JP2002502262A - 高等植物の色素体におけるトランスジーン発現用色素体プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、高等植物の色素体を安定に形質転換するために有用なプロモーターエレメントを提供する。本明細書に記載の構築物は、核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼ、色素体にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼまたはその両方によって転写される特有のプロモーターを含む。本発明の新規構築物を使用することによって、より広範な植物種の形質転換が容易になり、多細胞植物の色素体における形質転換ＤＮＡの偏在性発現が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】 高等植物の色素体におけるトランスジーン発現用色素体プロモーター 米国特許法第２０２（ｃ）条に従って、米国政府が、部分的に米国科学財団認 可番号ＭＣＢ９６−３０７６３からの基金を用いて実施された本明細書に記載の 発明に特定の権利を有すること認める。 発明の分野 本発明は、植物遺伝子操作、特に高等植物における色素体形質転換に関する。 本発明は、種々の植物種における目的外来遺伝子の発現に有用な新規プロモータ ー配列を提供する。 発明の背景 葉緑体遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラーゼのα、βおよびβ’サブ ユニットに相同な色素体にコードされるサブユニットを含有するＲＮＡポリメラ ーゼによって転写される。この酵素によって利用されるプロモーターは、−３５ および−１０コンセンサスエレメントからなるＥ．ｃｏｌｉ σ⁷⁰プロモーター に類似している（Ｇ．Ｌ．ＩｇｌｏｉおよびＨ．Ｋｏｓｓｅｌ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅ ｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１０，５２５，１９９２；Ｗ．Ｇｒｕｉｓｓｅｍおよ びＪ．Ｃ．Ｔｏｎｋｙｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１２：−１ ９，１９９３）。色素体にコードされるＲＮＡポリメラーゼによるプロモーター の選択は、核にコードされるシグマ様因子に依存する（Ｌｉｎｋら，１９９４， Ｐｌａｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａ ｃｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，６３− ８３頁）。さらに、いくつかのプロモーターからの転写活性は、コアプロモータ ーの上流のエレメントと相互作用する、核にコードされる転写因子によって調節 されている（Ｌ．Ａ．ＡｌｌｉｓｏｎおよびＰ．Ｍａｌｉ ｇａ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：３７２１−３７３０；Ｒ．Ｉｒａｔｎｉ，Ｌ．Ｂ ａｅｚａ，Ａ．Ａｎｄｒｅｅｖａ，Ｒ．Ｍａｃｈｅ，Ｓ．Ｌｅｒｂｓ−Ｍａｃｈ ｅ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８，２９２８，１９９４，Ｓｕｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌ．９：５６５０−５６５９，１９８９）。これらの因子は、発達刺 激および環境刺激に応答しての色素体遺伝子発現の核制御を媒介する。 色素体において第２の核にコードされるポリメラーゼの転写系が存在すること が実証されている。しかし、この系の新規調節エレメントを含有する転写開始に 必要な関連する核酸配列は、未だに明らかにされていない。本発明の１つの目的 は、これらの新規遺伝子エレメントを提供することである。これらの調節エレメ ントを特定の色素体指向性ＤＮＡ構築物に組込むことによって、色素体形質転換 に利用可能な植物種におけるより高い可撓性および範囲が可能になり、外来タン パク質および／またはＲＮＡの偏在性発現が容易になり、そしてこの組込みは非 緑色色素体において有用である。 発明の要旨 プロモーターは、遺伝子発現を導くＲＮＡポリメラーゼによる認識および転写 の開始を容易にするために、異なるＤＮＡ配列情報を含んでいる。本発明によっ て、単子葉植物および双子葉植物の両方において機能するプロモーターが見出さ れた。これらのプロモーターエレメントを、より広範な植物種において目的外来 遺伝子を発現させるために効果的に使用し得る。さらに、本発明のプロモーター エレメントは、非緑色組織における外来遺伝子の発現を駆動する。本発明の１つ の目的は、そのようなプロモーターを含有する多細胞植物の色素体を安定に形質 転換するためのＤＮＡ構築物および方法を提供することである。本発明のＤＮＡ 構築物は、形質転換し得る植物種の範囲を拡張する。 色素体にコードされる色素体ＲＮＡ（ＰＥＰ）ポリメラーゼによって認識され るプロモーターは、葉のような光合成組織において十分に特徴付けられている。 非緑色組織における外来タンパク質の発現のためのＰＥＰプロモーターの利用を 本明細 書に示す。本発明の核にコードされる色素体（ＮＥＰ）ポリメラーゼ転写系は、 根、種子、分裂組織および／または葉においても色素体遺伝子の発現を指向させ る。大部分の植物（トウモロコシ、綿およびコムギを含む）において、植物再生 は、体細胞胚形成を介して達成される（すなわち、分裂組織が関与する）。本発 明の好ましい実施態様において、これらの作物における色素体形質転換は、本発 明のＮＥＰおよびＰＥＰ色素体転写系およびプロモーターの使用を介して、多い に容易になる。 本発明の構築物における使用に特に好ましいプロモーターは、単子葉植物およ び双子葉植物の形質転換用のｃｌｐＰ−１１１（配列番号１５、１６、３０およ び３１）プロモーター、ならびに双子葉植物における形質転換用のｐｃｌｐ−５ ３プロモーターである。他の植物種由来の相同なｃｌｐＰプロモーターは、本発 明の範囲内に入ることが意図される。 非緑色組織中の植物色素体における目的外来遺伝子の発現に使用するために好 ましい他のプロモーターは、１６ＳｒＤＮＡオペロンに存在するＰＥＰプロモー ターである(配列番号２８および２９)。本発明における使用に適切なさらなるプ ロモーターエレメントは、ｒｐｏＢおよびａｔｐＢプロモーターである。 本発明のＮＥＰプロモーターを、係属中の米国出願第０８／１８９，２５６号 に記載され、ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，９０，９１３（１９９３）にも記載されるもののような現在利用 可能な色素体形質転換ベクター中に組込む。そのようなベクターを使用するため のプロトコルは、米国特許第５，４５１，５１３号に記載されている。上記で引 用した３つの参考文献の開示を全て本明細書に出典明示で援用する。トランスジ ェニック植物を得るために、非光合成組織の色素体を、ＮＥＰプロモーターから 発現され、核にコードされるポリメラーゼによって転写される選択マーカー遺伝 子とともに形質転換する。同様に、目的外来タンパク質を発現させるために、核 にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＮＥＰプロモータ ーを使用して、非光合成組織における高レベル発現用の発現カセットを構築する 。本発明の別の態様において、本発明のＰＥＰプロモーターを、現在利用可能な 色素体形質転換ベクターおよびその使用のためのプロトコルに組込む。 本発明のなお別の態様において、ＮＥＰ転写系を、二重のＮＥＰ／ＰＥＰプロ モーターの使用を介して、σ⁷⁰型の系と組み合わせてもよい。形質転換ＤＮＡ構 築物において、プロモーターを、縦列に整列させ、目的外来遺伝子のコード領域 に作動可能に連結させる。本明細書で用いる用語、転写単位は、１つ以上の目的 外来タンパク質の本質的なコード領域を含む単離されたＤＮＡセグメントをいう 。そのような転写単位は、エンハンサーエレメントのような遺伝子発現を増強す るための他のシスエレメントを含んでもよい。転写単位を本発明のプロモーター に作動可能に連結させ、その結果転写単位の発現は、このプロモーターによって 調節される。組合せでの使用に特に好ましいプロモーターは、双子葉植物におい てはｃｌｐＰ ＩＩ型ＮＥＰプロモーターと組合せたＰｒｒｎ ＰＥＰプロモー ターであり、単子葉植物および双子葉植物の両方における使用については、ｃｌ ｐＰ Ｉ型ＮＥＰプロモーターと組合せたＰｒｒｎ ＰＥＰプロモーターである 。１つの適切なＰｒｒｎプロモーターは以下の配列（配列番号３２）を有する 上記で列挙するものに対応する種々の植物種由来の相同なＰＥＰおよびＮＥＰ プロモーターも、本発明の範囲内に入ると考えられる。形質転換ＤＮＡは、効率 的な転写終結のために、植物または細菌起源の３’調節領域も含む。例示的な３ ’調節領域を図１３、配列番号２７に示す。 図面の簡単な説明 図１は、緑色（Ｇ）および白色（Ｗ）ｉｏｊａｐトウモロコシ葉におけるＲＮ Ａ定常状態濃度を示す一連のオートラジオグラフを示す。負荷について制御する ために、上記に示すブロットを記載(Ｄｅｍｐｓｅｙら，Ｍｏｌ．Ｐｌａｎ Ｐ ａｔｈ．８３：１０２１−１０２９，１９９３)のように細胞質２５Ｓリボソー ムＲＮＡについて再プローブした（下のパネル）。 図２Ａおよび２Ｂは、ｃｌｐＰプロモーターのマッピングのための緑色（Ｇ） および白色（Ｗ）ｉｏｊａｐトウモロコシ葉に対するプライマー伸張分析の結果 を示 す１対のオートラジオグラフである（図２Ａ）。数字−１１１は、ＡＴＧ翻訳開 始コドンに対しての転写物の５’末端を指す。図２Ｂは、一次転写物の５’末端 を同定するためのインビトロキャッピングおよびＲＮａｓｅ保護アッセイの結果 を示すオートラジオグラフである。ＲＮａｓｅ保護構築物は短く、７９ｎｔのフ ラグメントのみを保護することに留意のこと。分子量（ＭＷ）マーカーの大きさ （１００、２００、３００、４００および５００ヌクレオチド）も示す。 図３Ａおよび３Ｂは、トウモロコシｒｐｏＢプロモーターのマッピングを示す 。図３Ａは、緑色（Ｇ）および白色（Ｗ）ｉｏｊａｐトウモロコシ葉由来のＲＮ Ａのプライマー伸張分析の結果を示すオートラジオグラフである。数字−１４７ は、転写物の５’末端を指す。図３Ｂは、一次転写物の５’末端を同定するため のインビトロキャッピングおよびＲＮａｓｅ保護アッセイの結果を示す。ＲＮａ ｓｅ保護構築物は短く、７４ｎｔのフラグメントのみを保護することに留意のこ と。分子量(ＭＷ)マーカーの大きさ（１００、２００、３００、４００および５ ００ヌクレオチド）も示す。 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、ａｔｐＢプロモーターのマッピングを示す。図４ Ａは、緑色（Ｇ）および白色（Ｗ）ｉｏｊａｐトウモロコシ葉由来のＲＮＡのプ ライマー伸張分析の結果を示す。数字−２９８および−６０１は、転写物の５’ 末端を指す。図４Ｂは、一次転写物の５’末端を同定するためのインビトロキャ ッピングおよびＲＮａｓｅ保護アッセイの結果を示す。