JP2002503109A - 新規なヒトリボヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトリボヌクレアーゼ（ＨＵＲＩＢＯ）及びＨＵＲＩＢＯを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＨＵＲＩＢＯの発現に関係する疾病の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なヒトリボヌクレアーゼ技術分野 本発明は、新規なヒトリボヌクレアーゼの核酸及びアミノ酸配列、及び細胞増 殖及びアポトーシスに関連する疾病及び炎症の診断、予防、及び治療におけるこ れらの配列の使用に関するものである。背景技術 リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ鎖のホスホジエステル結合の加水分解を触媒する タンパク質である。このリボヌクレアーゼ群は類似した一次構造及び触媒作用機 構を有している。加水分解されるＲＮＡの結合は、リン酸と5'末端酸素原子の間 の結合であり、この加水分解によって、フリーの5'-OH基とフリーの3'リン酸基 が新たな末端となる。加水分解は、ＲＮＡ配列に独特である必須の2',3'-環状リ ン酸塩中間体を介して進行する。リボヌクレアーゼはＤＮＡ配列に対する親和性 も有しているが、ＤＮＡは2',3'-環状リン酸中間体の形成に重要な2'-ヒドロキ シル基を欠いているため加水分解は起こらない。リボヌクレアーゼ群では４箇所 のジスルフィド結合、２個のヒスチジン残基、及び１個のリジン残基が高度に保 存されており、これらは触媒作用において重要なものである。 リボヌクレアーゼは、ＲＮＡの加水分解におけるその機能に加えて様々な他の 生理学的活性を補助するべく進化してきた。このような活性には、抗寄生虫活性 、抗菌活性、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性、神経毒性、及び血管形成が含まれる 。例えば、ウシ精液リボヌクレアーゼは、抗腫瘍性である（Laccetti,P.等(1992 )Cancer Res.52:4582-4586）。いくつかの種類のカエルリボヌクレアーゼは、抗 ウイルス活性と抗腫瘍活性の双方を示す（Youle,R.J.等(1994)Proc.Natl.Acad.S ci.USA 91:6012-6016;Mikulski,S.M.等(1990)J.Natl.Cancer Inst.82:151- 152;and Wu,Y._N.等(1993)J.Biol.Chem.268:10686-10693）。アンジオゲニンは 、エンドサイトーシスのために内皮細胞の表面上のアクチンに結合するｔＲＮＡ 特異的リボヌクレアーゼである。エンドサイトーシスで取り込まれたアンジオゲ ニンは核に転位置し、そこでアンジオゲニンは血管形成に必要な内皮侵入性を促 進する（Moroianu,J.and Riordan,J.F.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:1677- 81）。好酸球由来神経毒素（ＥＤＮ）及び好酸球陽イオンタンパク質（ＥＣＰ） は、ともに神経毒性を有する近縁なリボヌクレアーゼである(Beintema,J.J.等(1 988)Biochemistry 27:4530-4538;Ackerman,S.J.(1993)In Makino,S.及びFukuda, T.,Eosinophils：Biological and Clinical Aspects,CRC Press,Boca Raton,FL, pp33-74)。更に、ＥＣＰは細胞毒性、抗寄生虫活性、及び抗菌活性を示す。ＲＮ アーゼｋ６と称するＥＤＮに近縁なリボヌクレアーゼは、正常なヒト単球及び好 中球における発現が認められており、このことはこのリボヌクレアーゼがホスト の防御において一定の役割を果たすことを示唆している（Rosenberg,H.F.及びDy er,K.D.(1996)Nuc.Acid.Res.24:3507-3513）。 新規なヒトリボヌクレアーゼ及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見は 、細胞増殖及びアポトーシスに関連する疾病及び炎症の診断、予防、及び治療に おいて役立つ新たな物質を提供することにより、当分野における必要性を満たす ものである。発明の開示 本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列又はその断片を有する実質的に精 製されたポリペプチド、ヒトリボヌクレアーゼ（ＨＵＲＩＢＯ）を提供する。 更に本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列有するポリペプチドまたはその断 片をコードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチド 配列を提供する。具体的な態様では、このポリヌクレオチドは、配列番号：２の ヌクレオチド配列又はその変異配列である。 更に本発明は、配列番号：２のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイ ブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明は、Ｈ ＵＲＩＢＯをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド配列を含む組成物 を提供する。 更に本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列コードするポリヌクレオチド配列 の相補配列又はその断片若しくはその変異配列を含むポリヌクレオチド配列を提 供する。具体的な態様では、このポリヌクレオチド配列は、配列番号：２の相補 配列である。別の態様では、本発明は、配列番号：２の相補配列又はその断片若 しくはその変異配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド配列を含む組成 物を提供する。 更に本発明は、請求の範囲に記載のポリヌクレオチド配列の何れかの少なくと も断片を含む発現ベクターを提供する。更に別の態様では、該ポリヌクレオチド 配列を含む発現ベクターが宿主細胞に含められる。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチド の製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下でＨＵＲ ＩＢＯをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクター を含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプ チドを回収する過程とを含むことを特徴とする配列番号：１のアミノ酸配列又は その断片を含むポリペプチドの製造方法を提供する。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＨＵ ＲＩＢＯを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物を提供する。 また本発明は、配列番号：１のポリペプチドの活性を低下させる精製 されたアンタゴニストを提供する。或る態様では、本発明は、配列番号：１のア ミノ酸配列の少なくとも断片を含むポリペプチドに結合する精製された抗体を提 供する。 更に本発明は、配列番号：１のポリペプチドの活性を変調する精製されたアゴ ニストを提供する。 また本発明は、ＨＵＲＩＢＯの投与による過剰な細胞増殖に関連する疾病又は 炎症の治療又は予防方法、及びＨＵＲＩＢＯのアンタゴニストの投与による、ア ポトーシスに関連する疾患の治療又は予防方法又は細胞増殖を刺激する方法を提 供する。 また本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌク レオチドの検出方法であって、（ａ）ＨＵＲＩＢＯ（配列番号：１）に相補的な ポリヌクレオチド配列と生物学的サンプルの核酸材料とをハイブリダイズさせ、 ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼー ション複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が、前記生物学的サン プルにおけるＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有す る、該過程とを含むことを特徴とする生物学的サンプルにおけるＨＵＲＩＢＯを コードするポリヌクレオチドの検出方法を提供する。好ましい実施例では、ハイ ブリダイゼーションの前に、前記生物学的サンプルの核酸材料をＰＣＲ法により 増幅する。図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、ＨＵＲＩＢＯのアミノ酸配列（配列番 号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す。配列アライメントは、MacDNASI S PRO^TMソフトウェア（Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,San Bruno，CA ）を用いて作成した。 第２図は、ＨＵＲＩＢＯ（配列番号：１）とＲＮアーゼｋ６（GI 1513102；配列番号：３）との間のアミノ酸配列アライメントを示す。この配列 アライメントは、DNASTAR^TMソフトウェア（DNASTAR Inc，Madison WI）のマルチ シーケンスアライメントプログラムを用いて作成した。 第３Ａ図及び第３Ｂ図は、それぞれＨＵＲＩＢＯ（配列番号：１）及びＲＮア ーゼｋ６（配列番号：３）の疎水性プロットを示す。Ｘ軸は正の方向にアミノ酸 の位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す（MacDNASIS PRO^TMソフ トウェアで作成）。発明の実施の形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、 ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定 されず、その実施形態を変えて実施できることを理解されたい。また、ここで用 いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、 請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図したもの ではないということも理解されたい。 本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「或る」及び「その」と形容さ れたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味 も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「宿主細胞」なる 表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、「抗体」なる表記は 、１またはそれ以上の抗体及び当業者に周知のその等価物等も表している。 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない場合に は、本発明の属する技術分野の専門家に一般に理解されるのと同じ意味を有する 。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発明の実施や試験に おいて用いることができるが、好適な方法、 装置、及び材料はここに説明されている。本明細書に記載された全ての文献は、 本発明の関連において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方 法論を説明し開示する目的で引用されたものであり、この引用により本明細書め 一部とする。この引用の記載は、本発明には許容されない、従来発明によって先 行開示されたそのような開示内容に先行することを本発明に許容するためのもの と解釈してはならない。 定義 本明細書において、ＨＵＲＩＢＯは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マ ウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳動物から得られる天然の、合成の、 半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＨＵＲＩＢＯのアミノ 酸配列である。 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＨＵＲＩＢＯに結合したとき、Ｈ ＵＲＩＢＯの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。ア ゴニストには、ＨＵＲＩＢＯに結合し、その効果を変調するタンパク質、核酸、 糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。 本明細書において「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＨＵＲＩＢＯの対立 形である。アレルは変異、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変異し たｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチド の構造或いは機能は、変わる場合もあれば変わらない場合もある。遺伝子によっ ては、アレル形が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するもの がある。一般にアレルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に 起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、所定 の配列内で１又は２回以上生じ得る。 本明細書において、ＨＵＲＩＢＯをコードする「変異」核酸配列とは、 異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、また は機能的に等価なＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドとなるものである 。この定義には、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色 体上の遺伝子座以外の位置における、アレルとの不適切又は予期されないハイブ リダイゼーション、及びＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドの特定のオ リゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出が困難な多形 性が含まれている。コードされたタンパク質も同様に「変異」したものであり、 サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に 機能的に等価なＨＵＲＩＢＯとなるものであり得る。意図的な（deliberate）ア ミノ酸置換は、ＨＵＲＩＢＯの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の 極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基 づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタ ミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近 い親水性値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イ ソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン 、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。 本明細書において「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプ チド、又はタンパク質の配列及びその断片であり、自然発生又は合成の分子であ る。ＨＵＲＩＢＯの断片は、好ましくは約５〜約１５のアミノ酸からなる長さを 有し、ＨＵＲＩＢＯの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである 。ここでは「アミノ酸配列」が、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指す ものとして用いられているが、「アミノ酸配列」や類似の用語は、アミノ酸配列 を、説明されるタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定 する意味 で用いられるわけではない。 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり 、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行われる（D ieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer.a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）。 本明細書において、用語「アンタゴニスト」は、ＨＵＲＩＢＯに結合したとき 、ＨＵＲＩＢＯの生物学的又は免疫学的作用の大きさを低下させたり、持続時間 を短縮させる分子である。アンタゴニストには、ＨＵＲＩＢＯの作用を低下させ るタンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。 本明細書において、用語「抗体」は、そのままの抗体分子及び、例えば抗原決 定基と結合し得るFa、F(ab')₂、及びFvのようなその断片である。ＨＵＲＩＢＯ ポリペプチドに結合する抗体は、そのままのポリペプチド、或いは免疫化する抗 原としての目的の小型のペプチドを含む断片を用いて調製することができる。動 物を免疫するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮ Ａまたは化学的合成物を起源とするものであり得、必要ならば担体タンパク質と 結合することができる。ペプチドに化学的に結合する通常用いられる担体には、 ウシ血清アルブミン及びサイログロブリンが含まれる。次にこの結合したペプチ ドを用いて動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫化する。 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の一部 分（即ちエピトープ）である。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホス トの動物を免疫すると、このタンパク質の種々の領域が、該タンパク質上の所定 の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。このよう な領域または構造を抗原決定基と称 する。抗原決定基は、抗体への結合について、元の抗原（即ち免疫応答を引き出 すために用いられる免疫原）と競合し得る。 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に 対して相補的なヌクレオチド配列である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖 に対して相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸 を含み、合成や転写を含む任意の方法で作ることができる。この相補的ヌクレオ チドは、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合し て二重鎖を形成し、この二重鎖は更なる転写や翻訳を阻害する。表記「ネガティ ブ（−）」はアンチセンス鎖の意味で時折用いられ、「ポジティブ(＋)」はセン ス鎖の意味で用いられることがある。 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能 、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質である。同様に「免疫学的に 活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＨＵＲＩＢＯ、若しくはその任意の オリゴペプチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗 体に結合する能力を指す。 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩及び温度 の条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然の結合である。例えば 、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの二本鎖分 子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合している「部分的」なものであるか、 若しくは一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相補的なものであ り得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの 効率及び強度に有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左 右される増幅反応や、ＰＮＡ分子の設計及び使用において特に重要である。 