JP2002345461A - 胃癌特異的モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明の課題は、胃癌を診断可能なモノクロー
ナル抗体を作製することにある。 【解決手段】Subtractive immunization法により免疫し
たマウスより、モノクローナル抗体を作製し、胃癌細胞
のみならず肺癌細胞および肝癌細胞とも反応するモノク
ローナル抗体S7C4-10・S1E2-5・S5B10-1及びその産生株
を得た。

Description

【発明の詳細な説明】

【発明の属する技術的な分野】本発明は、モノクローナ
ル抗体S7C4-10・S1E2-5・S5B10-1と反応する抗原を検出
することにより、胃癌・肺癌・肝癌を診断する診断薬に
関する。

【従来の技術】胃癌に特異的であるとされる腫瘍マーカ
ーは、数多く報告されている（石井勝、癌と化学療法、
第８巻、第６号1059(1991)、石井勝、癌と化学療法、第
２２巻、第９号1139(1995)、Sen-ichiroh Hakomori(198
4) Tumor-associated carbohydrate antigen, Ann.Rev.
Immunol.2:103-126）。これらの中には、胃癌の診断に
有効なものが含まれるが、低分化の胃癌では無効な場合
が多く、現在までに抗体による胃癌の診断は実用化に到
っていない。

【０００１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、胃癌
を診断可能なモノクローナル抗体を作製することにあ
る。

【０００２】

【課題を解決するための手段】発明者らは、胃癌特異的
なモノクローナル抗体を作製する目的でSubtractiveImm
unization（Williams, C.V. et al., BioTechniques 1
2:842, 1992、Brooks,P.C. et al., J. Cell Biol., 12
2:1532, 1993）という方法を用いた。即ち、胃正常細胞
を免疫した後、シクロフォスファミドを投与して、胃正
常細胞に反応して分裂を開始したリンパ球を死滅させ、
その後に胃癌細胞を免疫して、胃正常細胞に反応しなか
ったリンパ球の集団から、胃癌細胞にのみ反応して分裂
を開始した細胞を増殖させ、その細胞をミエローマ細胞
と融合してモノクローナル抗体産生細胞を得る方法を用
いた。得られた抗体産生細胞を増殖させ、そのクローン
の中から胃正常組織あるいは培養正常細胞とは反応せ
ず、胃癌組織あるいは培養癌細胞と強く反応する抗体を
産生するクローンを見出して、本発明を完成するに到っ
た。また該抗体は胃癌のみならず、肺癌細胞株および肝
癌細胞株に反応することが見出され、本抗体が肺癌およ
び肝癌の診断にも適用可能であることが示唆された。

【０００３】すなわち本発明は、 １．癌特異的モノクローナル抗体であって、受託番号FE
RM P-18248が産生するモノクローナル抗体S7C4-10、受
託番号FERM P-18506が産生するモノクローナル抗体S1E2
-5、受託番号FERM P-18507が産生するモノクローナル抗
体S5B10-1。 ２．癌細胞により産生される、１に記載のモノクローナ
ル抗体と結合する抗原。 ３．癌細胞が胃癌細胞株、肺癌細胞株あるいは肝癌細胞
株のいずれかである２に記載のモノクローナル抗体と結
合する抗原。 ４．癌細胞が胃癌細胞株MKN-74、MKN-28、MKN-45、KATO
III、あるいは肺癌細胞株RERF-LC-AI(AOI)、1-87(LK-
1)、11-18、あるいは肝癌細胞株HepG-2、hu-H1のいずれ
かである２に記載のモノクローナル抗体と結合する抗
原。 ５．２、３、４のいずれか一項に記載の抗原を、免疫化
学的方法により検出する癌の診断薬。 ６．癌が胃癌である５に記載の診断薬。 ７．癌が肺癌である５に記載の診断薬。 ８．癌が肝癌である５に記載の診断薬。 ９．２、３、４のいずれか一項に記載の抗原と反応する
癌特異抗体。 １０．１あるいは９に記載の抗体を含んで成る、癌の診
断薬。 １１．癌が胃癌である１０に記載の診断薬。 １２．癌が肺癌である１０に記載の診断薬。 １３．癌が肝癌である１０に記載の診断薬、に関する。 本発明は、モノクローナル抗体S7C4-10・S1E2-5・S5B10
-1に関する発明であり、以下モノクローナル抗体S7C4-1
0・S1E2-5・S5B10-1を併せて本件抗体と称す。また、本
件抗体を産生する細胞株S7C4-10株・S1E2-5株・S5B10-1
株は独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託セ
ンターにそれぞれFERM P-18248・FERM P-18506・FERM P
-18507の番号で寄託しており、以下S7C4-10株・S1E2-5
株・S5B10-1株を併せて本件細胞株と称す。

