JP2002325583A - 環境ストレス応答性プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ストレス応答性プロモーターの提供。 【解決手段】 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環
境ストレス応答性プロモーター。(a) 植物由来の特定な
塩基配列から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDN
A、(b) 配列番号１〜１８から選ばれるいずれかの塩基
配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しく
は付加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答
性プロモーターとして機能するDNA、(c) 植物由来の特
定な塩基配列から選ばれるいずれかの塩基配列からなる
DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDN
A。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、環境ストレス応答
性プロモーターに関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子の配列決定プロジェクトによっ
て、数種の生物について大量のゲノム配列及びcDNA配列
が決定されており、植物モデルであるシロイヌナズナ(A
rabidopsis thaliana)では、２つの染色体の完全なゲノ
ム配列が決定されている(Lin, X.et al., (1999) Natur
e 402, 761-768.; Mayer, K. et al., (1999) Nature 4
02, 769-777.)。

【０００３】EST(expressed sequence tag)プロジェク
トも、発現遺伝子の発見に大いに貢献している(Hofte,
H. et al., (1993) Plant J. 4, 1051-1061.; Newman,
T. et al., (1994) Plant Physiol. 106, 1241-1255.;
Cooke, R. et al., (1996) Plant J. 9, 1O1-124. Asam
izu, E. et al., (2000) DNA Res. 7, 175-180.)。例え
ば、dbEST(National Center for Biotechnology Inform
ation(NCBI)のESTデータベース)には部分cDNA配列が含
まれており、全遺伝子の半分以上(即ち、約28,000遺伝
子)が再現されている(完全に配列決定されたシロイヌナ
ズナの２番染色体の遺伝子含有量から推定[Lin, X. et
al., (1999) Nature 402, 761-768.])。

【０００４】近年、ゲノムスケールの遺伝子発現を分析
するのにマイクロアレイ（DNAチップ）技術が有用な手
段となっている(Schena, M. et al., (1995) Science 2
70,467-470.; Eisen, M. B. and Brown, P. O. (1999)
Methods Enzymol. 303, 179-205.)。このDNAチップを用
いる技術は、cDNA配列をスライドガラス上に1,000遺伝
子/cm²以上の密度で配列させるものである。このように
配列させたcDNA配列を、異なる細胞型又は組織型のRNA
サンプルから調製した２色蛍光標識cDNAプローブ対に同
時にハイブリダイズさせることで、遺伝子発現を直接か
つ大量に比較分析することが可能となる。この技術は、
最初、48個のシロイヌナズナ遺伝子を根及び苗条におけ
るディファレンシャル発現について分析することで実証
された(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-
470.)。さらに、マイクロアレイは、熱ショック及びプ
ロテインキナーゼＣ活性化に応答する新規な遺伝子を同
定するため、ヒトcDNAライブラリーからランダムに採取
した1,000個のクローンを調査するのに使用されている
(Schena, M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 93, 10614-10619.)。

【０００５】一方、このDNAチップを用いる方法によっ
て、各種の誘導条件下における炎症性疾患関連遺伝子の
発現プロフィールの分析が行われている(Heller, R. A.
etal., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 215
0-2155.)。さらに、マイクロアレイを用いて、6,000個
を超えるコード配列からなる酵母ゲノムの動的発現につ
いても分析が行われている(DeRisi, J.L. et al., (199
7) Science 278, 680-686.; Wodicka, L. et al., (199
7) Nature Biotechnol. 15, 1359-1367.)。

【０００６】しかしながら、植物の分野では、マイクロ
アレイ分析に対しては若干の報告がなされているに過ぎ
ない(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-47
0.;Ruan, Y. et al., (1998) Plant J. 15, 821-833.;
Aharoni. A. et al., (2000) Plant Cell 12, 647-66
1.; Reymond, P. et al., (2000) Plant Cell 12, 707-
719.)。

【０００７】植物の生育は、乾燥、高塩濃度及び低温等
の環境ストレスの影響を顕著に受ける。これらのストレ
スのうち乾燥又は水分欠乏が、植物の生育及び作物の生
産にとって最も厳しい制限因子となる。乾燥ストレス
は、植物に様々な生化学的及び生理学的な応答を引き起
こす。

【０００８】植物は、これらのストレス条件下で生き抜
くために、ストレスに対する応答性及び順応性を獲得す
る。近年、転写レベルで乾燥に応答する数種の遺伝子が
記載されている(Bohnert, H.J. et al., (1995) Plant
Cell 7, 1099-1111.; Ingram, J., and Bartels, D. (1
996) Plant Mol. Biol. 47, 377-403.; Bray, E. A.(19
97) Trends Plant Sci. 2, 48-54.; Shinozaki. K., an
d Yamaguchi-Shinozaki, K. (1997) Plant Physiol. 11
5, 327-334. ； Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinoz
aki, K. (1999). Molecular responses to drought str
ess. Molecular responses to cold, drought, heat an
d salt stress in higher plants. Edited by Shinozak
i, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. R. G. Landes Com
pany.；Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K.
(2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223.)。

【０００９】一方、遺伝子導入によって植物のストレス
耐性を向上させるために、ストレス誘導性遺伝子が使用
されている(Holmberg, N., and Bulow, L. (1998) Tren
ds Plant Sci. 3, 61-66.; Bajaj, S. et al., (1999)
Mol. Breed. 5, 493-503.)。高等植物のストレス耐性と
ストレス応答の分子機構をさらに解明するためだけでな
く、遺伝子操作によって作物のストレス耐性を向上させ
るためにも、ストレス誘導性遺伝子の機能を分析するこ
とが重要である。

