JP2002369679A - α−マンノシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来知られている公知のα-マンノシダーゼ
より糖蛋白質糖鎖に対する酵素活性が強く、中性付近で
作用し、また酵母のマンノース-1-リン酸結合を有する
糖蛋白質糖鎖からマンノースを切り出すことが容易であ
る新規α-マンノシダーゼを提供する。 【解決手段】 至適pHが６〜９．５のα-マンノシダー
ゼ、及び該α-マンノシダーゼを含有し、かつエンド-α
-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-
β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に有さない
ことを特徴とする、α-マンノシダーゼを含有する画分
を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はα-マンナンなどの
α-マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ糖のα-
マンノシド結合に特異的に作用する新規な酵素α-マン
ノシダーゼ、及びその製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生化学辞典（東京化学同人発行、1990
年）には、α-マンノシダーゼは、α-マンノピラノシド
結合を加水分解するエキソグリコシダーゼである旨、お
よびα-マンノシダーゼは動物組織に広く分布し、また
高等植物や放線菌にも存在する旨が記載されている。

【０００３】α-マンノシダーゼは酵母マンナンをはじ
め多くのα-マンナンの構造決定のための生化学試薬と
して、更には酵母表層を覆っているマンナン類を改変し
てその物性を変化させることで種々の酵母を利用する生
産技術の発展を図るためなど多くの用途が考えられる。

【０００４】また、加水分解の逆反応（脱水縮合反応）
を利用してα-マンノシド結合を含む高マンノース型オ
リゴ糖の合成への利用も考えられている。また、出芽酵
母やメタノール酵母などの主にα-マンノシド結合から
なる糖鎖を削ることにより、糖蛋白質の糖鎖部分を除去
した構造安定的な蛋白質を回収できる。糖蛋白質糖鎖は
蛋白質の結晶化に不都合であることから、糖鎖の除去に
より結晶構造解析に適した蛋白質の生産が可能である。

【０００５】α-マンノシダーゼには、その基質特異性
からα-１，２-マンノシダーゼ、α-１，６-マンノシダ
ーゼ、α-１，２；１，３-マンノシダーゼ、α-１，
３；１，６-マンノシダーゼ、および非特異的に切断す
るα-マンノシダーゼなどが知られている。α-１，２-
マンノシダーゼは非還元末端側からα-１，２-マンノシ
ド結合を切断する酵素で、糸状菌（特開昭５７-５４５
８８）や担子菌（Lipari et al., Biochemistry, 38, 1
111-1118 (1999) ; Maras et al., J. Biotechnol., 7
7, 255-63 (2000)）などが知られており、いずれも組み
換え体が市販されている。α-１，６-マンノシダーゼと
α-１，２；１，３-マンノシダーゼは、Xanthomonas s
p. 由来のものが市販されている（Womg-Madden and Lan
dry, Glycobiology, 5, 19-28 (1995); Scaman et al.,
Glycobiology, 6, 265-270 (1996)）。α-１，３；
１，６-マンノシダーゼは、主に動物細胞のゴルジ体で
糖蛋白質糖鎖のプロセシングに関わる酵素として知られ
ており、マンノシダーゼIIとも呼ばれる（Moremen and
Robbins, J. Cell Biol., 115, 1521-1534 (1991) ; Mi
sago etal., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 92, 117
66-11770 (1995)）。

【０００６】これらがいずれも結合特異性を有するのに
対し、非特異的に切断するα-マンノシダーゼはすべて
のα結合のマンノースを切断できる。真核生物で比較的
よく保存されているのがリソソーマルマンノシダーゼ
（酵母では液胞マンノシダーゼ）と呼ばれるもので、弱
酸性領域に至適pHを有し、細胞内で不溶になった糖蛋白
質糖鎖部分を分解・再利用するのに利用されている。し
かしながら細胞内では膜に結合して存在し、比較的疎水
性の高い蛋白質であることが多いため、精製が容易でな
い。

【０００７】非特異的に切断するα-マンノシダーゼで
もっとも知られているのは、タチナタマメ（Jack Bea
n）由来のα-マンノシダーゼである。この酵素は1966年
に発見され（Li, J. Biol. Chem., 241, 1010-1012 (19
66)）、以後数多くの研究が行われてきた（Snaith, Bio
chem. J., 147, 83-90 (1975) ; Hara et al., Biosci.
Biochem. Biotech., 58, 60-63 (1994)など）。この酵
素は市販され、構造決定のための生化学試薬として利用
されている。他にサザエ由来のα-マンノシダーゼ（生
化学工業社製）が市販されているが、いずれも糖蛋白質
の糖鎖そのものに対しては比較的酵素活性が弱く長時間
の反応が必要であるため、糖蛋白質の糖鎖部分を除去し
た構造安定的な蛋白質の回収には不適である。また弱酸
性側に至適pHを有する（pH=4.5）ため、弱酸性側で不安
定な蛋白質は失活する恐れがある。したがって、更に酵
素活性が強く、精製も容易であり、かつ蛋白質が安定な
中性のpHで作用できる新規のα-マンノシダーゼが求め
られている。

