JP2002325600A - 子宮内膜症のインビトロ診断法 - Google Patents
子宮内膜症のインビトロ診断法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 子宮内膜症の新規な診断手段の提供。
【解決手段】 本発明は、子宮内膜症のインビトロ診断
法において、患者サンプル中の、フィブロネクチン、イ
ンスリン状増殖因子結合たんぱく質−２、貫膜レセプタ
ＰＴＫ７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラ
ーゲンＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱ
く質（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン）、エラ
スチン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２７インター
フェロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビン、アルデ
ヒド脱水素酵素６、グラビン、ニドゲンおよびホスホリ
パーゼＣイプシロンから成る群から、少なくとも１つの
遺伝子の遺伝子産物の量を測定し、対照サンプル中のこ
の遺伝子産物の量と比較し、患者サンプル中の遺伝子産
物の量がより少ないことが子宮内膜症の存在を示唆する
ことに関する。
法において、患者サンプル中の、フィブロネクチン、イ
ンスリン状増殖因子結合たんぱく質−２、貫膜レセプタ
ＰＴＫ７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラ
ーゲンＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱ
く質（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン）、エラ
スチン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２７インター
フェロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビン、アルデ
ヒド脱水素酵素６、グラビン、ニドゲンおよびホスホリ
パーゼＣイプシロンから成る群から、少なくとも１つの
遺伝子の遺伝子産物の量を測定し、対照サンプル中のこ
の遺伝子産物の量と比較し、患者サンプル中の遺伝子産
物の量がより少ないことが子宮内膜症の存在を示唆する
ことに関する。
Description
【０００１】本発明は、子宮内膜症のインビトロ診断法
に関する。子宮内膜症は、生殖可能な年齢の女性全体の
うち概算で５％〜１０％が見舞われる、頻発する婦人科
疾患のうちの１つである(Sillem, M. 1998; Programmed
（商標）23, Suppl. 1, 1-28)。子宮内膜症は、子宮の
生理学的な粘膜被覆体以外に子宮内膜組織が生じること
を特徴としている。
に関する。子宮内膜症は、生殖可能な年齢の女性全体の
うち概算で５％〜１０％が見舞われる、頻発する婦人科
疾患のうちの１つである(Sillem, M. 1998; Programmed
（商標）23, Suppl. 1, 1-28)。子宮内膜症は、子宮の
生理学的な粘膜被覆体以外に子宮内膜組織が生じること
を特徴としている。
【０００２】痛みおよび他の多くの兆候のほかに、多く
の子宮内膜症患者は不妊であり、体外受精患者（ＩＶＦ
−インビトロ受精(in vitro Fertilisation)）の大部分
が子宮内膜症を患っている（Adamson, G.D. 1997; Sem.
Reprod. Biol. 15, 263-271)。最近では、子宮内膜症
の発生における遺伝子的要因を証明する出版物が増えて
いる(Kennedy, S. 1997; Sem. Reprod. Biol. 15, 309-
318)。例えば、子宮内膜症における腫瘍サプレッサー分
子の損失ならびに家族性頻発が記載されている。
の子宮内膜症患者は不妊であり、体外受精患者（ＩＶＦ
−インビトロ受精(in vitro Fertilisation)）の大部分
が子宮内膜症を患っている（Adamson, G.D. 1997; Sem.
Reprod. Biol. 15, 263-271)。最近では、子宮内膜症
の発生における遺伝子的要因を証明する出版物が増えて
いる(Kennedy, S. 1997; Sem. Reprod. Biol. 15, 309-
318)。例えば、子宮内膜症における腫瘍サプレッサー分
子の損失ならびに家族性頻発が記載されている。
【０００３】目下のところ、子宮内膜症は腹腔鏡を用い
て診断される。このことは身体内挿入方法で行われる。
このような方法は複雑な状況を招く（Chapron C.他、19
98;Hum. Reprod. 13, 867-872; Jansen F. W.他、1997;
Br. J. Obstet. Gynecol.104, 595-600）。この方法は
麻酔下で行われ、完全装備された手術室を前提とする。
従って、新しい診断方法が必要となる。望ましいのは、
患者にとって負担が少なく、治療に当たる医師によって
実施することができる方法である。この課題は本発明に
基づき、子宮内膜症において示差レギュレートされた遺
伝子を識別し、遺伝子産物を検出するための方法を提供
することにより解決される。
て診断される。このことは身体内挿入方法で行われる。
このような方法は複雑な状況を招く（Chapron C.他、19
98;Hum. Reprod. 13, 867-872; Jansen F. W.他、1997;
Br. J. Obstet. Gynecol.104, 595-600）。この方法は
麻酔下で行われ、完全装備された手術室を前提とする。
従って、新しい診断方法が必要となる。望ましいのは、
患者にとって負担が少なく、治療に当たる医師によって
実施することができる方法である。この課題は本発明に
基づき、子宮内膜症において示差レギュレートされた遺
伝子を識別し、遺伝子産物を検出するための方法を提供
することにより解決される。
【０００４】本発明は、子宮内膜症のインビトロ診断法
において、患者サンプル中の、フィブロネクチン、イン
スリン様増殖因子結合たんぱく質−２、膜貫通レセプタ
ＰＴＫ７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラ
ーゲンＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱ
く質（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン(Merosi