【００１０】DRE/CRT(乾燥応答性エレメント/C-反復配
列)は、乾燥、高塩分濃度及び低温ストレス応答性遺伝
子のABA（アブシジン酸：植物ホルモンの一種で種子の
休眠や環境ストレスのシグナル伝達因子として機能す
る。）に依存しない発現において重要なシス作動性エレ
メントとして同定されている(Yamaguchi-Shinozaki,
K.,and Shinozaki, K. (1994) Plant Cell 6, 251-26
4.; Thomashow, M.F. et al.,(1999) Plant Mol. Biol.
50, 571-599.; Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinoz
aki, K. (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-22
3.)。また、DRE/CRT応答性遺伝子発現に関与する転写因
子(DREB/CBF)がクローニングされている(Stockinger.
E.J. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,
1035-1040.; Liu, Q. et al., (1998) Plant Cell 10,
1391-1406.; Shinwari, Z.K. et al., (1998) Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 250, 161-170.; Gilmour,
S.J.et al.,(1998) Plant J. 16, 433-443.)。DREB1/CB
Fは低温応答性遺伝子発現において機能すると考えら
れ、DREB2は乾燥応答性遺伝子発現に関与している。カ
リフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの
制御下でCBF1(DREB1B)cDNAを過剰発現するトランスジェ
ニック・シロイヌナズナ植物では、凍結ストレスに対す
る強力な耐性が観察されている(Jaglo-Ottosen, K.R. e
t al., (1998) Science280, 104-106.)。

【００１１】本発明者らは、CaMV 35Sプロモーター又は
ストレス誘導性rd29Aプロモーターの制御下におけるト
ランスジェニック植物でのDREB1A(CBF3)cDNAの過剰発現
によって、ストレス誘導性DREB1A標的遺伝子の強力な構
成的発現が引き起こされ、凍結ストレス、乾燥ストレス
及び塩ストレスに対する耐性が向上することを報告して
いる(Liu, Q. et al., (1998) Plant Cell 10, 1391-14
06.; Kasuga, M. et al., (1999) Nature Biotechnol.
17, 287-291.)。また、既に本発明者らは、rd29A/lti78
/cor78、kin1、kin2/cor6.6、cor15a、rd17/cor47及びe
rd10等の６個のDREB1A標的遺伝子を同定している(Kasug
a, M. et al., (1999) Nature Biotechnol. 17, 287-29
1.)。しかしながら、トランスジェニック植物におけるD
REB1A cDNAの過剰発現が凍結、乾燥及び塩分に対するス
トレス耐性をどのように高めているのかは、十分には解
明されていない。乾燥及び凍結耐性の分子機構を研究す
るためには、DREB1Aによって制御される遺伝子をより多
く同定・分析することが重要である。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、環境ストレ
ス応答性プロモーターを提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、cDNAマイクロアレ
イ分析を応用して、新規なDREB1A標的遺伝子を同定し、
そのプロモーター領域を単離することに成功し、本発明
を完成するに至った。

【００１４】すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は
(c)のDNAを含む、環境ストレス応答性プロモーターであ
る。 (a) 配列番号１〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列
からなるDNA (b) 配列番号１〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列
において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付
加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プ
ロモーターとして機能するDNA (c) 配列番号１〜８から選ばれるいずれかの塩基配列か
らなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能
するDNA

【００１５】環境ストレスとしては、低温ストレス、乾
燥ストレス、塩ストレス及び強光ストレスからなる群か
ら選択される少なくとも１つが挙げられる。さらに、本
発明は、前記プロモーターを含む発現ベクター、又は該
発現ベクターに、さらに任意の遺伝子が組み込まれた発
現ベクターである。さらに、本発明は、前記発現ベクタ
ーを含む形質転換体である。さらに、本発明は、前記発
現ベクターを含むトランスジェニック植物（例えば、植
物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞）である。
さらに、本発明は、前記トランスジェニック植物を培養
又は栽培することを特徴とするストレス耐性植物の製造
方法である。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、乾燥処理植物及び低温処理植物等の条件
の異なる植物から、ビオチン化CAPトラッパー法(Carnin
ci. P. et al., (1996) Genomics, 37, 327-336.)によ
ってシロイヌナズナの完全長cDNAライブラリーを構築し
(Seki. M. et al., (1998) Plant J. 15, 707-720.)、
ストレス誘導性遺伝子を含む約1,300個の完全長cDNA及
び約7,000個の完全長cDNAを用いてシロイヌナズナの完
全長cDNAマイクロアレイをそれぞれ調製した。また、こ
れらの乾燥・低温誘導性の完全長cDNAに加えて、ストレ
ス応答性遺伝子の発現をコントロールする転写制御因子
であるDREB1Aの標的となる遺伝子を用いてcDNAマイクロ
アレイを作成した。そして、乾燥ストレス及び低温スト
レス下における遺伝子の発現パターンをモニターし、ス
トレス応答性遺伝子を網羅的に解析した。その結果、約
1,300個の完全長cDNAを含む完全長cDNAマイクロアレイ
から、新規な環境ストレス応答性遺伝子、すなわち、44
個の乾燥誘導性遺伝子及び19個の低温誘導性遺伝子を単
離した。44個の乾燥誘導性遺伝子のうち30個、19個の低
温誘導性遺伝子のうち10個が新規のストレス誘導性遺伝
子であった。さらに、12個のストレス誘導性遺伝子がDR
EB1Aの標的遺伝子であり、そのうち6個が新規の遺伝子
であることがわかった。また、解析の結果、約7,000個
の完全長cDNAを含むcDNAマイクロアレイから、301個の
乾燥誘導性遺伝子、54個の低温誘導性遺伝子及び211個
の高塩濃度ストレス誘導性遺伝子を単離した。

