JP2009506776A - コーヒー中のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

コーヒー中のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路の酵素をコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

コーヒー植物中のカロテノイド及びアポカロテノイドの生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを開示する。コーヒーカロテノイド遺伝子由来のプロモーター配列、並びにこれらのポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びプロモーター配列を、コーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の遺伝子制御及び操作とともに、コーヒー植物の光合成の操作に使用する方法も開示する。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明
（発明の分野）
本発明は、農業バイオテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、カロテノイド及びアポカロテノイド合成に関与する酵素をコードするコーヒー植物由来のポリヌクレオチド、コーヒーカロテノイド遺伝子由来のプロモーター配列、並びにこれらのポリヌクレオチド、ポリペプチド、及びプロモーターを、コーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の遺伝子制御及び操作に使用する方法を特徴とする。
（発明の背景）
特許、公開された出願及び学術論文を含めた様々な刊行物が本明細書全体にわたって引用されている。これらの各刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書内で完全には示されていない引用文献は、本明細書の末尾に認めることができる。
コーヒーの芳香及び風味は、コーヒーの品種及び銘柄に関する消費者の好みにおいて重要な構成要素である。コーヒーの特徴的な芳香及び風味は、豆を焙煎する間に起こる、風味前駆体が関与する複雑な一連の化学反応（メイラード反応）に由来する。風味前駆体には、緑色コーヒー豆中に存在する化合物及び生体分子がある。今までに、８００を超える化学物質及び生体分子がコーヒーの風味及び芳香に寄与するものとして同定されている。（Ｆｌａｍｅｎｔ，Ｉ．，２００２「Ｃｏｆｆｅｅ Ｆｌａｖｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｋ．）コーヒー消費者はますます洗練されてきているので、消費者の好みに合うように芳香及び風味が向上したコーヒーを生産することが望ましい。芳香も風味も、化学的手段によりコーヒー製品に人工的に入れることができる。例えば、米国特許第４，０７２，７６１号明細書（芳香）及び米国特許第３，９６２，３２１号明細書（風味）を参照されたい。しかし、コーヒーの芳香及び風味に対する多糖類、タンパク質、色素や脂質などの天然のコーヒー粒の構成要素の影響に関係する情報が今までに少ししかない。１つの手法は、優れた芳香の特徴を有する既存の生殖質から品種を選択することである。この手法の不利な点は、頻繁に、最高品質の品種が、産出不良や疾患及び環境ストレスに対する低抵抗性などの著しい負の農学的形質をも有することである。産業的農学的形質が異なる品種を交配し、高い品質と良好な農学的成績の両方についてその子孫をスクリーニングする育種の試みから新たな品種を選択することも可能である。しかし、この後者の手法は非常に時間がかかり、１回の交配実験及び３回の生育期にわたる選択に最低限７〜８年かかる。したがって、コーヒーの品質を高める代替の手法は、分子生物学の技術を使用して、コーヒー豆中で天然に認められる風味及び芳香に関与するそれらのエレメントを増強し、又はコーヒー豆中で天然には存在しない芳香及び風味を増強するエレメントを添加することとなる。遺伝子工学は、これらの目的の達成に特に適する。例えば、異なるコーヒー種由来のコーヒータンパク質を交換することができる。代替の方法では、コーヒーの風味に正に寄与する、天然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を増強することができる。逆に、コーヒーの風味に負に寄与する、天然に存在するコーヒータンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制することができる。
異なる品種及び起源由来のコーヒーは、同じように緑色粒試料を焙煎し加工したときに著しい風味及び芳香の品質の差異を示す。品質の違いは、粒試料内での化学的物理的差異の現れであり、それは主として生育及び加工条件の違いから生じ、母系植物と粒両方の遺伝的背景の違いからも生じる。化学組成のレベルでは、少なくとも一部の風味の品質は、異なる品種由来の粒と関係することが認められている糖、酸、フェノール類やカフェインなどの少量の代謝物のレベルの差異と関係し得る。不十分に特徴付けられている他の風味及び風味前駆分子が存在することが認められている。さらに、粒内の構造的差異もコーヒーの品質の違いに寄与する可能性が高い。コーヒーの品質につながるコーヒー粒中の新たな構成要素を見つける１つの手法は、異なる品質の特徴を有する異なる品種において粒試料の成熟の間に差次的に発現する遺伝子及びタンパク質を研究することである。同様に、風味及び風味前駆分子の生合成に関与する遺伝子及びタンパク質を研究することができる。
カロテノイドは、風味及び風味前駆分子の候補の１クラスである。カロテノイドは、すべての植物、並びに広範な藻類、特定の真菌及び細菌中で同定されている（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。その炭素４０個の構造は特定の特性を付与し、それによって約４００〜５００ｎｍの光を吸収することが可能となる。カロテノイドは親油性であり、このことは、その呈色とともに、カロテノイドを酸化的分解に感受性にする特徴となる（Ｂｒｉｔｔｏｎ，１９８８）。カロテノイドは自然界で最も大きな群の色素に相当し、約６００種の異なるカロテノイドが今までに同定されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｇｒａｎｔ，１９９８）。実際、カロテノイドに由来するアポカロテノイドは、自然界で最も大きなクラスの分子の１つを構成すると考えられる。一部のアポカロテノイドは、食用植物中の色、風味、及び芳香の不可欠及び有益な構成成分である（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｒｏｕｓｅｆｆ，２００２）。
植物では、カロテノイド色素は色素体中で合成される。生合成経路は細胞の色素体区画中の膜上で行われ、対応する遺伝子は核中に位置する。葉緑体では、カロテノイドは、集光性複合体と結合して、主として光合成膜中に蓄積する。成熟果実及び花弁の有色体並びに老化した葉の葉緑体では、カロテノイドは、膜又はプラスト顆粒などの油体、或いは間質内の他の構造中に認めることができる。
第１の真のカロテノイドは、ゲラニルゲラニル二リン酸２分子が濃縮してフィトエンとなることによって形成される（図１Ａ）。この反応は、酵素フィトエンシンターゼ（ゲラニルゲラニル二リン酸ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＰＳＹ；ＥＣ２．５．１．３２）によって媒介される。可視波長で光を吸収できないため真の色素でないフィトエンは、４つの連続した不飽和化ステップを経る。最初の２つのステップは、酵素フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ；ＥＣ１．３．９９）によって実施され、その結果、中間体フィトフルエンを介してζ−カロテン（図１Ｂ）が形成される（Ｂａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕｇｕｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。２番目の２つのステップは、酵素ζ−カロテンデサチュラーゼ（ＺＤＳ；ＥＣ１．１４．９９．３０）によって媒介されて、中間体ニューロスポレンを介してリコペン（図１Ｃ）が形成する（Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらの不飽和化ステップは、補因子として色素体ターミナルオキシダーゼ（ＰＴＯＸ）の存在を必要とする（Ｃａｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｊｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｊｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００３；総説についてはＫｕｎｔｚ， ２００４を参照されたい）。
ＰＤＳ及びＺＤＳから、赤色トマト中で認められる主要な色素であるリコペン（図１Ｃ）が得られる。リコペンは、２つの環化反応を介してα−カロテンとβ−カロテンの両方を形成するための基質として働く。β−カロテン（β，β−カロテン）（図１Ｄ）は、酵素リコペンβ−シクラーゼ（ＬβＣＹ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）によって形成され、その酵素は、炭素鎖の末端に２つのβ−環構造を導入する。この反応によって、１つのβ−環、及びプサイ（Ψ）と称する１つの非環化末端を含有する中間体γ−カロテン（β，Ψ−カロテン）も形成される。アルファ−カロテン（β，ε−カロテン）（図１Ｅ）は、酵素リコペンε−シクラーゼ（ＬεＣＹ；Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）及びＬβＣＹによって形成され、それらの酵素は、１つのε−環及び１つのβ−環をそれぞれ導入する。ＬεＣＹの活性によって、１つのε−環及び１つの非環化プサイ末端を有する中間体δ−カロテン（ε，Ψ−カロテン）も形成される。ラクツカサリバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｌｉｖａ）（レタス）などの植物では、ＬεＣＹは炭素鎖の末端に２つのε−環構造を導入し、その結果、ε−カロテン（ε，ε−カロテン；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｇａｎｔｔ ２００１）（図１Ｆ）が形成される。
２つの連続したヒドロキシル化ステップによって酸素化カロテノイドが形成される。β−カロテン（β，β−カロテン）が、酵素β−カロテンヒドロキシラーゼ（βＣＨＹ；ＥＣ１．１４．１３−；Ｓａｎｄｍａｎｎ．，１９９４）の作用によって最初にクリプトキサンチンに、次いでゼアキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン）（図１Ｇ）に転換される。アルファ−カロテン（β，ε−カロテン）もまた二度ヒドロキシル化される；最初にβ−環がβＣＨＹによりヒドロキシル化されて中間体ジエノキサンチン（図１Ｍ）を形成し、次いでε−環がε−カロテンヒドロキシラーゼ（εＣＨＹ）によってヒドロキシル化されてルテイン（ジヒドロキシ−β，ε−カロテン）（図１Ｈ）を形成する。つい最近εＣＨＹがクローン化され（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｉａｎ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ，２００４；総説についてはＩｎｏｕｅ，２００４を参照されたい）、ルテイン欠損突然変異体（ｌｕｔ１）が特徴付けられた（Ｐｏｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｉａｎ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ，２００１）。
ゼアキサンチンのヒドロキシル化β−環を２ステップでエポキシ化して、アンテラキサンチン（図１Ｊ）及びビオラキサンチン（図１Ｋ）を得る。この反応は、酵素ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ；Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）によって触媒される。光ストレス中に、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）の活性によりビオラキサンチンを転換してアンテラキサンチン及びゼアキサンチンに戻すことができる。ＺＥＰ及びＶＤＥはキサントフィルサイクルに関与し、そのサイクルは、環境上の光の条件の変化に対する色素体の適応に関係する（総説については、Ｈｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００を参照されたい）。
高等植物における他のカロテノイドはネオキサンチン（図１Ｌ）である。ネオキサンチンは、ネオキサンチンシンターゼ（ＮＹＳ）によって触媒される反応によってビオラキサンチンから合成される。ＮＹＳは、トマト及びジャガイモから最初にクローン化された（Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ａｌ−Ｂａｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
上記に記載のカロテノイド基質はすべて、多様な揮発性及び不揮発性アポカロテノイドを形成する酸化的開裂と酵素的開裂の両方に利用可能である。テルペノイド風味揮発性化合物は、一般に比較的低レベルで植物中に存在するが、例えば、トマト（Ｂｕｔｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９７１及び１９８７；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１及び２０００）、ニンジン（Ｋｊｅｌｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）、マルメロ（Ｌｕｔｚ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ，１９９２）、及びゴレンシ（Ａｖｅｒｒｈｏａ ｃａｒａｍｂｏｌａ）（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｅｒ，１９９５）における風味の全体的なヒトの評価に対して強い影響を有する。より重要なカロテノイド由来揮発性化合物には、β−イオノン、α−イオノン、ゲラニルアセトン（６，１０−ジメチル−５，９−ウンデカジエン−２−オン）、プソイドイオノン（６，１０−ジメチル−３，５，９−ウンデカジエン−２−オン）及びβ−ダマセノンがある。アルファ−イオノン、β−イオノン、β−シクロシトラール、及びβ−ダマセノンは、バレンシアオレンジジュースの芳香強度全体の約８％、及び花の芳香の種類全体の７８％に寄与することが示されている（Ｍａｈａｔｔａｎａｔａｗｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。β−ダマセノンはまた、グレープフルーツジュースの芳香にも寄与する（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
熟したトマト果実からのβ−イオノン及びゲラニルアセトン放出のピークレベルは、それぞれ１．２５ｐｇ／ｇ ｆｗ−１ｈｒ−１及び４０ｐｇ／ｇ ｆｗ−１ｈｒ−１であると計算された。１０，０００倍高いレベルで検出されているシス−３−ヘキセナールやヘキセナールなどの他のより豊富な揮発性物質と比較したときβ−イオノン及びゲラニルアセトンは低濃度で認められるが、β−イオノン及びゲラニルアセトンはそれぞれ０．００７ｎＬ／Ｌ−１及び６０ｎＬ／Ｌ−１の臭気の閾値を有する（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これらの臭気の閾値は、他のより豊富な揮発性物質の多くで観察されるものより著しく低い。したがって、カロテノイド由来揮発性物質は、低濃度で芳香及び風味に大きな影響を及ぼす潜在性を有する。β−イオノンは、トマト果実の風味に対する２番目に重要な揮発性寄与物質であると考えられる（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
アポカロテノイドが形成される生合成経路は依然としてはっきりしていない。その化学構造及び異常なカロテノイド蓄積を伴うトマト品種中の揮発性物質産生の研究に基づいて、Ｂｕｔｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９８８）は、これらの化合物が酸化的カロテノイド開裂に由来する可能性が高いと予測した。近年、様々な二重結合でカロテノイド基質を開裂するカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ）のファミリーが同定されている（総説についてはＢｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照されたい）。同定されたファミリーの最初の構成要素は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＶＰ１４という、ザントキシン（図１Ｎ）の合成に関与する９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼであり、それは、植物ホルモンのアブシジン酸（ＡＢＡ；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）の前駆体である。ＡＢＡは、コーヒー種子の発芽中の、胚成長の潜在性及び胚乳キャップ弱化を調節する（ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで複数のカロテノイド基質の９，１０（９’，１０’）二重結合を対称的に開裂してＣ１４ジアルデヒド及び２つのＣ１３シクロヘキソン誘導体にするシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼのＡｔＣＣＤ１を含めて、ジオキシゲナーゼファミリーの他の構成要素が同定されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。ＡｔＣＣＤ１の相同分子種が、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００１）、唐辛子（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）（Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ）、サフラン（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ）及びペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）（Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）を含めた様々な種で見つかっている。最近になって、Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４ｂ）は、トランスジェニックトマト植物において、ＣＣＤ１酵素がｉｎ ｖｉｖｏで様々なＣ１３シクロヘキソンの形成に関与することを示した。これらの揮発性物質とそのカロテノイド前駆体との潜在的な関係を図２に示す。９，１０（９’，１０”）結合で開裂されたカロテノイドにより、対応するアポカロテノイドが形成される。ＣＣＤ１酵素が９，１０（９’，１０”）開裂特異性を有するので、存在するカロテノイド前駆体に基づいて特定の産物が得られる。ＡｔＣＣＤ１及びそのトマト相同分子種は、ゲラニルアセトン及びα−イオノン（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ及び２００４ｂ）、並びにおそらくはβ−ダマセノン（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）の形成に関与する。Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）及びＳｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４ｂ）は、ＣＣＤ１がいくつかの他の重要なカロテノイド由来揮発性物質を形成することもできることを示した。
Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００１）及びＳｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４ｂ）は、組換えＡｔＣＣＤ１及びＬｅＣＣＤ１Ａ酵素をそれぞれ精製し、複数のカロテノイド基質についてｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイを行った。薄層クロマトグラフィー及びＨＰＬＣによってそのアッセイ産物を特徴付けた。β−カロテン、ゼアキサンチン、ルテイン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンを含有するアッセイでは、中心Ｃ１４ジアルデヒド開裂産物（４，９−ジメチルドデカ−２，４，６，８，１０−ペンタエン−１，１２−ジアール；Ｉ）が、９，１０及び９’，１０’位での対称的開裂から得られる主要な化合物であった（図２を参照）。β−カロテン、ゼアキサンチン及びリコペンを含有するアッセイでは、β−イオノン（９−アポ−β−カロテン−９−オン；ＩＩ）、３−ヒドロキシ−β−イオノン（３−ヒドロキシ−９−アポ−β−カロテン−９−オン；ＩＩＩ）及びプソイドイオノン（Ｖ）がそれぞれ形成されたが、α−カロテンからβ−イオノン（ＩＩ）とα−イオノン（ＶＩ）がどちらも産生され、その一方で、δ−カロテンからα−イオノン（９−アポ−α−カロテン−９−オン；ＶＩ）及びプソイドイオノン（６，１０−ジメチル−３，５，９−ウンデカトリエン−２−オン；Ｖ）が産生された。ビオラキサンチン又はネオキサンチンを含有するアッセイでは、５’６−エポキシ−３−ヒドロキシ−β−イオノン（５，６−エポキシ−３−ヒドロキシ−９−アポ−β−カロテン−９−オン；ＩＶ）が形成された。非対称開裂でも、これらの基質を用いてＣ２７エポキシアポカロテナールが形成された。フィトエン及びζ−カロテンを含めたいくつかの直鎖型カロテノイドは、トマト果実における重要な風味揮発性物質であるゲラニルアセトン（６，１０−ジメチル−５，９−ウンデカトリエン−２−オン；ＶＩＩ）の前駆体、及び第２のＣ１４ジアルデヒド（４，９−ジメチルドデカ−４，６，８−トリエンジアール；ＸＩ）の前駆体であると考えられる。
ネオキサンチンを含有するアッセイでは、非対称的開裂でも、Ｃ２７アレンアポカロテナール及びＣ１３グラスホッパーケトン（３，５−ジヒドロキシ−６，７−ジデヒドロ−９−アポ−β−カロテン−９−オン；ＶＩＩＩ）が形成された（図３ａを参照）。グラスホッパーケトンは、β−ダマセノン（ＩＸ）及び３−ヒドロキシ−β−ダマセノン（Ｘ；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）を形成するための前駆体であると仮定される。ルテインを基質として含有するアッセイでは、９，１０及び９’，１０’位での対称的開裂により、３−ヒドロキシ−β−イオノン（ＶＩ）と３−ヒドロキシ−α−イオノンがどちらも形成される。
さらに、Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３ｂ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでクロセチンジアルデヒド（ＸＩＩ）及び３−ヒドロキシ−β−シクロシトラール（ＸＩＩＩ；図３ｂを参照）を形成することができる酵素をコードするサフラン由来のゼアキサンチン特異的７，８（７’，８’）−開裂ジオキシゲナーゼ（ＣｓＺＣＤ）を同定した。クロセチンジアルデヒドは、ジャクイニアアングスティフォリア（Ｊａｃｑｕｉｎｉａ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）の花（Ｅｕｇｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９６９）及びコレウスフォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）の根（Ｔａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９）の中に蓄積することが知られている。３−ヒドロキシ−β−シクロシトラールは、サフラン（Ｃ． ｓａｔｉｖｕｓ）中の香味料サフランの構成成分であるサフラナールの形成において最初にコミットされたステップであると考えられる（Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ）。トマトＺＣＤ相同分子種によるβ−カロテンの７，８（７’，８’）−開裂は、トマトの芳香に寄与するβ−シクロシトラールの形成に関与することが疑われる。Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３ｂ）はまた、ビキシンジアルデヒド（ＸＩＶ）及び以前に６−メチル−５−ハプテン−２−オン（ＭＨＯ；ＸＶ；Ｆａｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）として同定されたＣ７開裂産物の形成に関与する、ベニノキ（Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ）由来のリコペン特異的５，６（５’，６’）−開裂ジオキシゲナーゼ（ＢｏＬＣＤ）（図３ｃを参照）をも同定した。ビキシンジアルデヒドは、色素ビキシン／アナトーを形成するための前駆体である。ＭＨＯは、トマトの風味に対する重要な寄与物質として同定されている（Ｂｕｔｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ，１９９０；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
この広範な知識にもかかわらず、緑色コーヒー及び焙煎コーヒー中のそのような揮発性分子を特徴付ける研究はほとんどなされていない。焙煎及び非焙煎コーヒーは、カロテノイドに由来する２つの風味構成要素であるα−イオノン及びβ−ダマセノンを含有することが示されている（Ｃｚｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｖａｒｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。後者の構成要素は、焙煎前後両方のコーヒーの主要な構成要素として同定されている（Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これら及び他のカロテノイド由来揮発性化合物は、その低い臭気の閾値のために、芳香の変化を引き起こすのに少量しか必要としない。
前記の論述から、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成に関与するタンパク質の産生を遺伝的に調節することによるコーヒー粒中のカロテノイド及びアポカロテノイド含量の調節が、遺伝子工学により作製されたそのようなコーヒー豆から生産されたコーヒー飲料及びコーヒー製品の芳香及び風味を増強するのに非常に有用となることが理解されるであろう。コーヒー中の高いカロテノイド及びアポカロテノイド含量はまた、そのようなコーヒー豆から生産されたコーヒー飲料及び製品の消費者の全体的な健康状態に正に寄与する可能性もある。さらに、コーヒー植物中のカロテノイド及びアポカロテノイド含量の調節は、過剰又は不十分な日光の条件において光合成を最適化する意味を有する。したがって、カロテノイド及びアポカロテノイドの生合成に関与するコーヒー由来の遺伝子及び酵素を同定、単離及び利用する必要がある。
（発明の概要）
本明細書に記載の発明は、コーヒー植物中でのカロテノイド及びアポカロテノイド生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、そのコードされたポリペプチド、コーヒーカロテノイド及びアポカロテノイドの生合成経路酵素遺伝子由来のプロモーター配列、並びにこれらのポリヌクレオチド、ポリペプチド及びプロモーターを、コーヒー豆の風味、芳香、及び他の特徴の遺伝子制御及び操作に使用する方法を特徴とする。
本発明の一態様は、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒー種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．））から単離された核酸分子を特徴とする。一実施形態では、酵素は、配列番号１３と少なくとも７６％同一であるフィトエンシンターゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号１４と少なくとも７６％同一であるフィトエンデサチュラーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号１５と少なくとも６１％同一である色素体ターミナルオキシダーゼ（ｐｌａｓｔｉｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｘｉｄａｓｅ）である。他の実施形態では、酵素は、配列番号１６と少なくとも７３％同一であるβ−カロテンヒドロキシラーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号１７と少なくとも８６％同一であるリコペンε−シクラーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号１８と少なくとも２６％同一であるゼアキサンチンエポキシダーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号１９と少なくとも７４％同一であるビオラキサンチンデエポキシダーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号２０と少なくとも７５％同一である９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号２１と少なくとも８３％同一であるカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼである。他の実施形態では、酵素は、配列番号２２と少なくとも７２％同一であるフィブリリンである。他の実施形態では、酵素は、配列番号２３と少なくとも７２％同一であるフィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素である。他の実施形態では、酵素は、配列番号２４と少なくとも８２％同一であるゼータ−カロテンデサチュラーゼである。
特定の実施形態では、核酸分子は、コード配列を含むオープンリーディングフレームを有する遺伝子である。或いは、核酸分子はその遺伝子の転写によって作製されたｍＲＮＡ分子を含んでもよく、又はｍＲＮＡ分子の逆転写によって作製されたｃＤＮＡ分子を含んでもよい。本発明はまた、上記の核酸分子のセグメントと相補的である、長さが８〜１００塩基のオリゴヌクレオチドをも特徴とする。
本発明の他の態様は、上記に記載のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする核酸分子を含むベクターを特徴とする。特定の実施形態では、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵母及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、構成的プロモーターと作動的に連結した核酸分子のコード配列を含有する。他の実施形態では、コード配列は誘導性プロモーターと作動的に連結している。他の実施形態では、核酸分子のコード配列は、種子特異的プロモーター、好ましくはコーヒー種子特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターと作動的に連結している。具体的な実施形態では、組織特異的プロモーターは、配列番号２５中に含有されるプロモーターなどのコーヒーカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素遺伝子プロモーターである。
