JP2002504340A - ヒト腫瘍細胞類を感作しおよびヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物および方法 - Google Patents

ヒト腫瘍細胞類を感作しおよびヒト腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物および方法

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セイント．ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 カルボキシルエステラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド類および化学療法プロドラッグおよびその不活性代謝物を活性薬物に代謝可能で前記ポリヌクレオチド類によってコードされるポリぺプチド類の提供、および腫瘍細胞類をプロドラッグ化学療法剤に感作させ本酵素によって腫瘍増殖を阻害するための組成物類および方法類の提供、さらに、本酵素によって活性化される薬物類の同定のためのスクリーニングアッセイの説明。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、米国政府国立衛生研究所（ＮＩＨ）グラント番号ＣＡ−６６１２４
およびＣＡ−６３５１２からの資金によって一部援助を受けており、したがって
、米国政府は、本発明においてある権利を有することができる。
【０００２】 （産業上の利用分野） 本発明は、カルボキシルエステラーゼ酵素をコードする同定されかつ塩基配列
決定された新規ポリヌクレオチド類、これらのポリヌクレオチド類によってコー
ドされるポリぺプチド類、およびベクター類およびこれらのベクター類を含み前
記酵素を発現する宿主細胞類に関する。この酵素は、化学療法のプロドラッグ類
および不活性代謝物類を活性ドラッグに代謝できる。本発明は、したがって、こ
れらのポリヌクレオチド類を含む組成物類、および選択された腫瘍細胞に対して
疾病特異的応答性プロモータの制御下においたポリヌクレオチドをトランスフェ
クションさせることによって、前記腫瘍細胞を化学療法のプロドラッグに感作さ
せる方法類に関する。感作された腫瘍細胞を次に化学療法プロドラッグに接触さ
せ、腫瘍細胞増殖を阻害することができる。本発明の組成物類は、また、化学療
法プロドラッグと併用して、骨髄から腫瘍細胞を浄化することができる。本発明
は、さらに、本酵素によって活性化される化学療法プロドラッグ類を同定するた
めの新規薬物スクリーニングアッセイ類も含む。
【０００３】 （発明の背景） 癌は、ゲノムレベルにおける複数の変化によって生じる疾病である。これらの
変化は、究極的には細胞サイクル機構の機能不良をおこし、最終的には自律的細
胞増殖が起こる。悪性形質転換には４種の遺伝子類が関与しており、オンコジー
ン類、腫瘍抑制遺伝子類、変異誘発遺伝子類およびアポトーシス遺伝子類である
。異なる種類の癌は、これらの遺伝子類のいずれか１種またはそれらのいずれか
の組み合わせの改変を伴っている。
【０００４】 ｍｙｃファミリのプロトオンコジーン類は、乳癌、結腸癌、子宮頚癌、頭頚部
癌および脳腫瘍を含むさまざまな異なる種類のヒト腫瘍類において過剰発現され
る。多くの固形腫瘍はｃ−ｍｙｃを増幅するかまたは過剰発現し、健常細胞に比
べて腫瘍細胞におけるｃ−ｍｙｃ ＲＮＡが５０倍まで増加することが報告され ている（Ｙａｍａｄａ、Ｈ．ら、１９８６。Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ．７７：３７０−３７５）。たとえば、６種の最も一般的な固形腫瘍のうちの３
種として結腸腺癌、乳癌および子宮頚癌があり、その１００％、５７％および３
５％までが、ｃ−ｍｙｃ蛋白質増加を示す。非腫瘍化細胞においてｃ−ｍｙｃを
強制的に発現させると、不死化を起こすが形質転換は起こさない;しかし、良性 癌類および健常分化組織においては、ｃ−ｍｙｃ蛋白質のレベル上昇はまれであ
る。固形腫瘍は外科的に除去できることが多いが、ｃ−ｍｙｃの過剰発現は、ｃ
−ｍｙｃ遺伝子の増幅と関連づけられてきており、予後不良と再燃リスク上昇と
相関している（Ｎａｇａｉ、 Ｍ．Ａ．ら、１９９２。Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ Ｒｅ
ｃｔｕｍ ３５：４４４−４５１；Ｏｒｉａｎ、Ｊ．Ｍ．ら、１９９２。Ｂｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：１０６−１１２；Ｒｉｏｕ、Ｇ．ら、１９８７。Ｌａ ｎｃｅｔ ２：７６１−７６３；Ｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｋ．ら、１９８９。Ｏｎｃｏ ｇｅｎｅ ４：１４６３−１４６８）。
【０００５】 ｍｙｃオンコジーンファミリのもうひとつの一員であるＮ−ｍｙｃは、若年小
児における神経芽細胞腫の発生に関連づけられてきた。プロトオンコジーン類の
ｍｙｃファミリのこの一員の過剰発現は、また、疾病の進行期および予後不良と
相関している（Ｂｒｏｄｅｕｒ、Ｇ．Ｍ．ら、１９９７。Ｊ．Ｐｅｄ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１９：９３−１０１）。この特異的条件において原発性腫
瘍は、通常、腹部に発生し、患者の７０％もが、診断時に骨髄転移を有している
（Ｍａｔｔｈａｙ、Ｋ．Ｅ．１９９７。Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１：１８５７−１ ８７５）。外科、化学療法および自家または同種間浄化骨髄移植によるステージ
４疾病を有する小児の治療は、移植後４年にわたり、患者の非進行性生存率を２
５から４９％としてきた（Ｍａｔｔｈａｙ，Ｋ．Ｋ．ら、１９９４。Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２：２３８２−２３８９）。自家移植後の再燃の大半は、重
大な疾病部位および／または以前に関連した部位で発生する。局所再発率の推定
値は、研究により異なっている。しかし、原発部位における腫瘍再発は、神経芽
細胞腫高リスク患者の約２５％で発生すると推定されてきた。
【０００６】 さらに、遺伝子マーキング研究による決定的証拠によれば、標準的臨床および
形態基準によって悪性細胞を全く含んでいないとされた自家骨髄は、髄質部位お
よび髄質外部位の両者で再燃に寄与する（Ｒｉｌｌ、Ｄ．Ｒ．ら、１９９４。Ｂ
ｌｏｏｄ ８４：３８０−３８３）。最近の試験的臨床研究では、骨髄関与の診 断は、自家浄化骨髄を受けた小児において当部位における特異的再燃と相関して
いた（Ｍａｔｔｈａｙ、Ｋ．Ｋ．、１９９３。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１
：２２２６−２２３３）。したがって、外科手術の改良、腫瘍辺縁の検出、新規
抗腫瘍剤の開発または新規療法の適用が、局所腫瘍再増殖を防止するために必要
である。特に、より効果的な治療戦略が、腫瘍摘出術または骨髄から腫瘍細胞を
浄化した後の疾病部位に少数の腫瘍細胞が存在することから生じる2 最小残留疾
病2 すなわち2 ＭＲＤ2 を消失させるために、必要である。
【０００７】 ＣＰＴ−１１（イリノテカン、７−エチル−１０−｛４−（１−ピペリジノ）
−１−ピペリジノ｝カルボニルオキシカンプトテシン）は、腫瘍治療のために現
在研究されているプロドラッグであり、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ハイド
ロキシ−カンプトテシン）として公知の活性薬物に変換される（Ｔｓｕｊｉ、Ｔ
．ら、１９９１。Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ １４：３ ４１−３４９；Ｓａｔｏｈ、Ｔら、１９９４。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ
．１７：６６２−６６４）。ＳＮ−３８は、細胞中で阻害されるとＤＮＡ損傷お
よびアポトーシス誘導を生じる酵素であるトポイソメラーゼＩ（Ｔａｎｉｚａｗ
ａ、Ａ．ら、１９９４。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６：８３６ −８４２；Ｋａｗａｔｏ、Ｙ．ら１９９１。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４１ ８７−４１９４ ）の強力な阻害剤である（Ｈｓｉａｎｇ、Ｙ−Ｈ．ら、１９８ ９。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：５０７７−５０８２）。インビボでＣＰＴ− １１の活性化に関与しているこの特異的酵素は、数種の哺乳類由来の血清または
肝ホモジネートがＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換する活性を有することが明ら
かにされているにもかかわらず、まだ、同定されていない（Ｔｓｕｊｉ、Ｔ．ら
、１９９１。Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ １４：３４１ −３４９；Ｓｅｎｔｅｒ、Ｐ．Ｄ．ら、１９９６。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６ ：１４７１−１４７４；Ｓａｔｏｈ、Ｔ．ら、１９９４。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ
．Ｂｕｌｌ．１７：６６２−６６４）。これらの活性は、どれも画一的にカルボ
キシルエステラーゼ（ＣＥ）の特徴を有している（Ｔｓｕｊｉ、Ｔ．ら、１９９
１。Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ １４：３４１−３４９ ；Ｓｅｎｔｅｒ、Ｐ．Ｄ．ら、１９９６。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１４７ １−１４７４；Ｓａｔｏｈ、Ｔ．ら、１９９４。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌ
ｌ．１７：６６２−６６４）。実際、ＳＮ−３８は、ＣＰＴ−１１投与数分後の
動物およびヒトの血しょう中で検出でき（Ｓｔｅｗａｒｔ、Ｃ．Ｆ．ら、１９９
７。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２５９− ２６５；Ｋａｎｅｄａ、Ｎ．ら、１９９０。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１７ １５−１７２０；Ｒｏｗｉｎｓｋｙ、Ｅ．Ｋ．ら、１９９４。Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．５４：４２７−４３６）、このことは、血清または組織のいずれかに存在
するＣＥ酵素が、カンプトテシンアナログをその活性代謝物に変換できることを
示唆している。
【０００８】 ＣＥ類は、さまざまな生体異物の解毒に関与すると考えられているいたるとこ
ろに存在するセリンエステラーゼ酵素類である。ＣＥ類は主に肝と血清中に存在
するが、この酵素属の生理的役割は、まだ同定を待たねばならない。１３種のＣ
Ｅ類の最近の生化学的分析では、ＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に代謝する能力を比
較した。変換効率は酵素間で異なったが、げっ歯類から単離されたものが最も効