【０００８】ところで、酵母の糖鎖中にはα結合のマン
ノースのほかに、コア糖鎖部分および糖外鎖部分にマン
ノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖も生成することが
わかっている。この修飾は、動物細胞と異なり、酵母で
は液胞（動物細胞のリソソームに相当するオルガネラ）
局在性糖蛋白質のsorting signalとしては機能しないこ
とが報告されている。従って、酵母におけるこのリン酸
化糖鎖の生理機能は不明のままである[Kukuruzinska et
al, Ann. Rev. Biochem., Vol.56, p915-944(1987)]。

【０００９】一方、動物細胞内において、細胞内小器官
のひとつであるリソソームでは、数多くの酸性加水分解
酵素が存在し、細胞内外からリソソームに取り込まれた
物質の分解を担っている。ヒトリソソームに局在する酵
素群の多くは、生合成されゴルジ体に輸送されると、そ
のハイマンノース型糖鎖の非還元末端のマンノース残基
の6位にリン酸基が付加し、酸性糖鎖をもつ糖蛋白質に
変換され、これがリソソーム酵素特異的な認識マーカー
となる。そしてその高親和性受容体であるマンノース-6
-リン酸受容体（MPR）との結合を介して、他の蛋白質か
ら選別され、プレリソソームへ運ばれ、酸性条件下でMP
Rから解離した後、さらにリソソームへと輸送される（v
on Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem., 54, 16
7-193 (1984)）。マンノース-6-リン酸受容体（M6PR）
との結合にはマンノース-6-リン酸を１本の糖鎖内に１
分子以上含むことが必要である。このリソソーム酵素特
異的なリン酸基の付加反応は、2種の酵素反応により行
なわれている。W. Canfieldらはマンノース-６-リン酸
合成に関与する２種の酵素（GlcNAc-phosphotransferas
e、GlcNAc-phosphodiester-GlcNAc'ase）の遺伝子クロ
ーニングに成功している（Abstract of the XV Interna
tional Symposium on Glycoconjugates. Glycoconjugat
e Journal Vol. 16 No. 4/5 S41 (1999)）。したがっ
て、マンノース-6-リン酸、あるいはそれを含有する糖
蛋白質を作製できれば、リソソームやマンノース-6-リ
ン酸受容体（MPR）の機能解明、さらにはリソソーム酵
素を欠損したヒトの治療薬への応用が期待できる。

【００１０】本発明者らは酵母の糖鎖合成変異株（ΔOC
H1 mnn1）を用いて糖蛋白質を生産させ、これにMNN6遺
伝子産物を生体内または生体外で働かせることにより、
マンノース-１-リン酸が付加した酸性糖鎖を得て、これ
を酸処理することによりリソソーム輸送シグナルとして
有効な哺乳類と同様な糖鎖を得る方法を提案している
（特開平9-135689）。しかしこの方法では極度の変性条
件下（0.01Ｎ塩酸中、100℃、30分間）におくため殆ど
の糖蛋白質は変性してしまう。よって生理活性を有する
糖蛋白質を得る方法としては十分なものではなかった。
すなわち、特開平9-135689に記載されているような酵母
を利用して、マンノース-6-リン酸を含有した糖蛋白質
を得るためには、フォスフォジエステル結合したα-マ
ンノースを温和な条件で切断する酵素が求められてい
た。

【００１１】前述のようなフォスフォジエステル結合し
たα-マンノースを温和な条件で切断するためには、ア
グリコンとなる部分に特異性が低いことが重要であると
考えられる。これまでの実験ではフォスフォジエステル
結合したα-マンノースを切断できたのはタチナタマメ
由来のα-マンノシダーゼのみである（Herscovics eta
l., J. Biol. Chem., 250, 8079-8084 (1975)）。この
タチナタマメ由来のα-マンノシダーゼは合成基質であ
るｐ-ニトロフェニル-α-マンノシドや4-メチルウンベ
リフェリル-α-マンノシドを切断できるが、前述のよう
に至適pHが低いことが問題である。

【００１２】非特異的に切断するα-マンノシダーゼと
してCellulomonas属のα-マンノシダーゼが考えられた
（Takegawa et al., Biochim. Biophys. Acta, 991, 43
1-437(1989)；Takegawa, J. Ferm. Bioeng., 69, 129-1
31 (1990)）。しかしこれらは合成基質であるｐ-ニトロ
フェニル-α-マンノシドをほとんど切断できない。した
がってフォスフォジエステル結合したα-マンノースを
切断することは難しいと考えられた。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、従来知られている公知のα-マンノシダー
ゼより糖蛋白質糖鎖に対する酵素活性が強く、中性付近
で作用し、また酵母のマンノース-1-リン酸結合を有す
る糖蛋白質糖鎖からマンノースを切り出すことが容易で
ある新規α-マンノシダーゼ、および当該α-マンノシダ
ーゼを含有する画分を提供することである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、土壌中より高マンノ
ース型糖鎖を有する糖蛋白質などのα-マンノシド結合
に特異的に作用する新規なα-マンノシダーゼを生産す
るグラム陽性菌を分離した。そのグラム陽性菌の生産す
る高マンノース型糖鎖を有する糖蛋白質などのα-マン
ノシド結合を含有する糖鎖に作用する新規なα-マンノ
シダーゼ（本発明酵素）の分離を試み、本発明を完成さ
せるに至った。

