JP2002365272A - 液体クロマトグラフ及び分析システム - Google Patents
液体クロマトグラフ及び分析システムInfo
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Abstract
能にし、高感度の検出又は分析ができるように工夫され
た液体クロマトグラフ、分析システム及びグラジェント
溶離方法を提供すること。 【解決手段】 溶離液Eを所定流量で流す送液手段1
と、前記溶離液Eに試料Smを注入する試料注入手段9
と、試料Sm中に含まれる溶質Soを分離する分離カラ
ム手段13と、を少なくとも備えた液体クロマトグラフ
において、前記送液手段1から送られてくる溶離液Eの
流路3を分岐させて所定容量の分岐流路7,7…を形成
し、該分岐流路7,7…に組成の異なる溶離液E1,E
2…を一時格納し、この一時格納された溶離液E1,E
2…を選択する溶離液選択手段8と、前記試料注入手段
9により、選択された溶離液E1,E2…に試Smを注
入して分離カラム13に流し、溶質Soをグラジエント
溶出する手段と、が設けられた液体クロマトグラフとこ
の液体クロマトグラフを質量分析計に接続した分析シス
テム並びにこの液体クロマトグラフを用いたグラジエン
ト溶離方法を提供する。
Description
分析に適した液体クロマトグラフ、該液体クロマトグラ
フを備える分析検出器、該液体クロマトグラフを用いた
グラジェント溶離方法に関する。
LC」と称する。)を用いて、溶離液の組成(組成比)
を順次変化させて分離カラムに流し、分離カラムに保持
された溶質の溶出強度を変化させる、いわゆるグラジエ
ント溶離法(グラジエント溶出法)を利用した分析技術
がある。
分離が短時間で可能になる、類似の構造の分子を分離す
ることが可能となる等の利点があるので普及している。
1mL/min程度の流速で送液するのが一般的である
が、溶離液の流速をより低速化して、試料の検出精度を
より高めようとする技術的傾向を背景に、近年、5μL
/min程度の低流速条件で溶離液を送液できるように
工夫されたHPLCも提案され始めている。
向けに設計されたHPLCは、装置構造が非常に複雑で
あって、操作が難しいという基本的な技術的課題があっ
た。
りも遅い条件で、グラジエント溶離を行おうとする場合
は、溶離液が搬送される流路を本流路と内口径の小さな
支流路に分岐(スプリット)させて、支流路側に分析カ
ラムを接続し、支流路を低流速で流れる溶離液を用いて
グラジエント溶離分析を行うという技術を採用すること
が可能である。
詰り等が発生しやすく、所定(sub−uL/min)
の所望の低流速条件を安定に保つことが困難で、しかも
設定流量で流れているか否かの確認さえ困難となるた
め、高精度のグラジエント溶離を行うことができないと
いう技術的課題があった。
順次安定した低流速条件で確実に送液することによっ
て、溶離液のより高精度なグラジエント変化を可能に
し、高感度の検出又は分析ができるように工夫された液
体クロマトグラフ、分析検出器及びグラジェント溶離方
法を提供することを目的とする。
ために、本発明では、以下の手段を採用する。
異なる溶離液(eluent)によって試料を分離カラ
ムに導入し、前記溶離液の溶出強度に基づいて試料中の
溶質(solute)をグラジエント溶離する構成の液
体クロマトグラフにおいて、前記溶離液の流路を分岐さ
せて所定容量の分岐流路を形成し、この分岐流路に組成
の異なる溶離液を一時格納する溶離液格納手段と、前記
分岐流路に一時格納された溶離液を順次選択して前記分
離カラム側に搬送する溶離液選択手段と、が設けられた
液体クロマトグラフを提供する。
液を流す高圧送液手段と、(2)この高圧送液手段によ
って搬送される溶離液の流路を分岐させて、有機溶媒
比、pH、塩濃度その他の組成が異なる溶離液をそれぞ
れ各分岐流路中に所定量一時格納する溶離液格納手段
と、(3)前記分岐流路に一時格納された溶離液を順次
選択して分離カラム側に搬送する溶離液選択手段と、
(4)順次搬送されてくる溶離液に試料を注入する試料
注入手段と、(5)分離カラムを用いて試料中に含まれ