率的であった（Ｓａｔｏ,Ｔ．ら、１９９４。Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ ．１７：６６２−６６４）。ウサギ肝ＣＥのアミノ酸配列が、開示されている（
Ｋｏｒｚａ、Ｇ．およびＪ．Ｏｚｏｌｓ、１９８８。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６３：３４８６−３４９５）。さらに、現在、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ
データベースには、ラット血清およびラット肝ミクロゾームＣＥを含めてＣＥを
コードする１３種のｃＤＮＡ配列がある。おもしろいことに、ヒト組織から精製
されたＣＥ類は、ＣＰＴ−１１のＳＮ−３８変換効率が最も低く、プロドラッグ
の５％未満しか活性薬物に変換されないことが分かった（Ｌｅｉｎｗｅｂｅｒ, Ｆ．Ｊ．１９８７。Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｖ．１８：３７９−４３９；Ｒ ｉｖｏｒｙ,Ｌ．Ｐ．ら、１９９７。Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：１２
６１−１２６６）。
【０００９】 ＳＮ−３８への代謝に加えて、ヒトＣＰＴ−１１では、ＡＰＣとして公知の化
合物に代謝される（Ｈａａｚ、Ｍ．Ｃ．ら、１９９８。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ：５８：４６８−４７２）。ＡＰＣは、もしあるにしてもわずかの抗腫瘍活性し
か有しておらず、ヒトでは、活性代謝物に変換されない（Ｒｉｖｏｒｙ、Ｌ．Ｐ
．ら、１９９６。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３６８９−３６９４）。 前臨床研究では、ＣＰＴ−１１をヒト腫瘍異種移植片を有する免疫不良マウス
に投与すると、神経膠芽腫、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）、神経芽細胞腫および結腸腺
癌の完璧な退縮をもたらす（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、Ｐ．Ｊ．ら、１９９５。Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６：３９３−４０３；Ｈ ｏｕｇｈｔｏｎ、Ｐ．Ｊ．ら、１９９３。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２８２ ３−２８２９ ）。しかし、ＣＰＴ−１１による研究では、腫瘍退縮を維持する ことは薬物投与計画に依存しているようであり、このことは、生腫瘍細胞が治療
後も生存することを示唆している（すなわち、最小残留疾病（ＭＲＤ））。これ
らの研究は、また、投与薬物用量と腫瘍退縮誘発の間には強い用量−応答関係が
あることを示した。たとえば、毎日ＣＰＴ−１１ ２０ｍｇ／ｋｇ／日を５日間 、２週間にわたり投与すると、Ｒｈ１８ ＲＭＳ異種移植片の完璧な退縮をもた らしたが、一方、同一スケジュールで１０ｍｇ／ｋｇ／日投与すると、部分腫瘍
退縮しかもたらさなかった。ＳＪＧＣ３Ａ結腸腺癌移植片を有するマウスを２０
ｍｇ／ｋｇ用量と比較してＣＰＴ−１１ ４０ｍｇ／ｋｇで処置しても、同様の 効果が観察された。
【００１０】 ＣＰＴ−１１による初期の臨床知見では、このプロドラッグがまたヒトにおい
て多くの異なる種類の固形腫瘍にたいして抗腫瘍活性を有していることを示唆し
ている。しかし、骨髄抑制と分泌性下痢が、患者に投与できる薬物量を制限して
いる。したがって、この将来性のある抗腫瘍剤を使用して成果をあげることがで
きる前に、これらの用量を制約する毒性を克服しなければならない。
【００１１】 腫瘍に対する新しい有効な治療戦略の開発は、特異的な薬物スクリーニングア
ッセイ類が入手できるかどうかに依存している。特異的薬物スクリーニングアッ
セイ類では、単離された標的組織モデル類、すなわち、ウサギ類、ラット類およ
びモルモット類などの動物由来の単離された心臓、回腸、脈管系または肝を必要
とすることがあり、前記標的組織は、動物から除去されこの標的細胞の選択され
た活性を候補薬物に暴露する前後の両方で測定する。新規腫瘍剤同定のための薬
物スクリーニングアッセイ類において測定する選択活性の例として、トポイソメ
ラーゼＩまたはＩＩのような酵素類の活性があり、これらは、細胞死を調節する
ことが公知である。このようなアッセイ類を用いてまた、選択された組織中で活
性代謝物に変換される潜在的プロドラッグ類をスクリーニングしまたはプロドラ
ッグをその活性代謝物に変換できる選択された組織を同定することもできる。
【００１２】 しかし、新規化合物属によって修飾されることが示される分子的事象であれば
いかなるものも、治療法開発のために最も有望な化合物類の選択のためのスクリ
ーニングアッセイとして開発することができる。実際、最近では、ゲノムレベル
で細胞を調節するという考えが、癌のような疾病の治療に適用されてきた。癌治
療のための遺伝子療法は、米国国立衛生研究所組換ＤＮＡ顧問委員会に承認され
た多数の臨床知見の主眼となってきたし、その知見の多くは臨床的適用成功を明
らかにしている（Ｈａｎａｎｉａら、１９９５。Ａｍ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ．９９
：５３７−５５２；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５。Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒ
ｍ．３２（５）：６８９−７０７；Ｂａｒｎｅｓら、１９９７。Ｏｂｓｔｅｔｒ
ｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ、８９：１４５−１５５；Ｄａｖｉｓら、
１９９６。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ８：４９９
−５０８；Ｒｏｔｈ ａｎｄ Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ １９９７、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃ ａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８９（１）：２１−３９）。悪性細胞を特異的に標的にし健
常細胞を救うためには、癌遺伝子療法では、選択的遺伝子運搬と特異的遺伝子発
現、特異的遺伝子産物活性、およびおそらく特異的薬物活性化を併用せねばなら
ない。最近、ウイルス（レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス
）法および非ウイルス（リポゾーム、遺伝子銃、注入）法の両者を用いる腫瘍部
位へのＤＮＡの効率的運搬にかなりの進歩が見られた。遺伝子類は、スクレープ
ローディングまたは弾道的透過のような物理的手段、リン酸カルシウムとのＤＮ
Ａの共沈またはリポゾームカプセル封入のような化学的手段によって、またはエ
レクトロポレーションのような電気生理学的手段によって、細胞中に移入させる
ことができる。しかし、最も広く使用されている方法は、ウイルス感染工程の相
対的効率性という利点を利用して、組換えウイルスによる遺伝子類の形質導入を
利用している。現在の遺伝子療法では、所望の遺伝子を含む複製欠失組換えウイ
ルス類による生物類の感染を利用している。最も広く使用されている複製欠失ウ
イルス類として、レトロウイルス類、アデノウイルス類、アデノ関連ウイルス類
、レンチウイルス類およびヘルペスウイルス類があげられる。ウイルス媒介遺伝
子運搬の効率性は１００％に近づけることができ、インビボで細胞の形質導入の
ためにこれらのウイルス類を潜在的に使用できるようにしている。
【００１３】 特に、アデノウイルスベクター系は、いくつかの利点を有している。これらに
は、非分割細胞を形質導入できること；形質導入されたＤＮＡは宿主細胞ＤＮＡ
に取り込まれないこと；それによって挿入的変異誘発が無視できること、アデノ
ウイルスベクター類の設計では、７ｋｂまでの外来ＤＮＡがウイルスゲノム中に
取り込まれるようにできること；非常に高ウイルス力価が得られ感染性を喪失す
ることなく保存できること；および適切なプラスミド類および封入細胞系統が感
染性、複製欠失ウイルスの迅速生成のために利用可能であることなどの事実が挙
げられる（Ｙａｎｇ、Ｎ．Ｓ．１９９２、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．１２：３３５−３５６）。遺伝子類のアデノウイルス媒介培養哺乳類細胞
中および動物中への運搬の有効性は、実証されている。
【００１４】 癌治療のための遺伝子療法の特異性と安全性を高めるために、標的細胞内部で
の治療遺伝子の発現もまた、厳密に制御しなければならない。腫瘍治療のため、
胸部、前立腺およびメラノーマ特異的プロモータ類および癌胎児性抗原、ＨＥＲ
−２／ｎｅｕ、Ｍｙｃ−Ｍａｘ 応答要素類、ＤＦ３／ＭＵＣのような疾病特異 的応答性プロモータ類を用いて、標的遺伝子発現が解析されてきた。Ｄａｃｈｓ
、Ｄ．Ｕ．ら、１９９７。Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．９（６−７）：３１３−２５。
たとえば、Ｍｙｃ−Ｍａｘ応答要素、ＣＡＣＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
が４個繰り返し連結した単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺
伝子のガンシクロビアによる肺癌治療のための遺伝子療法剤としての用途は、Ｃ
−、Ｌ−またはＮ−ｍｙｃ−過剰発現小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞系統において
検討された（Ｋｕｍａｇａｉ、Ｔ．ら、１９９６。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６ （２）：３５４−３５８）。このＣＡＣＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）コア
連結ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の形質導入は、インビトロにおいて親細胞よりもガンシ
クロビアに対して３種のＳＣＬＣ系統のすべての各クローン類の感受性を高め、
このことは、したがって、ＣＡＣＧＴＧ担持ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子がいかなる種類
のｍｙｃファミリオンコジーンを過剰発現しているＳＣＬＣであってもその治療
に有効であるかもしれないことを示唆している。ｃ−ｍｙｃによるさらなる実験
では、オルニチンデカルボキシルラーゼ（ＯＤＣ）プロモーター遺伝子の使用に
注目している。ＯＤＣ遺伝子の第１イントロン内部には２個のＣＡＣＧＴＧ2 Ｅ
ボックス類2 があり、ｍａｘとして公知のそのパートナー蛋白質に結合するとき
にｃ−ｍｙｃ蛋白質に対して結合部位を提供している。Ｅボックス配列の変異の
結果、ｃ−ｍｙｃはＯＤＣプロモータのトランス活性化ができなくなる。先の報
告では、第二エクソンに直接隣接しているクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子の上流に融合されたＯＤＣプロモータを含有するレポータ構
築体類はｃ−ｍｙｃ過剰発現細胞中で活性化された（Ｂｅｌｌｏ−Ｆｅｒｎａｎ