ＲＮａｓｅ保護構築物は 短く７９ｎｔのフラグメントのみを保護することに留意のこと。分子量（MW）マ ーカーの大きさ（１００、２００、３００、４００および５００ヌクレオチド） も示す。図４Ｃは、ａｔｐＢ−ｒｂｃＬ遺伝子間領域の物理地図を示す。ＮＥＰ およびＰＥＰプロモーターについての一次転写物の５’末端のマップ位置をそれ ぞれ黒丸および白丸で示す。 図５Ａは、ＮＥＰプロモーター転写開始部位に隣接するＤＮＡ配列のアライン メントを示す。転写開始部位を示す（黒丸）。有意な類似性を有する領域を四角 で囲む（Ｂｏｘ ＩおよびＢｏｘ ＩＩ）。厳密でない１０ｎｔの双子葉植物Ｎ ＥＰコンセンサスに対応する配列に細い下線を付す。トウモロコシにおけるｃｌ ｐＰ−１ １１プロモーター領域を太い下線で示す。図５Ａは、それぞれトウモロコシにお けるｒｐｏＢ（配列番号１）、ａｔｐＢ（配列番号２）およびｃｌｐＰ（配列番 号３）プロモーター領域を示す。トウモロコシ、モロコシ、オオムギ、コムギお よびイネにおけるａｔｐＢプロモーターのアラインメントおよびヌクレオチド配 列を図５Ｂに示し、これらはそれぞれ配列番号４、５、６、７および８に対応す る。図５Ｃはトウモロコシ（配列番号９）、イネ（配列番号１０）およびタバコ （配列番号１１）のｒｐｏＢ配列のアラインメントを示す。トウモロコシ（配列 番号１２）、イネ（配列番号１３）およびコムギ（配列番号１４）におけるｃｌ ｐＰ配列のアラインメントを図５Ｄに示す。 図６は、タバコ（配列番号１５）およびイネ（配列番号１６）の色素体ｃｌｐ Ｐプロモーター領域の配列アラインメントを示す。ＮＥＰ転写開始部位を黒丸で 示し、ＰＥＰ転写開始部位を白丸で示す。第３のタバコＮＥＰプロモーターは示 す配列の外側に存在する。ｃｌｐＰコード領域を四角で囲む。ＩＩ型タバコＰｃ ｌｐＰ−５３プロモーター周辺の２９ｂｐの共通相同領域に下線を付す。 図７はプラスミドｐＤＳ４４の色素体標的化領域の模式図である。上方にキメ ラｕｉｄＡ遺伝子の制限地図を示す。ＰｃｌｐＰは、図５の下部に示すＳａｃＩ 部位とＮｃｏＩ部位との間のイネｃｌｐＰプロモーターフラグメントである（配 列番号１７）。ｕｉｄＡはβ−グルクロニダーゼレポーター酵素をコードする。 Ｔｒｐｓ１６は、ｒｐｓ１６リボソームタンパク質遺伝子の３’非翻訳領域であ る。ｐＰＲＶ１１１Ａ色素体ベクター（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ登録番号Ｕ１２８１ ２）中の形質転換ＤＮＡのマップも示す(Ｚｏｕｂｅｎｋｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３８１９−３８２４，１９９４)。 図８Ａおよび８Ｂはトランスジェニックタバコ色素体におけるイネｃｌｐＰプ ロモーター領域のプロモーター活性を示す。図８Ａは、イネＰｃｌｐＰ::ｕｉｄ Ａ::Ｔｒｐｓ１６キメラ遺伝子上流のＲＮＡ５'末端をマッピングするためのプ ライマー伸張分析の結果を示す。プライマー伸張分析を、野生型（ｗｔ）および トランスプラストム（transplastomic）（Ｔ）タバコ植物の葉から単離した全細 胞ＲＮＡに対して実施した。数字（−６１、−１１１、−１３６、−１６９、１ ７７）は、マッ ピングされた、イネｃｌｐＰ遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンに対しての５’末端 のヌクレオチド位を指す。図８Ｂは、イネ（Ｏｓ）およびタバコ（Ｏs ｉｎ Ｎｔ）におけるイネｃｌｐＰプロモーター領域ならびに野生型タバコｃｌｐＰ遺 伝子（Ｎｔ）の上流にマッピングされたＲＮＡの５’末端の模式図である。相同 な系において同定されたプロモーターを示す（ＮＥＰ、黒丸、ＰＥＰ、白丸）。 数字は翻訳開始コドンからの距離を示す（ＡＴＧ上流のヌクレオチドが−１位で ある）。 図９は、色素体ｃｌｐＰ転写開始部位周辺で保存されているＤＮＡ配列のアラ インメントを示す。配列をＭａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｋｏ ｃｈｉ）（配列番号１８）、Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ（Ｃｌａｒｋｅ）（ 配列番号１９）、ホウレンソウ（Ｗｅｓｔｈｏｆ）（配列番号２０）、タバコ（ Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９７７）（配列番号２１）、イネ（配列番号２ ２））、トウモロコシ（配列番号２３）およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（配列番 号２４）について整列させた。野生型ＲＮＡ ５’末端を黒丸で示す。イネｃｌ ｐＰ−ｕｉｄＡキメラｍＲＮＡの−６１ ５’末端をアステリスクで示す。少な くとも５つの種において同一である場合、保存ヌクレオチドを四角で囲む。翻訳 開始コドンに陰影を付す。 図１０は、プラスミドｐＰＳ１８の色素体標的化領域を示す。プラスミドｐＰ Ｓ１８は、ＰｃｌｐＰ−５３（−２２／＋２５）プロモーターから発現されるキ メラｕｉｄＡ遺伝子を含む、色素体ベクターｐＰＲＶ１１１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号Ｕ１２８１２）の色素体標的化領域を有する。ｕｉｄＡ遺伝子のＤＮＡ 配列を図１３に示す（配列番号２７）。 図１１は、プロモーター活性について試験したｃｌｐＰ ５’フラグメントを 示す。最大のセグメントは、それぞれＩＩ型ＮＥＰおよびＰＥＰプロモーター由 来のＰｃｌｐＰ−５３およびＰｃｌｐＰ−９５転写開始部位を含む。境界に、Ｐ ｃｌｐＰ−５３転写開始部位（＋１）からのヌクレオチドでの距離を示す。配列 番号２５は、−２２と＋２５との間に存在する配列を含み、配列番号２６は、− １０と＋２５との間に存在するヌクレオチドを示す。両方の配列はプロモーター として機能する。 図１２は、図１１中に含まれるｃｌｐＰ ５’フラグメントのプロモーター活 性を試験するためのプライマー伸張分析の結果を示す。ＰｃｌｐＰ−５３（−５ ３）、弱いＮＥＰプロモーター（＊）、ＰｃｌｐＰ−９５（−９５）よびＰｃｌ ｐＰ−１７３（−１７３）由来の転写物を示す。側方のＤＮＡ配列はヌクレオチ ドでのプライマーからの距離を示す。 図１３は、キメラｕｉｄＡ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号２７）を示す。Ｓａ ｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を示す。ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、Ｎｃ ｏＩ、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を付す。翻訳開始（ＡＴＧ）お よび終止（ＴＧＡ）コドンに二重下線を付す。大文字はタバコ色素体ゲノム由来 のヌクレオチドであり；ゲノム内の最初および最後のヌクレオチドの位置を列挙 する。 図１４は、イネの葉（Ｌ）および胚形成培養細胞（Ｅ）におけるＲＮＡ定常状 態濃度を示すノーザンブロットである。負荷について制御するために、ブロット を剥し、細胞質２５ＳリボソームＲＮＡについてプローブした（下のパネル）。 ハイブリダイゼーションシグナルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐ ｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒを用いて定量した。培養細胞シグナルを上回る葉に おける過剰の倍数をパネルの下に示す。 図１５は、イネの葉（Ｌ）および培養胚形成細胞（Ｅ）における相対的色素体 ゲノムコピー数を示すサザンブロットである。ＥｃｏＲＩ消化した全細胞ＤＮＡ （１レーン当り約２μｇ）を色素体１６ＳｒＤＮＡ（上方）および核にコードさ れる２５ＳｒＤＮＡ（下方）についてプローブした。ハイブリダイゼーションシ グナルをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ ｒを用いて定量した。胚形成細胞に対しての葉における１６ＳｒＤＮＡ／２５Ｓ ｒＤＮＡシグナル強度の比は１．１であった。 図１６は、プライマー伸張分析を使用した、イネの葉（Ｌ）および胚形成培養 細胞（Ｅ）における色素体ｍＲＮＡプロモーターのマッピング結果を示すオート ラジオグラフである。右の数字は翻訳開始コドン（ＡＴＧ）と、一次転写物（Ｐ ＥＰ、○；ＮＥＰ、●）またはプロセシングされたｍＲＮＡ（−）の５’末端と の間の距離を示す。左のＤＮＡ配列はサイズマーカーである。１６ＳｒＤＮＡお よびｃｌｐ Ｐについて示す配列ラダーを、プライマー伸張分析に使用したものと相同のテン プレートおよびオリゴヌクレオチドを用いて得た。 図１７は、トウモロコシ（配列番号２８）およびイネ（配列番号２９）のｒｒ ｎオペロン中のＰＥＰプロモーターのアラインメントを示す（図１７Ａ）。図１ ７Ｂは、トウモロコシにおける色素体ｃｌｐＰプロモーター領域（配列番号３０ ）のイネにおける相同領域（配列番号３１）とのアラインメントを示す。ＰＥＰ （○）およびＮＥＰ（●）転写開始部位ならびにプロセシングされた５’末端（ −）を示す。１６ＳｒＤＮＡの配列情報については、Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ ら（１９８５）を参照のこと。本発明は、トウモロコシｃｌｐＰについての配列 情報を提供する。 発明の説明 いくつかの報告によって、さらなる色素体に局在化する核にコードされるＲＮ Ａポリメラーゼの存在が示唆されていた（ＧｒｕｉｓｓｅｍおよびＴｏｎｋｙｎ ，１９９３；ＩｇｌｏｉおよびＫｏｓｓｅｌ，１９９２；Ｍｕｌｌｅｔ，１９９ ３；Ｌｉｎｋ，１９９４に総説される）。タバコのＥ．ｃｏｌｉ様ＲＮＡポリメ ラーゼの必須βサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子を欠失させることによ って、核にコードされる第２の色素体転写系の存在が確立されている（Ａｌｌｉ ｓｏｎら，１９９６，ＥＭＢＯ Ｊ．１５：２８０２−２８０９）。ｒｐｏＢの 欠失によって、光合成欠陥、色素欠損植物が生じた。 葉のような光合成活性組織における、以前知られていた色素体にコードされる σ⁷⁰型転写系の活性は多くの研究の主題であったが、核にコードされるポリメラ ーゼの転写系は未だに特徴付けられていない。本発明によって、ＮＥＰ系もまた 、根、種子および分裂組織における発現を指向させることが見出された。大部分 の植物(トウモロコシ、綿およびコムギを含む)において、植物再生は、体細胞胚 形成を介して達成される（すなわち、分裂組織が関与する）。これらの作物にお ける効率的な色素体形質転換が、本発明のＮＥＰ色素体転写系によって駆動され るｃｌｐＰプロモーターの使用を介して、可能になるかまたは大いに容易になる 。 ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方 で、 偏在性ではないにせよ、広く存在する（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．２０３：９−２３，１９９２）。