る溶質を溶離液の溶出強度に基づいてグラジエント溶離
する手段と、を少なくとも備えた液体クロマトグラフを
提供する。
nL/min以下レベルの極めて低流量条件で、溶離液
を順次一定流量で安定かつ確実に流すことができるとい
う基本特性を備えているので、試料中に含まれる溶質成
分を高精度にグラジエント溶離することが可能となる。
また、溶離液を低流量で流す構成によって、溶離液中の
溶質を確実に濃縮させることができるようになる。
て、組成が異なる溶離液を、所定量分一時格納しておく
溶離液格納手段を設けたことによって、必要な組成の溶
離液を、必要に応じて、必要なタイミングで、段階的又
は連続的に、容易に搬送させることができるグラジェン
ト溶離方法を提供できる。
は、送液手段後に設けられる各分岐流路に、バルブの切
り替えにより、シリンジで溶離液を充填できる手段を備
えるように工夫したので、溶離液の交換又は補充を簡単
に行うことができる。
る溶離液の充填を、自動制御で行うようにしてもよい。
この手段を採用すると、溶離液の充填精度を高めること
ができる。
の吐出口から前記分離カラム手段に至る流路中に、予め
組成の異なる溶離液を前記分岐流路から順番に送液し、
貯留しておく手段を採用することもできる。この手段に
よれば、分析開始からより短時間でグラジエント溶離を
行うことが可能となるので、分析時間の短縮を達成でき
る。
トグラフの分離カラム手段に、質量分析計(MASS)
を接続した分析検出器、即ちLC/MS(liquid chrom
atography/mass spectrometry)を提供する。
えていく階段溶離法又は連続的に変化させていく勾配溶
離法のいずれも自在に選択して簡単に行うことができる
ようになることから、単一組成の溶離液では、溶離が難
しいとされた多成分系の試料でも、低速少流量で、短時
間で効率よく、分離・検出を行うことができるようにな
る。
速で溶離液を搬送して、高精度に溶質をグラジエント溶
離できるように構成された液体クロマトグラフを備えて
いるので、溶質成分の検出を高感度で行うことができる
とともに、検出のための積算時間をより長くすることが
できる。
ピークの濃度をより高くすることが可能となるので、高
感度の質量分析を行うことができるようになる。
て、添付図面に基づいて説明する。
グラフと該液体クロマトグラフを備えた分析検出器の構
成を簡易に表すブロック図である。以下、この図1に基
づいて、本発明に係る液体クロマトグラフ及び分析検出
器の基本構成について説明する。
は、図1中符号Eで示された溶離液を、nl/minレ
ベルの低流速で安定して送液できる高圧送液ポンプ1を
備えている。この高圧送液ポンプ1としては、プランジ
ャー型ポンプ、マイクロシリンジ型ポンプ等を採用する
ことができるが、低流速安定送液により適しているマイ
クロシリンジ型の送液ポンプ(infusion pu
mp)を採用するのが好ましい。
Hamilton社製の250μl容量のマイクロシリ
ンジを備える送液ポンプPHD2000(米国・HAR
VERD APPARATUS社製)を採用することが
できる。
溶離液の送液手段としては、分離カラム13の後に質量
分析計が接続される場合を除き、分離カラム13の後方
から負圧吸引する手段も採用することも可能である。
視・測定するための圧力計である。
る溶離Eが通過する流路3は、内径0.25mmのステ
ンレス製鋼管で形成することができる。この流路3は、
バルブ4の所定のポート41を通過した後、10ポート
の多岐管(マニホルド)6に接続され、この多岐管6を
介して合計10本の分岐流路7,7…に枝分かれされて
いる。
限定するものではなく、分析目的に応じて適宜選択する
ことができる。多岐管6は、VICI社製のZ10M1
等を採用することができる。
路として機能する分岐流路7,7…は、それぞれ内径
0.25mm、長さ150mm、容量7.5μLのステ
ンレス製鋼管で形成されており、有機溶媒比、pH、塩
濃度その他の組成が異なる溶離液E,E,E…を所定量分
一時格納しておく溶離液格納手段として機能する。な
お、分岐流路7,7,7…の長さ、容量等は、目的に応じ
