよ
うにするのに必要であることを示した。
とにより達成されたＣＬＰ−２４３特異的Ｉ−Ａb結合ヘルパーＴ細胞と、ＣＬ Ｐ−１７７でパルスしたＪｕｒｋａｔ Ａ２ｋｂ細胞との共存培養により達成さ
れたＣＬＰ−１７７特的エフェクターの同時再刺激は、ＣＬＰ−１７７特異的エ
フェクターの増加を高めて、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣＴＬアッセイで検出できるよ
うにするのに必要であることを示した。
【００２４】 成分は投与処方に適した方法で、免疫プロトコールで治療上有効であり、免疫
原性であり、保護的であるような量で投与する。投与すべき物質の量は、例えば
、各人の免疫系の抗体合成能および細胞性免疫応答生成能を含め、投与する対象
に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。
しかし、適切な用量範囲は、当業者には容易に決定でき、物質マイクログラムか
らミリグラムのオーダーとすることができる。用量は投与経路に依存する可能性
があり、宿主の大きさによって変化する。
原性であり、保護的であるような量で投与する。投与すべき物質の量は、例えば
、各人の免疫系の抗体合成能および細胞性免疫応答生成能を含め、投与する対象
に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は医師の判断に依存する。
しかし、適切な用量範囲は、当業者には容易に決定でき、物質マイクログラムか
らミリグラムのオーダーとすることができる。用量は投与経路に依存する可能性
があり、宿主の大きさによって変化する。
【００２５】 抗原をアジュバントと共に投与すると、抗原性を顕著に改善することができる
。アジュバントは、抗原の免疫原性を増強するが、それ自体抗原性である必要は
ない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に保持して、抗原が免疫
系の細胞にゆっくりと、持続的に放出されることを促進するデポー作用を生じる
よう作用することができる。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原デポーに
引きつけ、このような細胞を刺激して免疫応答を誘発することもできる。
。アジュバントは、抗原の免疫原性を増強するが、それ自体抗原性である必要は
ない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに局所的に保持して、抗原が免疫
系の細胞にゆっくりと、持続的に放出されることを促進するデポー作用を生じる
よう作用することができる。アジュバントはまた、免疫系の細胞を抗原デポーに
引きつけ、このような細胞を刺激して免疫応答を誘発することもできる。
【００２６】 免疫刺激剤またはアジュバントは長年にわたり、例えばワクチンに対する宿主
の免疫応答を改善するために使用されてきた。リポ多糖などの内因性アジュバン
トは通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化した細菌の成分である。
外因性アジュバントは、典型的には、非共有的に抗原と結合し、宿主の免疫応答
を増強するように処方された免疫調節剤である。したがって、アジュバントは、
非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を増強するものと同定されてきた。
しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、望ましくない副作用を引き
起こし、ヒトや多くの動物への使用に不適切となる可能性がある。実際、水酸化
アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（集合的に一般にアラムと呼ばれている
）のみがヒトおよび動物用のワクチンに日常的にアジュバントとして使用されて
いる。トキソイド中のアラムの効果は十分確立されており、ＨＢｓＡｇワクチン
は、アラムでアジュバントされている。
の免疫応答を改善するために使用されてきた。リポ多糖などの内因性アジュバン
トは通常、ワクチンとして使用される死滅または弱毒化した細菌の成分である。
外因性アジュバントは、典型的には、非共有的に抗原と結合し、宿主の免疫応答
を増強するように処方された免疫調節剤である。したがって、アジュバントは、
非経口的に送達された抗原に対する免疫応答を増強するものと同定されてきた。
しかし、これらのアジュバントの一部は毒性であり、望ましくない副作用を引き
起こし、ヒトや多くの動物への使用に不適切となる可能性がある。実際、水酸化
アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（集合的に一般にアラムと呼ばれている
）のみがヒトおよび動物用のワクチンに日常的にアジュバントとして使用されて
いる。トキソイド中のアラムの効果は十分確立されており、ＨＢｓＡｇワクチン
は、アラムでアジュバントされている。
【００２７】 広範な外因性アジュバントが抗原に対する強力な免疫応答を誘発することがで
きる。これらには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕ
ｉｌ Ａ、それらの誘導体および成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、