n)）、エラスチン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２
７インターフェロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビ
ン(Reticulocalbin)、アルデヒド脱水素酵素６、グラビ
ン(Gravin)、ニドゲン(Nidogen)およびホスホリパーゼ
Ｃイプシロンから成るグループから、少なくとも１つの
遺伝子の遺伝子産物の量を測定し、対照サンプル中のこ
の遺伝子産物の量と比較し、患者サンプル中の遺伝子産
物の量がより少ないことが子宮内膜症の存在を示唆する
ことに関する。
において、患者サンプル中の、フィブロネクチン、イン
スリン様増殖因子結合たんぱく質−２、膜貫通レセプタ
ＰＴＫ７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラ
ーゲンＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱ
く質（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン(Merosi
n)）、エラスチン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２
７インターフェロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビ
ン(Reticulocalbin)、アルデヒド脱水素酵素６、グラビ
ン(Gravin)、ニドゲン(Nidogen)およびホスホリパーゼ
Ｃイプシロンから成るグループから、少なくとも１つの
遺伝子の遺伝子産物の量を測定し、対照サンプル中のこ
の遺伝子産物の量と比較し、患者サンプル中の遺伝子産
物の量がより少ないことが子宮内膜症の存在を示唆する
ことに関する。
【０００５】遺伝子群を表１においてさらに詳しく説明
する。発現強度、つまり、表１に挙げた遺伝子のうちの
少なくとも１つの遺伝子産物量が測定され、対照サンプ
ル（子宮内膜症を患っていない女性）からの遺伝子産物
量と比較される。被対照サンプルは両方とも分泌期、つ
まり最終月経後１５〜２８日範囲に由来しなければなら
ない。患者サンプルの上記遺伝子のうちの少なくとも１
つの発現強度が減じられていることは、子宮内膜症の存
在を示唆している。患者サンプルは、患者の子宮内膜組
織、腹膜液、血液、膣分泌物または尿であってよい。
する。発現強度、つまり、表１に挙げた遺伝子のうちの
少なくとも１つの遺伝子産物量が測定され、対照サンプ
ル（子宮内膜症を患っていない女性）からの遺伝子産物
量と比較される。被対照サンプルは両方とも分泌期、つ
まり最終月経後１５〜２８日範囲に由来しなければなら
ない。患者サンプルの上記遺伝子のうちの少なくとも１
つの発現強度が減じられていることは、子宮内膜症の存
在を示唆している。患者サンプルは、患者の子宮内膜組
織、腹膜液、血液、膣分泌物または尿であってよい。
【０００６】遺伝子産物は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから導
出されるｃＤＮＡ、ポリペプチドまたはポリペプチド部
分である。ポリペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。
本発明による方法は、子宮内膜症の最初の診断のために
用いることができる。この場合、患者サンプル中の遺伝
子産物の量が、非発症女性の対照サンプルと比較され
る。本発明による方法は、疾患の経過を評価するのにも
用いられる。つまり、例えば治療の成果を確かめること
ができる。この場合、患者サンプルが、その患者のより
古いサンプルと比較される。
出されるｃＤＮＡ、ポリペプチドまたはポリペプチド部
分である。ポリペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。
本発明による方法は、子宮内膜症の最初の診断のために
用いることができる。この場合、患者サンプル中の遺伝
子産物の量が、非発症女性の対照サンプルと比較され
る。本発明による方法は、疾患の経過を評価するのにも
用いられる。つまり、例えば治療の成果を確かめること
ができる。この場合、患者サンプルが、その患者のより
古いサンプルと比較される。
【０００７】遺伝子産物であるポリペプチドまたはポリ
ペプチドの一部が免疫検定により検出される。このため
に、１つまたは複数のポリペプチドに対する特定抗体
が、表２に記載したグループから選択され、製造され
る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであっ
てよい。これらの抗体はそれぞれポリペプチド全体に、
または、ポリペプチドのフラグメントに対して向けられ
ていてよい。このような抗体は標準的な方法に従って、
実験動物を免疫化することにより取得される。次いで抗
体は、遺伝子産物量を測定するために、例えばＥＬＩＺ
Ａ（酵素結合イムノソルベント検定法）、ＲＩＡ（放射
線免疫検定法）または免疫組織化学で使用される(Aok
i，K. 他 1996; Forensic Sci. Int. 80, 163-173)。
ペプチドの一部が免疫検定により検出される。このため
に、１つまたは複数のポリペプチドに対する特定抗体
が、表２に記載したグループから選択され、製造され
る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであっ
てよい。これらの抗体はそれぞれポリペプチド全体に、
または、ポリペプチドのフラグメントに対して向けられ
ていてよい。このような抗体は標準的な方法に従って、
実験動物を免疫化することにより取得される。次いで抗
体は、遺伝子産物量を測定するために、例えばＥＬＩＺ
Ａ（酵素結合イムノソルベント検定法）、ＲＩＡ（放射
線免疫検定法）または免疫組織化学で使用される(Aok
i，K. 他 1996; Forensic Sci. Int. 80, 163-173)。
【０００８】さらに本発明は、子宮内膜症を診断するた
めの、本発明による抗体チップの使用に関する。抗体チ
ップは多くの場合、ガラスまたは珪素から成る、微小化
された支持体である。これらの支持体上には、公知の特
異性を有する抗体が、整列した網目の状態で高密度に固
定化される。たんぱく質／たんぱく質相互作用の検出
は、質量分析法、蛍光または表面プラズモン共鳴によっ
て行うことができる。抗体チップ上には、表２に記載し
た群から選択されたたんぱく質を特異的に結合する抗体
が固定化されてよい。抗体チップを製造して使用する方
