JP2002355040A

JP2002355040A - カロチノイド生合成経路の酵素の調節物質を見出す方法

Info

Publication number: JP2002355040A
Application number: JP2001127652A
Authority: JP
Inventors: Marco Busch; マルコ・ブツシユ; Ruediger Hain; リユデイガー・ハイン
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-05-08
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2002-12-10
Also published as: DE10022362A1; US20020128464A1; EP1156117A3; EP1156117A2

Abstract

(57)【要約】【課題】除草剤を開発するための探索手段の提供。【解決手段】本発明は、タバコのζ−カロチン合成酵
素をコードする核酸、それによりコードされるポリペプ
チド、ならびに、ζ−カロチン合成酵素、フィトエン合
成酵素およびフィトエンデサチュラーゼ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術的分野】本発明は、タバコζ−カロ
チン合成酵素をコードする核酸、それによりコードされ
るポリペプチド、ならびに、ζ−カロチン合成酵素、フ
ィトエン合成酵素およびフィトエンデサチュラーゼの活
性の調節物質を見出す方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】所望されない植物の成長は除草剤の使用
により妨げることができる。除草剤に対しなされる要求
は、それらの効能、費用および環境との適合性に関して
常に増大してきた。従って、強力な新たな除草剤に開発
することができる新たな物質に対する必要性が存在す
る。一般に、通常の手順は温室試験でこうした新たなリ
ード構造を探索することである。しかしながら、こうし
た試験は困難かつ費用がかかる。従って、温室で試験す
ることができる物質の数は制限される。

【０００３】動物生物体に存在しない植物特異的な生合
成経路で、有利な除草剤の標的が探索されている。一例
はカロチノイド生合成経路である。

【０００４】カロチノイドは、植物代謝で多数の役割を
演じる。それらは、光合成系において集光性複合体（ｌ
ｉｇｈｔｈａｒｖｅｓｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）と
会合し、これは、光合成反応中心への入射する光量子の
光学的伝達を保証する。さらに、それらは過剰の光エネ
ルギーの散逸および遊離酸素ラジカルの捕獲に参画し、
そして従って保護的機能を有する。カロチノイドは、光
合成に対するそれらの重要性に加え、キサントフィルお
よび成長調節剤アブシジン酸の生合成の前駆体である。
カロチノイドは花および果実において色素として作用す
る（例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓ
ｃｕｌｅｎｔｕｍ）中のリコペンもしくはニンジン（Ｄ
ａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ）中のβ−カロチン）。

【０００５】カロチノイド生合成は色素体中で起こる。
合成の前駆体はジテルペン、ゲラニルゲラニルピロリン
酸である。それはおそらくいわゆるＤＸＰ、でなければ
ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）経路を介して（そして標準的
なメバロン酸経路を介してでなく）形成される（リヒテ
ントハラー（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ）、１９９
７）。２分子のゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰ
Ｐ）が頭部と頭部の結合によりフィトエン合成酵素（Ｐ
ＳＹ）により転化されて１分子のフィトエンを生成する
（図１）。酵素フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）お
よびζ−カロチンデサチュラーゼ（ＺＤＳ）が４個のさ
らなる二重結合を成功裏に導入する。各酵素は対称位置
での脱水素を触媒する（図１）。

【０００６】生じるリコペンはその後、第一の段階で、
δ−カロチンを生成するようにリコペンε−シクラーゼ
（ＬＣＹｅ）、もしくはγ−カロチンを生成するように
リコペンβ−シクラーゼ（ＬＣＹｂ）のいずれかにより
転化される。第二段階でこれはそれぞれα−およびβ−
カロチンを生成する。この第二の環化段階は各場合でリ
コペンβ−シクラーゼにより実施される。その後、α−
およびβ−カロチンはルテイン、アスタキサンチン、ビ
オラキサンチンなどのようなキサントフィルの合成の前
駆体を構成する。

【０００７】カロチノイドおよびキサントフィルの生合
成に参画する全部の酵素は核でコードされる。ほぼ全部
のタンパク質の遺伝子配列が少なくとも１種の植物から
既知である。翻訳されたプレタンパク質が葉緑体に移入
され、プロセシングされ、オリゴマー化され、そして適
切な場合には認識配列により転流される。シャペロンＣ
ｐｎ６０および熱ショックタンパク質Ｈｓｐ７０がこの
過程に参画する（ボンク（Ｂｏｎｋ）、１９９７）。

【０００８】フィトエン合成酵素は約４５ｋＤａのタン
パク質である。ＰＳＹは補助因子としてマンガンイオン
およびＡＴＰを必要とする（ドグボ（Ｄｏｇｂｏ）、１
９８８）。さらに、該植物酵素の活性にはガラクト脂質
との会合が必要とされる。エルウィニアウレドボラ
（Ｅｒｗｉｎｉａｕｒｅｄｏｖｏｒａ）のＰＳＹが過
剰発現される場合に、リン酸に対する感受性および１５
μＭのｐＩ値を伴うスクアレスタチンにより阻害される
能力を測定した（ノイダート（Ｎｅｕｄｅｒｔ）、１９
９８）。これは、スクアレン合成酵素とのアミノ酸レベ
ルで約３４％の既知のＰＳＹ遺伝子の相同性と相関し、
そして、これら２種の酵素が緊密に関係していることを
示唆する。スクアレン合成は２分子のファルネシルピロ
リン酸の類似の頭部と頭部の結合を介して進行する（こ
れは機械的にフィトエンの合成に対応する）。発現の光
依存性の誘導がトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎ
ｕｕｍ）のフィトエン合成酵素について立証された（リ
ンティッヒ（Ｌｉｎｔｉｇ）、１９９７）。トマト植物
中の果実特異的ＰＳＹ１の過剰発現は矮性の表現型の結
果物を有した。これは、ジベレリン生合成からカロチノ
イド生合成に再度向けられるゲラニルゲラニルピロリン
酸に帰された（フレイ（Ｆｒａｙ）、１９９５）。例え
ばメロンおよびタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）スピー
シーズからのＰＳＹをコードするＤＮＡが既に記述され
ている（ＷＯ９６／０２６５０、ＵＳ５，７０５，６
２４）。しかしながら、植物の生命力に対するフィトエ
ン合成酵素の重要性について何も既知になっていない。
ＰＳＹをコードする遺伝子のスイッチオフ(switching o
ff)が植物に致命的であるのかどうか、すなわち該酵素
が除草性有効成分の標的分子として適しているのかどう
かは、今までのところ開示されていない。

【０００９】フィトエンデサチュラーゼは約６４ｋＤａ
のタンパク質である。ＰＤＳはフラビニル化により活性
化され、また、電子受容体としてプラストキノンを利用
する（ノリス（Ｎｏｒｒｉｓ）、１９９５）。フィトエ
ンデサチュラーゼの調節に関する矛盾する情報が存在す
る。一方では、ＰＤＳ遺伝子発現がクロロフィルおよび
色素含有量により影響を及ぼされることが報告されてい
る（コロナ（Ｃｏｒｏｎａ）、１９９６）が、他方で
は、色素含有量に対するＰＤＳ発現の依存性が否定され
ている（ヴェツェル（Ｗｏｅｔｚｅｌ）、１９９８）。
既知の阻害剤ノルフルラゾンおよびフルリドンでのＰＤ
Ｓの阻害後に光化学反応系ＩＩの活性の喪失がインビト
ロで検出された。活性のこの喪失は、機能的光化学反応
系ＩＩに組み込まれるべきＤ１タンパク質にとってのβ
−カロチンの存在の必要性に帰された（トレブスト（Ｔ
ｒｅｂｓｔ）、１９９７）。しかしながら、フィトエン
デサチュラーゼのスイッチオフが植物に致命的であるの
かどうか、すなわち、該酵素が除草性有効成分の標的分
子として適しているかどうかは今までのところ研究され
ていない。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕ
ｍ）のフィトエンデサチュラーゼの配列は文書ＵＳ
５，５３９，０９３に記述されている。この配列は本出
願の一部であることが明白に意図されている。ＰＤＳを
コードするＤＮＡ配列はとりわけＷＯ９９／５５８８
８に見出すことができる。

【００１０】ζ−カロチンデサチュラーゼは約６５ｋＤ
ａの大きさを有し、そしてカロチノイド生合成の最小の
特徴づけられた酵素である。既知の植物、例えばコメ、
トウモロコシ、コムギ、ダイズもしくはトウガラシ（Ｃ
ａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）（ＷＯ９９／５５８
８８）からのＺＤＳの配列は、既知のＰＤＳ配列と約３
４％の相同性を示す。ＺＤＳの調節に関しての情報は今
までのところ存在しない。

【００１１】リコペンβ−シクラーゼは約５５ｋＤａの
大きさをもつタンパク質である。それは、色素体におい
て、それらが基質として共有するリコペンに関してリコ
ペンε−シクラーゼと競争する。その遺伝子が多様な植
物から既知であるβ−シクラーゼと対照的に、ε−シク
ラーゼの場合にはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓｔｈａｌｉａｍａ）およびトマトの植物遺伝子の
みが既知である。２種のシクラーゼの型の配列の比較は
アミノ酸レベルで約３６％の相同性を示す。２種のシク
ラーゼによるリコペンの環化は、カロチノイド生合成中
の分岐点および従って意義のある調節点を構成する。β
−シクラーゼとε−シクラーゼとの間の比は強い光の下
で増大し、そしてより多くの保護的キサントフィル、ゼ
アキサンチン、ビオラキサンチンおよびアンテラキサン
チンが形成される。弱い光においては、ε−シクラーゼ
に対するβ−シクラーゼの比が減少し、そしてより多く
のルテイン（集光性に参画する）が形成される（カニン
ガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）、１９９６）。

【００１２】カロチノイド生合成およびキサントフィル
生合成は高度に調節された過程である。生合成は、光強
度の関数として光合成組織の葉緑体中で調節される。対
照的に、花および果実の葉緑体中での調節は発達段階に
依存する。トマト果実（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）においては、成熟の間の赤色着色
はリコペンの蓄積により達成される。この蓄積は、増大
された量のＰＳＹおよびＰＤＳの転写物と相並んで進行
する。同時にリコペンシクラーゼの転写物が消失する
（ペッカー（Ｐｅｃｋｅｒ）、１９９６）。

【００１３】カロチノイド生合成が調節される機構の詳
細についてはわずかに知られているにすぎない。

【００１４】

【発明の構成】本出願はカロチノイド生合成の遺伝子の
クローニングを記述する。とりわけ２種のフィトエン合
成酵素遺伝子が見出された。トマトの場合でのように、
発達依存性の調節との類似性を立証することが可能でな
かった。光強度依存性の調節の可能性が存在する。この
場合、１種の遺伝子がハウスキーピング活性をコードす
るかも知れない一方、他者は光強度依存性の様式で調節
されるかも知れない。

【００１５】本出願は、ζ−カロチンデサチュラーゼを
コードする遺伝子のクローニングもまた記述する。

【００１６】本出願は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ）のフィトエンデサチュラーゼをコード
する遺伝子のクローニングもまた記述する。

【００１７】本出願は、カロチノイド生合成における連
続する段階の触媒により相互に結びつけられるカロチノ
イド生合成経路の既知の酵素、すなわちフィトエン合成
酵素、フィトエンデサチュラーゼおよびζ−カロチンデ
サチュラーゼが植物で必須に重要であることもまた記述
する。本出願は、酵素フィトエン合成酵素、フィトエン
デサチュラーゼおよびζ−カロチンデサチュラーゼが除
草性有効成分の標的分子として適しており、そして従っ
て除草性有効成分を見出す方法で使用することができる
こともまた記述する。

【００１８】従って、本発明は、除草性有効成分を見出
す方法でのカロチノイド生合成の酵素、すなわちフィト
エン合成酵素、フィトエンデサチュラーゼおよびζ−カ
ロチンデサチュラーゼの使用に関する。