ｄｅｚ,Ｃ．ら、１９９３。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９
０：７８０４−７８０８）。対照的に、Ｅボックス類が｛ＣＡＣＧＴＧ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：２２）がＣＡＣＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）に｝変異してい
るプロモータ構築体類の一過性トランスフェクションは、より有意に低いレポー
タ遺伝子活性を明らかにした。これらのデータは、ｃ−ｍｙｃ応答ＯＤＣプロモ
ータの制御下に特定遺伝子類の転写が活性化できることを示唆している。Ｎ−ｍ
ｙｃの場合、Ｎ−ｍｙｃ蛋白質は、基本的ヘリックス−ループ−ヘリックス（Ｂ
ＨＬＨ）蛋白質であり、同属の蛋白質類とダイマー類を形成できる。Ｎ−ｍｙｃ
は、ＢＨＬＨ蛋白質ｍａｘとダイマーを形成し、ＯＤＣのような遺伝子プロモー
タ中に存在するＣＡＣＧＴＧモチーフに結合する複合体を形成し、その結果、こ
の配列を含む特定遺伝子類のトランス活性化および発現を起こす（Ｌｕｔｚ、Ｗ
．、１９９６。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３：８０３−８１２）。神経芽細胞腫細胞 系統および腫瘍類における研究では、そのコンセンサスＤＮＡ結合配列とのＮ−
ｍｙｃの結合はＮ−ｍｙｃ発現と相関しており、このデータは、神経芽細胞腫細
胞中のＮ−ｍｙｃレベルが、ＣＡＣＧＴＧ配列を含むプロモータ制御下における
蛋白質類の発現の決定因子であることを示唆している（Ｒａｓｈｅｌｌａ、Ｇ．
ら、１９９４。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：２２５１−２２５５）。腫瘍増殖 阻害手段としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド類によるｃ−ｍｙｃ遺伝子の
発現阻害も、また、開示されている｛Ｋａｗａｓａｋｉ,Ｈ．ら、１９９６。Ａ ｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ ２０（８）：８３６−４８｝。
【００１５】 本発明では、カルボキシルエステラーゼ酵素類またはその活性断片類をコード
するポリヌクレオチド類、および化学療法プロドラッグＣＰＴ−１１およびその
不活性代謝物ＡＰＣを活性薬物ＳＮ−３８に代謝できそれによってコードされる
ポリぺプチド類が開示される。ＡＰＣと併用して本酵素を使用すると、この不活
性代謝物を有用な化学療法プロドラッグにすることができる。また、本発明のポ
リヌクレオチドおよび疾病特異的応答性プロモータを含む組成物は選択された腫
瘍細胞類に運搬され、化学療法プロドラッグＣＰＴ−１１に前記腫瘍細胞を感作
させ、それによって、腫瘍細胞増殖を阻害できることも見い出された。
【００１６】 （発明の要約） 本発明の目的は、化学療法プロドラッグおよびその不活性代謝物類を活性薬物
に代謝できるカルボキシルエステラーゼをコードするポリヌクレオチド類を提供
することである。 本発明のもうひとつの目的は、これらのポリヌクレオチド類によってコードさ
れるポリぺプチド類を提供することである。 本発明のもうひとつの目的は、これらのポリヌクレオチド類を含むベクター類
およびこれらのベクター類を有しカルボキシルエステラーゼを発現する宿主細胞
類を提供することである。 さらに本発明の目的は、カルボキシルエステラーゼをコードするポリヌクレオ
チドおよび選択された腫瘍細胞の疾病特異的応答性プロモータまたはＣＭＶのよ
うなプロモータを含む組成物を提供することである。 本発明の更なる目的は、化学療法プロドラッグに腫瘍細胞を感作させる方法を
提供し、前記方法は、選択された腫瘍細胞に、カルボキシルエステラーゼをコー
ドするポリヌクレオチドおよび前記選択された腫瘍細胞の疾病特異的応答性プロ
モータを含む組成物を移入させることを含む。 本発明のもうひとつの目的は、選択された腫瘍細胞を感作することを含む選択
された腫瘍細胞の増殖阻害方法を提供し、前記方法は、選択された腫瘍細胞をカ
ルボキシルエステラーゼによって活性薬物に代謝された化学療法プロドラッグに
感作させ化学療法プロドラッグを投与することを含む。 本発明のもうひとつの目的は、腫瘍治療においてプロドラッグとしてＡＰＣを
用いる方法を提供することである。 さらに本発明の目的は、カルボキシルエステラーゼによって活性化された化合
物類の同定のための薬物スクリーニングアッセイ類を提供することである。
【００１７】 （発明の詳細な説明） ＣＰＴ−１１は、患者に投与すると、ヒトカルボキシルエステラーゼによって
その活性代謝物ＳＮ−３８に変換される有望な抗腫瘍プロドラッグである。しか
し、前記のヒト酵素は比較的非効率であり、前記プロドラッグの５％未満しかＳ
Ｎ−３８に代謝されない（Ｒｉｖｏｒｙ,Ｌ．Ｐ．ら、１９９７。Ｃｌｉｎ． Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３：１２６１−１２６６）。患者では、このプロドラッグ
はＡＰＣにも代謝される（Ｈａａｚ、Ｍ−Ｃ．ら、１９９８。Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．５８：４６８−４７２）。ＡＰＣは活性な抗腫瘍活性を有するにしてもわ
ずかしか有しておらず、ヒトでは活性代謝物に変換されない（Ｒｉｖｏｒｙ,Ｌ ．Ｐ．ら、１９９６。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３：３６８９−３６９４）。した
がって、インビボで有効レベルの活性薬物を得るためには、このプロドラッグを
高濃度で投与しなければならない。しかし、骨髄抑制や分泌性下痢によって、患
者に投与できるプロドラッグの量が制限される。
【００１８】 本発明では、腫瘍細胞増殖を阻害するために必要なプロドラッグの有効量を減
らすために腫瘍細胞を感作する方法が提供され、本法は、ｍｙｃプロモータのよ
うな疾病特異的応答性プロモータの制御下に選択した腫瘍細胞にポリヌクレオチ
ドを移入することを含む。本発明は、前記ｍｙｃファミリオのンコジーン類の腫
瘍特異的過剰発現を利用して化学療法プロドラッグによって選択的死滅をもたら
す。
【００１９】 本発明の一つの１面では、化学療法プロドラッグおよびその不活性代謝物類を
活性薬物に代謝できるカルボキシルエステラーゼをコードするポリヌクレオチド
類が提供される。2 ポリヌクレオチド類2 とは、本酵素またはその活性断片をコ
ードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなＤＮＡまたはＲＮ
Ａのいかなる形態をも意味しており、前記ポリヌクレオチド類は、クローニング
によって得られるかまたは周知の化学技術によって合成によって生成される。Ｄ
ＮＡは、二重鎖であっても一重鎖であってもよい。一重鎖ＤＮＡは、コードすな
わちセンス鎖または非コードすなわちアンチセンス鎖を含むことができる。した
がって、用語ポリヌクレオチドは、また、緊縮条件下で上記のポリヌクレオチド
類にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド類も含む。本文で使用する場
合、用語“緊縮条件”とは、２´ ＳＳＣ緩衝液で６０° Ｃのハイブリダイゼー
ション条件下で少なくとも６０％の相同性を意味する。好適な態様では、前記ポ
リヌクレオチドは、第４図に示したｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）または
その相同配列または断片を含み、このウサギ肝ＣＥ酵素の活性と類似の活性を有
するポリぺプチドをコードする。遺伝コードの縮重のゆえに、本発明のポリヌク
レオチド類は、また、この酵素をコードする他の核酸配列類、およびその誘導体
類、変異体類または活性断片類を含むことができる。本発明は、また、このポリ
ヌクレオチドの天然由来であってもよい変異体類すなわち対立変異体類、または
周知の変異誘発技術によって調製した突然変異体類に関する。
【００２０】 また、本発明では、本発明のポリヌクレオチド類を含むベクター類、および本
発明のベクター類によって遺伝子工学的に処理されＣＥまたはこの酵素の活性断
片類を生成する宿主細胞類を提供する。通常、ポリヌクレオチド類を維持し、増
加させ、または発現させ宿主細胞で本酵素を生成させるのに適したいかなるベク
ターも、この観点から発現に使用することができる。本発明のこの面によれば、
前記ベクターは、たとえば、プラスミドベクター、一重鎖または二重鎖ファージ
ベクター、または一重鎖または二重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであ
ることができる。このようなベクター類として、細菌プラスミド類、バクテリオ
ファージ類、酵母エピゾーム類、酵母染色体要素類、およびバキュロウイルス類
、パポバウイルス類、ＳＶ４０、ワクチニアウイルス類、アデノウイルス類、家
禽ポックスウイルス類、仮性狂犬病ウイルス類およびレトロウイルス類などのウ
イルス類に由来するベクター類のような染色体、エピゾームおよびウイルス由来
ベクター類、およびプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素類、コスミド
類およびファージミド類に由来するもののようにそれらの組み合わせに由来する
ベクター類があげられるが、それらに限定されない。適切なプロモータを選択し
ｍＲＮＡ転写と発現ベクター類の構築を誘導することは周知である。しかし、一
般に、発現構築体類は、転写開始および終始のための部位を含み、かつ転写領域
には翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むであろう。前記構築体類によって発
現された成熟転写体類のコード部分は、翻訳されることになるポリぺプチドのは
じめに翻訳開始コドンを含み末尾に適切に位置する終始コドンを含むであろう。
発現ベクター類に通常使用される真核生物プロモータ類の例として、ＣＭＶ超早
期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプ ロモータ、早期および後期ＳＶ４０プロモータ類、ルイスザルコーマウイルス（
ＲＳＶ）のプロモータのようなレトロウイルスＬＴＲ類のプロモータ類、および
マウスメタロチオネイン−Ｉプロモータのようなメタロチオネインプロモータが
あげられるが、それらに限定されない。前記ポリヌクレオチド類を含むベクター
類は、感染、形質導入、トランスフェクション、トランスベクションおよび形質
転換を含む周知の技術をいくつでも用いることで、宿主細胞中に導入できる。前
記ポリヌクレオチド類は、宿主に単独でまたはたとえば選択可能なマーカーをコ
ードする付加的ポリヌクレオチド類とともに宿主に導入することもできる。種々
の発現構築体類の宿主細胞類は周知で、当業者であれば通常、本発明のこの面に
従ってウサギ肝ＣＥ酵素を発現する宿主細胞を選択できる。本発明で有用な哺乳
類発現系の例として、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ,ＨｅＬａ、ヒト腎２９３およ びＢＨＫ細胞系統、およびサル腎線維芽細胞類のＣｏｓ-7系統があげられるが、
これらに限定されない。これとは別に、本文にも例示してあるが、ウサギＣＥは
、バキュロウイルスベクターによってスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） Ｓｆ２１細胞類中で発現できる（実施例３
参照）。
【００２１】 本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物類に関し、それらは