Ｃｌｐプロテアーゼの発現が最近、 ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓにおいて検討されている（Ｈｕａｎｇら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４４：１５１−１５９，１９９４）。この単細胞 藻類における遺伝子ノックアウト実験の結果によって以下が実証された： １）全ての形質転換体は破壊されたｃｌｐＰおよび野生型コピーの両方を含有す るヘテロプラスミー性変異体であることが見出された；２）形質転換体は破壊さ れたｃｌｐＰについての選択圧下での６回の増殖およびスクリーニングの後にヘ テロプラスミー性変異体として維持された；３）ヘテロプラスミー性変異体は、 約８０％のｃｌｐＰ ＤＮＡコピーが破壊されたレベルで安定した。これらのデ ータによって、光合成が必要とされない条件下においてさえも、ｃｌｐＰが細胞 増殖に重要であることが示される。 Ｓｈａｎｋｌｉｎらは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ葉緑体におけるｃｌｐＰタン パク質の免疫局在化を検討した（Ｓｈａｎｋｌｉｎら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃ ｅｌｌ ７：１７１３−１７２２，１９９５）。これらの研究によって、ｃｌｐ ＰおよびｃｌｐＣがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの全ての組織においてＥ．ｃｏｌｉ ｃｌｐＰおよびｃｌｐＡに等価なレベルで構成的に発現されていることが判明 した。ｃｌｐＰ ＮＥＰプロモーターが植物の全ての部分において構成的な遺伝 子発現を駆動するという観察によって、このプロモーターは、本発明における使 用に特に適切となっている。 本発明のＮＥＰプロモーターを、係属中の米国出願第０８／１８９，２５６号 に記載され、ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，９０，９１３（１９９３）にも記載されるもののような現在利用 可能な色素体形質転換ベクター中に組込む。そのようなベクターを使用するため のプロトコルは、来国特許第５，４５１，５１３号に記載されている。上記で引 用した３つの参考文献の開示を全て本明細書に出典明示で援用する。トランスジ ェニック植物を得るために、非光合成組織および光合成組織の色素体を、ＮＥＰ プロモーターから発現され、核にコードされるポリメラーゼによって転写される 選択マー カー遺伝子とともに形質転換する。同様に、目的外来タンパク質を生産するため に、核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるｃｌｐＰ ＮＥＰプロモーターを使用して、非光合成組織における高レベル発現用の発現カ セットを構築する。ＮＥＰ転写系を、二重のＮＥＰ／ＰＥＰプロモーターの使用 を介して、σ⁷⁰型の系と組み合わせてもよい。 融通性および普遍的適用のためには、全ての標的化組織型における高レベルで の選択マーカー遺伝子の発現が、色素体形質転換に所望される。現在利用されて いる色素体形質転換ベクター中の選択マーカー遺伝子は、色素体にコードされる ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるＰＥＰプロモーターから発現される。Ｐ ＥＰポリメラーゼは、光合成遺伝子およびいくつかのハウスキーピング遺伝子を 転写する。それゆえ、ＰＥＰポリメラーゼは、光合成活性葉組織における優勢な ＲＮＡポリメラーゼであるようである。葉細胞における葉緑体形質転換に基いて 、効率的な色素体形質転換が、タバコにおいて達成されている。しかし、最も農 学的に重要な穀物（トウモロコシ、イネ、コムギおよび綿を含む）の葉からの植 物再生は、実行可能でないかまたは実用的でない。これらの作物において、トラ ンスジェニック植物は代表的には、胚形成組織培養細胞または実生組織を形質転 換することによって得られる。これらの組織が非光合成性である場合、非緑色組 織において活性な構成性ｃｌｐＰ ＮＥＰプロモーターによるマーカー遺伝子の 発現によって、全ての非光合成性組織型における色素体の形質転換が容易になる 。さらに、本明細書中で実証するように、リボソームＲＮＡオペロンＰＥＰプロ モーターはイネ胚形成細胞において非常に活性である。 下記の非限定的な実施例は、本発明をより詳細に説明する。詳細には、下記の 実施例Ｉ〜ＩＩＩは、本発明のＤＮＡ構築物の作製および使用ならびに本発明の 方法の実施の好ましい方法を記載する。具体的に記載しない全ての分子クローニ ングおよび組換えＤＮＡ技術を、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈ ｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）に一般的に記載されるよ うな標準的な方法によって実施する。 実施例Ｉ リボソーム欠損トウモロコシ変異体ｉｏｊａｐにおける 核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターの同定 上記のように、保存された−１０／−３５エレメントを有する色素体プロモー ターは、色素体にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＥＰ）について十 分に特徴付けられている。さらに、１０ヌクレオチドのプロモーターコンセンサ スが、双子葉植物であるタバコにおいて、第２の核にコードされる色素体ＲＮＡ ポリメラーゼ(ＮＥＰ)について報告されている(Ｈａｊｄｕｋｅｉｗｉｃｚら， １９９７，印刷中)。この実施例において、単子葉植物において活性なＮＥＰプ ロモーターを記載する。ＰＥＰを欠く無色素体リボソームトウモロコシ変異体ｉ ｏｊａｐにおいて、ＮＥＰプロモーターマッピングを実施した。これらの研究に よって、ＡＴＰａｓｅサブユニット遺伝子であるａｔｐＢがＮＥＰおよびＰＥＰ の両方に対するプロモーターを含むことが判明した。対照的に、プロテアーゼサ ブユニット遺伝子であるｃｌｐＰならびにｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ１およびｒｐｏＣ ２ ＰＥＰサブユニット遺伝子をコードするｒｐｏＢオペロンは、ＮＥＰプロモ ーターのみから転写される。これらの知見によって、特定の色素体遺伝子の発現 について、単子葉植物と双子葉植物との間で転写系が保存されていることが示唆 される。単子葉植物のＮＥＰプロモーターは、双子葉植物において同定された１ ０ヌクレオチドの厳密でないコンセンサスを含めて、転写開始部位周辺の配列相 同性を共有する。 光合成高等植物の色素体において、遺伝子は以下の少なくとも２つのＲＮＡポ リメラーゼによって転写される:色素体にコードされる色素体ＲＮＡポリメラー ゼ(ＰＥＰ)および核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ）。シグ マ因子ホモログおよびＰＥＰ調節因子は核にコードされており、色素体に輸送さ れる(ＩｇｏｌｉおよびＫｏｓｓｅｌ，（１９９２）前出；Ｌｉｎｋ，（１９９ ６）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １８：４６５−４７１；Ｓｔｅｒｎ ＤＢ，Ｈｉｇｇ ｓＤＣ，Ｙａｎｇ Ｊ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ ＰｌａｎｔＳｃｉ ２：３０ ８−３１５）。ＮＥＰについてはずっと少ししか知られていない。ＮＥＰの１つ の興味深い候補は、酵母ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡ ポリメラーゼに類似の生化学的特性を有する１１０ｋＤタンパク質である。ＮＥ Ｐはその活性のためにＣＤＦ２のような補助因子を必要とする可能性がある（Ｌ ｅｒｂｓ−Ｍａｃｈｅ，１９９３；Ｉｒａｔｎｉら，９４；Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｄｅｖ）。 ＮＥＰに対する双子葉植物プロモーターは、ＰＥＰβサブユニットをコードす るｒｐｏＢの欠失に起因してＰＥＰを欠くタバコ植物において同定された。これ らの研究から浮かび上がる一般則は、色素体遺伝子が３つのクラスに入るという ことである。クラスＩの遺伝子はＰＥＰプロモーターのみを含む。このクラスの 例は光化学系（photosytem）ＩおよびII遺伝子である。クラスII遺伝子はＮＥＰ およびＰＥＰプロモーターの両方を含む。このクラスの遺伝子の代表的なメンバ ーは、植物代謝に関与する遺伝子およびハウスキーピング遺伝子である。第３の クラスの遺伝子は、ＮＥＰプロモーターのみを含む。このクラスの遺伝子には、 ｒｐｏＢおよびａｃｃＤが含まれる。 色素体形質転換は単子葉植物においては未だに利用可能でないので、Δｒｐｏ Ｂ植物をトウモロコシＮＥＰプロモーター分析のために得ることはできなかった 。しかし、色素体リボソーム蓄積の欠陥を有する変異体がオオムギ（ａｌｂｏｓ ｔｒｉａｎｓ；Ｈｅｓｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．１２：５６３−５７１，１９９３） およびトウモロコシ（ｉｏｊａｐ；ＷａｌｂｏｔおよびＣｏｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２７６０−２７６４，１９７９；Ｈａｎら，Ｐ ｌａｎｔａ １９１：５５２−５６３，１９９３；Ｈａｎら，ＥＭＢＯ Ｊ．１ １：４０３７−４０４６，１９９２）において利用可能である。色素体リボソー ムの非存在下において、これらの変異体はＰＥＰを合成することができない。両 方の変異体は、色素体遺伝子のサブセットに対するｍＲＮＡを蓄積し、このこと によってＮＥＰ活性の存在が示唆される（Ｈｅｓｓら，１９９３，前出；Ｈａｎ ら，１９９３，前出）。 ３つの色素体遺伝子についてのＮＥＰプロモーターを、白色無リボソームトウ モロコシｉｏｊａｐ実生においてマッピングした。データによって、トウモロコ シａ ｔｐＢ遺伝子は代替的なＮＥＰおよびＰＥＰプロモーターを有し、ｃｌｐＰおよ びｒｐｏＢ遺伝子は白色および緑色の両方の実生においてもっぱらＮＥＰプロモ ーターから転写されることが示される。ＤＮＡ配列アラインメントによって、単 子葉植物ＮＥＰプロモーターが転写開始部位の直ぐ上流の相同性を共有すること が判明した。相同領域は、以前に同定されたタバコＮＥＰプロモーターコンセン サスエレメントを含み、このことによって、単子葉植物と双子葉植物との間でＮ ＥＰ転写機構が保存されていることが示唆される。実施例Ｉについての材料および方法 植物材料。ｉｏｊａｐはトウモロコシの劣性縞模様（striped）変異体である 。母性白色および緑色実生を、縞模様ｉｊ／ｉｊ母性親（１４０４）を野生型雄 性（同系交配Ｏｈ５１ａ）由来の花粉と交配することによって得た。種子をＲｏ ｂ ＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎおよびＭａｒｙ Ｂｙｒｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。