【００１７】そして、これら環境ストレス応答性遺伝子
からプロモーター領域を単離することに成功したもので
ある。以上のように、完全長cDNAマイクロアレイは、シ
ロイヌナズナの乾燥・低温ストレス誘導性遺伝子の発現
様式の解析やストレス関連転写制御因子の標的遺伝子の
解析にとって有効なツールである。

【００１８】１．プロモーターの単離 本発明のプロモーターは、低温、乾燥、高塩濃度などの
環境ストレスにより発現されるストレス応答性タンパク
質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメント
であり、転写因子と結合して、その下流の遺伝子の転写
を活性化する機能を有するものである。前記シスエレメ
ントには、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydr
ation-responsive element)、アブシジン酸応答性エレ
メント(ABRE；abscisic acid responsive element)、低
温ストレス応答性エレメントなどがあり、これらのエレ
メントに結合するタンパク質をコードする遺伝子とし
て、DRE結合タンパク質1A遺伝子(DREB1A遺伝子ともい
う)、DRE結合タンパク質1C遺伝子(DREB1C遺伝子ともい
う)、DRE結合タンパク質2A遺伝子(DREB2A遺伝子ともい
う)、及びDRE結合タンパク質2B遺伝子(DREB2B遺伝子と
もいう)等が挙げられる。

【００１９】本発明のプロモーターを単離するにあた
り、まず、マイクロアレイを用いてストレス応答性遺伝
子を単離する。マイクロアレイの作製には、シロイヌナ
ズナ（Arabidopsis）の全長cDNAライブラリーから単離
した遺伝子のほか、RD（Responsive to Dehydration）
遺伝子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝
子、kin1遺伝子、kin2遺伝子、cor15a遺伝子、また内部
標準としてα-tubulin遺伝子、さらにネガティブコント
ロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプ
ターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマ
ウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子の
計約1300のcDNAを用いることができる。

【００２０】また、本発明のプロモーターを単離する際
のマイクロアレイとしては、シロイヌナズナ（Arabidop
sis）の全長cDNAライブラリーから単離した遺伝子のほ
か、RD（Responsive to Dehydration）遺伝子、ERD（Ea
rly Responsive to Dehydration）遺伝子、内部標準と
してλコントロール鋳型DNA断片（TX803、宝酒造株式会
社製）から得られたPCR増幅断片、さらにネガティブコ
ントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレ
セプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及
びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝
子からなる計約7000のcDNAを用いることもできる。

【００２１】Kurabo製プラスミド調製装置を用いて抽出
したプラスミドDNAをシーケンス解析に用いて、DNAシー
ケンサー（ABI PRISM 3700. PE Applied Biosystems, C
A,USA）により配列を決定する。GenBank/EMBLデータベ
ースをもとに、BLASTプログラムを用いて配列のホモロ
ジー検索を行う。

【００２２】次に、ポリAセレクション後、逆転写反応
をおこない2本鎖DNAを合成し、cDNAをベクターに挿入す
る。cDNAライブラリ作成用ベクターに挿入されたcDNA
を、cDNAの両側のベクターの配列と相補的なプライマー
を用いてPCR法により増幅する。ベクターとしては、λZ
APII、λPS等が挙げられる。

【００２３】マイクロアレイは、通常の方法に従って作
製することができ、特に限定されるものではない。例え
ば、gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS SYS
TEM（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使って、
上記PCR産物をマイクロタイタープレートからロード
し、マイクロスライドガラスの上に所定間隔でスポット
する。その後、非特異的なシグナルの発現を防ぐために
スライドをブロッキング・ソルーションに浸す。

【００２４】植物材料としては野生型のほか、特定の遺
伝子の破壊株等が挙げられるが、DREB1AのcDNAが導入さ
れたトランスジェニック植物を用いることができる。植
物種は、シロイヌナズナ、タバコ，イネ等が挙げられる
が、シロイヌナズナが好ましい。乾燥及び低温ストレス
処理は公知方法の方法で行うことができる（Yamaguchi-
Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1994) Plant Cell
6, 251-264.）。

【００２５】ストレス処理にさらした後は、植物体（野
生型及びDREB1A過剰発現型形質転換体）をサンプリング
し、液体窒素を用いて凍結保存する。野生型及びDREB1A
過剰発現型形質転換体を、DREB1Aの標的遺伝子を同定す
るための実験に用いる。植物体から、公知方法又はキッ
トを用いてmRNAを単離精製する。標識用Cy3 dUTP又はCy
5 dUTP（Amersham Pharmacia）の存在下でそれぞれのmR
NAサンプルの逆転写を行い、ハイブリダイゼーションに
用いる。