、前記プロドラッグとＣＥ酵素の併用療法によって腫瘍細胞をＣＰＴ−１１細胞
毒性に感作させる際に有用であると見出された。本発明は、したがって、腫瘍細
胞をプロドラッグ腫瘍剤に感作させる方法類を提供する。本文では、“感作させ
ること”とは、本発明の組成物類および方法類を使用して前記プロドラッグの有
効量を低減できることを意味している。有意な毒性の出現または用量を制約する
毒性の出現によって前記プロドラッグ治療活性が限定される場合、前記プロドラ
ッグに対する腫瘍細胞の感作は、特に有用である。
【００２２】 一つの態様において、選択された腫瘍細胞は、本発明のｃＤＮＡによってトラ
ンスフェクションされ、ＣＭＶプロモータのような周知のプロモータ、より好適
には前記選択された腫瘍細胞類を特異的に標的にする疾病特異的応答性プロモー
タによって発現される。腫瘍細胞中における標的遺伝子発現は、癌胎児性抗原、
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｍｙｃ−Ｍａｘ応答要素類、およびＤＦ３／ＭＵＣのよう
な疾病特異的応答性プロモータ類を用いて達成されてきた。したがって、ｃＤＮ
Ａウサギ肝ＣＥおよびこれらのような疾病特異的応答性プロモータを含む組成物
を用いて、前記の疾病特異的応答性プロモータを含有する腫瘍細胞類をトランス
フェクションしかつ感作することができる。したがって、本発明は、疾病特異的
応答性プロモータに関連する腫瘍特異的発現を利用する手段を提供し、腫瘍類の
選択的療法を提供する。
【００２３】 ｍｙｃ発現はさまざまなヒト腫瘍中で脱制御されているので、ｍｙｃは、化学
療法にとって魅力的な標的である。公知の薬物でｃ−ｍｙｃまたはＮ−ｍｙｃと
特異的に相互作用するものはない。しかし、ｍｙｃオンコジーンを過剰発現する
細胞は、ｍｙｃ特異的プロモータの制御下に本発明のポリヌクレオチドを含む本
発明の組成物類によって標的となることができる。したがって、本発明を用いて
ｃ−ｍｙｃおよびＮ−ｍｙｃの腫瘍特異的過剰発現を利用して、化学療法剤によ
る選択的死滅をもたらすことができる。特に、Ｎ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｃのい
ずれかのＣＡＣＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）結合配列を含むプロモータの
制御下に遺伝子の転写を、これらのｍｙｃ−遺伝子類を過剰発現する細胞中で正
の方向に制御し、化学療法プロドラッグＣＰＴ−１１を活性化できる前記ＣＥコ
ードポリヌクレオチドの腫瘍細胞特異的発現をもたらす。
【００２４】 プロモータの遺伝子発現制御能は、ｃ−ｍｙｃ、ＳＪ−Ｇ２およびＮＣＩ−Ｈ
８２細胞（ｃ−ｍｙｃを過剰発現する）およびＲｈ２８細胞（検出可能なレベル
のｃ−ｍｙｃ蛋白質を有していない）を過剰発現する細胞系統で確認された。こ
れらの実験において、細胞は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼのレポータ遺伝子の発現を制御するＯＤＣプロモータを含むプラスミドで一過
性にトランスフェクションさせた。ｃ−ｍｙｃトランス活性化ドメイン類が点変
異によって不活化された変異ＯＤＣプロモータを対照として用いた。変異プロモ
ータ配列に比較して、天然のＯＤＣプロモータを含むプラスミドでトランスフェ
クションした後、ＳＪ−Ｇ２細胞およびＮＣＩ−Ｈ８２細胞中でそれぞれ４から
５倍のレポータ活性の増加が観察された。Ｒｈ２８細胞中では、有意なプロモー
タ活性の増加は全く観察されなかった。これらの結果は、ＯＤＣプロモータ内部
のコグネイト配列に結合することによるｃ−ｍｙｃ媒介転写活性化と一致してい
る。さらに、活性化レベルは、ｃ−ｍｙｃの強制的同時発現がＣＶ−１およびＮ
ＩＨ−３Ｔ３細胞のトランスフェクション時に起こる際レポータ構築体によって
見られるレベルと類似していた。
【００２５】 第４図に示したｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）は、公表されたウサギＣ
Ｅ蛋白質配列（Ｋｏｒｚａ,Ｇ．およびＪ．Ｏｚｏｌｓ、１９８８。Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３４８６−３４９５）のアミノ酸残基１−５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および５１８−５２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）から縮重し たオリゴヌクレオチド類を合成することによって単離した。構築したオリゴヌク
レオチド類は、第２図に示した。ＰＣＲによって前記ウサギｃＤＮＡを増幅する
ため、ｃＤＮＡをウサギ肝ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡから調製し、オリゴヌクレオチ
ドプライマー類組み合わせを含有する複数試料を調製した。ＰＣＲ技術を用いて
、１組の反応から単一生成物を得たが、これは、ＤＮＡ配列決定すると、前記の
ウサギＣＥをコードすることが明らかになった。
【００２６】 これは部分ｃＤＮＡを意味しているので、５¢ および３¢ 両者のＲＡＣＥを
用いて全コード配列を増幅した。この部分ＤＮＡ配列から独自のプライマー類を
設計した。これらのオリゴヌクレオチド類をＡＰ１プライマーと併用し、マラソ
ン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）適応ウサギ肝ｃＤＮＡから調製した配列類を増幅した。
タッチダウンＰＣＲ（Ｄｏｎ、Ｒ．Ｈら、１９９１。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．１９：４００８）は、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ） ｃＤＮＡ増幅
プロトコールによって実施した。 ウサギ肝ＣＥのｃＤＮＡの完全な配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびそれ
に由来するアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を第４図に示した。ウサギ
肝由来ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡの［３２Ｐ］標識ｃＤＮＡによるノーザン解析によ
って、約１．８４ｋｎｔの唯一の転写物の存在が確認された。他のいかなるｍＲ
ＮＡとも全く交差反応は観察されず、このｃＤＮＡが独自のＲＮＡ種を示してい
ることと一致していた。
【００２７】 さらに、本発明のｃＤＮＡによってコードされたポリぺプチドのアミノ酸配列
とウサギＣＥについて公表されているアミノ酸配列（スイスプロット（Ｓｗｉｓ
ｓｐｒｏｔ）寄託番号Ｐ１２３３７；Ｋｏｒｚａ、Ｇ．およびＪ．Ｏｚｏｌｓ、
１９８８。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３４８６−３４９５）を比較し、
３個のミスマッチが明らかになった。さらに、本発明のｃＤＮＡによってコード
されたポリぺプチドは、アミノ酸８個のインサート１個とＮ末端にアミノ酸１８
個のリーダー配列を１つ含み、これは、前記の公表された配列には含まれていな
い。したがって、本発明の別の面は、本発明のポリヌクレオチド類によってコー
ドされる新規ポリぺプチド類に関する。2 ポリぺプチド2 とは、第４図に示した
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１のアミノ酸配列、および基本的にこのウサギ肝ＣＥと同
様の生物活性および／または機能を保持する断片類、誘導体類およびアナログ類
を意味する。
【００２８】 このウサギｃＤＮＡは細菌中で発現された。１．７ｋｂのこのｃＤＮＡをｐＥ
Ｔ３２ｂに連結し、大腸菌Ｌ２１に形質転換した（ＤＥ３）。Ｔ７プロモータに
関して正しい（ｐＥＴＲＡＢＦＬ）または正しくない（ｐＥＴＬＦＢＡＲ） ）方向のいずれかでウサギｃＤＮＡを含む２個のクローンを単離した。ＩＰＴＧ
により液体培養で発現誘発後に、細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタ
ンブロッティングによって解析した。７５ｋＤａの蛋白質が、ｐＥＴＲＡＢＦＬ
においてチオレドキシン蛋白質とウサギＣＥの融合によって生じた。ラット肝ミ
クロゾームＣＥ抗体および西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合蛋白質Ｓ
によるウェスタン解析によって、ｐＥＴＲＡＢＦＬによってコードされた前記の
７５ｋＤａ蛋白質がウサギＣＥを含有することを確認した。他のＣＥ類はＥＲに
局在化しかつこのウサギ酵素の一次配列が類似の特徴的リーダーおよびアンカー
配列類を含有している（Ｓａｔｏｈ、Ｔ．およびＭ．Ｈｏｓｏｋａｗａ、１９９
５。Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２／８３：４３９−４４５）ので、ＣＥのＥ
Ｒへのコンパートメント化が酵素活性に必要であるようである。実際、ヒト肺胞
マクロファージＣＥの大腸菌中における過剰発現はＣＥ活性をもたらすことがで
きなかったが、哺乳類細胞を同ｃＤＮＡでトランスフェクションすると、全細胞
抽出物によってｏ−ＮＰＡの有意な変換をもたらした。さらに、前記のウサギＣ
Ｅは、ヒト肺胞マクロファージＣＥと８５％を超える相同性を示したが、後者の
酵素は、哺乳類細胞においてＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換できなかった。こ
のことは、ＣＥ類が広範囲の基質特異性を有することができる一方、異なる種の
類似酵素類が特定基質を利用できる効率が顕著に異なることを示唆している。
【００２９】 前記ｃＤＮＡがＣＥをコードすることを確認するため、前記の１．７ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片をｐＣＩｎｅｏに連結しｐＣＩＲＡＢＦＬを生成させ、このプラス
ミドを一過性にＣｏｓ７細胞にトランスフェクションさせた。ｐＣＩｎｅｏは、
ＳＶ４０複製開始点を有しており、ラージＴ抗原を発現するＣｏｓ７のような細
胞におけるプラスミド増幅を可能とする。ＣＥ発現細胞のＣＰＴ−１１のＩＣ５ ０ 値は、親細胞系統のそれに比較して約８−８０倍、さらに最も典型的には約５
６倍も小さかった。このことは、本酵素がＣＰＴ−１１に対して哺乳類細胞を感
作したことを示唆している（第５図参照）。
【００３０】 ウサギＣＥは、バキュロウイルスベクターによってスポドプテラ・フルギペル
ダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ） Ｓ２１細胞中でも発現され
た。これらの細胞中で分泌されたＣＥは限外ろ過によって約１ｍｌまで濃縮し、
それは酵素活性約３０，０００マイクロモル／ｍｌを有していた。
【００３１】 本発明のもうひとつの面は、カルボキシルエステラーゼをコードするポリヌクレ
オチドおよび選択された腫瘍細胞類の疾病特異的応答性プロモータを含む本発明
の組成物類の前記腫瘍細胞類を化学療法プロドラッグに感作させる能力に関する
。ヒト腫瘍細胞をＣＰＴ−１１に感作させる能力を、本発明のウサギＣＥとＣＰ
Ｔ−１１を併用した場合について調べた。最初に、本発明のＣＥ活性によって生
成される代謝物がインビトロで生物活性であることを確認する実験を行った。次
に、Ｒｈ３０細胞を各反応の生成物に１時間暴露させ、増殖阻害百分率を求めた