【０００４】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態につい
て、１．本件抗体の取得、２．本件抗体を用いた癌の診
断、３．本件抗体と結合する抗原と反応する癌特異抗体
の取得、に関し説明する。 １．本件抗体の取得 本件抗体は、本件細胞株を培養してその培養上清より、
あるいはマウスの腹腔内で増殖させてその腹水より精製
して得ることができる。具体的には、本件細胞株を10%
のFCSを含むRPMI1640培地で増殖させ、必要ならば無血
清培地（例えばSFM101等）中で更に増殖させて、その培
養上清よりPEG（polyethylenglycol）沈殿、ゲルろ過等
の方法によりIgMを精製する。また、BALB/Cマウスをプ
リスタン（2,6,10,14テトラメチルペンタデカン、和光
純薬社製）で前処理し、2 x 10⁶〜1 x 10⁷ /mouseの本
件細胞株を接種し、１〜２週間後に、貯留した腹水を採
取して、その腹水よりIgMを精製しても良い。場合によ
っては、培養した本件細胞株よりIgMをコードするmRNA
を抽出し、遺伝子組換え技術により本件抗体の抗原認識
部位を取り出して、本件抗体が反応する抗原を認識す
る、融合蛋白質を作製することも許される。

【０００５】２．本件抗体を用いた癌の診断 1).組織染色による方法 癌が疑われる組織よりバイオプシにより取り出した組織
を、例えばO.C.T.Compound （TISSUE-TEK社製）に凍結
包埋して切片を作製し、本件抗体を用いた蛍光抗体法
（Hudson,L&Hay,F.C. Eds., Practical Immunology, Bl
ackwell Scientific Publications (1976)）、あるい
は酵素抗体法（Campbell, A.M., Monoclonal Antibody
and Immunosensor Technology, Elsevier Scientific
PublishersB.V.(1991)）により染色して、取り出した組
織が癌細胞か否かを診断することができる。 2).血清診断の方法 本件抗体の反応する抗原（以下本件抗原と称す）は、血
清あるいは血漿からELISA法・Western blot法等、本件
抗体を用いた免疫化学的方法により検出が可能である。
実施例８に示すが、本件抗原は細胞をホモゲナイズする
だけで上清中に検出されることから、本件抗原は血清あ
るいは血漿からも検出できると考えられる。具体的には
Western blot法では、血清あるいは血漿を、Laemmli U.
Kらの方法（Nature 227:680, 1970）によりSDS-PAGEを
行い、Towbin, H.らの方法によりWestern blot法を行っ
て、泳動した本件抗原をメンブレンに転写する。その
後、メンブレン上の本件抗原に本件抗体を反応させ、更
に例えば酵素標識した抗マウスIgM抗体を反応させて、
本件抗原をのバンドとして検出することができる。S7C4
-10抗体であれば46〜50 KDのバンドとして検出すること
ができる。またELISA法としては、サンドイッチ法・競
合法等が挙げられる。競合法について具体的に説明する
と、被検血清に既知量の標識した本件抗原を加え、更に
本件抗体を加えてインキュベートした後、例えば抗マウ
スIgM抗体をコートしたウェルあるいはビーズと反応さ
せる等の方法により本件抗体を分離して、分離した本件
抗体に結合している標識量を定量することにより、被検
血清中の本件抗原量を推定することが可能である。