本発明の他の態様によれば、上記のベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。宿主細胞は、植物、細菌、真菌、昆虫又は哺乳動物細胞でよい。特定の実施形態では、宿主細胞は、コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、トマト トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ヒャクニチソウ、及び芝草のいずれか１つから選択される植物細胞である。本発明はまた、形質転換植物細胞を再生することによって作製された稔性トランスジェニック植物をも特徴とする。具体的な実施形態では、稔性トランスジェニック植物はコーヒー種である。
本発明の他の態様は、コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法を特徴とする。その方法は、コーヒー種子内で１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生を調節するステップを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、例えばコーヒー種子内で１つ又は複数の内因性カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を増大することによって、或いはカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする導入遺伝子を植物中に導入することによって、１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生を増大するステップを含む。他の実施形態では、その方法は、例えば１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒー中に導入することによって、１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生を低下するステップを含む。
本発明の他の態様は、特に過剰又は不十分な光の条件において、植物中の光合成を調節する方法を特徴とし、その方法は、コーヒー種子内でカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成する１つ又は複数のポリペプチドの産生を調節するステップを含む。この方法は、例えばコーヒー種子内で１つ又は複数の内因性カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を増大することによって、或いはカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする導入遺伝子を植物中に導入することによって、１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生を増大するステップを含む。
本発明の他の態様によれば、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードするコーヒー植物遺伝子から単離されたプロモーターが提供される。特定の実施形態では、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードするコーヒー遺伝子は、上記に記載の１つ又は複数の特徴を有するカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする。特定の実施形態では、プロモーターは、ＴＡＴＡボックス、アブシジン酸反応性エレメント、レグミニン（ｌｅｇｕｍｉｎｉｎ）型タンパク質の発現を制御するレグミニンボックスのＲＹ反復（ＣＡＴＧＣＡ（Ｔ／ａ）（Ａ／ｇ）、少なくとも１つの脱水反応性エレメント／Ｃ−反復シス作用性配列モチーフ（Ｇ／ＡＣＣＧＡＣ）及び少なくとも１つのＥ−ボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧ）からなる群から選択される１つ又は複数の制御性配列を含む。具体的な実施形態では、プロモーターは配列番号２５を含む。
本発明はまた、１つ又は複数のコード配列と作動的に連結した、コーヒーカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする遺伝子のプロモーターを含むキメラ遺伝子をも特徴とする。キメラ遺伝子を含む、細胞を形質転換するベクター、並びにベクターで形質転換された細胞、及びベクターで形質転換された植物細胞を再生することによって作製された稔性トランスジェニック植物も提供される。
本発明の他の特徴及び利点は、図面、下記の詳細な説明及び実施例から理解されるであろう。
（例示的な実施形態の詳細な説明）
定義：
本発明の生体分子及び他の態様に関係する様々な用語を、本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用する。
「カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路」という用語は、植物、より具体的にはコーヒー植物中でのカロテノイド又はアポカロテノイド生合成に関与するポリペプチドを指す。この用語は、酵素が媒介する、カロテノイドからのアポカロテノイドの誘導を含めて、経路中にあるそれぞれの各タンパク質の特定の作用機序を包含する。ポリペプチドには、それだけに限らないが、本明細書で例示されるように、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ、色素体ターミナルオキシダーゼ、リコペンβ−シクラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、ε−カロテンヒドロキシラーゼ、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ、ネオキサンチンシンターゼ、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ４、フィブリリン、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼなどがある。
「単離された」とは、天然の状態から「ヒトの手によって」変化したことを意味する。組成物又は物質が自然界で存在する場合、それが変化し又はその元の環境から取り出され、或いはその両方が起こった場合にそれは「単離」されている。例えば、その用語を本明細書で使用するとき、生存している植物又は動物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」されていないが、その天然の状態の共存物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離」されている。
「ポリヌクレオチド」はまた「核酸分子」とも称され、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、それは非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよく、或いは修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい。「ポリヌクレオチド」には、それだけに限らないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖でもよく、又はより典型的には二本鎖でもよく、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物でもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子がある。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ或いはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１つ又は複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性のために又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡをも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、及びイノシンなどの珍しい塩基がある。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる；したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で典型的に認められる、化学的に、酵素的に又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチド、並びにウイルス及び細胞に特徴的な、化学的な形のＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を指す。「ポリペプチド」は、通常はペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと称される短い鎖も、一般にタンパク質と称される長い鎖も指す。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされた２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの自然の過程によって、又は当技術分野で周知である化学修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。そのような修飾は、基本的な教科書及びより詳細なモノグラフ、並びに多量の研究文献中に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含めて、ポリペプチド中のどこでも起こる可能性がある。同じ型の修飾が、同じ又は様々な程度で、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に存在してよいことが理解されるであろう。また、所与のポリペプチドは、多数の型の修飾を含んでよい。ポリペプチドは、ユビキチン化により分枝してもよく、分枝を伴う又は伴わない環状のものでもよい。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチド及び分枝環状ポリペプチドは、自然の翻訳後の過程から生じるものでもよく、又は合成の方法により作製してもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などタンパク質に対するアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、及びユビキチン化がある。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３及びＷｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６及びＲａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい。
「変異体」は、その用語を本明細書において使用するとき、基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとはそれぞれ異なるが、基本的な特性を保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が他の基準ポリヌクレオチドと異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化により、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化してもよく、又は変化しなくてもよい。下記で論じるように、ヌクレオチド変化の結果、基準配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断が生じ得る。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が他の基準ポリペプチドと異なる。一般に違いは限定され、その結果、基準ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に密接に類似し、多数の領域で同一である。変異及び基準ポリペプチドは、任意の組合せの１つ又は複数の置換、付加、欠失、融合又は切断によりアミノ酸配列が異なってよい。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものでよく、又はそうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体など天然に存在するものでもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異生成技術又は直接合成によって作製することができる。
突然変異植物に関して、「ヌル突然変異体」又は「機能欠失突然変異体」という用語は、遺伝子産物を無機能にさせ、又はその大部分を欠如させる突然変異を有する生物又はゲノムＤＮＡ配列を示すのに使用する。そのような突然変異は、遺伝子のコード領域及び／又は制御性領域中で起こる可能性があり、個々の残基の変化である可能性もあり、或いは核酸の領域の挿入又は欠失である可能性もある。これらの突然変異はまた、タンパク質を無機能にさせ、又はその大部分を欠如させるように、遺伝子及び／又はコードされたタンパク質を制御又は調節することができる他の遺伝子のコード領域及び／又は制御性領域中で起こる可能性もある。
「実質的に同じ」という用語は、タンパク質の性質（すなわち、タンパク質の構造、安定性の特徴、基質特異性及び／又は生物活性）に著しくは影響を及ぼさない配列変異を有する核酸又はアミノ酸配列を指す。特に核酸配列に関して、「実質的に同じ」という用語は、コード領域及び発現を支配する保存された配列を指すものとし、主として、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、又はコードされたポリペプチド中の保存的な置換アミノ酸をコードする代替コドンを指す。アミノ酸配列に関して、「実質的に同じ」という用語は一般に、構造又は機能の決定に関与しないポリペプチドの領域中の保存的置換及び／又は変異を指す。
「パーセント同一である」及び「パーセント類似する」という用語も、アミノ酸及び核酸配列間の比較において本明細書で使用する。アミノ酸配列に言及するとき、「同一性」又は「パーセント同一である」とは、配列分析プログラムにより比較したアミノ酸配列中で同一のアミノ酸と整合している対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。「パーセント類似する」とは、同一の又は保存されているアミノ酸と整合している対象アミノ酸配列のアミノ酸のパーセントを指す。保存されているアミノ酸は、構造が異なるが物理的特性が類似するものであり、その結果、１つのアミノ酸と他のものとの交換では、得られたタンパク質の三次構造は感知できるほどには変化しない。保存的置換は、Ｔａｙｌｏｒ（１９８６，Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． １１９：２０５）で定義されている。核酸分子に言及するとき、「パーセント同一である」とは、配列分析プログラムにより同一のヌクレオチドと整合している対象核酸配列のヌクレオチドのパーセントを指す。
「同一性」及び「類似性」は、既知の方法により容易に計算することができる。核酸配列及びアミノ酸配列は、核酸又はアミノ酸の類似した配列を整列し、それによって違いを明らかにするコンピュータプログラムを使用して比較することができる。好ましい方法では、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）及びその中で使用されるパラメーターを使用し、ＤＮＡｓｔａｒシステム（ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡ配列の配列断片を整列する。しかし、任意の標準的なアラインメントソフトウェアの使用により、同等のアラインメント及び類似性／同一性の評価を得ることができる。例えば、ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ第９．１版、及びそのプログラムにより使用されている初期設定パラメーター（ギャップ生成ペナルティー＝１２、ギャップ伸長ペナルティー＝４）を使用して、配列同一性及び類似性を比較することもできる。
本明細書において「抗体」には、Ｆａｂ又は他のイムノグロブリン発現ライブラリの産物を含めて、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、及びヒト化抗体、並びに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）が含まれる。抗体に関して、「免疫学的に特異的な」又は「特異的な」という用語は、対象とするタンパク質の１つ又は複数のエピトープと結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含有する試料中の他の分子を実質的に認識せずそれと結合しない抗体を指す。抗体の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは当技術分野で周知であり、日常的に実施されている。そのようなアッセイの包括的な論述については、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）， Ｃｈａｐｔｅｒ ６を参照されたい。
「実質的に純粋な」という用語は、対象とする化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を少なくとも５０〜６０重量％含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は対象とする化合物を少なくとも７５重量％含み、最も好ましくは９０〜９９重量％含む。純度は、対象とする化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
一本鎖核酸分子に関して、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野で一般に使用される所定の条件下でそのようなハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相補的な配列の２つの一本鎖核酸分子間の関係を指す（時折「実質的に相補的な」と称される）。具体的には、その用語は、オリゴヌクレオチドと、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子内に含有される実質的に相補的な配列とのハイブリダイゼーションを指し、オリゴヌクレオチドと、相補的でない配列の一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションの実質的な除外を指す。
「コード配列」又は「コード領域」とは、配列が発現するときに、遺伝子産物の産生に必要な配列情報を有する核酸分子を指す。コード配列は、翻訳領域内に非翻訳配列（例えば、イントロン）を含んでもよく、又は（例えば、ｃＤＮＡのように）そのような介在非翻訳配列を欠いてもよい。
「イントロン」とは、タンパク質合成に関係する情報をコードしない、核酸中のポリヌクレオチド配列を指す。そのような配列はｍＲＮＡに転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質へと翻訳される前に除去される。
「作動的に連結した」又は「作動的に挿入した」という用語は、コード配列の発現に必要な制御性配列を、コード配列の発現が可能となるように、コード配列に対して適当な位置で核酸分子中に置くことを意味する。一例として、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写又は発現を調節することができるとき、そのコード配列と作動的に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンスの方向でプロモーター又は制御性配列と作動的に連結することができる。「作動的に連結した」という用語は、発現ベクター中の他の転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の配置に時折適用される。
転写及び翻訳調節配列はプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列などのＤＮＡ制御性配列であり、それは、宿主細胞中でのコード配列の発現をもたらす。
「プロモーター」、「プロモーター領域」又は「プロモーター配列」という用語は一般に遺伝子の転写制御性領域を指し、それはコード領域の５’又は３’側、或いはコード領域内、又はイントロン内に認めることができる。典型的には、プロモーターは、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御性領域である。典型的な５’プロモーター配列は、転写開始部位によりその３’末端で結合し、上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドより上の検出可能なレベルでの転写の開始に必要な最小限の数の塩基又はエレメントを含む。プロモーター配列内には、（好都合なことにヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって定義される）転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（共通配列）がある。
「ベクター」とは、他の核酸セグメントの複製又は発現をもたらすようにそのセグメントを作動的に挿入することができるプラスミド、ファージ、コスミドやウイルスなどのレプリコンである。
「核酸構築物」又は「ＤＮＡ構築物」という用語は、適当な制御性配列と作動的に連結し、細胞を形質転換するベクター中に挿入した１つ又は複数のコード配列を指すのに時折使用する。この用語は、「形質転換用ＤＮＡ」又は「導入遺伝子」という用語と互換的に使用することができる。そのような核酸構築物は、選択マーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子とともに、対象とする遺伝子産物のコード配列を含有してよい。
「マーカー遺伝子」又は「選択マーカー遺伝子」とは、そのコードされた遺伝子産物が、その遺伝子を含有する細胞がその遺伝子を含有しない細胞の中から選択されることを可能にする特徴を付与する遺伝子である。遺伝子工学に使用されるベクターは、典型的には１つ又は複数の選択マーカー遺伝子を含有する。選択マーカー遺伝子の型には、（１）抗生物質耐性遺伝子、（２）除草剤寛容性又は耐性遺伝子、及び（３）形質転換細胞が、その他の場合では細胞が産生することができない必須の構成要素、通常はアミノ酸を合成することを可能にする代謝又は栄養要求性マーカー遺伝子がある。
「レポーター遺伝子」もマーカー遺伝子の一種である。それは、典型的には、標準的な実験室の手段（例えば、酵素活性、蛍光）によってアッセイ可能又は検出可能な遺伝子産物をコードする。
遺伝子の「発現する（ｅｘｐｒｅｓｓ）」、「発現された（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」又は「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。その過程では遺伝子がｍＲＮＡへと転写され、次いでｍＲＮＡが１つ又は複数のポリペプチドへと翻訳され、その過程は天然に存在するすべての翻訳後修飾を包含する。
「内因性」とは、特定の生物内で天然に認めることができる任意の構成成分、例えば、遺伝子又は核酸、或いはポリペプチドを指す。
核酸構築物の「異種」領域とは、自然界では大きな分子に関連して認められない、大きな分子内にある核酸分子の同定可能なセグメント（又は複数のセグメント）である。したがって、異種領域が遺伝子を含むとき、遺伝子は通常、供給源の生物のゲノム中ではゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接する。他の例では、異種領域は、コード配列自体が自然界で認められない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、又は天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異又は天然に存在する突然変異事象からは、本明細書で定義したＤＮＡの異種領域は生じない。上記で定義した「ＤＮＡ構築物」という用語は、異種領域、特に細胞の形質転換で使用するために構築されたものを指すのにも使用される。
外因性又は異種ＤＮＡが細胞内に導入されているとき、細胞は、そのようなＤＮＡにより「形質転換」又は「トランスフェクト」されている。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれて（共有結合して）もよく、又は組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換用ＤＮＡをプラスミドなどのエピソームエレメント上に維持することができる。真核細胞に関して、安定形質転換細胞とは、形質転換用ＤＮＡが染色体中に組み込まれており、その結果、それが染色体複製により娘細胞に遺伝する細胞である。この安定性は、真核細胞が形質転換用ＤＮＡを含有する娘細胞の集団からなる細胞株又はクローンを樹立できることによって実証される。「クローン」とは、単一細胞、又は有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」とは、多数の世代へと安定してｉｎ ｖｉｔｒｏで 増殖することができる初代細胞のクローンである。
「粒」、「種子」、又は「豆」とは、他のそのような植物へと成長することができる顕花植物の再生単位を指す。本明細書において、特にコーヒー植物に関しては、その用語は、同義的にかつ互換的に使用される。
本明細書において、「植物」という用語は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、苗条、根）、種子、花粉、植物細胞、植物細胞小器官、及びその子孫への言及を含む。例えば、トランスジェニック植物又はその子孫に由来する植物細胞、原形質体、組織、カルス、胚並びに花、茎、種子、花粉、果実、葉、又は根を含むトランスジェニック植物の部分は、本発明の範囲内で理解されるべきである。
説明：
その態様の１つでは、本発明は、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路に関与する様々なタンパク質をコードするコーヒー由来の核酸分子を特徴とする。カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする核酸分子の代表的な例は、幼葉並びに発生の様々な段階で採取した実の粒及び果皮組織から単離されたＲＮＡを用いて作製されたいくつかのコフィアカネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）（ロブスタ）ｃＤＮＡライブラリの４７，０００を超える発現配列タグ（ＥＳＴ）のデータベースから同定された。重複するＥＳＴを同定し、それを完全なコード配列を含むユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）（コンティグ）へと「クラスター化」した。ＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））の重複のないタンパク質データベースに対する個々の各配列のＢＬＡＳＴ検索を行うことによってユニジーン配列に注釈を付けた。
公的データベースの生化学的に特徴付けられたタンパク質の配列を使用するコーヒーＥＳＴデータベースのＢＬＡＳＴ検索から、コーヒー植物中のカロテノイド生合成経路のいくつかの重要な酵素に相当する遺伝子の配列、アポカロテノイドの生成に関与する２つの酵素（ＮＣＥＤ３及びＣＣＤ１）をコードする配列が明らかとなった。いくつかのこれらの配列の完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得、２つの他のカロテノイド生合成酵素（ＰＤＳ及びＺＤＳ）の部分的な配列も、縮重及び非縮重プライマーを使用してクローン化した。これらのｃＤＮＡ及びそのコードされたタンパク質を下記の通りに称する：
本発明の他の態様は、コーヒー中のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路遺伝子の発現を調節するプロモーター配列及び関連エレメントを特徴とする。実施例中でより詳細に説明するように、ＣｃＮＣＥＤ３由来のプロモーター配列（配列番号２５中に含有されている）が、実施例中で記載するＰＣＲ支援プライマーウォーキングによって同定された。
重要なステップであるコフィアカネフォラ由来のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を触媒するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを本明細書で記載し例示するが、本発明は、下記に記載の目的でＣ．カネフォラ（Ｃ． ｃａｎｅｐｈｏｒａ）ポリヌクレオチド及びタンパク質と互換的に使用するのに十分に類似した他のコーヒー種由来の核酸及びコードされたタンパク質を包含するものとする。したがって、「カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成する」ポリペプチド及びタンパク質という用語を本明細書で使用するとき、その用語は、本明細書に記載の一般的な物理的、生化学的及び機能的特徴を有するコーヒー属タンパク質、並びにそれをコードするポリヌクレオチドをすべて包含するものとする。
その配列の点から考慮すると、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドには、Ｃ．カネフォラの異なる品種中で認められる可能性が高い配列番号１〜１２の対立遺伝子変異体及び天然突然変異体、並びに異なるコーヒー種で認められる可能性が高い配列番号１〜１２の相同体がある。そのような変異体及び相同体は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列における特定の違いを有することが予想されるので、本発明は、配列番号１３〜２４のいずれか１つと少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％又は７０％、より好ましくは少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、又は８０％、さらに好ましくは８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、さらに好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、最も好ましくは９６％、９７％、９８％及び９９％以上の同一性を有し、配列番号１〜１２のいずれか１つと同等の範囲の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質の間で存在する可能性が高い天然配列変異、並びに異なるコーヒー品種及び種においてそれをコードする遺伝子のために、当業者なら、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドの独特の特性を依然として維持しながら、このレベルの変異を見つけることを予想するであろう。そのような予想は、部分的にはコードされたタンパク質の性質を感知できるほどには変化させない遺伝コードの縮重、並びに保存的アミノ酸配列変異の既知の進化的な成功に起因する。したがって、そのような変異体及び相同体は、互いに実質的には同じであるとみなされ、本発明の範囲に含まれる。
カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子と関係する遺伝子制御性配列は実用性があり、本発明の範囲内にあるとみなされる。Ｃ．カネフォラＮＣＥＤ３プロモーターが本明細書で例示されている。Ｃ．カネフォラＮＣＥＤ３ゲノム配列の上流領域は、本明細書において配列番号２５として示され、本発明の例示的なプロモーターの一部又は全部を含有するが、そのプロモーターの他の部分は、上記で示した「プロモーター」の定義で説明したように、その遺伝子の他の位置で見つけることができるかもしれない。しかし、下記に記載する方法によって任意のコーヒー種由来のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター及び他の遺伝子制御性配列を得ることができ、それを本発明に従って利用することができる。カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の組織特異性及び時間的特異性を支配するプロモーター及び制御性エレメントを使用して、他にも有用性はあるが、そのような修飾を含むコーヒー豆から生産されるコーヒー製品の風味及び芳香を増強する目標に向けて、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質の発現を促進し、変化させ又は修飾することができる。
下記の節では、本発明の実施に関与する一般的な手順を示す。特定の物質について述べる限り、それは単に例示の目的のものに過ぎず、本発明を限定するものではない。別段の指定がない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（２００５）で示すものなどの一般的な生化学及び分子生物学的手順を使用する。
核酸分子、タンパク質及び抗体：
２つの一般的な方法によって本発明の核酸分子を調製することができる：（１）その分子は適当なヌクレオチド三リン酸から合成することができ、又は（２）その分子は生物学的供給源から単離することができる。どちらの方法も、当技術分野で周知のプロトコルを利用する。
配列番号１〜１２を有するｃＤＮＡや、配列番号２５の制御性配列などのヌクレオチド配列情報が利用できることにより、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の調製が可能となる。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ又は類似する装置で使用されるホスホラミダイト法によって調製することができる。得られた構築物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、当技術分野で知られている方法に従って調製することができる。本発明のＤＮＡ分子などの長い二本鎖ポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌクレオチド合成法に固有のサイズ限界により、段階的に合成しなくてはならない。したがって、例えば、長い二本鎖分子は、適当な相補性を有するいくつかの小さなセグメントとして合成することができる。こうして作製された相補的セグメントは、各セグメントが、隣接するセグメントの結合に適した付着末端を有するようにアニールすることができる。隣接するセグメントをＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニールすることにより連結して、長い二本鎖分子全体を構築することができる。次いで、そのように構築された合成ＤＮＡ分子をクローン化し、それを適当なベクター中で増幅することができる。
本発明によれば、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード領域及び／又は制御性領域の一部又は全部との適当なレベルの配列相同性を有する核酸を、適当な厳密性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を使用することによって同定することができる。ゲノム配列に適用するとき、上記の戦略によって、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子のコード配列の単離が可能となることに加えて、制御性配列自体が適切なハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相同性を有していない可能性があっても、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子と関係するプロモーター及び他の遺伝子制御性配列の単離も可能となることが当業者に理解されるであろう。さらに、少なくとも部分的なコード配列の注釈付けから、当業者が、上流又は下流のゲノムウォーキングの技術によって、対象とするカロテノイド又はアポカロテノイドタンパク質と関係するプロモーター又は他の遺伝子制御性配列と同時に残りのコード配列を決定することが可能となる。そのような技術は当技術分野で確立されている。（Ｍｉｓｈｒａ ＲＮ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｉｓｈｉ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
典型的な例示として、５×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、及び最大で５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用するＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の方法に従ってハイブリダイゼーションを行うことができる。ハイブリダイゼーションを３７〜４２℃で少なくとも６時間実施する。ハイブリダイゼーション後、フィルターを下記の通りに洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ中、室温で５分；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分；（３）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、３０分毎に溶液を交換しながら４５〜５５℃で２時間。
特定の配列相同性を有する核酸分子間でのハイブリダイゼーションを実現するのに必要となる厳密性の条件を計算する１つの一般式（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／二重鎖中の塩基対数
上記の式の例示として、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドと、ＧＣ含量４２％及び平均プローブサイズ２００塩基を使用すると、Ｔｍは５７℃となる。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低下する毎に１〜１．５℃低下する。したがって、約７５％を超える配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用すると観察される。一実施形態では、上記のハイブリダイゼーション及び洗浄溶液を用いて、ハイブリダイゼーションは３７℃で行い、最終洗浄は４２℃で行う；他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、最終洗浄は５０℃で行う；さらに他の実施形態では、ハイブリダイゼーションは４２℃で行い、最終洗浄は６５℃で行う。高厳密性の条件では、上記のハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションを４２℃で行い、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で最終洗浄を６５℃で１０分間行う。
任意の便利なクローン化ベクター中のＤＮＡとして本発明の核酸を維持することができる。好ましい実施形態では、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）やｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）などのプラスミドクローン化／発現ベクター中でクローンを維持し、これらのベクターはすべて、適切な大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）宿主細胞中で増殖させることができる。
本発明の核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその断片があり、それらは一本鎖、二本鎖でよく、さらに三本鎖でもよい。したがって、本発明は、本発明の核酸分子の少なくとも１つの配列とハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス又はアンチセンス鎖）を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、植物組織の試験試料中のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子又はｍＲＮＡを検出するためのプローブとして、例えばＰＣＲ増幅によって、或いはタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳時又はその前の、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するタンパク質をコードする遺伝子の発現の正又は負の制御に有用である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをそのようなアッセイのプローブとして利用することができる方法には、それだけに限らないが、（１）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（２）サザンハイブリダイゼーション（３）ノーザンハイブリダイゼーション；及び（４）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲを含む）やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）などの様々な種類の増幅反応がある。
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、知られている方法に従って、様々な形で調製することができる。ｉｎ ｓｉｔｕで産生された場合、ポリペプチドは、適当な供給源、例えば、種子、果皮や他の植物の部分から調製することができる。
或いは、単離核酸分子が利用できることにより、当技術分野で知られているｉｎ ｖｉｔｒｏ発現方法を使用したタンパク質の産生が可能となる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のｐＳＰ６４やｐＳＰ６５などの適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクター中にｃＤＮＡ又は遺伝子をクローン化し、その後コムギ胚芽やウサギ網状赤血球などの適切な無細胞翻訳系で無細胞翻訳を行うことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、ＢＲＬ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから市販されている。
好ましい実施形態に従って、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成する大量のポリペプチドを、適切な原核生物又は真核生物系中での発現によって産生することができる。例えば、配列番号１〜１２を有するｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部又は全部を、細菌細胞（大腸菌など）又は酵母細胞（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）中での発現に適合されたプラスミドベクター、或いは昆虫細胞中での発現用のバキュロウイルスベクター中に挿入することができる。そのようなベクターは、宿主細胞中でのＤＮＡの発現を可能にするように位置している、宿主細胞中でのＤＮＡの発現に必要な制御性エレメントを含む。発現に必要となるそのような制御性エレメントには、プロモーター配列、転写開始配列、及び場合によってはエンハンサー配列がある。
組換え原核生物又は真核生物系中での遺伝子発現によって産生された、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドは、当技術分野で知られている方法に従って精製することができる。好ましい実施形態では、市販されている発現／分泌系を使用し、それによって組換えタンパク質が発現され、その後宿主細胞から分泌されて、その周囲の培地からそれを容易に精製することができる。発現／分泌ベクターを使用しない場合、代替の手法では、組換えタンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用などの親和性分離により組換えタンパク質を精製する。そのような方法は、熟練した専門家によって一般に使用される。
上記の方法によって調製された、本発明のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドは、標準的な手順に従って分析することができる。
知られている方法に従って、コーヒーから精製され、又は組換えにより産生されたカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドを使用して、本明細書で定義したポリクローナル又はモノクローナル抗体、抗体の断片又は誘導体を生成することができる。本発明のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドの断片を認識しそれと結合する抗体も、その抗体がカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドに特異的であるという条件で企図される。例えば、タンパク質の分析又はサザン及びクローン化の分析（下記を参照）からクローン化された遺伝子が多重遺伝子族に属することが示唆される場合、タンパク質の非保存的領域と対応する合成ペプチドに対して作製された構成要素特異的抗体を生成することができる。
本明細書に記載したいずれかの目的のための本発明の抗体を含むキットも本発明の範囲に含まれる。一般に、そのようなキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原を含む。
カロテノイド及びアポカロテノイドは、ヒトの健康状態の多数の面で役割を果たす。カロテノイドは、強力な抗酸化物質であり（ＤｉＭａｓｃｉｏ，Ｐ ｅｔ ａｌ．１９９１）、紫外線からの保護に効果的であり（Ｓｉｅｓ，Ｈ ｅｔ ａｌ．２００４）、免疫保護的役割を有し免疫細胞増殖を促進することができ（Ｗａｔｚｌ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｂｏｅｌｓｍａ，Ｅ ｅｔ ａｌ．２００１；Ａｕｓｔ，Ｏ ｅｔ ａｌ．２００５）、光線過敏症の治療に使用することができ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ−Ｒｏｔｈ，．Ｍ． ｅｔ ａｌ．１９９３）、加齢性黄斑変性症に対して保護的であり（Ｓｅｄｄｏｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．１９９４）、白内障に対して保護的であり（Ｔａｙｌｏｒ Ａ １９９３）、心血管系疾患から防護することができ（Ｇａｚｉａｎｏ ＪＭ ｅｔ ａｌ．１９９３）、とりわけ肺癌、口腔喉頭癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌や子宮頸部癌などの多数のヒト癌に対する予防的かつ考えられる化学療法的な効果を示す（Ｍａｙｎｅ，Ｓ １９９６）ことが実証されている。さらに、アルファ−カロテンやベータ−カロテンなどのカロテノイドは、ビタミンＡ合成で重要な役割を果たす。（Ｂｒｉｔｔｏｎ Ｇ，１９９５）。カロテノイド及びアポカロテノイドに起因する健康上の利点のこのリストは例示的であり網羅的でないことを意味し、現在は不明である、カロテノイドに起因する多数の他の有益な健康上の効果があることが推定される。したがって、本明細書で例示し記載したカロテノイド及びアポカロテノイドの生合成経路を構成するコーヒーポリペプチドは、様々な食物、健康状態への適用で有用性が見出されることが予想される。例えば、カロテノイド及びアポカロテノイドの生合成経路を構成するコーヒーポリペプチド、或いはそのそれぞれのカロテノイド又はアポカロテノイド産物を栄養補助食品として利用することができる。さらに、カロテノイド及びアポカロテノイドの抗酸化及び光保護特性は、食品にも化粧品にも有益となることが判明する可能性がある。
カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドの１つ又は複数の上記の適用は、本明細書に記載のカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが利用できることを利用して、組換え生物を使用して（例えば、酵母ピチアパストリス（Ｐｉｃｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又は食物適合性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）中で、或いは植物細胞中で）かなり大量の純粋なタンパク質を生成し、次いで新たな又は確立されているアッセイで抗酸化潜在性、免疫増殖潜在性、化学保護的又は化学療法的潜在性などについてタンパク質を試験することによって追求することができる。当技術分野で確立又は開発された適切な手段に従って、これらのタンパク質によって産生されたカロテノイド又はアポカロテノイドを使用して同様の試験を実施することができる。特定の精製タンパク質、或いはそのようなタンパク質によって産生されたカロテノイド又はアポカロテノイド産物が特に有用であることが分かった場合、天然型のそれらのタンパク質及びそのカロテノイド又はアポカロテノイド産物はまた、コーヒー粒又は他の植物の部分、或いはこれらのカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路酵素に富む他の植物の組織及び器官から単離することもできる。
ベクター、細胞、組織及び植物：
本発明によれば、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、或いはオリゴヌクレオチド、又はセンス若しくはアンチセンス方向のその相同体、類似体若しくは変異体、或いは細胞又は組織特異的プロモーター、特に本明細書に記載のカロテノイド又はアポカロテノイドをコードする遺伝子のプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子及び他の構築物、並びに他の制御性配列を含有する、トランスジェニック宿主細胞を産生するベクター及びキットも特徴とする。適切な宿主細胞には、それだけに限らないが、植物細胞、細菌細胞、酵母及び他の真菌細胞、昆虫細胞並びに哺乳動物細胞がある。多様なこれらの宿主細胞を形質転換するベクターは当業者に周知である。そのベクターには、それだけに限らないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに他の細菌、酵母及びウイルスベクターがある。典型的には、トランスジェニック宿主細胞を産生するキットは、１つ又は複数の適当なベクター及びベクターを使用してトランスジェニック細胞を産生するための使用説明書を含有する。キットは、いくつか例を挙げると、細胞を培養する培地、細胞の形質転換を行う試薬、及び遺伝子発現についてトランスジェニック細胞を試験する試薬などの１つ又は複数のさらなる構成要素をさらに含んでよい。
本発明は、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする１コピー又は複数コピーの遺伝子、或いはカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成する植物の内因性ポリペプチドの産生又は機能を阻害する核酸配列を含むトランスジェニック植物を含む。これは、下記に記載する天然又は組換えの制御性配列によって調節される、ＲＮＡを含めた、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の一部又は全部、或いはその突然変異体、アンチセンス又は変異体を含む導入遺伝子で植物細胞を形質転換することによって実現される。それだけに限らないが、Ｃ．アベオクタエ（Ｃ． ａｂｅｏｋｕｔａｅ）、Ｃ．アラビカ（Ｃ． ａｒａｂｉｃａ）、Ｃ．アーノルディアナ（Ｃ． ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）、Ｃ．アルベミエンシス（Ｃ． ａｒｕｗｅｍｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ベンガレンシス（Ｃ． ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、Ｃ．カネフォラ、Ｃ．コンゲンシス（Ｃ． ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｃ．デベブレイ（Ｃ． ｄｅｗｅｖｒｅｉ）、Ｃ．エキサルサ（Ｃ． ｅｘｅｌｓａ）、Ｃ．ユーゲニオイデス（Ｃ． ｅｕｇｅｎｉｏｉｄｅｓ）、及びＣ．ヘテロカリクス（Ｃ． ｈｅｔｅｒｏｃａｌｙｘ）、Ｃ．カパカタ（Ｃ． ｋａｐａｋａｔａ）、Ｃ．カシアナ（Ｃ． ｋｈａｓｉａｎａ）、Ｃ．リベリカ（Ｃ． ｌｉｂｅｒｉｃａ）、Ｃ．モルンドウ（Ｃ． ｍｏｌｏｕｎｄｏｕ）、Ｃ．ラセモサ（Ｃ． ｒａｓｅｍｏｓａ）、Ｃ．サルバトリクス（Ｃ． ｓａｌｖａｔｒｉｘ）、Ｃ．セシフローラ（Ｃ． ｓｅｓｓｉｆｌｏｒａ）、Ｃ．ステノフィラ（Ｃ． ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）、Ｃ．トラベンコレンシス（Ｃ． ｔｒａｖｅｎｃｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ウィッチアナ（Ｃ． ｗｉｇｈｔｉａｎａ）及びＣ．ザングエバリエ（Ｃ． ｚａｎｇｕｅｂａｒｉａｅ）を含めたトランスジェニック植物コーヒー種が好ましい。任意の種の植物も本発明中に含まれる；これらの植物には、それだけに限らないが、タバコ、シロイヌナズナ及び他の「実験に適した」種、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバーなどの禾穀類、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオなどの油産生性植物、トマト トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメなどの野菜、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ペチュニア、ヒャクニチソウ、芝生や芝草などの園芸植物がある。
当業者に知られている標準的な植物形質転換法を使用して、トランスジェニック植物を生成することができる。これらの方法には、それだけに限らないが、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクター、原形質体のポリエチレングリコール処理、微粒子銃ＤＮＡ送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、ＵＶレーザーマイクロビーム、ジェミニウイルスベクター又は他の植物ウイルスベクター、原形質体のリン酸カルシウム処理、単離原形質体のエレクトロポレーション、形質転換用ＤＮＡで被覆したマイクロビーズを入れた溶液中の細胞懸濁物の撹拌、形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を入れた溶液中の細胞懸濁物の撹拌、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームが媒介するＤＮＡ取り込みなどがある。そのような方法は当技術分野で刊行されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，ｅｄｓ．，１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ ＆ Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，ｅｄｓ．，１９８９）；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｖｅｒｍａ，ｅｄｓ．，１９９３）；及びＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍａｌｉｇａ，Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｃａｓｈｍｅｒｅ，Ｇｒｕｉｓｓｅｍ ＆ Ｖａｒｎｅｒ，ｅｄｓ．，１９９４）を参照されたい。
形質転換の方法は、形質転換する植物によって決まる。アグロバクテリウムベクターは、双子葉植物種の形質転換にしばしば使用される。アグロバクテリウムバイナリーベクターには、それだけに限らないが、ＢＩＮ１９及びその誘導体、ｐＢＩベクターシリーズ、及びバイナリーベクターｐＧＡ４８２、ｐＧＡ４９２、ｐＬＨ７０００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＹ２３４３３０）並びにｐＣＡＭＢＩＡベクター（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｓｖａｂ ＆ Ｍａｌｉｇａ，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍａｌ Ｂｉｏｌ ２５：９８９−９９４によって構築されたｐＰＺＰベクターに由来し、ＣＡＭＢＩＡ、ＧＰＯ Ｂｏｘ ３２００、Ｃａｎｂｅｒｒａ ＡＣＴ ２６０１、オーストラリアから又はワールドワイドウェブＣＡＭＢＩＡ．ｏｒｇを介して入手可能）のうち任意の適切なものがある。単子葉植物種の形質転換では、形質転換用ＤＮＡで被覆した粒子及び形質転換用ＤＮＡで被覆したケイ素繊維を用いた遺伝子銃照射が核形質転換にしばしば有用である。或いは、アグロバクテリウム「スーパーバイナリー」ベクターは、イネ、トウモロコシ及び様々な他の単子葉植物種の形質転換に使用することに成功している。
選択された植物を形質転換するＤＮＡ構築物は、適当な５’（例えばプロモーター及び翻訳制御性配列）及び３’制御性配列（例えば転写終結配列）と作動的に連結した対象とするコード配列を含む。好ましい実施形態では、その天然の５’及び３’制御性エレメントの調節下で、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするコード配列を利用する。他の実施形態では、コード配列と制御性配列を交換して（例えば、ＬβＣＹプロモーターと作動的に連結したＣｃＰＳＹ１コード配列）、例えば風味、芳香又は他の特徴において表現型を改良するために形質転換された植物の種子のタンパク質含量を変化させる。
代替の実施形態では、遺伝子のコード領域を、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターやゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの強力な構成的プロモーター下に置く。本発明での使用に企図される他の構成的プロモーターには、それだけに限らないが、Ｔ−ＤＮＡマンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼプロモーターがある。他の実施形態では、強力な単子葉植物プロモーター、例えば、トウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター又はイネチューブリンプロモーターを使用する（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１２３：１００５−１４，２０００）。
誘導性プロモーター下でカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドを発現するコード配列を有するトランスジェニック植物が本発明の範囲内にあることも企図されている。誘導性植物プロモーターには、ほんのいくつか例を挙げると、テトラサイクリンリプレッサー／オペレーター調節プロモーター、熱ショック遺伝子プロモーター、ストレス（例えば、傷害）誘導プロモーター、防御反応性遺伝子プロモーター（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子）、傷害誘導遺伝子プロモーター（例えば、ヒドロキシプロリンリッチ細胞壁タンパク質遺伝子）、化学誘導性遺伝子プロモーター（例えば、硝酸レダクターゼ遺伝子、グルカナーゼ遺伝子、キチナーゼ遺伝子など）及び暗所誘導性遺伝子プロモーター（例えば、アスパラギンシンターゼ遺伝子）がある。
本発明のカロテノイド又はアポカロテノイドタンパク質プロモーターに加えて、組織特異的及び成長特異的プロモーターも本発明での使用に企図される。種子特異的プロモーターの非限定的な例には、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａザイン）、ｍｉｌｐｓ（ミオイノシトール−１−リン酸シンターゼ）、及びｃｅｌＡ（セルロースシンターゼ）（米国特許出願第０９／３７７，６４８号明細書）、マメベータ−ファゼオリン、ナピン、ベータ−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、トウモロコシ１５ｋＤａザイン、２２ｋＤａザイン、２７ｋＤａザイン、ｇ−ザイン、ｗａｘｙ、ｓｈｒｕｎｋｅｎ１、ｓｈｒｕｎｋｅｎ２、及びグロブリン１、ダイズ１１Ｓレグミン（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、及びＣ．カネフォラ１１Ｓ種子貯蔵タンパク質（Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：２７３−２８２）がある。ｅｎｄ１及びｅｎｄ２遺伝子由来の種子優先的プロモーターが開示されている国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照されたい。それだけに限らないが、本願権利者が所有する同時係属の米国特許仮出願第６０／６９６，４４５号明細書に記載のオレオシン遺伝子プロモーター及び本願権利者が所有する同時係属の米国特許仮出願第６０／６９６，８９０号明細書に記載のデヒルジン（ｄｅｈｙｒｄｉｎ）遺伝子プロモーターを含めて、他のコーヒー属種子特異的プロモーターを利用することもできる。他の組織特異的プロモーターの例には、それだけに限らないが、光合成組織中での発現用のリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）低分子サブユニット遺伝子プロモーター（例えば、Ｍａｒｒａｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００３に記載のコーヒー低分子サブユニットプロモーター）又はクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター；及び根での発現が所望される根特異的グルタミンシンターゼ遺伝子プロモーターがある。
コード領域はまた、適当な３’制御性配列とも作動的に連結している。天然の３’制御性配列を使用しない実施形態では、ノパリンシンターゼポリアデニル化領域を使用することができる。他の有用な３’制御性領域には、それだけに限らないが、オクトピンシンターゼポリアデニル化領域がある。