。予測どおり、加熱によって不活化した１から５単位のＣＥに暴露したＲｈ３０
細胞は細胞増殖を全く阻害しなかった。対照的に、活性ＣＥ １から５単位とイ ンキュベートしたＣＰＴ−１１の反応生成物は、細胞増殖を３０−６０％阻害し
た。これらのデータは、これらの細胞中におけるＣＥによるＣＰＴ−１１のＳＮ
−３８への変換と一致している。
【００３２】 トランスフェクションされた細胞の抽出物のＣＥ活性を次に調べた。本発明の
ウサギ肝ＣＥ ｃＤＮＡを安定的に形質移入されたかまたはｐＩＲＥＳベクター だけを移入したＲｈ３０横紋筋肉腫細胞におけるＣＰＴ−１１のＩＣ５０値も求
めた。ＣＥ ｃＤＮＡを移入した細胞は、対照細胞に比べて約６０倍高いＣＥ活 性を有していた。Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳ細胞（ＣＥ ｃＤＮＡなし）のＣＰＴ−１ １のＩＣ５０値は、４．３３´ １０−６Ｍであり、一方、Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳ ｒａｂｂｉｔ 細胞のＩＣ５０値は５．７６´ １０−７であった。したがって、 移入細胞は、ＣＰＴ−１１に対して８倍を超えるほど感受性が高かった。これら
のデータは、本発明のＣＥを移入した細胞におけるＣＰＴ−１１のＳＮ−３８へ
の変換上昇と一致している。
【００３３】 また、本発明のＣＥが不活性代謝物ＡＰＣをＳＮ−３８に変換可能なことを明
らかにする実験を行った。これらの化合物類の構造は、第８図に示した。第６図
は、本発明のウサギＣＥによって濃度依存的にＡＰＣがＳＮ−３８に変換される
インビトロ実験結果を示している。これらのデータから、プロドラッグＣＰＴ−
１１を活性化する本発明のＣＥの独自の能力ならびにその代謝物類のひとつを活
性化する独自の能力が確認される。さらに、本発明のＣＥを発現するＵ−３７３
細胞中における実験では、これらの細胞類がＡＰＣの増殖阻害効果に感作された
ことを示している（第７図参照）。
【００３４】 腫瘍細胞類をＣＰＴ−１１に感作する本発明のＣＥのインビボにおける有効性
は、また、異なる２種の腫瘍細胞類で明らかにされた。マウスモデルで実施した
実験では、本発明のＣＥがＣＰＴ−１１の増殖阻害効果に細胞類を感作できるこ
とを明らかにする。 第１群の実験では、免疫不良マウスで異種移植片として増殖させたＲｈ３０横
紋筋肉腫ヒト腫瘍細胞類を感作するウサギＣＥの能力を明らかにした。この前臨
床モデルでは、トランスフェクションされたウサギＣＥ ｃＤＮＡの発現は、少 なくとも１２週間維持された。ＣＰＴ−１１による治療が開始される前に腫瘍類
が進行していた（容積１ｃｍ３よりも大きい）ことが重要である。第９Ｂ図に示
したように、ＣＥ発現マウスをＣＰＴ−１１ ２．５ｍｇ／ｋｇ／日で２週間に わたり各週５日間（１治療サイクル）処置し、２１日おきに総計３サイクル（８
週にわたり）繰り返したマウスでは、腫瘍類は完全に退縮し１２週間の本研究時
においては再増殖しなかった。対照的に、ＣＥを発現しない腫瘍類はＣＰＴ−１
１処置により一過性には退縮したが、ＣＰＴ−１１処置停止１週間以内に再増殖
が起こった（第９図参照）。 第２の実験群では、ウサギ肝ＣＥ発現ヒトＵ３７３神経膠芽腫異種移植片は、
対照プラスミド移入異種移植片（ウサギＣＥなし）よりもＣＰＴ−１１により感
受性であることを示した。ウサギＣＥをコードするプラスミドを移入した細胞類
から樹立した異種移植片は完全に退縮し、対照プラスミド移入細胞類から樹立し
た異種移植片は、安定疾病を示したが有意な退縮は示さなかった（第１０図参照
）。
【００３５】 したがって、これらのデータは、本発明のＣＥをコードするポリヌクレオチド
とＣＰＴ−１１を併用し、腫瘍細胞増殖の阻害をもたらすかまたはＣＰＴ−１１
に対して前記腫瘍細胞類を感作できることを裏付けている。これらのデータは、
また、腫瘍患者においてＣＰＴ−１１の用量低減を可能とし、したがって、用量
限定性の毒性の可能性を低減するための本発明の用途を裏付けている。さらに、
これらの実験によって明らかにされたように、比較的無毒であるＡＰＣも、また
、本発明のＣＥと併用して化学療法プロドラッグとして使用し、毒性副作用を最
小としつつ腫瘍特異的細胞死をもたらすことができる。
【００３６】 したがって、本発明は、副作用を低減し癌を治療する方法にも関する。一つの
態様では、遺伝子トランスファー操作を用いて、本発明のポリヌクレオチドをウ
イルスベクターに挿入する。好適なウイルスベクター類として、レトロウイルス
、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルスおよびアデノ関連ウ
イルスベクター類があげられるが、これらに限定されない。この態様では、好適
には、前記ベクターがさらに疾病特異的応答性プロモータを含む。前記ベクター
類は、その後、ＣＰＴ−１１のようなプロドラッグの全身投与とともに腫瘍除去
部位に注入し、腫瘍の外科摘出後に存在する残留腫瘍細胞類による腫瘍類の再発
を阻害することができる。
【００３７】 これとは別に、このウイルスベクターを用いて自家移植時に夾雑する腫瘍細胞
類を骨髄から浄化することができる。アデノウイルスのような本発明のＣＥを発
現するウイルスベクターによる骨髄浄化は、エクスビボで実施される。夾雑腫瘍
細胞類の除去効率は、浄化した試料のＰＣＲアッセイによって求める。データか
ら、本発明の方法が、実施例６に記載したような神経芽細胞腫細胞を骨髄から浄
化する動物モデルに適用可能であることが示唆される。前記ベクター類調製方法
、投与方法、およびプロドラッグの適切な用量は、当業者に周知である。化学的
およびリポゾーム媒介遺伝子トランスファーのような遺伝子運搬、受容体媒介Ｄ
ＮＡ取り込み、および遺伝子銃またはエレクトロポレーションによる物理的トラ
ンスファーの他の方法も同様に使用することができる。
【００３８】 選択した腫瘍細胞類にＣＥ類を運搬する別法では、抗体特異的酵素プロドラッ
グ療法（ＡＤＥＰＴ）を必要とする。この方法では、腫瘍特異的マーカー抗体と
ウサギ肝ＣＥのような分子を連結することによって、ヒト腫瘍を標的とする。前
記複合体の細胞取り込みおよび活性ＣＥの放出が生じ、前記マーカーの抗原を発
現する細胞に特異的なＣＰＴ−１１活性化が起こる。細胞表面で発現されたマー
カー分子類の並びかたは各腫瘍種類に応じて異なるので、各標的腫瘍種類に特異
的なマーカー類を適切に選択することができる。同様に、アビジン−ビオチン結
合分子類を標的腫瘍細胞類に使用すること（Ｍｏｒｏ、Ｍ．ら、１９９７。Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：１９２２−１９２８）も細胞表面にＣＥ類を局在化さ せるために適用でき、その後、標的細胞で薬物活性化が起こる。
【００３９】 ウサギ肝ＣＥは、小胞体に局在化している。前記６個の末端アミノ酸類を除去
することで、細胞外環境へ活性蛋白質が分泌されることになる。分泌された蛋白
質および小胞体限局蛋白質の両者ともＣＰＴ−１１をＳＮ−３８に変換できる。
したがって、前記分泌された酵素を発現する細胞に由来する第３者的効果の可能
性が存在する。同様の第３者的効果は他の酵素／プロドラッグ組合わせについて
も明らかにされており、たとえば、ＨＳＶｔｋおよびガンシクロビアがそうであ
り（Ｄｉｌｂｅｒ、Ｍ．Ｓ．ら、１９９７。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：１５ ２３−１５２８）、その結果、細胞毒性が高まる。ＣＰＴ−１１の細胞外活性化
の結果、外因性に産生されたＳＮ−３８による非感染隣接腫瘍細胞類の死滅とい
う点でＭＲＤのより効率的な根絶が生じることがある。ＣＴＰ−１１と分泌ＣＥ
との組合わせによる遺伝子療法プロトコールは、したがって、残留腫瘍細胞の消
滅により適しているかもしれない。したがって、本態様では、ポリぺプチドをコ
ードするポリヌクレオチドの断片を使用することが好適で、それは分泌される。
たとえば、ウサギ肝について、第４図に示した前記６個の末端アミノ酸類を含ま
ない蛋白質をコードするｃＤＮＡまたは第４図のアミノ酸１−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）から構成されるウサギ肝ＣＥ酵素をコードするｃＤＮＡが好 適であろう。さらに、最近の報告によると、細胞外細胞表面に薬物活性化酵素が
つなぎとめられる結果、適切なプロドラッグと併用すると、ヒト腫瘍異種移植片
中に抗腫瘍活性がもたらされる（Ｍａｒａｉｓ、Ｒ．ら、１９９７．Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１３７３−１３７７）。前記蛋白質は血しょう中を 自由に循環しないので、つなぎとめられた酵素は局所的第３者効果をもたらす。
本発明のＣＥを細胞表面に結合すると、ＣＰＴ−１１のＳＮ−３８への細胞外活
性化が局部的に起こり、局所細胞死を高めるはずである。骨髄からの夾雑腫瘍細
胞類の浄化は細胞内酵素によって達成され、一方、ＭＲＤの根絶は、ＣＰＴ−１
１を細胞外の場所で活性化する酵素によってよりよく達成される。
【００４０】 本発明のＣＥ類は、ＣＰＴ−１１中でエステル結合として存在するＣＯＯＣ結
合を切断し、ＳＮ−３８を生成する（第８図参照）。本酵素はまたこのような結
合を含む他の化合物類の活性化も触媒できるので、本発明は、また、この部分お
よび関連部分を含む化合物類のスクリーニングのためのアッセイ類を提供する。
一つの態様において、本発明のアッセイは、たとえば、酵母、バキュロウイルス
、またはヒト腫瘍細胞系統を用いて細胞系で実施する。この態様において、ＣＥ
によって活性化される化合物類は、本発明のＣＥを発現するかまたは欠失してい
る細胞を用いて、増殖阻害またはクロノジェン細胞生存アッセイによって抗腫瘍
活性を同定し評価されるであろう。これとは別に、本酵素を発現する宿主細胞か
ら単離された本発明のＣＥを用いて、細胞非含有アッセイ類でスクリーニングで
きる。この態様において、候補化合物のＣＯＯＣエステル結合を切断する本酵素
の能力は、本発明のＣＥ含有標準酵素アッセイ緩衝系で直接測定できる。公知濃
度の候補化合物類を、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳのような生物学的緩衝液および前
記酵素を含むアッセイ試験管に添加し、選択した時間中37° Ｃでインキュベー トできる。その後、本反応を、メタノール添加によって停止する。アッセイ試験
管をその後遠心分離し、その上清について、切断化合物断片の存在を分析する。
上清の分析は、分光蛍光分析、高速液体クロマトグラフィまたはマス分光分析を
含む周知の技術をいくつでも用いて実施できるが、これらに限定されない。これ
らのスクリーニングアッセイ類で潜在的抗腫瘍プロドラッグ類として同定された
化合物類は、それらの抗腫瘍活性を最適化するための化学的修飾を必要とするこ
とがある。 下記の非限定性実施例は、請求の範囲に記載の発明を例示するために示した。
【００４１】
【実施例】
実施例１：ＣＥ類の同定 ＣＰＴ−１１を活性型ＳＮ−３８に変換するために適したＣＥ酵素は、種々の
試料を試験することによって、同定した。このスクリーニングでは、迅速蛍光ア
ッセイを用い、一群の血清、細胞抽出物および市販のＣＥ類に由来する酵素類が
含まれる。これらの酵素類のあるものは、ＣＰＴ−１１代謝において活性を示す
。 部分精製ＣＥ類は商業的に入手できたので、これらのうちのいくつかについて
も同様にＣＰＴ−１１代謝能力を試験した。ウサギおよびブタ両者の肝ＣＥ類は
、ＣＰＴ−１１を効率的に代謝した。前記の市販ブタＣＥは、数種の蛋白質類を
含有していた。しかし、主なバンド類は分子量で非常に類似しており、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥを用いても分離しなかった。対照的に、前記ウサギ調製物は、１個の主