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、 広く所定のポリヌクレオチド配列を含む任意の物質をさす。この組成物は、乾燥 した製剤又は水溶液を含み得る。ＨＵＲＩＢＯ（配列番号：１）をコードするポ リヌクレオチド配列又はその断片（例えば配列番号：２又はその断片）を含む組 成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用することができる。このプ ローブは凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合 させることができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（ 例えばＮａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（例えばデンハー ト液、乾燥ミルク、サケの精子ＤＮＡ等）に展開することができる。 本明細書において「コンセンサス」は、再度シークエンシングされて不要な塩 基が分離された核酸配列か、XL-PCR^TM（Perkin Elmer,Norwalk,CT）を用いて５ ’方向及び／または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配 列か、GELVIEW^TM Fragment Assembly system（GCG,Madison WI）を用いて２以上 のインサイト社クローンの重複した配列を元に組み立てられた核酸配列か、若し くは延長と組み立ての双方によって形成された核酸配列の何れかである。 本明細書において、「ポリヌクレ才チドの発現と相関性を有する」なる表現は 、ノーザン解析ハイブリダイゼーションアッセイにより、配列番号：２に類似な リボ核酸の存在が検出されることが、サンプル内のＨＵＲＩＢＯをコードするｍ ＲＮＡの存在を表しており、従って該タンパク質をコードする遺伝子からの転写 物の発現と相関性を有しているということを表している。 本明細書において「欠失」は、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミノ 酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である。 本明細書において、用語「誘導体」は、ＨＵＲＩＢＯ或いはその相補 配列をコードする核酸、又はコードされたＨＵＲＩＢＯを化学的に修飾したもの を意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はア ミノ基への置換がある。核酸誘導体は、未修飾のＨＵＲＩＢＯの生物学的又は免 疫学的機能を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、 元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的機能を保持している、グリコシル化、 ポリエチレングリコール化、又は他の任意のプロセスで修飾されたものである。 本明細書において、用語「相同性」は、相補性の程度を意味する。部分的な相 同性と、完全な相同性（即ち同一性）の場合があり得る。部分的に相補的な配列 は、同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害 するものであり、これを機能的な用語「実質的に相同な」を用いて表す。完全に 相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低い厳密性の条 件の下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザン ブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定することができる。 実質的に相同な配列またはプローブは、低い厳密性の条件の下で標的の配列と、 完全に相同な配列またはプローブとの結合（即ちハイブリッド形成）について競 合し、それを阻害する。これは、低い厳密性の条件が、非特異的な結合を許容す るようなものであるということを意味するのではない。低い厳密性の条件では、 ２つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要であ る。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未 満の同一性）を有していない第２の標的配列を用いることにより試験できる。非 特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダ イズしない。 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は１０Ｋ〜１０ＭのサイズのＤＮＡ配列を含み得、 安定した分裂染色体分離及び維持に必要な全ての要素を含む直 鎖状の小染色体である（Harrington,J.J.等(1997)Nat Genet.15:345-355）。 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつ つ、非抗体結合領域においてアミノ酸を置換してヒトの抗体により近づけた抗体 分子である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は 、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩 基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、 ２つの核酸配列で形成された複合体である。これらの水素結合は、塩基スタッキ ング相互作用（base stacking interaction）により更に安定化し得る。この２ つの相補的核酸配列は水素結合して、逆平行構造をなす。ハイブリダイゼーショ ン複合体は、溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析）、或いは核酸 は溶液中に存在する一方の核酸と、固定支持体（例えばin situハイブリダイゼ ーションのために細胞が固定される紙、メンブラン、フィルタ、ピン、またはス ライドガラス）に固定化された他方の核酸との間で形成され得る。 本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較して、１ または２以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような、ヌクレオ チド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 「マイクロアレイ」とは、基板上に、合成された個々のポリヌクレオチド又は オリゴヌクレオチドを配列したものである。基板には例えば紙、ナイロン又は他 のタイプのメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な 固形支持体が用いられる。 本明細書において、用語「変調」は、ＨＵＲＩＢＯの活性の変化である。例え ば、変調によって、タンパク質活性の上昇や低下、結合特性の 変化、又はＨＵＲＩＢＯの生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化がもたら される。 本明細書において「核酸配列」は、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチセ ンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌクレオチ ド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分である。「 断片（フラグメント）」は、長さが６０ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最 も好ましくは、長さが１００ヌクレオチド以上又は１０００ヌクレオチド以上、 及び１００００ヌクレオチド以上の断片を含む。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリダイゼ ーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であ って、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適には１５ 〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを指す。 本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当分野において一般に定義されてい る用語「アンブリマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」 と実質的に等価である。 本明細書において「ペプチド核酸」ＰＮＡは、末端がリジンであるアミノ酸残 基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレ オチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンがこの 物質に安定性を与えている。ＰＮＡをポリエチレングリコール化して細胞におけ るＰＮＡの寿命を延ばすことができる。このような細胞では、ＰＮＡが相補的な 一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して、転写物の伸長を止める。（Nielsen, P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8:53-63）。 本明細書において、（「所定のタンパク質の一部分」と用いられるよ うな）タンパク質に関連する用語「一部分」は、そのタンパク質の断片である。 この断片のサイズは５つのアミノ酸残基から、（全アミノ酸配列−１）個のアミ ノ酸の範囲に亘る。従って、「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部分 を含む」タンパク質は、完全長ヒトＨＵＲＩＢＯとその断片を含む。 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。Ｈ ＵＲＩＢＯをコードする核酸またはその断片またはＨＵＲＩＢＯ自体を含む疑い のある生物学的サンプルは、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官、 又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または例えばサザンブロット 解析用に固体支持体に結合した）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、 組織や、組織プリントその他を含み得る。 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体 及びタンパク質またはペプチドの相互作用が、タンパク質上の特定の構造（即ち 抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味している。つま り、この抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合 する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した「Ａ 」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり結合していない、無 標識のＡ）を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合した標識Ａの量が低下す る。 本明細書において、用語「厳密な条件」又は「厳密性」は、核酸、塩、及び温 度によって定義されるようなハイブリダイゼーションの条件をさす。これらの条 件は当分野でよく知られており、同一のポリヌクレオチド配列の同定や検出のた めであるか、或いは近縁なポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであるかに よって変えることができる。低い厳密性条件か高い厳密性条件の何れかを含む名 目上の等価な条件は、例えば 配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基構成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮ Ａ、塩基構成）、環境（溶液中に存在するか或いは固定化されているか等）、塩 や他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン硫酸、及び／またはポリ エチレングリコールの有無）、及び反応の温度（プローブの融解温度（Ｔｍ）よ り５℃下からＴｍの約２０〜２５℃下までの範囲内）のような要素によってきま す。１又は２以上の因子を変更することによって、上に列挙した条件とは異なる が等価である低い厳密性または高い厳密性の何れかの条件を作り出すことができ る。 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天 然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、その構成 要素が６０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去され た核酸配列又はアミノ酸配列である。 本明細書において「置換」は、それぞれ１または２以上のヌクレオチド或いは アミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる 変化である。 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた種々の方法 を用いた天然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原 核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づいて いる。この方法は形質転換される宿主細胞によって選択され、以下のものに限定 されないが、ウイルス感染、電気穿孔法、リポフェクション、及び微粒子銃を用 いる方法が含まれ得る。このように「形質転換された」細胞は、その中で挿入さ れたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして、或いは宿主の染色体の一部と して複製が可能な安定的に形質転換された細胞を含む。またこのような細胞は、 限られた時間だけ導入されたＤＮＡの一過性の発現をする細胞も 含む。 本明細書においてＨＵＲＩＢＯの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸 が変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり 得、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合 のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変 異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例えば グリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失 か挿入、若しくはその両方も含まれる。例えばDNASTARソフトウエアのような良 く知られたコンピュータプログラムを用いて、何れのアミノ酸が生物学的或いは 免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除去できるものであるかということ 、及びそのようなアミノ酸がいくつかということを決定することができる。 発明 本発明は、新規なヒトリボヌクレアーゼ（以下「ＨＵＲＩＢＯ」と称する）の 発見、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチド及び細胞増殖及びアポトーシ スに関連する疾病及び炎症の診断、予防、及び治療のためのこれらの物質の使用 に基づくものである。 本発明のＨＵＲＩＢＯをコードする核酸は、回腸組織ｃＤＮＡライブラリー(S ININOT01)を起源とするインサイト社クローンNo.2181484においてアミノ酸配列 アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定された。コンセンサス配列 の配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列、即ちインサイト 社クローンNo.364446(PROSNOT01を起源)、2181484(SININOT01を起源）、及び171 1221（PROSNOT16を起源）から構成されたものである。 或る実施例では、本発明は、第１Ａ図〜第１Ｃ図に示す配列番号：１のアミノ 酸配列を有するポリペプチドを包含する。ＨＵＲＩＢＯは１６３個のアミノ酸か らなる長さを有する。ＨＵＲＩＢＯは、Ｃ（60番）〜Ｆ（66番）、Ｃ（46番）、 Ｃ（60番）、Ｃ（78番）、Ｃ（85番）、Ｃ（92番）、Ｃ（104番）、Ｃ（114番） 、及びＣ（129番）における８個の保存的システイン残基、Ｈ（38番）及びＨ（1 47番）の２つの保存的ヒスチジン残基、及びＫ（61番）の保存的リジン残基を含 むリボヌクレアーゼファミリーのサイン（signature）を有する。これらの保存 的残基は、ＨＵＲＩＢＯのヌクレアーゼ活性のために必須である。更にＨＵＲＩ ＢＯは、Ｎ（55番）及びＮ（100番）に２箇所のＮグリコシル化可能部位、Ｋ（2 6番）〜Ｔ（29番）を含む１箇所のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナ ーゼリン酸化可能部位、残基Ｌ（7番）〜Ｌ（21番）を含む１個のロイシンジッ パーモチーフ、及びＳ（95番）〜Ｋ（97番）、Ｓ（108番）〜Ｋ（110番）、及び Ｓ（108番）〜Ｒ（154番）を含む３箇所のプロテインキナーゼＣリン酸部位を有 する。第２図に示すように、ＨＵＲＩＢＯは、ＲＮアーゼｋ６（GI 1513102；配 列番号：３）と化学的及び構造的相同性を有する。詳述すると、ＨＵＲＩＢＯと ＲＮアーゼｋ６は９８％の配列同一性を共有している。第３Ａ図及び第３Ｂ図に 示すように、ＨＵＲＩＢＯとＲＮアーゼｋ６はかなり類似した疎水性プロットを 示す。ノーザン解析の結果から、様々なライブラリーにおけるこの配列の発現が 分かる。この配列を発現するライブラリーの５５％以上は不死化細胞又は癌性の ものであり、その少なくとも３５％は免疫応答に関連するものであり、その少な くとも１５％は乳仔／胎仔の組織及び器官に関連するものである。 また本発明はＨＵＲＩＢＯ変異体を包含する。好適なＨＵＲＩＢＯ変異体は、 ＨＵＲＩＢＯアミノ酸配列（配列番号：１）と８０％以上、よ り好適には９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するものである。最も好適なＨ ＵＲＩＢＯ変異体は、配列番号：１の配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を 有するものである。 また本発明は、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドを包含する。従っ て、ＨＵＲＩＢＯのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＨＵＲ ＩＢＯを発現する組み換え分子を作り出すことができる。具体的な実施例では、 本発明は、第１Ａ図〜第１Ｃ図に示す配列番号：２の核酸配列を有するポリヌク レオチドを包含する。 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生 遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多 種のＨＵＲＩＢＯコーディングヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発 明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作り出され得 る、全ての可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせ は、自然発生のＨＵＲＩＢＯのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なト リプレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異 は、ここに具体的に示されたものと考えられたい。 ＨＵＲＩＢＯ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択さ れた厳密性の条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可 能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドンの使用頻度を有するＨＵ ＲＩＢＯ又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益で あり得る。