【００１５】すなわち本発明は、下記の（1）〜（3）の
酵素学的性質を有することを特徴とするα-マンノシダ
ーゼ、及び該α-マンノシダーゼを含有し、かつエンド-
α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド
-β-N-アセチルグルコサミニダーゼを実質的に含有しな
いことを特徴とする、α-マンノシダーゼ画分（以下、
「本発明酵素画分」ともいう）を提供するものである。 （1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-Man）のα-マ
ンノシド結合を特異的に分解し、マンノースを遊離す
る。およびフォスフォジエステル結合しているα-D-マ
ンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解し、マンノー
スを遊離する。 （2）以下の基質特異性のうち少なくとも一つを有す
る： （a）β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、お
よびエンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活
性）は検出されない。 （b）下記構造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に
構造式２で示される糖鎖を生成する。

【００１６】

【化４】 ［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチル
グルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、
α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシ
ド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジ
ルアミノ基をそれぞれ示す。］

【００１７】（c）下記構造式３で示される糖鎖構造を
含有する糖蛋白質に作用し、最終的に下記構造式４で示
される糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成する。

【００１８】

【化５】 ［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチル
グルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、
α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシ
ド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示
す。］

【００１９】（d）下記構造式５〜７で示される糖鎖に
作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末
端に含有する糖鎖を生成する。

【００２０】

【化６】

【００２１】（e）構造式５〜７で示される糖鎖構造を
含有する糖蛋白質に作用し、マンノース-6-リン酸（構
造式８）を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖
蛋白質を生成する。

【００２２】（3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Man
を基質とした場合） 好ましくは、上記（1）〜（3）の酵素学的な性質に加
え、更に下記（4）〜（6)の酵素学的性質を有すること
を特徴とする、α-マンノシダーゼを提供する。 （4）至適温度：30〜55℃（4-MU-α-Manを基質とした場
合） （5）安定温度：55℃以下（4-MU-α-Manを基質とした場
合） （6）阻害及び活性化：1 mM Ca²⁺によって僅かに（１０
％）活性化される。Hg²⁺、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca^{2 +}の添
加によって活性が回復する。 （7）ミハエリス定数：0.32 mM^-1（4-MU-α-Manを基質
とした場合） エンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノシダーゼ、およ
びエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼは、その基
質が本発明酵素の基質と共通するグリコシダーゼであ
る。従って、これら類縁のグリコシダーゼを実質的に含
有しない本発明画分は、たとえ前記類縁のグリコシダー
ゼ以外の酵素が混入していても、本発明酵素とほぼ同様
に利用することができる。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳しく説明する。
本発明酵素画分は、下記の（1）〜（3）の酵素学的性質
を有することを特徴とするα-マンノシダーゼ（本発明
酵素）を含有し、かつエンド-α-マンノシダーゼ、β-
マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサ
ミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴とするもの
である。

【００２４】（1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-M
an）のα-マンノシド結合を特異的に分解し、マンノー
スを遊離する。およびフォスフォジエステル結合してい
るα-D-マンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解
し、マンノースを遊離する。この点で既知のCellulomon
as属のα-マンノシダーゼとは区別される。尚、基質と
しては、天然の基質の他、分解活性の確認のため等に、
例えば4-メチルウンベリフェリル-α-D-マンノピラノシ
ド等の合成基質を使用することもできる。

【００２５】（2）以下の基質特異性のうち少なくとも
一つを有する： β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、および
エンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）は
検出されない。これらの点で公知のβ-マンノシダー
ゼ、エンド-α-マンノシダーゼとは区別される。下記構
造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に下記構造式２
で示される糖鎖を生成する。

【００２６】

【化７】 ［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチル
グルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、
α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシ
ド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジ
ルアミノ基をそれぞれ示す。］ 構造式５〜７で示される糖鎖に作用し、マンノース-6-
リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する糖鎖を生成
する。

【００２７】

【化８】 なお、上述の基質となる糖鎖はPA誘導体に限定されな
い。例えば、2-アミノベンズアミドなどの他の標識体で
も構わないし、蛋白質に結合した状態でも構わない。

【００２８】（3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Man
を基質とした場合） 本発明の酵素：α-マンノシダーゼの至適ｐＨは、より
望ましくは７〜８、最も望ましくは７．５である。ここ
でいう至適ｐＨは、実施例で示された実験によって計測
された相対活性が５０％以上の範囲を指す。該酵素の至
適温度は、３０〜５５℃、より望ましくは３５〜４５
℃、最も望ましくは４０℃である。ここでいう至適温度
は、実施例で示された実験によって計測された相対活性
が５０％以上の範囲となる温度を指す。該酵素の安定温
度は５５℃以下、より望ましくは４０℃以下、最も望ま
しくは３０℃以下である。ここでいう安定温度は、実施
例で示された実験によって計測された相対活性が５０％
以上の範囲となる温度を指す。

【００２９】尚、本発明に係るα-マンノシダーゼ酵素
は、糖鎖及び糖鎖構造を含有する蛋白質に対してα-
１，２、α-１，３、α-１，６マンノシド結合をいずれ
も分解することができる。従って、構造式１に示す糖
鎖、あるいは構造式３に示す糖鎖構造を含有する糖蛋白
質に対して作用した場合、上記のマンノシド結合を、構
造式２に示す糖鎖、あるいは構造式４に示す糖鎖構造を
含有する糖蛋白質まで順次分解し得る。従って、本明細
書において、「最終的に」とは、複数の分解反応を経て
生成物が得られることを意味する。