【０００６】３．本件抗体と結合する抗原と反応する癌
特異抗体の取得 本件抗体と結合する抗原（本件抗原）は、S7C4-10抗体
であれば免疫沈降法で主要な分子量46,54 KD,および微
量な34-40,44,50,68,74 KDの蛋白質として同定できる。
またS1E2-5抗体であれば、免疫沈降法で主要な分子量4
6,54 KD,および微量な34-40,44,50,68,74 KDの蛋白質と
して、好ましくは74 KDの蛋白質として同定できる。S5B
10-1抗体であれば免疫沈降法で68,74 KD、細胞株によっ
てはさらに46,48,50,54 KDの蛋白質として同定できる。
本件抗原は、培養した癌細胞より、あるいはその培養上
清より本件抗体アフィニティーカラムを用いて精製でき
る。別法としては、 本件抗原を発現するヒト癌細胞よ
りmRNAを抽出し、cDNAライブラリーを作製して、細胞に
発現させ、本件抗原をコードするcDNAをクローニングす
ることが可能である。 また、該cDNAをクローニング
は、 本件抗原を発現するヒト癌細胞より精製した、本
件抗原のアミノ酸配列の情報からも可能である。クロー
ニングしたcDNAを適当な発現ベクターに組込めば、本件
抗原を作製することができる。これらのDNAの組換え及
び細胞へのベクターの導入は、例えば文献（Sambruck,
J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecu
lar Cloning: A Laboratory, Manual, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）に記載の方
法により行うことができる。精製した本件抗原をマウス
に免疫し、Kohler G.らの方法（Nature 256:495, 197
5）によりモノクローナル抗体産生クローンを得て、そ
れらクローンの中から、胃癌細胞とは反応するが胃正常
細胞とは反応しないクローンを選び出すことにより、本
件抗原と結合し、癌細胞を識別する抗体を取得すること
ができる。上記のハイブリドーマの作製、蛍光抗体法、
酵素抗体法は文献、例えばEd Harlow, David Lane, Ant
ibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory(1988)に記載の方法により行うことができる。

【０００７】

【発明の効果】本発明により、胃癌細胞のみならず肺癌
細胞とも反応するS7C4-10抗体・S1E2-5抗体・S5B10-1抗
体及びその産生株を取得した。

【０００８】

【実施例】以下に、具体的な例をもって本発明を示す
が、本発明はこれに限られるものではない。 ［実施例１］胃癌特異的モノクローナル抗体の作成 1）.胃癌細胞と胃正常細胞の培養 進行胃癌の治療のため全摘出された胃の癌組織と正常組
織を細切し、抗生物質、10% FCS 及び25% EPI medium
（IBL社製）を含むRPMI-1640培地で培養した。培養は37
℃、5% CO₂で25 cm² Tフラスコで行った。一週間に一度
の割合で培養液の交換を行い、約３カ月後に癌組織の培
養フラスコ24個のうち３個から癌細胞の増殖があった。
正常組織の培養フラスコからはすべて正常胃細胞が増殖
し、これらを拡大して、4種の正常胃細胞株とした。

【０００９】2）.マウスの免疫（Subtractive immuniza
tion） 第1日目にBALB/cマウス（6-8週令）に4種の正常胃細胞
株を均等に混合したもの4 x 10⁶個を腹腔に接種した。
第2日目と第3日目にシクロフォスファミド4 mg/mouseを
投与した。その後、第18日目に培養癌細胞2 x 10⁶個を
腹腔に接種し、更に第39日目に培養癌細胞3 x 10⁶個を
腹腔に接種した。第42日目に尾静脈から少量の血液を採
取し、それを1000倍に希釈した血清を用いて、蛍光抗体
法を行い、正常胃細胞より胃癌細胞に強い蛍光シグナル
を確認した。