法はKreider BL,Med Res Rev 2000,20: 212-215に記載
されている。
めの、本発明による抗体チップの使用に関する。抗体チ
ップは多くの場合、ガラスまたは珪素から成る、微小化
された支持体である。これらの支持体上には、公知の特
異性を有する抗体が、整列した網目の状態で高密度に固
定化される。たんぱく質／たんぱく質相互作用の検出
は、質量分析法、蛍光または表面プラズモン共鳴によっ
て行うことができる。抗体チップ上には、表２に記載し
た群から選択されたたんぱく質を特異的に結合する抗体
が固定化されてよい。抗体チップを製造して使用する方
法はKreider BL,Med Res Rev 2000,20: 212-215に記載
されている。
【０００９】遺伝子産物ｍＲＮＡもしくはこれから導出
されたｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によって、例えばノーザン・ブロット法によって
測定することができる。このようなヌクレオチドは、検
出しようとする遺伝子の部分配列に対して補完的な配列
を有しており、例えば色素原グループ、放射性グループ
または蛍光グループでマーキングすることができる。ハ
イブリッド形成の前に、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅
することができる(Sambrook, J 他、1989; Cold Spring
Harbor Laboratory Press)。遺伝子産物ｍＲＮＡもし
くはこれから導出されたｃＤＮＡは量的なＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）によって測定することもできる。
されたｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によって、例えばノーザン・ブロット法によって
測定することができる。このようなヌクレオチドは、検
出しようとする遺伝子の部分配列に対して補完的な配列
を有しており、例えば色素原グループ、放射性グループ
または蛍光グループでマーキングすることができる。ハ
イブリッド形成の前に、ｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅
することができる(Sambrook, J 他、1989; Cold Spring
Harbor Laboratory Press)。遺伝子産物ｍＲＮＡもし
くはこれから導出されたｃＤＮＡは量的なＰＣＲ（ポリ
メラーゼ連鎖反応）によって測定することもできる。
【００１０】ｍＲＮＡはアンチセンス−ＲＮＡとのｉｎ
ｓｉｔｕハイブリッド形成によって測定することもで
きる。この場合、アンチセンス−ＲＮＡはジオキシゲニ
ン、３２Ｐまたは３３Ｐでマーキングすることもでき
る。アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡに対して補完的なＤ
ＮＡおよび／またはＲＮＡである。アンチセンス核酸は
全体的に補完的な配列または部分配列を有していてよ
い。このような方法は当業者に良く知られている(Barla
ti, S.他、1999; Histol. Histopathol. 14, 1231-124
0)。
ｓｉｔｕハイブリッド形成によって測定することもで
きる。この場合、アンチセンス−ＲＮＡはジオキシゲニ
ン、３２Ｐまたは３３Ｐでマーキングすることもでき
る。アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡに対して補完的なＤ
ＮＡおよび／またはＲＮＡである。アンチセンス核酸は
全体的に補完的な配列または部分配列を有していてよ
い。このような方法は当業者に良く知られている(Barla
ti, S.他、1999; Histol. Histopathol. 14, 1231-124
0)。
【００１１】ハイブリッド形成はＤＮＡチップによって
行うこともできる。従って本発明はさらに、表１に記載
されたグループから選択された１つの遺伝子の完全なｃ
ＤＮＡ配列または部分配列もしくは補完的な配列に対応
する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固定化され
ているＤＮＡ−チップに関する。従って本発明はさら
に、子宮内膜症を診断するための、本発明によるＤＮＡ
−チップの使用に関する。
行うこともできる。従って本発明はさらに、表１に記載
されたグループから選択された１つの遺伝子の完全なｃ
ＤＮＡ配列または部分配列もしくは補完的な配列に対応
する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固定化され
ているＤＮＡ−チップに関する。従って本発明はさら
に、子宮内膜症を診断するための、本発明によるＤＮＡ
−チップの使用に関する。
【００１２】ＤＮＡ−マイクロアレイとしても知られる
ＤＮＡ−チップは、多くの場合ガラスまたは珪素から成
る、微小化された支持体である。この支持体の表面上
に、公知の配列を有するＤＮＡ分子が高密度の整列網目
の状態で固定化される。表面結合されたＤＮＡ分子は、
補完的な、場合によってはマーキングされた核酸とハイ
ブリッド形成される。このマーキングは蛍光色素であっ
てよい。
ＤＮＡ−チップは、多くの場合ガラスまたは珪素から成
る、微小化された支持体である。この支持体の表面上
に、公知の配列を有するＤＮＡ分子が高密度の整列網目
の状態で固定化される。表面結合されたＤＮＡ分子は、
補完的な、場合によってはマーキングされた核酸とハイ
ブリッド形成される。このマーキングは蛍光色素であっ
てよい。
【００１３】オリゴヌクレオチド−チップにおいて、本
発明によるＤＮＡ−チップ上に結合可能なオリゴヌクレ
オチドは、センス方向またはアンチセンス方向に遺伝子
産物（ｍＲＮＡもしくはこれから導出されたｃＤＮＡ）
の部分配列を形成する。ＤＮＡチップ上では、１つの遺
伝子当たり１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが結合
可能である。好ましいのは、非コード鎖から導出された
２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
発明によるＤＮＡ−チップ上に結合可能なオリゴヌクレ
オチドは、センス方向またはアンチセンス方向に遺伝子
産物（ｍＲＮＡもしくはこれから導出されたｃＤＮＡ）
の部分配列を形成する。ＤＮＡチップ上では、１つの遺
伝子当たり１つまたは複数のオリゴヌクレオチドが結合
可能である。好ましいのは、非コード鎖から導出された