要バンドと１個のマイナーバンドのみから構成されていた。したがって、ウサギ
蛋白質類を以後の研究に選んだ。 前記のウサギ蛋白質類を自動Ｎ末端アミノ酸配列決定に供した。両者のバンド
類ともに、前記ぺプチド類がＮ末端をブロックされていないことを示す蛋白質配
列決定をもたらした。誘導アミノ酸配列類を、ＦａｓｔａおよびＢＬＡＳＴ比較
プログラムを用いて、コンピュータサーチによって解析した。バンド１（約６０
ｋＤａ）は、ＧｅｎＢａｎｋおよびスイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）デー
タベースに存在するウサギＣＥを含むいくつかのＣＥ配列類に有意な相同性を示
した（第１図）。しかし、ウサギＣＥ蛋白質をコードする核酸配列は開示されて
いない。さらに、本発明のｃＤＮＡによってコードされるポリぺプチドのアミノ
酸配列をウサギＣＥの公表されたアミノ酸配列と比較すると、３個のミスマッチ
が示された。さらに、本発明のｃＤＮＡによってコードされたポリぺプチドは、
アミノ酸８個のインサートおよびＮ末端にアミノ酸１８個のリーダー配列を有し
ており、それは、公表された前記配列には含まれていない。したがって、ウサギ
肝カルボキシルエステラーゼ蛋白質の公表されたアミノ酸配列（スイスプロット
（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）寄託番号Ｐ１２３３７；Ｋｏｒｚａ,ＧおよびＪ．Ｏｚ ｏｌｓ、１９８８。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３４８６−３４９５ ） は、本発明のｃＤＮＡによってコードされるポリぺプチドとは異なっている。
【００４２】 実施例２：ウサギカルボキシルエステラーゼのクローニング 本発明のウサギＣＥ蛋白質をコードするｃＤＮＡは、ウサギ肝ＣＥの公表され
た蛋白質配列のアミノ酸残基１−５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）および５１８−５
２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）から縮重オリゴヌクレオチド類を合成すること
によって、単離された（Ｋｏｒｚａ、ＧおよびＪ．Ｏｚｏｌｓ、１９８８。Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３４８６−３４９５ ）。前記構築されたオリゴ ヌクレオチド類は、第２図に示してある。ＰＣＲによって前記ウサギｃＤＮＡを
増幅するため、ｃＤＮＡをウサギ肝ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡから調製し、オリゴヌ
クレオチドプライマー類の組み合わせを含む複数の試料を調製した。９５° Ｃ で５分間加熱後、アニーリング温度でポリメラーゼを添加し、反応を下記のよう
にサイクルさせた：９４° Ｃで４５秒間、アニーリング温度（４６−５８° Ｃ
）で１分間、７２° Ｃで９０秒間とした。通常、増幅２５サイクルを実施した 。１組の反応でただ１個の生成物が得られ、それは、ＤＮＡ配列決定すると、新
規ウサギＣＥをコードすることが示された。 これは部分ｃＤＮＡを示していたので、５¢ および３¢ 両者のＲＡＣＥを用
いて全コード配列を増幅した。この部分ＤＮＡ配列からそれぞれ５¢ および３ ¢ 末端に対応する２７および２８個のヌクレオチド類の独自のプライマー類を 設計した。これらのオリゴヌクレオチド類をＡＰ１プライマーと併用し、マラソ
ン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）適応ウサギ肝ｃＤＮＡから調製した配列類を増幅した。
タッチダウンＰＣＲ（Ｄｏｎ、Ｒ．Ｈら、１９９１。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．１９：４００８）は、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ） ｃＤＮＡ増幅
プロトコールにしたがって実施した。約４２０ｂｐの唯一の生成物が３¢ プラ イマーによって生成したが、５¢ オリゴヌクレオチド類では全く生成物が観察 されなかった。標準ＰＣＲ増幅プロトコール類（９４° Ｃで４５秒間、６０°
Ｃで１分間、７２° Ｃで１分間を３０サイクル）の結果、約２８０ｂｐのとこ ろにマイナーバンドを有するわずかのＤＮＡ生成物が生じた。前記反応の特異性
を高めようと試みたが、成功しなかった。したがって、ＤＮＡは、アガロースゲ
ルから単離し、その後ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯに連結した。ＤＮＡ配列決定によっ
て、両方の試料中でオリゴヌクレオチドＲＡＣＥプライマー類の存在が示唆され
た。前記の３¢ ＲＡＣＥ生成物はこの特異的プライマーから４０７ｂｐだけ伸 長しており、公表されたデータと一致する末端アミノ酸類をコードしていた（Ｋ
ｏｒｚａ、ＧおよびＪ．Ｏｚｏｌｓ、１９８８。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
３：３４８６−３４９５ ）。さらに、ｐｏｌｙＡテイルが存在したが、もとも とのマラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ） ｃＤＮＡ合成プライマー配列類は同定でき なかった。前記の５¢ ＲＡＣＥ生成物はこのＣＥ特異的プライマーから２４７ ｂｐだけ伸長しており、公表されたアミノ酸配列をコードしていた。メチオニン
開始コドンから始まる１８残基の付加的疎水性リーダー配列が同定され、他の種
由来のＣＥ類のＮ末端に存在するアミノ酸類と一致していた（第３図）。５¢ および３¢ の両者の非翻訳配列類を含む全転写物は、ＲＡＣＥ実験によって求 められたように、１８８６ｎｔ長であり、ノーザン解析で示唆されたものと極め
て類似していた。これによって、これらの実験で記載されたｃＤＮＡが全長であ
ることが確認された。
【００４３】 全長ウサギＣＥ ｃＤＮＡを増幅するため、オリゴヌクレオチドプライマー類 ＲａｂＮＴＥＲＭ（ＧＧＣＡｇｇａａｔｔＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）および ＲａｂＣＴＥＲＭ （ＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣ
ＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＴＧＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）を設計し、ＡＴ
Ｇ開始コドン上流９ｂｐおよびＴＧＡ終始コドンの下流８ｂｐにＥｃｏＲＩ部位
類を作成した。これらを用いて、Ｐｆｕポリメラーゼを用いるウサギ肝ｃＤＮＡ
増幅を行った。増幅の最初の５サイクルは、下記のように行った:９４° Ｃで４
５秒、５０° Ｃで１分、７２° Ｃで９０秒とし、その後の２５サイクルについ
て、アニーリング温度は５６° Ｃまで上昇させた。この結果、ｃＤＮＡ末端に ＥｃｏＲＩ制限部位類が形成できた。約１７００ｂｐの生成物が得られ、Ｅｃｏ
ＲＩ制限ｐＵＣ９に連結し、全ＤＮＡを配列決定した。
【００４４】 実施例３：スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉ ｐｅｒｄａ） Ｓｆ２１におけるウサギＣＥの発現 細胞（４´ １０７）を、インテグラ（Ｉｎｔｅｇｒａ） ＣＬ１０００フラス
コ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）の
下部チェンバーに入れ、インセクトエスプレス（Ｉｎｓｅｃｔ Ｘｐｒｅｓｓ）
媒体（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）４５ｍｌ
中においた。前記細胞の適切な増殖を確保するため、フラスコの上部チェンバー
に完全グレース（Ｇｒａｃｅ）媒地を添加した。２７° Ｃで２日間インキュベ ート後、バキュロウイルスを下部チェンバーの細胞に添加し、感染回数２０回と
した。下部チェンバー中の媒地は、２４時間ごとにカルボキシルエステラーゼ（
ＣＥ）活性をアッセイし、通常、１２０時間後に採取した。分泌されたＣＥは、
限外ろ過によって濃縮し試料約１ｍｌを得たが、これは、酵素活性約３０，００
０マイクロモル／ｍｌを含んでいた。
【００４５】 実施例４：ウサギＣＥのインビトロ生物活性 ウサギ肝ＣＥのインビトロ活性を腫瘍細胞系統で調べた。ＣＰＴ−１１の増殖
阻害は、活性ウサギＣＥを有する細胞と有していない細胞中で比較した。使用し
た細胞は、リン酸緩衝生理食塩水容量２００マイクロリットル中で２０マイクロ
グラムのＩＲＥＳプラスミドＤＮＡまたはＣＥ ｃＤＮＡを含むプラスミドでエ レクトロポレーションしておいたＲｈ３０細胞（１０７）であった。エレクトロ
ポレーションの最適条件は、１８０Ｖおよび９６０マイクロＦを用いて達成され
た。細胞を７５ｃｍ２のフラスコ中の新鮮媒地中に入れ、トランスフェクション
４８時間後に５００マイクログラムのＧ４１８／ｍｌを添加し、ｎｅｏ遺伝子お
よびＣＥを発現する細胞を選択した。細胞は最低でも１０日間増殖させ、増殖阻
害実験に使用した。
【００４６】 最初のアッセイでは、ＣＰＴ−１１をウサギ肝ＣＥでプレインキュベートし、
細胞を薬物に暴露する前にＳＮ−３８を産生させた。具体的には、ＣＥ０．５か
ら５単位を１マイクロモルのＣＰＴ−１１とＤＭＥＭ媒地中で３７° Ｃで２日 間インキュベートした。各反応混合物をその後ろ過滅菌し、Ｒｈ３０細胞を薬物
に１時間暴露させた。その間、媒地は、薬物非含有血清含有媒地と交換した。全
く酵素を添加しない薬物またはＣＰＴ−１１とインキュベートする前に沸騰を５
分間行い不活化した酵素を、陰性対照として用いた。細胞を３細胞倍加時間にわ
たり増殖させ、細胞数を求めた。 第２の増殖阻害アッセイでは、ｐＩＲＥＳ親プラスミドＤＮＡまたはウサギＣ
Ｅ ｃＤＮＡを含むプラスミドによってトランスフェクションしたＲｈ３０細胞 を異なる濃度のＣＰＴ−１１に暴露した。２時間にわたり安定にトランスフェク
ションされた細胞系統のそれぞれの組織培養媒地に薬物を添加し、その後、前記
媒地を薬物非含有媒地に交換した。その後、細胞を前と同じく３細胞倍加時間だ
け増殖させた。結果は、対照細胞の５０％に細胞増殖を低下させるために要する
薬物濃度、すなわちＩＣ５０値として示した。
【００４７】 ｏ−ニトロフェニル酢酸のｏ−ニトロフェノールへの転換によって求めたとこ
ろ、結果は、トランスフェクション細胞の抽出物が対照の６０倍を超える活性を
有していることを示した。さらに、ウサギＣＥによってトランスフェクションさ
れたＲｈ３０ｐＩＲＥＳ細胞は、ＩＣ５０値の低下によって示されるように、対
照よりもＣＰＴ−１１に８倍を超えてより感受性であった。したがって、ウサギ
ＣＥに安定的にトランスフェクションされたＲｈ３０細胞は、ウサギＣＥのｃＤ
ＮＡを含まない細胞よりもＣＰＴによる増殖阻害により感受性であった。
【００４８】 実施例５：ウサギＣＥは新規プロドラッグＡＰＣを活性化する ＣＰＴ−１１を効率的に活性化合物ＳＮ−３８に変換することに加えて、不活
性最終代謝生成物ＡＰＣをＳＮ−３８に変換するウサギ肝ＣＥの能力を明らかに
する実験を同様に行った。第６図は、インビトロ反応においてウサギ肝ＣＥ５０
単位によるＡＰＣのＳＮ−３８への変換動態を示している。第７図は、ウサギ肝
ＣＥは発現するがこのウサギ酵素と８５％相同であるヒト肺胞マクロファージカ
ルボキシルエステラーゼは発現しないＵ−３７３グリオーマ細胞がＡＰＣの増殖