【００３０】本発明酵素は、該酵素を生産する細菌を適
当な培地に接種して培養し、培養後の培養物（液体培養
の時は培養液）から菌体を分離除去し（遠心分離、凝集
分離、濾過など）、次いで一般的な酵素の分離精製法
（例、「入門酵素化学」、昭和４８年７月１日、（株）
南江堂発行 参照）を適用することによって必要とされ
る精製度の酵素標品として採取される。

【００３１】なお本発明酵素はもともと細菌から得られ
たものであるが、本発明酵素画分が得られるかぎりにお
いてその由来は限定されない。例えば動物由来であって
もよく、また遺伝子工学的手法等により製造されたもの
であってもよい。これらの中でも細菌由来のものが好ま
しく、グラム陽性菌由来のものがより好ましい。本発明
において特に好適に使用できるものは、Cellulomonas属
に属する細菌由来のものである。本発明者等は、本発明
において特に好適な細菌として、Cellulomonas属に属す
るSO-5株を、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１
中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物
寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628と
いう受託番号で国際寄託されている。本発明酵素の製造
方法も、最終的に本発明酵素画分が取得できる限りにお
いて特に限定されない。例えば上述したような細菌等を
培養し、その培養物から本発明酵素画分を精製すること
により製造することができる。

【００３２】前記細菌の培養は、該菌が資化可能な窒素
源（酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティー
プリカー、大豆粕などの有機窒素源；硫安、尿素、硝酸
アンモニウムなどの無機窒素源）、無機塩（鉄、マグネ
シウム、カルシウム、カリウムなどの硫酸塩、リン酸
塩、塩酸塩など）などを含む培地に、酵母マンナンなど
の本発明酵素画分が誘導されるような炭素源を加え、好
気的な培養法（振盪培養、攪拌培養、通気培養など）に
よって生育に適した温度で８時間〜数日間培養すること
によって培地中に酵素を生産させることができる。培養
に際し、培地に酵母エキスを添加すると生育が盛んにな
り、培地単位体積あたりの酵素活性を上昇させることが
できる。

【００３３】菌体を分離除去した液体培養後の培養液か
ら、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による
塩析；エタノール、アセトン、イソプロパノール、テト
ラヒドロフラン等の有機溶媒による沈澱法；ヒドロキシ
アパタイト（水酸化リン酸カルシウム）等による吸着ク
ロマトグラフ法；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）
基、トリエチルアミノエチル基等の交換基を有する陰イ
オン交換体等によるイオン交換クロマトグラフ法；アフ
ィニティークロマトグラフ法；ゲル濾過クロマトグラフ
法；分子ふるい膜等による限外濾過法；電気泳動法など
公知の酵素精製法によって目的とする精製度の酵素標品
を得ることができる。本発明酵素画分に特徴的な活性
は、例えば後述の[実施例1]に従って測定することがで
きる。本発明酵素画分は、少なくとも本発明酵素を含有
しており、かつエンド-α-マンノシダーゼ、β-マンノ
シダーゼ、およびエンド-β-N-アセチルグルコサミニダ
ーゼを実質的に含有しない限りにおいて特に限定されな
い。

【００３４】なお本明細書において「実質的に」とは、
この言葉のかかる状態が、いわゆる当業者において、そ
の状態であると認識するのに十分な実質を備えている状
態を意味する。例えば「実質的に含有しない」とは、全
く含有しない、又は含有しているとしてもその含有量が
わずかであって、いわゆる当業者において検出できな
い、もしくは検出できたとしても微量であって、測定誤
差範囲内と認識される状態であることを意味するもので
ある。

【００３５】本発明酵素画分は完全に精製されていなく
てもよく、本発明酵素の作用が発揮でき、かつ本発明酵
素の利用上好ましくない物質を含まない限りにおいて、
部分精製されたものであってもよい。「本発明酵素の利
用上好ましくない物質」は、本発明の利用の目的・態様
に応じて、当業者が適宜決定でき、除去できる。部分精
製された酵素画分の酵素学的性質を分析し、本発明によ
り開示された本発明酵素画分の酵素学的性質と比較する
ことにより、本発明酵素画分の製造が確認できる。

【００３６】本発明酵素画分には、エンド-α-マンノシ
ダーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセ
チルグルコサミニダーゼ以外の成分であって、かつ本発
明酵素の活性を実質的に害さないかぎり、他の成分を含
有していてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられ
る賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有せしめる
こともできる。上記本発明のα-マンノシダーゼは、種
々の用途に使用することができる。例えば、マンノース
-6-リン酸を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する
糖蛋白質を製造することができる。

【００３７】

【実施例】次に実施例により本発明を更に詳しく説明す
るが、これらの実施例は本発明の一例を示すものであ
り、これらに限定されるものではない。

【００３８】[実施例1] 本発明酵素および夾雑酵素の
活性測定法 スクリーニングの際のマンナン分解活性の測定は、α-
マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の還元力
を測定することによって行なった。すなわち、α-マン
ナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液（0.4 M リ
ン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分間、反応を行
い、反応後マンノースを標準として還元糖をネルソン・
ソモジ（Nelson Somogi）法によって測定した（福井作
蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の定量法（学会
出版センター）、p. 10(1979)）。