２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００１４】これらのオリゴヌクレオチドは好ましくは
それぞれ、遺伝子の３’非翻訳末端から選択される。検
出のためには、表１に記載されたグループから選択され
た１つの遺伝子、複数の遺伝子または全ての遺伝子のオ
リゴヌクレオチドを使用することができる。ＤＮＡ−チ
ップの製造・使用法は例えば米国特許第５，５７８，８
３２号明細書；同第５，５５６，７５２号明細書；同第
５，５１０，２７０号明細書に記載されている。
それぞれ、遺伝子の３’非翻訳末端から選択される。検
出のためには、表１に記載されたグループから選択され
た１つの遺伝子、複数の遺伝子または全ての遺伝子のオ
リゴヌクレオチドを使用することができる。ＤＮＡ−チ
ップの製造・使用法は例えば米国特許第５，５７８，８
３２号明細書；同第５，５５６，７５２号明細書；同第
５，５１０，２７０号明細書に記載されている。
【００１５】ｃＤＮＡチップの場合、完全な遺伝子産物
（ｃＤＮＡ）またはサブフラグメント（２００〜５００
ｂｐ長）がチップ上に結合されている。この方法は例え
ば、Eckmann, L他、J Biol Chem 2000, 275: 14084-140
94に記載されている。遺伝子産物ｍＲＮＡは色素源検定
によって測定することもできる。
（ｃＤＮＡ）またはサブフラグメント（２００〜５００
ｂｐ長）がチップ上に結合されている。この方法は例え
ば、Eckmann, L他、J Biol Chem 2000, 275: 14084-140
94に記載されている。遺伝子産物ｍＲＮＡは色素源検定
によって測定することもできる。
【００１６】表の説明 表１は、子宮内膜症が存在する場合の分泌期においてダ
ウンレギュレートすることができ、ひいては子宮内膜症
の診断に使用することができる遺伝子のリストを示す。
第１列には、遺伝子の名称およびデータバンク番号（受
け入れ番号）がリストアップされている。これらの遺伝
子は検定時に示差レギュレートされるものと認められ
た。第２列にはぞれぞれ、正常状態（子宮内膜症でない
状態）に対する子宮内膜症の、分泌期(sekr. Phase)か
ら得たサンプルの比較が示されている。
ウンレギュレートすることができ、ひいては子宮内膜症
の診断に使用することができる遺伝子のリストを示す。
第１列には、遺伝子の名称およびデータバンク番号（受
け入れ番号）がリストアップされている。これらの遺伝
子は検定時に示差レギュレートされるものと認められ
た。第２列にはぞれぞれ、正常状態（子宮内膜症でない
状態）に対する子宮内膜症の、分泌期(sekr. Phase)か
ら得たサンプルの比較が示されている。
【００１７】「ダウン」はダウン・レギュレーション状
態を意味している。括弧内の第１の数値は、どのくらい
の頻度で遺伝子がアップ・レギュレートされたと認めら
れたかを示し、第２の数値は、どのくらいの頻度で遺伝
子がダウン・レギュレートされたと認められたかを示
す。このような検定においては２０の個別比較が行われ
た。第３列には、増殖期(prol. Phase)から得たサンプ
ルの比較が示されている。このような検定に際しては３
０の個別比較が行われた。
態を意味している。括弧内の第１の数値は、どのくらい
の頻度で遺伝子がアップ・レギュレートされたと認めら
れたかを示し、第２の数値は、どのくらいの頻度で遺伝
子がダウン・レギュレートされたと認められたかを示
す。このような検定においては２０の個別比較が行われ
た。第３列には、増殖期(prol. Phase)から得たサンプ
ルの比較が示されている。このような検定に際しては３
０の個別比較が行われた。
【００１８】「ダウン」は第１列におけるのと同じ状態
を意味し、「ｎｃ」は「相関なし(no correlation)」、
すなわち、この遺伝子はダウンレギュレートされたと
も、アップレギュレートされたとも認められることを意
味する。これらの数値の意味は第２列と同様である。第
４列には、分泌期から得たサンプルと、増殖期から得た
サンプルとの比較が示されている。この場合、子宮内膜
症を患っていない女性の子宮内膜が比較された。このよ
うな検定に際しては、２５の個別比較が行われた。「ア
ップ」とはアップ・レギュレーション状態を意味してい
る。数値の意味は図２と同様である。表２は、表１に示
した遺伝子によってコーディングされ、子宮内膜症存在
時に減少するように実験されるポリペプチドのリストを
示す。
を意味し、「ｎｃ」は「相関なし(no correlation)」、
すなわち、この遺伝子はダウンレギュレートされたと
も、アップレギュレートされたとも認められることを意
味する。これらの数値の意味は第２列と同様である。第
４列には、分泌期から得たサンプルと、増殖期から得た
サンプルとの比較が示されている。この場合、子宮内膜
症を患っていない女性の子宮内膜が比較された。このよ
うな検定に際しては、２５の個別比較が行われた。「ア
ップ」とはアップ・レギュレーション状態を意味してい
る。数値の意味は図２と同様である。表２は、表１に示
した遺伝子によってコーディングされ、子宮内膜症存在
時に減少するように実験されるポリペプチドのリストを
示す。
【００１９】例 例において使用された分子生物学的方法、例えばＲＮＡ
の分離、ＤＮＡの配列決定、ＲＮＡｓｅ保護、ノーザン
・ブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は標
準プロトコル、例えば公知のテキストブック、例えばMo
lecular Cloning, A Laboratory Manual(Sambrook, J.
et al. 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press)
に記載されているようなプロトコルに従って行われた。
遺伝子発現の消去式分析のための方法は例えば、Liang,
P.およびPardee, A. B. 1995; Curr. Opin. Immunol.
7, 274-280に記載されている。
の分離、ＤＮＡの配列決定、ＲＮＡｓｅ保護、ノーザン
・ブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は標
準プロトコル、例えば公知のテキストブック、例えばMo
lecular Cloning, A Laboratory Manual(Sambrook, J.
et al. 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press)
に記載されているようなプロトコルに従って行われた。
遺伝子発現の消去式分析のための方法は例えば、Liang,
P.およびPardee, A. B. 1995; Curr. Opin. Immunol.