コドン選択では、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従っ て、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高 めるように選択することができる。ＨＵＲＩＢＯ及びその誘導体をコードするヌ クレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に変更す る理由は、例えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような 、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 本発明の範囲には、ＨＵＲＩＢＯ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又は その一部の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製したこの合成遺 伝子を、この出願時点において周知の試薬を用いて任意の入手可能なＤＮＡベク ター及び細胞系に挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＨＵＲ ＩＢＯをコードする配列又はその任意の一部分に突然変異を誘発させることがで きる。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で請求項に 記載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２のヌクレオチド配列とハイブリダイ ズし得るポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl,G .M．及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.152:399-407)及びKimmel,A.R.(1987 ;Methods in Enzymol.152:507-511)に記載されている。 当業者が一般に利用可能な周知のＤＮＡ配列決定のための方法を、本発明の実 施において用いることができる。この方法では酵素、例えばＤ Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ （Amersham,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithersburg MD）社から市販さ れているELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼと組換え体ポリ メラーゼとの組み合わせを使用する。この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Ham ilton,Reno,NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Reserch,Watertown MA)並 びにABI377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）のような装置を用いて自動化するの が好ましい。 ＨＵＲＩＢＯをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモ ーター及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の 様々な方法とを用いて伸長させることができる。例えば、用いることができる或 る方法、即ち「制限部位」ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の座位に 隣接する未知の配列を得る（Sarkar,G.(1993)PCR Methods Applic 2:318-322） 。詳述すると、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に対して特異的なプライマー及 びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅する。増幅された配列を、そ の同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プ ライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかける。ＰＣＲの各回の生成物を、適切なＲ ＮＡポリメラーゼを用いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または伸長を行うことができる（Triglia,T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社,Plymouth MN ）や別の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで、５０％ 以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするよ うに設計される。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域の 適当な断片を作り出す。次にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、 ＰＣＲ用の鋳型として使用する。 使用できる別の方法にはキャプチャＰＣＲ法があり、この方法ではヒト及び酵 母菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（ Lagerstrom,M.等（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法では、Ｐ ＣＲ処理の前に、ＤＮＡ分子の未知の部分に、複数の制限酵素による消化及びラ イゲーションによって組換え二 本鎖配列を配置しておいてもよい。 未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker,J.D.等の方 法（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060）である。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行 うことができる（Clontech,Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーを スクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有 用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、 サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダ ムプライミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流 領域を含む配列をより多く含むという点で好適である。ランダムプライミングし たライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーで完全長ｃＤＮＡが得られない 場合に特に有用である。またゲノムライブラリーは、５’及び３’非翻訳領域へ の配列の伸長のために役立つことがある。 配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したり確認するため には、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることができる。特に、キャ ピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、 レーザーで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ） を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切 なソフトウエア（例えばPerkin elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^{T M} ）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電 子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法 は、特定のサンプル内に限られた量だけ存在するＤＮＡ小片の配列決定に特に適 している。 本発明の別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯ、融合タンパク質或いはその 機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＨＵ ＲＩＢＯの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子において用いることができる。遺伝 暗号固有の縮重のために、同一か機能的に等価なアミノ酸配列を実質的にコード する他のＤＮＡ配列も、ＨＵＲＩＢＯのクローニングや発現のために用いること ができる。 当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＨＵＲＩＢＯコード ディングヌクレオチド配列を作り出すことが有益なことがある。特定の原核細胞 或いは真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、例えば、ＨＵＲＩ ＢＯ発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い 半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができ る。 本発明のヌクレオチド配列は、様々な理由でＨＵＲＩＢＯをコードする配列を 変更するために周知の方法を用いて組換えることができる。このような配列変更 には、限定するものではないが、例えば遺伝子産物のクローニング、プロセシン グ及び／又は発現を変えるような変更が含まれる。無作為断片によるＤＮＡ再編 成や遺伝子断片のＰＣＲ再会合及び合成オリゴヌクレオチドを用いて、ヌクレオ チド配列を組換えることができる。例えば、特定部位突然変異誘発のような当業 者には周知の技術を用いて突然変異を誘発させることによって、新しい制限部位 の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライスバリアン トの生成等をもたらし得る。 本発明の別の実施例では、未改変ＨＵＲＩＢＯコーディング配列、変異ＨＵＲ ＩＢＯコーディング配列、又は組換えＨＵＲＩＢＯコーディング配列を異種の配 列に結合して、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＨＵＲＩＢＯ 活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスクリーニングする場合、市販 の抗体により認識される異なるペプ チドを発現するキメラＨＵＲＩＢＯタンパク質をコードすることが役立つ。融合 タンパク質はＨＵＲＩＢＯ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位 を有するように設計することもでき、これによってＨＵＲＩＢＯを切断して、ヘ テロの部分から分けて精製することが可能となる。 本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的方法（Caruthers.M.H. 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223;Horn,T.等（1980）Nucl.Acids Res Symp.Ser.225-232参照）を用いて、ＨＵＲＩＢＯコーディング配列の全体、或 いはその一部を合成することができる。別法では、化学的方法を用いてタンパク 質自体を作り出して、ＨＵＲＩＢＯアミノ酸配列の全体或いはその一部を合成す ることができる。例えば、種々の固相技術（Roberge,J.Y.等(1995)Science 269: 202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI 431A ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いることにより達成することができ る。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより実 質的に精製することができる（例えばCreighton T．(1983)Proteins Structure And Molecular Principles ,WH Freeman and Co.,NY参照）。合成されたペプチド の構成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（ 例えばエドマン分解法；Creighton，上述）。さらにＨＵＲＩＢＯのアミノ酸配 列或いはその任意の部分を、その直接の合成の際の改変することにより、及び／ 又は化学的方法を用いて他のタンパク質或いはその任意の部分に由来する配列と の結合することによって変異体ポリペプチドを作ることができる。 生物学的に活性なＨＵＲＩＢＯを発現させるために、ＨＵＲＩＢＯコーディン グヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベ クター、すなわち挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメン トを含むベクターに挿入する。 ＨＵＲＩＢＯコーディング配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベ クターを作製するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、 in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、又は遺伝子 組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook,J.等(1989)Molecular Clo ning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel ,F.M.等Current Protocol in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York NYに記載されている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＨＵＲＩＢＯコーディング配列を保持させ、 かつ発現させるために利用することができる。このようなものには、以下のもの に限定はしないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮ Ａ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形 質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染 させた昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイ ルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をトランスフェクトした、或いは細菌 の発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞 系や、或いは動物細胞系が含まれる。 これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するた めに宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハン サー、プロモーター及び３’非翻訳領域である。このようなエレメントの、強さ 及び特異性は様々であり得る。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及 び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを用いる ことができる。例えば、細 （Stratagene,LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモーター及びptrp-lacハイ ブリッド等のような誘導的プロモーターを用いることができる。バキュロウイル スポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において用いることができる。植物細胞 のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば熱ショック遺伝子,R UBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来するプロモー ター或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）を、 ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳類遺伝子或いは哺乳 類ウイルス由来のプロモーターが最適である。ＨＵＲＩＢＯをコードする配列の 多数の複製を含む株細胞を作る必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベ クターを適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＨＵＲＩＢＯの用途に応じて多数の発現ベクターを選択すること ができる。例えば抗体誘発のために大量のＨＵＲＩＢＯが必要とされる場合は、 容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。 そのようなベクターには、以下のものに限定はしないが、多機能の大腸菌クロー ニング・発現ベクター、例えばドする配列を、アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基 の配列を備えたフレーム内においてベクターに結合してハイブリッドタンパク質 を生成できる）や、pINベクター（Van Heeke,G.及びS.M.Schuster（1989）J.Bio l.Chem.264:5503-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage、Madison W I）も、グルタチオンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質とし て異種ポリペプチドを発現するため用いることができる。一般に、そのような融 合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させ た後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより溶解した細胞から容易 に精製できる。その系において生成されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン 或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含めて、目的のクローン化ポリペプチド をGST部分から随意に放出させることができるように設計される。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター を含む多数のベクターを用いることができる。その概要を知るには、Ausubel等 （前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＨＵＲＩＢＯをコードする配列の発現は 、多数のプロモーターの何れかで促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモー ターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Takamatsu,N.等 （1987）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と共に用いることができ る。別法として、RUBISCOの小サブユニット、或いは熱ショックプロモーターの ような植物プロモーターが用いてもよい（Coruzzi,G.等（1984）EMBO J 3:1671- 1680）;Broglie,R.等（1984）Science 224:838.843:及びWinter,J.等（1991）Re sults Probl.Cell Differ.17:85-105）。これらの構成は、直接のＤＮＡ形質転 換或いは病原体によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。こ のような技術の種々の一般に入手可能な文献に記載されている(Hobbs,S.又はMur ry,L.E.McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill N Y,pp191-196を参照されたい)。 ＨＵＲＩＢＯの発現のために用いることができる別の発現系に、昆虫系がある 。例えば、そのような系の一つでは、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichop lusia の幼虫において外来遺伝子を発現するための ベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が用いら れる。ＨＵＲＩＢＯをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルス の非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ 得る。ＨＵＲＩＢＯコーディング配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子 が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成される。 次に、この変異体ウイルスを用いて、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼 虫へ感染させ、その中でＨＵＲＩＢＯが発現される(Engelhard,E.K.等(1994)Pro c.Natl.Acad.Sci.91:3224-3227)。 哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。 発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＵＲＩＢＯをコー ドする配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノウイルス転 写物／翻訳物複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域 へ挿入することにより、感染した宿主細胞でＨＵＲＩＢＯを発現できる生ウイル スになる（Logan,J.及びShenk,T.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659） 。さらに、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（ RSV）エンハンサのような転写エンハンサを用いることができる。 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに含められ て発現され得るものより大きいＤＮＡの断片を供給することもできる。治療の目 的で、従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカチオンのアミノポリマー、又 は小胞）を用いて６〜１０ＭのＨＡＣを構築し、供給することができる。 また、ＨＵＲＩＢＯ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必 要である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含まれる 。ＨＵＲＩＢＯ及びその開始コドン及び上流配列が適 切な発現ベクター内に挿入される場合には、翻訳制御シグナルを加える必要はな い。しかしながらコーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、AT G開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、 全インサートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドンは正しい読 み枠に存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及 び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。例えば文献(Scharf,D.等(1 994)Results Probl.Cell Differ.20:125-162)に記載されているもののような、 その細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の効率を高めること ができる。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節したり、発現したタンパク 質を望ましい形にプロセシングする能力で選択される。このようなポリペプチド の修飾には、以下のものに限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ コシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含まれる。またタ ンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折 り畳み、及び／又は機能の発揮のために重要である。そのような翻訳後の作用の ための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有している異なる宿主細胞（例えばCH O、HeLa、MDCK、293、WI38）はAmerican Type Culture Collection（ATCC;Bethe sda,MD）より市販されており、導入される外来タンパク質の正しい修飾やプロセ シングが確実に行われるようにするために、これを選択することができる。 長期間にわたって組換えタンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起源及び／または内在性発現エレメ ント及び選択マーカー遺伝子を、同一のベクター上、或いは別のベクター上に含 む発現ベクターを用いて、ＨＵＲＩＢＯを安 定的に発現する株細胞を形質転換することができる。ベクターの導入の後、細胞 を、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカ ーの目的は、選択のための耐性を与え、その存在によって導入された配列をうま く発現する細胞を増殖、回収できるようにすることである。安定的に形質転換さ れた細胞の耐性クローンは、その細胞の型に適した組織培養技術を用いて増殖す ることができる。 形質転換された細胞系を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン キナーゼ（tk）（Wigler,M.等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼ（aprt）（Lowy,I.等（1980）Cell 22:817-23）遺伝 子が含まれ、それぞれtk^-及びaprt^-細胞において用いられる。また代謝拮抗物質 、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例え ばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler,M.等(1980)Natl Acad S ci 77:3567）、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え （Colberre-Garapin,F.等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロル スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（Murry，前出 ）。さらに選択に利用できる遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わ りにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒス チノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記載されている（Ha rtman,S.C.及びR.C.Mulligan（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047-51）。最近 になって、形質転換体を特定するためばかりではなく、特定ベクター系による一 過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられる、例 えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその 基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのような可視マー カーがよく利用されるようになった（Rhodes,C.A.等（1995）Methods Mol.Biol. 55:121-131）。 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示されるが 、その存在及び発現は確認すべきである。例えばＨＵＲＩＢＯをコードする配列 がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＨＵＲＩＢＯをコードする配列を 含む組換え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。別法では、 マーカー遺伝子をＨＵＲＩＢＯをコードする配列と直列に配置して、両者が単一 プロモータの制御下となるようにすることができる。誘導に応じてのマーカー遺 伝子の発現、つまり選択は、通常直列に配置された配列の発現をも同時に示すこ とになる。 或いは、当業者には周知の様々な方法により、ＨＵＲＩＢＯのコーディング配 列を含みＨＵＲＩＢＯを発現する宿主細胞を識別できる。このような方法には、 以下のものに限定はしないが、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション及 び、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するための膜ベース、溶液ベース 或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセ イが含まれる。 ＨＵＲＩＢＯをコードする配列のプローブ、一部、或いは断片を用いるDNA-DN A又はDNA-RNAハイブリダイゼーション若しくは増幅により、ＨＵＲＩＢＯポリヌ クレオチド配列の存在を検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは 、ＨＵＲＩＢＯをコードするDNA或いはRNAを含む形質転換体を検出するために、 核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いる。 このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず れかを用いる、ＨＵＲＩＢＯポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々 のプロトコルが当業者には周知である。このようなプ ロトコルの例には、酵素結合免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA ）及び蛍光表示式細胞分取器法（FACS）を含まれる。ＨＵＲＩＢＯポリペプチド 上で２つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する 二部位モノクローナルベースイムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immu noassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイ の並びに他のアッセイは、他の文献、Hampton,R.等(1990;Serological Methods, a Laboratory Manual ,APS Press,St.Paul MN）及びMaddox,D.E.等(1983,J.Exp.M ed.158:1211-1216)に記載されている。 他にも様々な標識及び結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸のアッセイにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標 識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作成するための手 段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識ヌク レオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。別法では、ＨＵＲＩＢＯコーディ ング配列、或いはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの作成のためのベクター にクローン化する。そのようなベクターは当分野では周知で、市販されており、 例えばT7、T3、或いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌ クレオチドを加えることにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用 いることができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Pharmacia Upjohn（ Kalamazoo,MI）；Promega（Madison WI）；及びU.S.Biochemical Corp.（Clevel and OH））を用いて実行することができる。適切なリポーター分子、すなわち標 識には、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学発光剤或いは色素 剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が含まれる。 ＨＵＲＩＢＯをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細 胞を、コードされたタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適 した条件下で培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質 は、用いられる配列及び／またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞 内に含まれるようにすることができる。当業者には理解されるように、ＨＵＲＩ ＢＯをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞 の細胞膜を通してのＨＵＲＩＢＯ分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計 することができる。また他の作製物を用いて、ＨＵＲＩＢＯをコードする配列を 、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌク レオチド配列に結合することができる。そのような精製を容易にするドメインに は、以下のものに限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジ ントリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブ リン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS伸長／アフィ ニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex Corp.,Seattle WA） が含まれる。精製ドメインとＨＵＲＩＢＯの間にＸＡ因子或いはエンテロキナー ゼ（Invitrogen，San Diego CA）に対して特異的な配列のような切断可能なリン カー配列を含めるのは精製を促進するのに役立つ。ＨＵＲＩＢＯをコードする配 列とともに、６個のヒスチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエンテロキ ナーゼ切断部位をコードする核酸配列を含むこのような発現ベクターの１つは、 融合タンパク質を発現する。ヒスチジン残基がIMIAC（Porath,J等（1992;Protei n Exp.Purif.3:263-281）に記載のような固定化金属イオンアフィニティクロマ トグラフィー）精製を促進するとともに、エンテロキナーゼ切断部位が融合タン パク質からのＨＵＲＩＢＯの精製のための手段となる。融合タンパク質を含むベ クターについての解説は、Kroll,D.J.等（1993;DNA Cell Biol．12:441-453）に 記載さ れている。 組換え体の産生に加えて、ＨＵＲＩＢＯの断片を、固層技術を用いた直接のペ プチド合成で形成することもできる（Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:21 49-2154参照）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが、自動化すること もできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサ イザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。ＨＵＲＩＢＯの種々の断片を 個別に化学的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出しても よい。 治療 ＨＵＲＩＢＯとヒトリボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼｋ６（GI 1513102）の間に 化学的及び構造的相同性が存在する。ノーザン解析の結果から、ＨＵＲＩＢＯの 発現が、細胞増殖、炎症、胎仔及び乳仔の発達、及び免疫応答と関連を有するこ とが分かる。 ＨＵＲＩＢＯの発現の低下は、細胞増殖の上昇と関連を有すると思われる。従 って、或る実施例では、過剰な細胞増殖に関連する疾病の予防又は治療のために 、ＨＵＲＩＢＯ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。このような疾 病には、限定するものではないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、 肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆 嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰 茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌を含む種 々のタイプの癌が含まれる。 別の実施例では、限定するものではないが、上述したものを含む過剰な細胞増 殖に関連する疾病の予防又は治療のために、ＨＵＲＩＢＯの断片若しくは誘導体 のアゴニストを用いてＨＵＲＩＢＯの活性を変調する ことができる。。 更に別の実施例では、限定されないが、上述したものを含む過剰な細胞増殖に 関連する疾病の予防又は治療のために、ＨＵＲＩＢＯ、又はその断片若しくは誘 導体を発現し得るベクターを用いることができる。 別の実施例では、或る種の疾患に関連する炎症の予防又は治療のために、ＨＵ ＲＩＢＯ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。このような疾病には 、限定を意図するものではないが、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギ ー、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、 潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、腎 炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス 、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症 、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、及び自己 免疫性甲状腺炎；癌、血液透析、体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄 生虫、原虫、及び蠕虫の感染症及び外傷が含まれる。 別の実施例では、限定されないが、上述したものを含む疾病に関連する炎症の 予防又は治療のために、ＨＵＲＩＢＯ又はその断片若しくは誘導体のアゴニスト を用いてＨＵＲＩＢＯの活性を変調することができる。 更に別の実施例では、限定されないが、上述したものを含む疾病に関連する炎 症の予防又は治療のために、ＨＵＲＩＢＯ又はその断片若しくは誘導体を発現し 得るベクターを用いることができる。 ＨＵＲＩＢＯの発現レベルの上昇は、正常な胎仔の発達においてアポトーシス をもたらすが、他の被験者では同じ発現レベルが有害なものとなる。従って、或 る実施例では、アポトーシスに関連する疾病の予防又は治療のために、ＨＵＲＩ ＢＯ又はその断片若しくは誘導体のアンタゴニストを患者に投与することができ る。このような疾病には、限定する ものではないが、ＡＩＤＳ及び他の感染性の又は一般的な免疫不全、例えばアル ツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、及び小脳 変性のような神経変性疾患、再生不良性貧血のような脊椎形成異常症候群、心筋 梗塞、脳卒中、及び再潅流障害のような虚血性障害、アルコール誘発性肝障害、 肝硬変、及びラチリスムのような毒素誘発性疾患、カヘキシーのような消耗性疾 患、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎に因るもののようなウイルス感染症、及び骨粗鬆症が 含まれる。