JP2002502500A - 小さなサンプル容量中の被検体の測定のための電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 液体サンプル中の被検体の電気化学的分析に用いるための装置であって、非伝導性基体（１）と、該基体上に置かれ、２部（２ａ，２ｂ）からなり、それらの間の非伝導性空隙（８）を規定する伝導性層と、該空隙の一方の側の、前記伝導性層上にコートされた被検体特有の試薬（５）と、前記空隙の他方の側の、前記伝導性層上の標準電極（３）と、前記伝導層上に置かれたスペーサー層（４）と、前記試薬、前記標準電極及び前記スペーサー層を覆うように置かれた、界面活性剤又はカオトロピック剤でコートされたモノフィラメントメッシュ（６）と、該メッシュ層に付着するが同一の広がりを有さないことにより前記メッシュ上にサンプル適用領域（９）を供する第２の非伝導性層（７）と、を含む装置。

Description

【発明の詳細な説明】 小さなサンプル容量中の被検体の測定のための電極 発明の分野 本発明は、少量のサンプルを受け入れることができる電極装置に、並びに小さ なサンプル容量中に存在するテスト種の検出及び定量のためのテスト方法におけ るそれらの使用に関する。 発明の背景 少量のサンプル材料を受け入れることができ、光学的又は電気的過程のいずれ かで、サンプル中に存在する被検体が応答するのを許容する多くの装置が開示さ れている。特に、毛管作用により充填することができるサンプルチャンバーの使 用及び構造が特許及び科学文献の両方に記載されている。例えば、EP-A-0170375 及びUS-A-5141868を参照のこと。 このような周知の装置は、毛管作用によるサンプルの導入を許容するために十 分に小さい寸法である空洞内に収容され、関心の被検体に特異的な試薬系でコー トされた非伝導性基質が析出した電極を含み得る。そのサンプルは電極のすぐ近 くに保持され、その電極はサンプルの特定の電気特性の測定を容易にするように 電極が形づくられている。 このような装置は多数の欠点を有し、特に、極めて厳しく規定された制限内で 空洞の寸法を調節する必要がある。これらの製造許容度を超えると、サンプルが 毛管作用により空洞に入らないであろう。 更に、粘性のサンプル流体、例えば血液をその空洞に導入する場 合、そのチャンバーは、比較的ゆっくりとサンプルで満たされ、これにより分析 を完了するのにかかる時間を遅らせるであろう。サンプル粘度及びこれによるサ ンプル表面張力特性の変化は充填時間を変化させ；これは全分析時間を害するば かりでなく、より重要なのは、分析結果を不正確にすることである。なぜなら、 サンプルを被検体特異的試薬に露出するのにかかる時間が変化するからである。 WO-A-9730344は、サンプルを基準電極に導くのに適合したポリエステルメッシ ュを含む電極装置を開示する。この装置は、試薬が、サンプルの取扱いのバリエ ーションに関連した問題を避けるため、及びグルコーステストのため、サンプル のヘマトクリットと独立するため、疎水性及び親水性表面領域の両方を有する充 填剤を含むことを必要とする。 発明の記載 本発明によれば、少い流体サンプル容量中に存在する被検体のレベルを電気化 学的に測定することができる装置は、被検体特異的試薬でコートされ非伝導性基 体上に置かれた伝導層と、厚膜印刷により該非伝導性基体上に置かれたスペーサ ー層と、界面活性剤及び／又はカオトロピック試薬でコートされたモノフィラメ ントメッシュ材料であって該メッシュが前記スペーサー層上に重層されているも のと、該メッシュ層に付着した第２の非伝導性基体と、を含む。これにより、そ の装置は、多層構造であり、印刷されたスペーサー層により分離され、サンプル の導入のため一端が開口した空洞又は領域を形成する２つの表面を含む。この空 洞又は領域は、第２の基質を超えて広がり、サンプル適用領域を形成するメッシ ュ材料で満たされる。 