【００３９】精製の各段階の粗酵素および部分精製酵素
のα-マンノシダーゼ活性の測定は、4-メチルウンベリ
フェリル（MU）-α-マンノピラノシドを基質として反応
を行い、遊離する4-MUを測定することによって行なっ
た。すなわち、0.5 mM 4-MU-α-マンノピラノシドと酵
素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭリ
ン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で30分間反応後、0.2 M
グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停止
した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量をマ
イクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で測
定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間に1
μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下
「U」と略す）とした。

【００４０】共存する夾雑酵素の測定法は以下のように
行なった。エンド-α-マンノシダーゼ活性の測定は、α
-1,6-マンナンを基質として反応を行い、遊離した糖の
還元力を測定することによって行なった。すなわち、α
-1,6-マンナン（終濃度0.1％）と酵素液を含む反応液
（0.4 M リン酸緩衝液、pH 7.0）中、３７℃で１０分
間、反応を行い、反応後マンノースを標準として還元糖
をネルソン・ソモジ（Nelson Somogi）法によって測定
した（福井作蔵、生物化学実験法シリーズ１，還元糖の
定量法（学会出版センター）、p. 10(1979)）。

【００４１】β-マンノシダーゼ活性の測定は、p-ニト
ロフェニル（pNP）-β-D-マンノピラノシドを基質とし
て反応を行い、遊離するpNPを測定することによって行
なった。すなわち、5 mM pNP-β-D-マンノピラノシドと
酵素液を含む反応液70 μl（0.15 M NaClを含む20 mＭ
リン酸緩衝液、 pH 7.5）中、37℃で24時間反応後、0.2
M グリシン緩衝液（pH 10.7）を700μl加えて反応を停
止した。うち100 μlをとり、遊離した4-MUの蛍光量を
マイクロプレートリーダー（Ex:385 nm, Em:450 nm）で
測定した。酵素活性の単位は、上記反応において1分間
に1 μmoleの4-MUを遊離する酵素量を１ユニット（以下
「U」と略す）とした。

【００４２】[実施例2] α-マンノシダーゼ生産菌のス
クリーニング マンノシダーゼを誘導生産するための培地（マンナン液
体培地）は以下の通りに作成した。パン酵母マンナン2
g、硫酸アンモニウム［（NH₄）₂SO₄］500 mg、硫酸第二
鉄［Fe₂SO₄］ 20 mg、硫酸マグネシウム［MgSO₄・7H
₂O］ 400 mg、塩化カルシウム［CaCl₂・2H₂O］ 60 mg、
酵母エキス 1 g、第二リン酸カリウム［K₂HPO₄］ 7.54
g、第一リン酸カリウム［KH₂PO₄］ 2.32 gに水を加えて
１Ｌとした。またマンノシダーゼ生産菌を単離するため
の平板培地は、上記マンナン液体培地に寒天末を1.5%に
なるように加えたものを用いた。

【００４３】試験管に入った2 mlのマンナン液体培地
に、土壌懸濁水から植菌耳で植菌し、30℃、2晩振盪培
養した。この培養液を植菌耳で新しい2 mlのマンナン液
体培地に植え継ぎし、再び30℃、2晩振盪培養した。2晩
の振盪培養を計3回行なった後、1晩の振盪培養を2回行
なった。培養液を遠心し、培養上清を10 mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析した粗酵素液を、マ
ンナン分解酵素活性の測定に用いた。活性のあった土壌
サンプルについて、さらにα-マンノシダーゼ生産菌の
スクリーニングを進めた。

【００４４】活性のあった培養液を、線引き法、希釈法
にて平板プレートに植菌して、30℃で培養した。数日
後、現れたコロニーを拾い、マンナン液体培地に植菌し
て30℃、2晩振盪培養した。培養液を遠心し、培養上清
を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に対して透析
した粗酵素液について、α-マンナンと合成基質をもち
いて酵素活性を測定した。

【００４５】この操作を数回繰り返し、確実なシングル
コロニーを拾って完全なα-マンノシダーゼ生産菌の単
離を行なった。この生産菌をSO-5と命名した。なお、こ
のSO-5株は、日本国茨城県つくば市東１丁目1番地１
中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物
寄託センターに2001年６月１２日付けでFERM BP-7628と
いう受託番号で国際寄託されている。

【００４６】[実施例3] 新規なα−マンノシダーゼ生
産菌SO-5の同定 リボゾームRNA遺伝子の塩基配列の相同性は分子系統、
分類上重要であり、遺伝子のコピー数、構成は種によっ
て異なっている。したがってリボゾームRNAの塩基配列
により細菌の同定が可能である。

【００４７】SO-5株よりWizard Genomic DNA Purificat
ion Kit（プロメガ社製）を用いてゲノムDNAを単離し
た。これをテンプレートDNAとし、リボゾームRNA領域を
コードする部分の塩基配列をPCRにて増幅した。プライ
マーはSPF1（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG:配列番号１）とSPR
1（GGTTACCTTGTTACGACTT：配列番号２）を用い、得られ
た約1.5 kbの断片をPGEM-T vector（プロメガ社製）に
クローニングした後、ジデオキシ法により部分塩基配列
を決定した。その結果を配列番号３に示した。