水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプ
チド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭ マトリックス、ＤＣ−
Ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡ、および他のアジュバントならびに細菌毒素、その成分およ
び誘導体が含まれる。特に有利な組合せは、本発明の譲受人に譲渡された、同時
係属の１９９４年６月１３日出願の米国出願第０８／２５８，２２８号および１
９９５年６月７日出願の米国出願第０８／４８３，８５６号に記載されており、
これらの開示は参照して本明細書に組み込むものとする（ＷＯ９５／３４３０８
）。特定の状況下では、Ｔｈ１応答を誘導するアジュバントが望ましい。
きる。これらには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕ
ｉｌ Ａ、それらの誘導体および成分、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、
水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプ
チド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭ マトリックス、ＤＣ−
Ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡ、および他のアジュバントならびに細菌毒素、その成分およ
び誘導体が含まれる。特に有利な組合せは、本発明の譲受人に譲渡された、同時
係属の１９９４年６月１３日出願の米国出願第０８／２５８，２２８号および１
９９５年６月７日出願の米国出願第０８／４８３，８５６号に記載されており、
これらの開示は参照して本明細書に組み込むものとする（ＷＯ９５／３４３０８
）。特定の状況下では、Ｔｈ１応答を誘導するアジュバントが望ましい。
【００２８】 本発明を下記実施例によりさらに説明する。
【００２９】 上記の開示は一般に本発明を記載している。以下の具体的な実施例を参照する
ことにより、より完全に理解することができる。これらの実施例は、単に説明の
ためのものであって、何ら本発明の技術的範囲を限定する意図のものではない。
状況により手段が示唆または示されるため、形態の変化ならびに均等物の置換は
企図される。本明細書で具体的な用語が使用されているものの、このような用語
は説明的なものであり、限定する目的を持って、使用する意図はない。
ことにより、より完全に理解することができる。これらの実施例は、単に説明の
ためのものであって、何ら本発明の技術的範囲を限定する意図のものではない。
状況により手段が示唆または示されるため、形態の変化ならびに均等物の置換は
企図される。本明細書で具体的な用語が使用されているものの、このような用語
は説明的なものであり、限定する目的を持って、使用する意図はない。
【００３０】 （実施例） この開示に明確に示されていないペプチドおよびリポペプチドの合成、細胞培
養、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ＣＴＬアッセイおよび他の試験手順の方法は
、学術文献に詳細に報告されており、十分当業者の範囲である。
養、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、ＣＴＬアッセイおよび他の試験手順の方法は
、学術文献に詳細に報告されており、十分当業者の範囲である。
【００３１】 実施例１： この実施例はペプチドおよびリポペプチドの合成を説明する。
【００３２】 固相ペプチド合成はメーカーの標準プロトコールに従ってＡＢＩ４３０Ａ自動
ペプチド合成装置で実施した。合成したペプチドのアミノ酸配列は下記表１に示
す。
ペプチド合成装置で実施した。合成したペプチドのアミノ酸配列は下記表１に示
す。
【００３３】 次の脂質化のために設計されたリジン残基は、Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボ
ニル−Ｎε−フルオレニルメトキシカルボニル−リジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｅｍ
ｏｃ）−ＯＨ）を使用してペプチドに導入した。脂質部分は、側鎖Ｆｍｏｃ保護
基を手動で除去し、次いで、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でジイソプロピ
ルエチルアミンおよびＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化し
た適切なカルボン酸でアシル化することにより、導入した。チオクレゾール、ア
ニソールおよび硫化メチルの存在下で、液体フッ化水素で処理することにより固
体支持体からリポペプチドを切り離した。粗生成物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）で抽出し、ジエチルエーテルで沈殿させた。リポペプチドならびに脂質化され
ていないペプチドを表２に示す。
ニル−Ｎε−フルオレニルメトキシカルボニル−リジン（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｅｍ
ｏｃ）−ＯＨ）を使用してペプチドに導入した。脂質部分は、側鎖Ｆｍｏｃ保護