【００１９】従って、本発明は、配列番号２もしくは配
列番号４のアミノ酸配列を含んで成るフィトエン合成酵
素の生物活性をもつ植物ポリペプチドをコードする核酸
に関する。とりわけ、本発明の核酸はタバコのフィトエ
ン合成酵素をコードし、本発明のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１の核酸がとりわけ好ま
しい。

【００２０】本発明は、フィトエン合成酵素をコードす
る本発明の核酸のフラグメントにもまた関する。

【００２１】本発明は、配列番号６のアミノ酸配列を含
んで成るζ−カロチンデサチュラーゼの生物活性をもつ
植物ポリペプチドをコードする核酸にもまた関する。と
りわけ、本発明の核酸はタバコのζ−カロチンデサチュ
ラーゼをコードし、本発明のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎ
ａｔａｂａｃｕｍ）のＳＲ１核酸がとりわけ好まし
い。

【００２２】本発明は、ζ−カロチンデサチュラーゼを
コードする本発明の核酸のフラグメントにもまた関す
る。

【００２３】本発明の核酸は、とりわけ一本鎖もしくは
二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸
（ＲＮＡ）である。好ましい態様は、適切な場合はイン
トロンもまた含有してよいゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ
のフラグメントである。

【００２４】該フラグメントはまた一本鎖もしくは二本
鎖であってもよく、一本鎖フラグメントが本発明の核酸
のコード原性の(codogenic)鎖もしくはコーディング鎖
に相補的であることが可能である。その場合、こうした
一本鎖フラグメントは、本発明の核酸のコード原性の鎖
もしくはコーディング鎖のいずれかとハイブリダイズす
ることができる。

【００２５】本情況で使用されるところの「フラグメン
ト」という用語は、１０ないし１０００塩基対（ｂｐ）
の長さ、好ましくは１２ないし５００ｂｐの長さ、とり
わけ好ましくは１５ないし２００ｂｐの長さ、そして非
常にとりわけ好ましくは２０ないし１００塩基対の長さ
をもつ一本鎖もしくは二本鎖核酸を含んで成る。

【００２６】本発明の核酸は、好ましくは、イントロン
を含有してよいタバコ植物のゲノムＤＮＡに対応するＤ
ＮＡ、もしくはそのフラグメントである。

【００２７】本発明の核酸は、とりわけ好ましくは、
ａ）配列番号１、３もしくは５の配列、ｂ）配列番号
２、４もしくは６のアミノ酸配列を含んで成るポリペプ
チドをコードする配列、ｃ）長さが最低１４塩基対であ
る、ａ）もしくはｂ）で定義される配列の部分配列、
ｄ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義される配列とハイブ
リダイズする配列、ｅ）ａ）、ｂ）もしくはｃ）で定義
される配列に相補的である配列、およびｆ）遺伝暗号の
縮重によりａ）ないしｃ）で定義される配列と同一のア
ミノ酸配列をコードする配列のなかから選択される配列
を含んで成る。

【００２８】本発明の核酸の非常にとりわけ好ましい一
態様は配列番号１の配列をもつｃＤＮＡ分子である。

【００２９】本発明の核酸の別の非常にとりわけ好まし
い態様は配列番号３の配列をもつｃＤＮＡ分子である。

【００３０】本発明の核酸の別の非常にとりわけ好まし
い態様は配列番号５の配列をもつｃＤＮＡ分子である。

【００３１】本情況で使用されるところの「ハイブリダ
イズすること」という用語は、一本鎖核酸分子が相補的
鎖との塩基対形成をうける過程を記述する。この様式に
おいて、本明細書に開示される配列情報から出発して、
例えばフィトエン合成酵素もしくはζ−カロチンデサチ
ュラーゼをコードしかつ配列番号２もしくは４、または
配列番号５のアミノ酸配列をもつ酵素と同一もしくはそ
れに類似の特性を有するＤＮＡフラグメントを、タバコ
植物以外の植物から単離することが可能である。

【００３２】ハイブリダイゼーション条件は以下の式を
使用する近似により算出する：融解温度Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ｛ｃ（Ｎａ
⁺）｝＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ（ロッツペ
イヒ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）とゾルバス（Ｚｏｒｂａ
ｓ）、１９９８）。

【００３３】この式中、ｃは濃度であり、また、ｎは塩
基対中のハイブリダイズする配列セグメントの長さであ
る。＞１００ｂｐの配列については項５００／ｎを省略
する。最高のストリンジェンシーはＴｍより５〜１５℃
下の温度および１５ｍＭＮａ⁺のイオン強度（０．１
×ＳＳＣに対応する）での洗浄を意味する。ＲＮＡサン
プルをハイブリダイゼーションに使用する場合、融点は
１０ないし１５℃より高い。

【００３４】好ましいハイブリダイゼーション条件を下
に述べる。すなわちハイブリダイゼーション溶液：６×ＳＳＣ／５×デンハ
ルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液／５０％ホルムアミド；ハイブリダイゼーション温度：３６℃、好ましくは４２
℃；洗浄段階１：２×ＳＳＣ、室温で３０分；洗浄段階２：１×ＳＳＣ、５０℃で３０分；好ましくは
０．５×ＳＳＣ、６５℃で３０分；とりわけ好ましくは
０．２×ＳＳＣ、６５℃で３０分。

【００３５】核酸の同一性の程度は、プログラムＮＣＢ
ＩＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．４（アルチュル
（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９７）の助けを借りて好
ましく決定する。

【００３６】本発明はまた、植物細胞、とりわけタバコ
植物において本発明の核酸の転写を天然に制御する調節
領域にも関する。

【００３７】本情況で使用されるところの「調節領域」
という用語は、細胞タンパク質と相互作用し従って転写
を制御する、プロモーター、エンハンサー、リプレッサ
ーもしくはアクチベーター結合部位または終止配列のよ
うな問題の遺伝子の非翻訳領域に関する。

【００３８】本発明は、本発明の核酸および異種プロモ
ーターを含んで成るＤＮＡ構築物にさらに関する。

【００３９】本情況で使用されるところの「異種プロモ
ーター」という用語は、元の生物体における問題の遺伝
子の発現を制御するプロモーター以外の特性を有するプ
ロモーターに関する。

【００４０】異種プロモーターの選択は、発現に原核生
物細胞を使用するのかもしくは真核生物細胞を使用する
のかまたは細胞を含まない系を使用するのかに依存す
る。異種プロモーターの例は、植物細胞のためのカリフ
ラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、酵母細
胞のためのアルコール脱水素酵素プロモーター、原核生
物細胞もしくは細胞を含まない系のためのＴ３、Ｔ７も
しくはＳＰ６プロモーターである。

【００４１】本発明は、本発明の核酸、本発明の調節領
域もしくは本発明のＤＮＡ構築物を含有するベクターに
さらに関する。使用することができるベクターは、全部
のファージ、プラスミド、ファージミド、ファスミド、
コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、人工的染色体もしくは粒子
衝撃法に適する粒子であり、その全部は分子生物学の実
験室で使用されている。

【００４２】好ましいベクターは、植物細胞のためのｐ
ＢＩＮ（ベヴァン（Ｂｅｖａｎ）、１９８４）およびそ
の誘導体、酵母細胞のためのｐＦＬ６１（ミネ（Ｍｉｎ
ｅｔ）ら、１９９２）、細菌細胞のためのｐＢＬＵＥＳ
ＣＲＩＰＴベクター、およびファージのためのλＺＡＰ
（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））である。

【００４３】本発明は、本発明の核酸、本発明のＤＮＡ
構築物もしくは本発明のベクターを含有する宿主細胞に
もまた関する。

【００４４】本情況で使用されるところの「宿主細胞」
という用語は、本発明の核酸を天然には含有しない細胞
を指す。

【００４５】適する宿主細胞は、原核生物細胞、好まし
くは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のみならず、しかしまたサ
ッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキアパストリス（Ｐｉ
ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫、植物の細胞、カ
エル卵母細胞および哺乳動物細胞系のような真核生物細
胞でもある。

【００４６】本発明は、本発明の核酸によりコードされ
るフィトエン合成酵素の生物活性をもつポリペプチドに
さらに関する。それらはとりわけ本発明のフィトエン合
成酵素を構成するポリペプチドである。本発明は、配列
番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列に対応するポ
リペプチドに非常に具体的に関する。

【００４７】本発明は、本発明の核酸によりコードされ
るζ−カロチンデサチュラーゼの生物活性をもつポリペ
プチドにさらに関する。それらはとりわけ本発明のζ−
カロチンデサチュラーゼを構成するポリペプチドであ
る。本発明は、配列番号６のアミノ酸配列に対応するポ
リペプチドに非常に具体的に関する。

【００４８】本情況で使用されるところの「ポリペプチ
ド」という用語は、ペプチド、オリゴペプチドもしくは
オリゴマーと通常命名される短いアミノ酸鎖のみなら
ず、しかしタンパク質と通常命名されるより長いアミノ
酸鎖もまた指す。それは、翻訳後プロセシングのような
天然の過程、もしくは従来技術の化学的過程のいずれか
により改変することができるアミノ酸鎖を含んで成る。
こうした改変は、例えばペプチドバックボーン、アミノ
酸側鎖、アミノ末端および／もしくはカルボキシル末端
のような多様な部位でかつ反復してポリペプチド中で起
こることができる。それらは、例えば、アセチル化、ア
シル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビン、ヘ
ム構成要素、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導
体、脂質もしくは脂質誘導体、またはホスファチジルイ
ノシトールとの共有結合、環化、ジスルフィド架橋の形
成、脱メチル化、シスチン形成、ホルミル化、γ−カル
ボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解
的プロセシング、ホスホリル化、セレノイル化およびｔ
ＲＮＡに媒介されるアミノ酸の付加を含んで成る。

【００４９】本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形態で、もしくはより大きなタンパク質の一部とし
て、例えば融合タンパク質として存在してよい。それら
はさらに、分泌もしくはリーダー配列、プロ配列、複数
のヒスチジン残基のような単純な精製を可能にする配列
もしくは付加的な安定させるアミノ酸を表してよい。

【００５０】本発明のポリペプチドは完全なフィトエン
合成酵素もしくはζ−カロチンデサチュラーゼを表す必
要はないが、しかし、それらが完全なフィトエン合成酵
素もしくはζ−カロチンデサチュラーゼの最低１種の生
物活性を保持する限りは正にそれらのフラグメントであ
ってもまたよい。配列番号２もしくは配列番号４のアミ
ノ酸配列をもつフィトエン合成酵素と同一の種類の生物
活性、または配列番号６のアミノ酸配列をもつζ−カロ
チンデサチュラーゼと同一の種類の生物活性を発揮する
こうしたフラグメントは、本発明に従うとみなされる。

【００５１】本発明のポリペプチドは、それらが完全な
酵素の最低１種の生物活性を発揮する限りは、天然に存
在するタバコのフィトエン合成酵素もしくはζ−カロチ
ンデサチュラーゼの対応する領域と比較して、欠失もし
くはアミノ酸置換を表してよい。保存的置換が好まし
い。こうした保存的置換は変異を含んで成り、ここでは
アミノ酸が以下の群の間の別のアミノ酸により置き換え
られる：１．小型の脂肪族残基、非極性残基もしくは極性のほと
んどない残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏおよび
Ｇｌｙ；２．極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａ
ｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；３．極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬ
ｙｓ；４．大型の脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌ
ｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。

【００５２】好ましい保存的置換を以下の一覧から見る
ことができる：

【００５３】

【表１】

【００５４】本発明のポリペプチドの好ましい一態様
は、配列番号２のアミノ酸配列もしくは配列番号４のア
ミノ酸配列をもつタバコのフィトエン合成酵素である。

【００５５】本発明のポリペプチドのさらに好ましい一
態様は、配列番号６のアミノ酸配列をもつタバコのζ−
カロチンデサチュラーゼである。

【００５６】本発明は、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体にさらに関する。こうした抗体の生成は
通例の手順に従う。これらの抗体は、例えば、例えば本
発明の核酸をもつ遺伝子ライブラリーの発現クローンの
同定に利用することができる。