適当な制御性エレメントの制御下にある選択されたコード領域は、カナマイシン耐性などの核薬物耐性マーカーと作動的に連結している。他の有用な選択マーカー系には、抗生物質又は除草剤耐性（例えば、ハイグロマイシン、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン、又はグリホサートに対する耐性）を付与する遺伝子、或いは選択的増殖を付与する遺伝子（例えば、マンノース上での植物細胞の増殖を可能にするホスホマンノースイソメラーゼ）がある。選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするものなどの抗生物質耐性をコードする遺伝子、並びにグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ及び／又はグリホサートオキシドレダカターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃａｔａｓｅ）（ＧＯＸ）、ブロモキシニルに対する耐性についてのブロモキシニルニトリラーゼ（ＢＸＮ）、イミダゾリノンに対する耐性についてのＡＨＡＳ遺伝子、スルホニル尿素耐性遺伝子や、２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性遺伝子などの除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子がある。
特定の実施形態では、本発明によって包含されるプロモーター及び他の発現制御性配列をレポーター遺伝子と作動的に連結する。本発明での使用に企図されるレポーター遺伝子には、それだけに限らないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ハナギンチャクオレンジ蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（α−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、或いはホタル又は細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする遺伝子がある。本発明の実施と関係する多数の標準的な手順のように、当業者なら、マーカー又はレポーターの機能を果たすことができるさらなる配列に気づくであろう。
細胞宿主中の遺伝子発現を増強するさらなる配列修飾は当技術分野で知られている。これらの修飾には、余分なポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復をコードする配列、及び遺伝子発現にとって有害である可能性がある他の十分に特徴付けられているそのような配列の除去がある。或いは、必要なら、コード配列のＧ／Ｃ含量を、コーヒー植物細胞中で発現される既知の遺伝子を参照することによって計算される、所与のコーヒー植物細胞宿主で平均のレベルに調整することができる。また、可能であるとき、コード配列を修飾して、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避する。遺伝子発現を増強する他の代替方法は、５’リーダー配列を使用することである。翻訳リーダー配列は当技術分野で周知であり、それには、タバコモザイクウイルスの５’リーダー配列（オメガ）のシス作用性誘導体（オメガ’）、ブロムモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、及びカブラ黄色モザイクウイルス由来の５’リーダー配列がある。
植物を形質転換し、その後、導入遺伝子産物の存在、導入遺伝子がコードするｍＲＮＡ、又は導入遺伝子の発現と関係する表現型の変化を含めた１つ又は複数の特性についてそれをスクリーニングする。発現の量、並びに形質転換植物中での導入遺伝子の発現の組織及び時間特異的パターンが、核ゲノム中にそれが挿入された位置に応じて様々となり得ることが認識されるべきである。そのような位置の効果は当技術分野で周知である。この理由で、いくつかの核形質転換体を再生し、導入遺伝子の発現についてそれを試験すべきである。
方法：
コーヒー植物中でタンパク質産物が発現することができ、その結果、そのタンパク質が光合成、並びにタンパク質が発現しているコーヒー植物の豆から最終的に生産されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香の増強において役割を果たすことができるいくつかの方法のいずれか１つで本発明の核酸及びポリペプチドを使用することができる。同様に、ポリペプチドから合成されたカロテノイド、アポカロテノイド、及び他のそのような植物化学産物が光合成、並びにカロテノイド及びアポカロテノイドを含有するコーヒー植物の豆から最終的に生産されるコーヒー飲料又はコーヒー製品の風味及び／又は芳香の増強において役割を果たすことができるいくつかの方法のいずれか１つで本発明のポリペプチドを使用することができる。
光合成に関して、カロテノイドは、光ストレス下の光保護、及び日陰の環境での光収集において役割を果たす。実際、多数の植物が、完全な日光に対する日陰の状態に反応してそのカロテノイド組成を変化させる。（Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。したがって、植物中でカロテノイド及びアポカロテノイドの生合成経路を構成するポリペプチドの産生を操作できることによって、又は本発明のポリヌクレオチド及びタンパク質を使用してそのような遺伝子発現をモニターできることによっても、様々なレベルの日光に対するコーヒー植物の反応の研究及び操作が可能となる。この知識によって、カロテノイドが光合成色素を保護する過剰な光や、補助色素の低下によって光採取がより効率よくなる不十分な光などの次善の状態において光合成の準備がより整っている改変コーヒー植物の生成が可能となる。
焙煎コーヒー粒の風味及び芳香に関して、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドが、タンパク質自体の内容物、又はそれが産生するカロテノイドやアポカロテノイドなどの産物を用いた、焙煎の間に起こるメイラード反応によるコーヒーの風味の生成に対して何らかの影響を及ぼすことが予想される。タンパク質、特にタンパク質分解産物（ペプチド及びアミノ酸）が、重要な群の風味前駆体となる（Ｓｐａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。したがって、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するものなどの比較的豊富なタンパク質が、コーヒーを焙煎する間に起こる風味生成反応に対して何らかの寄与を果たすことが予想できる。そのような寄与は、コーヒー豆中のタンパク質自体の濃度、或いはそのタンパク質から最終的に産生されるカロテノイド又はアポカロテノイドの濃度に由来する可能性がある。本明細書に記載の方法に従って、本発明のポリヌクレオチドにより、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドのタンパク質発現プロファイルを（例えば、マーカーによって支援される育種を介して）モニターし又は操作することができる。
したがって、本発明の一態様は、植物中のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドのプロファイルを変化させる方法を特徴とし、その方法は、植物中のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成する１つ又は複数のポリペプチドの量又は活性を増大又は低下させるステップを含む。例えば、本発明の一実施形態では、その固有の発現調節配列の調節下にあるカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を使用して、植物中のそのポリペプチドの産生を増大させる目的で植物を形質転換する。或いは、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード領域を、構成的又は誘導性プロモーターなどの異種発現調節領域と作動的に連結する。
コーヒー種子中のカロテノイド及びアポカロテノイド産生の増大は、種々の有益な効果を有することが予想される。コーヒーは、カロテノイドに由来する２つの風味構成要素であるα−イオノン及びβ−ダマセノンを含有することが示されており（Ｃｚｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｖａｒｉｙａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、後者は、焙煎前後両方のコーヒーの主要な構成要素として同定されている（Ｏｒｔｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００４）。Ｃｚｅｒｎｙ ｅｔ ａｌ．（２０００）は、焙煎後にβ−ダマセノンが８００倍増大することを明らかにした。その低い臭気の閾値のために、焙煎したコーヒーの芳香を変化させるのにこれら及び他のカロテノイド由来揮発性化合物は少量しか必要とならない。
したがって、コーヒー粒中のカロテノイド含量が増大すると、焙煎過程の間に、芳香に関係するカロテノイド由来揮発性物質が増大することが予想される。焙煎中のβ−ダマセノンの８００倍の増大は、カロテノイド前駆体の温度による分解に起因する可能性が高い。カロテノイドの産生が増大すると、β−ダマセノンが増大するとともに、β−イオノン、プソイドイオノン、ゲラニルアセトン、β−シクロシトラール、シトラールや６−メチル−５−ヘプテン−２−オンなどのコーヒー中で以前には検出されていない新たなアポカロテノイドが形成する可能性がある。他の系、例えばトマトでは、β−カロテンを蓄積する「高ベータ」突然変異体の芳香は、β−カロテンに由来するβ−イオノンによって支配され、一方、主として非環式カロテンを産生するＪｕｂｉｌｅｅ突然変異体は、ゲラニルアセトンを産生することが示されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ， １９７０）。ζ−カロテンなどの非環式カロテンは、ゲラニルアセトンの前駆体であることが示されている（Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ）。したがって、カロテノイド含量の改変又は特定のカロテノイドの改変により、関連するカロテノイド由来揮発性物質が変化する可能性がある。
本発明に従って提供されるポリヌクレオチド及び方法によって、ナツザキフクジュソウ（Ａｄｏｎｉｓ ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ）ケトカロテノイド生合成遺伝子の過剰発現によりβ−カロテン及びゼアキサンチンから形成されるアスタキサンチン（３，３’ジヒドロキシ−４，４’ジケト−β，β−カロテン）などの新規のケトカロテノイドの過剰産生も可能となる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｇａｎｔｔ， ２００５）。アスタキサンチンは癌の予防に関与し（Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、免疫系の増強因子として記載されている（Ｊｙｏｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。アスタキサンチンは、補助食品として、動物及び魚の飼料中で使用される。コーヒー中にそれが存在すると、健康上の利点を与えることができ、焙煎中に新規のアポカロテノイドを形成することができる。
トランスジェニックトマト中のフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）の過剰発現によって、カロテノイド形成のジテルペノイド経路の代謝物が再度誘導された（Ｆｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。すべてのジテルペノイドは、第１のカロテノイドであるフィトエンの前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸に由来する（Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。対象となる２つのジテルペノイドはカフェストール及びカーウェオールであり、これらはエスプレッソコーヒーの健康上の負の影響と関係している。したがって、コーヒー種子中でのＰＳＹの種子特異的過剰発現によって、代謝物を健康上有益なカロテノイドの形成に転用することにより望ましくないジテルペノイド（カフェストール及びカーウェオール）を低下させることができる。
コーヒー植物などの植物における日陰の環境での光収集能力は、植物中のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成する１つ又は複数のポリペプチドの産生を低下させ、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドの発現の低下について天然に存在する変異体をスクリーニングし、或いは種々のカロテノイド又はアポカロテノイドのレベルの低下について天然に存在する変異体をスクリーニングすることによって向上させることができる。例えば、機能欠失（ヌル）突然変異植物は、作製することもでき、又は現在入手可能な植物突然変異体の集団から選択することもできる。本明細書に記載の１つ又は複数の方法を利用して、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路を構成する特定のポリペプチドを過剰発現する突然変異体について突然変異植物集団をスクリーニングできることも当業者には理解されるであろう。化学的突然変異生成、放射線突然変異生成、及びトランスポゾン又はＴ−ＤＮＡの挿入、或いはゲノム中の標的誘導局所損傷（ＴＩＬＬＩＮＧ、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３５（２）：６３０−６３６；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＆ Ｈａｕｇｈｎ，２００５，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：２１１−２１５を参照）によって突然変異体集団を作製することができる。突然変異体集団を作製する方法は当技術分野で周知である。
本発明の核酸を使用して、様々な植物種中でカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成する突然変異ポリペプチドを同定することができる。トランスポゾン挿入系統が入手可能であるトウモロコシやシロイヌナズナなどの種では、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子中の挿入について系統がスクリーニングされるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。次いで、育種を介して、分断された遺伝子についてヘテロ接合性又はホモ接合性である植物系統を生じさせることができる。
突然変異生成技術によって作製されたヌル突然変異体で認められるものと類似した表現型を示す植物を工学的に作製することもできる。カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成する突然変異型の選択されたポリペプチドを発現させて「優性阻害効果」を引き起こすことによって、トランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。任意の一機構に本発明を限定するものではないが、この突然変異タンパク質は、タンパク質又は他の細胞因子との相互作用について野生型タンパク質と競合する。この型の「優性阻害」効果の例は、昆虫と脊椎動物のどちらの系についても周知である（Ｒａｄｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４５：１６３−１７１；Ｋｏｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：４２６−４２８）。
「翻訳後遺伝子サイレンシング」によりカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって、他の種のトランスジェニックヌル突然変異体を作製することができる。下方制御の標的とする種由来の遺伝子、又はその断片を利用して、コードされたタンパク質の産生を調節することができる。完全長アンチセンス分子をこの目的に使用することができる。或いは、翻訳にとって決定的に重要なｍＲＮＡの特定の領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用することができる。所定の遺伝子の発現レベルを低下させるアンチセンス分子の使用は当技術分野で知られている。アンチセンス分子は、転写後にアンチセンスＲＮＡ配列を産生するＤＮＡ構築物で植物細胞を形質転換することによって、ｉｎ ｓｉｔｕで提供することができる。そのような構築物は、完全長の又は部分的なアンチセンス配列が産生されるように設計することができる。大量のｄｓＲＮＡが産生されるように、導入遺伝子により遺伝子コード配列のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡをどちらも過剰発現させることによって、この遺伝子サイレンシング効果を増強することができる（例えば、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ ９５：１３９５９−１３９６４を参照）。これに関して、少なくとも１つのイントロンの一部又は全部と対応する配列を含有するｄｓＲＮＡが特に有効であることが分かっている。一実施形態では、コード配列アンチセンス鎖の一部又は全部は導入遺伝子によって発現される。他の実施形態では、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドのコード配列の一部又は全部のハイブリダイズ用センス及びアンチセンス鎖は、導入遺伝子により発現される。
他の実施形態では、植物の系に現在利用可能である様々な他の翻訳後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）技術の使用によりカロテノイド及びアポカロテノイド遺伝子を発現抑制することができる。ＲＮＡサイレンシングでは、ＲＮアーゼＨに基づく酵素（「ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）」又は「ダイサー様酵素」）により二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をプロセシングして短鎖の２１〜２８ヌクレオチドの断片にする。ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）である切断産物を、配列特異的な形で遺伝子発現を制御するタンパク質エフェクター複合体中に組み込む（植物中のＲＮＡサイレンシングの総説については、Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７２：６５−７３；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，２００４，Ｎａｔｕｒｅ ４３１：３５６−３６３；Ｈｅｒｒ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．３２：９４６−９５１を参照されたい）。
短鎖干渉ＲＮＡを化学的に合成し、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び増幅し、次いでそれを細胞中に送達することができる。送達は、微量注入（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）、化学的トランスフェクション（Ａｇｒａｗａｌ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）、エレクトロポレーション又はカチオン性リポソームが媒介するトランスフェクション（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，２００２）、或いは当業者によって認められる、当技術分野で利用可能な任意の他の手段によるものでよい。或いは、例えばプラスミドを用いて対象とする細胞中にｓｉＲＮＡのＤＮＡ鋳型を挿入することにより細胞内でｓｉＲＮＡを発現させることもでき（Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）、選択した細胞を特異的に標的とすることもできる。短鎖干渉ＲＮＡは植物中に導入することに成功している（Ｋｌａｈｒｅ Ｕ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
本発明で好ましいＲＮＡサイレンシング方法は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用である。特定の所望されるｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターを、任意の一般的な手段によって標的細胞中に送達する。細胞中に入った後、ＤＮＡ配列はＲＮＡ分子へと継続的に転写され、それは折り重なり分子内塩基対形成を介してヘアピン構造を形成する。これらのヘアピン構造は、細胞によりプロセシングを受けた後、ｓｉＲＮＡ分子と同等となり、細胞により使用されて所望のタンパク質のＲＮＡサイレンシングを媒介する。植物中のＲＮＡサイレンシングについて特に有用な種々の構築物は、上記のＨｏｒｉｇｕｃｈｉ，２００４に記載されている。典型的には、そのような構築物は、プロモーター、「センス」方向のサイレンシングされる標的遺伝子の配列、スペーサー、標的遺伝子配列のアンチセンス、及び転写終結配列を含む。
「同時抑制」の技術によって、さらに他の型の合成ヌル突然変異体を作製することもできる（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６（６）：６５１−６５９）。抑制の標的とする内因性遺伝子のコピーで植物細胞を形質転換する。多くの場合、この結果、天然の遺伝子並びに導入遺伝子が完全に抑制される。一実施形態では、対象とする植物種由来の、カロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、それを使用してその同じ種の細胞を形質転換する。
本発明によれば、上記の方法のいずれかによって産生された突然変異又はトランスジェニック植物も特徴とする。好ましくは、植物は稔性であり、それによって育種の目的に有用となる。したがって、突然変異体或いは１つ又は複数の上記の望ましい表現型を示す植物を植物の育種に使用することもでき、或いは農業又は園芸への適用で直接使用することもできる。それらは、色素及び光合成と関係するコーヒー種子の風味、芳香及び他の特徴におけるカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路を構成するポリペプチドの関与をさらに解明するための研究ツールとしても有用となる。増強された又は組合せの表現型を有する植物を産生するために、１つの導入遺伝子又は特定の突然変異を含有する植物を、相補的な導入遺伝子又は遺伝子型を含有する植物と交雑することもできる。
本発明はまた、種子優先的又は種子特異的な形で、植物中で任意の選択された異種遺伝子産物を産生する組成物及び方法も特徴とする。対象とするコード配列を、カロテノイド又はアポカロテノイドタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターなどの種子特異的コーヒープロモーター或いは他の適当な制御性配列の調節下に置いて、種子特異的キメラ遺伝子を作製する。本明細書に記載の又は当技術分野で知られている形質転換法のいずれかによってキメラ遺伝子を植物細胞中に導入する。これらのキメラ遺伝子及び方法を使用して、それだけに限らないが、（１）上記で列挙したＧＦＰやＧＵＳなどの検出可能な遺伝子産物；（２）その酵素活性によって微量栄養素（例えば、ベータ−カロテンとしても知られるプロビタミンＡ）又は抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、オメガ脂肪酸、リコペン、イソプレン、テルペン）が産生されるものなどの、農業又は園芸上の利点を付与する遺伝子産物；或いは（３）Ｍｏｕｒｇｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），ＴｉｂＴｅｃｈ １６：２０３−２１０に記載されているような病原体若しくは害虫を調節する遺伝子産物、又は植物の種子に対して保護的であり若しくは病原体に対して有害であることが知られている他のものを含めて、対象とする様々な遺伝子産物を植物中で産生することができる。
下記の実施例を提供して、本発明をより詳細に例示する。実施例は本発明を例示するものでありそれを限定するものではない。
実施例１
以下の実施例のための材料及び方法
植物材料。生育の種々の段階にある新しく収穫した根、若葉、茎、花及び果実を、温室条件下（２５℃、７０ＲＨ）で生育したコフィアアラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ） Ｌ．ｃｖ．Ｃａｔｕｒｒａ Ｔ−２３０８及びコフィアカネフォラ ｖａｒ．ＢＰ４０９、並びにインドネシア、東ジャワの畑で成長したコフィアカネフォラ ＢＰ−４０９から収穫した。生育段階は、次のように定義する：小緑色果実（ＳＧ）、大緑色果実（ＬＧ）、黄色果実（Ｙ）及び赤色果実（Ｒ）。新鮮な組織を、液体窒素中で迅速に凍結させ、ＲＮＡ抽出に用いるまで−８０℃にて保存した。
全長ｃＤＮＡ配列のクローニング：コフィアカネフォラからのフィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）の５’上流領域を、Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びプライマーＧＷＰＳＹ１（５’−ＡＣＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣ−３’）（配列番号２６）を用い、続いてプライマーＧＷＰＳＹ２（５’−ＴＴＣＡＣＧＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号２７）を用いるネステッドＰＣＲにより回収した。ＰＣＲ反応物は、１×緩衝液及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰと、１単位のＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃｏｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ、ベルギー）と、２００ｎＭのプライマーＧＷＰＳＹ１及び２００ｎＭのプライマーＡＰ１（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキット）（配列番号２８）を含んでいた。反応混合物を、９４℃にて１０分間、続いて９４℃にて２５秒間／７２℃にて４分間の７増幅サイクル、次いで９４℃にて２５秒間／６７℃にて４分間の３２増幅サイクルでインキュベートした。ＰＣＲ反応物を、滅菌蒸留水で１／２００に希釈し、２００ｎＭのネステッドプライマーＧＷＰＳＹ２及び２００ｎＭのネステッドプライマーＡＰ２（５’−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’；Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキット）（配列番号２９）を用いる２回目のＰＣＲ反応に用いた。ネステッドＰＣＲは、９４℃にて１０分間、続いて９４℃にて２５秒間／７２℃にて４分間の５増幅サイクル、次いで９４℃にて２５秒間／６７℃にて４分間の２２増幅サイクルでインキュベートした。約１．８ｋｂのバンドをＰＣＲの後に回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４−ＧＷＰＳＹ１を作製し、このプラスミドの挿入断片を配列決定して、配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの組立の後に、全長ＯＲＦ ＰＳＹを回収した。
Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキットを用いて、ビオラキサンチンデエポキシダーゼの５’領域を、プライマーＧＷＶＤＥ１（５’−ＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＣＡＣＡＣＴＣ−３’）（配列番号３０）を用い、続いてプライマーＧＷＶＤＥ２（５’−ＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣ−３’）（配列番号３１）を用いるネステッドＰＣＲにより、コフィアカネフォラから回収した。約２．３ｋｂのバンドを回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４−ＧＷＶＤＥを作製し、このクローンの挿入断片を配列決定して、ＶＤＥについての全長ＯＲＦを作製した。ＯＲＦは、ＯＲＦの２８２位及び４４７位にそれぞれ、１２８ｂｐ及び８４１ｂｐの２つのイントロンを含んでいた。配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの組立の後に１２４８ｂｐのＯＲＦを、プライマーＶＤＥＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＣ−３’）（配列番号３２）及びＶＤＥＲＥＶ（５’−ＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧＣＴＴＣＣＴＡＡＴＴＧＧ−３’）（配列番号３３）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより再クローニングし、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＥＮＴＲ−ＣｃＶＤＥを作製した。このクローンを、次いで、配列決定により確認した。
Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキットを用いて、ＣＣＤ１の欠損された５’領域を、ネステッドプライマーＧＷＣＣＤ１１（５’−ＡＡＣＡＡＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＣ−３’）（配列番号３４）及びＧＷＣＣＤ１２（５’−ＧＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣＧ−３’）（配列番号３５）を用いて回収した。２４７５ｂｐの断片を回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯに挿入してｐＣＲ４−ＧＷＣＣＤ１ ＃１を作製して、このクローンの挿入断片を配列決定して、ＯＲＦの２３７位、３０９位及び３２４位にそれぞれ１６０４ｂｐ、２６７ｂｐ及び６０５ｂｐの３つのイントロンを含むＣＣＤ１についての伸長された長さのコード配列が作製された。このステップは、全長コード配列を生成しなかったので、２回目のゲノム歩行を、ネステッドプライマーＧＷＣＣＤ１３（５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＡＧＧＣ−３’）（配列番号３６）及びＧＷＣＣＤ１４（５’−ＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号３７）を用いて行った。このゲノム歩行ステップは、１０４５ｂｐの断片をもたらし、これをｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４−ＧＷＣＣＤ１＃２を作製し、このクローンの挿入断片を配列決定した。全長コード配列は、２つの重複するｇｅｎｅｗａｌｋｅｒ配列及びＥＳＴ配列（ｃｃｃｗｃ２２ｗ２ａ６）から作製した。配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの組立の後に、１６４７ｂｐのＯＲＦを、プライマーＣＣＤ１ＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号３８）及びＣＣＤ１ＲＥＶ（５’−ＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号３９）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより再クローニングし、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてｐＥＮＴＲ−ＣｃＣＣＤ１を作製した。このクローンを、次いで、配列決定した。
Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキットを用い、ネステッドプライマーＧＷＮＣＥＤ３Ｆ（５’−ＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣ−３’）（配列番号４０）及びＧＷＮＣＥＤ３Ｒ（５’−ＴＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣ−３’）（配列番号４１）を用いて、全長コード配列ＮＣＥＤ３を得た。この作製された２．５ｋｂの断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＮＣＥＤ＃４を作製した。このクローンの挿入断片を配列決定して、ＡＴＧの上流１９０８ｂｐ及び１１０４ｂｐに全長オープンリーディングフレームが得られた。その他の報告されているＮＣＥＤと矛盾することなく、ＣｃＮＣＥＤ３はイントロンを含まない。
ＯＲＦのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの組立は、プライマーＮＣＥＤ３ＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＣ−３’）（配列番号４２）及びＮＣＥＤ３ＲＥＶ（５’−ＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣａＧＴＴＣＣＡＧＧＣ−３’）（配列番号４３）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより確認される。ＣｃＮＣＥＤ３を、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてｐＥＮＴＲ−ＣｃＮＣＥＤ３を作製し、このクローンを、次いで、配列決定により確認する。
全長β−カロテンヒドロキシラーゼのｃＤＮＡを、粒から、プライマーβＣＨＹＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴＣ−３’）（配列番号４４）及びβＣＨＹＲＥＶ（５’−ＣＡＡＧＴＴＧＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＴＡＡ−３’）（配列番号４５）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより回収し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＥＮＴＲ−ＣｃβＣＨＹを作製した。このクローンは、配列決定により確認した。
縮重プライマーを用いるｃＤＮＡ単離
ＰＤＳについてＥＳＴデータベースを検索すると、対応する配列は見つからなかった。しかし、８９７ｂｐの部分長ｃＤＮＡを、黄色ロブスタ粒から、縮重プライマーＤｅｇＰＤＳ２ ＦＷＲ（５’−ＧＧＴＧＧＡＡＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡ−３’）（配列番号４６）及びＤｅｇＰＤＳ４ ＲＥＶ（５’−ＴＧＴＴＡＣＲＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＣＡＣ−３’）（配列番号４７）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより回収し、これは、ＬｅＰＤＳ（ＣＡＡ５５０７８）、ＣａＰＤＳ（ＣＡＡ４８１９５）及びＡｔＰＤＳ（ＡＡＡ２０１０９）の相同分子種に見出される保存ペプチド配列ＧＧＫＶＡＡＷ（配列番号４８）及びＶＹＡＤＭＳＶＴ（配列番号４９）に対応した。ｃＤＮＡを作製するために、ＰＣＲを次のようにして行った：９４℃にて３分間、続いて９４℃にて１分間；６０〜５０℃にて３０秒間（温度はサイクルあたり１℃低下させる）；７２℃にて２分間を１０サイクル、続いて９４℃にて１分間；５０℃にて３０秒間；７２℃にて２分間をさらに２５サイクル。
Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキットを用いて、ＰＤＳの部分コード配列を、ネステッドプライマーＧＷＰＤＳ１（５’−ＡＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号５０）及びＧＷＰＤＳ２（５’−ＴＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧ−３’）（配列番号５１）を用いて伸長した。このことにより２０６６ｂｐの断片を作製した。この断片を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＰＤＳ＃５を作製した。このクローンの挿入断片を配列決定して、追加の２２５ｂｐのコード配列と、部分ＯＲＦの１２２ｂｐ位、２１５ｂｐ位及び２７２ｂｐ位にそれぞれ６１６ｂｐ、３７３ｂｐ及び６０９ｂｐの３つのイントロンを含む１０７７ｂｐの部分ＯＲＦとが得られた。
ＺＤＳについて、ＥＳＴデータベースには対応する配列は検出されなかった。しかし、４７２ｂｐの部分ｃＤＮＡクローンを、非縮重プライマーＤｅｇＺＤＳ１ ＦＷＲ（５’−ＴＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧ−３’）（配列番号５２）及びＤｅｇＺＤＳ３ ＲＥＶ（５’−ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＴ−３’）（配列番号５０）を用いて回収し、これはゼータ−カロテンデサチュラーゼの相同分子種であるＬｅＺＤＳ（ＡＦ１９５５０７）、ＣａＺＤＳ（Ｘ８９８９７）及びＡｔＺＤＳ（Ｕ３８５５０）における保存アミノ酸配列ＬＡＧＭＳＴＡＶ（配列番号５４）及びＭＷＤＰＶＡＹＡＬ（配列番号５５）をコードしていた。この部分ｃＤＮＡクローンを回収するのに用いるコーヒーのｃＤＮＡを、黄色の段階のロブスタ粒から作製した。ＰＣＲ条件は、ＰＤＳ ｃＤＮＡのクローニングに用いたものと同じである（上記）。得られた部分ｃＤＮＡ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＣｃＺＤＳ＃１を作製した。
全ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの作製：
−８０℃にて貯蔵した植物組織試料を、粉末にすりつぶし、この粉末から、Ｌｅｐｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．により記載された方法（これはＨＱＴ／ＨＣＴ参照である）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮＡを除去するために、試料を、「Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ」キットを製造者の指示書に従って用いてＤＮアーゼで処理した。すべてのＲＮＡ試料を、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動により分析した。リボソームＲＮＡのバンドを、エチジウムブロミド染色により視覚化した。
オリゴ（ｄＴ２０）をプライマーとして用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）のプロトコルに従って、約４μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡ調製物中のゲノムＤＮＡの混入の存在を試験するために、特定の遍在的に発現されるコーヒーｃＤＮＡであるカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）の既知のイントロンにまたがるように、プライマー対を設計した。ＲＴ−ＰＣＲは、元のＲＮＡの０．１μｇに相当するｃＤＮＡの１０倍希釈を用いて行った。通常のＰＣＲ反応物は、１×緩衝液及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１単位のポリメラーゼ、並びに３５サイクル用の８００ｎＭの各遺伝子特異的プライマーＦＷＤ−ＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＡＴＴＣＴＧＴＴ（配列番号５６）及びＲＥＶ−ＣＣＣＣＧＴＣＧＧＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＣ（配列番号５７）を含んでいた。ＰＣＲの後に、２７２ｂｐのｃＤＮＡバンドが観察された。７５０ｂｐでのｃＤＮＡ＋イントロンに対応するであろう第２のバンドは観察されず、試料中にゲノムＤＮＡが存在しないことを示した（データ示さず）。これらのＲＮＡ試料を、上記の方法に従って、全長ＯＲＦ配列を作製するために後で用いた。これらのＯＲＦを、続いて、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
定量ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲを、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により推奨されるプロトコルを用い、ｃＤＮＡを用いて行った。すべての反応は、１×ＴａｑＭａｎ緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、並びに５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに０．６２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲは、それぞれ８００ｎＭのフォワード及びリバースの遺伝子特異的プライマー、ＴａｑＭａｎプローブについては２００ｎＭ、並びに０．００１μｇの元のＲＮＡに相当する１０００倍希釈のｃＤＮＡを用いて行った。プライマー及びプローブは、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：表１を参照されたい）を用いて設計した。プライマー及びプローブの交差特異性を、表４にまとめる。反応混合物を、５０℃にて２分間、次いで９５℃にて１０分間、続いて９５℃にて１５秒間／６０℃にて１分間の４０増幅サイクルでインキュベートした。試料を、ＧｅｎｅＡｍｐ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。転写産物のレベルは、対照遺伝子ｒｐｌ３９のレベルで標準化した。
表１．リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで用いたプライマー及びプローブ。右側の欄は、単位複製配列の大きさを示す。

全ての配列は、５’から３’で示す。
(１)ＭＧＢプローブは、５’末端にて蛍光レポーター色素である６−カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)で、及び３’末端にて消光色素である６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン(ＴＡＭＲＡ)で標識した。
(２)ＲＰＬ３９プローブは、５’末端にて蛍光レポーター色素であるＶＩＣで、及び３’末端にて消光剤であるＴＡＭＲＡで標識した。
Ｅ．ｃｏｌｉでの選択されたｃＤＮＡの機能評価：
いくつかのコードされたタンパク質の機能性を、Ｅ．ｃｏｌｉのカロテノイド蓄積株で、完全ＯＲＦ配列を含む対応するｃＤＮＡの同時発現により試験した。全長Ｃｏｆｆｅａ ＣＣＤ１を、プライマーＣＣＤ１ＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号３８）及びＣＣＤ１ＲＥＶ（５’−ＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＣＡＧＣ−３’）（配列番号３９）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより粒から回収し、ゲートウェイベクターｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてｐＥＮＴＲ−ＣｃＣＣＤ１を作製した。クローンｐＥＮＴＲ−ＣｃＣＣＤ１の配列は、以前のｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ配列のものと同一であった。ＣＣＤ１のＯＲＦを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されるようにして組換えにより、ゲートウェイ細菌発現ベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移して、ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃＣＣＤ１を作製した。
同時に、全長Ｃｏｆｆｅａ βＣＨＹを、プライマーβＣＨＹＦＷＲ（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴＣ−３’）（配列番号４４）及びβＣＨＹＲＥＶ（５’−ＣＡＡＧＴＴＧＣＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＴＡＡ−３’）（配列番号４５）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより粒から回収し、ｐＥＮＴＲ／Ｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＥＮＴＲ−ＣｃβＣＨＹを作製し、次いで配列決定した。βＣＨＹのＯＲＦを、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されるようにして組換えにより、ゲートウェイ細菌発現ベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移して、ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃβＣＨＹを作製した。
それぞれリコペン、β−カロテン及びゼアキサンチンの形成を担うＥｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａの特定の組の機能的カロテノイド生合成遺伝子を含むプラスミドｐＡＣ−ＬＹＣ、ｐＡＣ−ＢＥＴＡ及びｐＡＣ−ＺＥＡＸ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｇａｎｔｔ，２００１）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＡＩ株に、上記のｐＤＥＳＴ１７−ＣｃＣＣＤ１又はｐＤＥＳＴ１７−ＣｃβＣＨＹ構築物のいずれかと同時形質転換した。クロラムフェニコール（ｐＡＣプラスミド）及びアンピシリン（ｐＤＥＳＴ１７プラスミド）の添加により両方の組のプラスミドを含むように選択されるそれぞれの株の３ｍｌの一晩の培養物を用いて、適切な抗生物質と０．２％グルコースとを含む５０ｍｌのＬＢ培地に接種した。培養物は、２８℃にて、６００ｎｍでの吸光度に対応する細胞密度が０．５に到達するまで増殖させた。タンパク質の発現は、０．２％のアラビノースの添加により誘導し、培養物を２８℃にて一晩増殖させた。２ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養物を遠心分離し、細胞ペレットを撮影した（図６Ａ及び７Ａ）。残りのＥ．ｃｏｌｉ培養物を遠心分離し、細胞ペレットを等容量のホルムアルデヒドに再懸濁した。次いで、等容量のメタノール、続いて２容量の酢酸エチルを加えた。水の添加により相を分離し、酢酸エチル相をＨＰＬＣ分析のために確保した。酢酸エチルを真空下で蒸発させ、以下に記載するようにしてＨＰＬＣにより分析した。
カロテノイド分析：
カロテノイドを分析し定量するために用いた方法は、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記載されている。典型的には、粒組織を粉末にすりつぶし、凍結乾燥させ、１０〜５０ｍｇの分割量を、メタノール：クロロホルム（容量で１：３）を用いて抽出し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０（２容量）に対して分配した。水相を、２回再抽出した。ＨＰＬＣによる分離を、ノースカロライナ、ウィルミントンのＹＭＣから購入したＣ３０逆相カラム（２５０×４．６ｍｍ）で行った。用いた移動相は、メタノール（Ａ）、０．２％酢酸アンモニウムを含有した、水／メタノール（容量で２０／８０）（Ｂ）及びｔｅｒｔ−メチルブチルエーテル（Ｃ）であった。用いた勾配は、均一濃度で１２分間の９５％Ａ／５％Ｂ、１２分での８０％Ａ／５％Ｂ／及び１５％Ｃへのステップ、続いて３０分間の３０％Ａ／５％Ｂ／６５％Ｃへの直線勾配であった（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
実施例２
コフィアカネフォラからのカロテノイド生合成経路遺伝子の単離及び同定
カロテノイド生合成経路の遺伝子及びカロテノイド由来のアポカロテノイドの形成に関わる遺伝子についての最長の入手可能なｃＤＮＡを表すＥＳＴを適切なライブラリから単離して、配列決定した。完全に配列決定したｃＤＮＡを、次いで、既知の配列との相同性について分析し、以下のように命名した：フィトエンシンターゼ（ＰＳＹ）（ｃｃｃｓ３０ｗ７ｅ６）、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ＢＣＨ）（ｃｃｃｓ４６ｗ２１ｂ８）、リコペンε−シクラーゼ（ＬεＣＹ）（ｃｃｃｐ８ｆ１６）、ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ）（ｃｃｃｐ１２９ｇ１５）、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）（ｃｃｃｐ１３ａ９）、及びカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１（ＣＣＤ１）（ｃｃｃｗｃ２２ｗ２ａ６）。カロテノイドの貯蔵に関わるフィブリリン（ＦＩＢ）構造タンパク質（ｃｃｃｓ１６ｗ１５ｅ１４）、及び色素体ターミナルオキシダーゼの相同分子種、カロテノイド不飽和化の補因子（ＰＴＯＸ；ｃｃｃｌ２４ｏ１０）及び推定上のリコペンε−シクラーゼ（ＬεＣＹ）（ｃｃｃｐ８ｆ１６）をコードするさらなるＥＳＴも同定した。関連するＥＳＴの数及び分布を、表２に示す。

ＰＳＹ：フィトエンシンターゼ；ＰＴＯＸ：色素体ターミナルオキシダーゼ；βＣＨＹ：β−カロテンヒドロキシラーゼ；ＬεＣＹ：リコペンε−シクラーゼ；ＺＥＰ：ゼアキサンチンエポキシダーゼ；ＶＤＥ：ビオラキサンチンデエポキシダーゼ；ＮＣＥＤ３：９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ；ＣＣＤ１：カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１；ＦＩＢ：フィブリリン；ＰＤＨ：フィトエンデヒドロゲナーゼ様。
Ａ．フィトエンシンターゼ
最初の真のカロテノイドは、ゲラニルゲラニルジホスフェート２分子のフィトエンへの縮合により形成され、酵素フィトエンシンターゼ（ＰＳＹ；ＥＣ２．５．１．３２）により触媒される。ＰＳＹをコードする部分長ｃＤＮＡクローン（ｃｃｃｓ３０ｗ７ｅ６）を、コーネル コフィアカネフォラ ＥＳＴデータベースで同定した。このクローンはＯＲＦの５’末端を欠損しているので、ゲノム歩行を用いて欠損している２５８ｂｐの５’配列を回収した。ネステッドプライマーＧＷＰＳＹ１（５’−ＡＣＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣ−３’）（配列番号２６）及びＧＷＰＳＹ２（５’−ＴＴＣＡＣＧＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣ−３’）（配列番号２７）を用いて、約１８００ｂｐ長の断片を回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４−ＧＷＰＳＹ１を作製し、配列決定した。配列のｉｎ“ｓｉｌｉｃｏ”での組立により、ＰＳＹの全長ＯＲＦが明らかになった。表３に示すように、ＣｃＰＳＹの導き出されたアミノ酸配列は、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ ＰＳＹ１（Ｘ６８０１７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９３）に対して７６％の同一性、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ＰＳＹ１（Ｘ６０４４１；Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２）に対して７４％の同一性、及びシロイヌナズナ ＰＳＹ（ＮＭ＿１２１７２９）に対して７０％の同一性を有すると決定された。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
ＰＳＹによる２分子のゲラニルゲラニルジホスフェートのフィトエンへの縮合は、いくつかの異なる植物種及び異なる生育段階での組織において律速反応であることが見出されている。粒特異的な様式でのＰＳＹの過剰発現は、よって、コーヒー粒中のカロテノイド及びカロテノイド由来風味分子の過剰生産に有用であると予測される。ＰＳＹの種子特異的過剰発現は、他の種でも行われている。例えば、シロイヌナズナでのＰＳＹの種子特異的過剰発現は、カロテノイドの増加、クロロフィル含量の増加、発芽の遅延、及びＡＢＡの増加を導いた（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。イネ胚乳でのＰＳＹ及び細菌のフィトエンデサチュラーゼ（ＣＲＴＩ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来）の種子特異的過剰発現は、β−カロテン合成及びさらに下流のキサントフィルの形成を駆動することが示された（Ｂｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐａｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。アブラナ種子でのＰＳＹの過剰発現は、カロテノイド生産の５０倍増加を導いた（Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
図４Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの最も相同性が高い配列と整列させたコフィアカネフォラ（ＣｃＰＳＹ）アミノ酸配列を示す。
Ｂ．フィトエンデサチュラーゼ、ζ−カロテンデサチュラーゼ及びリコペンシクラーゼ
フィトエンは、酵素フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ；ＥＣ １．３．９９）及びζ−カロテンデサチュラーゼ（ＺＤＳ；ＥＣ １．１４．９９．３０）により触媒される４つの連続する不飽和化ステップを受け得る（Ｂａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｈｕｇｕｅｎｅｙ ｅｔ ａｔ．，１９９２；Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらの不飽和化ステップは、補因子として色素体ターミナルオキシダーゼ（ＰＴＯＸ）の存在を必要とする。
ｉ）フィトエンデヒドロゲナーゼ
ＰＤＳ又はＺＤＳについて、対応する配列はＥＳＴデータベースで検出されなかった。しかし、フィトエンデヒドロゲナーゼ様（ＰＤＨ）タンパク質をコードする２つの部分長クローン（ＰＤＨ、ｃｃｃｌ３１ｇ２２；ＰＤＨ２、ｃｃｃｓ４６ｗ１３ｎ１９）が検出された。コーヒーのＰＤＨ１は、シロイヌナズナ ＰＤＨ様と７２％の相同性、及びＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ ＰＤＨタンパク質と２３％の相同性を有することが見出された。Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ ＰＤＨタンパク質は、フィトエンに４つの二重結合を導入してリコペンを形成でき、よって、ＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓにおいてＰＤＳ及びＺＤＳを置換できる（Ａｒｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１；図１を参照されたい）。このタンパク質は、１又は複数のコーヒー組織で同様の機能を行うと考えられている。
ｉｉ）フィトエンデサチュラーゼ
ＰＤＳについてのクローンがコーヒーのＥＳＴライブラリで見つかったので、ＰＤＳのｃＤＮＡクローンを新たに作製する実験を行った。これらの実験により、黄色ロブスタ粒から作製したｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲを用いて、８９７ｂｐのＰＤＳの部分ｃＤＮＡを作製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＬｅＰＤＳ（ＣＡＡ５５０７８）、ＣａＰＤＳ（ＣＡＡ４８１９５）及びＡｔＰＤＳ（ＡＡＡ２０１０９）で見出される保存ペプチド配列ＧＧＫＶＡＡＷ（配列番号４８）及びＶＹＡＤＭＳＶＴ（配列番号４９）から設計した縮重プライマーＤｅｇＰＤＳ２ ＦＷＲ（５’−ＧＧＴＧＧＡＡＡＧＲＴＡＧＣＴＧＣＡＴＧＧＡ−３’）（配列番号４６）及びＤｅｇＰＤＳ４ ＲＥＶ（５’−ＴＧＴＴＡＣＲＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＡＴＡＣＡＣ−３’）（配列番号４７）を用いて行った。８９７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＰＤＳを作製した。Ｇｅｎｅｗａｌｋｅｒキットを用いて、ＰＤＳの部分コード配列を、ネステッドプライマーＧＷＰＤＳ１（５’−ＡＴＣＡＴＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣ−３’）（配列番号５０）及びＧＷＰＤＳ２（５’−ＴＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＣＡＧＧ−３’）（配列番号５１）を用いて伸長して、２０６６ｂｐの断片を作製した。この断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＰＤＳ＃５を作製した。得られたクローンを配列決定して、追加の２２５ｂｐのコード配列と、部分オープンリーディングフレームの１２２ｂｐ位、２１５ｂｐ位及び２７２ｂｐ位にそれぞれ６１６ｂｐ、３７３ｂｐ及び６０９ｂｐの３つのイントロンを含む１０７７ｂｐの部分ＯＲＦとが得られた。図４Ｂは、プラスミドｐＣＲ４−ＣｃＰＤＳ及びｐＣＲ４−ＧＷＰＤＳ＃５から導き出されるコフィアカネフォラ（ＣｃＰＤＳ）の部分ＰＤＳアミノ酸配列を示す。部分ＯＲＦを、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベース中の最も相同性が高い配列と整列させた。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、コフィアカネフォラからの部分ＰＤＳ配列及び相同分子種からの対応する領域を用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
ｉｉｉ）ゼータ−カロテンデサチュラーゼ
ＺＤＳについてのクローンがコーヒーのＥＳＴライブラリで見つからなかったので、ＺＤＳのｃＤＮＡクローンを新たに作製する実験を行った。これらの実験により、黄色ロブスタ粒から作製したｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲを用いて、４７２ｂｐのＺＤＳの部分ｃＤＮＡを作製した。ＲＴ−ＰＣＲは、ＬｅＺＤＳ（ＡＦ１９５５０７）、ＣａＺＤＳ（Ｘ８９８９７）及びＡｔＺＤＳ（Ｕ３８５５０）相同分子種の保存ペプチド配列ＬＡＧＭＳＴＡＶ（配列番号５４）及びＭＷＤＰＶＡＹＡＬ（配列番号５５）から設計した非縮重プライマーＤｅｇＺＤＳ１ ＦＷＲ（５’−ＴＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＧＣＴＧ−３’）（配列番号５２）及びＤｅｇＺＤＳ３ ＲＥＶ（５’−ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＴ−３’）（配列番号５３）を用いて行った。
４７２ｂｐのＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＺＤＳ＃１を作製した。図４Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの最も相同性が高い配列と整列させた、プラスミドｐＣＲ４−ＣｃＺＤＳ＃１から導き出されるコフィアカネフォラ（ＣｃＺＤＳ）部分ＺＤＳアミノ酸配列を示す。表５は、重複する領域の図４Ｃの配列の％同一性を示す。相同性のレベルが高いことは、ｐＣＲ４−ＣｃＺＤＳ＃１がコフィアカネフォラのＺＤＳ遺伝子ＣｃＺＤＳをコードする部分ｃＤＮＡをコードするという考えと矛盾しない。この遺伝子の残りの５’及び３’コード領域は、５’及び３’ＲＡＣＥ並びにプライマー支援歩行の公知の技術を用いて得ることができる。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、コフィアカネフォラからの部分ＺＤＳ配列及び相同分子種からの対応する領域を用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
ｉｖ）色素体ターミナルオキシダーゼ
フィトエン不飽和化の補因子であるＰＴＯＸ（ｃｃｃｌ２４ｏ１０）をコードする全長ｃＤＮＡクローン（Ｃａｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｊｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０００；概説としてＫｕｎｔｚ，２００４を参照されたい）を、Ｃ．カネフォラのＥＳＴデータベースで検出した。最も相同性が高いＧｅｎＢａｎｋ配列とのＰＴＯＸのアラインメントにより、トマト（ＡＦ１７７９８０）に対して６０％の相同性、コショウ（ＡＦ１７７９８１）に対して６１％の相同性、及びシロイヌナズナ（ＡＪ００４８８１）ＰＴＯＸタンパク質に対して４６％の相同性が明らかになった（表６を参照されたい）。Ｃ末端アミノ酸配列を、ＮＣＢＩデータベース中の３つの最も近縁の配列と整列させた。アラインメントは、図４Ｄに示す。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