基を手動で除去し、次いで、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でジイソプロピ
ルエチルアミンおよびＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化し
た適切なカルボン酸でアシル化することにより、導入した。チオクレゾール、ア
ニソールおよび硫化メチルの存在下で、液体フッ化水素で処理することにより固
体支持体からリポペプチドを切り離した。粗生成物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）で抽出し、ジエチルエーテルで沈殿させた。リポペプチドならびに脂質化され
ていないペプチドを表２に示す。
【００３４】 実施例２： この実施例は、ペプチドのＨＬＡ−Ａ２結合および調整を示すために使用した
方法を説明する。
方法を説明する。
【００３５】 ＨＬＡ−Ａ２分子を発現するＴ２細胞株はエール大学、Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇ
ｈｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｗｅｌ
ｌ博士から入手した。細胞はＩｓｃｏｖｅの完全培地（１０％加熱不活化ウシ血
清、ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩
１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの 培地）で増殖させた。実施例１に記載のように調製し、表１で同定される８〜１
３マーの各ペプチドの、Ｔ２細胞上のＡ２分子への結合能およびその安定性調整
能は、Ｙｕｐｉｎｇ Ｄｅｎｇらが記載したプロトコール（参考文献６）を改良
したペプチド誘導ＭＨＣクラス１アセンブリー・アッセイを使用して判定した。
ｈｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｗｅｌ
ｌ博士から入手した。細胞はＩｓｃｏｖｅの完全培地（１０％加熱不活化ウシ血
清、ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩
１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの 培地）で増殖させた。実施例１に記載のように調製し、表１で同定される８〜１
３マーの各ペプチドの、Ｔ２細胞上のＡ２分子への結合能およびその安定性調整
能は、Ｙｕｐｉｎｇ Ｄｅｎｇらが記載したプロトコール（参考文献６）を改良
したペプチド誘導ＭＨＣクラス１アセンブリー・アッセイを使用して判定した。
【００３６】 本質的に、１×１０6個のＴ２細胞を、３７℃で、一晩、滅菌したエッペンド ルフ管中、Ｉｓｃｏｖｅの無血清培地（ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位
／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの培地）２５０．０μｌ中の所定濃度の被験ペ
プチドと共にインキュベートした。次いで、細胞を氷上で３０分間インキュベー
トした後、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ ５．０μｇ/ｍｌ、アニソマイシン１２． ５μｇ/ｍｌおよびシクロへキサミド５．０μｇ/ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの完
全培地１．０ｍｌを加えた。次いで、サンプルを３７℃のＣＯ2インキュベータ 中で３．０時間インキュベートした。
／ｍｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０μｇ/ｍｌ、Ｌ−グルタミン０．３５ ｍｇ／ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの培地）２５０．０μｌ中の所定濃度の被験ペ
プチドと共にインキュベートした。次いで、細胞を氷上で３０分間インキュベー
トした後、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ ５．０μｇ/ｍｌ、アニソマイシン１２． ５μｇ/ｍｌおよびシクロへキサミド５．０μｇ/ｍｌを補ったＩｓｃｏｖｅの完
全培地１．０ｍｌを加えた。次いで、サンプルを３７℃のＣＯ2インキュベータ 中で３．０時間インキュベートした。
【００３７】 薬剤の存在下では、それ以上のタンパク質の合成およびＨＬＡ−Ａ２分子の細
胞表面への細胞内送達は阻害され、生理学的温度では、膜結合型クラス１分子の
コンフォーメーションの脱安定化が起こる。
胞表面への細胞内送達は阻害され、生理学的温度では、膜結合型クラス１分子の
コンフォーメーションの脱安定化が起こる。
【００３８】 次いで、細胞を氷冷ＰＢＡ（０．９％塩化ナトリウム、０．５％ウシ血清アル
ブミン、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファ）で２回洗浄した。次いで
、コンフォメーション感受性のＨＬＡ−Ａ２特異的マウスモノクローナル抗体Ｂ
Ｂ７．２（参照７）を５．０μｇ/ｍｌ含むＰＢＡ１００．０μｌを各被験サン プルに加えた。氷上で４５分間反応させた。次いで、細胞を氷冷ＰＢＡで３回洗
浄した。
ブミン、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファ）で２回洗浄した。次いで