7, 274-280に記載されている。
【００２０】例１：子宮内膜症に関連する遺伝子の識別 子宮内膜症の病状に関連する遺伝子が、次のような患者
グループの子宮内膜症サンプルを比較することによって
識別された： １．分泌期：最終月経後４〜１４日。このようなグルー
プは平滑筋腫により、子宮鏡検査または子宮摘出が実施
された患者から構成された。 ２．増殖期：最終月経後１５〜２８日。このようなグル
ープは１．に記載したような患者から構成された。 ３．分泌期プラス子宮内膜症：最終月経後４〜１４日。
このようなグループの患者は子宮内膜症を患っている。 ４．増殖期プラス子宮内膜症：最終月経後１５〜２８
日。このようなグループの患者は子宮内膜症を患ってい
る。
グループの子宮内膜症サンプルを比較することによって
識別された： １．分泌期：最終月経後４〜１４日。このようなグルー
プは平滑筋腫により、子宮鏡検査または子宮摘出が実施
された患者から構成された。 ２．増殖期：最終月経後１５〜２８日。このようなグル
ープは１．に記載したような患者から構成された。 ３．分泌期プラス子宮内膜症：最終月経後４〜１４日。
このようなグループの患者は子宮内膜症を患っている。 ４．増殖期プラス子宮内膜症：最終月経後１５〜２８
日。このようなグループの患者は子宮内膜症を患ってい
る。
【００２１】子宮内膜症を患う女性の子宮内膜が線状掻
爬によって採取された。比較グループの子宮内膜は、平
滑筋腫のため行われた子宮鏡検査または子宮摘出の範囲
の女性から採取された。組織は取り出されたあと、液体
窒素中で急速冷凍された。次いで、サンプルから総ＲＮ
Ａが抽出された。このＲＮＡは増幅され、蛍光マーカー
でマーキングされ、ＤＮＡチップ（Affymetrix社のヒト
ＳＬアレイ(Human SLarray)、約７０００個のヒト遺伝
子に対応するオリゴヌクレオチドを含む）とハイブリッ
ド形成された。ハイブリッド形成法のあと、ＤＮＡ−チ
ップがスキャナーで分析された。チップ上に位置する全
ての遺伝子配列のハイブリッド形成パターンが、全ての
サンプル間で比較された。
爬によって採取された。比較グループの子宮内膜は、平
滑筋腫のため行われた子宮鏡検査または子宮摘出の範囲
の女性から採取された。組織は取り出されたあと、液体
窒素中で急速冷凍された。次いで、サンプルから総ＲＮ
Ａが抽出された。このＲＮＡは増幅され、蛍光マーカー
でマーキングされ、ＤＮＡチップ（Affymetrix社のヒト
ＳＬアレイ(Human SLarray)、約７０００個のヒト遺伝
子に対応するオリゴヌクレオチドを含む）とハイブリッ
ド形成された。ハイブリッド形成法のあと、ＤＮＡ−チ
ップがスキャナーで分析された。チップ上に位置する全
ての遺伝子配列のハイブリッド形成パターンが、全ての
サンプル間で比較された。
【００２２】全体的に見ると、分泌期から得たサンプル
との個別比較が２０だけ、増殖期から得たサンプルとの
個別比較が３０だけ行われた。これらの比較において
は、それぞれ１つのサンプルは子宮内膜症を患う１人の
女性に由来しており、１つのサンプルは、子宮内膜症を
患っていない１人の女性に由来している。示差レギュレ
ートされたと見なされたのは、症例（１０比較）の少な
くとも半分で対照グループ（子宮内膜症を患っていない
女性のサンプル）に対して少なくとも１．５倍だけアッ
プ・またはダウン・レギュレートされた全ての遺伝子で
ある。さらに、分泌期から得たサンプルと、増殖期から
得たサンプルとの個別比較が２５だけ行われた。この場
合、子宮内膜症を患っていない女性の子宮内膜症が比較
された。
との個別比較が２０だけ、増殖期から得たサンプルとの
個別比較が３０だけ行われた。これらの比較において
は、それぞれ１つのサンプルは子宮内膜症を患う１人の
女性に由来しており、１つのサンプルは、子宮内膜症を
患っていない１人の女性に由来している。示差レギュレ
ートされたと見なされたのは、症例（１０比較）の少な
くとも半分で対照グループ（子宮内膜症を患っていない
女性のサンプル）に対して少なくとも１．５倍だけアッ
プ・またはダウン・レギュレートされた全ての遺伝子で
ある。さらに、分泌期から得たサンプルと、増殖期から
得たサンプルとの個別比較が２５だけ行われた。この場
合、子宮内膜症を患っていない女性の子宮内膜症が比較
された。
【００２３】結果は表１に示されている。リストアップ
された遺伝子は示差マーカーと見なすことができる。増
殖期がその名の通り増殖プロセスによって支配されると
いう考察から、分泌期はむしろ示差期と見なすことがで
きる。このような見地から、示差にとって重要な遺伝子
は示差期にはアップ・レギュレートされ（表１、第４列
と比較せよ）、増殖期にはダウン・レギュレートされ
（表１、第３列と比較せよ）ていることが望ましい。第
１列にリストアップされた遺伝子はこのような基準を満
たし、従って示差マーカーと呼ばれる。子宮内膜症を患
う女性のこのような遺伝子がダウンレギュレートされて
いること（第２列）は、分泌期に不都合な示差があるこ
とを暗示している。
された遺伝子は示差マーカーと見なすことができる。増
殖期がその名の通り増殖プロセスによって支配されると
いう考察から、分泌期はむしろ示差期と見なすことがで
きる。このような見地から、示差にとって重要な遺伝子
は示差期にはアップ・レギュレートされ（表１、第４列
と比較せよ）、増殖期にはダウン・レギュレートされ
（表１、第３列と比較せよ）ていることが望ましい。第
１列にリストアップされた遺伝子はこのような基準を満
たし、従って示差マーカーと呼ばれる。子宮内膜症を患
う女性のこのような遺伝子がダウンレギュレートされて
いること（第２列）は、分泌期に不都合な示差があるこ
とを暗示している。
【００２４】例２：子宮内膜症の診断 １．サンプル採取 ＤＮＡ−チップ分析のために、子宮内膜組織が患者から
採取され、この組織から総ＲＮＡが分離される。次いで
ＲＮＡは増幅され、蛍光マーカーにカップリングされ
る。免疫テストのために、腹膜液、血液、膣分泌物、尿
または子宮内膜組織が患者から採取されてよい。
採取され、この組織から総ＲＮＡが分離される。次いで
ＲＮＡは増幅され、蛍光マーカーにカップリングされ
る。免疫テストのために、腹膜液、血液、膣分泌物、尿
または子宮内膜組織が患者から採取されてよい。
【００２５】２．遺伝子産物の検出 ２ａ．ＤＮＡ−チップによって 先ず、表１に記載されたグループから選択された遺伝子
から適切なＤＮＡ配列が突き止められる。適切なのは、
選択された遺伝子転写物とハイブリッド形成することが