【００１０】3）.細胞融合 第42日目に脾細胞を取出し、P3-NS1-1との細胞融合を行
った（Kohler G. et al., Nature 256:495, 1975、Galf
re, G. et al., Nature 277:131, 1979）。融合後に、
８枚の96 well平底マイクロプレートに、融合細胞（脾
細胞として1 x 10⁵/well）を、フィーダー細胞（正常マ
ウス腹腔マクロファージ、1 x 10⁴/well、Peters J.H.
Monoclonal Antibodies, Springer Laboratory, 1992）
と共に分注した。培養開始２〜３週間でハイブリドーマ
が増殖し、スクリーニングが可能となった。 4）.スクリーニング 12-wellのスライドグラス（ERIE SCIENTIFIC社製）の上
半分に培養癌細胞浮遊液、下半分に正常細胞浮遊液を滴
下し風乾、アセトンで10分固定し風乾、更にPBSに浸漬
した後に風乾した。培養上清を一滴ずつスライドグラス
の上半分と下半分に滴下し、湿潤箱に入れて室温で一時
間反応させた。培養上清を捨て、PBSに浸漬し洗浄して
風乾した。FITC標識抗マウスIgG（H+Ｌ）希釈液を滴下
して湿潤箱に入れ、室温で一時間反応させた後、標識抗
体を捨て、PBSに浸漬して洗浄し風乾した。蛍光顕微鏡
で観察して癌細胞のみに反応を観察できたハイブリドー
マS7C4をクローニングし、S7C4-10株を得た。なお本発
明者らは、本株をS7C4-10として独立行政法人産業技術
総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-18248の番
号で寄託している。S7C4-10抗体のアイソタイプをマウ
スモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Amersh
am pharmaciabiotech社製）により決定した。S7C4-10抗
体のアイソタイプはIgMであった。

【００１１】［実施例２］S7C4-10抗体を用いた胃癌細
胞の検出 胃癌組織はO.C.T.Compound （TISSUE-TEK社製）に凍結
包埋して切片を作製した。培養癌細胞株は10％ FCS添加
RPMI-1640で培養し、PBSで洗浄後、12-wellのスライド
グラス（ERIE SCIENTIFICO.）に固着させ風乾、アセト
ンで10分固定し風乾、更にPBSに浸漬した後に風乾し
た。S7C4-10株の培養上清を一滴ずつスライドグラスに
滴下し、湿潤箱に入れて室温で一時間反応させた。培養
上清を捨て、PBSに浸漬して洗浄し風乾した。更にFITC
標識抗マウスIgG（H+Ｌ）希釈液を滴下して湿潤箱に入
れ、室温で一時間反応させたあと標識抗体を捨て、PBS
に浸漬して洗浄し風乾した。グリセリン−PBS溶液を滴
下し、カバーグラスをかけて蛍光顕微鏡で観察した。

【００１２】S7C4-10抗体は胃癌組織を明確に蛍光染色
し、癌細胞の細胞質に蓄積している物質と反応している
ことが観察された。しかし、胃癌組織周辺の正常部分と
は反応しなかった（図1）。またS7C4-10抗体は、胃癌細
胞株（MKN74−図２、MKN-45）肝癌細胞株（HepG-2）、
肺癌細胞株（AOI、1-87、11-18）との反応が観察され
た。一方培養胃正常細胞（3-16）や肺培養正常細胞株
（MRC9）とは反応しなかった。癌細胞とは異なる、無限
増殖をする2種の不死化細胞（アデノウイルス5型不死化
腎細胞株293、SV-40不死化肝細胞株T5b）とも反応する
ことが観察された。またBorrmann IV型胃癌（スキルス
胃癌）組織から培養した胃癌細胞もS7C4-10抗体と反応
することを観察した。