【００４８】この配列を日本DNAデータバンクのweb sit
eから利用できるBLASTシステムを用いて相同性検索を行
なったところ、Oerskovia xanthineolyticaならびにCel
lulomonas属と高い相同性がみられた。Oerskovia属は樹
枝状に成長するが、SO-5株は普通の丸いコロニーを形成
する。これらの結果から、SO-5株はCellulomonas sp.で
あることが推定された。

【００４９】[実施例4] α-マンノシダーゼの生産と部
分精製 α-マンノシダーゼを誘導生産するため、実施例２で得
られたSO-5をマンナン液体培地で30℃、一晩培養を行な
った。培養後、4℃、15,000 x gで10分遠心し、菌体を
除去した。上清を2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HE
PES-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、粗酵素液とし
た。

【００５０】次にこの粗酵素液に終濃度1.2 Mとなるよ
うに硫酸アンモニウムを添加したあと、4℃で一晩混合
した。これを遠心し、沈殿を除いた上清に対し、さらに
終濃度1.7 Mとなるように硫酸アンモニウムを添加した
あと、4℃で一晩混合した。次に4℃、15,000 x gで10分
遠心し、沈殿する蛋白質を回収した。得られた沈殿物を
H₂Oに溶解し、2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPES
-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行なった。これを2 mMの
塩化カルシウムを含む10 mM HEPES-Na緩衝液（pH 7.0）
で平衡化したHiTrap Qカラムに供した。NaClの濃度を1
Mまで増加させるグラジエント溶出を行ない、活性画分
を得た。これを2 mMの塩化カルシウムを含む10 mM HEPE
S-Na緩衝液（pH 7.0）で透析を行ない、部分精製標品と
した。

【００５１】部分精製標品は[実施例1]に従い、α-マン
ノシダーゼ活性、エンド-α-マンノシダーゼ活性、β-
マンノシダーゼ活性を測定した。比活性は31.9 mU/mg
で、エンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活
性）、β-マンノシダーゼ活性は検出されなかった。

【００５２】[実施例5] 新規なα-マンノシダーゼの酵
素学的性質 測定は実施例4で得られた精製酵素を用いて行なった。 （ａ）至適ｐＨ：本酵素について酢酸ナトリウム緩衝液
（pH 4.0〜6.5）、リン酸緩衝液（pH 6.0〜8.0）、トリ
ス緩衝液（pH7.5〜10.0）を用いて37℃、30分間の酵素
反応を行い、至適ｐＨを調べたところ、図１に示すよう
にｐＨ６〜９．５、特に7.5付近であった。 （ｂ）至適温度：本酵素について20〜80℃の各温度でリ
ン酸緩衝液（ｐＨ 7.5）中、30分間反応させて至適温度
を調べたところ、図２に示すように30〜55℃、特に40℃
付近であった。 （ｃ）安定温度：本酵素について0.1 Ｍリン酸緩衝液
（pH 7.5）中、0〜80℃の範囲で30分間処理した後、37
℃、30分間の酵素反応によって残存活性（相対活性）を
調べたところ、図２に示すように55℃まで安定であっ
た。 （ｄ）金属イオンの影響：本酵素について無機イオンお
よび阻害剤による影響を、反応系に添加して37℃、30分
間の酵素反応によって調べた。Ca²⁺によって僅かに（１
０％）活性化された。またHg²⁺、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca
²⁺の添加によって活性が回復した。 （ｅ）ミハエリス定数：本酵素の4-MU-α-マンノピラノ
シドに対するミハエリス定数（Km）を、基質濃度の逆数
と反応速度の逆数をプロットとして求めたところ、Km=
0.32 mM^-1であった（図３）。なお、高濃度の基質（1 m
M以上）では、基質阻害が見られた。

【００５３】（ｆ）高マンノース糖鎖に対する作用：本
酵素を高マンノース型糖鎖に作用させたときの切断様式
を図５に示す。アミノカラムを用いたHPLCでは、蛍光標
識された（PA化）オリゴ糖をその鎖長によって分離する
ことが可能である。カラムはSHODEX AsahiPak NH₂P-50
（4.6 x 250 mm、昭和電工製）を使用し、溶媒は、200
mM酢酸-トリエチルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニ
トリルとの30：70の混合液（A液）、200 mM酢酸-トリエ
チルアミン緩衝液（pH 7.0）とアセトニトリルとの50：
50の混合液（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml
/minで流すことによりカラムを平衡化し、試料注入直後
から溶媒Bの割合を50分かけて100％まで直線的に上昇さ
せ、PA化オリゴ糖を溶出した。PA化糖鎖は蛍光検出器
（励起波長:320nm, 蛍光波長:400nm）にて検出した。反
応は糖鎖100 pmolに対し、本発明酵素画分20 μUを加
え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）中、37℃で
10分から2時間反応した。Man8GlcNAc2-PA（構造式1、Ｍ
８）を基質とした場合、Man5GlcNAc2-PA（Ｍ５）まで比
較的早く分解されたあと、さらにMan4GlcNAc2-PA（Ｍ
４）が徐々に生成し、Man2GlcNAc2-PA（Ｍ２）もわずか
ながら生成している（図４）。２時間反応後では、Man4
GlcNAc2-PAの他に、Man3GlcNAc2-PA（Ｍ３）、Man2GlcN
Ac2-PA（Ｍ２）、Man1GlcNAc2-PA（Ｍ１）の３本のピー
クが見られた。このことから、本酵素は、α-１，２-マ
ンノシド結合、α-１，３-マンノシド結合、α-１，６-
マンノシド結合に関わらず、非還元末端から非特異的に
α-マンノシド結合に作用することから、エンド-α-マ
ンノシダーゼ活性（エンド型分解活性）がないことがわ
かった。またこの結果からエンド-β-N-アセチルグルコ
サミニダーゼ活性は共存しないことが予想された。