できる配列である。次いでオリゴヌクレオチドがフォト
リソグラフィック法に基づく化学的プロセスによってチ
ップ上に製造される。このために、フォトリソグラフィ
ック・マスクが使用される。このマスクは適切なコンピ
ュータ・アルゴリズムによって形成されたものである。
から適切なＤＮＡ配列が突き止められる。適切なのは、
選択された遺伝子転写物とハイブリッド形成することが
できる配列である。次いでオリゴヌクレオチドがフォト
リソグラフィック法に基づく化学的プロセスによってチ
ップ上に製造される。このために、フォトリソグラフィ
ック・マスクが使用される。このマスクは適切なコンピ
ュータ・アルゴリズムによって形成されたものである。
【００２６】マーキングされたＲＮＡはハイブリッド形
成用オーブン内でチップと一緒に保温される。次いでチ
ップは、ハイブリッド形成プロフィルを測定するスキャ
ナ内で分析される。これにより、表１にリストアップさ
れた遺伝子のうちの１つまたな複数の遺伝子が、分泌期
においてダウンレギュレートされた（このことは子宮内
膜症を示唆する）かどうかを見極めることができる。
成用オーブン内でチップと一緒に保温される。次いでチ
ップは、ハイブリッド形成プロフィルを測定するスキャ
ナ内で分析される。これにより、表１にリストアップさ
れた遺伝子のうちの１つまたな複数の遺伝子が、分泌期
においてダウンレギュレートされた（このことは子宮内
膜症を示唆する）かどうかを見極めることができる。
【００２７】２ｂ．免疫テストにより 免疫テストを行うために、表２に記載したポリペプチド
に結合する特異的抗体が必要となる。抗体はモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。これ
らの抗体は、浄化されたたんぱく質、コーディングされ
たたんぱく質から選択されたペプチド、または、組換え
製造されたフラグメントまたは総たんぱく質に向けられ
ている。
に結合する特異的抗体が必要となる。抗体はモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。これ
らの抗体は、浄化されたたんぱく質、コーディングされ
たたんぱく質から選択されたペプチド、または、組換え
製造されたフラグメントまたは総たんぱく質に向けられ
ている。
【００２８】免疫組織化学によって分析が行われる場
合、分析しようとする患者から取り出された子宮内膜が
使用される。組織が例えばホルムアルデヒドによって適
宜に固定され、次いでパラフィン内に埋め込まれたあ
と、組織は免疫組織化学的な分析のために使用すること
ができる。このために、固定されて埋め込まれた組織か
ら、マイクロトムで適切な厚さ、例えば４μｍの厚さの
断片が調製される。次いで特異的抗体は、別に準備され
た組織断片（例えば脱パラフィン、蝋処理(Blocken)）
と一緒に所定の時間、適切な温度条件下で、例えば１時
間室温で保温される。
合、分析しようとする患者から取り出された子宮内膜が
使用される。組織が例えばホルムアルデヒドによって適
宜に固定され、次いでパラフィン内に埋め込まれたあ
と、組織は免疫組織化学的な分析のために使用すること
ができる。このために、固定されて埋め込まれた組織か
ら、マイクロトムで適切な厚さ、例えば４μｍの厚さの
断片が調製される。次いで特異的抗体は、別に準備され
た組織断片（例えば脱パラフィン、蝋処理(Blocken)）
と一緒に所定の時間、適切な温度条件下で、例えば１時
間室温で保温される。
【００２９】適切な溶液、例えばＰＢＳによる洗浄ステ
ップの後、断片は第２のステップにおいて、適切な第２
の抗体と一緒に保温される。この第２の抗体は後続の反
応のために例えばビオチン化されている。第２の抗体
は、第１の抗体の、それぞれの種にとってコンスタント
な領域に結合する。適切な保温時間および洗浄ステップ
の後、今や第３のステップにおいて、組織サンプルは例
えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと一緒に、
ストレプトアビジンにカップリングされた状態で保温さ
れる。
ップの後、断片は第２のステップにおいて、適切な第２
の抗体と一緒に保温される。この第２の抗体は後続の反
応のために例えばビオチン化されている。第２の抗体
は、第１の抗体の、それぞれの種にとってコンスタント
な領域に結合する。適切な保温時間および洗浄ステップ
の後、今や第３のステップにおいて、組織サンプルは例
えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと一緒に、
ストレプトアビジンにカップリングされた状態で保温さ
れる。
【００３０】適切な保温時間および洗浄ステップの後、
今や最後のステップにおいて、適切な色素、例えばＤＡ
Ｂの付加により、ペルオキシダーゼの触媒作用によって
酵素反応が生じる。この酵素反応は、第１の抗体が特異
的に結合している場所で色素反応を引き起こす。酵素反
応および洗浄ステップの停止後、組織断片を乾燥させ、
固定し、この断片にカバーグラスを施し、断片を顕微鏡
で分析することができる。組織サンプルにおいて量的ま
たは質的な差異があるかどうかを決定するためには、子
宮内膜症を患っていない１人の女性の１つのサンプルの
対応する対照を比較として利用しなければならない。
今や最後のステップにおいて、適切な色素、例えばＤＡ
Ｂの付加により、ペルオキシダーゼの触媒作用によって
酵素反応が生じる。この酵素反応は、第１の抗体が特異
的に結合している場所で色素反応を引き起こす。酵素反
応および洗浄ステップの停止後、組織断片を乾燥させ、
固定し、この断片にカバーグラスを施し、断片を顕微鏡
で分析することができる。組織サンプルにおいて量的ま
たは質的な差異があるかどうかを決定するためには、子
宮内膜症を患っていない１人の女性の１つのサンプルの
対応する対照を比較として利用しなければならない。
【００３１】分析がウェスタンブロット法によって行わ
れる場合、採取された組織サンプルまたは腹膜液からの
抽出物、血液、膣分泌物または尿が、ポリアクリルアミ
ドゲル電気遊動によって分離される。分離後、ゲル中で
分離されたポリペプチドが給電されることにより、適切
な支持体メンブラン、例えばニトロセルロース上に移さ
れる。支持体メンブラン上に固定されたたんぱく質は第
１のステップにおいて、特異的抗体と一緒に保温され
る。
れる場合、採取された組織サンプルまたは腹膜液からの
抽出物、血液、膣分泌物または尿が、ポリアクリルアミ