【００１３】［実施例３］S7C4-10抗体が認識する抗原
（S7C4-10抗原）のWestern Blot法による検索 SDS-PAGE法はLaemmli U.Kらの方法（Nature 227:680, 1
970）、Western Blot法はTowbin, H.らの方法（Proc.Na
tl. Acad. Aci. USA, 76:4350, 1979）により行った。
培養癌細胞株は10% FCS添加RPMI-1640培地、不死化細胞
株は10% FCS添加D-MEM培地で培養し、PBSで洗浄した後
にsample bufferに溶解した。BCA protein assay reage
nt （PIERCE社製）により、各サンプルの蛋白量を1 mg/
mlに調製し、SDS-PAGEのレーンあたり20μgのタンパク
質を泳動した。Western Blotしたメンブレンを、S7C4-1
0抗体で染色した結果、正常細胞株に検出されず、胃癌
細胞株、肺癌細胞株、肝癌細胞株で4.6-5.0 KD部分に複
数のバンドが観察された。胃癌細胞株MKN-74とMKN-28で
は46,48,50 KDの三本のバンド、MKN-45とKATO IIIでは4
6,48 KDの二本のバンドが観察された。 また、Borrmann
IV型胃癌(スキルス胃癌)培養細胞株では46,48,50 KDの
三本のバンドが観察された。しかし、胃正常細胞では4
6,48,50 KDの何れのバンドも観察されなかった（図
３）。肺癌細胞株RERF-LC-AI(AOI)では46,48,50 KDの三
本のバンド、1-87(LK-1)、11-18では48,50 KDの二本の
バンドが観察された（図３及び図４）。肝癌細胞株, He
pG-2、hu-H1では46,48KDの二本のバンドが観察された。
また、不死化細胞のうち、アデノウイルス5型不死化腎
細胞株293では46,48,50 KDの三本のバンド、SV-40不死
化肝細胞株T5bでは46,48 KDの二本のバンドが観察され
た（図４）。また、免疫沈降法では、主要な46,54 KD、
および微量な34-40,44,50,68,74 KDが共沈した。しか
し、リンパ性白血病株Molt-4およびHTLV-1感染細胞株MT
-2Cではバンドが観察されず、また、EBVトランスフォ-
ム末梢B-cell株及び正常細胞株MRC-5、MCR-9では46,48,
50 KDの何れのバンドも観察されなかった（図４）。培
養癌細胞株、不死化細胞株、正常細胞株のどれにも56,
59 KDのバンドが観察されたが非特異反応物質と考えら
れた。

【００１４】［実施例４］S7C4-10抗体の糖鎖との反応 いくつかのビオチン化糖鎖プローブ（生化学工業）を用
いてS7C4-10抗体と糖との反応性をELISA法で検討した。
ストレプトアビジン（PIRCE)を10μg/mLの濃度に精製水
で溶解しELISAプレート（MaxiSorp, Nunc）に吸着させ
た。洗浄後4℃で17時間ブロッキング（50mM Tris・HCl,
1% BSA, 0.1M NaCl, 0.05% Tween20, pH7.5）した。ビ
オチン化糖鎖プローブ10μg/mLを１穴100μL加えて室温
で2時間インキュベートし、5回洗浄した。S7C4-10培養
上清及び培地を１穴100μL加えて室温で2時間インキュ
ベートした後5回洗浄した。2000倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体（Zymed社製）を
１穴当たり100μl加えて室温で1時間インキュベートし
た後、5回洗浄した。ABTSを基質として発色させE405nm
を測定した。下表に示す通りS7C4-10は3-α-N-Acetylga
lactosaminyl-β-N-Acetylgalactosamineと反応した。