、コンフォメーション感受性のＨＬＡ−Ａ２特異的マウスモノクローナル抗体Ｂ
Ｂ７．２（参照７）を５．０μｇ/ｍｌ含むＰＢＡ１００．０μｌを各被験サン プルに加えた。氷上で４５分間反応させた。次いで、細胞を氷冷ＰＢＡで３回洗
浄した。
【００３９】 次いで、各細胞サンプルに、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）フルオレセイ
ン（ＦＩＴＣ）結合体を１．０μｇ/ｍｌ含有するＰＢＡを１００．０μｌ加え ることにより、ＢＢ７．２の結合を検出した。氷上で３０分間インキュベートし
た後、細胞をＰＢＡで２回、さらにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。１．
０％パラホルムアミド１００．０μｌを細胞ペレットに加えて洗浄を終了させた
直後に、細胞を固定した。細胞を緩和に再縣濁し、通常は、実験終了後３日以内
にＦＡＣＳ分析した。
ン（ＦＩＴＣ）結合体を１．０μｇ/ｍｌ含有するＰＢＡを１００．０μｌ加え ることにより、ＢＢ７．２の結合を検出した。氷上で３０分間インキュベートし
た後、細胞をＰＢＡで２回、さらにＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。１．
０％パラホルムアミド１００．０μｌを細胞ペレットに加えて洗浄を終了させた
直後に、細胞を固定した。細胞を緩和に再縣濁し、通常は、実験終了後３日以内
にＦＡＣＳ分析した。
【００４０】 膜結合型Ａ２分子の密度上昇の指標である蛍光係数は、実験サンプル（ペプチ
ド処理したＴ２細胞）の平均蛍光を対照サンプル（ペプチドで処理していないＴ
２細胞）の平均蛍光で除して計算した。得られた結果は図１に示す。
ド処理したＴ２細胞）の平均蛍光を対照サンプル（ペプチドで処理していないＴ
２細胞）の平均蛍光で除して計算した。得られた結果は図１に示す。
【００４１】 実施例３： この実施例は、ペプチドおよびリポペプチドの免疫原性を調べるために使用し
た予備的刺激および追加免疫のプロトコールを記載する。
た予備的刺激および追加免疫のプロトコールを記載する。
【００４２】 ＡｓＫｂキメラ遺伝子についてトランスジェニックなＢ１０バックグラウンド
のマウスを購入し、米国カリフォルニアのＳｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃからラ
イセンスを取得した。コロニーは、カナダ、コンノートのＰａｓｔｅｕｒ Ｍｅ
ｒｉｅｕｘの動物サービス施設で維持されている。
のマウスを購入し、米国カリフォルニアのＳｃｒｉｐｐｓ Ｃｌｉｎｉｃからラ
イセンスを取得した。コロニーは、カナダ、コンノートのＰａｓｔｅｕｒ Ｍｅ
ｒｉｅｕｘの動物サービス施設で維持されている。
【００４３】 第１グループのマウスには、ＩＦＡ中に乳濁させたＩＦＡ製剤化ペプチドまた
はリポペプチド１００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、次いで、３０日後
と４２日から４８日後に同じ接種物で追加免役した。第２グループのマウスには
、ＩＦＡ製剤化ＣＬＰ−２４３ １００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、
次いで同量のプライム免疫原と、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６またはＣ
ＬＰ−１６４ １００．０μｇとのＩＦＡ製剤化混合物で追加免役した。
はリポペプチド１００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、次いで、３０日後
と４２日から４８日後に同じ接種物で追加免役した。第２グループのマウスには
、ＩＦＡ製剤化ＣＬＰ−２４３ １００．０μｇを尻尾の付け根に皮下注射し、
次いで同量のプライム免疫原と、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６またはＣ
ＬＰ−１６４ １００．０μｇとのＩＦＡ製剤化混合物で追加免役した。
【００４４】 最後の注射後１０日目または１１日目に採取した実験動物の血清を標準的なＥ
ＩＡを用いてＣＬＰ−１６４特異的ＩｇＧ抗体についてアッセイした。得られた
結果は図２に示す。実験に使用したマウスの脾細胞を同時に培養してＣＴＬを増
加させたが、下記のようにエフェクター活性についてアッセイした。
ＩＡを用いてＣＬＰ−１６４特異的ＩｇＧ抗体についてアッセイした。得られた
結果は図２に示す。実験に使用したマウスの脾細胞を同時に培養してＣＴＬを増
加させたが、下記のようにエフェクター活性についてアッセイした。
【００４５】 実施例４： この実施例は、ＣＴＬエフェクターを増加させるのに使用したｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ培養法とＣＴＬアッセイについて説明している。
ｏ培養法とＣＴＬアッセイについて説明している。
【００４６】 ２５ｃｍ2の組織培養フラスコ当たり１５．０ｍｌの完全培地（１０．０％の ５６℃で加熱不活化したウシ血清、ペニシリンＧナトリウム１２０．０単位／ｍ
ｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０．０μｇ/ｍｌおよびＬ−グルタミン０． ３５ｍｇ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ１６４０）中で、実施例３からの実験に使用し