リコペン自体は、９’１０開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ１；Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ）を介してプソイドイオノン（図２Ｖ）の、及び５’６開裂ジオキシゲナーゼ（ＣＣＤ４；Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）を介して６−メチル−５−ヘプテン−２−オン（ＭＨＯ）の前駆体である。ＭＨＯ及びプソイドイオノンはともに、トマト果実風味の強力な寄与物質である（Ｂｕｔｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。いずれの特定の理論にも結び付けられることを意図しないが、現在までにどちらもコーヒー粒で検出されていないが、これらのカロテノイド由来生成物は、これらがコーヒー中のより豊富に存在する他の揮発性物質とともに同時溶出されるので検出されないのだろうと考えられる。
β−カロテンは、炭素鎖の末端に２つのβ環構造を導入する酵素リコペンβ−シクラーゼ（ＬβＣＹ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）により形成され、α−カロテンは、１つのε環と１つのβ環とをそれぞれ導入する酵素リコペンε−シクラーゼ（ＬεＣＹ；Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）及びＬβＣＹにより形成される。推定上のコーヒーＬεＣＹ（ｃｃｃｐ８ｆ１６）についての対応するｃＤＮＡは、ネスレ−コーネル Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定されている。
Ｃ．β−カロテンヒドロキシラーゼ
酸化されたカロテノイドは、２つの連続するヒドロキシル化ステップにより形成される。β−カロテンは、酵素β−カロテンヒドロキシラーゼ（βＣＨＹ；ＥＣ １．１４．１３−；Ｓａｎｄｍａｎｎ，１９９４）の作用によりゼアキサンチンに変換され、α−カロテンは、βＣＨＹとε−カロテンヒドロキシラーゼ（εＣＨＹ）との作用によりルテインに変換される。εＣＨＹは、最近クローニングされたばかりであり（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｉａｎ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ，２００４；概説としてＩｎｏｕｅ，２００４を参照されたい）、ルテイン欠損変異体（ｌｕｔ１）が特徴決定されている（Ｐｏｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｔｉａｎ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ，２００１）。
Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｙ１４８０９；Ｈｉｒｓｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）βＣＨＹに対して７３％の同一性、及びＡ．ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＭ＿１２４６３６）βＣＨＹに対して６７％の同一性を有するタンパク質をコードする全長クローン（ｃｃｃｓ４６ｗ２１ｂ８）＋イントロンが、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定された（表７を参照されたい）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｅは、表７に示すＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの最も相同性が高い配列と整列させたＣｃβＣＨＹアミノ酸配列を示す。
Ｄ．リコペンε−シクラーゼ
リコペンは、２つの酵素リコペンε−シクラーゼ（ＬεＣＹ；Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）とリコペンβ−シクラーゼ（ＬβＣＹ）との活性により、α−カロテン（β，ε−カロテン、図１Ｅ）及びβ−カロテンに変換される。ＬεＣＹは、１つのε環を導入し、ＬβＣＹは、１つのβ環を導入して、α−カロテンを形成する。ＬεＣＹの活性も、１つのε環と１つの閉環されていないプサイ末端とを有する中間体であるδ−カロテン（ε，Ψ−カロテン）の形成をもたらす。Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（レタス）のような植物においては、ＬεＣＹは、炭素鎖の末端に２つのε環構造を導入して、ε−カロテン（ε，ε−カロテン；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｇａｎｔｔ ２００１）の形成をもたらす（図１Ｆ）。
Ｔ．ｅｒｅｃｔａ（ＡＦ２５１０１６；Ｍｏｅｈｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）βＬεＣＹに対して８６％の同一性、及びＬ．ｓａｔｉｖａ（ＡＦ３２１５３８；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００１）ＬεＣＹに対して７７％の同一性を有するタンパク質のＣ末端ドメインを表す部分ｃＤＮＡ（ｐｃｃｃｐ８ｆｌ６）が、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定されている（表８）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、コフィアカネフォラからの部分ＬεＣＹ配列及び相同分子種からの対応する領域を用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｆは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの最も相同性が高い配列と整列させたＣ末端部分ＣｃＬεＣＹアミノ酸配列を示す。
Ｅ．ゼアキサンチンエポキシダーゼ及びビオラキサンチンデエポキシダーゼ
ゼアキサンチンのヒドロキシル化されたβ環は、環境光条件の変化への色素体の適合に関わる可逆的サイクルにおいて、酵素ゼアキサンチンエポキシダーゼ（ＺＥＰ；Ｍａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）によりエポキシ化され、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（ＶＤＥ）の活性により脱エポキシ化される。ＶＤＥ（ｃｃｃｐ１３ａ９）及びＺＥＰ（ｃｃｃｌ２９ｇ１５）の両方についての部分ｃＤＮＡクローンは、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定された。
コフィアカネフォラのＺＥＰ（ＣｃＺＥＰ）の推定Ｃ末端アミノ酸配列を、最も相同性が高いＧｅｎＢａｎｋ配列と整列させ、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（Ｚ８３８３５；Ｂｕｒｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）ＺＥＰのＣ末端アミノ酸配列に対して７２％の相同性、及びＰｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ（ＡＦ１５９９４８；Ｍｂｅｇｕｉｅ−Ａ−Ｍｂｅｇｕｉｅ ａｎｄ Ｆｉｌｓ−Ｌｙｃａｏｎ，２０００）ＺＥＰのＣ末端アミノ酸配列に対して７１％の相同性、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＡＢ０５０８８４；Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２００１）ＺＥＰのＣ末端アミノ酸配列に対して６０％の相同性、及びシロイヌナズナ（ＮＭ＿１２６１０３）ＺＥＰのＣ末端アミノ酸配列に対して５２％の相同性を有するタンパク質をコードすることが見出された（表９）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、コフィアカネフォラからの部分ＺＥＰ配列及び相同分子種からの対応する領域を用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｇは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの最も相同性が高い配列と整列させたＮ末端部分ＣｃＺＥＰアミノ酸配列を示す。
ＶＤＥの部分長ｃＤＮＡクローン（ｃｃｃｌ２９ｇ１５、挿入断片１１３２ｂｐ）は、Ｃ．カネフォラ ネスレ−コーネル ＥＳＴデータベースで同定された。この遺伝子のコード配列を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキットを用いて伸長した。ＣｃＶＤＥのＯＲＦの残りの部分は、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットと、ネステッドプライマーＧＷＶＤＥ１（５’−ＡＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＧＴＧＡＧＡＣＴＧＣＡＣＡＣＴＣ−３’）（配列番号３０）及びＧＷＶＤＥ２（５’−ＡＴＣＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣ−３’）（配列番号３１）とを用いて得た。このゲノム歩行により、２．３ｋｂの断片を作製した。この断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＶＤＥを作製した。このクローンの挿入断片を配列決定して、ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ再構築の後に１２４８ｂｐの全長ＯＲＦが得られた。
コフィアカネフォラ ＶＤＥ（ＣｃＶＤＥ）の推定全長アミノ酸配列を、最も相同性が高いＧｅｎＢａｎｋ配列と整列させて、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｕ３４８１７；Ｂｕｇｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）ＶＤＥのアミノ酸配列に対して７４％の相同性、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（ＡＦ４１１１３３）ＶＤＥのアミノ酸配列に対して６７％の相同性、及びシロイヌナズナ（ＡＹ０６３０６７）ＶＤＥに対して６７％の相同性を有するタンパク質をコードすることが見出された（表１０）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｈは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの３つの最も相同性が高い配列と整列させた全長ＣｃＶＤＥアミノ酸配列を示す。
Ｆ．９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ１
ネオキサンチンからの植物ホルモンであるアブシジン酸の合成に関わる９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（ＮＣＥＤ３；ｃｃｃｗｃ２２ｗ２３ｏ２０）の部分クローン（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）が、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで検出された。シロイヌナズナでは、５つのｃＤＮＡ、ＮＣＥＤ２（ＮＭ１１７９４５）、ＮＣＥＤ３（ＮＭ１１２３０４）、ＮＣＥＤ５（ＮＭ１０２７４９）、ＮＣＥＤ６（ＮＭ１１３３２７）及びＮＣＥＤ９（ＮＭ１０６４８６）がこの９−シス開裂反応を担う。ここで同定されるＣ．カネフォラのｃＤＮＡは、ＡｔＮＣＥＤ３（ＮＭ１１２３０４）に対して最も高いオルソロジーを示し、よってＣｃＮＣＥＤ３と命名した。ＡＢＡは、ＮＣＥＤ３の作用により形成されるカロテノイド由来アポカロテノイドである（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＮＣＥＤは、１１，１２−カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼであり、これは、種々の植物食品の風味及び芳香に関わる種々のカロテノイド由来アポカロテノイドの形成と類似の反応で、ネオキサンチンを開裂して、ＡＢＡの前駆体であるザントキシンを形成する。
ＣｃＮＣＥＤ３完全コード配列は、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットと、ネステッドプライマーＧＷＮＣＥＤ３Ｆ（５’−ＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣ−３’）（配列番号４０）及びＧＷＮＣＥＤ３Ｒ（５’−ＴＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣ−３’）（配列番号４１）とを用いて得て、２．５ｋｂの断片を作製した。この断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＮＣＥＤ＃４を作製した。このクローンの挿入断片を配列決定して、ＡＴＧの上流に１９０８ｂｐ及び１１０４ｂｐの全長ＯＲＦを得た。すべての報告されているＮＣＥＤと同様に、ＣｃＮＣＥＤ３はイントロンを含まない。コフィアカネフォラ ＮＣＥＤ３（ＣｃＮＣＥＤ３）の推定Ｎ末端アミノ酸配列を、最も相同性が高いＧｅｎＢａｎｋ配列と整列させ、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＣＡＤ３０２０２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）ＮＣＥＤ１のアミノ酸配列に対して７５％の相同性、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ＡＡＴ７５１５１）ＮＣＥＤ１に対して７５％の相同性、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＡＦ１５９９４８；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）ＮＣＥＤ１に対して７０％の相同性、及びシロイヌナズナ（ＢＡＢ０１３３６）ＮＣＥＤ３に対して６６％の相同性を有するタンパク質をコードすることが見出された（表１１）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｉは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの４つの最も相同性が高い配列と整列させたＣｃＮＣＥＤ３全長アミノ酸配列を示す。
Ｇ．カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１
カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１（ＣＣＤ１）は、β−イオノン、α−イオノンゲラニルアセトン及びプソイドイオノンのｉｎ ｖｉｖｏでの形成に関わることが示されている（Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ；図２を参照されたい）。この遺伝子は、ネオキサンチンからのＣ１３グラスホッパーケトンの形成におけるその役割のために、特に興味がある（図３）。いずれの特定の理論又は作用の機構にも結び付けられないが、グラスホッパーケトンは、グリーンコーヒー及び焙煎コーヒーの重要な風味揮発性物質であるβ−ダマセノン及び３−ヒドロキシ−β−ダマセノンの形成のための前駆体と仮定されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）（図２）。
コフィアカネフォラ ＣＣＤ１（ＣｃＣＣＤ１）についての部分ｃＤＮＡ配列（ｐｃｃｃｗｃ２２ｗ２ａ６）が、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定された。欠損された５’配列を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキットと、プライマーＧＷＣＣＤ１１（５’−ＡＡＣＡＡＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＣ−３’）（配列番号３４）及びＧＷＣＣＤ１２（５’−ＧＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＡＣＧＴＡＣＣＧ−３’）（配列番号３５）とを用いて回復した。２４７５ｂｐの断片を回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＣＲ４−ＧＷＣＣＤ１＃１を作製して、このクローンの挿入断片を配列決定した。このステップは全長コード配列を生じなかったので、ネステッドプライマーＧＷＣＣＤ１３（５’−ＴＧＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＡＴＧＡＣＴＡＧＧＣ−３’）（配列番号３６）及びＧＷＣＣＤ１４（５’−ＡＡＧＣＡＡＴＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧ−３’）（配列番号３７）を用いて２回目のゲノム歩行を行い、１０４５ｂｐの断片を回収した。この断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＣＣＤ１＃２を作製した。挿入断片を配列決定して、適切な配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの組立の後に、全長ＣＣＤ１ ＯＲＦを得た。ＣｃＣＣＤ１は、次いで、最も相同性が高いＧｅｎＢａｎｋ配列と整列させ、Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＡＹ５７６００１）に対して８３％の相同性、及びＬ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＡＹ５７６００２；Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ）ＣＣＤ１ｓに対して７８％の相同性、Ｐｅｔｕｎｉａ ｘ ｈｙｂｒｉｄａ（ＡＹ５７６００３；Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ）ＣＣＤ１に対して８２％の相同性、並びにシロイヌナズナ（ＡＪ００５８１３；Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８）ＣＣＤ１に対して７９％の相同性を有するタンパク質をコードすることが見出された（表１２）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｊは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの４つの最も相同性が高い配列と整列させたＣｃＣＣＤ１全長アミノ酸配列を示す。
Ｈ．フィブリリン
植物フィブリリン又は色素体脂質関連タンパク質とよばれるタンパク質は、ラン藻類から高等植物まで（Ｌａｉｚｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）、そして後者の場合は多様な組織に多様な種々の脂質構造と関連して広まっている。いずれの特定の理論又は作用の機構にも結び付けられないが、フィブリリンタンパク質は、水性環境での脂質構造の安定化に関わると考えられている（Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。さらに、その中でフィブリリンが見出されたリポタンパク質構造は、カロテノイドを（多少は）含有し得る。タバコ葉緑体でのフィブリリンの過剰発現は、カロテノイドの隔離に関わるリポタンパク質構造であるプラスト顆粒の数の増加を導くことが報告された（Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。よって、フィブリリンは、カロテノイドの「沈降」の改変を導き得るだろう。このことは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）の結果により支持され、彼らは、カロテノイドの過剰蓄積が、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａのＯｒ変異体において、カロテン生成遺伝子の発現又は酵素の豊富さの変化よりもむしろ、沈着構造の増殖に関連するだろうと報告した。同様に、コーヒー粒でのフィブリリンタンパク質の過剰発現は、粒の生育の間のカロテノイド貯蔵を導くだろう。
Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ（Ｓ５６６３３；Ｄｅｒｕｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ａ）及びシロイヌナズナ（ＮＭ−１１８３５０及びＮＭ−１１６６４０；Ｌａｉｚｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）のフィブリリンタンパク質とそれぞれ７０％、６１％及び６０％の相同性を示す全長ｃＤＮＡクローン（ｃｃｃｓ１６ｗ１５ｅ１４）が、Ｃ．カネフォラ ＥＳＴデータベースで同定されている（表１３）。

１．同一性は、デフォルトパラメータを用いるｃｌｕｓｔａｌ Ｗで、全長ＯＲＦを用いて個別に算出した。
２．ＮＰ＝未公表
図４Ｋは、ＧｅｎＢａｎｋ非重複タンパク質データベースの３つの最も相同性が高い配列と整列させたコフィアカネフォラ フィブリリンアミノ酸配列を示す。
実施例３
コーヒー粒中での転写産物の発現
ＴａｑＭａｎアッセイを用いて、ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、ＰＴＯＸ、ＬεＣＹ、βＣＨＹ、ＺＥＰ、ＶＤＥ、ＣＣＤ１、ＮＣＥＤ３及びＦＩＢ１についての転写産物の相対量を、コフィアカネフォラ及びＣ．アラビカからのコーヒー粒中で定量した。
図５に示す結果は、Ｃ．カネフォラ（ＦＲＴ０５）について得られたＱＲＴ−ＰＣＴ発現データのＣ．アラビカ（Ｔ２３０８）との比較である。緑色小段階でのいくらかの明らかな発現の違いとは別に、２つのロブスタの試料は、比較的類似の発現パターンを示したが、分析した単独のアラビカ試料とは著しく異なる発現パターンを示した。これらのデータは、アラビカ品種とロブスタ品種のコーヒー粒においてカロテノイド経路遺伝子の発現パターンに潜在的に大きい違いがあることを示唆する。
さらに、図５にみられるように、それぞれの転写産物は、生育の間に粒中で発現を示していることが確認される。コーヒー粒中での最初の生合成酵素であるＰＳＹの発現が低いことは、コーヒー粒中でのカロテノイドの蓄積に重要であろう（図５Ａ）。２分子のゲラニルゲラニルジホスフェートのフィトエンへのＰＳＹによる縮合は、いくつかの異なる植物種及び異なる生育段階の組織において律速反応であることが見出されている。アラビカ粒とロブスタ粒の間の著しい違いが、ＰＴＯＸ転写産物蓄積のレベルで観察された（図５Ｄ）。ＰＴＯＸ転写産物は、ロブスタ粒と比較すると、アラビカではすべての段階の粒で著しく高いことが示されている。アラビドプシスのｉｍｍｕｔａｎｓ変異体（Ｃａｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）及びトマトのｇｈｏｓｔ変異体（Ｊｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）で決定されたフィトエン不飽和化におけるＰＴＯＸの重要性を鑑みて、ＰＴＯＸが粒の生育中にカロテノイドの生合成において重要な役割を演じるであろうと考えられている。アラビカ粒とロブスタ粒との別の重要な違いはＣＣＤ１転写産物レベルで観察され、これはロブスタで減少が観察されたのに対して、アラビカ粒では生育の間に増加するようである（図５Ｊ）。風味揮発性物質形成におけるＣＣＤ１の重要性を鑑みて、３種のＣ．カネフォラ遺伝子型（ＢＰ４０９、ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４）及び１種のＣ．アラビカ（Ｔ２３０８）遺伝子型の粒でのＣＣＤ１転写産物レベルのより詳細な分析を行った。３種すべてのＣ．カネフォラ遺伝子型において、ＣＣＤ１転写産物は、生育の間に減少したか又は低いままであった（図６Ａ）。対照的に、Ｃ．アラビカ（Ｔ２３０８）でのＣＣＤ１転写産物は、生育の初期に４倍に増加し、そして生育の間にわたって高いままであった（図６Ａ）。成熟期間の最後に、ＣＣＤ１転写産物レベルは、Ｃ．カネフォラに比較して、Ｃ．アラビカにおいて約４倍（ＢＰ４０９）〜２０倍（ＦＲＴ０５）高かった。
実施例４
Ｅ．ｃｏｌｉでのＣＣＤ１及びβＣＨＹの活性
組換えＣｃＣＣＤ１タンパク質（ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃＣＣＤ１）を発現するプラスミドを、異なるカロテノイド化合物を蓄積するように予め工学的に改変したＥ．ｃｏｌｉ株に導入した（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．１９９４； Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．１９９６； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．１９９６）。これらの株で蓄積するカロテノイドは、細胞に色を与え、色の変化又は消失は、導入された新しい遺伝子産物によりカロテノイドが改変されたことを示す。２つの組換えタンパク質のそれぞれがリコペン、β−カロテン又はゼアキサンチンを産生する細胞で発現したときに、色の消失が観察された（図６Ｂ）。これらの知見は、Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４ｂ）により以前に報告された結果と矛盾しない。これらの結果により、コーヒーのＣＣＤ１酵素が、一連の直鎖状及び環状のカロテノイド基質を異化でき、与えられるカロテノイド基質に応じて一連のアポカロテノイドの形成をもたらすことが確認される。
組換えＣｃβＣＨＹタンパク質（ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃβＣＨＹ）を発現するプラスミドを、β−カロテン又はゼアキサンチンを蓄積するように予め工学的に改変したＥ．ｃｏｌｉ株に導入した。図６Ｂで観察された色の消失は、ＨＰＬＣ−ＰＤＡ分析により確認された（図６Ｃ）。観察された色の消失を評価するために、カロテノイドを次のようにして分析及び定量した。
ＨＰＬＣ−ＰＤＡによるＥ．ｃｏｌｉからのカロテノイドの分析及び検出。Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）の方法を用いて、ＨＰＬＣ−ＰＤＡ分析を行った。分離は、ＹＭＣ製でインターキム（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）（フランス）から購入したＣ３０逆相カラム（２５０×４．６ｍｍ）で行った。用いた移動相は、メタノール（Ａ）、０．２％酢酸アンモニウムを含有する、水／メタノール（容量で２０／８０）（Ｂ）及びｔｅｒｔ−メチルブチルエーテル（Ｃ）であった。用いた勾配は、均一濃度で１２分間の９５％Ａ／５％Ｂ、１２分での８０％Ａ／５％Ｂ／１５％Ｃへのステップ、続いて３０分間の３０％Ａ／５％Ｂ／６５％Ｃへの直線勾配であった。Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）
ＨＰＬＣによるＣｏｆｆｅａからのカロテノイドの分析及び検出。Ｃ．アラビカ（Ｔ２３０８）及びＣ．カネフォラ（ＦＲＴ０５）の粒からのカロテノイドの分析及び定量に用いた方法は、Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）に詳述されている。簡単に、８〜９個の粒を液体窒素中ですりつぶし、凍結乾燥させた。メタノールに溶解した既知量のアスタキサンチンを空のチューブに加え、凍結乾燥させた。６０ｍｇの凍結乾燥物質をチューブに加え、メタノール：クロロホルム（容量で１：３）を用いて抽出し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０（２容量）で分配した。ＨＰＬＣ分離を、Ｃ１８逆相カラム（マチェリ−ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ））で行った。溶媒は、最初は８５％アセトニトリル／メタノール（７５：２５）及び１５％水で構成され、続いて１２分間で水の含量を８％まで、続く１０分間で５％まで、続く３分間で０％まで減少させる勾配であった。１００％アセトニトリル／メタノールを、次いで、運転の最後まで維持した。
カロテノイドの定量は用量応答曲線で行い、カロテノイドの同定は同時クロマトグラフィー及びオンラインで得た比較分光特性により行った。濃いオレンジがかった黄色から明るい黄色への色の変化が、β−カロテンを中間体β−クリプトキサンチンを経てゼアキサンチンに変換する（図１Ｄ〜１Ｇ）βＣＨＹの活性によりβ−カロテンの存在下で観察された。これらの知見は、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）により以前に報告された結果と矛盾しない。このような色の変化はゼアキサンチン蓄積株では観察されず、この株は誘導の前後で明るい黄色であった（図７Ａ）。色の変化を確かめるために、細胞からカロテノイドを抽出し、ＨＰＬＣにより分析した。図７Ｂにより、ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃβＣＨＹの誘導前に主要なカロテノイドとしてβ−カロテンの存在が確認される。誘導の後に、β−カロテンを表すピークが減少し、ゼアキサンチン及び中間体であるβ−クリプトキサンチンを表す２つの新しいピークが観察される。これらのデータは、ＣｃβＣＨＹがβ−カロテンヒドロキシラーゼ活性を有し、β−カロテンからβ−クリプトキサンチン及びゼアキサンチンの形成をもたらすことを示す。
また、図６Ｃにみられるように、非誘導培養物（ＮＩ）では、リコペン、β−カロテン及びゼアキサンチンを表すピークが観察される。ＣＣＤ１の誘導に続いて、これらのカロテノイドのそれぞれの蓄積が著しく低減され（Ｉ）、一方、添加対照として抽出物に加えたアスタキサンチンのピークは同じサイズのままである。これらのデータは、コーヒーＣＣＤ１タンパク質が、直鎖状及び環状のカロテノイド基質をともに異化できることを示す。コーヒー粒（特にアラビカ粒）中のＣＣＤ１の著しい発現が検出され、この酵素がおそらく、粒中のカロテノイド分解産物、通常の細胞代謝産物及び場合によっては潜在的なコーヒー芳香／芳香前駆体の両方である分子を発生させることを示す。
実施例５
コーヒーの未熟及び成熟緑色粒のカロテノイドの分析
成熟アラビカ及びロブスタコーヒー粒が、カロテノイドであるルテイン及びゼアキサンチンを低レベルで含有することが最近示されている（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。いくつかの種子では、カロテノイドのレベルが成熟の進行とともに減じられることが知られているので（Ｂｏｎｈａｍ−Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００６）、我々は、未熟なアラビカ及びロブスタの粒で見出されるカロテノイドのレベルを調べ、これらを同じ品種からの成熟粒で見出されるレベルと比較した。得られたＨＰＬＣプロファイルを図８に示し、定量されたレベルを表１４に示す。
コーヒー粒中の多様なカロテノイドの存在は、ＨＰＬＣ分析により示された。図８Ａ及びＢに示すように、４５０ｎｍで得られたクロマトグラムは、緑色コーヒー粒中でのネオキサンチン（１）、ビオラキサンチン（２）、ルテイン（３）、α−カロテン（４）及びβ−カロテン（５）の存在を示す。著しいレベルのクロロフィルＡ及びＢ（ピークａ及びｂ）も検出され、これは焙煎していないコーヒー豆の緑色の原因のようである。リコペンはコーヒー粒中では検出されず、おそらく、経路中でこの中間体の代謝回転が迅速であることによるのであろう。２８０ｎｍで得られたクロマトグラムは、最初の真のカロテノイド及びゲラニルアセトン（ＶＩ）の形成の潜在的な前駆体であるフィトエンを表している可能性のあるピークを示す（データ示さず）。