【００５７】本情況で使用されるところの「抗体」とい
う用語は、本発明のポリペプチドのエピトープに結合す
ることがなお可能であるＦａ、Ｆ（ａｂ’）₂もしくは
Ｆｖフラグメントのような完全な抗体の部分にもまたわ
たる。

【００５８】本発明は本発明の核酸の生成方法にもまた
関する。本発明の核酸は通例の様式で生成することがで
きる。例えば、核酸分子は化学合成により完全に合成す
ることができる。本発明の核酸の短いセグメントを化学
的に合成し、そしてこうしたオリゴヌクレオチドを放射
標識するか、もしくはこうしたオリゴヌクレオチドを蛍
光色素で標識することもまた可能である。標識されたオ
リゴヌクレオチドは、出発原料として植物ｍＲＮＡを用
いて作成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
するのにもまた使用することができる。問題のＤＮＡフ
ラグメントを単離するために、標識されたオリゴヌクレ
オチドにハイブリダイズするクローンを選択する。単離
されたＤＮＡを特徴づけた後に、本発明の核酸を単純な
様式で得る。

【００５９】本発明の核酸は、化学的に合成されたオリ
ゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ法によってもまた生成
することができる。

【００６０】本情況で使用されるところの「オリゴヌク
レオチド（１種もしくは複数）」という用語は、１０な
いし５０ヌクレオチド、好ましくは１５ないし３０ヌク
レオチドより成るＤＮＡ分子を示す。それらを化学的に
合成し、そしてプローブとして使用することができる。

【００６１】本発明は本発明のポリペプチドの生成方法
にさらに関する。本発明の核酸によりコードされるポリ
ペプチドを生成させるため、本発明の核酸を含有する宿
主細胞を適する条件下で培養してよい。その後、所望の
ポリペプチドを細胞もしくは培地から通例の様式で単離
することができる。ポリペプチドはインビトロ系で生成
させてもまたよい。

【００６２】本発明の核酸を使用して宿主細胞により合
成される本発明のポリペプチドの迅速な単離方法は融合
タンパク質を発現することで開始し、融合パートナーを
単純な様式で親和性精製することが可能である。融合パ
ートナーは例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼで
あってよい。その後、融合タンパク質をグルタチオンア
フィニティーカラムで精製することができる。融合パー
トナーは、例えば、融合パートナーと精製されるべきで
ある本発明のポリペプチドとの間のリンカーでの部分的
タンパク質分解性切断により分離することができる。ト
リプシン切断のための部位を規定するアルギニンおよび
リシン残基のような標的アミノ酸をそれが包含するよう
なリンカーを設計することができる。こうしたリンカー
を生成するために、オリゴヌクレオチドを使用する標準
的クローニング法を使用してよい。

【００６３】可能であるさらなる精製方法は、調製的電
気泳動、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えばゲル濾過、逆相も
しくは穏やかに疎水性のカラムを使用する）、ゲル濾
過、示差的沈殿法(differential precipitation)、イオ
ン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマ
トグラフィーに基づく。

【００６４】本情況で使用されるところの「単離もしく
は精製」という用語は、本発明のポリペプチドが細胞も
しくは組織の他のタンパク質もしくは他の巨大分子から
分離されていることを示す。本発明のポリペプチドを含
有する組成物は、好ましくは、宿主細胞調製物と比較し
て、そのタンパク質含量に関して最低１０倍およびとり
わけ好ましくは最低１００倍より濃縮されている。

【００６５】本発明のポリペプチドは、該ポリペプチド
に結合する抗体の助けを借りて、融合パートナーなしで
親和性精製してもまたよい。

【００６６】本発明は、本発明のポリペプチドに結合し
そしてそれらの特性を改変する化合物を見出す方法にも
また関する。こうした化合物は、アゴニストもしくはア
ンタゴニストのいずれかとして本発明のポリペプチドの
調節物質として作用することができる。

【００６７】本発明は、フィトエンデサチュラーゼに結
合しそしてその特性を改変する化合物を見出す方法にも
また関し、これらの化合物がアゴニストもしくはアンタ
ゴニストとして作用することが可能である。

【００６８】本情況で使用されるところの「アゴニス
ト」という用語は、酵素フィトエン合成酵素、酵素フィ
トエンデサチュラーゼもしくは酵素ζ−カロチンデサチ
ュラーゼの酵素活性を加速もしくは高める分子を指す。

【００６９】本情況で使用されるところの「アンタゴニ
スト」という用語は、酵素フィトエン合成酵素、酵素フ
ィトエンデサチュラーゼもしくは酵素ζ−カロチンデサ
チュラーゼの酵素活性を減速もしくは阻害する分子を指
す。

【００７０】本情況で使用されるところの「調節物質」
という用語はアゴニストもしくはアンタゴニストに対す
る包括的用語を構成する。調節物質は、本発明のポリペ
プチドに結合する小型の有機化学分子、ペプチドもしく
は抗体であることができる。さらなる調節物質は、本発
明のポリペプチドに順に結合しそうしてそれらの生物活
性に影響する分子に結合する小型の有機化学分子、ペプ
チドもしくは抗体であってよい。調節物質は、天然の基
質およびリガンド、またはそれらの構造的もしくは機能
的模倣物であってよい。

【００７１】調節物質は好ましくは小型の有機化学分子
である。

【００７２】酵素フィトエン合成酵素、フィトエンデサ
チュラーゼおよびζ−カロチンデサチュラーゼへの調節
物質の結合は、それで処理された植物の死につながる様
式で細胞事象を変える可能性がある。

【００７３】従って、本発明は、酵素活性に影響する化
合物を見出す方法における本発明のポリペプチド、フィ
トエン合成酵素、ζ−カロチンデサチュラーゼおよびフ
ィトエンデサチュラーゼの使用もまた含んで成る。

【００７４】本発明は、フィトエン合成酵素、ζ−カロ
チンデサチュラーゼおよびフィトエンデサチュラーゼの
発現を改変する化合物を見出す方法をさらに含んで成
る。こうした「発現調節物質」はまた、新たな成長調節
物質もしくは除草性有効成分を構成することもできる。
発現調節物質は、フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデ
サチュラーゼもしくはフィトエンデサチュラーゼをコー
ドする核酸の調節領域に結合する小型の有機化学分子、
ペプチドもしくは抗体であることができる。さらに、発
現調節物質は、フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデサ
チュラーゼもしくはフィトエンデサチュラーゼをコード
する核酸の調節領域に順に結合してそうしてそれらの発
現に影響する分子に結合する小型の有機化学分子、ペプ
チドもしくは抗体であってよい。発現調節物質はまたア
ンチセンス分子であってもよい。

【００７５】従って、本発明は、植物の成長の調節物質
もしくは除草剤としてのフィトエン合成酵素、ζ−カロ
チンデサチュラーゼおよびフィトエンデサチュラーゼの
調節物質もしくは発現調節物質の使用にもまたわたる。

【００７６】本発明の方法は高スループットスクリーニ
ング（ＨＴＳ）を包含する。宿主細胞のみならず、しか
し本発明の核酸および／あるいはフィトエン合成酵素、
ζ−カロチンデサチュラーゼもしくはフィトエンデサチ
ュラーゼ、またはそれらをコードする核酸を含有する細
胞を含まない調製物もまた、この目的上使用することが
できる。

【００７７】調節物質を見出すため、フィトエン合成酵
素、ζ−カロチンデサチュラーゼもしくはフィトエンデ
サチュラーゼを含有する合成の反応混合物（例えばイン
ビトロ転写の生成物）もしくは細胞の成分を、候補分子
（アゴニストもしくはアンタゴニストであることができ
る）の存在および非存在下でポリペプチドの標識された
基質もしくはリガンドと一緒にインキュベートすること
ができる。フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデサチュ
ラーゼもしくはフィトエンデサチュラーゼの活性を増大
もしくは阻害する候補分子の能力は、標識されたリガン
ドの増大もしくは低下された結合、または標識された基
質の増大もしくは低下された転化から見ることができ
る。フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデサチュラーゼ
もしくはフィトエンデサチュラーゼに十分に結合しかつ
それらの増大された活性につながる分子はアゴニストで
ある。フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデサチュラー
ゼもしくはフィトエンデサチュラーゼに十分に結合する
がしかしそれらの生物活性を誘発しない分子はおそらく
良好なアンタゴニストである。フィトエン合成酵素、ζ
−カロチンデサチュラーゼもしくはフィトエンデサチュ
ラーゼの生物活性の検出はいわゆるレポーター系により
向上させることができる。この点に関してのレポーター
系は、限定されるものでないが生成物に転化される比色
的に標識された基質、またはフィトエン合成酵素、ζ−
カロチンデサチュラーゼもしくはフィトエンデサチュラ
ーゼの活性もしくは発現の変化に応答するレポーター遺
伝子、あるいは他の既知の結合試験を挙げることができ
る。

【００７８】その助けを借りてフィトエンデサチュラー
ゼおよび／もしくは本発明のポリペプチドの調節物質を
見出すことができる方法のさらなる一例は置き換え試験
であり、ここで、フィトエン合成酵素、ζ−カロチンデ
サチュラーゼもしくはフィトエンデサチュラーゼおよび
潜在的調節物質を、適する条件下で、天然の基質もしく
はリガンドまたは基質もしくはリガンドの模倣物のよう
な本発明のポリペプチドに結合することが既知である分
子と組み合わせる。本発明のポリペプチドもしくはフィ
トエンデサチュラーゼそれ自身は標識（例えば放射標識
もしくは比色的に標識）することができ、その結果リガ
ンドに結合するもしくは転化をうけたポリペプチドの数
を正確に測定することが可能である。これは、アゴニス
トもしくはアンタゴニストの効力を決定することを可能
にする。

【００７９】本発明は、トランスジェニック植物の生成
のための本発明の核酸、本発明のＤＮＡ構築物もしくは
本発明のベクターの使用、およびこうしたものもしくは
それらの部分または繁殖材料としての対応するトランス
ジェニック植物にさらに関する。

【００８０】本発明の核酸、本発明のＤＮＡ構築物もし
くは本発明のベクターを導入した後に対応する野性型の
形態と比較してレセプター様のプロテインキナーゼの細
胞内濃度が増大もしくは低下されているトランスジェニ
ック植物、植物の部分、プロトプラスト、植物組織もし
くは植物繁殖材料もまた本発明の主題である。

【００８１】本情況で使用されるところの「植物の部
分」という用語は、苗条、葉、花および根のような植物
の全部の気中および地下の部分および器官、ならびにプ
ロトプラストおよびそれで作成された組織培養物を示
す。

【００８２】本情況で使用されるところの「繁殖材料」
という用語は、挿し木、根茎(tuber)、根茎(rhizoma)、
取り木および種子のような植物を生長させるおよび生殖
力のある繁殖材料を示す。

【００８３】本発明は、フィトエン合成酵素をコードす
る配列中の改変が実施されている植物、および本発明の
フィトエン合成酵素の産生につながり選択される、また
は増大もしくは低下された内在性のフィトエン合成酵素
活性が突然変異誘発により達成されている植物にもまた
関する。

【００８４】本発明は、ζ−カロチンデサチュラーゼを
コードする配列中の改変が実施されている植物、および
本発明のζ−カロチンデサチュラーゼの産生につながり
選択される、または増大もしくは低下された内在性のζ
−カロチンデサチュラーゼ活性が突然変異誘発により達
成されている植物にもまた関する。