表面滅菌種子を、インビ トロで２％ＭＳ培地上で発芽させた（２４℃、１６時間照明）。 ＲＮＡゲルブロット全細胞ＲＮＡを９日齢の実生の葉から調製した（Ｓｔｉｋ ｅｍａら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２５５−２６９，１９８８） 。ＲＮＡ（１レーン当り５μｇ）を１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電 気泳動し、次いでＰｏｓｉｂｌｏｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ装置（Ｓtｒａｔａｇｅ ｎｅ）を使用してＨｙｂｏｎｄ Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。ランダムプ ライマー標識したフラグメントをＲａｐｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂ ｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で一晩６５℃で実施した。 二本鎖ｐｔＤＮＡプローブを、ＰＣＲで生成したかまたはゲル精製したＤＮＡ フラグメントをランダムプライム³²Ｐ標識することによって調製した。ＰＣＲに 使用したプライマーの配列およびタバコ（Ｎ．ｔ．；Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号 Ｚ０００４４）またはトウモロコシ（Ｚ．ｍ．；Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号Ｘ８ ６５６３）のｐｔＤＮＡ内でのその位置は以下のとおりである： 以下のｐｔＤＮＡフラグメントをプローブとして使用した：ｒｂｃＬ（Ｎ．ｔ ．）、ＢａｍＨＩフラグメント（ｐｔＤＮＡにおけるヌクレオチド５８０４７〜 ５９２８５）；１６ＳｒＤＮＡ（Ｎ．ｔ．）、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメ ント（ｐｔＤＮＡにおけるヌクレオチド１３８４４７〜１４０８５５）；ｒｐｏ Ｂ、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ｎｔ２４２９１〜２４８１６）。 プライマー伸張分析。プライマー伸張反応を、記載（Ａｌｌｉｓｏｎら，ＥＭ ＢＯ Ｊ．１５：２８０２−２８０９，１９９６）のように１０μｇの全葉ＲＮ Ａに対して実施した。プライマーを、公開されたトウモロコシ色素体ゲノム配列 （Ｍａｉｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５１：６１４−６２８，１９９５） におけるヌクレオチド位とともに以下に列挙する。下線を付したオリゴヌクレオ チド（クローニング部位を作製するために付加した）もキャッピング構築物を生 成させるために使用した。この場合、ゲノム配列における第１のヌクレオチドを 、下線の直ぐ後に配置する。（注:ａｔｐＢ＃２オリゴヌクレオチドの３'末端のＣはｎｔ位５６６４４である ；公開された配列は本発明者らが見出した配列に比較して１５ヌクレオチドの欠 失を有する）。 インビトロキャッピングによる一次転写物の同定。白色実生由来の全葉ＲＮＡ (ｃｌｐＰについて２０μｇ、またはｒｐｏＢおよびａｔｐＢ転写物について１ ００μｇ)を０．２５または１．０ｍＣｉ［α−³²Ｐ］ＧＴＰの存在下でキャッ ピングした（ＫｅｎｎｅｌｌおよびＰｒｉｎｇ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． ２１６：１６−２４，１９８９）。標識ＲＮＡをＲＰＡＩＩキット（Ａｍｂｉｏ ｎ）を使用するリボヌクレアーゼ保護（Ｖｅｒａら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ ｏｌ．１９：３０９−３１１，１９９２）によって検出した。保護相補性ＲＮＡ を調製するために、色素体ゲノムの適切なセグメントを以下に列挙するプライマ ーを使用してＰＣＲ増幅した。 上記の５’プライマーを、増幅フラグメントの上流にＸｂａＩ制限部位（下線 を付した）を付加するように設計した。３’プライマーを、増幅配列の下流にＸ ｈｏＩ（ａｔｐＢ、ｒｐｏＢ）またはＥｃｏＲＩ（ｃｌｐＰ）部位（下線を付し た）を付加するように設計した。適切な制限酵素で消化した後、増幅産物をｐＢ ＳＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローン化した。ＲＮＡの５’ 末端に相補 的な非標識ＲＮＡを生成させるために、得られたプラスミドをＸｈｏＩ（ａｔｐ Ｂ、ｒｐｏＢ）またはＥｃｏＲＩ（ｃｌｐＰ）で線状化し、Ｔ７ ＲＮＡポリメ ラーゼを用いるＭｅｇａｓｃｒｉｐｔ(Ａｍｂｉｏｎ)反応物中で転写した。マー カー（１００、２００、３００、４００および５００ヌクレオチド）を、製造業 者のプロトコルに従ってＲＮＡ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍａｒｋｅｒ Ｔｅｍｐｌａ ｔｅ Ｓｅｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて調製した。 ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列分析を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を利用して実施した。 結果および考察 母性白色および緑色トウモロコシ植物における色素体転写物の蓄積。 白色トウモロコシ植物中において１６ＳｒＲＮＡの蓄積が無いことによって、 報告された、白色ｉｏｊａｐ実生中の色素体リボソームの無いことを確認した（ ＷａｌｂｏｔおよびＣｏｅ １９７９，前出）。ＰＥＰプロモーターから転写さ れることが知られているｒｂｃＬおよびｐｓｂＡ ｍＲＮＡが存在しないことに よって、母性白色植物が実際にＰＥＰ活性を欠いていることが示される（Ｈａｎ ら，１９９３，前出）。図１を参照のこと。 ３つのさらなる色素体遺伝子ｃｌｐＰ、ｒｐｏＢおよびａｔｐＢの転写物の蓄 積がｉｏｊａｐ植物において分析されている。ＮＥＰプロモーターの存在を示す 高い定常状態ｍＲＮＡレベルが、これらの遺伝子について、それぞれｉｏｊａｐ トウモロコシ（Ｈａｎら，１９９３，前出）、ａｌｂｏｓｔｒｉａｎｓオオムギ （Ｈｅｓｓら，１９９３，前出）およびΔｒｐｏＢタバコ（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗ ｉｃｚら，ＥＭＢＯ Ｊ．，印刷中，１９９７）において報告されている。無リ ボソームｉｏｊａｐ植物における容易に検出可能なｍＲＮＡの蓄積によって、活 性なＮＥＰプロモーターがこれらの遺伝子の各々について発現を調節しているこ とを確認した（図１）。 ｃｌｐＰ ＮＥＰプロモーターは白色および緑色実生において効率的に転写さ れる。 ＮＥＰプロモーターを同定するために、転写物の５’末端を、プライマー伸張 分析によってマッピングした。ＮＥＰプロモーター由来の転写物を表す５’末端 と、ＲＮＡプロセシングによって生成する５’末端とを区別するために、５’末 端をグアニリルトランスフェラーゼを使用してキャッピングした。 ｃ１ｐＰについては、白色および緑色の両方の実生において有意なｍＲＮＡの 蓄積が見出された。プライマー伸張分析によって、ヌクレオチド位−１１１（Ａ ＴＧの上流のヌクレオチドが−１位である）の１つのみの強いｃｌｐＰ ５’末 端が同定された。ｃｌｐＰ−１１１転写物をインビトロでキャッピングすること ができた。図２Ｂを参照のこと。これらのデータによって、この５’末端が一次 転写物であることが確認され、また、トウモロコシＮＥＰプロモーターＰｃｌｐ Ｐ−１１１が同定された。同じ５’末端が白色および緑色の両方のトウモロコシ 実生において観察され、このことによって、同じｃｌｐＰプロモーターが葉緑体 および非光合成ioｊａｐ色素体において活性であることが示される（図２Ａ）。 それゆえ、ＰｃｌｐＰ−１１１は構成性プロモーターであると考えられる。イネ において、ｃｌｐＰ転写物の５’末端は同じヌクレオチドにマッピングされ、こ のことによって、単子葉植物においてＰｃｌｐＰ−１１１が保存されていること が示される（データは示さず）。 ｒｐｏＢ ＮＥＰプロモーター活性はｉｏｊａｐ色素体において増強される。 ＲＮＡゲルブロット分析によって、ｒｐｏＢ ｍＲＮＡが白色実生においての み検出可能なレベルまで蓄積されることが示される（図１）。しかし、より高感 度のプライマー伸張分析によって、同じ５’末端が白色および緑色の両方の葉に 存在することが判明した。ヌクレオチド位−１４７の強いバンドおよび−２８５ 位の弱いバンドの２つの５’末端を同定することができた（図３Ａ）。インビト ロキャッピングアッセイによって、−１４７ ＲＮＡ種は一次転写物であり（図 ３Ｂ）、それゆえＰｒｐｏＢ−１４７プロモーターの産物であることが確認され た。 ａｔｐＢ遺伝子は白色植物においてＮＥＰプロモーターから転写され緑色実生 においてＰＥＰプロモーターから転写される。 緑色葉中には実質的なａｔｐＢ ｍＲＮＡの蓄積が存在するが、白色ｉｏｊａ ｐ葉中にはずっと少ししか見出されない(図１)。緑色葉由来のｍＲＮＡのプライ マー伸張分析によって、ヌクレオチド位−２９８の５’末端を有する転写物が同 定され（図４Ａ）、このことによって以前の報告が確認された（Ｍｕｌｌｅｔら ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４：３９−５４，１９８５）。この−２９８ ｍＲＮＡ種は、白色植物から単離した葉ＲＮＡ中には存在せず、このことによ って−２９８ ｍＲＮＡがＰＥＰ転写物であることが示される。代わりに、別の ａｔｐＢ転写物がヌクレオチド位−６０１にマッピングされた（図４Ａ）。２つ のｍＲＮＡの大きさの差は図１に示すＲＮＡゲルブロットで明らかである。 −６０１転写物をインビトロでグアニリルトランスフェラーゼによってキャッ ピングすることができた。このことによって、これが一次転写物であることが示 される（図４Ｂ）。それゆえ、これは、白色ｉｏｊａｐ葉においてのみ容易に検 出可能な活性を有するＰａｔｐＢ−６０１ ＮＥＰプロモーターの産物である。 単子葉植物ＮＥＰ転写開始部位周辺の配列保存。 トウモロコシｃｌｐＰ、ｒｐｏＢおよびａｔｐＢ ＮＥＰプロモーターのアラ インメントによって、転写開始部位の上流の有意な相同性が判明した。１３ヌク レオチドの領域において、８ヌクレオチドが３つ全てのプロモーターにおいて共 有されている（図５；Ｂｏｘ Ｉ）。対での比較では、ａｔｐＢ／ｃｌｐＰ、ａ ｔｐＢ／ｒｐｏＢおよびｃｌｐＰ／ｒｐｏＢはそれぞれ１１、１０および８ヌク レオチドを共有する。さらに、ａｔｐＢおよびｃｌｐＰはさらに上流で９ヌクレ オチド中８ヌクレオチドを共有する（転写開始部位に対して−２１〜−３０；図 ５中Ｂｏｘ ＩＩ）。 興味深いことに、各々のトウモロコシＮＥＰプロモーターは、厳密でない双子 葉植物ＮＥＰプロモーターコンセンサスCATAGAATA/GAAと、転写開始部位周辺で 配列 類似性を有する（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９７，前出;図５中下線） 。