予測されたように、著しくより高いレベルのルテインが、成熟粒に対して未熟粒で見出された。興味深いことに、ここで示す実験は、コーヒー粒中にいくつかのその他のカロテノイドも検出した。未熟粒中では、低いレベルの４種のその他のカロテノイド、すなわちネオキサンチン、ビオラキサンチン、α−カロテン及びβ−カロテンを明確に見ることができる。コーヒーの葉について以前に記載されたように（下記）、α−カロテンの存在は予想外であったが、このスペクトル及び保持時間がニンジンの根から抽出したα−カロテン標準物質と同一であることが見出されて、このピークの同一性が確認された（データ示さず）。
用いた成熟アラビカ又はロブスタの粒試料中には、以前の報告（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）とは対照的に、著しい量のゼアキサンチンは観察されなかった。ゼアキサンチンが存在しないという知見を確認するために、試料を、ルテインとゼアキサンチンのより完全な分離を与えるＦｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）により以前に記載されたＣ３０カラムで再分析した。この方法を用いても、これらの試料中にはゼアキサンチンは検出されなかった（データ示さず）。
ＰＳＹ及びＢＣＨについてのＥＳＴが、生育３０週目の粒で検出された。コーヒー粒中に終端のカロテノイドであるルテイン及びネオキサンチンが存在することを鑑みて（図１及び図８を参照されたい）、カロテノイド生合成に関わるすべての酵素が経路を通して流れを維持するのに十分なレベルで発現されていると考えられる。ＣＣＤ１転写産物は、生育３０週目の粒中でも検出され、ｉｎ ｖｉｖｏでα−イオノン（ＶＩ）及びβ−ダマセノン（ＩＸ）の形成を担っているようである。

数字は、図８でのピークを表す。値は、３〜４回の決定の平均である。標準偏差を括弧内に示す。６０ｍｇの試料を、材料及び方法に記載するようにして抽出した。ＮＤ＝検出せず
ここで示す結果は、緑色コーヒー種子が少なくとも５種の異なるカロテノイドを含有することを示す。コーヒー粒中に終端のカロテノイドであるルテイン及びネオキサンチンが存在すること（図８及び表１４を参照されたい）は、カロテノイド生合成に関わるすべての酵素が、経路を通して流れを維持するのに十分なレベルで発現されていることを示す。コーヒー粒は、薄い果皮に取り囲まれた小さい実の中で生育するので、直接の日光から遮断される。しかし、コーヒー粒は、クロロフィルａ及びｂをともに含有することが見出され、このことが焙煎していないコーヒー豆の緑色の原因のようである。
我々は、品種により、カロテノイドの合計の２〜１８％の濃度でα−カロテンの量が存在することも検出した。一般に、葉のような緑色組織は、α−カロテンではなく、著しい量のβ−カロテン及びルテインを蓄積する（概説としてＦｒａｎｋ ａｎｄ Ｃｏｇｄｅｌｌ，１９９６及びその中の参考文献を参照されたい）。しかし、α−カロテンは、ニンジン（Ｋｏｃｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｎ，２００５）のようないくつかの植物の葉で見出され得る。成熟緑色コーヒー粒中にα−カロテンが存在することは、コーヒーの葉でのα−カロテンの以前の報告と矛盾せず（Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．、投稿中）、Ｃ．アラビカの成熟緑色粒がＣ．カネフォラよりも高い相対レベルで含有する。Ｃ．アラビカの成熟緑色粒でのこれらのより高いα−カロテンレベルは、Ｃ．カネフォラに比較してＣ．アラビカで著しくより多く見出された（図５を参照されたい）より高いレベルのＬεＣＹ転写産物に関連し得る。ＬβＣＹとともにＬεＣＹは、リコペンからのα−カロテンの形成を担う（Ｒｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｃ．カネフォラに対するＣ．アラビカでのルテインのより低い相対レベルは、Ｃ．アラビカ粒のα−カロテンのより高い相対含量を伴うことに言及すべきである。この結果は、コーヒーの葉で以前に観察された結果（下記）と矛盾しない。つまり、その他の可能性は存在するが、１つの可能性は、ルテインを犠牲にしてα−カロテンを蓄積することが、βＣＨＹとともにα−カロテンからのルテインの形成を担うε−カロテンヒドロキシラーゼの、より低い転写産物レベル又は酵素活性によるということであり得る（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔｉａｎ ａｎｄ ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ，２００４）。
今回示したＣ．カネフォラに対するＣ．アラビカのカロテノイドプロファイルの全体的な違いは、種特異的又は品種特異的な多様性の結果であり得るという可能性が残されている。観察されたいくつかの違いが、少なくとも部分的には、樹木が成長した成長条件の違いの結果であるという可能性もある。
実施例６
プロモーターの単離及びベクターの構築
コフィアカネフォラからのＮＣＥＤ３の５’上流領域を、Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて回収した。簡単に、２．５μｇのコフィアカネフォラ ＢＰ４０９のＤＮＡを、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩ及びＳｔｕＩで別々に切断して、Ｇｅｎｏｍｅ ＷａｌｋバンクＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３及びＤＬ４をそれぞれ作製した。精製後、０．５μｇのＤＮＡを、製造者のプロトコルに従ってＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプタ（２５μＭ）に連結した。その後のＰＣＲ反応物は、１×緩衝液及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１単位のＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｃｏｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ、ベルギー）、並びに２００ｎＭのプライマーＧＷＮＣＥＤ３Ｆ（５’−ＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＡＣＴＴＣＴＡＣＣ−３’）（配列番号４０）及び２００ｎＭのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒアダプタプライマーＡＰ１（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’；Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒキット）（配列番号２８）を含んでいた。反応混合物を９４℃にて１０分間、続いて９４℃にて２５秒間／７２℃にて４分間の７増幅サイクル、次いで９４℃にて２５秒間／６７℃にて４分間の３２増幅サイクルでインキュベートした。ＰＣＲ反応物を１／２００に希釈し、２００ｎＭのネステッドプライマーＧＷＮＣＥＤ３Ｒ（５’−ＴＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＧＡＡＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣ−３’）（配列番号４１）及び２００ｎＭのネステッドＧｅｎｏｍｅ ＷａｌｋｅｒアダプタプライマーＡＰ２（５’−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’；Ｇｅｎｏｍｅｗａｌｋｅｒキット）（配列番号２９）を用いる２回目のＰＣＲ反応に用いた。ネステッドＰＣＲは、９４℃にて１０分間、続いて９４℃にて２５秒間／７２℃にて４分間の５増幅サイクル、次いで９４℃にて２５秒間／６７℃にて４分間の２２増幅サイクルでインキュベートした。ＤＬ２から１０７５ｂｐのゲノム断片を回収し、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ｐＣＲ４−ＧＷＮＣＥＤ＃４を作製した。このクローンの挿入断片を配列決定して、ＮＣＥＤ３のＡＴＧ開始コドンの上流の１１０４ｂｐの配列が得られた（配列番号２５）。
実施例７
コーヒーの葉のカロテノイド含量
ＨＰＬＣによるコーヒーの葉の抽出物の分析は、Ｃ．カネフォラがＣ．アラビカよりも高い量のカロテノイドを含有することを示した。各カロテノイドの定量（表１５）は、カロテノイドであるネオキサンチン、ビオラキサンチン及びβ−カロテン（約１２〜１３％β−カロテン、１４〜１６％ビオラキサンチン及び１３〜１４％ネオキサンチン）の２つの種での相対分布が類似することを明らかにした。表１５からの最も著しい知見の１つは、ルテイン生合成の中間体であり、シロイヌナズナを含むほとんどの種からの葉では通常蓄積しない（図９Ｃ）著しい量のα−カロテン（ピーク４：図９）の存在である。ピークのα−カロテンとしての同一性を確かめるために、ニンジンの根から抽出されたα−カロテン標準物質のものとスペクトル及び保持時間を比較し、同一であることを見出した。Ｃ．アラビカ及びＣ．カネフォラでのα−カロテンレベルの比較は、Ｃ．アラビカの葉がより高い相対α−カロテンレベル（カロテノイドの合計のそれぞれ１２％及び３．５％）を含有することを示した。対照的に、Ｃ．カネフォラは、より高い相対ルテインレベルを有した（Ｃ．アラビカでの４８％に比較して５４％）。より高いα−カロテンレベルは、Ｃ．アラビカにおいてＣ．カネフォラよりも著しく高いことが示された、より高いレベルのＬεＣＹ転写産物に関連し得る。さらに、Ｃ．カネフォラの葉は、Ｃ．アラビカからのものよりも高い相対ルテインレベルを有したので、そしてα−カロテンはルテインの直接の前駆体であるので、Ｃ．カネフォラの葉でのより高いルテイン含量は、より低いレベルのα−カロテンに直接関連し得、逆に、Ｃ．アラビカでのより低いルテイン含量は、より高いα−カロテン含量に関連する。

値は、３〜４回の決定の平均である。標準偏差を括弧内に示す。６０ｍｇの試料を、材料及び方法に記載するようにして抽出した。数字は、図７でのピークを表す。
葉及び粒でのカロテノイド代謝の関連は、この時点で正確に明らかではないが、上記のデータは、アラビカ及びロブスタコーヒーのカロテノイドプロファイルの小さいが重要な違いが存在するという考えをさらに支持する。これらのプロファイルの違いが、これらの２種のコーヒーの間に一般に存在する環境ストレスに対する耐性及び粒の質における違いのいくつかに寄与すると考えられる。
実施例８
カロテノイド生合成及び干ばつストレス条件下での貯蔵に関わるコーヒー遺伝子の定量発現解析
我々は、長期の干ばつストレスに起因する３年齢のＣ．アラビカ（カティモール）植物の葉でのカロテノイド遺伝子発現の変化を評価した。この実験のために、葉の試料を、十分に水を与えた２つの対照植物と、並行して水を与えなかった２つの植物とから種々の時期（Ｔ＝０、３、４、５及び６週）で採取した。試料のそれぞれからＲＮＡを調製した。水不足試料について、葉の組織からの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を用いて単離した。ＲＮＡ試料を、ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）で処理し、キアゲンミニカラムを用いて精製した。全植物ＲＮＡの濃度及び純度は、分光分析により決定した。定量は、各実験のすべてのＲＮＡ試料について、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロミド染色によるｒＲＮＡバンドの目視検査により確認した。ｃＤＮＡは、約２μｇの全ＲＮＡから、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）のプロトコルに従ってポリｄＴプライマーを用いて調製した。
ＲＮＡを、次いで、カロテノイド及びＦＩＢ１遺伝子の定量ＲＴ−ＰＣＲ発現解析のために用いた（図１０）。発現解析は、ＦＩＢ１、ＰＳＹ、ＺＤＳ、ＰＴＯＸ、βＣＨＹ及びＶＤＥ転写産物のレベルが、それぞれ干ばつ期間の間に増加したことを示した。対照的に、ＺＥＰ転写産物の量は、初期のストレスの下で増加した後に減少したが、ＬεＣＹの転写産物は、いくつかの試料では検出不可能なレベルまで迅速に減少した。干ばつストレスの最初の５週間の間にＰＤＳ転写産物の量の著しい増加は観察されず、最も過酷なストレスの徴候を示す２つの植物のうちの１つのみが、干ばつ後６週間の後にＰＤＳの増加を示した。
我々は、長期の干ばつに起因する葉でのカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子発現の変化も評価した。ＣＣＤ１転写産物の量は、水不足条件下で増加し、６週間のサンプリング期間にわたってゆっくりと増加した。対照的に、ＮＣＥＤ３の転写産物は、早期に著しく増加した後に、残りのサンプリング期間にわたって減少した。
転写産物のレベルのわずかな違いが、種々の日に採取した対照試料で観察された（試料は、すべて各日同じ時間に回収したが）。この知見は、おそらく、２つの植物同士での環境条件の小さい違いがカロテノイド遺伝子の発現にわずかに影響し得ることの現れである。同様に、ストレス負荷された植物のそれぞれで生じる転写産物レベルの変化の違いは、潅漑の除去に続く脱水の速度の試料特異的な違いによるものであったかも知れない。ヒストグラムの左側の植物の組は、試験期間の最後に水不足の最も過酷な物理的徴候を示した（データ示さず）。
水不足は、活性酸素種の生成の増加をもたらし得る。酸化ストレスに対する防御に関わるカロテノイドは、干ばつストレスの下ではより高い代謝回転速度に供され得る。このことは、水がない植物での適切な色素レベルを維持するために、より高い合成速度が必要であろうことを示唆する（Ｓｉｍｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂを参照されたい）。よって、我々は、水不足条件下のコーヒーの葉でのいくつかのカロテノイド生合成遺伝子の発現を調べた。チラコイド機能に影響するＦＩＢ１／ＣＤＳＰ３４遺伝子は水不足のようなストレス要因に応答することが知られているので（Ｍａｎａｃ’ｈ ａｎｄ Ｋｕｎｔｚ，１９９９；Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）、我々は、この実験において、ＦＩＢ１発現レベルを、水ストレスについての明確な対照として調べた。予測されたように、ＦＩＢ１の発現は、干ばつストレスによりコーヒーにおいて強く誘導された（図１０）。この結果により、ここで用いた実験条件が、色素体内で強いストレス応答に導いたことが確認された。このストレス応答は、細胞の他の部分でも検出された。なぜなら、同じ試料を用いた付加的な実験は、水ストレス誘導性遺伝子デヒドリンＣｃＤＨ１ａ（ＤＱ３２３９８７）が水ストレス負荷した試料で非常に強く誘導され、水を与えた対照で誘導されなかったことを明確に証明したからである（Ｇ． Ｐａｇｎｙ ａｎｄ Ｊ． ＭｃＣａｒｔｈｙ；未公表の結果）。
我々は、コーヒーの葉でのリコペンイプシロンシクラーゼ転写産物のレベルが、水不足の条件下で検出不可能なレベルまで減少したことに注目する。この明らかなダウンレギュレーションは、代謝の流れを、経路のルテイン支流から経路のキサントフィル（ゼアキサンチン、アンテラキサンチン及びビオラキサンチン）支流に再び向け得る。キサントフィルは、光合成からの過剰エネルギーを、キサントフィルサイクルとして知られる機構により散逸させることに寄与する。このサイクルには、２つの酵素、ＺＥＰ及びＶＤＥが関わる。ＺＥＰは、ゼアキサンチンのアンテラキサンチンへ、続いてビオラキサンチンへの変換を触媒する。ＶＤＥは、逆反応を触媒する。通常条件下では、ＺＥＰ活性は、高含量のビオラキサンチン及び低含量のゼアキサンチンをもたらし、ＶＤＥ活性（及びゼアキサンチン蓄積）は、過剰な光条件下で誘導される（Ｒｕｂａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｗｏｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｒｏｍｅｒ，２００３）。我々の結果は、通常の成長条件下では、Ｃ．アラビカでのＺＥＰ転写産物の量が、ＶＤＥ転写産物の量より約１０倍多いことを示す。興味深いことに、水ストレス負荷した植物を用いて得られたデータは、ＺＥＰ転写産物のレベルが、ストレス応答の初期の部分の間にまず増加し、次いで、ストレスシグナルが強くなるにつれて減少することを示す。ＺＥＰ転写産物の量の減少に伴い、水ストレス負荷した植物ではＶＤＥ転写産物の量が付随して安定して増加する。この遺伝子発現調節は、水ストレスの下でのキサントフィルサイクルの最適な働きに寄与する可能性がある。全体として、これらの結果は、以下の方策の１つ又は複数を用いて、コーヒーのものを含む緑色植物組織の水ストレスからの防御を改善し得ることを示唆する。１）例えばストレス応答の初期にコーヒーＰＳＹ発現を増加させることにより、全体的なカロテノイドの合成を増加させる（シグナルに対してより応答性が高い）、２）ストレス応答の初期にＬεＣＹの発現を減少させて、カロテノイドのキサントフィル合成経路への侵入を改善する、又は３）キサントフィルサイクルの機能的能力を改善する（例えばＶＤＥ発現の増加により）。コーヒーでストレス応答のこれらのそしてその他の改善の可能性は、本明細書で示すコーヒーカロテノイド及びアポカロテノイド生合成経路酵素の全長ｃＤＮＡ配列の単離により、今回、可能になる。
本発明は、本明細書に記載され例示される実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲の範囲内で変動及び修飾が可能である。
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Ｋｊｅｌｄｓｅｎ Ｆ， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＬＰ， Ｅｄｅｌｅｎｂｏｓ Ｍ． （２００３）． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ ｃａｒｒｏｔｓ （Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ Ｌ．） ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ ａｎｄ ｆｒｏｚｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５１： ５４００−５４０７．
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Ｌｉ， Ｌ．， Ｐａｏｌｉｌｌｏ， ＤＪ．， Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ， ＭＶ．， ＤｉＭｕｚｉｏ， ＥＭ．， Ｇａｒｖｉｎ， ＤＦ． （２００１）． Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ −ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｂｏｔｒｙｔｉｓ）． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２６（１）： ５９−６７．
Ｌｉｎ Ｃ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＬＡ， ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｊ， Ｐｅｔｉａｒｄ Ｖ， Ｃｒｏｕｚｉｌｌａｔ Ｄ， Ｔａｎｋｓｌｅｙ Ｓ （２００５） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｃｏｆｆｅｅ ＥＳＴ ｄａｔａｂａｓｅ： Ｄｅｄｕｃｔｉｏｎｓ ａｂｏｕｔ ｇｅｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． （Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ）．
Ｌｉｎｄｇｒｅｎ ＬＯ， Ｓｔａｌｂｅｒｇ ＫＧ， Ｈｏｇｌｕｎｄ ＡＳ． （２００３）． Ｓｅｅｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｅｌａｙｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ， ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２（２）： ７７９−７８５．
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Ｒａｙ Ｊ， Ｍｏｕｒｅａｕ Ｐ， Ｂｉｒｄ Ｃ， Ｂｉｒｄ Ａ， Ｇｒｉｅｒｓｏｎ Ｄ， Ｍａｕｎｄｅｒｓ Ｍ， Ｔｒｕｅｓｄａｌｅ Ｍ， Ｂｒａｍｌｅｙ Ｐ， Ｓｃｈｕｃｈ Ｗ． （１９９２）． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｏｍａｔｏ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９： ４０１−４０４．
Ｒｅｙ Ｐ， Ｇｉｌｌｅｔ Ｂ， Ｒｏｍｅｒ Ｓ， Ｅｙｍｅｒｙ Ｆ， Ｍａｓｓｉｍｉｎｏ Ｊ， Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｇ， Ｋｕｎｔｚ Ｍ． （２０００）． Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｅｐｐｅｒ ｐｌａｓｔｉｄ ｌｉｐｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｔｉｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｕｐｏｎ ｓｔｒｅｓｓ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２１（５）： ４８３−４９４．
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Ｓｅｄｄｏｎ ＪＭ， Ａｊａｎｉ ＵＡ， Ｓｐｅｒｄｕｔｏ ＲＤ， Ｈｉｌｌｅｒ Ｒ， Ｂｌａｉｒ Ｎ， Ｂｕｒｔｏｎ ＴＣ， Ｆａｒｂｅｒ ＭＤ， Ｇａｒｏｕｄｏｓ ＥＳ， Ｈａｌｌｅｒ Ｊ， Ｍｉｌｌｅｒ ＤＴ， Ｙａｎｎｕｚｚｉ ＬＡ， Ｗｉｌｌｅｔ Ｗ． （１９９４）． Ｄｉｅｔａｒｙ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ， ｖｉｔａｍｉｎｓ Ａ， Ｃ， ａｎｄ Ｅ， ａｎｄ ａｄｖａｎｃｅｄ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｍ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． ２７２： １４１３−１４２０．
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Ｓｉｅｓ Ｈ， Ｓｔａｈｌ Ｗ． （２００４）． Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ＵＶ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ８： ７４９−７５２．
Ｓｉｍｋｉｎ ＡＪ， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ ＢＡ， Ａｕｌｄｒｉｄｇｅ Ｍ， Ｌｏｕｃａｓ ＨＭ， Ｓｈｉｂｕｙａ Ｋ， Ｃｌａｒｋ ＤＧ， Ｋｌｅｅ ＨＪ． （２００４ａ）． Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰｈＣＣＤ１ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ β−ｉｏｎｏｎｅ， ａ ｆｒａｇｒａｎｃｅ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｏｆ ｐｅｔｕｎｉａ ｆｌｏｗｅｒｓ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３６（３）： ３５０４−３５１４．
Ｓｉｍｋｉｎ ＡＪ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＨ， Ａｕｌｄｒｉｄｇｅ Ｍ， Ｔａｙｌｏｒ ＭＧ， Ｋｌｅｅ ＨＪ． （２００４ｂ）． Ｔｈｅ ｔｏｍａｔｏ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ １ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｕｒ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ β−ｉｏｎｏｎｅ， ｐｓｅｕｄｏｉｏｎｏｎｅ ａｎｄ ｇｅｒａｎｙｌａｃｅｔｏｎｅ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ４０（６）： ８８２−８９４．
Ｓｉｍｋｉｎ ＡＪ， Ｌａｉｚｅｔ Ｙ， Ｋｕｎｔｚ Ｍ． （２００４ｃ）． Ｐｌａｓｔｉｄ ｌｉｐｉｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ｆａｍｉｌｙ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｒｅｃ Ｒｅｓ Ｄｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５： ３０７−３１６．
Ｓｏａｒ，Ｃ．Ｊ．， Ｓｐｅｉｒｓ，Ｊ．， Ｍａｆｆｅｉ，Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｌｏｖｅｙｓ，Ｂ．Ｒ． （２００４）． Ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｉｎ ｓｔｏｍａｔａｌ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ， ｘｙｌｅｍ ｓａｐ ＡＢＡ ａｎｄ ｂｕｌｋ ｌｅａｆ ＡＢＡ ａｌｏｎｇ ｃａｎｅｓ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ｃｖ Ｓｈｉｒａｚ： ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｏｕｒｃｅ． Ｆｕｎｃｔ． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ． ３１， ６５９−６６９．
Ｓｐａｎｉｅｒ ＡＭ， Ｆｌｏｒｅｓ Ｍ， Ｔｏｌｄｒａ Ｆ， Ａｒｉｓｔｏｙ ＭＣ， Ｂｅｔｔ ＫＬ， Ｂｙｓｔｒｉｃｋｙ Ｐ， Ｂｌａｎｄ ＪＭ （２００４）． Ｍｅａｔ ｆｌａｖｏｒ： ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｌａｖｏｒ ｏｆ ｂｅｅｆ． Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． ５４２： ３３−４９．
Ｓｔａｌｂｅｒｇ Ｋ， Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｏ， Ｅｋ Ｂ， Ｈｏｇｌｕｎｄ ＡＳ． （２００３）． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｋｅｔｏｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３６： ７７１−７７９．
Ｓｔｅｖｅｎｓ ＡＡ． （１９７０）． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｌｙｅｎｅ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏｅｓ． Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｈｏｒｔ． Ｓｃｉ． ９５： ４６１−４６４．
Ｓｕｚｕｋｉ Ｍ， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｓ， Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ Ｍ， Ｈｉｒａｔａ Ｓ， Ｔａｋａｇｉ Ｋ， Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｉ， Ｙａｍａｎｏ Ｙ， Ｉｔｏ Ｍ， Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ Ｐ， Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ Ｐ， Ｍｏｒｉｔａ Ｔ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｎ． （２００２）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ （３Ｓ， ９Ｒ）− ａｎｄ （３Ｓ， ９Ｓ）−ｍｅｇａｓｔｉｇｍａ−６，７−ｄｉｅｎ−３，５，９−ｔｒｉｏｌ ９−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ ａｓ ｄａｍａｓｃｅｎｏｎｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｒｏｓａ ｄａｍａｓｃｅｎａ Ｍｉｌｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６６（１２）： ２６９２−２６９７．
Ｔａｎ ＢＣ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＨ， Ｚｅｅｖａａｒｔ ＪＡＤ， ＭｃＣａｒｔｙ ＤＲ． （１９９７） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｍａｉｚｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４： １２２３５−１２２４０．
Ｔａｎ ＢＣ， Ｊｏｓｅｐｈ ＬＭ， Ｄｅｎｇ ＷＴ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｌｉ ＱＢ， Ｃｌｉｎｅ Ｋ， ＭｃＣａｒｔｙ ＤＲ． （２００３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ９−ｃｉｓ ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３５： ４４−５６．
Ｔａｎａｋａ Ｔ， Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｙ， Ｓｕｚｕｉ Ｍ， Ｋｏｊｉｍａ Ｔ， Ｏｋｕｍｕｒａ Ａ， Ｍｏｒｉ Ｈ． Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｕｒｉｎａｒｙ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｖｏｌ １５， １５−１９， Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ (c) １９９４ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．
Ｔａｎｄｏｎ ＪＳ， Ｋａｔｔｉ ＳＢ， Ｒｕｅｄｉ Ｐ， Ｅｕｇｓｔｅｒ ＣＨ． （１９７９） Ｃｒｏｃｅｔｉｎ−ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｌｉｉ Ｂｒｉｑ．， Ｌａｂｉａｔａｅ． Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ２７４： ２７０６−２７０７．