【００８５】

【実施例】実施例１タバコのフィトエン合成酵素遺伝子のクローニングＲＡＣＥ−ＰＣＲを介してＰＳＹの５’および３’末端
をクローン化した。得られたフラグメントを配列決定し
た。これらのフラグメントの配列からＰＳＹの完全な配
列を組み立てた。配列決定されたフラグメントから、各
場合において中央および３’−末端のフラグメントはヌ
クレオチドレベルでおよそ８０％の残存するフラグメン
トとの相同性をもつ逸脱する配列を示した。これらの２
フラグメントは重なり合う領域で１００％の同一性を示
した。異なるＰＣＲ反応からの２種の逸脱するフラグメ
ントが一致するという事実は、タバコにおけるさらなる
ＰＳＹ遺伝子の存在を意味した。従って、既に完了され
たＰＳＹ配列に接尾辞ＰＳＹ１を与え、逸脱する配列に
接尾辞ＰＳＹ２を与えた。ＰＳＹ２の部分配列に従っ
て、対応する５’末端のＲＡＣＥ増幅のために新たなプ
ライマーを定義した。このプライマーを使用して５’−
末端フラグメントを得た。これらのフラグメントの配列
を決定した。それらは重なり合う領域でＰＳＹ２の存在
する配列と１００％の相同性を示した。これらのフラグ
メントの配列からＰＳＹ２の完全な配列を組み立てた。
得られた配列に基づいてタンパク質の配列を決定した。
ＰＳＹ１について見出された読取り枠は約４８ｋＤａに
対応する４３９アミノ酸のタンパク質をコードする。Ｐ
ＳＹ２についての読取り枠は約４５ｋＤａに対応する４
１０アミノ酸のタンパク質をコードする。２種のタバコ
のＰＳＹ遺伝子はアミノ酸レベルで８６％の相同性を示
す。最大の逸脱はＮ末端領域の４および２２アミノ酸の
２個の欠失に位置を突きとめられる。ＰＳＹ１およびＰ
ＳＹ２は、アミノ酸レベルで、トマトＰＳＹ２とそれぞ
れ９６％および９３％、ならびにトマトＰＳＹ１とそれ
ぞれ８５％および８７％の相同性を示す。全部の他の植
物からはせいぜい１種のＰＳＹ遺伝子が知られている。

【００８６】詳細なクローニング手順を下に記述する。

【００８７】タバコ種子を温室に入れ、そして４週間後
に実生から全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡを二本鎖ｃＤ
ＮＡの合成のための鋳型として使用した。ｃＤＮＡをク
レノウフラグメントで埋め、そしてＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼでホスホリル化した。マラソン（Ｍａｒａ
ｔｈｏｎ）アダプター（５’−ｃｔａａｔａｃｇａｃｔ
ｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｃｃｇｃ
ｃｃｇｇｇｃａｇｇｔ−３’／３’−ｃｃｃｇｔｃ
ｃａ−５’）をｃＤＮＡに連結した（クロンテック（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇ
ｅ）ｃＤＮＡＰＣＲキット）。

【００８８】配列５’−ｔａｔｇｃｔａａｇａｃｇｔ
ｔｔｔａｔｃｔｔｇｇａａｃ−３’および５’−ｃｃ
ａｔａｃａｇｇｃｃａｔｃｔｇｃｔａｇｃ−３’の
プライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借りて、タバ
コ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のフィトエ
ン合成酵素のコーディング配列のフラグメントを増幅し
た。増幅されたフラグメントはＴＯＰＯＴＡ−クロー
ニングを介して細菌ベクターｐＣＲ２．１（インヴィト
ロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し
た。増幅されたフラグメントの配列は、サンガーの方法
に従って配列決定することにより決定した。２種の異な
る配列を得、そしてＰＳＹ１およびＰＳＹ２と命名し
た。

【００８９】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素１の配列の５’末端は、配
列５’−ｃｃａｔｃｇａｃｔａｇｃｔｃａｔｃｃｇｔ
ｔｃｔｃｃｔｇｃａｃｃ−３’および５’−ｃｃａ
ｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ
ｃ−３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借
りて増幅した。

【００９０】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素２の配列の５’末端は、配
列５’−ａａｇｃｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｔａｔ
ｃｔａａｇｇｃｔｔｇｇ−３’および５’−ｃｃａ
ｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ
ｃ−３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借
りて増幅した。

【００９１】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素１および２の配列の３’末
端は、配列５’−ａｇｔａｇｇａｃｔｇａｔｇａｇｔ
ｇｔｔｃｃａｇｔｔａｔｇｇｇｔａｔｔｇｃａｃｃ
−３’および５’−ｃｃａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃ
ｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃ−３’のプライマーを使用
するＰＣＲ技術の助けを借りて増幅した。

【００９２】増幅されたフラグメントは、ＴＯＰＯＴ
Ａ−クローニングを介して細菌ベクターｐＣＲ２．１
（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にク
ローン化した。増幅されたフラグメントの配列は、サン
ガーの方法に従って配列決定することにより決定した。

【００９３】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素１の転写された配列は、配
列５’−ａｇａａａｃｃｃａｇａａａｇａａｃａａｃ
ａｇｇｔｔｔｔｇ−３’および５’−ｃｔｃａｃｔｔ
ｇａｇｇｇｔｔｔｇａｔｇａｇｔｇｔｇｇ−３’の
プライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借りて増幅し
た。増幅されたフラグメントは、ＴＯＰＯＴＡクロー
ニングを介して細菌ベクターｐＣＲ２．１（インヴィト
ロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し
た。増幅されたフラグメントの配列は、サンガーの方法
に従って配列決定することにより決定した。該配列をＰ
ＳＹ１と命名した。

【００９４】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素１のコーディング配列は、
配列５’−ｔｔｃｃｃｇｇｇｔｔｇｔｔｔｃａｔｇａ
ｇｃａｔｇ−３’および５’−ｔｔｃｃｃｇｇｇｔｃ
ａｔｔｃａｔｇｔｃｔｔｔｇｃ−３’のプライマーを
使用するＰＣＲ技術の助けを借りて増幅した。増幅され
たフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＸｍａＩで再
切断した。生じるＸｍａＩＰＳＹ１フラグメントを、
直線状にされかつ脱ホスホリル化されたベクターｐＳＳ
に連結した。生じる構築物ｐＳＳ−ＰＳＹ１を制限マッ
ピングによりトランスジーン(transgene)の向きについ
てチェックした。

【００９５】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエン合成酵素２のコーディング配列は、
配列５’−ａｔｇａａｔｔｃｔｇｔｔｃａａａａｔｇ
ｔｃｔｇｔｔｇｃｃ−３’および５’−ａｔｇａａｔｔ
ｃｃｔｇａｔｇｔｃｔａｔｇｃｃｔｔａｇｃｔａｇ
ａｇ−３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助け
を借りて増幅した。増幅されたフラグメントを制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで再切断した。生じるＥｃｏ
ＲＩＰＳＹ２フラグメントを、直線状にされかつ脱ホ
スホリル化されたベクターｐＳＳに連結した。生じる構
築物ｐＳＳ−ＰＳＹ２を制限マッピングによりトランス
ジーンの向きについてチェックした。

【００９６】実施例２タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のζ−
カロチンデサチュラーゼのクローニングタバコ種子を温室に入れ、そして４週間後に実生から全
ＲＮＡを調製した。二本鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型
として全ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡをクレノウフラグ
メントで埋め、そしてＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
でホスホリル化した。マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ア
ダプター（５’−ｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔ
ａｇｇｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｃ
ａｇｇｔ−３’／３’−ｃｃｃｇｔｃｃａ−５’）
をｃＤＮＡに連結した（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ）、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮＡ
ＰＣＲキット）。

【００９７】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼのコーディング配
列のフラグメントは、配列５’−ｇａｇｃｔｇｇａｃｔ
ｔｇｃａｇｇｃａｔｇｔｃｇ−３’および５’−ａ
ａｃｔｇｇａａｇａａｔｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃａｇ
ｇａａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−
３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを借りて
増幅した。増幅されたフラグメントは、ＴＯＰＯＴＡ
クローニングを介して細菌ベクターｐＣＲ２．１（イン
ヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン
化した。増幅されたフラグメントの配列は、サンガーの
方法に従って配列決定することにより決定した。

【００９８】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼの配列の５’末端
は、配列５’−ｔｃｃａｃｃｔｃａｔｇｔｃｃｔｔｇ
ａｔｃｃａａｇａｇｃｔｃｃ−３’および５’−ｃｃ
ａｔｃｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇ
ｇｃ−３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助けを
借りて増幅した。増幅されたフラグメントはＴＯＰＯ
ＴＡクローニングを介して細菌ベクターｐＣＲ２．１
（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にク
ローン化した。増幅されたフラグメントの配列は、サン
ガーの方法に従って配列決定することにより決定した。

【００９９】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼの転写された配列
は、配列５’−ｃｔｇｇｃａｔｃｔｔａｃａｔｃｔｇ
ｃｃａａａｔｔｔｃｃ−３’および５’−ｔｃｔｔｃ
ｔｃａａｔｇａａｔｇａｔｇａｇｃａａｔａｃｇａ
ｔｃｃ−３’のプライマーを使用するＰＣＲ技術の助
けを借りて増幅した。増幅されたフラグメントは、ＴＯ
ＰＯＴＡクローニングを介して細菌ベクターｐＣＲ
２．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ））にクローン化した。増幅されたフラグメントの配
列は、サンガーの方法に従って配列決定することにより
決定した。これは配列、配列番号１を与えた。

【０１００】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼのコーディング配
列は、配列、配列番号３および配列番号４のプライマー
を使用するＰＣＲ技術の助けを借りて増幅した。増幅さ
れたフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＸｍａＩで
再切断した。生じるＸｍａＩＺＤＳフラグメントを、
直線状にされかつ脱ホスホリル化されたベクターｐＳＳ
に連結した。生じる構築物ｐＳＳ−ＺＤＳを制限マッピ
ングによりトランスジーンの向きについてチェックし
た。

【０１０１】ＺＤＳの見出された読取り枠は、約６５ｋ
Ｄａに対応する５８８アミノ酸のタンパク質をコードす
る。アミノ酸レベルでの既知のトウガラシ（Ｃａｐｓｉ
ｃｕｍａｎｎｕｕｍ）のＺＤＳとの相同性は９５％で
ある。従って、これがタバコ色素体のＺＤＳである。

【０１０２】実施例３タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１
のフィトエンデサチュラーゼのクローニングタバコ種子を温室に入れ、そして４週間後に実生から全
ＲＮＡを調製した。一本鎖ｃＤＮＡの合成のための鋳型
として全ＲＮＡを使用した（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）、第一鎖ｃＤＮＡ合成キット）。

【０１０３】タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃ
ｕｍ）のフィトエンデサチュラーゼのコーディング配列
は、配列、配列番号９および配列番号１０のプライマー
を使用するＰＣＲ技術の助けを借りて増幅した。増幅さ
れたフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＸｍａＩで
再切断した。生じるＸｍａＩＰＤＳフラグメントを、
直線状にされかつ脱ホスホリル化されたベクターｐＳＳ
に連結した。生じる構築物ｐＳＳ−ＰＤＳを制限マッピ
ングによりトランスジーンの向きについてチェックし
た。

【０１０４】実施例４サザンおよびノーザンブロットタバコのＰＳＹ遺伝子をさらに特徴づけるためサザンブ
ロットを実施した。ゲノムのタバコＤＮＡを調製し、そ
して多様な制限エンドヌクレアーゼで切断した。ＤＮＡ
をニトロセルロース上にブロッティングし、そして放射
標識されたプローブとＰＳＹ１をハイブリダイズさせ
た。各場合において３もしくは４個のバンドをみとめる
ことができる。タバコの２種もしくは適切な場合はそれ
以上のＰＳＹ遺伝子の機能性に対する表示を得るため
に、タバコ種子を温室に入れた。２、４および６週間後
に植物材料のいくらかを収穫し、そして液体窒素中で凍
結した。同時に、成体タバコ植物の花弁を収穫しそして
同一の様式で処理した。この材料を用いてｍＲＮＡの調
製を実施した。ｍＲＮＡをニトロセルロースに移し（ス
ロットブロット）、そして放射活性なＰＳＹ１およびＰ
ＳＹ２プローブと別個にハイブリダイズさせた。全体で
２種の遺伝子が高度に異なる転写レベルを示す。しかし
ながら、発達段階に独立に、２種の遺伝子の間の比は一
定のままである。