ｃｌｐＰについては、１０ヌクレオチド中９ヌクレオチドが保存されており； ａｔｐＢおよびｒｐｏＢについては、保存ヌクレオチドの数は１０個中７個であ る（図５）。さらに、第２の保存領域（Ｂｏｘ ＩＩ、図５）がａｔｐＢおよび ｃｌｐＰにおいてＢｏｘ Ｉの上流に見出されるが、ｒｐｏＢプロモーターには 見出されない。興味深いことに、単子葉植物Ｂｏｘ ＩＩは、順方向で双子葉植 物ＮＥＰコンセンサスの短縮型を含んでいる：トウモロコシｃｌｐＰ（ATAGAAT ）およびａｔｐＢ（AT-GAATA）遺伝子の場合は１０ｂｐ中７ｂｐが一致する（図 ５）。これらの縦列反復配列は、ＮＥＰプロモーター活性の調節において役割を 担っている可能性がある。 仮のトウモロコシＮＥＰプロモーター配列を含む領域（−３０〜＋２５）を、 他の単子葉植物由来の相同領域と整列させた。図５Ｂ〜５Ｄを参照のこと。高度 の配列保存によって、これらの単子葉植物種の各々における機能的プロモーター の存在が示される。トウモロコシＰｃｌｐＰ−１１１プロモーターのイネホモロ グについてのプロモーター活性をプライマー伸張分析によって確認した（データ は示さず）。 本明細書に報告するデータによって、トウモロコシ色素体ＮＥＰプロモーター 領域がタバコにおける保存CATAGAATA/GAA ＮＥＰ配列モチーフと、転写開始部 位の周辺で配列相同性を共有することが示される(図５)。それゆえ、これらのプ ロモーターはＩ型 ＮＥＰプロモーターであると考えられる。この知見によって 、単子葉植物と双子葉植物との間でＮＥＰ転写機構が保存されていることが示さ れる。双子葉植物Ｉ型ＮＥＰプロモーターに類似して、図５に示すように、トウ モロコシｃｌｐＰ、ｒｐｏＢおよびａｔｐＢプロモーターの間で、転写開始部位 の上流の配列は下流の配列よりも高く保存されている(Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃ ｚら，１９９７，前出)。 トウモロコシＰｃｌｐＰ−１１１プロモーターおよびタバコＰｃｌｐＰ−５３ プロモーターの両方は構成性である。トウモロコシのプロモーターとは対照的に 、タバコのｃｌｐＰプロモーター領域はCATAGAATA/GAA配列モチーフを欠いてお り（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９７，前出）、このことによって、異な るＮ ＥＰ特異性因子による認識が示唆される（ＩＩ型ＮＥＰプロモーター）。興味深 いことに、下記の実施例に記載のように、ＩＩ型ＮＥＰプロモーターにおいて、 転写開始部位の下流の配列は上流よりも高く保存されている。タバコＰｃｌｐＰ −５３プロモーターホモログは、色素体ＩＩ型ＮＥＰプロモーターの唯一の既知 の例である。コケ類（Ｍａｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）および針葉 樹（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ）を含めて、これは進化の間に高度に保存さ れてきた。ｃｌｐＰ ＩＩ型ＮＥＰプロモーター機能に必要とされるＤＮＡ配列 は維持されているが、この領域はトウモロコシ、イネおよびコムギにおいては転 写がサイレントである。穀物においてこの領域からの転写が無いことは、おそら くＩＩ型認識特異性の損失に起因する。実施例ＩＩを参照のこと。従って、タバ コ（双子葉植物）ＩＩ型ｃｌｐＰプロモーターは双子葉植物においてのみ色素体 トランスジーンの発現を駆動するために適切であり、穀物Ｉ型プロモーターは単 子葉植物および双子葉植物の両方において有用であり得る。 ｒｐｏＢオペロンは、ＮＥＰのみによって発現されることが知られているわず かな遺伝子の１つである。ＰｒｐｏＢ−１４７はＩ型ＮＥＰプロモーターである が、ｃｌｐＰおよびａｔｐＢとは異なり、Ｂｏｘ ＩＩを欠く（図５）。このプ ロモーター由来のｍＲＮＡの蓄積は、転写速度のダウンレギュレーションに起因 して成熟葉において低い（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉ ｏｌｏｇｙ １０１：７８１−７９１，１９９３）。この研究において同定した ＰｒｐｏＢ−１４７プロモーターはおそらく、色素体発達において中心的な役割 を担っている。なぜなら、これは５つの色素体にコードされるＰＥＰサブユニッ トのうち４つの発現を調節しているからである（Ｓｈｉｍａｄａら，Ｍｏｌ．Ｇ ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：３９５−４０２，１９９０）。１つのモデルによれ ば、２つのＲＮＡポリメラーゼは、葉緑体分化の間に発達カスケードを形成して いる。色素体発達の初期の間、色素体の転写および翻訳装置をコードする色素体 遺伝子はＮEPによって転写される。一旦ＰＥが作製されると、これはＰＥＰプロ モーターからの光合成遺伝子の転写を開始し、代替ＰＥＰプロモーターからのハ ウスキーピング遺伝子の転写を引き継ぐ（Ｈｅｓｓら，１９９３，前出；Ｌｅｒ ｂｓ−Ｍ ａｃｈｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：５５０９−５５１３ ，１９９３；Ｍｕｌｌｅｔ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：３０９−３ １３，１９９３；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９７，前出）。ＮＥＰプロ モーターからのｒｐｏＢの転写はこのモデルに一致する。しかし、トウモロコシ において、少なくとも１つの遺伝子ｃｌｐＰは、成熟葉緑体においてもっぱらそ して効率的にＮＥＰによって転写される。このことによって、たとえＰＥＰが存 在していても、ＮＥＰが活性かつ細胞機能に重要なままであることが示される。 別の仮説を本明細書において提唱する。これは、ＮＥＰおよびＰＥＰが構成的に 常に存在し、選択的転写がプロモーター特異的転写因子によって媒介されている と仮定する。双子葉植物(Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９７，前出)および 単子葉植物(本明細書に記載)に対するＮＥＰプロモーターの同定によって、色素 体の機能および発達においてこれら２つの色素体ＲＮＡポリメラーゼが担う役割 の解明が容易になる。 実施例ＩＩ核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼによる変化したｃｌｐＰプロモータ ー認識によって単子葉植物における保存色素体転写因子の損失が示唆される 色素体ｃｌｐＰ遺伝子は、イネ（単子葉植物）およびタバコ（双子葉植物）に おいて核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ）によって転写され る。しかし、２つのＮＥＰプロモーターは、配列相同性を共有しない。単子葉植 物と双子葉植物との間のＮＥＰプロモーター認識の保存を評価するために、イネ ｃｌｐＰプロモーター領域から発現されるレポーター遺伝子（ｕｉｄＡ）をタバ コ色素体中に導入した。タバコにおいて転写が正確な部位でイネｃｌｐＰプロモ ーターから開始することがデータによって示される。従って、この遺伝子につい てのＮＥＰプロモーター認識は、単子葉植物および双子葉植物の両方で保存され ている。驚くべきことに、イネ配列からの転写は、タバコｃｌｐＰプロモーター 領域に類似した短い範囲の相同配列を有する第２の部位で開始した。ｃｌｐＰ転 写開始部位の周辺の配列は、タバコ（双子葉植物）、Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐ ｏｌｙｍｏｒｐｈａ（コ ケ類）およびＰｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ（針葉樹）において保存されている 。イネおよび他の穀物においてこの領域からの転写がないことによって、ＮＥＰ クラスＩＩプロモーター特異性に必要とされる因子の進化的損失が示される。 実施例ＩＩについての材料および方法 プラスミドｐＤＳ４４の構築 プラスミドｐＤＳ４４は、Ｐｒｒｎプロモーターから発現されるｕｉｄＡレポ ーター遺伝子を有するｐＬＡＡ２４誘導体である（Ｚｏｕｂｅｎｋｏら，Ｎｕｃ ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：３８１９−３８２４，１９９４）。プラ スミドｐＤＳ４４を、ＰｒｒｎプロモーターをＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメン トとして切出し、これをＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして加工したイネ ｃｌｐＰプロモーター領域で置換することによって得た。イネｃｌｐＰプロモー ター領域を含む２５１ヌクレオチドのＳａｃＩ／ＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメン ト（１９塩基対のコード領域を含む）をＰＣＲ増幅によって得た。ＰＣＲプライ マーの配列およびイネ色素体ゲノム（Ｈｉｒａｔｓｕｋａら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２１７：１８５−１９４，１９８９；ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｘ １５９０１）におけるその最初のヌクレオチド（またはその相補物）の位置は以 下のとおりである： 大文字は色素体ゲノム由来のヌクレオチドである；小文字は制限部位を作製する ために含めたヌクレオチドである。ＳａｃＩまたはＥｃｏＲＩ制限部位に下線を 付す。 タバコ色素体形質転換。色素体形質転換およびトランスジェニックタバコ植物 の再生を、ＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．９０：９１３−９１７，１９９３)によって記載されるプロトコルに従って 実施した。簡潔に記載すると、タバコ葉を、ＤｕＰｏｎｔ ＰＤＳ １０００Ｈ ｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｇｕｎを使用してプラスミドｐＤＳ４４ ＤＮＡでコ ートしたタングステン粒子でボンバードした。トランスジェニックシュートを、 ５０ ０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンジヒドロクロリドを含有するＲＭＯＰ培地上 で選択した。推定の初代形質転換体を、ｕｉｄＡによってコードされるβ−グル クロニダーゼ活性についての組織化学的染色によって同定した(Ｊｅｆｆｅｒｓ ｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１０巻，Ｓｅｔｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ．編Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ＆ Ｌｏｎｄｏｎ，２４７−２６ ３頁，１９８８)。