阻害効果に感受性であることを示している。したがって、上記に述べたようにＡ
ＰＣとウサギ肝ＣＥによる選択された腫瘍細胞の感作の組合わせを用いることに
よって、化学療法剤投与と関連する毒性副作用を最小としつつ腫瘍特異的細胞死
をもたらすことができる。
【００４９】 実施例６：ＭＲＤのためのインビボモデルにおけるウサギＣＥの使用 ＭＲＤのための異種移植片モデルを開発し、ＭＲＤ防止におけるウサギＣＥと
プロドラッグ併用の有効性を明らかにした。このモデルにおいては、ヒトＮＢ−
１６９１異種移植片を有する免疫不良マウスすなわちＳＣＩＤマウスに対してＣ
ＰＴ−１１を１日１０ｍｇ／ｋｇで５日間、２週連続処置し、腫瘍の完全退縮を
見た。しかし、４−６週以内に腫瘍が当初異種移植片を埋め込んだ場所と全く同
じ場所で触知できる。これらの腫瘍類は最初の化学療法サイクルに耐え生き延び
た細胞から生じているので、したがって、このモデルは原発腫瘍の外科的摘出後
に患者に観察される結果とその後の同一部位における再増殖を模倣している。
【００５０】 ヒトＲｎ３０とＲｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ異種移植片を有するマウスの
応答を比較するため、このモデルで実験を実施した。Ｒｈ３０横紋筋肉腫異種移
植片は、ウサギ肝ＣＥｃＤＮＡを有するＲｈ３０ｐＩＲＥＳｎｅｏプラスミドで
トランスフェクションし、Ｇ４１８で選択した。ＣＥ発現は、ＣＥ基質ｏ−ＮＰ
Ａを用いて生化学アッセイによって確認し、少なくとも１２週間維持した。２つ
の群のＳＣＩＤマウスに対して、その後、形質移入Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂ ｉｔ 細胞を側面に皮下注入した。第３群の対照マウスには、前記プラスミドを移
入していないＲｈ３０細胞を同様に注入した。腫瘍が約１ｃｍ３の大きさに達し
た時、２．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＰＴ−１１を移入Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳｒａ ｂｂｉｔ 細胞を注入されたマウス群と第３群の対照マウスに対して、各週５日２
週間（１治療サイクル）にわたり投与し、２１日おきに計３サイクル（８週にわ
たり）繰り返した。 ウサギＣＥ発現腫瘍類は１２週におよぶ本研究の間完全に退縮し再増殖しなか
った（第９Ｂ図）。対照的に、ＣＥ非発現腫瘍類は一過性には退縮したが、ＣＰ
Ｔ−１１処置を停止後１週以内に再増殖した（第９Ｃ図）。 ｐＩＲＥＳｎｅｏプラスミドまたはウサギ肝ＣＥのｃＤＮＡ含有ｐＩＲＥＳｎ
ｅｏを移入しＧ４１８で選択されたＵ３７３神経膠芽腫細胞を用いて、同様の研
究を行った。腫瘍細胞中におけるＣＥの発現は、基質ｏ−ＮＰＡを用いて生化学
アッセイによって確認した。細胞を、ＳＣＩＤマウスの側面に皮下注射した。腫
瘍が大きさ約１ｃｍ３に達したとき、ＣＰＴ−１１を７．５ｍｇ／ｋｇ／日で上
記のように各週毎日５日間、３サイクル投与した。 ウサギＣＥを発現したＵ３７３細胞は、また、ＣＰＴ−１１により感受性であ
った。ウサギＣＥコードプラスミドを移入した細胞から樹立した異種移植片は完
全に退縮する一方、対照プラスミドを移入した細胞由来の異種移植片は、有意な
退縮を全くみせず安定な疾病を示した。２種の異なるヒト腫瘍細胞種類における
これらのデータから、ＣＰＴ−１１に対して腫瘍細胞を感作させるウサギＣＥの
インビボ効率が明らかとなる。
【００５１】 腫瘍が存在していない４−６週時において本モデルに異種移植片を埋め込みそ
の後低用量のＣＰＴ−１１で処置した前記モデルのインプラント部位に皮下投与
した腫瘍特異的プロモータの制御下にウサギＣＥを発現するアデノウイルスは、
また、ＭＲＤ防止において前記ウイルスの有効性を実証する。典型的には、腫瘍
退縮は、ＣＰＴ−１１治療開始後３週で完了するので、アデノウイルス／薬物投
与は第４週に開始する。最初の実験では、アデノウイルスは、月曜日、水曜日、
金曜日に投与し、ＣＰＴ−１１は、２サイクルにわたり火曜日から土曜日までず
っと毎日投与する。これによって、最も寛容かつ有効なアデノウイルスおよびＣ
ＰＴ−１１投与計画および用量が決定でき、疾病再発が最も長く遅延するように
なる。これらの結果を用いて、ヒトＭＲＤ治療の適切な用量が決定される。動物
実験の開始時点は、本発明のウサギＣＥを含有するアデノウイルスの１０５から
１０８ｐｆｕの注入となる。
【００５２】 実施例７：骨髄の腫瘍細胞浄化におけるウサギＣＥ／プロドラッグの用途 免疫不良マウスへのヒト神経膠芽腫ＮＢ−１６９１腫瘍細胞の静注の結果、広
範囲の転移疾病が発生し、死亡が第３６−３８日に起こる。シナプトファイシン
およびチロシンハイドロキシラーゼの両者の発現は神経膠芽腫細胞に特異的であ
るので、これらのｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＴ解析で混合細胞集団に存在する腫瘍細
胞を検出できる。循環している神経膠芽腫細胞は、ＮＢ−１６９１注入後３６日
にこれらの動物の末梢血中で検出できる。その後、これら同一動物の骨髄が神経
膠芽腫細胞を含むかどうかを、調べて決定するであろう。ウサギ肝ＣＥ／ＣＰＴ
−１１併用による骨髄のエクスビボ浄化の成功は、浄化された骨髄を致死的照射
マウスに移植することで実証される。もしマウスが長期にわたり無病であれば、
このことは、このアデノウイルスＣＥ／プロドラッグ浄化療法がドナー骨髄の神
経膠芽腫細胞を殺細胞することを示唆する。
【００５３】 実施例８：ヒトにおける最小残留疾病（ＭＲＤ）の治療 本酵素によって活性化したＣＰＴ−１１または他のプロドラッグ併用ウサギＣ
Ｅを用いて、自家骨髄移植前に残留腫瘍細胞を骨髄から除去し、外科手術または
化学療法によって肥大化した腫瘍を除去した後の局所ＭＲＤ再発を防止する。原
発腫瘍の摘出後（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）、腫瘍応答性プロモータの制御下にウサ
ギ肝ＣＥを含むアデノウイルスを、外科手術時点、または定位注入によってまた
は徐放性高分子または他の物質の埋め込みによってのいずれかで腫瘍辺縁に適用
する。外科手術時における単回適用の抗腫瘍効果を、アデノウイルス構築体類の
繰り返しまたは徐放性使用によってもたらされる効果と比較する。アデノウイル
スの腫瘍内注入で有効であると報告されているのと同様、アデノウイルス用量は
、１０６から１０１０プラーク形成単位の範囲である（Ｈｅｉｓｅ、Ｃ．ら、１
９７７。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：６３９−６４５）。ＣＰＴ−１１は、明く る１週間から４週間にわたり投与し、腫瘍選択的細胞死を惹起する。ＣＰＴ−１
１の用量および投与計画は、ＣＰＴ−１１それ自体の臨床治験およびヒト移植片
モデル系において最大腫瘍効果をもたらすように決定される。
【００５４】 実施例９：ヒトにおける腫瘍細胞の骨髄からの浄化 自家移植に使用した骨髄に夾雑する腫瘍細胞類は、腫瘍再燃に寄与する。した
がって、適切なプロドラッグとウサギ肝ＣＥを併用し、移植に用いる骨髄試料中
の腫瘍細胞を根絶する。この手法では、再構成に必要な造血細胞の生存を維持す
る。骨髄試料は、腫瘍細胞の１００％に感染するであろう感染回数（ｍｏｉ）を
用いてウサギ肝ＣＥ ｃＤＮＡを含むアデノウイルスをエクスビボで形質導入す る。典型的には、０．５から１０の感染回数が腫瘍細胞には適しており、一方、
主要な造血始原細胞類を形質導入するためには１００から１，０００の感染回数
が必要である。アデノウイルス形質導入２日後において、通常は５０ｎＭから１
００マイクロモルの範囲であるＣＰＴ−１１濃度に細胞を２時間暴露させる。薬
物暴露２日後に、骨髄試料を採取し患者への再注入および無腫瘍骨髄の再構築の
ために保存する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ウサギ肝カルボキシルエステラーゼ（ＣＥ）酵素（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の
Ｎ末端アミノ酸配列と、ウサギ（Ｐ１２３３７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ヒト
（Ｐ２３１４１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ラット（Ｐ１０９５９；ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：４）およびマウス（Ｐ２３９５３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含む他 の公知のＣＥ類 との相同性を示したものである。垂直線は、配列決定ＣＥとス イスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）データベース中のウサギ蛋白質との相同性
を示している。ウサギ配列中の下線を付した残基類は、あらゆるＣＥ蛋白質類中
で保存されるアミノ酸類を示している。
【図２】 縮退ＰＣＲ用に使用したオリゴヌクレオチド類の設計を示している。ウサギＣ
Ｅの残基１から５までのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）およびそのコー
ド配列を、対応するオリゴヌクレオチドＲａｂ５１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）お
よびＲａｂ５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）とともに示している。また、ウサギＣ
Ｅの残基５１８から５２４までのアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、コ
ード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）および逆相補体（リバースコンプレメント
ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）を、オリ ゴヌクレオチドＲａｂ３１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）およびＲａｂ３２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１４）とともに示している。
【図３】 ウサギ肝ＣＥ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）およびラット（Ｐ１０９５９；ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１６）、ヒト（Ｐ２３１４１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）、ラッ
ト（Ｐ１６３０３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）およびマウス（Ｐ２３９５３；Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を含む他の公知のＣＥ類のＮ末端シグナル配列の並びか
たを示している。全ＣＥ類に共通する残基類には下線を付し、１８残基リーダー
配列はイタリック体で示してある。スイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）寄託
番号は、括弧内に示してある。
【図４】 ウサギ肝ＣＥの完全なコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）およびそれによ
ってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を示している。１６
９８ｂｐのＯＲＦは、６２．３ｋＤａの蛋白質をコードする。そのＮ末端疎水性
リーダー配列はイタリック体としてあり、５¢ および３¢ ＲＡＣＥ配列には下
線を付し、その潜在的活性部位セリンは、星印で示してある。アミノ酸２０８−
２２３および１１４−１２４のカルボキシルエステラーゼＢ−１およびＢ−２モ
チーフ類には、二重下線を付してある。
【図５】 Ｘ軸上に示した種々の濃度のＣＰＴ−１１における％細胞生存率を比較してＹ
軸上に示した線グラフである。対照Ｃｏｓ７細胞（黒四角）は、ＣＥ移入Ｃｏｓ
７細胞（黒三角）に比べて、ＣＰＴ−１１に対しておよそ３５０倍感受性である
。
【図６】 用量単位０（黒十字）、１０（黒六角形）、２５（黒三角）、５０（黒丸）ま
たは１００（黒四角）のウサギ肝ＣＥの活性によって、Ｘ軸上にナノモル濃度で
示したＡＰＣのＹ軸上にナノモル濃度で示したＳＮ−３８へのインビトロでの転
換を示した線グラフである。示したデータは、各用量レベルにおける平均応答を
示している。
【図７】 ＡＰＣ暴露Ｕ−３７３グリオーマ細胞の感作をＹ軸上の％生存率として、Ｘ軸
上の１０−８から１０−５Ｍの濃度のｌｏｇ[ＡＰＣ]に対して示し、ウサギ肝Ｃ
Ｅ（黒四角）およびヒト肺胞マクロファージＣＥ（黒丸）のインサイチュ発現と
比較して示した線グラフである。細胞は、ＡＰＣに２時間暴露させた。
【図８】 ＣＰＴ−１１、ＡＰＣおよびＳＮ−３８の化学構造を示している。
【図９Ａ】 ＣＰＴ−１１処置に対するＲｈ３０およびＲｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ横
紋筋肉腫異種移植片を有するマウスの応答を示した線グラフである。各グラフ上
の各線は、各腫瘍の増殖を示している。腫瘍増殖速度は、腫瘍容積として各グラ
フのＹ軸に示し、週単位時間の関数として（Ｘ軸）にプロットした。第９Ａ図は
、ＣＰＴ−１１非処置細胞のウサギＣＥ（Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ）発
現を示している。
【図９Ｂ】 ＣＰＴ−１１処置に対するＲｈ３０およびＲｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ横
紋筋肉腫異種移植片を有するマウスの応答を示した線グラフである。各グラフ上
の各線は、各腫瘍の増殖を示している。腫瘍増殖速度は、腫瘍容積として各グラ
フのＹ軸に示し、週単位時間の関数として（Ｘ軸）にプロットした。第９Ｂ図は
、ウサギＣＥ（Ｒｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ）を発現するがその後ＣＰＴ−
１１で処置した細胞を示し、完全な腫瘍退縮を示し、１２週までには消失したこ
とを示している。
【図９Ｃ】 ＣＰＴ−１１処置に対するＲｈ３０およびＲｈ３０ｐＩＲＥＳｒａｂｂｉｔ横
紋筋肉腫異種移植片を有するマウスの応答を示した線グラフである。各グラフ上
の各線は、各腫瘍の増殖を示している。腫瘍増殖速度は、腫瘍容積として各グラ
フのＹ軸に示し、週単位時間の関数として（Ｘ軸）にプロットした。第９Ｃ図は
、ＣＰＴ−１１暴露対照細胞（Ｒｈ３０）を示し、当初は退縮したが再増殖を示
している。
【図１０】 ウサギＣＥ発現Ｕ３７３神経膠芽腫異種移植片に対するＣＰＴ−１１処置の効
果を示した線グラフである。異種移植片を有するマウスをＣＰＴ−１１（７．５
ｍｇ／ｋｇで５日間）で治療サイクルを３回行った。腫瘍増殖速度は、腫瘍容積
としてＹ軸上に示し、週単位時間（Ｘ軸）の関数としてプロットしてある。白丸
は、ウサギＣＥ発現非処置Ｕ３７３異種移植片の腫瘍容積を示している。黒三角
は、ＣＰＴ−１１処置対照異種移植片（ウサギＣＥなし）の応答を示している。
黒四角は、ウサギＣＥ発現細胞をＣＰＴ−１１で処置した場合の応答を示してい
る。前記データは、腫瘍退縮がウサギＣＥ発現処置細胞でのみ見られたことを示
している。各点は、各マウス７匹における１４個の腫瘍の平均を示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年８月２１日（２０００．８．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 ４Ｃ０８５ 1/19 1/21 ４Ｃ０８６ 1/21 9/18 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/44 9/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/44 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ホックトン，ペーター ジェイ． アメリカ合衆国 テネシー州38103、メン フィス、ハーバー ヴィレッジ ドライブ 122 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 BB20 CB01 CB02 DA12 DA13 DA14 DA20 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA11 CA01 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 KK03 KK18 LL01 4B063 QA18 QQ61 QR12 QS36 QX02 4B065 AA90X AA90Y AC14 CA02 CA25 CA28 CA44 4C084 AA13 AA20 MA02 NA05 NA13 NA15 ZB261 ZB262 4C085 AA21 CC01 EE03 4C086 AA01 AA02 CB05 MA01 MA02 MA04 NA05 NA15 ZB26 ZC02

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 化学療法プロドラッグおよびその不活性代謝物を活性薬物に
    代謝することができるカルボキシルエステラーゼをコードする単離ポリヌクレオ
    チド。
  2. 【請求項２】 図４のｃＤＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）からなる請求項
    １記載の単離ポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 図４のアミノ酸１−５４３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）から
    なるカルボキシルエステラーゼをコードするｃＤＮＡからなる請求項１記載の単
    離ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項１記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単
    離ポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項１記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリ
    ぺプチド。
  8. 【請求項８】 請求項１記載のポリヌクレオチドおよび疾病特異的応答性プ
    ロモータを含む組成物。
  9. 【請求項９】 疾病特異的応答性プロモータがｍｙｃプロモータである請求
    項８記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 ｍｙｃプロモータがＯＤＣである請求項９記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 選択された腫瘍細胞に請求項８記載の組成物をトランスフ
    ェクトさせることを含む、化学療法プロドラッグに対する腫瘍細胞の感作方法。
  12. 【請求項１２】 （ａ）請求項１１記載の方法によって腫瘍細胞を感作する
    こと、および （ｂ）前記感作腫瘍細胞を化学療法プロドラッグに接触させ、腫瘍細胞増殖を
    阻害させること、 を含む腫瘍細胞増殖阻害方法。
  13. 【請求項１３】 化学療法プロドラッグがＣＰＴ−１１およびＡＰＣからな
    る群から選択される請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 （ａ）腫瘍を患者から外科的に除去すること、 （ｂ）腫瘍摘出部位に請求項８記載の組成物を投与すること、および （ｃ）化学療法プロドラッグを全身投与し、腫瘍再発を阻害すること、 を含む患者における腫瘍再発を阻害する方法。
  15. 【請求項１５】 化学療法プロドラッグがＣＰＴ−１１およびＡＰＣからな
    る群から選択される請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 （ａ）骨髄細胞を患者から除去すること、および （ｂ）前記骨髄細胞を請求項８記載の組成物および化学療法プロドラッグに接
    触させること、 を含む腫瘍細胞類の骨髄浄化方法。
  17. 【請求項１７】 患者に対して請求項８記載の組成物およびＡＰＣを投与す
    ることを含む患者における腫瘍増殖を阻害する方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）培養細胞を請求項１記載のポリヌクレオチドでトラ
    ンスフェクトすること、 （ｂ）前記細胞類を候補薬物と接触させること、および （ｃ）前記候補薬物の存在下における前記細胞の増殖または生存を定量するこ
    と、 を含むカルボキシルエステラーゼ酵素によって活性化される薬物の同定のための
    薬物スクリーニングアッセイ。
  19. 【請求項１９】 （ａ）ＣＯＯＣエステル結合を含有する公知濃度の試験化
    合物を生物学的緩衝液および請求項７記載のポリぺプチドを含有するアッセイ試
    験管に添加すること、 （ｂ）前記アッセイ試験管をインキュベートすること、および （ｃ）前記試験化合物の前記ＣＯＯＣエステル結合部における切断断片であっ
    て、前記切断断片の存在が前記カルボキシルエステラーゼ酵素による前記化合物
    の活性を示す、前記の切断片について前記アッセイ試験管の内容物を解析するこ
    と、 を含むカルボキシルエステラーゼ酵素によって活性化されるＣＯＯＣエステル結
    合含有化合物の同定のための薬物スクリーニングアッセイ。
  20. 【請求項２０】 （ａ）選択された腫瘍細胞上のマーカーに特異的な抗体を
    選択すること、 （ｂ）前記腫瘍特異的マーカーに対する抗体を前記カルボキシルエステラーゼ
    に結合させ、複合体を形成させること、および （ｃ）前記複合体を投与し、前記カルボキシルエステラーゼ類を前記選択され
    た腫瘍細胞類に運搬させること、 を含む前記選択された腫瘍細胞へのカルボキシルエステラーゼ類の運搬方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０記載の方法に従って患者中の選択された腫瘍細胞
    にカルボキシルエステラーゼ類を運搬することを含む、患者における選択された
    腫瘍細胞類の増殖阻害方法。
  22. 【請求項２２】 さらに、カルボキシルエステラーゼ類によって活性薬物に代
    謝される化学療法プロドラッグおよびその不活性代謝物を患者に投与することを
    含む請求項２１記載の方法。
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