【０１０５】実施例５タバコのカロチノイド生合成経路の酵素をコードする遺
伝子のスイッチオフ得られたＰＳＹ、ＰＤＳおよびＺＤＳ配列、ならびにタ
バコのＬＣＹの既知の配列を使用して、完全なコーディ
ング配列の増幅のためのプライマーを定義した。これら
のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。増幅物(a
mplificate)をＴＯＰＯＴＡクローニングにより細菌
ベクターｐＣＲ２．１にクローン化した（インヴィトロ
ジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。挿入物の正体(ide
ntity)を配列決定によりチェックした。双方の側のＸｍ
ａＩ制限切断部位での増幅のためのプライマーを全部の
遺伝子について定義した。これらのプライマーを用いて
ＰＣＲ反応を実施した。ベクターｐＣＲ２．１中の遺伝
子の構築物を鋳型として使用した。生じるフラグメント
を制限エンドヌクレアーゼＸｍａＩで切断した。二成分
(binary)ベクターｐＳＳもまたＸｍａＩで切断し、そし
て仔ウシ胸腺アルカリホスファターゼで脱ホスホリル化
した。切断された遺伝子をベクターｐＳＳに連結した。
得られた構築物中の遺伝子のセンスもしくはアンチセン
スの向きを制限分析によりチェックした。いくつかのク
ローンを選択し、そして配列決定することによりｐＳＳ
と遺伝子との間の移行を付加的にチェックした。選択さ
れた構築物および空のベクターｐＳＳ（対照）をコンピ
テントなＳ１７．１細胞に形質転換した。プラスミドを
接合(conjugation)によりアグロバクテリウムツメフ
ァシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）ｐＭＰ９０ＲＫに移した。アグロバクテ
リウムの培養物をＰＣＲによりプラスミドの存在につい
てチェックした。タバコ植物を２種の異なるアプローチ
でｐＳＳ構築物を用いて形質転換した。４週齢のタバコ
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ＳＲ１の苗条
培養物からプロトプラストを単離した。プロトプラスト
を共培養によりアグロバクテリウムで形質転換した。共
培養に使用されたアグロバクテリウムはセンスおよびア
ンチセンスの向きで遺伝子構築物を含有した。形質転換
されたプロトプラストから適する選択圧下でカルスを成
長させた。構築物および対照につき７０個のカルスを再
生した。同時に、全部の構築物を用いて葉円盤形質転換
(leaf disc transformation)を実施した。

【０１０６】カナマイシン含有培地への再生された苗条
の移動後に、各別個の構築物の残存するカルスを合わせ
た。この材料からｍＲＮＡを調製し、そして４個の同一
の複写物でニトロセルロース膜にスロットブロットの形
態で移した。各場合において、１個の複写物がＰＳＹ
１、ＰＤＳ、ＺＤＳおよびＬＣＹのそれぞれの１個の放
射活性プローブとハイブリダイズした。全部のサンプル
において、植物に移されていた特定の遺伝子の転写物に
ついて強いシグナルが出現した。二重にされた３５Ｓプ
ロモーターの活性がこうして証明される。

【０１０７】再生された苗条を滅菌培養物中に定着させ
た。先端を新鮮培地に移し、そして苗条を短く摘み込ん
だ。先端が定着した後に、再度発芽していた苗条を温室
中の滅菌培地から土壌に移した。定着された先端を滅菌
培地中に留まらせ、そして一定の間隔で新鮮培地に移植
した。

【０１０８】５〜６週間後に、植物のおよそ２／３の高
さで１枚の葉をトランスジェニック温室植物から切断し
た。この葉の０．５ｇを、スパチュラ先端いっぱいの酸
化マグネシウムおよび３ｍｌのアセトンと一緒にポッタ
ー(Potter)中で細分した。消化物を濾過し、そしてＨＰ
ＬＣを介してキサントフィル、カロチノイドおよびクロ
ロフィルの含有量を測定した。残存する葉の材料を液体
窒素中で直ちに凍結し、そして乳鉢中で細分した。この
材料を用いてスロットブロットのためのｍＲＮＡの調製
を実施した。

【０１０９】実施例６トランスジェニック植物の表現型分析センスの向きでフィトエン合成酵素をもつトランスジェ
ニック植物は、滅菌培養物および温室の双方において表
現型の影響を示し、そのいくつかは著しかった。葉の形
態に対する影響は著しい。すなわち、幼若葉のいくつか
は、しかしながら増大する齢とともに消失するいくぶん
橙色がかった黄色の着色を示す一方、より古い葉は非常
に不規則な薄緑色の色素形成を示す。加えて、葉は水気
が多く、粗い長毛で覆われ、そして非常に堅く、そして
それらの縁は側から内側へ丸くなる。全体としての植物
の発達は対照植物に比較して大きく遅延される。とりわ
け大きく影響を及ぼされているいくつかの植物の花は事
実上無色であり、そして対照植物が表す花弁の桃色の着
色を示さない。種子の外皮(capsule)は緑色の代わりに
明らかに橙色である。

【０１１０】これらの植物のカロチノイド、キサントフ
ィルおよびクロロフィルの含有量の測定は、少量のフィ
トエンの蓄積およびβ−カロチン含有量の顕著な増大を
示す。フィトエン合成酵素の直接の生成物としてのフィ
トエンは、与えられた条件下で対照植物において検出す
ることができない。さらに、トランスジェニック植物は
クロロフィル含有量の４０％までの低下を示す。これ
は、ゲラニルゲラニルピロリン酸をフィトール合成から
カロチノイド合成へ再度向けることに帰される可能性が
あり、それは結果として低下されたクロロフィル合成に
つながる。

【０１１１】アンチセンスの向きでフィトエンデサチュ
ラーゼをもつトランスジェニック植物は温室で葉の色素
形成の効果を示す。葉は白色の葉脈を有し、そして葉の
先端はいくつかの場合において完全に白色である。１系
統の種子の外皮もまた完全に白色であった。問題の系統
のカロチノイド含有量の測定は、おおよそノルフルラゾ
ンで処理されたタバコ植物で見出される桁のフィトエン
の非常に高度の蓄積を示す。キサントフィルおよびクロ
ロフィルの含有量は低下される。問題の系統の１種の自
家受粉された植物の種子を植え、そして選択条件下で発
芽させた。これらの実生は３種の表現型、すなわち白色
の子葉を有するのみである選択された植物、および緑色
植物、ならびに一次葉の段階を越えて成長した白色植物
への分離を示した。白色の実生はホモ接合性のトランス
ジェニック植物であった。温室への移動後に、全部の白
色植物は１週間以内に枯れた一方、緑色植物は成体のヘ
テロ接合性の植物の上述された表現型を示す。特徴の決
定は緑色の実生の場合にフィトエンの非常に高度の蓄積
を示した。白色の実生においては、β−カロチンは検出
されず、また、少量のみのキサントフィルが検出され
た。

【０１１２】

【表２】

【０１１３】

【表３】

【０１１４】配列表および図面の説明配列番号１タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のフィ
トエン合成酵素をコードするＤＮＡ配列。該ＤＮＡによ
りコードされるアミノ酸配列を述べる。配列番号２タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のフィ
トエン合成酵素の活性をもつポリペプチドのアミノ酸配
列。配列番号３タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のフィ
トエン合成酵素をコードするＤＮＡ配列。該ＤＮＡによ
りコードされるアミノ酸配列を述べる。配列番号４タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のフィ
トエン合成酵素の活性をもつポリペプチドのアミノ酸配
列。配列番号５タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のζ−
カロチンデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列。該Ｄ
ＮＡによりコードされるアミノ酸配列を述べる。配列番号６タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）のζ−
カロチンデサチュラーゼの活性をもつポリペプチドのア
ミノ酸配列。配列番号７ＰＣＲ技術によりタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂ
ａｃｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼを増幅するた
めのオリゴヌクレオチド。配列番号８ＰＣＲ技術によりタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂ
ａｃｕｍ）のζ−カロチンデサチュラーゼを増幅するた
めのオリゴヌクレオチド。配列番号９ＰＣＲ技術によりタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂ
ａｃｕｍ）のフィトエンデサチュラーゼを増幅するため
のオリゴヌクレオチド。配列番号１０ＰＣＲ技術によりタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂ
ａｃｕｍ）のフィトエンデサチュラーゼを増幅するため
のオリゴヌクレオチド。