形質転換した色素体ゲノムの一様な集団を、サザン分析によ って確認した（データは示さず）。 ＲＮＡ ５’末端をマッピングするためのプライマー伸張分析。 全葉ＲＮＡをインビトロで増殖させた植物の葉からＳｔｉｅｋｅｍａら（前出 ）の方法によって単離した。プライマー伸張反応を、２０μｇのＲＮＡに対して 、ＡｌｌｉｓｏｎおよびＭａｌｉｇａ（１９９５）によって記載されるプライマ ーｕｉｄＡ ＰＥ１とともにプライマーＰ３：5'-GGCCGTCGAGTTTTTTGATTTCACGGG TTGGGG-3'（配列番号５２）（ｕｉｄＡコード領域に相補的である）を使用して 実施した。 ＤＮＡ配列分析。ＤＮＡ配列分析を、実施例ＩＶに記載のように、Ｗｉｓｃｏ ｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）を利用して実施した。結果および考察 トランスジェニック植物の構築。プラスミドｐＤＳ４４中にプロモーターフラ グメントとして含まれているイネｃｌｐＰ上流領域の配列を図６に示す。イネに おいて、この領域はＯｓ−ＰｃｌｐＰ−１１１ Ｉ型ＮＥＰプロモーターを含む 。タバコにおける対応する配列は、２つのＮＥＰプロモーターおよび１つのＰＥ Ｐプロモーターを含む。Ｏｓ−ＰｃｌｐＰ−１１１ ＮＥＰプロモーターを、リ ボソーム結合部位および図７に示すｍＲＮＡの安定化のためのｒｐｓ１６ ３’ 非翻訳領域（Ｔｒｐｓ１６）とともにｕｉｄＡコード領域（β−グルクロニダー ゼまたはＧＵＳをコードする）の上流にクローン化した。キメラｕｉｄＡ遺伝子 をｐＰＲＶ１１１Ａ色素体ベクター（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｕ１２８１２） 中選択スペクチノマイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子に隣接してクローン化し、タ バコ色素体に導入した。 ベクターの模式図を図７に示す。色素体形質転換体をスペクチノマイシン培地上 で選択した。２５のスペクチノマイシン耐性株のうち、１２がＧＵＳ陽性であっ た。標的部位におけるｕｉｄＡの組込みをサザン分析によって確認した（データ は示さず）。 プロモーター活性を試験するためのプライマー伸張分析。Ｏｓ−ＰｃｌｐＰ− １１１プロモーター領域において開始するｕｉｄＡの５’末端をマッピングする ために、プライマー伸張分析を実施した。３つの強いそして２つの弱いｕｉｄＡ 転写物をトランスジェニック植物の葉において同定した（図８Ａ）。強い転写物 の５’末端は、イネと同じ位置であるヌクレオチド位−１１１にマッピングされ た。この結果によって、イネＩ型ＰｃｌｐＰ−１１１プロモーターが双子葉植物 であるタバコにおいて正しく認識されていることが示され、このことによって、 このプロモーターが種々の植物種において広く適用可能であることが示される。 最も強いシグナルを有する第２の強い転写物は、イネ−６１位において見出され た。この転写物の５’末端は、タバコＮｔ−ＰｃｌｐＰ−５３プロモーター領域 に相同な２９ヌクレオチドの範囲のイネ配列にマッピングされた（図６）これは 予想外であった。なぜなら、イネおよびトウモロコシにおいてこの領域は転写が サイレントだからである（実施例Ｉ）。第３の強い転写物は、上流単子葉植物Ｎ ＥＰ ｂｏｘ（実施例Ｉ）内に入る−１３６位にマッピングされた。 ２つの弱い転写物の５’末端は、ヌクレオチド位−１６９および−１７７にマ ッピングされた（図８）。これらの転写物はイネ葉ＲＮＡ中には存在せず、いず れの既知のタバコｃｌｐＰ転写物にも対応しない。それゆえ、これらの５’末端 は、偶発性ＰＥＰまたはＮＥＰプロモーターの一次転写物であるかかもしれず、 あるいはプロセシングされたｍＲＮＡの５’末端である。 ｃｌｐＰプロモーターを含む領域の配列アラインメント。イネｃｌｐＰプロモ ーターフラグメントはタバコにおいて転写活性があった。このプロモーター配列 はタバコＩＩ型ＰｃｌｐＰ−５３プロモーターに対応する。この領域において、 イネお よびタバコは２９ヌクレオチドの範囲の相同配列を共有し、２３ヌクレオチドが 保存されている。進化の間でのこの同じ領域の保存を試験するために、コケ類の Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｋｏｈｃｈｉら，Ｃｕｒｒ．Ｇ ｅｎｅｔ．１４：１４７−１５４，１９８８）、針葉樹のＰｉｎｕｓ ｃｏｎｔ ｏｒｔａ（Ｃｌａｒｋｅら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５１−８ ６２，１９９４）、双子葉植物のタバコ(Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９ ７，前出)、ホウレンソウ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ(Ｗｅｓｔｈｏｆｆ，Ｍｏｌ ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０１：１１５−１２３，１９８５）ならびに単子葉植 物のトウモロコシおよびイネを含めて、ｃｌｐＰ転写開始部位の周辺の配列を整 列した。図９を参照のこと。タバコを除いて、単一の転写開始部位がｃｌｐＰ遺 伝子の各々についてマッピングされた。本発明者らは、ｃｌｐＰ転写開始部位周 辺の２９ヌクレオチドのセグメントが保存されていることを見出した。このこと によって、ｃｌｐＰがこれらの種の全てにおいてＮＥＰによって転写されること が示唆（強調）される。 この実施例に示すデータによって、イネＯｓ−ＰｃｌｐＰ−１１１ ＮＥＰプ ロモーターがタバコ色素体において正しく認識されることが示される。タバコに おけるイネＰｃｌｐＰ−１１１ ＮＥＰプロモーターからの転写は、おそらく転 写開始部位周辺の領域が双子葉植物Ｉ型ＮＥＰプロモーターコンセンサスを含む ので観察された。イネにおけるように、Ｏｓ−ＰｃｌｐＰ−１１１ ＮＥＰプロ モーターは成熟タバコ葉において活性である。それゆえ、これは成熟葉緑体およ びプロプラスチドにおいて活性な比較的少数のＩ型ＮＥＰプロモーターに属する 。 タバコＰｃｌｐＰ−５３ ＩＩ型ＮＥＰプロモーターに相同な短い範囲の配列 を有する第２の部位でのイネｃｌｐＰ ５’領域からの転写は予想外であった。 イネはＩＩ型プロモーター活性に必要とされる全てのシスエレメントを含んでい るので、イネにおいて転写物がないことは、ＩＩ型プロモーター認識に必要とさ れる特異性因子の進化的損失に起因するはずである。コケ類のＭａｒｃｈａｎｔ ｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよび針葉樹のＰｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａにお いて活性なＩＩ型ｃｌｐＰプロモーターで明らかなように、この特異性因子は、 進化の間に良好に 保存されている（図９）。 イネＯｓ−ＰｃｌｐＰ−１１１ ＮＥＰプロモーターについてここで報告した 実験によって、Ｉ型ＮＥＰ転写機構が、異種プロモーターの忠実な認識を確実に するために十分に、単子葉植物と双子葉植物との間で保存されていることが示唆 される。ｃｌｐＰ ｍＲＮＡは、全ての色素体型において有意なレベルまで蓄積 される（Ｓｈａｎｋｌｉｎら，１９９５，前出；Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら， １９９７，前出；実施例Ｉ）。それゆえ、強力な構成性のＯｓ−ＰｃｌＰ−１１ １ ＮＥＰプロモーターは、広範囲の作物におけるキメラ遺伝子の発現に適切で ある。 実施例ＩＩＩ 核にコードされる色素体ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＰ）に対するＩＩ型 プロモーターＰｃｌｐＰ−５３のインビボにおける規定 タバコにおいて、ｃｌｐＰ遺伝子は翻訳開始コドンの−５１１、−１７３およ び−５３ヌクレオチド上流で開始する３つの強いＮＥＰプロモーターならびにＰ ＥＰプロモーター（５’末端−９５）から転写される。ＩＩ型ＰｃｌｐＰ−５３ ＮＥＰプロモーターからの転写は野生型タバコ植物の緑色葉において維持され ている。それゆえ、選択マーカー遺伝子の発現を駆動する潜在性を仮定して、構 成性ＰｃｌｐＰ−５３プロモーターを分析用に選択した。 実施例ＩＩＩについての材料および方法 プラスミドの構築。プラスミドｐＰＳ８はｐＢＳＫＳ＋プラスミド(Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ)中にＳａｃｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｕｉｄＡレポ ーター遺伝子を含む。キメラｕｉｄＡ遺伝子は以下からなる：ＳａｃＩ部位とＸ ｈｏＩ部位との間、ｃｌｐＰ転写開始部位の２２ｎｔ上流および２５ｎｔ下流（ ＋１は転写が開始するｎｔである）を含むＰｃｌｐＰ−５３（−２２／＋２５） プロモーターフラグメント；ＸｈｏＩ部位とＮｃｏＩ部位との間、リボソーム結 合部位；ＮｃｏＩ部位とＸｂａＩ部位との間、ヒトｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｋｏ ｌｏｄｚｉｅｊお よびＹｏｕｎｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１９４：５０８−５１９，１９９１）のカ ルボキシ末端ドメイン内のアミノ酸４１０〜４１９（EQKLISEEDL;配列番号５３ ）に対応するＮ末端ｃ−ｍｙｃタグを有するｕｉｄＡコード領域；ＸｂａＩ部位 とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間、ｒｐｓ１６リボソームタンパク質遺伝子の３’非 翻訳領域（Ｔｒｐｓ１６）。プラスミドｐＰＳ８中のＳａｃＩ部位とＨｉｎｄＩ ＩＩ部位との間のキメラｕｉｄＡ遺伝子のＤＮＡ配列を図１３に示す。キメラｕ ｉｄＡ遺伝子の関連する制限部位を図１０に示す。ここで、ｕｉｄＡ遺伝子をプ ラスミドｐＰＳ１８の一部として示す。プラスミドｐＰＳ１８を、ＳａｃＩ−Ｈ ｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｕｉｄＡ遺伝子をＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消 化したｐＰＲＶＩＩＩＡ色素体形質転換ベクター中にクローン化することによっ て得た。ｐＢＳＫＳ＋プラスミド誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であるプラス ミドｐＰＲＶ１１１ＡはＺｏｕｂｅｎｋｏら，１９９４（前出）に記載されてい る。 図１１に列挙するプラスミドｐＰＳ１６、ｐＰＳ３７、ｐＰＳ１７およびｐＰ Ｓ３８を、プラスミドｐＰＳ１８から、ＰｃｌｐＰ−５３（−２２／＋２５）Ｓ ａｃＩ−ＸｈｏＩプロモーターフラグメントを、それぞれＰｃｌｐＰ−５３（− １５２／＋１５４）、ＰｃｌｐＰ−５３（−１５２／＋４１）、ＰｃｌｐＰ−５ ３（−１５２／＋１０）、ＰｃｌｐＰ−５３（−３９／＋１５４）プロモーター で置換することによって得た。ＳａｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントをＰＣＲ増幅に よって得た。ＰＣＲプライマーを、転写開始部位（タバコ色素体ゲノム中のｎｔ ７４５５７の相補物である：登録番号Ｚ０００４４）に対する末端ヌクレオチド の位置に従って列挙する： 大文字は色素体ゲノム由来のアンカー配列である；小文字は制限部位（下線を 付す）を作製するために付加したヌクレオチドである。 タバコ色素体形質転換。色素体形質転換およびタバコ植物の再生を、Ｓｖａｂ およびＭａｌｉｇａ，１９９３（前出）によって記載されるように実施した。ト ランスジェニック植物を、５００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンジヒドロクロ リドを含有する再生培地上で選択した。 プライマー伸張分析。全葉ＲＮＡをＲＭ培地上で維持したトランスジェニック 植物の葉からＳｔｉｅｋｅｍａら，１９８８（前出）の方法によって単離した。 プライマー伸張反応を、ＡｌｌｉｓｏｎおよびＭａｌｉｇａ，１９９５（前出） によって記載されるように、１５μｇの全ＲＮＡおよびｕｉｄＡコード配列の５ ’末端に相補的なプライマーＰＥ１を使用して実施した。 プライマーＰＥ１の配列： 結果および考察 ＩＩ型ＰｃｌｐＰ−５３プロモーター中の機能的に重要な配列を同定するため に、ｃｌｐＰ−５３ ＮＥＰ転写開始部位周辺の配列によって駆動されるレポー ター遺伝子の発現を測定した。５’および３’末端から配列を欠失させることに よって、プロモーターの境界の決定を容易にした。これらの研究によって、４７ ｂｐのフラグメントが正確な転写開始を支持するために十分であることが判明し た。データによって、４７ｂｐ中２８ｂｐ以下がプロモーター機能に必須である ことがさらに示唆される。大部分の関連配列は、転写開始部位の下流に存在する 。 全ての色素体プロモーターは転写開始部位の約１５０ヌクレオチド以内に存在 するので、ｃｌｐＰ−５３転写開始部位周辺の３０６ｂｐのフラグメント（１５ ２／＋１５４）からのインビボにおける転写開始を評価した。プロモーター機能 を試験するために、ｃｌｐＰフラグメントを、β−グルクロニダーゼをコードす るｕｉｄＡレポーター構築物の上流にクローン化した。図１１を参照のこと。ｕ ｉｄＡ構築物は、ＸｈｏＩ制限部位とＮｃｏＩ制限部位との間のリボソーム結合 部位および ｍＲＮＡを安定化させるための色素体ｒｐｓ１６遺伝子の３’非翻訳領域（Ｔｒ ｐｓ１６）を有する。キメラｕｉｄＡ遺伝子をタバコ色素体中に選択スペクチノ マイシン耐性（ａａｄＡ）遺伝子に対する連鎖によって導入した。３０６ｂｐの フラグメントは、ＰＥＰおよびＮＥＰプロモーターを含む(図１１)。両方のプロ モーターの機能をプライマー伸張分析によって確立した。図１２を参照のこと。 ３０６ｂｐのフラグメントがＮＥＰ転写を駆動するために十分であることを確 認した後、一連の欠失を５’および３’末端から作製した。次いで、これらの構 築物を、タバコにおけるインビボでの転写開始について試験した。プロモーター 欠失の模式図を図１１に示し、プライマー伸張データを図１２に示す。一連の欠 失に対するプライマー伸張分析によって、−１０〜＋２５（ｐＰＳ４３；図１２ ）および−５〜＋２５（ｐＰＳ４４；示さず）の範囲の配列がｃｌｐ−５３から の正確な開始を支持するために十分であることが示された。過剰露光に際して、 ＋１〜＋２５構築物においてさえも、正しい大きさの薄いバンドが観察された（ ｐＰＳ４５、示さず）。また、−１５２／＋１０構築物（ｐＰＳ１７；図１２） および−２２〜＋２１構築物（ｐＰＳ４１；示さず）において、ＮＥＰプロモー ターからの転写は完全に無くなった。このことによって、＋５と＋２５との間の 配列がＮＥＰプロモーターからの転写に重要であることが示される。このデータ のいくらかを図１１および１２にまとめる。 ＮＥＰポリメラーゼによる転写に必要とされる配列は未知である。転写開始部 位周辺のATAGAATA/GAAの保存に基づくと(Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９ ７，前出)、大部分のＮＥＰプロモーターはＩ型に分類された。ここで研究した プロモーターＰｃｌｐＰ−５３はこの配列モチーフを欠いており、そのためＩＩ 型に分類される。インビボにおけるプラスミドｐＰＳ１８の短縮プロモーターフ ラグメントの転写分析によって、ＰｃｌｐＰ−５３からの転写を支持するために 必要とされる配列は、転写開始部位に対して−５〜＋２５の範囲の３０塩基対フ ラグメント内に位置することが示される。さらに、＋１０と＋２５との間のヌク レオチドは転写開始のために重要である。なぜなら、この領域を欠くプラスミド ｐＰＳ１７およびｐＰＳ４１中のｃｌｐＰプロモーター誘導体からの転写は存在 しないからである。 イネｃｌｐＰプロモーター領域の発現によって、ＰｃｌｐＰ−５３プロモータ ーの転写開始部位に相同性を有する領域にマッピングされる転写物が明らかにな った。イネおよびタバコ配列のアラインメントによって、転写開始部位の下流の 有意な相同性およびそれほど高くない上流の相同性が示される。このイネの配列 がインビボにおいてタバコによって認識されたことを考慮すると（実施例ＩＩ） 、転写開始に重要な配列が、イネの配列中に存在するはずである。この情報を、 −２２／＋２５配列がインビボにおける転写開始に十分であるという知見と組合 せると、−３〜＋２５の範囲の配列5'-ATTGTTACGTTTCCACCTCAAAGTGAAA-3'（配列 番号２５の一部）がＰｃｌｐＰ−５３プロモーター機能に重要な情報を含むよう である。 構成性ＩＩ型ＰｃｌｐＰ−５３は全ての組織型において効率的に転写されるの で、これは全ての双子葉植物における選択マーカー遺伝子および経済的価値のあ るタンパク質の発現に有用である。 実施例ＩＶ イネ胚形成細胞培養物における色素体プロモーターの利用 タバコおよびトウモロコシ色素体におけるｃｌｐＰプロモーターの利用は上記 実施例に記載されている。この実施例は、イネにおける色素体プロモーターの利 用の分析に関する。いくつかのｍＲＮＡ種の５’末端を、培養胚形成イネ細胞お よび葉由来の試料においてマッピングした。ｃｌｐＰおよび１６ＳｒＲＮＡに対 するＲＮＡは胚形成イネ細胞において比較的豊富であり、このことによって、こ れらの遺伝子のプロモーターをイネにおける選択マーカー遺伝子および／または 目的外来遺伝子の色素体発現を駆動するために効果的に使用し得ることが示され る。 イネにおける色素体形質転換は、非常に所望されている。この実施例は、胚形 成培養イネ細胞におけるイネ色素体形質転換を実現するための組成物および方法 を提供する。そのような細胞を成熟植物に効率的に再生させ得る(Ｖａｓｉｌ， ＩＫ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：９２５−９３７；Ｃｈ ｒｉｓｔｏｕ，Ｐ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ １：４２３ −４３１)。培養タバコ（ＢＹ２）細胞からのデータによって、組織培養物にお ける色素体プロモーターの利用は葉とは異なる可能性があることが示唆される( Ｖｅｒａ Ａ，Ｓｕｇｉｕｒａ Ｍ（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２７： ２８０−２８４；Ｖｅｒａ Ａ，Ｈｉｒｏｓｅ Ｔ，Ｓｕｇｉｕｒａ Ｍ（１９ ９６）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５１：５１８−５２５，１９９６；Ｋａ ｐｏｏｒ Ｓ，Ｓｕｚｕｋｉ ＪＹ，Ｓｕｇｉｕｒａ Ｍ（１９９７）Ｐｌａｎ ｔ Ｊ １１：３２７−３３７)。本明細書に示すデータによって、培養胚形成 イネ細胞および葉が同じプロモーターを利用することが明らかにされる。ｒｂｃ Ｌ、ａｔｐＢ、１６ＳｒＤＮＡおよびｃｌｐＰは色素体にコードされる色素体Ｒ ＮＡポリメラーゼ（ＰＥＰ）によって認識されるプロモーターを各々１つのみ有 する。対照的に、ｃｌｐＰは両方の試料において核にコードされる色素体ＲＮＡ ポリメラーゼ（ＮＥＰ）によって転写される。ｃｌｐＰおよび１６ＳｒＲＮＡに 対するＲＮＡは胚形成細胞において比較的豊富であり、このことによって、これ らの遺伝子のプロモータが選択マーカー遺伝子の発現を駆動するために適切であ り得ることが示される。 実施例ＩＶについての材料および方法 植物材料。胚形成イネカルスをｃｖ．Ｔａｉｐｅｉ ３０９の成熟種子からＬ Ｓ２．５培地(Ａｂｄｕｌｌａｈ Ｒ，Ｃｏｃｋｉｎｇ ＥＣ，Ｔｈｏｒｎｐｓ ｏｎ ＪＡ（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１０８８−１０９ ０)上で開始(initiate)させた。カルスを液体ＡＡ培地(Ｍｕｌｌｅｒ ＡＪ，Ｇ ｒａｆｅ Ｒ（１９７８）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ １６１：６７−７６) に導入して、胚形成懸濁培養物を樹立し、２週間間隔で継代培養した。ＤＮＡお よびＲＮＡを、３ヶ月齢の培養物から継代培養の１４日後に調製した。植物を胚 形成カルスから２ｍｇ／ＬのＢＡＰおよび３％スクロースを補充した完全ＭＳ培 地上で再生させ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ Ｔ，Ｓｋｏｏｇ Ｆ（１９６２）Ｐｈｙ ｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ １５：４７３−４９７ １９６２）、無ホルモンＭＳ培 地上に移した。核酸単離用の葉を、これらの植物から４ヶ月後に取った。 ＲＮＡおよびＤＮＡゲルブロット。全細胞ＲＮＡをＳｔｉｅｋｅｍａら，１９ ８８（前出）に従って調製した。ＲＮＡ（１レーン当り５μｇ）をホルムアルデ ヒド−アガロースゲルの電気泳動に供し、ブロットし、ハイブリダイズさせた（ Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ ＰＴＪ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＬＡ，Ｍａｌｉｇａ Ｐ （１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ １６：４０４１−４０４８）。二本鎖ｐｔＤＮＡプ ローブをＰＣＲで生成させたかまたはゲル精製したＤＮＡフラグメントをランダ ムプライム³²Ｐ標識することによって調製した。ＰＣＲに使用したプライマーの 配列およびタバコ（Ｎ．ｔ．；登録番号Ｚ０００４４； Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら １９８６，前出）またはトウモロコシ(Ｚ．ｍ．；登録番号Ｘ８６５６３； Ｍ ａｉｅｒら，１９９５，前出)のｐｔＤＮＡ内でのその位置は以下のとおりであ る： 以下のｐｔＤＮＡフラグメントをプローブとして使用した：ｒｂｃＬ（Ｎ．ｔ ．）、ＢａｍＨＩフラグメント(ｐｔＤＮＡにおけるヌクレオチド５８０４７〜 ５９２８５)；１６ＳｒＤＮＡ（Ｎ．ｔ．）、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶフラグメ ント（ヌクレオチド１３８４４７〜１４０８５５）。 