て適宜選択することができる。
では、バルブ4のポート41の開閉切り替えによって、
各分岐流路7,7,7…に対して、シリンジ5から直接溶
離液Eを充填できるように工夫してもよい。これによ
り、配管をその都度調整して溶離液の交換又は補充を行
う手間が解消される。
接続された10箇所のポート81を備えるロータリー型
のバルブを示している。このバルブ8は、各分岐流路7
に一時格納された組成の異なる溶離液を選択するための
手段として機能し、手動操作で、所定のポート81を順
次開放することによって、所望の組成の溶離液E1,E
2,E3…を、順次後続の装置側に向けて、流すことが
できる構成とされている。なお、バルブ8の出口部分に
は、図示しないコントローラが接続されており、電気信
号により、バルブの選択と開閉を制御している。
る溶離液の充填を、自動制御で行うようにしてもよい。
具体的には、各分岐流路7に対して、所定組成の溶離液
E1,E2,E3…を自動調合作成し、順次自動で各分岐
流路7に送液及び格納するようにする。この手段を採用
すると、溶離液の充填精度を高めることができるので、
分析精度を向上させることが可能となる。
Eは、再び上記バルブ4の所定のポート41'を通過し
て、試料注入部9に向かうことになる。この試料注入部
9においては、予め前調整された試料Smをインジェク
ター(試料注入装置)10を溶離液E'に注入する。
ター10から直接、流路3'中に注入する方法、インジ
ェクター10からトラップカラム11に注入し、このト
ラップカラム11で濃縮されて試料Smを溶離液E中に
送り込む方法のいずれも選択することができる。試料S
mは溶離液Eによって分離カラム13に搬送される。
性、試料Smへの気泡混入がないように密着性を備える
等の条件を満たしているものであれば、適宜選択するこ
とができる。図1の符号12は、試料残液槽を示してい
る。
シング装置を付設し、溶離液Eと試料Sの混合処理を行
うようにしてもよい。このミキシング装置を導入するこ
とによって、グラジエントがスムーズにかかり、ピーク
の巾をほぼ一定にすることができる。また、組成の異な
る溶離液E1,E2…を拡散し、より直線的なベースラ
インを形成することができる。
おいて、前記バルブ8の吐出口82から後述する分離カ
ラムに至る流路3’中に、予め、組成の異なる溶離液E
1,E2…を各分岐流路7から濃度勾配の順番に送液
し、貯留しておくことも可能である。このように工夫す
ると、分析開始からより短時間でグラジエント溶離を行
うことが可能となるので、分析時間を短縮することがで
きる。
タデシルシラン化学結合型シリカゲル)が充填されてい
る分離カラムを示している。本発明においては、この分
離カラム13は、低流速で溶離液Eを流すことに対応し
て、内口径0.5mm以下のものを採用する。
注入された試料Smに含まれる溶質成分Soを、固定相
に対する親和力の差に基づいて分離するとともに、組成
の異なる溶離液E1,E2…の溶出強度の変化に基づい
て溶出させる。
上記各分岐流路7に格納された組成の異なる溶離液
E1,E2…を順次選択して流すことによって、試料成
分Soの高精度なグラジエント溶離を行うことができ
る。
吸収光度(UV/VIS)検出器、蛍光(FL)検出
器、示差屈折率検出器、電気化学検出器、化学発光検出
器、質量分析計その他の検出器14を適宜選択して使用
することで、定量、定性その他の分析を行うことができ
る。
る場合は、高精度のグラジエント溶離が可能な液体クロ
マトグラフに基づいて、試料成分の高感度検出が可能な
LC/MSを提供することができる。なお、液体クロマ
トグラフと質量分析計とのインターフェースは、ESI
(エレクトロスプレー)法、APCI(大気圧化学イオ
ン化法)のいずれも採用することが可能である。
続される記録計、符号16は検出器14に接続されるデ
ータ処理装置である。符号17は、溶質成分Soを分取
する場合において、検出器14に接続されるフラクショ
ンコレクター、符号18は、廃液槽である。
タノール中のアセトン濃度を10%ずつ変化させたとき
のグラジエント変化を500nL/min、300nL