ドゲル電気遊動によって分離される。分離後、ゲル中で
分離されたポリペプチドが給電されることにより、適切
な支持体メンブラン、例えばニトロセルロース上に移さ
れる。支持体メンブラン上に固定されたたんぱく質は第
１のステップにおいて、特異的抗体と一緒に保温され
る。
【００３２】例えばＴＢＳ／ＴＢＳＴによる適切な洗浄
過程後、支持体メンブランは第２のステップにおいて、
第２の抗体と一緒に保温される。この第２の抗体は、そ
れぞれの種にとってコンスタントな第１の抗体の領域に
結合する。第２の抗体は放射性マーキングまたはカップ
リングされた酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼを
支持していてよい。このアルカリ性ホスファターゼは後
続の色素反応において、無色の基質を有色の基質に変換
する。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量に比
例するので、抽出物中に存在するポリペプチドの量的分
析のために、測定された色素の量が利用される。
過程後、支持体メンブランは第２のステップにおいて、
第２の抗体と一緒に保温される。この第２の抗体は、そ
れぞれの種にとってコンスタントな第１の抗体の領域に
結合する。第２の抗体は放射性マーキングまたはカップ
リングされた酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼを
支持していてよい。このアルカリ性ホスファターゼは後
続の色素反応において、無色の基質を有色の基質に変換
する。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量に比
例するので、抽出物中に存在するポリペプチドの量的分
析のために、測定された色素の量が利用される。
【００３３】分析が固相免疫検定によって行われる場
合、特異的抗体がポリマー支持体マトリックス、例えば
ポリ塩化ビニルに結合される。次いで、固定された抗体
は、例えば腹腔液、血液、膣分泌物または尿から採取さ
れた抽出物と一緒に保温される。適切な洗浄後、第２の
ステップにおいて第２の抗体が添加される。この第２の
抗体は、検出しようとする抗原の別の個所に特異的に結
合する。第２の抗体は例えば放射性または蛍光マーキン
グを支持しており、従って高感度の状態で検出すること
ができる。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量
に比例するので、抽出物中に存在するたんぱく質の量的
な分析のために利用することができる。
合、特異的抗体がポリマー支持体マトリックス、例えば
ポリ塩化ビニルに結合される。次いで、固定された抗体
は、例えば腹腔液、血液、膣分泌物または尿から採取さ
れた抽出物と一緒に保温される。適切な洗浄後、第２の
ステップにおいて第２の抗体が添加される。この第２の
抗体は、検出しようとする抗原の別の個所に特異的に結
合する。第２の抗体は例えば放射性または蛍光マーキン
グを支持しており、従って高感度の状態で検出すること
ができる。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量
に比例するので、抽出物中に存在するたんぱく質の量的
な分析のために利用することができる。
【００３４】ＥＬＩＺＡ（酵素結合イムノソルベント検
定法）によって分析が行われる場合、特異的抗体がポリ
マー支持体マトリックス、例えばポリ塩化ビニルに結合
される。次いで、固定された抗体は、例えば腹腔液、血
液、膣分泌物または尿から採取された抽出物と一緒に保
温される。適切な洗浄後、第２のステップにおいて第２
の抗体が添加される。この第２の抗体は、検出しようと
する抗原の別の個所に特異的に結合する。
定法）によって分析が行われる場合、特異的抗体がポリ
マー支持体マトリックス、例えばポリ塩化ビニルに結合
される。次いで、固定された抗体は、例えば腹腔液、血
液、膣分泌物または尿から採取された抽出物と一緒に保
温される。適切な洗浄後、第２のステップにおいて第２
の抗体が添加される。この第２の抗体は、検出しようと
する抗原の別の個所に特異的に結合する。
【００３５】第２の抗体は付加的に、カップリングされ
た酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼを支持してい
てよい。この酵素は触媒作用によって、後続のステップ
において無色の基質を有色の生成物へ変換する。しかし
ながら、非蛍光基質が蛍光基質に変換されてもよい。有
色生成物または蛍光生成物の量は比色計によって測定さ
れてよい。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量
に比例するので、測定された色素または蛍光生成物の量
は、抽出物中に存在するポリペプチドの量的な分析のた
めに利用することができる。
た酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼを支持してい
てよい。この酵素は触媒作用によって、後続のステップ
において無色の基質を有色の生成物へ変換する。しかし
ながら、非蛍光基質が蛍光基質に変換されてもよい。有
色生成物または蛍光生成物の量は比色計によって測定さ
れてよい。抗原に結合された第２の抗体の量は抗原の量
に比例するので、測定された色素または蛍光生成物の量
は、抽出物中に存在するポリペプチドの量的な分析のた
めに利用することができる。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【００３９】
【表４】
【００４０】
【表５】
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】
【表８】
【００４４】
【表９】
【００４５】
【表１０】
【００４６】
【表１１】
【００４７】
【表１２】
【００４８】
【表１３】
【００４９】