【表１】

【００１５】［実施例６］胃癌細胞及び肺癌細胞培養上
清中のS7C4-10抗原の、ELASAによる検出 胃癌細胞株KATO III, MKN-28, MKN-45, MKN-74、および
培養胃正常細胞を25 cm²の培養フラスコで10% FCS 添加
RPMI-1640を用いてコンフルエントに増殖させ、次いで
血清無添加IMDMにmedium change を行ない、6日間培養
して継時的に培養上清を採取した。ELISA 法によるS7C4
-10抗原の検出は、癌細胞あるいは正常細胞の培養上清
0.1mlをELISAプレート（Maxisorb、Nunc社製）に吸着さ
せた後、ブロッキングした。S7C4-10抗体を含む培養上
清を0.1 ml加えて室温で1時間反応後、ペルオキシダー
ゼ標識抗マウスIgG（H+L）希釈液を加え、室温で1時間
反応した。AMPPDを基質にして発色、吸光度を405 nmと4
92 nmの２波長で測定し、その差を抗原量の指標とし
た。Western Blot法による培養上清中の S7C4-10抗原の
検出は、培養上清1 mlに氷下で100% TCAを0.1 ml加えて
30分放置、14,000 rpm 5分間遠心して沈澱を集めた。95
％エタノールで2回洗浄し、沈澱を乾燥後sample buffer
に溶解した。SDS-PAGEとWestern Blot は前記の方法に
従った。図５に示す通りELISAにより、培養6日後の胃癌
株細胞の培養上清には、S7C4-10抗原の存在が認められ
た。S7C4-10抗原は、胃正常細胞の培養上清には極めて
少なかった。また、最も量が多かったMKN-74では、培養
液中での継時的な増加が観察された（図６）。その増加
はWestern Blotでも46-48 KDのバンドの増加として確認
ができた（図６）。S7C4-10抗原が、培養上清中でも検
出されることは、この物質が癌患者の血中からも検出さ
れる可能性を示唆しており、S7C4-10抗体の癌血清診断
への応用の可能性を示している。

【００１６】［実施例７］胃癌特異的モノクローナル抗
体S1E2-5及びS5B10-1 実施例１と同様の方法で癌細胞のみに反応を観察できた
ハイブリドーマをクローニングしS7C4-10の他にS1E2-5
及びS5B10-1を得た。これらはS7C4-10と同様IgM抗体で
あった。S1E2-5及びS5B10-1は独立行政法人産業技術総
合研究所 特許生物寄託センターにそれぞれFERM P-185
06及びFERM P-18507の番号で寄託している。

【００１7】S7C4-10, S1E2-5, S5B10-1抗体が認識する
抗原（7C4-10, S1E2-5, S5B10-1抗原）が癌細胞の内部
または細胞表面に存在するかの検討をFACScanによるフ
ローサイトメトリー法によって行った。胃癌細胞株MKN-
74および胃培養正常細胞をトリプシンで分散し洗浄液
（PBS-0.2%BSA-0.05%NaN₃）で3回洗った後5 x 10⁷ cell
/mlに調製した。 0.1 ml（5 x 10 ⁶cell）をとり、各ハ
イブリドーマ培養上清0.1mlに含まれる抗体と氷上で30
分間反応させた。アイソタイプコントロールIgMはPharM
ingen社製のマウスIgM-κ（TNPに特異的）を用いた。3
回洗浄の後、FITC標識抗マウスIgG(H+L)と氷上で30分間
反応させた。再び3回洗浄の後、FACScanで測定した。ま
た、S7C4-10が認識する抗原はCytofix/CytopermTMKit
(PharMingen)によってあらかじめ細胞を固定、浸透の後
同様に各ハイブリド-マ培養上清と反応させた。図７に
示すようにS1E2-5, S5B10-1抗体が認識する抗原（S1E2-
5, S5B10-1抗原）は正常細胞にはみられず（a,c）、胃
癌細胞株MKN-74の細胞表面に存在することが解った（b,
d）。一方、S7C4-10抗体が認識する抗原（7C4-10抗原）
は図７に示すとおり胃癌細胞株MKN-74の細胞表面に存在
せず（e,f）細胞内に多量に蓄積していることが解った
（g,h）。S1E2-5, S5B10-1抗体は細胞表面に存在し、固
定しない生きた癌細胞を用いた場合においても癌細胞か
否かの同定に有用であると考えられた。S1E2-5及びS5B1
0-1抗体が反応する蛋白質を同定するため、免疫沈降法
を行った。最初に免疫沈降により共沈した蛋白質をウエ
スタンブロットで解析したところ、S1E2-5では主要な分
子量46,54 KD,および微量な34-40,44,50,68,74 KDの蛋
白質として同定された。またS5B10-1では68,74 KD、細
胞株によってはさらに46,48,50,54 KDの蛋白質として同
定された。続いて¹²⁵I-ヨウ素で胃癌細胞株を標識して
免疫沈降を行った。その結果、S1E2-5抗体では、74kDの
バンドのみが検出され、細胞表面からヨウ素標識される
S1E2-5抗体が認識する抗原は、74kDの分子量を持つと考
えられた。一方、S5B10-1抗体による同条件での免疫沈
降では有意なバンドは検出されず、細胞表面からはヨウ
素標識されにくい分子と考えられた。