/min、100nL/minの各流量別に、紫外線検
出器を用いて検証した。なお、本実験では、トラップカ
ラム11、分離カラム13、ミキシング装置は使用して
いない。
より描かれたベースラインを示す図(グラフ)である。
このグラジエントラインに示すように、500nL/m
in、300nL/min、100nL/minの各流
速において安定したグラジエント変化が示され、特に、
100nL/minの低流速条件においても、リニアな
ベースラインを形成できるので、溶離液のリニアなグラ
ジエント変化を達成するのに充分である。
ノール溶液を使用して、メタノール中のアセトン濃度を
変化させたときのグラジエント変化を300nL/mi
n、100nL/minの流量別に、紫外線検出器を用
いて検証した。
より描かれたベースラインを示す図(グラフ)である。
このベースラインに示すように、300nL/min、
100nL/minの各低流速条件でも、安定したベー
スラインを形成でき、低流速条件で、溶離液のリニアな
グラジエント変化を達成するのに充分である。
が可能となることを実証するために、実験を行った。使
用した試料は、カルモジュリンのトリプシン酵素消化物
(Calmodulin trypsic diges
t)であり、量は150fmoleである。使用した溶
離液は、水、アセトニトリル、ギ酸から構成されたもの
である。試料注入量は60nL。試料は、分離カラムに
直接導入した。流速は300nL/minである。な
お、質量分析計の測定分子量範囲は600から1500
ドルトンである。
消化物に含まれる各質量成分のクロマトグラムを示した
図(グラフ)である。様々な質量成分がシャープなピー
クを形成していることから、明らかに各試料成分が分離
されていることがわかる。
い成分をシングルイオンモニター検出した結果、600
attomol(S/N=2)のペプチドを検出できた
ことを示す図(クロマトグラム)である。
/MS)では、グラジエント溶離によって、試料成分が
高精度で分離されているとともに、分離された成分が高
感度に検出できたことがわかる。
おりである。
は、500nL/min以下レベルのごく低流速の溶離
液を、順次一定流量で安定かつ確実に流すことができる
ので、試料中に含まれる溶質成分を高精度にグラジエン
ト溶離することが可能となる。
は、試料注入手段前の流路位置において、組成が異なる
溶離液を、所定量分一時格納しておく溶離液格納するよ
うに工夫したことによって、必要な組成の溶離液を、必
要に応じて、必要なタイミングで、段階的又は連続的
に、容易に搬送させることができる。
し、バルブの切り替えで各分岐流路に溶離液を送り込む
ことができるように構成されているので、複数の高圧送
液ポンプを用いて各分岐流路に送液する構成と比べて装
置をコンパクト化でき、溶離液の送量に関する制御が単
純化し、圧縮率による溶媒の逆流も起こらないので正確
なグラジエントを達成できる。
速で溶離液を搬送して、高精度に溶質をグラジエント溶
離できるように構成された液体クロマトグラフを備えて
いるので、溶質成分の分離を高精度に行うことができる
とともに、分離成分を高感度に検出できる。
マトグラフを備えた分析検出器の構成を簡易に表すブロ
ック
様子を簡略に示す図
ベースラインを示す図(グラフ)
グラジエントライン(ベースライン)を示す図(グラ
フ)
れる各質量成分のクロマトグラムを示した図(グラフ)
グルイオンモニター検出した結果、600attomo
l(S/N=2)のペプチドを検出できたことを示す図
(クロマトグラム)
る)バルブ 5 (分岐流路7に溶離液Eを充填するときに使用され
る)シリンジ 7 分岐流路 8 (溶離液選択手段である)バルブ 13 分離カラム 14 検出器(質量分析計) E' 溶離液 Sm 試料 So 溶質(成分)
る)バルブ 5 (分岐流路7に溶離液Eを充填するときに使用され
る)シリンジ 7 分岐流路 8 (溶離液選択手段である)バルブ 13 分離カラム 14 検出器(質量分析計)E 溶離液 Sm 試料 So 溶質(成分) ─────────────────────────────────────────────────────