【００２６】ハイブリダイゼーション後は、走査レーザ
ー顕微鏡等を用いてマイクロアレイをスキャンする。マ
イクロアレイのデータ解析用プログラムとして、Imagen
e Ver 2.0（BioDiscovery）とQuantArray（GSI Lumonic
s）等を用いることができる。スキャン後は、目的とす
る遺伝子をもつプラスミドを調製することにより、遺伝
子が単離される。

【００２７】プロモーター領域の決定は、上記単離され
た遺伝子の塩基配列を解析し、データベース（GenBank/
EMBL, ABRC）のゲノム情報をもとに、遺伝子解析用プロ
グラムを用いて行われる。単離された遺伝子は、乾燥ス
トレス誘導性及び低温ストレス誘導性の両性質を有する
もの、乾燥ストレス誘導性に特異的なもの、低温ストレ
ス誘導性に特異的なものに分類することができる（図
４）。遺伝子解析用プログラムによれば、上記遺伝子の
中から18種の遺伝子（FL3-5A3，FL5-2H15，FL5-3M24，F
L5-90，FL5-2I22，FL6-55，FL1-159，FL5-2D23，FL05-0
8P24，FL05-09-G08，FL05-09-P10，FL05-10-N02，FL05-
18-I12，FL05-21-F13，FL06-10-C16，FL06-15-P15，FL0
8-10-E21及びFL09-11-P10）が同定される。これらの遺
伝子のプロモーター領域を、それぞれ配列番号１〜１８
に示す。

【００２８】但し、本発明のプロモーターが環境ストレ
ス応答性プロモーターとして機能する限り、配列番号１
〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列において１又は
複数個、好ましくは１又は数個（例えば１〜10個、１〜
５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有
するものでもよい。さらに、配列番号１〜１８から選ば
れるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答
性プロモーターとして機能するDNAも、本発明のプロモ
ーターに含まれる。

【００２９】一旦本発明のプロモーターの塩基配列が確
定されると、その後は化学合成によって、又はクローニ
ングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるい
は該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブ
リダイズさせることによって、本発明のプロモーターを
得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法
等によって本発明のプロモーターの変異型であって変異
前のプロモーターと同等の機能を有するものを合成する
こともできる。

【００３０】なお、プロモーター配列に変異を導入する
には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又は
これに準ずる方法を採用することができる。例えば部位
特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例
えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)
などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro
Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行わ
れる。

【００３１】ここで、「環境ストレス応答性プロモータ
ーとして機能する」とは、所定の環境ストレス条件下に
プロモーターをさらしたときに、RNAポリメラーゼがプ
ロモーターに結合し、転写開始させる機能をいう。「環
境ストレス」とは、一般には非生物的ストレスを意味
し、例えば乾燥ストレス、低温ストレス、高塩濃度スト
レス、強光ストレス等をいう。「乾燥」とは水分が欠乏
した状態を意味し、「低温」とはそれぞれの生物種の生
活至適温度よりも低い温度にさらされた状態（例えばシ
ロイヌナズナの場合-20〜+21℃の温度を継続的に1時間
〜数週間さらすことをいう。また、「高塩濃度」とは、
50mM〜600mMの濃度のNaClを継続的に0.5時間〜数週間処
理したときの状態を意味する。「強光ストレス」とは、
光合成能を超える強光が植物に照射された状態を意味
し、例えば5,000〜10,000Lx以上の光が照射した場合が
該当する。これらの環境ストレスは、１種類のものを負
荷してもよく、複数種類のものを負荷してもよい。

【００３２】本発明の植物プロモーターは、配列番号１
〜１８のいずれかの塩基配列において、これらの３'末
端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、
プロモーター活性を失うことなく、その５'末端を欠失
したものを含む。さらに、本発明のプロモーターは、配
列番号１〜１８のいずれかの塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境
ストレス応答性プロモーターとして機能するDNAを含
む。ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム
濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が
42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的に
は、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温
度42℃である。

【００３３】２．発現ベクターの構築 本発明の発現ベクターは、適当なベクターに本発明のプ
ロモーターを連結(挿入)することにより得ることができ
る。本発明のプロモーターを挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラス
ミドなどが挙げられる。

【００３４】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pU
C18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド
（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNA
としてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EM
BL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さら
に、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物
ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクタ
ーを用いることもできる。

【００３５】ベクターに本発明のプロモーターを挿入す
るには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断
し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクロ
ーニングサイトに挿入してベクターに連結する方法など
が採用される。本発明においては、任意遺伝子を発現さ
せるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子
を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法
は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様であ
る。任意の遺伝子は特に限定されるものではなく、例え
ば表２に示す遺伝子やそれ以外の既知の遺伝子等が挙げ
られる。

【００３６】本発明のプロモーターは、その3'末端にレ
ポーター遺伝子、例えば、植物で広く用いられているGU
S遺伝子を連結して用いれば、GUS活性を調べることでプ
ロモーターの強さを容易に評価することができる。な
お、レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子以外にも、
ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテイン
なども用いることができる。

【００３７】このように、本発明においては、様々なベ
クターを用いることができる。さらに、本発明のプロモ
ーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方
向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクター
と呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入
することができる。

【００３８】３．形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主中
に導入することにより得ることができる。ここで、宿主
としては、プロモーター又は目的遺伝子を発現できるも
のであれば特に限定されるものではないが、植物が好ま
しい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トラン
スジェニック植物）は以下のようにして得ることができ
る。