【００１８】［実施例８］S7C4-10抗原の検出 1).S7C4-10抗体の調製 細胞をマウス腹腔に投与し、腹水を採取した。腹水から
抗マウスIgM抗体結合カラムを用いてS7C4-10抗体を精製
した。 2).S7C4-10抗原の調製 MKN-74細胞株を10%牛胎児血清（FCS）を含むRPMI1640培
地で150 cm²フラスコ６個で培養した。また、ヒト胃正
常部分培養細胞を10%FCSを含むRPMI1640培地：EPI Medi
a（IBL）= 2:1で150 cm²フラスコ６個で培養した。これ
らの細胞を20 mLのPBSで１回洗浄後、トリプシン-EDTA
を１フラスコあたり2 mL入れ３７℃５分インキュベート
した。そこへ5%FCSを含む培地を10 mL入れ細胞を集めて
から1,000 rpm5分遠心した。細胞の沈殿をPBS 10mLで1,
000 rpm 5分で2回遠心洗浄し、さらに1,200 rpm10分の
遠心洗浄を行い細胞の沈殿を得た。得られた細胞沈殿を
湿重量の20倍量（w/v）の可溶化用バッファーＡ（0.1 M
Tris・HCl, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA, 1% n-
Octyl glucoside, Aprotinin 1μg/mL, PMSF 100μg/m
L）、またはＢ（0.1 M Tris・HCl, pH 7.6, 0.25 MSucr
ose, 1 mM EDTA, Aprotinin 1μg/mL, PMSF100μg/mL）
に懸濁した。バッファーAで懸濁した細胞は超音波処理
し、14,000 rpm30分遠心後、その上清を抗原液とした。
バッファーＢで懸濁した細胞はDounce型ホモジナイザー
で４℃４０往復ホモジナイズし、14,000 rpm20分遠心
後、その上清を抗原液とした。

【００１９】3).S7C4-10抗体結合ビーズの調製 ダイナビーズM-450 Epoxy 0.45 mLをPBS-1 0.45 mLで３
回洗浄した。そこへPBS-1で1 mg/mLに希釈したS7C4-10
抗体を0.45 mL加え室温で16時間撹拌混合した。次にブ
ロッキングバッファー（50 mM Tris・HCl, pH 7.5, 0.1
5 M NaCl, 1% BSA, 0.1% NaN₃）に置換して、室温で60
分撹拌した。次に100% NRSに置換し、室温で30分撹拌し
た。次に、ビーズ浮遊バッファー（50mM Tris・HCl, pH
7.8, 0.15MNaCl, 1% BSA, 0.05% Tween20, 10% NRS, 0.
1% NaN₃）0.45 mLで３回洗浄後、ビーズ浮遊バッファー
でビーズを1 mg/mLに希釈して使用した。 4).ルテニウム標識S7C4-10抗体の調製 S7C4-10抗体0.5 mLをチューブにとり、そこへDMSOで10
mg/mLに溶解したルテニウムNHS(IGEN Inc.)を8μL入
れ、遮光して室温で３０分間撹拌する。次に2 Mグリシ
ンを25μL加え遮光して室温で10分間撹拌する。それ
を、セファデックスＧ-25カラムで溶出液PBS-3を用いゲ
ルろ過し、第１ピークを分取した。これをルテニウム標
識抗体希釈液（50 mM Tris・HCl, pH 7.8, 0.15 M NaC
l, 1% BSA, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.05% Tween20, 10%
NRS, 0.1% NaN₃）で20倍（v/v）に希釈して使用した。