4)
分析に適した液体クロマトグラフ、該液体クロマトグラ
フを備える分析システム、該液体クロマトグラフを用い
たグラジェント溶離方法に関する。
順次安定した低流速条件で確実に送液することによっ
て、溶離液のより高精度なグラジエント変化を可能に
し、高感度の検出又は分析ができるように工夫された液
体クロマトグラフ、分析システム及びグラジェント溶離
方法を提供することを目的とする。
トグラフの分離カラム手段に、質量分析計(MASS)
を接続した分析システム、即ちLC/MS(liquid chr
omatography/mass spectrometry)を提供する。
流速で溶離液を搬送して、高精度に溶質をグラジエント
溶離できるように構成された液体クロマトグラフを備え
ているので、溶質成分の検出を高感度で行うことができ
るとともに、検出のための積算時間をより長くすること
ができる。
グラフと該液体クロマトグラフを備えた分析システムの
構成を簡易に表すブロック図である。以下、この図1に
基づいて、本発明に係る液体クロマトグラフ及び分析シ
ステムの基本構成について説明する。
Eは、再び上記バルブ4の所定のポート41'を通過し
て、試料注入部9に向かうことになる。この試料注入部
9においては、予め前調整された試料Smをインジェク
ター(試料注入装置)10を介して溶離液Eに注入す
る。
ってペプチドの高感度分析が可能となることを実証する
ために、実験を行った。使用した試料は、カルモジュリ
ンのトリプシン酵素消化物(Calmodulin t
rypsic digest)であり、量は150fm
oleである。使用した溶離液は、水、アセトニトリ
ル、ギ酸から構成されたものである。試料注入量は60
nL。試料は、分離カラムに直接導入した。流速は30
0nL/minである。なお、質量分析計の測定分子量
範囲は600から1500ドルトンである。
C/MS)では、グラジエント溶離によって、試料成分
が高精度で分離されているとともに、分離された成分が
高感度に検出できたことがわかる。
流速で溶離液を搬送して、高精度に溶質をグラジエント
溶離できるように構成された液体クロマトグラフを備え
ているので、溶質成分の分離を高精度に行うことができ
るとともに、分離成分を高感度に検出できる。
マトグラフを備えた分析システムの構成を簡易に表すブ
ロック図
様子を簡略に示す図
ベースラインを示す図(グラフ)
グラジエントライン(ベースライン)を示す図(グラ
フ)
れる各質量成分のクロマトグラムを示した図(グラフ)
グルイオンモニター検出した結果、600attomo
l(S/N=2)のペプチドを検出できたことを示す図
(クロマトグラム)
4)
Claims (4)
- 【請求項1】 流路中を順次搬送されてくる組成の異な
る溶離液によって試料を分離カラムに導入し、前記溶離
液の溶出強度に基づいて試料中の溶質をグラジエント溶
離する構成の液体クロマトグラフにおいて、 前記溶離液の流路を分岐させて所定容量の分岐流路を形
成し、該分岐流路に組成の異なる溶離液を一時格納する
溶離液格納手段と、 前記分岐流路に一時格納された溶離液を順次選択し、前
記分離カラム側に流す溶離液選択手段と、 が設けられたことを特徴とする液体クロマトグラフ。 - 【請求項2】 バルブの切り替えにより、インジェクタ
ーから前記分岐流路のそれぞれに溶離液を充填する手段
を備えたことを特徴とする請求項1記載の液体クロマト
グラフ。 - 【請求項3】 請求項1又は請求項2に記載の液体クロ
マトグラフに質量分析計を接続したことを特徴とする分
析検出器。 - 【請求項4】 請求項1又は請求項2に記載の液体クロ
マトグラフを用いることを特徴とするグラジェント溶離
方法。
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AU (1) | AU2002246375B2 (ja) |
CA (1) | CA2445939A1 (ja) |
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