【００３９】本発明において形質転換の対象となる植物
は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、
種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、
維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するもの
である。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ
科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参
照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるもので
はない。

【００４０】 アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana) ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum） イネ科：トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativ
a) マメ科：ダイズ(Glycine max)

【００４１】上記組換えベクターは、通常の形質転換方
法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、
アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等
によって植物中に導入することができる。例えばエレク
トロポレーション法を用いる場合は、パルスコントロー
ラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧
500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理
し、遺伝子を宿主に導入する。

【００４２】また、パーティクルガン法を用いる場合
は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用し
てもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロト
プラストを調製して使用してもよい。このように調製し
た試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/
He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物
又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の
圧力、5〜6cm程度の距離で行う。

【００４３】また、植物ウイルスをベクターとして利用
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、
カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわ
ち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなど
に挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中
に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修
飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体か
ら切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺
伝子を植物宿主に導入することができる。

【００４４】アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用
する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacteri
um)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有する
プラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるとい
う性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。
アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を
形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrob
acteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発
生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプ
ラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド
上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物
中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因
するものである。

【００４５】Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、
植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、ア
グロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目
的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。形
質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根など
は、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いる
ことが可能であり、また従来知られている植物組織培養
法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サ
イトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、
ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させ
ることができる。

【００４６】本発明のベクターは、上記植物宿主に導入
するのみならず、大腸菌(Escherichia coli）等のエッ
シェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseu
domonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces
pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あ
るいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得
ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場
合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可
能であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム
結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されて
いることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺
伝子が含まれていてもよい。

【００４７】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレク
トロポレーション法等が挙げられる。酵母を宿主とする
場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharom
ycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo
saccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換
えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法で
あれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション
法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられ
る。

【００４８】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への組
換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポ
レーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション
法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9
細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの
導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフ
ェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げら
れる。

【００４９】遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認
は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザ
ンハイブリダイゼーション法等により行うことができ
る。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プ
ライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミド
を調製するために使用した条件と同様の条件で行われ
る。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳
動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー
電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等に
より染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出
することにより、形質転換されたことを確認する。ま
た、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて
PCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さら
に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、
蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採
用してもよい。

【００５０】４．植物の製造 本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転
換植物体に再生することができる。再生方法としては、
カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変え
た培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物
体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS
培地、MS培地などが例示される。

【００５１】本発明の「植物体を製造する方法」は、上
記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主
細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植
物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換
植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生
産する工程を含む。

【００５２】形質転換植物体から植物種子を得るには、
例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含
んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させ
て、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、
種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物
体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、
水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させる
ことにより、植物体を生産する。このようにして育種さ
れた植物は、導入されたプロモーターのストレス応答性
に応じた環境ストレス耐性植物となる。

【００５３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。 〔実施例1〕 プロモーターの単離 １．材料と方法 (1) Arabidopsis cDNAクローン Arabidopsisの全長cDNAライブラリーから単離した遺伝
子に加えて、RD（Responsive to Dehydration）遺伝
子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝子、
kin1遺伝子、kin2遺伝子、cor15a遺伝子、また内部標準
としてα-tubulin遺伝子、さらにネガティブコントロー
ルとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプター
のエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマウス
のグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子の計約
1300のcDNAをマイクロアレイ作成に用いた。

【００５４】陽性対照：乾燥誘導遺伝子（脱水応答性：
rd、及び初期脱水応答遺伝子：erd） 内部標準：α-チューブリン遺伝子 陰性対照：非特異的ハイブリダイゼーションを評価する
ためにArabidopsisのデータベースにある任意の配列と
は実質的にホモロジーを有さないニコチン性アセチルコ
リン受容体εサブユニット(nAChRE)遺伝子及びマウスグ
ルココルチコイド受容体ホモログ遺伝子

【００５５】また、Arabidopsisの全長cDNAライブラリ
ーから単離した遺伝子に加えて、RD（Responsive to De
hydration）遺伝子、ERD（Early Responsive to Dehydr
ation）遺伝子、内部標準としてλコントロール鋳型DNA
断片（TX803、宝酒造株式会社製）から得られたPCR増幅
断片（以下「PCR断片」と呼ぶ）、さらにネガティブコ
ントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレ
セプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及
びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝
子からなる計約7000のcDNAをマイクロアレイ作成に用い
た。

【００５６】陽性対照：乾燥誘導遺伝子（脱水応答性：
rd、及び初期脱水応答遺伝子：erd） 内部標準：PCR断片 陰性対照：非特異的ハイブリダイゼーションを評価する
ためにArabidopsisのデータベースにある任意の配列と
は実質的にホモロジーを有さないニコチン性アセチルコ
リン受容体εサブユニット(nAChRE)遺伝子及びマウスグ
ルココルチコイド受容体ホモログ遺伝子

【００５７】(2) Arabidopsis 全長cDNAマイクロアレイ ビオチニル化CAPトラッパー法を用いて、本発明者はAra
bidopsisの植物体から、異なる条件（例えば、発芽から
成熟種子までの種々の成長段階における乾燥処理、低温
処理及び未処理）で全長cDNAライブラリーを構築した。
全長cDNAライブラリーから、本発明者は、約1300及び約
7000の独立したArabidopsis全長cDNAをそれぞれ単離し
た。公知の手法（Eisen and Brown, 1999）に従って、P
CRで増幅したcDNA断片をスライドグラス上の整列させ
た。本発明者は、以下の遺伝子を含む約1300個のArabid
opsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイ及
び約7000個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDN
Aマイクロアレイをそれぞれ調製した。