【００５４】（ｇ）β-マンノシド結合を有する糖鎖に
対する作用：ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-マンノシドを基
質とした際には活性が見られなかったことから、β-マ
ンノシドには作用しないことが明らかとなった。 （ｈ）酵母リン酸含有酸性糖鎖に対する作用：酵母の生
産する糖鎖中にはマンノースリン酸を含有する糖鎖が知
られている（Kukuruzinska et al, Ann. Rev. Bioche
m., 56, 915-944 (1987)）。（構造式７）に示したよう
な構造を有する糖鎖に対する作用を調べた。その結果を
図５に示した。なお、分析にはSuperQ 5PW（東ソー製）
を使用し、溶媒は、2 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.
0）（A液）、0．25 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0）
（B液）を調製した。予め溶媒Aを流速1.0 ml/minで流す
ことによりカラムを平衡化し、試料注入直後から溶媒B
の割合を30分かけて100％まで直線的に上昇させ、PA化
オリゴ糖を溶出した。反応は糖鎖100 pmolに対し、本発
明酵素画分20μUを加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液
（pH7.0）中、37℃で一晩反応した。リン酸に結合した
マンノースが切断された糖鎖はリン酸の負電荷が増える
ため、遅い保持時間で溶出されるようになる。コントロ
ール（酵素なし）の糖鎖が10分付近に溶出される（図５
Ａ）のに対し、本酵素を作用させたものは12分過ぎに新
たなピークが見られた（図５Ｃ）。この溶出位置は（構
造式６）の糖鎖を化学的に処理し、リン酸に結合したマ
ンノースを除去した糖鎖の溶出位置と一致した（図５
Ｂ）ことから、本酵素はフォスフォジエステル結合のα
-マンノースも切断することが可能であることが明らか
となった。

【００５５】[実施例6] 糖蛋白質に対する作用 リボヌクレアーゼB（RNase B）は高マンノース型糖鎖を
有する糖蛋白質として知られている。リボヌクレアーゼ
B 20 μgに対し、[実施例2]で得られたα-マンノシダー
ゼ画分を100 μU加え、0.1 M リン酸カリウム緩衝液（p
H 7.0）存在下で、37℃、14時間反応させた。なお、コ
ントロールとしてα-マンノシダーゼ画分の代わりに緩
衝液のみを等量加えた。それぞれをSDS-PAGEで分析した
ところ、コントロールに対し、α-マンノシダーゼ画分
を加えたものでは見かけの分子量が減少していた（図
６）。この分子量はペプチド部分の配列が同じで、糖鎖
のみを欠損したリボヌクレアーゼ A（RNase A）のもの
と近似していた。これらのリボヌクレアーゼ活性を測定
したところ、反応前と比べ活性の減少はほとんど見られ
なかった。従ってこれらのことから、本発明酵素画分を
加えたものでは、高マンノース型糖鎖のα-マンノシド
結合部分のみが切断され、糖鎖の根元部分に当たるMan
β1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcが残ったものの、蛋白質部分に
は影響がないことが示唆された。

【００５６】

【発明の効果】本発明によると、従来知られている公知
の酵素に比べて酵素活性が数十倍高く、糖蛋白質糖鎖に
対する親和性が高く、中性付近で安定性の優れた新規な
α-マンノシダーゼを提供することができる。また、本
酵素は細菌を液体培養することによって培地中に生産で
きるので、公知の酵素より生産が容易である。更に本酵
素は、α-マンノシド結合を含有する多糖またはオリゴ
糖を加水分解する目的だけでなく、フォスフォジエステ
ル結合のα-マンノースをも切断することが可能であ
り、本酵素を利用することでマンノース-6-リン酸型の
糖鎖を出芽酵母から生産するのに利用できる。

【００５７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> α-Mannosidase <130> P01-0456 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer SPF1 <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer SPR1 <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 619 <212> DNA <213> Cellulomonas sp. <400> 3 ggatgaaggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgcaa gtgacggtac 60 ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaac 120 gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggt ttgtcgcgtc tggtgtgaaa 180 actcgaggct caacctcgag cttgcatcgg gtacgggcag actagagtgc ggtaggggag 240 actggaattc ctggtgtagc ggtggaatgc gcagatatca ggaggaacac cgatggcgaa 300 ggcaggtctc tgggccgcaa ctgacgctga ggagcgaaag catggggagc gaacaggatt 360 agataccctg gtagtccatg ccgtaaacgt tgggcactag gtgtggggct cattccacga 420 gttccgtgcc gcagcaaacg cattaagtgc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 480 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag catgcggatt aattcgatgc 540 aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat gcacgggaag ccaccagaga tggtggtctc 600 tttggacact cgtgcacag 619

【００５８】

【配列表フリーテキスト】 配列番号１：プライマーSPF1 配列番号２：プライマーSPR1

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）の至適pHを
示す。

【図２】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）の至適温
度、及び安定温度を示す。

【図３】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）のミハエリ
ス定数（Km値）を求めるための、基質・反応速度の二重
逆数プロットを示す。