【０１１５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BAYER AG <120> DNA encoding the tobacco phytoene synthase <130> 200103107 <150> DE 100 22 362.1 <151> 2000-05-08 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1728 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> CDS <222> (244)..(1566) <400> 1 agaaacccag aaagaacaac aggttttgct tcttgttgat gagtgcattt gcctctgctt 60 gtgtaaggca aagtcggttc actttcttat atccgatttt tataatcgtt gaaattagtg 120 gatagactct agtggatatc tacaagtatt ggttttttga taaaataggc tgaggtgaga 180 aggtaacata aaggaaagac aaaaacttgg gaattgtttt agaccaccga ggtttcttgt 240 ttc atg agc atg tct gtt gct ttg ttg tgg gtt gtt tct ccc act tcc 288 Met Ser Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Ser Pro Thr Ser 1 5 10 15 gag gtc tcg aat ggg aca gga ttg ttg gat tca gtc cga gaa gga aac 336 Glu Val Ser Asn Gly Thr Gly Leu Leu Asp Ser Val Arg Glu Gly Asn 20 25 30 cgc gtc ttt gta tca tcc agg ttc cta gct cga gat agg aat ttg atg 384 Arg Val Phe Val Ser Ser Arg Phe Leu Ala Arg Asp Arg Asn Leu Met 35 40 45 tgg aat ggg aga atc aag aaa ggt ggg aga caa agg tgg aat ttt ggc 432 Trp Asn Gly Arg Ile Lys Lys Gly Gly Arg Gln Arg Trp Asn Phe Gly 50 55 60 tct tta att gct gat cca aga tat tca tgc ttg ggt gga tca aga act 480 Ser Leu Ile Ala Asp Pro Arg Tyr Ser Cys Leu Gly Gly Ser Arg Thr 65 70 75 gaa aag gga agc act ttc tct gta cag tcc agt ttg gtg gct agc cca 528 Glu Lys Gly Ser Thr Phe Ser Val Gln Ser Ser Leu Val Ala Ser Pro 80 85 90 95 gct gga gaa atg act gtg tca tca gag aaa aag gtg tat gat gtg gta 576 Ala Gly Glu Met Thr Val Ser Ser Glu Lys Lys Val Tyr Asp Val Val 100 105 110 tta aag cag gca gct tta gtg aag agg cag ctg aga tct acc gat gat 624 Leu Lys Gln Ala Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Arg Ser Thr Asp Asp 115 120 125 tta gaa gtg aag ccg gat att gtt gtt cca ggg aat ttg ggc ttg ttg 672 Leu Glu Val Lys Pro Asp Ile Val Val Pro Gly Asn Leu Gly Leu Leu 130 135 140 agt gaa gca tat gat cgt tgt ggc gaa gta tgt gca gag tat gca aag 720 Ser Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Gly Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala Lys 145 150 155 aca ttt tac tta gga acc aag cta atg acc cca gag aga aga aga gct 768 Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Lys Leu Met Thr Pro Glu Arg Arg Arg Ala 160 165 170 175 atc tgg gca ata tat gtg tgg tgc agg aga acg gat gag ctt gtt gat 816 Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp 180 185 190 ggc cct aat gca tcc cac ata act ccg caa gct tta gat agg tgg gag 864 Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu 195 200 205 acc agg ctg gaa gat att ttc agt ggg cgg cca ttt gat atg ctt gat 912 Thr Arg Leu Glu Asp Ile Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp Met Leu Asp 210 215 220 gct gct tta tcc gat act gtc tcc aga ttt cct gtt gat att cag cca 960 Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Arg Phe Pro Val Asp Ile Gln Pro 225 230 235 ttc aga gat atg att gaa gga atg cgt atg gac ttg tgg aaa tcc aga 1008 Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Trp Lys Ser Arg 240 245 250 255 tac aaa act ttc gat gag cta tat ctc tat tgt tac tat gtt gct ggt 1056 Tyr Lys Thr Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly 260 265 270 act gta gga ttg atg agt gtt cca gtt atg ggt att gca cct gaa tca 1104 Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser 275 280 285 aag gca aca aca gag agt gta tat aat gct gct ttg gct tta ggg ctt 1152 Lys Ala Thr Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu 290 295 300 gca aat caa cta acc aat ata ctc aga gat gta gga gaa gat gcc aga 1200 Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg 305 310 315 aga gga aga gta tac ttg cct caa gat gaa tta gca cag gca ggg ctc 1248 Arg Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly Leu 320 325 330 335 tcc gac gaa gac ata ttt gct gga aga gtg act gat aag tgg agg aac 1296 Ser Asp Glu Asp Ile Phe Ala Gly Arg Val Thr Asp Lys Trp Arg Asn 340 345 350 ttt atg aag aaa caa att cag agg gcg agg aaa ttc ttt gat gag tca 1344 Phe Met Lys Lys Gln Ile Gln Arg Ala Arg Lys Phe Phe Asp Glu Ser 355 360 365 gag aaa ggt gtc aca gaa ctg gac tct gct agt aga tgg cct gtg tta 1392 Glu Lys Gly Val Thr Glu Leu Asp Ser Ala Ser Arg Trp Pro Val Leu 370 375 380 aca gcg ctg ctg ttg tat cgc aag ata ttg gac gag att gaa gcc aac 1440 Thr Ala Leu Leu Leu Tyr Arg Lys Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn 385 390 395 gac tac aac aac ttc aca agg agg gct tat gtt agc aag cca aag aag 1488 Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Arg Arg Ala Tyr Val Ser Lys Pro Lys Lys 400 405 410 415 ctt ctc acc ttg ccc att gct tat gca aaa tct ctt gtg ccc cct aat 1536 Leu Leu Thr Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val Pro Pro Asn 420 425 430 aga act tcc tct cca cta gca aag aca tga atgaagtagt tgagtcaatg 1586 Arg Thr Ser Ser Pro Leu Ala Lys Thr 435 440 agtattatac actaaagaaa ctcaggtact tgtaaatgag atatcttttg ctaaatgtgt 1646 atcatcaaaa gtagattgta aattcaatat gacaatctct tggtagaata ttttctccac 1706 actcatcaaa ccctcaagtg ag 1728 <210> 2 <211> 440 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 2 Met Ser Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Ser Pro Thr Ser Glu 1 5 10 15 Val Ser Asn Gly Thr Gly Leu Leu Asp Ser Val Arg Glu Gly Asn Arg 20 25 30 Val Phe Val Ser Ser Arg Phe Leu Ala Arg Asp Arg Asn Leu Met Trp 35 40 45 Asn Gly Arg Ile Lys Lys Gly Gly Arg Gln Arg Trp Asn Phe Gly Ser 50 55 60 Leu Ile Ala Asp Pro Arg Tyr Ser Cys Leu Gly Gly Ser Arg Thr Glu 65 70 75 80 Lys Gly Ser Thr Phe Ser Val Gln Ser Ser Leu Val Ala Ser Pro Ala 85 90 95 Gly Glu Met Thr Val Ser Ser Glu Lys Lys Val Tyr Asp Val Val Leu 100 105 110 Lys Gln Ala Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Arg Ser Thr Asp Asp Leu 115 120 125 Glu Val Lys Pro Asp Ile Val Val Pro Gly Asn Leu Gly Leu Leu Ser 130 135 140 Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Gly Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala Lys Thr 145 150 155 160 Phe Tyr Leu Gly Thr Lys Leu Met Thr Pro Glu Arg Arg Arg Ala Ile 165 170 175 Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly 180 185 190 Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Thr 195 200 205 Arg Leu Glu Asp Ile Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp Met Leu Asp Ala 210 215 220 Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Arg Phe Pro Val Asp Ile Gln Pro Phe 225 230 235 240 Arg Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Trp Lys Ser Arg Tyr 245 250 255 Lys Thr Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr 260 265 270 Val Gly Leu Met Ser Val Pro Val Met Gly Ile Ala Pro Glu Ser Lys 275 280 285 Ala Thr Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Ala 290 295 300 Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg 305 310 315 320 Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly Leu Ser 325 330 335 Asp Glu Asp Ile Phe Ala Gly Arg Val Thr Asp Lys Trp Arg Asn Phe 340 345 350 Met Lys Lys Gln Ile Gln Arg Ala Arg Lys Phe Phe Asp Glu Ser Glu 355 360 365 Lys Gly Val Thr Glu Leu Asp Ser Ala Ser Arg Trp Pro Val Leu Thr 370 375 380 Ala Leu Leu Leu Tyr Arg Lys Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp 385 390 395 400 Tyr Asn Asn Phe Thr Arg Arg Ala Tyr Val Ser Lys Pro Lys Lys Leu 405 410 415 Leu Thr Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val Pro Pro Asn Arg 420 425 430 Thr Ser Ser Pro Leu Ala Lys Thr 435 440 <210> 3 <211> 1712 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> CDS <222> (333)..(1565) <400> 3 cttgaagagt agcagcagca agcaagahaa ttaaagtggg ctatttbkka naagccattg 60 ttacmagara attaagaagc caagamacag gttattttct acttgagtya ggaaaagttg 120 gtttgcttta tttgtgggct ttttataatc ttttttccac aagggaaagt gggtattttc 180 ttgaaagtgg atttagactc tagtgggaat ctactaggag taaatttatt aattttttat 240 aaattaagca gaggaaggaa ggaaacagaa aacagaaagt aagacaaaaa accttggaat 300 tgttttagaa agccaaggtt ttcctgttca aa atg tct gtt gcc ttg tta tgg 353 Met Ser Val Ala Leu Leu Trp 1 5 gtt gtt tca cct tgt gaa gtc tca aat ggg aca gga ttc ttg gat tca 401 Val Val Ser Pro Cys Glu Val Ser Asn Gly Thr Gly Phe Leu Asp Ser 10 15 20 gtc cgg gag gga aac cgg gtt ttt gat tcg tcg agg cat agg aat tta 449 Val Arg Glu Gly Asn Arg Val Phe Asp Ser Ser Arg His Arg Asn Leu 25 30 35 gtg tgc aat gag aga aac aag aga ggt gtg aaa caa agg tgg aat ttt 497 Val Cys Asn Glu Arg Asn Lys Arg Gly Val Lys Gln Arg Trp Asn Phe 40 45 50 55 ggt tct gta agg tct gct atg gtg gct aca ccg gcg gga gaa atg gcg 545 Gly Ser Val Arg Ser Ala Met Val Ala Thr Pro Ala Gly Glu Met Ala 60 65 70 acg atg aca tca gaa cag atg gtt tat gat gtg gtt tta aaa caa gca 593 Thr Met Thr Ser Glu Gln Met Val Tyr Asp Val Val Leu Lys Gln Ala 75 80 85 gct tta gtg aag agg cag ttg aga tct gct gat gat tta gaa gtg aag 641 Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Arg Ser Ala Asp Asp Leu Glu Val Lys 90 95 100 ccg gag atc cct ctc ccc ggg aat ttg agc ttg ttg agt gaa gca tat 689 Pro Glu Ile Pro Leu Pro Gly Asn Leu Ser Leu Leu Ser Glu Ala Tyr 105 110 115 gat agg tgt agt gaa gta tgt gca gag tat gca aag aca ttt tac tth 737 Asp Arg Cys Ser Glu Val Cys Ala Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Xaa 120 125 130 135 gga acc atg yta atg act cca gag aga aga agg gct att tgg gca ata 785 Gly Thr Met Xaa Met Thr Pro Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile 140 145 150 tat gtg tgg tgc agg aga aca gat gaa ctt gtt gat ggc cca aac gca 833 Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala 155 160 165 tca cat att aca ccc caa gcc tta gat agg tgg gaa gac cgg ctt gaa 881 Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp Arg Trp Glu Asp Arg Leu Glu 170 175 180 gat gtt ttc agc ggg cga cca ttt gat atg ctc gat gct gct ttg tcc 929 Asp Val Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser 185 190 195 gat act gtt tcc aag ttt cca gtt gat att cag ccg ttc aga gat atg 977 Asp Thr Val Ser Lys Phe Pro Val Asp Ile Gln Pro Phe Arg Asp Met 200 205 210 215 att gaa gga atg cgt atg gac ttg agg aag tca aga tat aga aac ttt 1025 Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Arg Lys Ser Arg Tyr Arg Asn Phe 220 225 230 gat gag ctt tac ctc tat tgt tat tac gtt gct ggt acg gtt ggg ttg 1073 Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu 235 240 245 atg agt gtt cca att atg ggt att gca cct gat tca aag gca aca aca 1121 Met Ser Val Pro Ile Met Gly Ile Ala Pro Asp Ser Lys Ala Thr Thr 250 255 260 gag agc gta tat aat gca gct ttg gct tta gga atc gca aat caa cta 1169 Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu 265 270 275 acg aac ata ctc aga gat gtt gga gaa gat gcc aga aga gga aga gtc 1217 Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Val 280 285 290 295 tac tta cct caa gat gaa tta gca cag gca ggt ctc ttc gac gat gac 1265 Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln Ala Gly Leu Phe Asp Asp Asp 300 305 310 ata ttt gct gga aaa gtg act gat aag tgg aga agc ttt atg aag aag 1313 Ile Phe Ala Gly Lys Val Thr Asp Lys Trp Arg Ser Phe Met Lys Lys 315 320 325 caa atc cag agg gca aga aag ttc ttc gat gag gca gag gaa gga gtt 1361 Gln Ile Gln Arg Ala Arg Lys Phe Phe Asp Glu Ala Glu Glu Gly Val 330 335 340 aca caa ctg agc tca gct agc aga tgg cct gta tgg gca tct ttg ctg 1409 Thr Gln Leu Ser Ser Ala Ser Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu 345 350 355 ttg tac cgc caa ata ctg gac gag att gaa gcc aat gac tac aac aac 1457 Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn 360 365 370 375 ttc aca aag aga gct tat gtg agc aaa cca aag aag cta att tcc tta 1505 Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Ser Lys Pro Lys Lys Leu Ile Ser Leu 380 385 390 cct att gct tat gca aaa tct ctt gtg ccc cct aca aga act ctt gtc 1553 Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val Pro Pro Thr Arg Thr Leu Val 395 400 405 acc tct agc taa ggcatagaca tcagatttaa attaaagcaa gaaagcatat 1605 Thr Ser Ser 410 actgttaaaa