【表１４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 37/00 １０２ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ Ａ (72)発明者 イェルン クレーツシュマー ドイツ連邦共和国，デー−13409 ベルリ ン，キューレバイシュトラーセ 32 (72)発明者 ベルトルト クレフト ドイツ連邦共和国，デー−13158 ベルリ ン，フォンタネシュトラーセ 21 (72)発明者 エルク ビンテルハガー ドイツ連邦共和国，デー−45259 エッセ ン，フェルンブリック ５ (72)発明者 ペドロ レギドー ドイツ連邦共和国，デー−45133 エッセ ン，ダイムラーシュトラーセ 10 (72)発明者 シモネ スコッティ ドイツ連邦共和国，デー−45529 ハッテ ィンゲン，ウーレンコッテン 12 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA08 BA11 BA63 BA80 CA04 CA12 HA14 4B029 AA07 FA12 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ43 QQ52 QR32 QR35 QR55 QS34
Claims (4)
- 【請求項１】 子宮内膜症のインビトロ診断法におい
て、患者サンプル中の、フィブロネクチン、インスリン
様増殖因子結合たんぱく質−２、膜貫通レセプタＰＴＫ
７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラーゲン
ＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱく質
（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン）、エラスチ
ン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２７インターフェ
ロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビン、アルデヒド
脱水素酵素６、グラビン、ニドゲンおよびホスホリパー
ゼＣイプシロンから成る群から、少なくとも１つの遺伝
子の遺伝子産物の量を測定し、対照サンプル中のこの遺
伝子産物の量と比較し、患者サンプル中の遺伝子産物の
量がより少ないことが子宮内膜症の存在を示唆すること
を特徴とする、子宮内膜症のインビトロ診断法。 - 【請求項２】 フィブロネクチン、インスリン様増殖因
子結合たんぱく質−２、膜貫通レセプタＰＴＫ７、血小
板由来増殖因子レセプタアルファ、コラーゲンＸＶＩＩ
Ｉ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱく質（ＰＡＣＥ
４）、ラミニンＭ鎖（メロシン）、エラスチン、ＩＶ型
コラーゲンアルファ２、ｐ２７インターフェロンアルフ
ァ−誘導遺伝子、網状カルビン、アルデヒド脱水素酵素
６、グラビン、ニドゲンおよびホスホリパーゼＣイプシ
ロンから成る群からの遺伝子によりコードされた１つま
たは複数のたんぱく質に対する抗体、または、ポリペプ
チドの部分またはたんぱく質の部分に対する抗体を、子
宮内膜症の診断に使用することを特徴とする、子宮内膜
症の診断のための抗体の使用。 - 【請求項３】 ＤＮＡ−チップにおいて、該チップに少
なくとも１つのオリゴヌクレオチドが結合されており、
該オリゴヌクレオチドが、フィブロネクチン、インスリ
ン様増殖因子結合たんぱく質−２、貫膜レセプタＰＴＫ
７、血小板由来増殖因子レセプタアルファ、コラーゲン
ＸＶＩＩＩ型アルファ１、ズブチリシン状たんぱく質
（ＰＡＣＥ４）、ラミニンＭ鎖（メロシン）、エラスチ
ン、ＩＶ型コラーゲンアルファ２、ｐ２７インターフェ
ロンアルファ−誘導遺伝子、網状カルビン、アルデヒド
脱水素酵素６、グラビン、ニドゲンおよびホスホリパー
ゼＣイプシロンから成る群から選択されたＤＮＡの部分
配列、または、ＤＮＡの補完的な配列を有していること
を特徴とする、ＤＮＡ−チップ。 - 【請求項４】 ＤＮＡ−チップを子宮内膜症の診断のた
めに使用する、請求項３記載のＤＮＡ−チップの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10048633A DE10048633A1 (de) | 2000-09-25 | 2000-09-25 | Methode zur in vitro Diagnostik von Endometriose |
| DE10048633.9 | 2000-09-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002325600A true JP2002325600A (ja) | 2002-11-12 |
Family
ID=7658320
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001292209A Pending JP2002325600A (ja) | 2000-09-25 | 2001-09-25 | 子宮内膜症のインビトロ診断法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1191107A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002325600A (ja) |
| DE (1) | DE10048633A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020218465A1 (ja) * | 2019-04-26 | 2020-10-29 | 中外製薬株式会社 | 子宮内膜症の診断方法、病態モニタリング方法及びキット |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0209040D0 (en) * | 2002-04-19 | 2002-05-29 | Singapore Eye Res Inst | Improvements in diagnostics |
| ATE397098T1 (de) * | 2002-08-30 | 2008-06-15 | Oncotherapy Science Inc | Verfahren zur diagnostik von eierstock endometriose |
| EP1932926A3 (en) * | 2002-08-30 | 2008-10-08 | Oncotherapy Science, Inc. | Method of diagnosing ovarian endometriosis |
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