たＡ２Ｋｂトランスジェニックの脾細胞３．０×１０7個を、ペプチドＣＬＰ− １７５またはＣＬＰ−１７６で惹起したＡ２Ｋｂ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞１．３×
１０7個と共存培養した。培養開始時に、Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３も
１５．０μｇ/ｍｌの濃度で加えた。培養物はＣＯ2インキュベータ内で３７℃に
７日間維持し、次いで、応答体を次のように、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ４時間
ＣＴＬアッセイでペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ Ａ２Ｋｂ感染体に対して試
験した。
ｌ、ストレプトマイシン硫酸塩１２０．０μｇ/ｍｌおよびＬ−グルタミン０． ３５ｍｇ／ｍｌを補ったＲＰＭＩ１６４０）中で、実施例３からの実験に使用し
たＡ２Ｋｂトランスジェニックの脾細胞３．０×１０7個を、ペプチドＣＬＰ− １７５またはＣＬＰ−１７６で惹起したＡ２Ｋｂ感染Ｊｕｒｋａｔ細胞１．３×
１０7個と共存培養した。培養開始時に、Ｉ−Ａb結合ペプチドＣＬＰ−２４３も
１５．０μｇ/ｍｌの濃度で加えた。培養物はＣＯ2インキュベータ内で３７℃に
７日間維持し、次いで、応答体を次のように、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ４時間
ＣＴＬアッセイでペプチドで惹起したＪｕｒｋａｔ Ａ２Ｋｂ感染体に対して試
験した。
【００４７】 応答体を７日間培養物から回収し、完全培地で２回洗った。３７℃のＣＯ2イ ンキュベータでＪｕｒｋａｔ Ａ２Ｋｂ細胞１×１０6個を所定のペプチド１０ ０．０μｇと伴に一晩インキュベートすることにより陽性の標的を作製した。次
いで、同じ被験ペプチド２５．０μｇの存在下で、１×１０6個当たり２５０． ０μＣｉの51Ｃｒで標的細胞を標識した。完全培地で２回洗浄して、過剰の51Ｃ
ｒを除去したのち、標的細胞２．５×１０3個を様々な数の応答細胞と共に３７ ℃のＣＯ2インキュベータ中で４時間インキュベートした。次いで、上清の半量 を取り出し、放射活性を計測した。得られた結果は図３に示す。
いで、同じ被験ペプチド２５．０μｇの存在下で、１×１０6個当たり２５０． ０μＣｉの51Ｃｒで標的細胞を標識した。完全培地で２回洗浄して、過剰の51Ｃ
ｒを除去したのち、標的細胞２．５×１０3個を様々な数の応答細胞と共に３７ ℃のＣＯ2インキュベータ中で４時間インキュベートした。次いで、上清の半量 を取り出し、放射活性を計測した。得られた結果は図３に示す。
【００４８】 （開示の概要） この開示を要約すると、本発明は、ヘルパーＴ分子とＨＩＶタンパク質の脂質
化ペプチドならびに新規ペプチドおよびリポペプチドを利用する予備的刺激／追
加免疫手順により、ヒト宿主を含む宿主で、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を達成する
新規のプロトコールを提供する。本発明の技術的範囲内で部分的な変形を行うこ
とも可能である。
化ペプチドならびに新規ペプチドおよびリポペプチドを利用する予備的刺激／追
加免疫手順により、ヒト宿主を含む宿主で、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を達成する
新規のプロトコールを提供する。本発明の技術的範囲内で部分的な変形を行うこ
とも可能である。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【図１】 ＦＡＣＳ（蛍光抗体細胞分離）による、ある種のＲｅｖ由来ペプチドを使用し
て実施したｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−Ａ２安定化実験の結果を示す図である。
Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２に結合したペプチドＣＬＰ−７２（配列番号８）、Ｃ
ＬＰ−１８２（配列番号７）、ＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１
７７（配列番号２）はそれぞれの蛍光ピークのシフトで示される。
て実施したｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−Ａ２安定化実験の結果を示す図である。
Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ２に結合したペプチドＣＬＰ−７２（配列番号８）、Ｃ
ＬＰ−１８２（配列番号７）、ＣＬＰ−１７８（配列番号３）およびＣＬＰ−１
７７（配列番号２）はそれぞれの蛍光ピークのシフトで示される。
【図２】 パネルＡからＦを含み、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）で予備的刺激し、ま
たは予備的刺激せずに、ＣＬＰ−１７５、１７６および１６４（配列番号９）を
使用した、Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒ
ｅｖ免疫原の免疫原性を示す図である。
たは予備的刺激せずに、ＣＬＰ−１７５、１７６および１６４（配列番号９）を