aagaaagaat ttctaaagta gatattgttg tattgatgcc acttgtatat 1665 catcaaaagt aggtagtaaa atccaatata acaatctcta gtagttg 1712 <210> 4 <211> 410 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 4 Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Ser Pro Cys Glu Val Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Gly Phe Leu Asp Ser Val Arg Glu Gly Asn Arg Val Phe Asp 20 25 30 Ser Ser Arg His Arg Asn Leu Val Cys Asn Glu Arg Asn Lys Arg Gly 35 40 45 Val Lys Gln Arg Trp Asn Phe Gly Ser Val Arg Ser Ala Met Val Ala 50 55 60 Thr Pro Ala Gly Glu Met Ala Thr Met Thr Ser Glu Gln Met Val Tyr 65 70 75 80 Asp Val Val Leu Lys Gln Ala Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu Arg Ser 85 90 95 Ala Asp Asp Leu Glu Val Lys Pro Glu Ile Pro Leu Pro Gly Asn Leu 100 105 110 Ser Leu Leu Ser Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Ser Glu Val Cys Ala Glu 115 120 125 Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Xaa Gly Thr Met Xaa Met Thr Pro Glu Arg 130 135 140 Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr Asp Glu 145 150 155 160 Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Gln Ala Leu Asp 165 170 175 Arg Trp Glu Asp Arg Leu Glu Asp Val Phe Ser Gly Arg Pro Phe Asp 180 185 190 Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Lys Phe Pro Val Asp 195 200 205 Ile Gln Pro Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp Leu Arg 210 215 220 Lys Ser Arg Tyr Arg Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys Tyr Tyr 225 230 235 240 Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Ile Met Gly Ile Ala 245 250 255 Pro Asp Ser Lys Ala Thr Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala Leu Ala 260 265 270 Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val Gly Glu 275 280 285 Asp Ala Arg Arg Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ala Gln 290 295 300 Ala Gly Leu Phe Asp Asp Asp Ile Phe Ala Gly Lys Val Thr Asp Lys 305 310 315 320 Trp Arg Ser Phe Met Lys Lys Gln Ile Gln Arg Ala Arg Lys Phe Phe 325 330 335 Asp Glu Ala Glu Glu Gly Val Thr Gln Leu Ser Ser Ala Ser Arg Trp 340 345 350 Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp Glu Ile 355 360 365 Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val Ser Lys 370 375 380 Pro Lys Lys Leu Ile Ser Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser Leu Val 385 390 395 400 Pro Pro Thr Arg Thr Leu Val Thr Ser Ser 405 410 <210> 5 <211> 2205 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220> <221> CDS <222> (189)..(1955) <400> 5 ctggcatctt acatctgcca aatttctcat ttatagcatc tcctaatctt tagatacctt 60 ttcttcttgt tttgtttttc tatccttcac ttcatgcttt cttgttttac ccatctcttc 120 cattttcttg gcatttgaca acaaaaggtt ccattttttt tcctttttgc tgtatatagc 180 acaattca atg gct act tct tca gct tat ctt tgt tgt cct gca act tct 230 Met Ala Thr Ser Ser Ala Tyr Leu Cys Cys Pro Ala Thr Ser 1 5 10 gct act gga aag aaa cat att ttg cca aat ggg tca gct gga ttc ttg 278 Ala Thr Gly Lys Lys His Ile Leu Pro Asn Gly Ser Ala Gly Phe Leu 15 20 25 30 gtt ttc cgt ggt ccc cgt ttg tcc aac cgg ttt gtg acc cgg aag tca 326 Val Phe Arg Gly Pro Arg Leu Ser Asn Arg Phe Val Thr Arg Lys Ser 35 40 45 gtt att cgt gct gat ttg gac tcc atg gtc tct gat atg agt act aat 374 Val Ile Arg Ala Asp Leu Asp Ser Met Val Ser Asp Met Ser Thr Asn 50 55 60 gct cca aaa ggg cta ttt cca cct gaa cct gaa cat tat cgg ggg cca 422 Ala Pro Lys Gly Leu Phe Pro Pro Glu Pro Glu His Tyr Arg Gly Pro 65 70 75 aag ctg aaa gta gct att att gga gct ggg ctt gca ggc atg tca act 470 Lys Leu Lys Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ala Gly Met Ser Thr 80 85 90 gct gtg gag ctc ttg gat caa gga cat gag gtg gat ata tat gaa tca 518 Ala Val Glu Leu Leu Asp Gln Gly His Glu Val Asp Ile Tyr Glu Ser 95 100 105 110 agg cct ttt att ggt ggg aaa gtg gga tct ttt gtt gat aga cgt gga 566 Arg Pro Phe Ile Gly Gly Lys Val Gly Ser Phe Val Asp Arg Arg Gly 115 120 125 aac cac att gaa atg gga ctg cat gtg ttc ttt ggt tgc tat aat aat 614 Asn His Ile Glu Met Gly Leu His Val Phe Phe Gly Cys Tyr Asn Asn 130 135 140 ttg ttc cgt ttg tta aaa aag gtg ggt gct gaa aaa aat ctg cta gtg 662 Leu Phe Arg Leu Leu Lys Lys Val Gly Ala Glu Lys Asn Leu Leu Val 145 150 155 aag gac cat act cac aca ttt gta aat aaa ggg ggt gaa ata ggg gag 710 Lys Asp His Thr His Thr Phe Val Asn Lys Gly Gly Glu Ile Gly Glu 160 165 170 ctt gat ttc cgc ttt cca gtt gga gca ccc cta cac gga att aat gca 758 Leu Asp Phe Arg Phe Pro Val Gly Ala Pro Leu His Gly Ile Asn Ala 175 180 185 190 ttt ttg tct acc aat cag cta aag att tat gat aag gct aga aat gct 806 Phe Leu Ser Thr Asn Gln Leu Lys Ile Tyr Asp Lys Ala Arg Asn Ala 195 200 205 gta gct ctt gcc ctt agt cca gtg gtg cgg gct tta gtt gat cca gat 854 Val Ala Leu Ala Leu Ser Pro Val Val Arg Ala Leu Val Asp Pro Asp 210 215 220 ggc gcg ttg cag cag ata cgt gat cta gat agt gta agc ttt tca gag 902 Gly Ala Leu Gln Gln Ile Arg Asp Leu Asp Ser Val Ser Phe Ser Glu 225 230 235 tgg ttt atg tct aaa ggt ggg acg cgt gct agc atc cag agg atg tgg 950 Trp Phe Met Ser Lys Gly Gly Thr Arg Ala Ser Ile Gln Arg Met Trp 240 245 250 gat cct gtc gca tat gct ctt gga ttc att gac tgt gac aat atc agt 998 Asp Pro Val Ala Tyr Ala Leu Gly Phe Ile Asp Cys Asp Asn Ile Ser 255 260 265 270 gct cgg tgt atg ctc act ata ttt gca tta ttt gcc act aaa acg gag 1046 Ala Arg Cys Met Leu Thr Ile Phe Ala Leu Phe Ala Thr Lys Thr Glu 275 280 285 gct tcc cta tta cgc atg ctt aaa ggt tct ccg gac gtt tat ttg agt 1094 Ala Ser Leu Leu Arg Met Leu Lys Gly Ser Pro Asp Val Tyr Leu Ser 290 295 300 ggt cca att aag aag tac atc ttg gat aag ggg gga agg ttt cac atg 1142 Gly Pro Ile Lys Lys Tyr Ile Leu Asp Lys Gly Gly Arg Phe His Met 305 310 315 agg tgg ggg tgc aga cag gta ctc tat gag aca tcc tct gat ggc agt 1190 Arg Trp Gly Cys Arg Gln Val Leu Tyr Glu Thr Ser Ser Asp Gly Ser 320 325 330 atg tat gtc agc ggg ctt gcc atg tca aag gcc act cag aag aaa gtt 1238 Met Tyr Val Ser Gly Leu Ala Met Ser Lys Ala Thr Gln Lys Lys Val 335 340 345 350 gta aaa gct gat gcc tat gtc gct gca tgt gat gtc cct gga att aaa 1286 Val Lys Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ala Cys Asp Val Pro Gly Ile Lys 355 360 365 cga ttg gta cct cag aag tgg agg gaa ttg gaa ttc ttt gac aac att 1334 Arg Leu Val Pro Gln Lys Trp Arg Glu Leu Glu Phe Phe Asp Asn Ile 370 375 380 tac aaa ttg gtt gga gtg cct gtt gtt acg gta caa cta cga tac aat 1382 Tyr Lys Leu Val Gly Val Pro Val Val Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn 385 390 395 ggc tgg gtt aca gag ttg cag gac ttg gag cgt tcg agg caa ttg aag 1430 Gly Trp Val Thr Glu Leu Gln Asp Leu Glu Arg Ser Arg Gln Leu Lys 400 405 410 cgc gct aca ggt ttg gac aat ctc ctg tat aca cca gat gca gat ttc 1478 Arg Ala Thr Gly Leu Asp Asn Leu Leu Tyr Thr Pro Asp Ala Asp Phe 415 420 425 430 tct tgc ttt gcg gac ctt gca ttg gca tct cct gaa gat tat tac att 1526 Ser Cys Phe Ala Asp Leu Ala Leu Ala Ser Pro Glu Asp Tyr Tyr Ile 435 440 445 gag ggc caa ggc tca ttg ctt caa tgt gtc ctt aca cct ggt gac cct 1574 Glu Gly Gln Gly Ser Leu Leu Gln Cys Val Leu Thr Pro Gly Asp Pro 450 455 460 tac atg cct cta cta aat gat gaa atc ata aaa aga gtg tca aag cag 1622 Tyr Met Pro Leu Leu Asn Asp Glu Ile Ile Lys Arg Val Ser Lys Gln 465 470 475 gtt ttg gca cta ttt cct tct tcc caa ggt ctt gag gtt acc tgg tca 1670 Val Leu Ala Leu Phe Pro Ser Ser Gln Gly Leu Glu Val Thr Trp Ser 480 485 490 tca gtt gtg aaa att ggg caa tcc cta tat cgt gaa gga cct ggt aaa 1718 Ser Val Val Lys Ile Gly Gln Ser Leu Tyr Arg Glu Gly Pro Gly Lys 495 500 505 510 gac cca ttc aga cct gat cag aag act cca gtg gaa aat ttc ttt ctt 1766 Asp Pro Phe Arg Pro Asp Gln Lys Thr Pro Val Glu Asn Phe Phe Leu 515 520 525 gct ggc tca tat aca aaa cag gac tac ata gat agc atg gaa ggg gca 1814 Ala Gly Ser Tyr Thr Lys Gln Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala 530 535 540 act ctt tca ggt agg caa gca tct gca tac gta tgt gat gct ggc gag 1862 Thr Leu Ser Gly Arg Gln Ala Ser Ala Tyr Val Cys Asp Ala Gly Glu 545 550 555 aag ctg gtg gtg ttg cgg aaa aag att gct gct gct gag tca aac gag 1910 Lys Leu Val Val Leu Arg Lys Lys Ile Ala Ala Ala Glu Ser Asn Glu 560 565 570 atc tct gaa ggt gta tca gta tct gat gag ttg agt ctt gtc tga 1955 Ile Ser Glu Gly Val Ser Val Ser Asp Glu Leu Ser Leu Val 575 580 585 tgactggaaa tcatccaatg aatactgaag agcacccccc actttgttaa tccgagaagc 2015 agatacaaac ataactcagt taggcattgc gtaaggaaga gttcttctaa attttgagtt 2075 cacaagatgg aaatcaaaag gttaaaatat gttgtatgta atattagtaa atcttcatag 2135 tgatgtatct attctgccac ccttcaggtt tagtgaaatg gatcgtattg ctcatcattc 2195 attgagaaga 2205 <210> 6 <211> 588 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 6 Met Ala Thr Ser Ser Ala Tyr Leu Cys Cys Pro Ala Thr Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gly Lys Lys His Ile Leu Pro Asn Gly Ser Ala Gly Phe Leu Val Phe 20 25 30 Arg Gly Pro Arg Leu Ser Asn Arg Phe Val Thr Arg Lys Ser Val Ile 35 40 45 Arg Ala Asp Leu Asp Ser Met Val Ser Asp Met Ser Thr Asn Ala Pro 50 55 60 Lys Gly Leu Phe Pro Pro Glu Pro Glu His Tyr Arg Gly Pro Lys Leu 65 70 75 80 Lys Val Ala Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ala Gly Met Ser Thr Ala Val 85 90 95 Glu Leu Leu Asp Gln Gly His Glu Val Asp Ile Tyr Glu Ser Arg Pro 100 105 110 Phe Ile Gly Gly Lys Val Gly Ser Phe Val Asp Arg Arg Gly Asn His 115 120 125 Ile Glu Met Gly Leu His Val Phe Phe Gly Cys Tyr Asn Asn Leu Phe 130 135 140 Arg Leu Leu Lys Lys Val Gly Ala Glu Lys Asn Leu Leu Val Lys Asp 145 150 155 160 His Thr His Thr Phe Val Asn Lys Gly Gly Glu Ile Gly Glu Leu Asp 165 170 175 Phe Arg Phe Pro Val Gly Ala Pro Leu His Gly Ile Asn Ala Phe Leu 180 185 190 Ser Thr Asn Gln Leu Lys Ile Tyr Asp Lys Ala Arg Asn Ala Val Ala 195 200 205 Leu Ala Leu Ser Pro Val Val Arg Ala Leu Val Asp Pro Asp Gly Ala 210 215 220 Leu Gln Gln Ile Arg Asp Leu Asp Ser Val Ser Phe Ser Glu Trp Phe 225 230 235 240 Met Ser Lys Gly Gly Thr Arg Ala Ser Ile Gln Arg Met Trp Asp Pro 245 250 255 Val Ala Tyr Ala Leu Gly Phe Ile Asp Cys Asp Asn Ile Ser Ala Arg 260 265 270 Cys Met Leu Thr Ile Phe Ala Leu Phe Ala Thr Lys Thr Glu Ala Ser 275 280 285 Leu Leu Arg Met Leu Lys Gly Ser Pro Asp Val Tyr Leu Ser Gly Pro 290 295 300 Ile Lys Lys Tyr Ile Leu Asp Lys Gly Gly Arg Phe His Met Arg Trp 305 310 315 320 Gly Cys Arg Gln Val Leu Tyr Glu Thr Ser Ser Asp Gly Ser Met Tyr 325 330 335 Val Ser Gly Leu Ala Met Ser Lys Ala Thr Gln Lys Lys Val Val Lys 340 345 350 Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ala Cys Asp Val Pro Gly Ile Lys Arg Leu 355 360 365 Val Pro Gln Lys Trp Arg Glu Leu Glu Phe Phe Asp Asn Ile Tyr Lys 370 375 380 Leu Val Gly Val Pro Val Val Thr Val Gln Leu Arg Tyr Asn Gly Trp 385 390 395 400 Val Thr Glu Leu Gln Asp Leu Glu Arg Ser Arg Gln Leu Lys Arg Ala 405 410 415 Thr Gly Leu Asp Asn Leu Leu Tyr Thr Pro Asp Ala Asp Phe Ser Cys 420 425 430 Phe Ala Asp Leu Ala Leu Ala Ser Pro Glu Asp Tyr Tyr Ile Glu Gly 435 440 445 Gln Gly Ser Leu Leu Gln Cys Val Leu Thr Pro Gly Asp Pro Tyr Met 450 455 460 Pro Leu Leu Asn Asp Glu Ile Ile Lys Arg Val Ser Lys Gln Val Leu 465 470 475 480 Ala Leu Phe Pro Ser Ser Gln Gly Leu Glu Val Thr Trp Ser Ser Val 485 490 495 Val Lys Ile Gly Gln Ser Leu Tyr Arg Glu Gly Pro Gly Lys Asp Pro 500 505 510 Phe Arg Pro Asp Gln Lys Thr Pro Val Glu Asn Phe Phe Leu Ala Gly 515 520 525 Ser Tyr Thr Lys Gln Asp Tyr Ile Asp Ser Met Glu Gly Ala Thr Leu 530 535 540 Ser Gly Arg Gln Ala Ser Ala Tyr Val Cys Asp Ala Gly Glu Lys Leu 545 550 555 560 Val Val Leu Arg Lys Lys Ile Ala Ala Ala Glu Ser Asn Glu Ile Ser 565 570 575 Glu Gly Val Ser Val Ser Asp Glu Leu Ser Leu Val 580 585 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 7 aacccgggat agcacgattc aatg 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 8 aacccgggat ttccagtcat cagac 25 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 9 ttcccgggct cagtaaaatg cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 10 tacccgggct aaactacgct tgc 23