【００２０】5).ECL測定 抗原液0μL（ブランク)、50μL、100μLに反応用溶液
（50 mM Tris・HCl, pH7.8, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 10
mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.05% Tween20, 10% NRS,0.1% Na
N₃）を全量200μLとなるように加え反応管に注入する。
この反応管、S7C4-10抗体結合ビーズおよびルテニウム
標識S7C4-10抗体をピコルミ8220（三光純薬社製）にセ
ットし、反応時間１２分-１２分の２ステップに設定しE
CL測定した。結果を図８に示した。MKN-74細胞からバッ
ファーＡを用いて調製した抗原はこの測定系では反応し
なかった。一方、MKN-74細胞からバッファーＢを用いて
調製した抗原は、濃度依存的に反応を示した。また、ヒ
ト胃正常細胞からバッファーＢを用いて調製した抗原と
は反応しなかった。従って、この測定系は、癌細胞に特
異的な抗原と反応することが示された。また、界面活性
剤を用いることなくS7C4-10抗原が抽出されたことか
ら、胃癌患者血清中でのS7C4-10抗原の検出の可能性も
示された。

【００２１】

【図面の簡単な説明】

【図１】S7C4-10抗体による胃癌組織及び癌組織周辺の
正常組織の蛍光染色。

【図２】S7C4-10抗体による胃癌細胞株MKN74の蛍光染
色。

【図３】胃癌細胞株、胃正常細胞、肺癌細胞株のS7C4-1
0抗原のウエスタンブロットによる解析。

【図４】肝癌細胞株, 不死化細胞株、リンパ性白血病
株、正常細胞株のS7C4-10抗原のウエスタンブロットに
よる解析。

【図５】胃癌株細胞の培養上清中のS7C4-10抗原のELISA
法による検出。

【図６】胃癌株MKN-74細胞の培養上清中のS7C4-10抗原
の継時的な変化。

【図７】S7C4-10, S1E2-5, S5B10-1抗体が認識する抗原
のFACScanによる解析。

【図８】S7C4-10抗原の定量。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA36 BA45 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA14 4B065 AA92X AA93X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 CA60 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 DA86 EA51 FA72

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】癌特異的モノクローナル抗体であって、受
   託番号FERM P-18248が産生するモノクローナル抗体S7C4
   -10、受託番号FERM P-18506が産生するモノクローナル
   抗体S1E2-5、受託番号FERM P-18507が産生するモノクロ
   ーナル抗体S5B10-1。
2. 【請求項２】癌細胞により産生される、請求項１に記載
   のモノクローナル抗体と結合する抗原。
3. 【請求項３】癌細胞が胃癌細胞株、肺癌細胞株あるいは
   肝癌細胞株のいずれかである請求項２に記載のモノクロ
   ーナル抗体と結合する抗原。
4. 【請求項４】癌細胞が胃癌細胞株MKN-74、MKN-28、MKN-
   45、KATO III、あるいは肺癌細胞株RERF-LC-AI(AOI)、1
   -87(LK-1)、11-18、あるいは肝癌細胞株HepG-2、hu-H1
   のいずれかである請求項２に記載のモノクローナル抗体
   と結合する抗原。
5. 【請求項５】請求項２、３、４のいずれか一項に記載の
   抗原を、免疫化学的方法により検出する癌の診断薬。
6. 【請求項６】癌が胃癌である請求項５に記載の診断薬。
7. 【請求項７】癌が肺癌である請求項５に記載の診断薬。
8. 【請求項８】癌が肝癌である請求項５に記載の診断薬。
9. 【請求項９】請求項２、３、４のいずれか一項に記載の
   抗原と反応する癌特異抗体。
10. 【請求項１０】請求項１あるいは請求項９に記載の抗体
    を含んで成る、癌の診断薬。
11. 【請求項１１】癌が胃癌である請求項１０に記載の診断
    薬。
12. 【請求項１２】癌が肺癌である請求項１０に記載の診断
    薬。
13. 【請求項１３】癌が肝癌である請求項１０に記載の診断
    薬。