或る態様では、ＨＵＲＩＢＯに特異的な抗体をアンタゴニストとして 直接的に用いたり、或いはＨＵＲＩＢＯを発現する細胞又は組織に薬物を送達す るためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いることができる 。 別の実施例では、限定されないが、上述したものを含むアポトーシスの増加に 関連する疾患の予防又は治療のために、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオ チド又はその断片若しくは誘導体のアンチセンス、つまり相補配列を発現するベ クターを用いることができる。 更に別の実施例では、細胞増殖を刺激するために、ＨＵＲＩＢＯのアンタゴニ スト又はインヒビター、又はその断片若しくは誘導体を細胞に与えることができ る。詳述すると、細胞又は細胞群の再生又は分化を促進するために、例えばリポ ソーム、ウイルスベースのベクター、又はエレクトロインジェクションのような デリバリー機構を用いて、ＨＵＲＩＢＯのアンタゴニストをin vivoで細胞又は 細胞群に与えることができる。更に、異種移植又は自家移植において使用するた め、細胞増殖を刺激するために、ＨＵＲＩＢＯのアンタゴニストを、細胞、細胞 系、組織又は器官の培地にin vitro又はex vivoで与えることができる。場合に よっては、細胞を、その感染症や癌と闘う能力、又は鎌状赤血球貧血、β地中海 貧血、嚢胞性線維症、又はハンチントン舞踏病のような遺伝子 異常を修正する能力について選択しておくことができる。或る態様では、ＨＵＲ ＩＢＯに特異的な抗体をアンタゴニストとして直接的に用いたり、或いはＨＵＲ ＩＢＯを発現する細胞又は組織に薬物を送達するためのターゲティング又はデリ バリー機構として間接的に用いることができる。 更に別の実施例では、上に詳述したように、細胞増殖を刺激するために、ＨＵ ＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチド又はその断片若しくは誘導体のアンチセ ンス、つまり相補配列を発現するベクターを用いることができる。 他の実施例では、本発明の治療用タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ スト、相補配列、又はベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組み合わせて投 与し得る。当業者は、従来の医薬上の原理に基づいて、併用療法において使用す るために適した薬剤を選択することができよう。治療薬を組み合わせることによ り、上述の様々な疾病の治療又は予防に効果を奏する相乗作用を与え得る。この 方法を用いることにより、より少ない投与量の各薬剤で同じ治療効果を達成する ことができ、従って副作用を低減できることがある。 ＨＵＲＩＢＯのアンタゴニスト又はインヒビターは、周知の方法を用いて製造 し得る。詳述すると、精製されたＨＵＲＩＢＯを用いることにより、抗体を精製 したり、或いはＨＵＲＩＢＯに特異的に結合するものを同定するべく薬物のライ ブラリーをスクリーニングすることができる。 ＨＵＲＩＢＯに対する抗体は、周知の方法を用いて製造することができる。こ のような抗体には、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクロー ナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライ ブラリーによって生成されたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち二量体形 成を阻害する抗体）は治療上の用途に特に好適である。 抗体を産生するため、ＨＵＲＩＢＯ或いは免疫学的特性を保持するその任意の 一部、断片或いはオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラッ ト、マウス等を含む種々の宿主を免疫することができる。宿主の種に応じて、種 々のアジュバントを免疫学的反応を増強するために用いることができる。そのよ うなアジュバントには、以下のものに限定はしないが、フロイントのアジュバン ト、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのよう な界面活性物質アジュバント、プルロニックポリオールアジュバント、ポリアニ オンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホール リンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが 含まれる。ヒトで使用するアジュバントのなかで、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン 杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）は特に好 適である。 ＨＵＲＩＢＯに対する特異的抗体を誘発するために用いられるペプチドは、５ 個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列 を有するものであるのが好ましい。またこれらの配列は、自然タンパク質のアミ ノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んで いるのが好ましい。ＨＵＲＩＢＯアミノ酸の短いストレッチを、キーホールリン ペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような他のタンパ ク質の配列に融合してもよい。 ＨＵＲＩＢＯのモノクローナル抗体は、培地内の連続株細胞によって抗体分子 を産生する任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下のものに 限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥ ＢＶ−ハイブリドーマ技術（Kohler,G.等(1975)Nature 256:495-497；Kozbor,D. 等(1983)Immunol Methods 81:31-42；Cote，R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:2026-2030；Cole,S.P.等 (1984)Mol.Cell Biol.62:109-120）が含まれる。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の産生、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子の結合のために開発さ れた技術が用いられる（Morrison,S.L.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-68 55；Neuberger,M.S.等（1984）Nature 312:604-608；Takeda,S.等（1985）Natur e 314:452-454）。或いは、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、Ｈ ＵＲＩＢＯ特異的一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有する がイディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為の免疫グロブリン組み合わせラ イブラリーからの鎖再編成（chain shuffling）によって作り出すことができる （Burton D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:11120-3）。 また抗体は、文献（Orlandi,R.等(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837； Winter,G.等1991,Nature 349:293-299）に開示されているように高度に特異的な 結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングするこ とにより、或いはリンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより作り出す こともできる。 ＨＵＲＩＢＯに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することが できる。このようなフラグメントには例えば、限定はしないが、抗体分子のペプ シンによる消化で生成することができるF(ab’)₂フラグメントや、F(ab’)₂フラ グメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラ グメントが含まれる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルFabフ ラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Fab発現ライブラリーを作製し てもよい(Huse,W.D.等（1989）Science 256:1275-1281)。 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するため のスクリーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクロ ーナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或 いは免疫放射線測定法の種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。この ようなイムノアッセイでは、ＨＵＲＩＢＯとその特異的抗体との複合体の形成、 並びに複合体形成の測定が行われる。特定のＨＵＲＩＢＯタンパク質上の２つの 互いに非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二部位 モノクローナルベースイムノアッセイが好適であるが、競合的結合アッセイも用 いられる（Maddox，前出）。 本発明の別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチド、また はその任意の断片やアンチセンス配列を、治療目的で用いることができる。或る 態様では、このタンパク質の合成を阻害することが望ましいような状況において 、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを用いるこ とができる。詳述すると、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドに対する アンチセンス配列で細胞を形質転換することができる。従って、アンチセンス配 列を用いて、ＨＵＲＩＢＯ関連の組織損傷を予防したり、遺伝子機能の調節を達 成することができる。このような技術は現在周知となっており、センス又はアン チセンスオリゴマー、若しくはより大きな断片を、ＨＵＲＩＢＯコーディング配 列のコード領域や調節領域の種々の位置から設計することができる。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の 発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的 の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。 当業者によく知られた方法を用いて、ＨＵＲＩＢＯをコードする配列のアンチセ ンスを発現する組換えベクターを作 り出すことができる。これらの技術はSambrook等(前出)及びAusubel等（前出） に記載されている。 所望のＨＵＲＩＢＯ断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織 にトランスフェクトすることにより、ＨＵＲＩＢＯをコードする遺伝子の機能を 停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス配列或いは アンチセンス配列で細胞に導入するために用いることができいる。このようなベ クターは、ＤＮＡへ組み込まれない場合ですら、全ての複製物が内在性ヌクレア ーゼにより分解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発 現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一 部である場合には更に長い期間継続し得る。 上述のように、ＨＵＲＩＢＯをコードする遺伝子の制御、５’、又は調節領域 （シグナル配列、プロモータ、エンハンサ、及びイントロン）に対する相補配列 、つまりアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計することによ り遺伝子発現を変化させることができる。転写開始部位、例えばリーダー配列の ＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。同様に、 「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対 合が有用なのは、それが、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子が結合する ために二重らせんが十分にほどける能力を阻害するからである。三重らせんＤＮ Ａを用いた最近の治療法の進歩については、文献（Gee,J.E.等(1994)In:Huber,B .E.及びB.I.Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing C o,Mt Kisco NY）に記載されている。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイムの作用機序では、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列 特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エン ドヌクレアーゼによる切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範 囲内には、ＨＵＲＩＢＯのエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果的に 触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。 任意のＲＮＡ標的可能部分内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、配列 GUA、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子を調べるこ とによって同定する。ひとたびその同定がなされると、切断部位を含む標的遺伝 子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、 そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価するこ とが可能となる。候補の標的部分の適切性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを 用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性（acce ssibility）をアッセイすることにより評価することができる。 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのため の当分野で周知の方法により作製することができる。これらの技術には、固相ホ スホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化 学的合成技術が含まれる。或いは、ＲＮＡ分子を、ＨＵＲＩＢＯをコードするＤ ＮＡ配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このような ＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータ ーを有する多種のベクターに組み込むことができる。或いは、構成的に或いは誘 導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ作成物を、株細胞、 細胞或いは組織内に導入することができる。 ＲＮＡ分子はその細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾するこ とができる。可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’末端か３’末端 、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子 のバックボーン内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネー ト（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メチルを使用することが含まれる。この コンセプトは、ＰＮＡ生成固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより 容易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、 アセチル−、メチル−、チオ−形態、及び類似の改変形態とともに、イノシン、 キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybutosine）のような従来あま り用いられなかった塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡張するこ とができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、in vivo 、in vitro、及びex vivoの使用に対しても同様に適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し、自家 移植用のクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またトランスフェ クションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー によるデリバリー（Goldman,C.K.等(1997)Nature Biotechnology 15:462-66;引 用により本明細書の一部とする）は、当分野でよく知られた方法を用いて実施す ることができる。 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び 最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、任意の適切な被験体に適用すること ができる。 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果のいずれかをあげるために、医 薬品組成物を薬学的に許容される担体とともに投与する。このような医薬品組成 物は、ＨＵＲＩＢＯ、ＨＵＲＩＢＯに対する抗体、ＨＵＲＩＢＯの擬似物、アゴ ニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬 品組成物は、単体で、或いは例えば安定剤のような１種以上の他の薬剤と組み合 わせて、任意の滅菌した生 体適合性の医薬用担体に含めて投与される。このような担体には、限定はしない が、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は、 患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して投与され得る。 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下の経路に限定されない が、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投 与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局 所投与、舌下投与、或いは直腸内投与が含まれ得る。 これらの医薬品組成物は、活性成分に加えて、薬学的に用いられ得、調合物内 への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許 容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington' s Pharmaceutical Sciences”（Maack Publishing Co,Easton PA）の最新版にお いて見ることができる。 経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担 体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、医薬品組成物は、 治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、 液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液或いは類似の製剤として処方 される。 