Ｔａｙｌｏｒ Ａ （１９９３）． Ｃａｔａｒａｃｔ： ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｎｕｔｒ． １２： １３８−１４６．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｊ．， Ｔｈｏｒｎｅ，Ｅ．Ｔ．， Ｂｕｒｂｒｉｄｇｅ，Ａ．， Ｊａｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｃ．， Ｓｈａｒｐ，Ｒ．Ｅ． ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ，Ｉ．Ｂ． （２００４）． ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ， ａｎ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ． ２７ （４）： ４５９−４７１．
Ｔｉａｎ Ｌ， ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ Ｄ． （２００１）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｔｈｅ ＬＵＴ１ ｌｏｃｕｓ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４７（３）： ３７９−３８８．
Ｔｉａｎ Ｌ， ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ Ｄ． （２００４）． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． ；４３０（１）：２２−２９．
Ｔｉａｎ Ｌ， Ｍｕｓｅｔｔｉ Ｖ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｍａｇａｌｌａｎｅｓ−Ｌｕｎｄｂａｃｋ Ｍ， ＤｅｌｌａＰｅｎｎａ Ｄ． （２００４）． Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＬＵＴ１ ｌｏｃｕｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｅｐｓｉｌｏｎ−ｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ． ＰＮＡＳ ６；１０１（１）： ４０２−４０７．
Ｖａｒｉｙａｒ ＰＳ， Ａｈｍａｄ Ｒ， Ｂｈａｔ Ｒ， Ｎｉｙａｓ Ｚ， Ｓｈａｒｍａ Ａ． （２００３）． Ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｒａｗ ｍｏｎｓｏｏｎｅｄ ａｒａｂｉｃａ ｃｏｆｆｅｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５１（２７）： ７９４５−７９５０．
ｖｏｎ Ｌｉｎｔｉｇ Ｊ， Ｖｏｇｔ Ｋ． （２０００）． Ｆｉｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｇａｐ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｔｏ ｒｅｔｉｎａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（１６）： １１９１５−１１９２０．
Ｗａｔｚｌ Ｂ， Ｂｕｂ Ａ， Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ ＢＲ， Ｒｅｃｈｋｅｍｍｅｒ Ｇ． （１９９９）． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ｒｉｃｈ ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ． Ｂｒ． Ｊ． Ｎｕｔｒ． ８２： ３８３−３８９．
Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ Ｐ， Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｐ． （１９９５） Ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｒｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ ｖｏｌａｔｉｌｅｓ ｉｎ ｓｔａｒｆｒｕｉｔ （Ａｖｅｒｒｈｏａ ｃａｒａｍｂｏｌａ Ｌ．）： Ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １１： ｐｐ． ２３７−２５４．
Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ Ｐ， Ｒｏｕｓｅｆｆ Ｒ． （２００２）． Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ ａｒｏｍａ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）．
Ｖｉｓｈｎｅｖｅｔｓｋｙ Ｍ， Ｏｖａｄｉｓ Ｍ， Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ Ａ． （１９９９）． Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ４（６）： ２３２−２３５．
本発明は、上記に記載され例示される実施形態に限定されないが、添付の特許請求の範囲の範囲内で変動及び修飾が可能である。
色素体におけるイソプレノイドの生合成の概要。植物カロテノイドについての生合成経路の模式図。用いた略語は、次の通りである：ＰＳＹ：フィトエンシンターゼ。ＰＤＳ：フィトエンデサチュラーゼ ＺＤＳ：ζ−カロテンデサチュラーゼ。ＰＴＯＸ：色素体ターミナルオキシダーゼ。ＬβＣＹ：リコペンβ−シクラーゼ。ＬεＣＹ：リコペンε−シクラーゼ。βＣＨＹ：β−カロテンヒドロキシラーゼ。εＣＨＹ：ε−カロテンヒドロキシラーゼ。ＺＥＰ：ゼアキサンチンエポキシダーゼ。ＶＤＥ：ビオラキサンチンデエポキシダーゼ。ＮＹＳ：ネオキサンチンシンターゼ。ＣＣＤ１：カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ１。ＦＩＢ：ＣＣＤ４：カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ４。フィブリリン。ＮＣＥＤ３：９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ。ＰＤＨＹ：フィトエンデヒドロゲナーゼ様。 ＣＣＤ１により触媒される反応の模式図。９，１０位及び９’，１０’位（点線で示す）で開裂されたときのカロテノイド基質（左）は、２つのモノアルデヒドと中心のジアルデヒド生成物を生じるだろう。Ｉ、４，９−ジメチルドデカ−２，４，６，８，１０−ペンタエン−１，１２−ジアル（Ｃ１４ジアルデヒド）。ＩＩ、９−アポ−β−カロテン−９−オン（β−イオノン）。ＩＩＩ、３−ヒドロキシ−９−アポ−β−カロテン−９−オン（３−ヒドロキシ−β−イオノン）。ＩＶ、３−ヒドロキシ−５，６−エポキシ−９−アポ−β−カロテン−９−オン（３−ヒドロキシ−５’６−エポキシ−β−イオノン）。Ｖ、６，１０−ジメチル−３，５，９−ウンデカトリエン−２−オン（プソイドイオノン）。ＶＩ、９−アポ−α−カロテン−９−オン（α−イオノン）。ＶＩＩ、６，１０−ジメチル−５，９−ウンデカトリエン−２−オン（ゲラニルアセトン）。 ＣＣＤにより触媒される芳香化合物形成の模式図。Ａ）９，１０（９’１０）開裂ジオキシゲナーゼＣＣＤ１により、ネオキサンチンが開裂されてＶＩＩＩの（３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−６，７−ジデヒドロ−５，６−ジヒドロ−９−アポ−β−カロテン−９−オン（グラスホッパーケトン；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００１）が形成される。グラスホッパーケトンは、ＩＸのβ−ダマセノン及びＸの３−ヒドロキシ−β−ダマセノンの形成の前駆体である（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｂ）ＣｓＺＣＤは、ゼアキサンチンから３−ヒドロキシ−β−シクロシトラールの形成をもたらす７，８（７’８）開裂ジオキシゲナーゼである。Ｃ）ＢｏＬＣＤは、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン（ＭＨＯ）として以前に同定されたＣ７開裂生成物の形成をもたらすリコペン特異的５，６（５’６）開裂ジオキシゲナーゼである。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＰＳＹ（配列番号９４）、ＬｅＰＳＹ１（配列番号９５）及びＣａＰＳＹ１（配列番号９６）と整列させたＣｃＰＳＹ（配列番号１３）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＰＤＳ（配列番号９７）、ＬｅＰＤＳ（配列番号９８）及びＣａＰＤＳ（配列番号９９）と整列させたＣｃＰＤＳ（配列番号１４）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＺＤＳ（配列番号１００）、ＣａＺＤＳ（配列番号１０１）及びＬｅＺＤＳ（配列番号１０２）と整列させたＣｃＺＤＳ（配列番号２４）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＰＴＯＸ（配列番号１０３）、ＣａＰＴＯＸ（配列番号１０４）及びＣａＰＴＯＸ（配列番号１０５）と整列させたＣｃＰＴＯＸ（配列番号１５）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔβＣＨＹ（配列番号１０６）及びＬｅβＣＨＹ（配列番号１０７）と整列させたＣｃβＣＨＹ（配列番号１６）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＬｓＬεＣＹ（配列番号１０８）及びＴｅＬεＣＹ（配列番号１０８）と整列させたＣｃＬεＣＹ（配列番号１７）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＬｅＺＥＰ（配列番号１０９）、ＰｄＺＥＰ（配列番号１１０）、ＯｓＺＥＰ（配列番号１１１）及びＡｔＺＥＰ（配列番号１１２）と整列させたＣｃＺＥＰ（配列番号１８）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＶＤＥ（配列番号１１３）、ＯｓＶＤＥ（配列番号１１４）及びＮｔＶＤＥ（配列番号１１５）と整列させたＣｃＶＤＥ（配列番号１９）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＮＣＥＤ３（配列番号１１６）、ＡｔＮＣＥＤ５（配列番号１１７）、ＬｅＮＣＥＤ１（配列番号１１８）、ＳｔＮＣＥＤ１（配列番号１１９）及びＶｖＮＣＥＤ１（配列番号１２０）と整列させたＣｃＮＣＥＤ３（配列番号２０）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＰｈＣＣＤ１（配列番号１２１）、ＬｅＣＣＤ１Ｂ（配列番号１２２）、ＬｅＣＣＤ１Ａ（配列番号１２３）及びＡｔＣＣＤ１（配列番号１２４）と整列させたＣｃＣＣＤ１（配列番号２１）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 最も近縁のデータバンク配列とのコフィアカネフォラタンパク質配列の最適アラインメント。ＡｔＦＩＢ１ｂ（配列番号１２５）、ＡｔＦＩＢ１ａ（配列番号１２６）、ＣａＦＩＢ（配列番号１２７）及びＬｅＦＩＢ（配列番号１２８）と整列させたＣｃＦＩＢ（配列番号２２）。アラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）中のｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて作製し、次いで手作業で調整してアラインメントを最適にした。 種子成熟の間のカロテノイド及びアポカロテノイドの生合成遺伝子の発現：ロブスタＦＲＴ−０５とアラビカＴ２３０８との比較。Ｃ．カネフォラ（ＦＲＴ０５；黒色のバー）及びＣ．アラビカ（Ｔ２３０８；灰色のバー）の粒中のＡ）ＰＳＹ、Ｂ）ＰＤＳ、Ｃ）ＺＤＳ、Ｄ）ＰＴＯＸ、Ｅ）ＬεＣＹ、Ｆ）βＣＨＹ、Ｇ）ＺＥＰ、Ｈ）ＶＤＥ、Ｊ）ＣＣＤ１、Ｋ）ＮＣＥＤ３及びＬ）ＦＩＢ１の転写産物レベル。発現レベルは、同じ試料中で構成的に発現しているＲＰＬ３９遺伝子の転写産物の発現に関して決定する。ＳＧ、小緑色粒；ＬＧ、大粒；ＹＧ、黄色粒；ＲＧ、成熟粒。 種子生育の間のＣＣＤ１転写産物の発現及びＥ．ＣｏｌｉにおけるＣｃＣＣＤ１の活性。 Ａ）定量ＰＣＲにより決定した３種のＣ．カネフォラ遺伝子型（ＢＰ４０９、ＦＲＴ０５、ＦＲＴ６４；黒色のバー）及びＣ．アラビカ（Ｔ２３０８；灰色のバー）の粒中のＣＣＤ１の転写産物レベル。逆転写を、等量の全ＲＮＡを用いて行った。ＳＧ、小緑色粒；ＬＧ、大粒；ＹＧ、黄色粒；ＲＧ、成熟粒。 Ｂ）リコペン、β−カロテン又はゼアキサンチンを蓄積するように予め工学的に改変したＥ．ｃｏｌｉでの過剰発現の後のＣＣＤ１の活性。ＮＩ、非誘導；Ｉ、誘導。 Ｃ）誘導の前後のＬｙｃ、β−Ｃ及びＺｅａ系統のＨＰＬＣ特徴決定。矢印は、ＣＣＤ１の誘導に続くカロテノイドピークの消失を示す。アスタキサンチン（Ｃ）を試料に添加して、結果の標準化に用いた。 β−カロテン又はゼアキサンチンを蓄積するように予め工学的に改変したＥ．ｃｏｌｉでのβＣＨＹ活性。Ａ）誘導の前（ＮＩ）又は後（Ｉ）のいずれかの、ｐＤＥＳＴ１７−ＣｃβＣＨＹで形質転換してβ−カロテン又はゼアキサンチンを蓄積するように工学的に改変したＥ．ｃｏｌｉ系統。Ｂ）誘導の前後でのβ−カロテン生産細胞株のＨＰＬＣ特徴決定。β−Ｃ、β−カロテン；ｚｅａ、ゼアキサンチン。 コフィアカネフォラ及びＣ．アラビカの緑色及び赤色粒のＨＰＬＣ分析。４５０ｎｍでの吸光度プロファイル。ピークは：（１）ネオキサンチン、（２）ビオラキサンチン、（３）ルテイン、（４）α−カロテン、（５）β−カロテン、（ａ）クロロフィルＡ、（ｂ）クロロフィルＢである。アスタキサンチン（Ｃ）は、抽出に先立って加え、結果の標準化に用いた。緑＝大緑色果皮段階からの粒（ＬＧ）。赤＝成熟赤色果皮段階からの粒（ＲＧ）。 コフィアアラビカ、Ｃ．カネフォラ及びシロイヌナズナの成熟葉のＨＰＬＣ分析。吸光度は、４５０ｎｍで監視した。６０ｍｇの試料を、材料及び方法に記載するようにして抽出した。ピークは：（１）ネオキサンチン、（２）ビオラキサンチン、（３）ルテイン、（４）α−カロテン、（５）β−カロテン、（ａ）クロロフィルＡ、（ｂ）クロロフィルＢである。アスタキサンチン（Ｃ）は、抽出に先立ってコーヒー試料に加え、結果の標準化に用いた。 干ばつストレス下のコフィアアラビカ（カティモール）の葉のカロテノイド生合成遺伝子及びカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ遺伝子の発現。ＰＳＹ、ＰＤＳ、ＺＤＳ、ＰＴＯＸ、ＬεＣＹ、βＣＨＹ、ＺＥＰ、ＶＤＥ、ＣＣＤ１、ＮＣＥＤ３及びＦＩＢ１についての転写産物レベルを、定量ＲＴ−ＰＣＲにより決定した。発現は、同じ試料中で構成的に発現しているＲＰＬ３９遺伝子の転写産物の発現に関して決定した。それぞれの場合の黒色のバーは、２つの十分に水を与えた対照における平均転写産物レベルを表す。２つの独立した水ストレス負荷植物における転写産物レベルを、灰色のバーで示す。

Claims (86)

  1. フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、色素体ターミナルオキシダーゼ（ｐｌａｓｔｉｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、β−カロテンヒドロキシラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、ゼアキサンチンエピオキシダーゼ（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｅ ｅｐｉｏｘｉｄａｓｅ）、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ、フィブリリン、フィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素−１及びゼータカロテンデサチュラーゼから選択される、カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードするコード配列を有する、コーヒー（コーヒー種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．））から単離された核酸分子。
  2. コード配列がフィトエンシンターゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  3. フィトエンシンターゼが配列番号１３と７６％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の核酸分子。
  4. フィトエンシンターゼが配列番号１３を含むアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の核酸分子。
  5. コード配列が配列番号１を含む、請求項２に記載の核酸分子。
  6. コード配列がフィトエンデサチュラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  7. フィトエンデサチュラーゼが配列番号１４と７６％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の核酸分子。
  8. フィトエンデサチュラーゼが配列番号１４を含むアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の核酸分子。
  9. コード配列が配列番号２を含む、請求項６に記載の核酸分子。
  10. コード配列が色素体ターミナルオキシダーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  11. 色素体ターミナルオキシダーゼが配列番号１５と６１％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 色素体ターミナルオキシダーゼが配列番号１５を含むアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. コード配列が配列番号３を含む、請求項１０に記載の核酸分子。
  14. コード配列がβ−カロテンヒドロキシラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  15. β−カロテンヒドロキシラーゼが配列番号１６と７３％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 色素体ターミナルオキシダーゼが配列番号１６を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. コード配列が配列番号４を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
  18. コード配列がリコペンε−シクラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  19. リコペンε−シクラーゼが配列番号１７と８６％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. リコペンε−シクラーゼが配列番号１７を含むアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の核酸分子。
  21. コード配列が配列番号５を含む、請求項１８に記載の核酸分子。
  22. コード配列がゼアキサンチンエピオキシダーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  23. ゼアキサンチンエピオキシダーゼが配列番号１８と７２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の核酸分子。
  24. ゼアキサンチンエピオキシダーゼが配列番号１８を含むアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の核酸分子。
  25. コード配列が配列番号６を含む、請求項２２に記載の核酸分子。
  26. コード配列がビオラキサンチンデエポキシダーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  27. ビオラキサンチンデエポキシダーゼが配列番号１９と７４％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項２６に記載の核酸分子。
  28. ビオラキサンチンデエポキシダーゼが配列番号１９を含むアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の核酸分子。
  29. コード配列が配列番号７を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
  30. コード配列が９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  31. ９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが配列番号２０と７５％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載の核酸分子。
  32. ９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼが配列番号２０を含むアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の核酸分子。
  33. コード配列が配列番号８を含む、請求項３０に記載の核酸分子。
  34. コード配列がカロテノイド開裂ジオキシゲナーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  35. カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼが配列番号２１と８３％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の核酸分子。
  36. カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼが配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の核酸分子。
  37. コード配列が配列番号９を含む、請求項３４に記載の核酸分子。
  38. コード配列がフィブリリンをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  39. フィブリリンが配列番号２２と７２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の核酸分子。
  40. フィブリリンが配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する、請求項３９に記載の核酸分子。
  41. コード配列が配列番号１０を含む、請求項３８に記載の核酸分子。
  42. コード配列がフィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素−１から選択されるフィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素をコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  43. フィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素が配列番号２３と７２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の核酸分子。
  44. フィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素が配列番号２３を含むアミノ酸配列を有する、請求項４３に記載の核酸分子。
  45. コード配列が配列番号１１を含む、請求項４２に記載の核酸分子。
  46. コード配列がゼータカロテンデサチュラーゼをコードする、請求項１に記載の核酸分子。
  47. ゼータカロテンデサチュラーゼが配列番号２４と９２％より大きい同一性があるアミノ酸配列を有する、請求項４６に記載の核酸分子。
  48. ゼータカロテンデサチュラーゼが配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する、請求項４７に記載の核酸分子。
  49. コード配列が配列番号１２を含む、請求項４６に記載の核酸分子。
  50. コード配列が遺伝子のオープンリーディングフレームである、請求項１に記載の核酸分子。
  51. 請求項５０に記載の遺伝子の転写によって作製されたｍＲＮＡ分子。
  52. 請求項５１に記載のｍＲＮＡ分子の逆転写によって作製されたｃＤＮＡ分子。
  53. 請求項１に記載の核酸分子のセグメントと相補的である、長さが８〜１００塩基のオリゴヌクレオチド。
  54. 請求項１に記載の核酸分子のコード配列を含むベクター。
  55. プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌、酵素及びウイルスベクターからなるベクターの群から選択される発現ベクターである、請求項５４に記載のベクター。
  56. 核酸分子のコード配列が構成的プロモーターと作動的に連結している、請求項５４に記載のベクター。
  57. 核酸分子のコード配列が誘導性プロモーターと作動的に連結している、請求項５４に記載のベクター。
  58. 核酸分子のコード配列が組織特異的プロモーターと作動的に連結している、請求項５４に記載のベクター。
  59. 組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項５８に記載のベクター。
  60. コーヒー種子特異的プロモーターがカロテノイド又はアポカロテノイド遺伝子プロモーターである、請求項５９に記載のベクター。
  61. カロテノイド又はアポカロテノイド遺伝子プロモーターが配列番号２５を含む、請求項６０に記載のベクター。
  62. 種子特異的プロモーターがコーヒー種子特異的プロモーターである、請求項５９に記載のベクター。
  63. 請求項５４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
  64. 植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項６３に記載の宿主細胞。
  65. コーヒー、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、モロコシ、アルファルファ、クローバー、アブラナ、ベニバナ、ヒマワリ、ラッカセイ、カカオ、トマティロ、ジャガイモ、コショウ、ナス、サトウダイコン、ニンジン、キュウリ、レタス、エンドウマメ、アスター、ベゴニア、キク、ヒエンソウ、ヒャクニチソウ、及び芝草からなる植物の群から選択される植物細胞である、請求項６４に記載の宿主細胞。
  66. 請求項６５に記載の宿主細胞から作製された稔性植物。
  67. コーヒー豆の風味又は芳香を調節する方法であって、コーヒー種子内で１つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生又は活性を調節するステップを含み、当該カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素が、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、色素体ターミナルオキシダーゼ、β−カロテンヒドロキシラーゼ、リコペンε−シクラーゼ、ゼアキサンチンエピオキシダーゼ、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ、フィブリリン、フィトエンデヒドロゲナーゼ様酵素−１、及びゼータカロテンデサチュラーゼから選択される方法。
  68. １つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生又は活性を増大するステップを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. コーヒー種子内で１つ又は複数の内因性カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素遺伝子の発現を増大するステップを含む、請求項６８に記載の方法。
  70. カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする導入遺伝子を植物中に導入するステップを含む、請求項６８に記載の方法。
  71. １つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素の産生又は活性を低下するステップを含む、請求項６７に記載の方法。
  72. １つ又は複数のカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する核酸分子をコーヒー中に導入するステップを含む、請求項７１に記載の方法。
  73. カロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードするコーヒー植物遺伝子から単離されたプロモーター。
  74. 遺伝子が配列番号１２〜２４のいずれか１つと５０％以上同一であるアミノ酸配列を有するカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする、請求項７３に記載のプロモーター。
  75. 遺伝子が配列番号１２〜２４のいずれか１つの任意のアミノ酸配列を有するカロテノイド又はアポカロテノイド生合成経路酵素をコードする、請求項７４に記載のプロモーター。
  76. 遺伝子が配列番号１〜１２で示す配列のいずれか１つと５０％以上同一であるオープンリーディングフレームを含む、請求項７３に記載のプロモーター。
  77. 遺伝子が配列番号１〜１２のいずれか１つを有するオープンリーディングフレームを含む、請求項７６に記載のプロモーター。
  78. ＴＡＴＡボックス、アブシジン酸反応性エレメント、レグミニン（ｌｅｇｕｍｉｎｉｎ）型タンパク質の発現を制御するレグミニンボックスのＲＹ反復（ＣＡＴＧＣＡ（Ｔ／ａ）（Ａ／ｇ）、少なくとも１つの脱水反応性エレメント／Ｃ−反復シス作用性配列モチーフ（Ｇ／ＡＣＣＧＡＣ）及び少なくとも１つのＥ−ボックスモチーフ（ＣＡＮＮＴＧ）からなる群から選択される１つ又は複数の制御性配列を含む、請求項７３に記載のプロモーター。
  79. 配列番号２５を含む、請求項７８に記載のプロモーター。
  80. １つ又は複数のコード配列と作動的に連結した、請求項７３に記載のプロモーターを含むキメラ遺伝子。
  81. 請求項７９に記載のキメラ遺伝子を含む、細胞を形質転換するベクター。
  82. 請求項８１に記載のベクターで形質転換された細胞。
  83. 植物細胞である、請求項８２に記載の形質転換細胞。
  84. コーヒー種の細胞である、請求項８３に記載の形質転換植物細胞。
  85. 請求項８３に記載の形質転換植物細胞を再生することによって作製された稔性トランスジェニック植物。
  86. コーヒー種である、請求項８５に記載の稔性トランスジェニック植物。
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