タバコ２５ＳｒＲＮＡに対するプローブは、プラスミドｐＢＲ３２５中にクロ ーン化したタバコ２５Ｓ／１８Ｓ遺伝子座由来の３．７５ｋｂ ＥｃｏＲＩフラ グメントを含むプラスミドｐＫＤＲ１（Ｄｅｍｐｓｅｙら，１９９３，前出）に 由来した。 相対的色素体ゲノムコピー数決定用の全葉ＤＮＡを調製し(Ｍｅｔｔｌｅｒ ＩＪ（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ ５：３４６−３４９ )、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、０．７％アガロースゲルで分 離し、ブロットし、色素体１６ＳｒＤＮＡおよび細胞質２５ＳｒＤＮＡプローブ とハイブ リダイズさせた（Ａｌｌｉｓｏｎら，１９９６，前出）。 プライマー伸張分析。プライマー伸張反応を全葉ＲＮＡに対して記載（Ａｌｌ ｉｓｏｎおよびＭａｌｉｇａ，１９９５，前出）のように実施した。プライマー を、公開されたイネ色素体ゲノム配列(Ｈｉｒａｔｓｕｋａら，１９８９，前出) におけるヌクレオチド位とともに以下に列挙する。 プライマー伸張反応を葉由来のＲＮＡ１μｇならびに胚形成細胞由来のＲＮＡ１ ０μｇ（ｃｌｐＰ、１６ＳｒＲＮＡ）および３０μｇ（ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ）を 用いて実施した。 結果および考察 いくつかの色素体プロモーターがイネおよび関連する単子葉植物において同定 されている。これらのプロモーターがこれらの植物種における選択マーカー遺伝 子および／または目的外来遺伝子の発現を駆動するために適切であるかどうかを 評価するために、転写物の蓄積を検討した。イネおよびトウモロコシにおいてｒ ｂｃＬ遺伝子はＰＥＰプロモーターから転写される(Ｍｕｌｌｅｔら，１９８５ ，前出；Ｎｉｓｈｉｚｉｗａ Ｙ，Ｈｉｒａｉ Ａ（１９８７）Ｊｐｎ Ｊ Ｇ ｅｎｅｔ ６２：３８９−３９５)。トウモロコシ葉緑体においてａｔｐＢ遺伝 子はＰＥＰプロモーターから転写され（Ｍｕｌｌｅｔら，１９８５，前出）、一 方、ＰＥＰを欠く母性白色ｉｏｊａｐ実生において、これは代替ＮＥＰプロモー ターから転写される。オオムギ葉緑体において１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（色素体リ ボソームＲＮＡオペロンの第１遺伝子）はＰＥＰプロモーターから転写され(Ｒ ｅｉｒｌｂｏ ｔｈｅ Ｓ，Ｒｅｉｂｏｔｈｅ Ｃ，Ｈｅｉｎｔｚｅｎ Ｃ，Ｓｅｉｄｅｎｂｅ ｃｈｅｒ Ｃ，Ｐａｒｔｈｉｅｒ Ｂ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：１５０ ５−１５１２)、一方、ＰＥＰを欠く白色ａｌｂｏｓｔｒｉａｎｓ実生において 、これは特徴付けられていないＮＥＰプロモーターから転写される（Ｈｅｓｓら ，１９９３，前出）。野生型およびｉｏｊａｐトウモロコシ葉緑体においてｃｌ ｐＰ遺伝子はＮＥＰプロモーターから転写される。 胚形成イネ細胞および葉細胞におけるこれらの遺伝子の発現レベルを測定する ために、ｍＲＮＡの蓄積をノーザンブロットで評価した。データによって、葉に 比較しての胚形成細胞における転写物レベルは、ｒｂｃＬについてはわずかに検 出可能であり（１５３倍低い）、ａｔｐＢ（３７倍低い）および１６ＳｒＤＮＡ （７倍低い）については低下しており、ｃｌｐＰについては同様である（約１． １倍低い）ことが明らかにされる。図１４を参照のこと。興味深いことに、１細 胞当りの色素体ゲノムコピー数（ｐｔＤＮＡ）は胚形成細胞および葉においてほ ぼ同じである。図１５を参照のこと。従って、転写物レベルの差は、ｐｔＤＮＡ コピー数について標準化した値を表す。 活性色素体プロモーターをさらに特徴付けるために、転写物の５’末端を、培 養胚形成細胞および葉においてプライマー伸張によってマッピングした。２つの 異なる５’末端(翻訳開始コドンの上流３１２および５８ヌクレオチド)がｒｂｃ Ｌについてマッピングされた。図１６を参照のこと。同じ２つの５’末端が、葉 の葉緑体および胚形成細胞の色素体においても同定された。２つの５’末端がイ ネ葉緑体においてＳ１ヌクレアーゼ分析によって同様な位置にマッピングされた （ＮｉｓｈｉｚａｗａおよびＨｉｒａｉ，１９８７，前出）。ｒｂｃＬの−３１ ２末端は、単子葉植物において保存されている−１０／−３５ σ⁷⁰型プロモー ターエレメントの下流に存在し；−５８末端はＲＮＡプロセシングによって生成 される（Ｍｕｌｌｅｔら，１９８５，前出；Ｒｅｉｎｂｏｔｈｅら，１９９３， 前出）。 ａｔｐＢについて、単一の５’末端が翻訳開始コドンの３１０ヌクレオチド上 流にマッピングされた。ｒｂｃＬについて、同じ５’末端が胚形成細胞および葉 において同定された。図１６を参照のこと。−３１０末端はＰＥＰプロモーター エレメ ントに関連し、イネ(Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｙ，Ｈｉｒａｉ Ａ（１９８９）Ｊ ｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ ６４：２２３−２２９)およびトウモロコシ（Ｍｕｌｌ ｅｔら，１９８５，前出）について葉緑体において以前に報告されている。 ｒＲＮＡオペロンについて、同じ２つの５’末端が、図１６に示すように胚形 成細胞および葉において成熟１６ＳｒＲＮＡの上流にマッピングされた。ＤＮＡ 配列保存に基づくと、−１１６末端はＰＥＰプロモーターの産物であり、一方− ２８末端はｍＲＮＡプロセシングに由来する。図１７Ａを参照のこと；Ｓｔｒｉ ｔｔｍａｔｔｅｒ Ｇ，Ｇｏｄｚｉｃｋａ−Ｊｏｓｅｆｉａｋ Ａ，Ｋｏｓｓｅ ｌ Ｈ（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ ４：５９９−６０４；ＶｅｒａよびＳｕｇｉ ｕｒａ，１９９５，前出；Ａｌｌｉｓｏｎら，１９９６，前出。 ｃｌｐＰについて、同じ５’末端が胚形成組織培養細胞および葉においてマッ ピングされた。図１６を参照のこと。転写物は１０ヌクレオチドのＮＥＰコンセ ンサス内、翻訳開始コドンの１１１ヌクレオチド上流で開始し（図５Ａに示す） 、これはｃｌｐＰ Ｉ型ＮＥＰプロモーターの産物である。 ｒｂｃＬ、ａｔｐＢ、１６ＳｒＤＮＡおよびｃｌｐＰの上流のＲＮＡ ５’末 端のマッピングによって、イネの培養胚形成細胞および葉において同じプロモー ターが同定された。イネにおけるこれらの研究から得られたデータをタバコにつ いて報告された結果に対照させることができる。タバコにおいて、ａｔｐＢおよ び１６ＳｒＤＮＡは、葉においてはＰＥＰプロモーターから、そしてＢＹ２組織 培養細胞においてはＮＥＰプロモーターから優先的に転写される(Ｖｅｒａおよ びＳｕｇｉｕｒａ １９９５；Ｋａｐｏｏｒら，１９９７）。イネ胚形成培養物 において、検討したいずれの色素体遺伝子についても、ＰＥＰからＮＥＰへのプ ロモーターの切り換えは観察されなかつた。データによって、ＰＥＰからＮＥＰ へのプロモーターの切り換えは細胞培養物への適応に必須ではないことが示唆さ れる。あるいは、上記の実施例において論じたように他の単子葉植物においてＰ ＥＰおよびＮＥＰプロモーターを有する遺伝子であるａｔｐＢおよび１６ＳｒＤ ＮＡは、イネにおいてＮＥＰプロモーターを有しない。 胚形成イネ細胞とタバコＢＹ２細胞株との間の１つの重要な差は、培養時間の 長 さである。本明細書に記載のイネ細胞培養株は、わずか数ヶ月齢であり、植物に 再生する能力を維持していた。ＢＹ２細胞株は、培養物中で数年間培養されてお り、植物再生能を失っている（Ｙａｓｕｄａ Ｔ，Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ，Ｎａｇ ａｔａ Ｔ（１９８８）Ｐｌａｎｔａ １７４：２３５−２４１）。従って、Ｂ Ｙ２細胞において色素体遺伝子発現が短期間培養のタバコ細胞またはタバコ植物 とは異なる可能性が残る。 本明細書に示す結果によって、トランスジェニックイネ細胞および／または植 物の生産のための実用的暗示が提供される。イネ胚形成細胞において活性な以下 の２つの強力なプロモーターが本明細書に記載されている：ｃｌｐＰ ＮＥＰプ ロモーターおよびｒｒｎ ＰＥＰプロモーター。両方のプロモーターは、胚形成 イネ細胞における色素体形質転換のための選択マーカー遺伝子の発現を駆動する ために適切である。 本発明の特定の好ましい実施態様を記載し、具体的に上記で例示したが、本発 明がそのような実施態様に限定されることは意図しない。下記の請求の範囲に記 載するような本発明の範囲および精神から逸脱することなく種々の改変がなされ 得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 スリラマン，プリヤ アメリカ合衆国08854ニュージャージー州 ピスカタウェイ、デイビッドソン・ロー ド900番、アパートメント60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１、配列番号９および配列番号１１によってコードされるプロモ ーターエレメントの群より選択される、植物細胞の色素体における少なくとも１ つの目的外来タンパク質の生産を増強するための、単離されたｒｐｏＢプロモー ターエレメントおよびそのホモログ。 ２．配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８によってコードさ れるプロモーターエレメントの群より選択される、植物細胞の色素体における少 なくとも１つの目的外来タンパク質の生産を増強するための、単離されたａｔｐ Ｂプロモーターエレメントおよびそのホモログ。 ３．配列番号３、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５ 、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、 配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配 列番号２６、配列番号３０および配列番号３１によってコードされるプロモータ ーエレメントの群より選択される、植物細胞の色素体における少なくとも１つの 目的外来タンパク質の生産を増強するための、単離されたｃｌｐＰプロモーター エレメントおよびそのホモログ。 ４．配列番号２８および配列番号２９によってコードされるプロモーターエレ メントの群より選択される、植物細胞の色素体における少なくとも１つの目的外 来タンパク質の生産を増強するための、単離された１６ＳｒＤＮＡプロモーター エレメントおよびそのホモログ。 ５．高等植物の色素体を安定に形質転換するためのＤＮＡ構築物であって： ａ）少なくとも１つの目的外来タンパク質をコードする転写単位； ｂ）該転写単位に作動可能に連結された縦列の第１のＮＥＰプロモーターおよ び第２のＰＥＰプロモーター；ならびに ｃ）該プロモーターによって調節される該転写単位の発現 を含む構築物。 ６．ＮＥＰプロモーターがｃｌｐＰ−１１１でありＰＥＰプロモーターがＰｒ ｒ ｎ−１１４である請求項５記載のＤＮＡ構築物。 ７．ＮＥＰプロモーターがｃｌｐＰ−５３でありＰＥＰプロモーターがＰｒｒ ｎ−１１４である請求項５記載のＤＮＡ構築物。