本発明による装置は、 （ａ）第１の非伝導性基体上に、ポリマーバインダー中の炭素及びグラファイ トの伝導性層を置き； （ｂ）該第１の伝導性層に隣接するが連続していない標準／対極電極として機 能するための銀／塩化銀からなる第２の伝導層を置き； （ｃ）該第１の伝導性層の表面を、サンプル材料中の１又は複数の被検体と特 異的に反応する試薬又は試薬の混合物でコートし； （ｄ）前記第１及び第２の伝導性層の各々の一部を露出したままにするように 、前記第１の非伝導性基体の上及び前記第１の伝導性層の上に厚膜印刷によりス ペーサー層を形成し； （ｅ）該スペーサー層の上にコートされたメッシュ材料を配置してそれを該ス ペーサー層に永久的に固定化し； （ｆ）メッシュの拡張領域を露出したままにするように、前記メッシュ材料の 上に第２の非伝導性基体を配置してそれを永久的に固定化し； （ｇ）前記メッシュをサンプルで湿らせることにより、装置の検出領域を満た し又は注ぎ込むように、前記拡張領域にサンプルを適用し；そして （ｈ）前記第１の伝導性層上での前記試薬との反応により、サンプル中の被検 体を定量すること により生産され、使用され得る。 本電極装置は、少量のサンプル（典型的には２μｌ未満）をメッシュ拡張部に 適用するのを許容する。この後、装置の検出領域がサンプルで満たされ、それは 測定電極と近密に接触する。空洞は、その空洞の端で、露出したメッシュの上に 一滴のサンプル液をおくことにより又は空洞の端をサンプルに接触させることに より満たすことができる。 発明の記載 添付の図面は詳述目的のためだけに供する。 図１Ａは本発明を具体化する検出装置の概略側面図である。 図１Ｂは、図１Ａに示す実施形態の一部の平面図である。 より詳しくは、本図面は、非伝導性シート１、及びその上に置かれた２部２ａ ，２ｂの伝導性電極を示す。２ａの部分は標準／対極電極３を有し、そして２ｂ の部分は試薬層５を有する。２ａ，２ｂの部分はスペーサー層４も有する（これ 及び以下に記載する他の部品は図１Ｂに示さない。この図は、単に電気的配置を 示すためだけに供する）。メッシュ材料６は電極３、スペーサー４及び試薬層５ 上に重層される。テープ７はメッシュ材料６の上に供される。 装置の検出領域８は、伝導層の各々の部分の間及びこれにより試薬と標準電極 との間に規定される。メッシュ材料はテープ７と同一の広がりを有さず、それに よりサンプル適用領域９を規定する。使用において、領域９に適用されるサンプ ルは、それが領域３，５及び８に流れるように、メッシュ６により保持される。 サンプル中の被検体の存在は、現在、電気化学的に測定することができる。 発明の記載 メッシュ材料は、（第１の基体上の）スペーサー層と第２の基体との間に挿入 され、その表面上にコートされた湿潤剤により表面張力及び／又はサンプルの粘 度を減少させるように機能する。メッシュの拡張部分へのサンプルの適用は、メ ッシュコーティング材料をサンプル中に溶かし、サンプル表面張力を減少させ、 そしてサンプルを装置の空洞に流す。サンプルは、メッシュ上にコートされた湿 潤試薬の欠如下では装置の空洞に入らないであろう。あるいは、完全な細胞の存 在により特定の被検体の測定が悪影響を受ける、血液 のような複合サンプルにおいては、例えば電極表面に毒を塗ることにより、メッ シュを接触した細胞を溶解する剤でコートすることができ；これは、完全な細胞 の干渉を除去しながら、同時にサンプル粘度を減少させる更なる利点を有する。 本システムは、一つの電極として、微小電極として、又は微小電極アレイとし て供することができる。電極は、同じ基体上に置かれた標準／対極電極と合わせ て用いることができる。 非伝導性基体材料は、例えばポリエステル、ポリカーボネート、ポリビニルク ロライド、高密度ポリプロピレン又は低密度ポリプロピレンのシートであり得る 。好ましい実施形態において、ポリエステルシート材料は処理前のポリエステル 材料に寸法の安定性を与えるために、伝導性層の適用前に熱安定化される。 伝導層は、好ましくはグラファイト、炭素及びポリマーバインダーを含む。例 えば、グラファイト成分は20μｍまで、例えば１〜20μｍの平均粒径、50ｍ²／ ｇ、例えば１〜50ｍ²／ｇの典型的な表面領域を有する。それは本質的に伝導性 であり；それは、天然のソースから得られ、又は合成して生産することができる 。炭素成分は、好ましくは１μｍ未満、例えば５〜70nmの平均粒径、及び150ｍ² ／ｇ未満の典型的な表面領域を有する。グラファイト成分と同様に、それも、本 質的に伝導性である。 