【００５８】(3) cDNAマイクロアレイを用いた乾燥誘導
性遺伝子、低温誘導性遺伝子及び高塩濃度誘導性遺伝子
の単離 本例では、約1300個のArabidopsisの全長cDNAを含有す
る全長cDNAマイクロアレイを用いて、乾燥誘導性遺伝子
及び低温誘導性遺伝子を単離した。また、約7000個のAr
abidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレ
イを用いて、乾燥誘導性遺伝子、低温誘導性遺伝子及び
高塩濃度誘導性遺伝子を単離した。

【００５９】乾燥処理植物、低温処理植物及びストレス
を受けていない植物のCy3及びCy5蛍光標識プローブを混
合し、約1300個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全
長cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。図１に
は、当該cDNAマイクロアレイの像を示す。一方のmRNAサ
ンプルをCy3-dUTPで標識し、他方のmRNAサンプルをCy5-
dUTPで標識するcDNAプローブ対の二重標識によって、マ
イクロアレイ上のDNAエレメントへの同時ハイブリダイ
ゼーションが可能となり、２種の異なる条件間(即ち、
ストレス有り又はストレス無し)における遺伝子発現の
直接的な定量測定が容易になる。ハイブリダイズさせた
マイクロアレイを、各DNAエレメントからのCy3及びCy5
発光について２つの別個のレーザーチャネルによって走
査した。次いで、各DNAエレメントの２つの蛍光シグナ
ルの強度比を相対値として測定し、マイクロアレイ上の
cDNAスポットで表される遺伝子のディファレンシャル発
現の変化を判定した。本実施例では、分析を行う２種の
実験条件下で発現レベルがほぼ同等であるα-チューブ
リン遺伝子を内部対照遺伝子として使用した。

【００６０】なお、約7000個のArabidopsisの全長cDNA
を含有する全長cDNAマイクロアレイの場合には、乾燥処
理植物、低温処理植物、高塩濃度誘導性遺伝子及びスト
レスを受けていない植物のCy3及びCy5蛍光標識プローブ
を混合してハイブリダイズさせた。また、当該cDNAマイ
クロアレイにおいては、PCR断片を内部対照遺伝子とし
て使用した。

【００６１】図２には、約1300個のArabidopsisの全長c
DNAを含有する全長cDNAマイクロアレイにおける乾燥誘
導性遺伝子又は低温誘導性遺伝子の同定手順を示す。な
お、約7000個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長c
DNAマイクロアレイの場合も、図２に示した同定手順に
準じて、乾燥誘導性遺伝子、低温誘導性遺伝子又は高塩
濃度誘導性遺伝子の同定を行った。

【００６２】1)乾燥処理又は低温処理を行った植物由来
のmRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmR
NAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNA
プローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混
合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。本
実施例では、２種の条件下で発現レベルがほぼ同等であ
るα-チューブリン遺伝子を内部対照遺伝子として使用
した。発現比率(乾燥／ストレス無し、又は低温／スト
レス無し)がα-チューブリンの２倍を超える遺伝子を、
乾燥誘導性遺伝子又は低温誘導性遺伝子とした（図
２）。

【００６３】2)35S:DREB1Aトランスジェニック植物由来
のmRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmR
NAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNA
プローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混
合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。本
実施例では、２種の条件下で発現レベルがほぼ同等であ
るα-チューブリン遺伝子を内部対照遺伝子として使用
した。35S:DREB1Aトランスジェニック植物における発現
レベルが、ストレスを受けていない野生型植物における
発現レベルの２倍を超える遺伝子を、DREB1A標的遺伝子
とした（図２）。

【００６４】乾燥処理又は低温処理を行った植物由来の
mRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmRNA
を、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNAプ
ローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混合
し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。マイ
クロアレイ分析の再現性を評価するため、同様の実験を
５回繰り返した。なお、同じmRNAサンプルを様々なマイ
クロアレイとハイブリダイズさせたところ、良好な相関
関係が認められた。発現比率(乾燥／ストレス無し、又
は低温／ストレス無し)がα-チューブリン遺伝子の２倍
を超える遺伝子を、乾燥誘導性遺伝子又は低温誘導性遺
伝子とした。

【００６５】(4) 配列の解析 遺伝子配列のホモロジー検索をおこなうため、Kurabo製
プラスミド調製装置（NA 100）を用いて抽出したプラス
ミド DNAを配列解析に用いた。DNAシーケンサー（ABI P
RISM 3700. PE Applied Biosystems, CA, USA）を用い
てダイターミネーターサイクルシーケンス法によりDNA
配列を決定した。GenBank/EMBLデータベースをもとに、
BLASTプログラムを用いて配列のホモロジー検索を行っ
た。

【００６６】(5) cDNAの増幅 cDNAライブラリ作成用ベクターとして、λZAPII（Carni
nci et al.1996）を用いた。ライブラリー用のベクター
に挿入されたcDNAを、cDNAの両側のベクターの配列と相
補的なプライマーを用いてPCR法により増幅した。プラ
イマーの配列は以下の通りである。

【００６７】FL forward 1224：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGT
CACGA(配列番号１９) FL reverse 1233：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA（配列
番号２０）