【図４】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）をMan8GlcNA
c2-PA（構造式１、Ｍ８）に１０分、６０分、及び１２
０分作用させたときの分解産物を、HPLCで解析した結果
を示す。

【図５】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）を(Man-P)2-
Man8GlcNAc2-PA（構造式７）に作用させた後の分解産物
を、HPLCで解析した結果を示す。 （A）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PA糖鎖 （B）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PAを0.01 N HCl中で、100
℃、30分間処理した糖鎖 （C）(Man-P)2Man8GlcNAc2-PAを本発明酵素（α-マンノ
シダーゼ）を加え、処理した糖鎖

【図６】本発明酵素（α-マンノシダーゼ）をリボヌク
レアーゼBに作用させたときのSDS-PAGEの結果を示す。 レーン1：リボヌクレアーゼB レーン2：本発明酵素（α-マンノシダーゼ）で処理した
リボヌクレアーゼB レーン3：リボヌクレアーゼA（糖鎖を欠損したリボヌク
レアーゼBと同質の酵素）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 地神 芳文 茨城県つくば市東１−１−１ 独立行政法 人産業技術総合研究所 つくばセンター内 (72)発明者 中島 佑 宮城県仙台市青葉区堤通雨宮町１−１ 東 北大学大学院 農学研究科内 (72)発明者 小笠原 諭 宮城県仙台市青葉区堤通雨宮町１−１ 東 北大学大学院 農学研究科内 (72)発明者 丸山 穣 宮城県仙台市青葉区堤通雨宮町１−１ 東 北大学大学院 農学研究科内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 EE02 EE03 FF03E FF05E FF11E GG01 LL05 4B064 AG01 CA22 CB07 CC06 CC07 CD09 CD19 CD20 DA13 DA20

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記(1)〜(3)の酵素学的性質を有する新
   規α-マンノシダーゼ。 （1）作用：α-D-マンノピラノシド（α-Man）のα-マ
   ンノシド結合を特異的に分解し、マンノースを遊離す
   る。およびフォスフォジエステル結合しているα-D-マ
   ンノピラノシド（α-Man）を特異的に分解し、マンノー
   スを遊離する。 （2）以下の基質特異性のうち少なくとも一つを有す
   る： （a）β-D-マンノピラノシド（β-Man）の分解活性、お
   よびエンド-α-マンノシダーゼ活性（エンド型分解活
   性）は検出されない。 （b）下記構造式１で示される糖鎖に作用し、最終的に
   下記構造式２で示される糖鎖を生成する。 【化１】 ［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチル
   グルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、
   α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシ
   ド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合を、PAはピリジ
   ルアミノ基をそれぞれ示す。］ （c）下記構造式３で示される糖鎖構造を含有する糖蛋
   白質に作用し、最終的に下記構造式４で示される糖鎖構
   造を含有する糖蛋白質を生成する。 【化２】 ［式中、Manはマンノース残基を、GlcNAcはN-アセチル
   グルコサミン残基を、α1-2はα1-2グリコシド結合を、
   α1-3はα1-3グリコシド結合を、α1-6はα1-6グリコシ
   ド結合を、β1-4はβ1-4グリコシド結合をそれぞれ示
   す。］ （d）下記構造式５〜７で示される糖鎖に作用し、マン
   ノース-6-リン酸（構造式８）を非還元末端に含有する
   糖鎖を生成する。 【化３】 （e）構造式５〜７で示される糖鎖構造を含有する糖蛋
   白質に作用し、マンノース-6-リン酸（構造式８）を非
   還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋白質を生成
   する。 （3）至適ｐＨ：６〜９．５（4-MU-α-Manを基質とした
   場合）
2. 【請求項２】 更に下記（4）〜（6）の酵素学的性質を
   有することを特徴とする、請求項１に記載のα-マンノ
   シダーゼ。 （4）至適温度：30〜55℃（4-MU-α-Manを基質とした場
   合） （5）安定温度：55℃以下（4-MU-α-Manを基質とした場
   合） （6）阻害及び活性化：1 mM Ca²⁺によって僅かに（１０
   ％）活性化される。Hg²⁺、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
   ＤＴＡ）によって活性が100％阻害されるが、Ca^{2 +}の添
   加によって活性が回復する。
3. 【請求項３】 Cellulomonas属に属する細菌由来であ
   る、請求項１または２に記載のα-マンノシダーゼ。
4. 【請求項４】 Cellulomonas属に属する SO−5株の産生
   する請求項３に記載のα-マンノシダーゼ。
5. 【請求項５】 請求項３または４に記載のα-マンノシ
   ダーゼ生産能を有する細菌を培養し、その培養物からα
   -マンノシダーゼを採取することを特徴とするα-マンノ
   シダーゼの製造方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のα
   -マンノシダーゼを含有し、かつエンド-α-マンノシダ
   ーゼ、β-マンノシダーゼ、およびエンド-β-N-アセチ
   ルグルコサミニダーゼを実質的に含有しないことを特徴
   とする、α-マンノシダーゼ画分。
7. 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のα
   -マンノシダーゼを用いて、マンノース-6-リン酸（構造
   式８）を非還元末端に含有する糖鎖構造を含有する糖蛋
   白質を製造する方法。