ポリマーバインダーは、熱硬化性又は熱可塑性のいずれであってもよい。それ は、多様なポリマーファミリー、例えばビニルクロライド、ビニルアセテート、 ビニルアルコール（及びビニルクロライド、アセテート及びアルコールのコポリ マー）、炭化水素類、エチル及びメチルセルロース、エポキシ類、ポリエステル 、アルキド樹脂、並びにポリマーを架橋させることができるカルボキシル、ヒド ロキシル、アミン、チオール、エステル、エポニシ及びアミド基の ような官能性反応基を含むポリマーのいずれかから得ることができる。 伝導性電極材料は、慣用的な印刷法、例えば厚膜印刷（スクリーン印刷とも呼 ばれる）、リトグラフィー、凸版印刷、真空めっき、スプレーコーティング、イ ンクジェント印刷、レーザージェット印刷、ローラーコーティング又は真空蒸着 によって非伝導性基体上に置くことができる。伝導性電極材料の配置の後、ポリ マーバインダーは、いくつかの慣用的な工程、例えば強制空気乾燥、高温での強 制空気乾燥、赤外照射、紫外照射、イオンビーム照射又はガンマ照射によって安 定化し、又は硬化させることができる。これらの工程は、全て、ポリマーバイン ダーの個々の分子の架橋の程度を変えることができる。紫外照射の使用は、ポリ マー架橋反応を始めるために、伝導性電極材料に感光性試薬を含めることを必要 とする。 第１の伝導性層の上に位置した試薬は、サンプル中の被検体の濃度を測定する ために必要な固体状態の全ての成分を含むことを特徴とする。このような成分に は、酵素、酵素補因子、補酵素、共通基質、抗体又は他の被検体結合パートナー 、DNA又はRNA、酸化還元パートナー、緩衝液、イオン透過担体及び塩がある。 試薬は、マトリックス、バインダー及び他の成分のための安定剤も含み得る。 例えば、適切なマトリックスには、グラファイト、炭素、シリカ、ガラス、ラテ ックス又はポリビニルクロライドの粒子がある。適切なバインダーには、ポリビ ニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリジン、タンパク質、 セルロース及びセルロースアセテートがある。適切な安定剤には、アルコール、 エステル、タンパク質、タンパク質加水分解物及び単純な及び複雑な炭化水素が ある。 試薬は、各々が特定の成分を含んだいくつかの個々に適用される 層を含み得る。その組成は、流体サンプルに接触した時、少くとも部分的に溶解 するような組成である。 試薬は、慣用的な析出工程、例えば厚膜印刷（スクリーン印刷とも呼ばれる） 、リトグラフィー、凸版印刷、真空めっき、スプレーコーティング、インクジェ ット印刷、レーザージェット印刷、ローラーコーティング又は真空蒸着により、 第１の伝導性層上に置くことができる。これらの配置工程の組合せは、多層を作 製するのに用いることができる。試薬の配置の後（又は各々の個々の層の配置の 後）、その層は、いくつかの慣用的な方法、例えば上述の方法により、ポリマー バインダーの個々の分子の架橋を行うために、安定化させ、硬化させることがで きる。 スペーサー層は、慣用的な厚膜析出法により第１の非伝導性基質上に析出させ ることができ、そしてポリマーバインダーの個々の分子を架橋するために、いく つかの慣用的な工程、例えば上述のものによって安定化し又は硬化させることが できる。スペーサー層の厚さは、いくつかのパラメータ、例えば印刷条件（圧力 、速度、スクリーン張力及びエマルションの厚さ）及びインク特性、例えば固体 成分及び粘度によって調製することができる。 メッシュ層は、好ましくは、合成、モノフィラメント、編んだ材料である。そ れは、ポリエステル又はナイロンから作ることができる。メッシュは、界面活性 材料、界面活性剤又は湿潤もしくは溶解剤でコートされる。例えば、フッ素界面 活性剤、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤 、サポニン及びコール酸ナトリウムがある。 本発明の電極は、いくつかの要求される特徴を有する。例えば、本装置は、極 めて少量、典型的には２μｌ未満のサンプル、例えば完全な血液、血漿、血清、 間質液、汗又は唾液を要求する。サンプ ルがサンプル空洞を満たした時、サンプルの極めて薄い膜が析出した試薬の表面 を横切って広がり、試薬との接触を最大にし、そして試薬をサンプル中に迅速に 溶解させる。