【００６８】100 μl のPCR混合液（0.25 mM dNTP，0.2
μM PCRプライマー，1 X Ex Taqバッファー，1.25 U E
x Taqポリメラーゼ （宝酒造製））に、テンプレートと
してプラスミド（1-2 ng）を加えた。PCRは、最初に94
℃で3分反応させた後、続いて95℃で1分、60℃で30秒及
び72℃で3分のサイクルを35サイクル、最後に72℃で3分
の条件で行った。PCR産物をエタノール沈澱させた後、2
5μlの3 X SSCに溶かした。0.7%アガロースゲルを用い
た電気泳動により、得られたDNAの質とPCRの増幅効率を
確認した。

【００６９】(6) cDNAマイクロアレイの作成 gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS SYSTEM
（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使って、0.5
μlのPCR産物（100-500 ng／ml）を384穴のマイクロタ
イタープレートからロードし、６枚のポリ-L-リジンで
コートしたマイクロスライドガラス（Matsunami製，S74
44）の上に280μmの間隔で5nlずつスポットした。DNAを
より等しくスポットするために、プリント後のスライド
を、熱した蒸留水を入れたビーカー内で湿らした後、10
0℃で3秒間乾燥させた。その後、スライドをスライドラ
ックに置きスライドラックをガラスチャンバーに入れ、
ブロッキング溶液（15mlの1 Mナトリウムホウ酸塩（pH
8.0），5.5g succinic無水化合物（Wako），及び335ml
の1-メチル-2-ピロリドン（Wako）を含む）をガラスチ
ャンバー注いだ。スライドラックを入れたガラスチャン
バーを上下に5回振ってさらに15分間静かに震盪し、そ
の後、熱湯を入れたガラスチャンバーにスライドラック
を移して5回振った後、2分間静置した。さらにその後、
スライドラックを95%エタノールを入れたガラスチャン
バーに移して5回振った後、30分間遠心（800rpm）し
た。

【００７０】(7) 植物材料とRNAの単離 植物材料として、寒天培地に播種して3週間栽培した（Y
amaguchi-ShinozakiとShinozaki，1994）野生型及びカ
リフラワーモザイクウイルスの35SプロモーターにDREB1
AのcDNA（Kasugaなど，1999）をつないで導入したシロ
イヌナズナ（コロンビア種）の植物体を用いた。乾燥及
び低温ストレス処理はYamaguchi-ShinozakiとShinozaki
（1994）の方法で行った。すなわち、寒天培地から引き
抜いた植物体をろ紙上に置き，22℃，相対湿度60%の条
件で乾燥処理をおこなった。22℃で栽培した植物体を4
℃に移すことにより低温処理をおこなった。また、高塩
濃度ストレス処理は、250mMのNaClを含む水溶液内で水
耕することによりおこなった。

【００７１】野生型の植物体を2時間又は10時間のスト
レス処理にさらした後サンプリングし、液体窒素を用い
て凍結保存した。また、カナマイシンを加えない寒天培
地で栽培した野生型及びDREB1A過剰発現型形質転換体
を、DREB1Aの標的遺伝子を同定するための実験に用い
た。DREB1A過剰発現型形質転換体に対しては、ストレス
処理を行わなかった。植物体から、ISOGEN（Nippon gen
e, Tokyo, Japan）を用いてトータルRNAを単離し、Olig
otex-dT30 mRNA精製キット（Takara，Tokyo，Japan）を
用いてmRNAを単離精製した。

【００７２】(8) プローブの蛍光標識 Cy3 dUTP又はCy5 dUTP（Amersham Pharmacia）の存在下
でそれぞれのmRNAサンプルの逆転写を行った。逆転写反
応のバッファー（30μl）組成は以下の通りである。

【００７３】

【００７４】42℃で1時間の反応を行った後、2つのサン
プル（Cy3でラベルしたもの及びCy5でラベルしたもの）
を混ぜ、15 μlの0.1 M NaOHと1.5 μlの20 mM EDTAを
加えて70℃で10分間処理し、さらにその後15μlの0.1 M
HClを加えた後、サンプルをMicro con 30 micro conce
ntrator（Amicon）に移した。400μlのTEバッファーを
加えてバッファー量が10〜20μlになるまで遠心し、流
出液を捨てた。400μlのTEバッファーと20μlの1mg/ml
ヒトCot-1 DNA (Gibco BRL)を加えて再び遠心した。ラ
ベリングの完了したサンプルを遠心によって回収し数μ
lの蒸留水を加えた。得られたプローブに2μlの10μg/
μl 酵母 tRNA 、2μlの1μg／μl pd（A）_12-18（Amer
sham Pharmacia）、3.4mlの20 X SSC、及び0.6μlの10%
SDSを加えた。さらに、サンプルを100℃で1分間変成処
理し、室温に30分間置いた後ハイブリダイゼーションに
用いた。