経口投与するための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによ って得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した後、 得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を得る ことができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは ソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、 小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ ルメチルセルロース 或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビア ゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのよう なタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、 アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムや、その 塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。 糖衣剤核（dragee core）は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられる が、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、 ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機 溶剤或いは溶剤混合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量 、すなわち投与量を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加 えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤とともに或いは安定剤なしで、 脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶 解或いは懸濁される。 非経口投与用の製剤は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンゲル溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁 剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性注入 懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような 脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂 肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、溶解度を増加し濃縮度の高 い溶液の調製を可能にする適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な 浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、当技術分野において周知 である。 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍 結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおけ る凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れて、さらに提示した疾病状態の治療のためにラ ベル付けすることができる。ＨＵＲＩＢＯの投与の場合、このようなラベルには 、投与の量、頻度、方法が表示される。 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するための有効量含む組成物である。有効量の決定は、 当業者の能力の範囲内で十分行うことができる。 任意の化合物について、治療的有効量は、初めに、新生物細胞、或いは通常マ ウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイか ら推定される。次に、このような情報を利用して、ヒトにおける有効量や投与経 路を決定することができる。 治療上の有効な量とは、症状や状態を改善するタンパク質、その抗体、アンタ ゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療上 の有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個 体群の５０％における治療上の有効量、５０％有効量）を決定するための、細胞 培地或いは実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することができる 。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の 比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。こ れらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへ の使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合 物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の 範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに 投与経路に応じてこの範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調節される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患 者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感 受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４ 日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて ２週間に１度投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大 約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いは送達の方法 に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献において見出すことが できる。当業者なれば、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用 の剤形とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポ リペプチドの送達方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。 診断 別の実施例において、ＨＵＲＩＢＯに特異的に結合する抗体を、ＨＵＲＩＢＯ の発現を特徴とする状態や疾病の診断や、ＨＵＲＩＢＯで治療を受けている患者 のモニタリングのためのアッセイにおいて用いることができる。診断目的で有用 な抗体は、上述の治療用のものと同一の方法で調製することができる。ＨＵＲＩ ＢＯの診断検査法には、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＨＵＲＩ ＢＯを検出するために抗体或いは標識を利用する方法が含まれる。本発明のポリ ペプチド及び抗体は、修飾したものでも、修飾なしでも用いることができ、共有 結合、或いは非共有結合かのいずれかでリポーター分子と結合することにより標 識することができる。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかに ついては上記した。 例えばELISA（酵素結合免疫測定法）、RIA（ラジオイムノアッセイ）並びにFA CS（蛍光表示式細胞分取器法）を含む、ＨＵＲＩＢＯを測定するための種々のプ ロトコルが当分野では周知であり、これによってＨＵＲＩＢＯ発現の変化や異常 を診断するための基礎が得られる。ＨＵＲＩＢＯの発現の正常値、つまり標準値 は、哺乳類、好ましくはヒトの正常被験者から得られる体液或いは細胞抽出物と ＨＵＲＩＢＯに対する抗 体とを、複合体形成に適した条件の下で結合することによって得ることができる 。標準の複合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いることにより 定量することができる。被験者、対照標準、及び生検組織からの患部組織サンプ ルにおいて発現されたＨＵＲＩＢＯの量を、標準値と比較する。標準値と被験者 の値との偏差で、疾病診断のパラメータが確立される。 本発明の別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチドを、診 断目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレ オチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びペプチド核酸（ＰＮＡ） が含まれる。このポリヌクレオチドは、ＨＵＲＩＢＯの発現が疾病と相関性を有 する生検組織における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断ア ッセイは、ＨＵＲＩＢＯが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを 区別したり、治療的介入の際にＨＵＲＩＢＯレベルの調節をモニタリングするの に役立つ。 或る態様では、ＨＵＲＩＢＯまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を含 むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰ ＣＲプローブを用いて、ＨＵＲＩＢＯをコードする核酸配列を同定することがで きる。そして、そのプローブの特異性、即ち、そのプローブが非常に高度な保存 領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）と、保存的で ある度合いの低い領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の間の領域 ）の何れに由来するのかということ、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の （高い、中程度の或いは低い）厳密性によって、そのプローブが自然発生ＨＵＲ ＩＢＯのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定する ものであるかということが決まってくる。 プローブは、近縁なインヒビターをコードする配列を検出するために も用いることができ、好ましくは、これらのＨＵＲＩＢＯをコードする任意の配 列から得られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイ ブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、自然発生 ＨＵＲＩＢＯのイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメントを含むゲ ノムの配列に由来するものであり得る。 ＨＵＲＩＢＯをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプ ローブの作製のための他の手段には、ＨＵＲＩＢＯやＨＵＲＩＢＯ誘導体をコー ドする核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する方 法がある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメラ ーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでのＲＮ Ａプローブを合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプロー ブは種々のリポータ分子により標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓ のような放射性核種、アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアル カリホスファターゼのような酵素標識等が含まれる。 ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＵＲＩＢＯの発現に関 連する状態、疾患、又は疾病の診断のために用いることができる。このような疾 病の例には、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具 体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、 心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、 皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌を含む種々のタイプの癌；アジ ソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬 化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚 筋炎、糖尿病、肺気腫、萎縮性胃炎、腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸 球増加症、過敏性腸症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、 心筋又は心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマチ性関 節炎、強皮症、シェーグレン症候群、及び自己免疫性甲状腺炎のような炎症に関 連する疾患；癌、血液透析、体外循環の合併症；ウイルス、細菌、真菌、寄生虫 、原虫、及び蠕虫の感染症及び外傷；及びＡＩＤＳ及び他の感染性の又は一般的 な免疫不全、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、 色素性網膜炎、及び小脳変性のような神経変性疾患、再生不良性貧血のような脊 椎形成異常症候群、例えば心筋梗塞、脳卒中、及び再潅流障害のような虚血性障 害、例えばアルコール誘発性肝障害、肝硬変、及びラチリスムのような毒素誘発 性疾患、カヘキシーのような消耗性疾患、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎に因るもののよ うなウイルス感染症、及び骨粗鬆症含まれる。ＨＵＲＩＢＯをコードするポリヌ クレオチド配列は、ＨＵＲＩＢＯ発現の変化を検出するための生検組織や体液を 試験するための、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット 法或いは他の膜ベース技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法 ）、ピン或いはチップ技術及びELISAアッセイにおいて用いることができる。こ のような定性的或いは定量的試験方法は当分野ではよく知られている。 具体的な実施態様では、種々の癌、特に上述の癌の活性化または誘導を検出す るアッセイにおいてＨＵＲＩＢＯをコードするヌクレオチド配列が役立つことが ある。ＨＵＲＩＢＯをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハ イブリダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプ ルに加える。適切なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗浄しシ グナルを定量して、標準値を比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけ るシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっている 場合、この ヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サ ンプルにおけるＨＵＲＩＢＯをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が存 在することは、関連疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験 、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療措置の 効果を評価するために用いることもできる。 ＨＵＲＩＢＯの発現が関係する疾病の診断の基礎を得るために、正常な、或い は標準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒ ト何れかの正常な被験者から得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼ ーション或いは増幅に適切な条件下で、ＨＵＲＩＢＯをコードする配列又はその 一部分と結合することにより確立される。標準のハイブリッド形成量は、既知の 量の実質的に精製されたＨＵＲＩＢＯが用いられる同一の実験で得られる値と、 正常被験者に対して得られる値とを比較することにより定量することができる。 正常なサンプルから得られた標準値は、疾病の症状を示す患者からのサンプルか ら得られる値と比較することができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病 の存在を確認する。 ひとたび疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、患者での発現レベ ルが正常な患者において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価するため に、このようなアッセイが定期的に繰り返される。継続的なアッセイから得られ る結果を用いて、数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を知ることができ る。 癌については、患者の生検組織において転写物が比較的少ない量存在すること が疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す る手段となり得る。この型の一層確定的な診断により、医療従事者が予防的処置 を講じたり、より早期に積極的な治療を開始す ることが可能となり、癌の発生や更なる進行を予防することができるようになり 得る。 ＨＵＲＩＢＯをコードするオリゴヌクレオチドの別の診断目的の使用では、Ｐ ＣＲを使用することがある。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成する が、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作り出すこともできる。オリゴ マーは、特定の遺伝子或いは状態を識別するために最適な条件下で用いられる２ つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及びアン チセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー 、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡ またはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより厳密性の低い条件の下であっても用 いることができる。 さらにＨＵＲＩＢＯの発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolab eling）或いはビオチン標識ヌクレオチドの利用、コントロールの核酸の同時増 幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準的なグ ラフ曲線の利用も含まれる（Melby,P.C.等1993 J.Immunol Methods,159:235-44 ；Duplaa,C.等(1993)Anal.Biochem.229-236）。多数のサンプルの定量は、ELISA 形式の連続アッセイを実行することにより一層迅速に行うことができる。このア ッセイでは目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度計を用いる 分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。 別の実施例では、ここに開示する任意のポリヌクレオチド配列を起源とするオ リゴヌクレオチドをマイクロアレイにおける標的として用い得る。マイクロアレ イを用いることにより、多くの遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転写物イ メージを生成する）、また遺伝子の変異体、変異及び多形性を同定することがで きる。