これにより、定常状態に迅速に達することができる。 本装置の好ましい実施形態において、空洞は装置の縁の端に位置する。この装 置は、テストストリップの縁をサンプルに接触させることにより、サンプルで直 ちに満たされ得る。別の好ましい実施形態において、空洞は装置の縁から０〜２ mmに位置し、これによりサンプルを収集するために、（皮膚の穿刺した領域のよ うな）表面に沿ってこすられ得るテストストリップの領域を露出し得る。 本発明の電極は、電極において電子の除去又は付加により直接、酸化又は還元 され得る被検体／種；電極において電子の除去又は付加により直接、酸化又は還 元され得る生成物に、酵素又は一連の酵素により迅速に変換され得る被検体／種 ；後に電子の付加／除去により直接、酸化又は還元され得る酵素補因子の同時の 酸化又は還元を伴って、酵素により生成物に変換され得る被検体／種；酵素が電 極から直接、電子を通過させ又は受容することができるように、電極表面に近密 に接触する酵素により生成物に変換され得る被検体／種の分析のために用いるこ とができる。その新規装置は、特にグルコースセンサーとして用いるのに適する 。この場合、試薬は、好ましくは、グルコースデヒドロゲナーゼであり；これは 、サンプルのヘマトクリットと実質的に独立したグルコースの読み取りを供する ことができる。 以下の例は本発明を詳述する。 実施例 伝導性インク材料を、スクリーン印刷法により、非伝導性ポリエ ステルシート材料(125μｍ厚)に印刷する。その伝導性インク材料は、グラファ イト粒子（平均粒径１μｍ、表面領域15ｍ²／ｇ）、伝導性炭素粒子（平均粒径4 0nm、表面領域100ｍ²／ｇ）、及び有機溶媒中のビニルクロライド／アセテート コポリマーバインダーの混合物からなる。伝導性インクの析出後、強制空気オー ブン内で溶媒を除去する一方、温度を上昇させて二官能性アミンによりポリマー バインダーの化学的架橋を開始する。 銀／塩化銀、スクリーン印刷標準／対極電極をポリエステル支持体上の伝導性 炭素層に隣接して配置する。次に、スペーサー層を、伝導性炭素電極の一部を残 し、標準／対極電極の全てを露出するように、スクリーン印刷する。 グルコースの測定に特有の多層試薬混合物を調製する。それは、２，６−ジク ロロフェノールインドフェノール、ナイルブルー、メドラ（Medola）ブルー又は 酵素補因子NADHのためのいずれかの他の適切なメディエーターを含み、それを、 ピペッティングにより水溶液から露出した伝導性炭素／グラファイト層上に析出 させ、そして伝導性炭素／グラファイト層上にコートされたメディエーターの膜 を残すように乾燥させる。グラファイト、NAD⁺、緩衝塩、界面活性剤、安定剤及 びレオロジー改質剤の混合物からなる第２の層を厚膜印刷により析出させる。次 にこれを乾燥させる。グルコースデヒドロゲナーゼ(NAD依存性)の水溶液、緩衝 塩及び安定剤からなる第３の層をピペッティングにより配置する。次にそれも乾 燥させる。 界面活性剤でコートしたモノフィラメントメッシュ材料はスペーサー層の上に おき、第２のスペーサー層の厚膜析出により固定する。一側面を感圧接着剤でコ ートした75μｍ厚ポリエステルテープ材料を含む第２の非伝導層を、メッシュの 拡張領域を露出したままにするようにモノフィラメントメッシュの上におく。そ の露出した領 域はサンプル適用ゾーンとして機能する。 適切な電位差を伝導性炭素と塩化銀標準電極との間に適用した時、本電極装置 は、クロノアンペロメトリーのような標準的な電気化学的技術を用いて、血液の サンプル中のグルコースの測定のために用いることができる。グルコースは、NA D⁺依存性グルコースデヒドロゲナーゼの作用により、NAD⁺のNADHへの変換を同時 に伴ってグルコノラクトンに変換され、そしてNADHはメディエーター化合物によ りNAD⁺に再び酸化される。次に、メディエーター化合物は電極表面において再び 酸化されて、その生成される電流は、サンプル中のグルコースの濃度に比例する 。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年５月１４日（１９９９．５．