使用した、Ａ２ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒ
ｅｖ免疫原の免疫原性を示す図である。
【図３】 パネルＡからＸを含み、上記と同様に様々なプロトコールを使用した、Ａ２Ｋ
ｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ特異的ＣＴＬ
誘導を示す図である。
ｂトランスジェニックマウスにおけるＨＩＶ−１（ＬＡＩ）Ｒｅｖ特異的ＣＴＬ
誘導を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１０月２５日（２０００．１０．２５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 14/16 ＺＮＡ Ｃ０７Ｋ 14/16 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 //(Ａ６１Ｋ 39/21 (Ａ６１Ｋ 39/21 39:29） 39:29） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 チャング、ペレ カナダ国 エル４シー ０ビー６ オンタ リオ州 リッチモンド ヒル エストール ストリート 32 (72)発明者 クレイン、マイケル エイチ． カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウデール モンロー ブー ルヴァード 16 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ02 QQ08 QQ79 QR48 QR69 QR72 QR77 QR80 QS22 QS24 QS28 QX07 4C085 AA03 BA69 BA87 CC05 DD22 EE06 FF01 FF02 4H045 AA10 AA30 BA10 BA55 CA01 DA86 EA22 EA31 FA58
Claims (15)
- 【請求項１】 宿主においてＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答
を生起する方法であって、 宿主にヘルパーＴ分子を投与して、宿主の免疫系のヘルパーＴ細胞を予備的刺
激することと、 続いて、宿主に、前記ヘルパーＴ分子とＴ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子の混合物
を投与して、宿主でＨＩＶ特異的なＴ細胞応答を生起することと を含む方法。 - 【請求項２】 前記ヘルパーＴ分子は、ＨＬＡクラスＩＩ結合ヘルパーＴエ
ピトープから選択する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ヘルパーＴエピトープは、ＤＰ、ＤＲおよびＤＱ特異的
Ｔ細胞エピトープからなる群から選択する請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記ヘルパーＴ分子は、ＣＬＰ−２４３（配列番号１０）で
ある請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記ヘルパーＴ分子は、アジュバントと共に投与される請求
項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記Ｔ細胞誘導性ＨＩＶ由来分子は、少なくとも１つのＴ細
胞エピトープを含み、ＨＩＶ−１抗原の一部に対応するペプチドを含む請求項１
に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ペプチドは、ＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質の配列に対
応している請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記ペプチドは、リポペプチドである請求項６に記載の方法
。 - 【請求項９】 脂質がパルミトイルまたはコレステロールである請求項８に
記載の方法。 - 【請求項１０】 前記リポペプチドは、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７
６である請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記混合物は、アジュバントと共に投与される請求項６に
記載の方法。 - 【請求項１２】 ＨＩＶ−１ ＬＡＩ分離株のＲｅｖタンパク質の配列のア
ミノ酸５２〜１１６（配列番号９）に対応するアミノ酸を有し、アミノ酸６３〜
７３（配列番号３）、７４〜８３（配列番号５）ならびに１０２〜１１０（配列
番号８）内にＴ細胞エピトープを含む、または、別のＨＩＶ−１分離株に由来す
る対応のアミノ酸配列を有するアミノ酸を有するペプチド。 - 【請求項１３】 リポペプチド型である請求項１２に記載のペプチド。
- 【請求項１４】 脂質がパルミトイルまたはコレステロールである請求項１
３に記載のペプチド。 - 【請求項１５】 リポペプチドは、ＣＬＰ−１７５またはＣＬＰ−１７６で
ある請求項１３に記載のペプチド。
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|---|---|---|---|
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