この情報は、遺伝子の機能の 決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の診断、及び治療薬の開発や活性のモ ニタリングにおいて役立つ（Heller,R．等.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:2150- 55）。 或る実施例では、ＰＣＴ出願WO95/11995(Chee等.)、Lockhart,D.J．等.(1996; Nat.Biotech.14:1675-1680)及びSchena,M．等.(1996;Proc.Natl.Acad.Sci.93:10 614-10619に記載の方法によりマイクロアレイを準備し、利用する。上記の文献 はここに引用することにより本明細書の一部とする。 マイクロアレイは、好ましくは、固体支持体に固定された、通常は合成アンチ センスオリゴヌクレオチドかｃＤＮＡの断片の何れかである、数多くの独特で一 本鎖の核酸配列からなる。マイクロアレイは、既知の５’又は３’配列をカバー するオリゴヌクレオチド、完全長配列をカバーする連続的なオリゴヌクレオチド 、又は配列の長さに沿った特定の領域から選択された独特のオリゴヌクレオチド を含み得る。マイクロアレイにおいて用いられるポリヌクレオチドは、特定の細 胞の型、発達又は疾病の状態について共通な１又は２以上の未同定ｃＤＮＡに特 異的な、或いは少なくとも配列の断片が既知である標的の遺伝子又は遺伝子群に 特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。 マイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを製造するために 、ヌクレオチド配列の５’又は又はより好ましくは３’末端からコンピュータア ルゴリズムを用いて目的の遺伝子を検定する。このアルゴリズムは、その遺伝子 に独特な、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含量を有し、且つハイ ブリダイゼーションを妨げ得る推定２次構造を有していない決まった長さのオリ ゴマーを同定する。このオリゴヌクレオチドは、光照射化学プロセスを用いて基 板上の所定の領域において合成される。この基板は、紙、ナイロン、又は他のタ イプのメ ンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固形支持体で あり得る。 別の実施態様では、オリゴヌクレオチドが、ＰＣＴ出願WO95/251116（Baldesc hweiler等.）に記載のように化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用 いることによって基板の表面上で合成され得る。上記ＰＣＴ出願はここに引用す ることにより本明細書の一部とする。別の態様では、ドットブロット（又はスロ ットブロット）に類似した「格子型」アレイを用いて、真空システム、熱、ＵＶ 、機械的又は化学的結合プロシージャを用いてｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオ チドを基板の表面上に配置し結合することができる。上述のようなアレイは、手 で製作するか、或いは市販の装置（スロットブロット又はドットブロット装置） 、材料（任意の適切な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いる ことにより製作することができ、８ドット、２４ドット、９６ドット、３８４ド ット、１５３６ドット、又は６１４４ドット、若しくは市販の器具で有効に使用 できるような他のドット数の格子を有する。 マイクロアレイを用いるサンプル解析を行うために、生物学的サンプルからの ＲＮＡ又はＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブにする。このｍＲＮＡは単 離され、ｃＤＮＡが作られて、アンチセンスＲＮＡ(ａＲＮＡ)を作るためのテン プレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光ヌクレオチドの存在のもとで増幅さ れ、標識されたプローブはマイクロアレイと共にインキュベートされて、プロー ブ配列がマイクロアレイの相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。 インキュベーション条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的な一致又は 様様なレベルのより低い相補性をもってハイブリダイゼーションが発生するよう に調節される。ハイブリダイズしたかったプローブを除去した後、スキャナーを 用いて、蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた イメージを調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程 度及び相対的な量を求める。生物学的サンプルは、体液（例えば血液、尿、唾液 、痰、胃液等）、培養された細胞、生検組織、又は他の組織調製物から得ること ができる。検出システムを用いることにより、全ての個別の配列について同時に ハイブリダイゼーションの不存在、存在、及び量を測定することができる。この データは、サンプルにおける配列、突然変異、変異、又は多形体についてのラー ジスケールの相関性の研究のために用いることができる。 本発明の別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯをコードする核酸配列を用いて、自然 発生のゲノム配列マッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを作り出 すこともできる。この配列を、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人工染 色体作成物にマッピングすることができる。前記人工染色体作成物には、例えば ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（Ｂ ＡＣ）、細菌性Ｐ１作成物又は一本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーがあり、Pric e,C.M.(1993)Blood Rev.7:127.134，及びTrask,B.J.(1991)Trends Genet.7:149- 154にその概要が記載されている。 蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH、Verma等(1988)Human Chromosomes :A Manual of Basic Technique ,Pergamon Press,New York,NY”に記載)は、他の 染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと関係を有し得る。遺伝子地図デー タの例は、種々の科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）に 見ることができる。物理的染色体地図上でのＨＵＲＩＢＯをコードする配列の位 置と、特定の疾病（または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある 遺伝病が関係するＤＮＡの領域の限界決定ができる。本発明のヌクレオチド配列 を用いて、正常者とキャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出す ることができる。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長するため に大変重要である。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であって も、マウスのような別の哺乳類種の染色体上の遺伝子配置から、関連するマーカ ーがわかる。新しい配列は、物理的マッピングにより染色体のアーム、或いはそ の一部へ割当てることができる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発見 技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛 細血管拡張性運動失調（AT）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域へ 、例えばATならば11q22-23(Gatti,R.A.等(1988)Nature 336:577-580)へ、遺伝子 連鎖によって粗い局所化がなされれば、その領域にマッピングされる任意の配列 は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子ということになる 。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者との間の、転座、 逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。 本発明の別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯや、その触媒作用性または免疫原性フ ラグメント或いはオリゴペプチドを、種々の薬物スクリーニング技術において治 療用化合物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験にお いて用いられるフラグメントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着した ものか、細胞表面へ付着したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。 ＨＵＲＩＢＯと試験される薬剤との結合複合体形成を測定することができる。 ＨＵＲＩＢＯポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物の高スループ ットスクリーニングのために用いることができる別の薬物スクリーニング技術が 、公開されたPCT出願WO84/03564に詳細に記載さ れている。この方法をＨＵＲＩＢＯに適用する場合には、多数の異なる小形ペプ チドの試験用化合物を、プラスチックピン或いは他の表面のような固体基質上で 合成する。ポリペプチド試験用化合物をＨＵＲＩＢＯ又はその断片と反応させ、 洗浄する。次いで結合ＨＵＲＩＢＯを当分野で周知の方法により検出する。また 、前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＨＵＲＩＢＯを プレート上に直接コーティングすることもできる。この他、ペプチドを捕捉し固 体支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いることができる。 別の実施例では、ＨＵＲＩＢＯに結合し得る中和抗体が、ＨＵＲＩＢＯとの結 合について試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを 使用することができる。このように、抗体を用いて、１または２以上のＨＵＲＩ ＢＯと共通のエピトープを有する任意のペプチドの存在を検出することができる 。 更に別の実施例では、ここに開示するＨＵＲＩＢＯをコードするヌクレオチド 配列は、その新技術が、以下に限らないが、例えばトリプレット遺伝暗号及び特 異的塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性 に基づく技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用い ることができる。 以下に示す本発明の実施例は、単なる例示であって、本発明をこの実施例に限 定しようとするものではない。実施例 １ SININOT01 ｃＤＮＡライブラリーの作製 SININOT01ｃＤＮＡライブラリーを、非開放性頭部損傷で死亡した年齢４歳の 白人女子の、顕微鏡検査で正常だった回腸組織（specimen RU96-03-0108;Intern ational Institute for the Advancement of Medicine,Exton,PA）から作製した。 冷凍組織を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instrume nts,Westbury,NJ）を用いてホモジナイズし、グアニジウムイソチオシアネート 溶液に溶解した。こめ溶解産物を、Beckman L81-70M超遠心分離機においてBeckm an SW28ロータ（Beckman Instruments）を用いて、5.7Mの塩化セシウムクッショ ンを通して、外界温度で18時間、１分当たり25,000回転の回転速度で遠心分離し た。pH4.7の酸性フェノールを用いてＲＮＡを抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウム及 び2.5倍量のエタノールを用いて沈殿させ、無ＲＮアーゼ水に再懸濁し、37℃でD Nアーゼ処理した。このＲＮＡの抽出を反復し、前回と同様にＲＮＡを沈殿させ た。次にｍＲＮＡを、Qiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）を用 いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。 このｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plas mid Cloning（Cat.# 18248-013,Gibco/BRL,Gaithersburg,MD）の推奨プロトコル に従って取り扱った。ｃＤＮＡはSepharose CL4Bカラム（Cat.#275105,Pharmaci a）で分画化し、400bpを越えるｃＤＮＡをpINCYＩにリゲートした。次にこのプ ラスミドpINCYＩをDH5a^TMコンピテント細胞（Cat.#18258-012,Gibco/BRL）に入 れて形質転換させた。 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit（Catalog #26173,QIAGEN,Inc.）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点 を変更した。（１）２５mg/Lのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールと共 に１mlの滅菌Terrific Broth（Catalog#22711,Life Technologies^TM,Gaithersbu rg,MD）において 細菌を培養した。（２）植菌の後、培地を１９時間インキュベートし、インキュ ベーションの終わりに、細胞を０．３mlの溶解バッファに溶解した。（３）イソ プロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１mlの蒸留水に再懸濁 した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９６穴ブロックに移し４℃で 保管した。 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers PTC200（MJ Research, Watertown,MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと組み合 わせてHamilton Micro Lab 2200（Hamilton,Reno,NV）を用いてSangerらの方法 （1975,J.Mol.Biol.94:441f）により行い、読み枠を決定した。 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合 わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのよ うなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が 注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用 いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al tschul S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300;Altschul.S.F.等(1993)J.Mol.Biol.2 15:403-410）。 BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントをとって配列の 類似性を決定する。そのアライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、 すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源とするホ モログを求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャップペナ ルティを処理する際には、本明細書の一部として引用されたSmith等(1992,Prote in Engineering 5:35-51)に記載のもののような他のアルゴリズムを用いること ができる。本明細書に開示された配列の長さは少なくとも49ヌクレオチドであり 、 不必要な塩基は12％以下である（ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又はＴ以外と記録さ れたものである）。 BLAST法は、本明細書の一部として引用されたKarlin及びAltschul（1993;Proc Nat Acad Sci 90:5873-7）に詳細に記載されているように、問い合わせ配列と データベースの配列の一致を検索する。BLASTは発見したあらゆる配列の一致の 統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致のみを報 告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25、ペプチドで１０^-14に設定 した。 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び 他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索した。次に同じクローンか ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳 類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索 した。これらのデータベースは特定の一致をGixxx±pという形式で報告した（こ こでxxxはpri;rod等であり、存在の場合はp=ペプチドである）。 ４ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由 来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写 物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrook等、上述）。 BLAST（Altschul,S.F.1993及び1990，上述）を用いる類似のコンピュータ技術 で、GenBankまたはLIFESEQ^TMデータベース（Incyte,Palo Alto CA）のようなデ ータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した（第３Ａ図〜第３Ｃ図） 。この解析は、多くの膜ベースのハイブリダイゼーションより非常に短時間で行 うことができる。更に、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な 一致か、相同的である かの分類を決定することができる。 検索の基準値は、積スコアであり、これは以下の式で定義されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方 が考慮されている。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の 範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、 通常積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、 スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。 検索の結果は、完全長配列、又はその部分が存在するライブラリー、配列の存 在量（abundance）、及びパーセント存在量（percent abundance）のリストとし て報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し、パーセント存 在量は、存在量をライブラリー内で検出された配列の総数で除したものである。 ５ ＨＵＲＩＢＯをコードする配列の延長 インサイト社クローンNo.2181484の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配 列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。一 方のプライマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成し、 他方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成した。