１４） 【補正内容】 請求の範囲 １．液体サンプル中の被検体の電気化学的分析に用いるための装置であって、 非伝導性基体と、 該基体上に置かれ、２部からなり、それらの間の非伝導性空隙を規定する伝導 性層と、 該空隙の一方の側の、前記伝導性層上にコートされた被検体特有の試薬と、 前記空隙の他方の側の、前記伝導性層上の標準電極と、 前記伝導層上に置かれたスペーサー層と、 前記試薬、前記標準電極及び前記スペーサー層を覆うように置かれた、界面活 性剤又はカオトロピック剤でコートされたモノフィラメントメッシュと、 該メッシュ層に付着するが同一の広がりを有さないことにより前記メッシュの １つの縁にサンプル適用領域を供する第２の非伝導性層と、 を含む装置。 ２．前記試薬が、疎水性及び親水性表面領域の両方を有する充填剤を含まない ことを特徴とする請求項１に記載の装置。 ３．前記被検体がグルコースであり、前記試薬がグルコースデヒドロゲナーゼ であることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。 ４．前記メッシュが界面活性剤で処理されることを特徴とする先の請求項のい ずれかに記載の装置。 ５．前記メッシュが、細胞溶解剤で更にコートされていることを特徴とする先 の請求項のいずれかに記載の装置。 ６．前記伝導性層が、グラファイト粒子、炭素粒子及びポリマーバインダーを 含むことを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の装置。 ７．前記グラファイト粒子が１〜20μｍの平均粒径及び１〜50ｍ²／ｇの表面 領域を有し、前記炭素粒子が、５〜70nmの平均粒径及び150ｍ²／ｇ未満の表面領 域を有することを特徴とする請求項６に記載の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨン−ヒン，バーナデット イギリス国，ケンブリッジ シービー４ １エックスティー，ダウハムズ レーン, ダウハムズ ハウス，ケンブリッジ セン サーズ リミティド (72)発明者 ブレア，ニール イギリス国，ケンブリッジ シービー３ ７エックスユー，ハードウィック，ライム ズ ロード 122

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液体サンプル中の被検体の電気化学的分析に用いるための装置であって、 非伝導性基体と、 該基体上に置かれ、２部からなり、それらの間の非伝導性空隙を規定する伝導 性層と、 該空隙の一方の側の、前記伝導性層上にコートされた被検体特有の試薬と、 前記空隙の他方の側の、前記伝導性層上の標準電極と、 前記伝導層上に置かれたスペーサー層と、 前記試薬、前記標準電極及び前記スペーサー層を覆うように置かれた、界面活 性剤又はカオトロピック剤でコートされたモノフィラメントメッシュと、 該メッシュ層に付着するが同一の広がりを有さないことにより前記メッシュ上 にサンプル適用領域を供する第２の非伝導性層と、 を含む装置。 ２．前記試薬が、疎水性及び親水性表面領域の両方を有する充填剤を含まない ことを特徴とする請求項１に記載の装置。 ３．前記被検体がグルコースであり、前記試薬がグルコースデヒドロゲナーゼ であることを特徴とする請求項１又は２に記載の装置。 ４．前記メッシュが界面活性剤で処理されることを特徴とする先の請求項のい ずれかに記載の装置。 ５．前記メッシュが、細胞溶解剤で更にコートされていることを特徴とする先 の請求項のいずれかに記載の装置。 ６．前記伝導性層が、グラファイト粒子、炭素粒子及びポリマー バインダーを含むことを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の装置。 ７．前記グラファイト粒子が１〜20μｍの平均粒径及び１〜50ｍ²／ｇの表面 領域を有し、前記炭素粒子が、５〜70nmの平均粒径及び150ｍ²／ｇ未満の表面領 域を有することを特徴とする請求項６に記載の装置。 ８．液体サンプル中の被検体の電気化学的分析のための方法であって、該サン プルを、先の請求項のいずれかに記載の装置の前記適用領域に適用し、そして前 記被検体を、前記試薬との反応により定量することを含む方法。