【図面の簡単な説明】

【図１】植物の色素体におけるカロチノイドの生合成経
路を示す；略語：ＰＳＹ：フィトエン合成酵素；ＰＤ
Ｓ：フィトエンデサチュラーゼ；ＺＤＳ：ζ−カロチン
デサチュラーゼ；ＬＣＹ：リコペンβ−シクラーゼ。

【図２】トランスジェニックカルスにおける転写物の蓄
積のチェックをするため電気泳動図に代わる写真であ
る：再生された苗条の移植後に、１回の形質転換の残存
するカルスを合わせた。これらのカルス混合物からｍＲ
ＮＡを調製した。各場合において、サンプルスキームに
示されるとおり、約５００ｎｇのｍＲＮＡをニトロセル
ロース膜上にブロッティングした。各場合において、膜
の１枚を４種の異なる遺伝子の放射活性のプローブとハ
イブリダイズさせた。４週齢のタバコ実生および４週齢
のイネ実生のｍＲＮＡを対照として使用した。略語：Ｐ
ｐ：プロトプラスト、Ｋ３０．４Ｍ：Ｋ３０．４Ｍ
培地、ＫＰＳ：ＫＰＳ培地。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｂ０６５ 9/02 1/26 ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/26 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:19 33/53 1:91 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:645 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/02 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者リユデイガー・ハインドイツ40764ランゲンフエルト・タルシユトラーセ53アーＦターム(参考） 2B030 AB03 AD08 CA17 CA19 CB02 CD12 CD13 CD17 2G045 AA40 BB20 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 FB04 FB07 4B024 AA01 AA11 BA08 CA04 DA01 DA02 DA06 DA12 EA04 EA05 GA11 HA12 HA15 4B050 CC03 DD09 LL03 4B063 QA19 QA20 QQ06 QQ09 QQ22 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 4B065 AA26X AA72X AA89X AA89Y AA90X AB01 BA02 CA28 4H045 AA11 AA30 CA30 DA75 EA50 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号６のアミノ酸配列を含んで成
る、ζ−カロチンデサチュラーゼの生物活性をもつタバ
コからのポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２】それらが配列番号６のアミノ酸配列をも
つポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項
１に記載の核酸。
【請求項３】それらが一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ
もしくはＲＮＡであることを特徴とする、請求項１もし
くは２に記載の核酸。
【請求項４】それらがゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ
のフラグメントであることを特徴とする、請求項３に記
載の核酸。
【請求項５】それらがタバコ植物由来であることを特
徴とする、請求項１ないし４の１つに記載の核酸。
【請求項６】（ａ）配列番号５の配列、（ｂ）配列番号
６のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードす
る配列、（ｃ）長さが最低１４塩基対である、（ａ）も
しくは（ｂ）で定義される配列の部分配列、（ｄ）
（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）で定義される配列とハイ
ブリダイズする配列、（ｅ）（ａ）、（ｂ）もしくは
（ｃ）で定義される配列に相補的である配列、および
（ｆ）遺伝暗号の縮重により（ａ）ないし（ｃ）で定義
される配列と同一のアミノ酸配列をコードする配列のな
かから選択される配列を含んで成る、請求項１ないし５
の１つに記載の核酸。
【請求項７】植物細胞、とりわけタバコ植物におい
て、請求項１ないし６の１つに記載の核酸の転写を天然
に制御する調節領域。
【請求項８】配列番号１ないし６の１つに記載の核酸
および異種プロモーターを含んで成るＤＮＡ構築物。
【請求項９】請求項１ないし６の１つに記載の核酸、
請求項７に記載の調節領域、もしくは請求項８に記載の
ＤＮＡ構築物を含んで成るベクター。
【請求項１０】核酸が、原核生物もしくは真核生物の
細胞における核酸の発現を確実にする調節配列に機能的
に連結されていることを特徴とする、請求項９に記載の
ベクター。
【請求項１１】請求項１ないし６の１つに記載の核
酸、請求項８に記載のＤＮＡ構築物、または請求項９も
しくは１０に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１２】それが原核生物細胞、とりわけ大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする、請求項１１
に記載の宿主細胞。
【請求項１３】それが真核生物細胞、とりわけ酵母細
胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞もしくは植物細胞であるこ
とを特徴とする、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１４】配列番号２もしくは配列番号４のアミ
ノ酸配列を含んで成る、配列番号１もしくは配列番号３
の核酸によりコードされるフィトエン合成酵素の生物活
性をもつポリペプチド。
【請求項１５】請求項１ないし６の１つに記載の核酸
によりコードされる、ζ−カロチンデサチュラーゼの生
物活性をもつポリペプチド。
【請求項１６】請求項１４のポリペプチドに特異的に
結合する抗体。
【請求項１７】請求項１５のポリペプチドに特異的に
結合する抗体。
【請求項１８】以下の段階、すなわち（ａ）それ自体
既知の様式で実施される完全な化学合成、または（ｂ）
オリゴヌクレオチドの化学合成、該オリゴヌクレオチド
の標識、植物細胞のゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡから
出発して生成させたゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリ
ーのＤＮＡとの該オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーション、陽性クローンの選択、および陽性クローンか
らのハイブリダイズするＤＮＡの単離、または（ｃ）オ
リゴヌクレオチドの化学合成およびＰＣＲによる標的Ｄ
ＮＡの増幅を含んで成る、請求項１ないし６の１つに記
載の核酸の生成方法。
【請求項１９】（ａ）請求項１ないし６の１つに記載の
核酸の発現を確実にする条件下で請求項１１ないし１３
の１つに記載の宿主細胞を培養すること、または（ｂ）
請求項１ないし６の１つに記載の核酸をインビトロ系で
発現すること、および（ｃ）細胞、培地もしくはインビ
トロ系からポリペプチドを得ることを含んで成る、請求
項１４もしくは１５に記載のポリペプチドの生成方法。
【請求項２０】以下の段階、すなわち（ａ）請求項１
１ないし１３の１つに記載の宿主細胞、請求項１４もし
くは１５に記載のポリペプチド、またはフィトエンデサ
チュラーゼの生物活性をもつポリペプチドを、該ポリペ
プチドと化合物の相互作用を可能にする条件下で化合物
もしくは化合物の混合物と接触させること、および
（ｂ）ポリペプチドに特異的に結合する化合物を決定す
ることを含んで成る、請求項１４および／もしくは１５
に記載のポリペプチド、またはフィトエンデサチュラー
ゼの生物活性をもつポリペプチドに結合する化合物を見
出す方法。
【請求項２１】以下の段階、すなわち（ａ）請求項１
１ないし１３の１つに記載の宿主細胞を化合物もしくは
化合物の混合物と接触させること、（ｂ）ポリペプチド
濃度を測定すること、および（ｃ）該ポリペプチドの発
現に特異的に影響する化合物を決定することを含んで成
る、請求項１４もしくは１５に記載のポリペプチドまた
はフィトエンデサチュラーゼの生物活性をもつポリペプ
チドの発現を改変する化合物を見出す方法。
【請求項２２】新たな除草性有効成分を見出すため
の、請求項１ないし６の１つに記載の核酸、請求項８に
記載のＤＮＡ構築物、請求項９もしくは１０に記載のベ
クター、請求項１１ないし１３の１つに記載の宿主細
胞、請求項１４もしくは１５に記載のポリペプチド、ま
たはフィトエンデサチュラーゼの生物活性をもつポリペ
プチド、あるいは請求項１６もしくは１７に記載の抗体
の使用。
【請求項２３】植物の成長の調節物質もしくは除草剤
としての、請求項１４もしくは１５に記載のポリペプチ
ド、またはフィトエンデサチュラーゼの生物活性をもつ
ポリペプチドの調節物質の使用。
【請求項２４】トランスジェニック植物を生成するた
めの、請求項１ないし６の１つに記載の核酸、請求項８
に記載のＤＮＡ構築物、または請求項９もしくは１０に
記載のベクターの使用。
【請求項２５】請求項１６もしくは１７に記載のポリ
ペプチドの細胞内濃度が、請求項１ないし６の１つに記
載の核酸、請求項８に記載のＤＮＡ構築物、もしくは請
求項９に記載のベクターを導入した後に対応する野性型
細胞に比較して増大もしくは減少されていることを特徴
とするトランスジェニック植物、植物の部分、プロトプ
ラスト、植物組織もしくは植物繁殖材料。
【請求項２６】対応する内在性ポリペプチドに比較し
てその生物活性もしくは発現パターンが改変されている
請求項１４もしくは１５に記載のポリペプチドを含有す
ることを特徴とする植物、植物の部分、プロトプラス
ト、植物組織もしくは植物繁殖材料。
【請求項２７】請求項１ないし６の１つに記載の核
酸、もしくは請求項７に記載の調節領域が内在性突然変
異誘発により改変されていることを特徴とする、請求項
２５に記載の植物、植物の部分、プロトプラスト、植物
組織もしくは植物繁殖材料の生成方法。