こ れらのプライマーを用いて、周知のＨＵＲＩＢＯ配列を「外側に」延長し、対象 の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初 めのプライマーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社）、或いは他の適切な プログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含量を 有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設 計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じるような任意 のヌクレオチドのストレッチの延長は避けた。 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて配列を延長した 。２以上の延長が必要な場合は、既知領域をさらに延長するために追加のプライ マーの組を設計する。 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。４０pmolの各プラ イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合 、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J.Reserch,Watertown MA）を用いて、以 下のパラメータでＰＣＲを行った。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、反応物が配列を 延長することに成功したか否かを決定した。最も大きな生成物或いはバンドを選 択して、ゲルから切り出し、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA）を用い て精製し、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取って再 結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのライゲーション緩衝液内に再溶解し 、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートした。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある ）を、３μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培 地（Sembrook等、上記）で培養した。３７℃で１時間のインキュベーションの後 、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani（LB）寒天（Sembrook 等、上記）上にのせた。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選 択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に 入れられた１５０μｌの液状LB/2xCarb培地で培養した。さらに後日、５μｌの 各一昼夜の培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後 、それぞれ５μｌのサンプルをＰＣＲアレイに移した。 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は以 下の条件に従って行った。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。 同様に配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順を用いて５’調 節配列を得たり、５’延長のために設計されたオリゴヌクレオチドを得たり、及 び適切なゲノムライブラリーを得ることができる。 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤ ＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対から なるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメン トの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO4.06（Nationa l Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏ ｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham ）及びＴ４ポ せて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹 脂カラム（Pharmacia）を用いて精製する。毎分１０⁷カウントのセンス及びアン チセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれを含む部分を、エンドヌクレアーゼAseI ，BglII，EcoRI，PstI，Xba1或いは 的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン 膜（Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH）にトランスファーする。ハ イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り 除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシ ル硫酸ナトリウムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄する。 XOMAT AR^TMフィルム（Kodak,Rochester,NY）を、Phosphoimager cassette（Mole cular Dynamics,Sunnyvale,CA）においてブロットに数時間露光した後、ハイブ リダイゼーションパターンを視覚的に比較する。 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作るために、ここに開示したヌクレ オチド配列を、ヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリズムを用 いて調べる。このアルゴリズムは、その遺伝子に独特な、ハイブリダイゼーショ ンに適した範囲内のＧＣ含量を有し、且つハイブリダイゼーションを妨げるよう な推定される２次構造が存在しない、決まった長さの各オリゴマーを同定する。 このアルゴリズムは、長さ２０ヌクレオチドの２０個の配列特異的オリゴヌクレ オチド（20量体）を同定する。各配列の中央の１個のヌクレオチドだけが変化し ている点を除いて一致しているオリゴヌクレオチドの組が作り出される。このプ ロセスはマイクロアレイにおける各遺伝子について反復され、２０個の20-mers の二重の組が、光照射化学プロセスを用いてシリコンチップの表面上で合成され 配列される（Chee,M．等,PCT/WO95/11995、この引用により本明細書の一部とす る）。 或いは、化学結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いて、基板の表面 上でオリゴマーを合成する（Baldeschweiler,J.D．等，PCT/WO95/25116、この引 用により本明細書の一部とする）。更に別の 形態では、ドットブロット法（スロットブロット法）に類似した「格子型」アレ イを用いて、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを利 用してｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面に配置し結合させる。 アレイは、手を用いることにより、又は市販の材料及び機械を用いることによっ て製造され得、８ドット、２４ドット、９４ドット、３８４ドット、１５３６ド ット、又は６１４４ドットの格子を有している。ハイブリダイゼーションの後、 マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキ ャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされた画像を調べ て、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な 量を求める。 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＵＲＩＢＯをコードする配列或いはその任意の一部分に対して相補的な配列 は、自然発生のＨＵＲＩＢＯの発現を低下又は阻害するために用られる。約１５ 〜約３０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用について特に記 すが、より小さな或いはより大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ方 法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア及びＨＵＲＩＢＯのコーディ ング配列（配列番号：１）を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計すること ができる。転写を抑制するためには、最も独特な５’配列から相補的なオリゴヌ クレオチドを設計し、これを用いてプロモーターが結合するのを阻害する。翻訳 を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＨ ＵＲＩＢＯをコードする転写物に結合するのを阻害する。 ９ ＨＵＲＩＢＯの発現 ＨＵＲＩＢＯの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、 そのベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって 行われる。この場合、前にｃＤＮＡライブラリーの作製の際に用いたクローニン グベクターを用いて、大腸菌においてＨＵＲＩＢＯを発現させる。クローニング 部位の上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろ にはアミノ基末端Met及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。後続のこ れら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多く の独特の切断部位を含むリンカーである。 単離されたトランスフェクト菌株を、IPTGを用いて標準的な方法で誘導し、初 めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長ＨＵ ＲＩＢＯからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は菌培地へのＨ ＵＲＩＢＯの分泌を誘導し、この培地は後の活性のアッセイにおいて直接用いる ことができる。 １０ ＨＵＲＩＢＯ活性の確認 ＨＵＲＩＢＯの活性についてのアッセイが、Rosenberg,H.F.及びDyer,K.D.(19 95)J.Biol.Chem.270:21539-21544）に記載されていた。具体的には、５００ｎｇ のＨＵＲＩＢＯを含む４０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）の０．８ｍｌ に、酵母菌ｔＲＮＡ（Catalog # R-9001;Sigma）の４ｍｇ／ｍｌ溶液の５μｌ（ ２０μｇ）を加える。３％の過塩素酸を含む２０ｍＭの窒化ランタンの０．５ｍ ｌを加えることにより、所定の時間で反応を止める。酵母菌ｔＲＮＡを添加する 前に、リン酸及びＨＵＲＩＢＯを含む反応混合物に停止溶液を加えることにより 、ｔ＝０の対照標準を調製する。停止した反応物を１５分間氷冷し、不溶性のｔ ＲＮＡを遠心分離により取り除く。可溶化ＲＮＡの量は、上清分画の２６０ｎｍ （Ａ₂₆₀）での紫外線吸収度と、ｔ＝０の対照標準の紫外線吸収量の差から、１ 単位のＡ２６０＝４０μｇのＲＮＡの標準値を用いて求めた。ミカエリス定数Ｋ_m 及びターンオーバー数ｋ_catは、 可溶化ＲＮＡの量を縦軸に、時間を横軸にとって作成したプロットにより求める 。 １１ ＨＵＲＩＢＯ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電 気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＨＵＲＩＢＯを用いる。 配列番号：２から類推されるアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社） を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当 業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するため に用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、 適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel等（上記）の論文他に記 載されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ プチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、 Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（Ｋ ＬＨ、Sigma,St.Louis,MO）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおい てオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の 抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ 素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＵＲＩＢＯの精製 自然発生ＨＵＲＩＢＯ或いは組換えＨＵＲＩＢＯは、ＨＵＲＩＢＯに特異的な 抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができ る。イムノアフィニティーカラムは、CnBr-activated Sepharose（Pharmacia Biotech社）のような活性化クロマトグラフレジンとＨＵ ＲＩＢＯ抗体とを共有結合させることにより構築される。結合後、そのレジンを 使用説明書の指示に従って、ブロックし洗浄する。 ＨＵＲＩＢＯを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムを ＨＵＲＩＢＯを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下におい て高イオン強度バッファで）洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＵＲＩＢＯ結合 を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファ、或いは高濃度の尿素または チオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＨＵＲＩＢ Ｏを回収する。 １３ ＨＵＲＩＢＯと相互作用する分子の同定 ＨＵＲＩＢＯ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬 （Bolton,A.E.及びW.M.Hunter(1973)Biochem.J.133:529-38）で標識する。マル チウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＵＲＩＢＯと ともにインキュベートし、洗浄して、標識ＨＵＲＩＢＯ複合体を有する任意のウ ェルをアッセイする。異なる濃度のＨＵＲＩＢＯを用いて得られたデータを用い て、候補の分子とＨＵＲＩＢＯの会合、親和性、数の数値を計算する。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、引用により本明細書の一部とする。 本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変は、本発明の範囲及び精神から 逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連 して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当 に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するた めに記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の専門家に は明らかなように、請求の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/00 1/21 9/22 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/00 1/68 Ａ 9/22 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含む実質的に精製されたヒトリ ボヌクレアーゼ。 ２．請求項１のヒトリボヌクレアーゼをコードする単離され精製されたポリヌク レオチド配列。 ３．請求項２のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズするポ リヌクレオチド配列。 ４．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ５．配列番号：２又はその変異配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド 配列。 ６．請求項５のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ７．請求項２のポリヌクレオチド配列又はその変異配列に相補的なポリヌクレオ チド配列。 ８．請求項７のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ９．請求項２のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクター。 １０．請求項９のベクターを含む宿主細胞。 １１．配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドの製造方法 であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項１０の宿主細胞を培 養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと を特徴とする配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドの製 造方法。 １２．配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたヒトリボヌクレ アーゼを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物。 １３．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 １４．請求項１のポリペプチドの活性を変調する精製されたアゴニスト。 １５．請求項１のポリペプチドの効果を低下させる精製されたアンタゴニスト。 １６．過剰な細胞増殖に関連する疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、有効な量の請求項１２の医薬品組成物を投与 する過程を含む過剰な細胞増殖が関連する疾患の治療方法。 １７．炎症の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、有効な量の請求項１２の医薬品組成物を投与 する過程を含む炎症の治療方法。 １８．細胞増殖を刺激する方法であって、 有効な量の請求項１５のアンタゴニストを細胞に与える過程を含む細胞増殖を 刺激する方法。 １９．アポトーシスに関連する疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、有効な量の請求項１５のアンタゴニストを投 与する過程を含むアポトーシスに関連する疾患の治療方法。 ２０．生物学的サンプルにおけるヒトリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレ オチドの検出方法であって、 （ａ）請求項７のポリヌクレオチドと、生物学的サンプルの核酸材料とをハイ ブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合 体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるヒトリボヌクレアーゼをコードする ポリヌクレオチドの存在の相関性を有する、該過程とを含むことを特徴特徴とす る生物学的サンプルにおけるヒトリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチ ドの検出方法。