【００７５】(9) マイクロアレイハイブリダイゼーショ
ン及びスキャニング プローブをbenchtop micro centrifugeを用いて1分間の
高速遠心にかけた。泡の発生を避けるために、プローブ
をアレイの中央に置きその上にカバースリップをかぶせ
た。スライドガラス上に5μlの3 X SSCを4滴落として、
チェンバーを適度な湿度に保ち、ハイブリダイゼーショ
ン中のプローブの乾燥を防いだ。スライドガラスをハイ
ブリダイゼーション用のカセット（THC-1，BM機器）に
入れて密封した後、65℃で12〜16時間処理した。スライ
ドガラスを取り出してスライドラックに置き、溶液１
（2 X SSC，0.1%SDS）中でカバースリップを慎重にはず
した後ラックを振って洗浄し、ラックを溶液２（1 X SS
C）中に移して2分間洗浄した。さらにラックを溶液３
（0.2 X SSC）に移して2分間放置し、遠心（800rpm, 1m
in）にかけて乾燥させた。走査レーザー顕微鏡(ScanArr
ay4000; GSI Lumonics，Watertown，MA)を用いて1ピク
セルあたり10μmの解像度でマイクロアレイをスキャン
した。マイクロアレイのデータ解析用プログラムとし
て、Imagene Ver 2.0（BioDiscovery）とQuantArray（G
SI Lumonics）を用いた。

【００７６】(10) ノーザン解析 トータルRNAを用いてノーザン解析を行った（Yamaguchi
-ShinozakiとShinozaki，1994）。シロイヌナズナの全
長cDNAライブラリーからPCR法によって単離したDNA断片
をノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして用
いた。 (11) プロモーター領域の決定 データベース（GenBank/EMBL, ABRC）のシロイヌナズナ
のゲノム情報をもとに、遺伝子解析用プログラムBLAST
を用いてプロモーター領域を解析した。

【００７７】２．結果 (1) ストレス誘導性遺伝子 ストレスを受けていないシロイヌナズナ植物から単離し
たmRNAから、Cy5-dUTPの存在下で逆転写を行って蛍光標
識cDNAを調製した。低温処理(２時間)を行った植物か
ら、Cy3-dUTPで標識した第２のプローブを調製した。両
プローブを約1,300個のシロイヌナズナcDNAクローンを
含むcDNAマイクロアレイへ同時にハイブリダイズさせた
後、疑似カラー像を作成した（図１）。

【００７８】低温ストレスによって誘導された遺伝子及
び抑制された遺伝子は、それぞれ赤色及び緑色のシグナ
ルで表される。両方の処理においてほぼ同レベルで発現
した遺伝子は、黄色のシグナルとなる。各スポットの強
度は、各遺伝子の発現量の絶対値に相当する。低温誘導
性遺伝子(rd29A)は赤色のシグナルであることが分か
る。α-チューブリン遺伝子(内部対照)は黄色シグナル
であることが分かる。cDNAマイクロアレイ分析によって
合計44個の乾燥誘導性遺伝子を同定した(表１及び表
２)。

【００７９】

【表１】

【００８０】

【表２】

【００８１】表２において、乾燥及び低温誘導性遺伝子
並びにDREB1A標的遺伝子(35S:DREB1A)は、rd29、cor15
A, Kin2, erd10, kin1, rd17, erd4, FL3-5A3, FL5-77,
FL5-94, FL3-27及びFL5-2I22である。乾燥及び低温誘
導性遺伝子であるがDREB1A標的遺伝子ではないものは、
FL5-2O24, FL5-1A9, FL5-3M24及びFL5-3A15である。乾
燥特異的誘導性遺伝子は、rd20, FL6-55, FL5-3J4, FL2
-56及びFL5-2D23である。低温特異的誘導性遺伝子はDRE
B1A及びFL5-90である。なお、これらの分類結果を図４
に示す。また、表２において、「コードタンパク質又は
他の特徴」の欄には、配列のホモロジーから予想される
遺伝子産物の推定機能を示す。「乾燥」の欄における
「比」は、以下の式から求めたものである（FI:蛍光強
度）。

【００８２】比＝[（乾燥条件での各cDNAのFI）/（スト
レスを負荷しない条件での各cDNAのFI）]÷[(乾燥条件
でのα-チューブリンのFI)/(ストレスを負荷しない条件
でのα-チューブリンのFI)] 「低温」の欄における「比」は、以下の式から求めたも
のである（FI:蛍光強度）。

【００８３】比＝[(低温条件での各cDNAのFI）/（スト
レスを負荷しない条件での各cDNAのFI)]÷[(低温条件で
のα-チューブリンのFI)/(ストレスを負荷しない条件で
のα-チューブリンのFI)] 「35S:DREB1A」の欄における「比」は、以下の式から求
めたものである（FI:蛍光強度）。

【００８４】比＝[(35S:DREB1A植物の各cDNAのFI）/
（野生型植物の各cDNAのFI)]÷[(35S:DREB1A植物のα-
チューブリンのFI)/(野生型植物のα-チューブリンのF
I)] 「乾燥」の欄において、「新規又は既報」は、遺伝子が
乾燥誘導性遺伝子として報告されていなければ「新規」
と、報告されていれば「既報」とした。「低温」の欄の
低温誘導性遺伝子及び「35S:DREB1A」の欄の DREB1A標
的遺伝子についても同様である。

【００８５】表２に記載の遺伝子のうち14個（cor15A,
kin1, kin2, rd17, rd19A, rd20, rd22, rd29A, erd3,
erd4, erd7, erd10, erd14, AtP5CS）は、これまでに乾
燥誘導性遺伝子として報告されているものである(Bohne
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【００８６】これらの結果から、本発明者らのcDNAマイ
クロアレイシステムが適切に機能してストレス誘導性遺
伝子を見出したことが分かる。残りの30個の新規な乾燥
誘導性遺伝子中には、推定低温順化タンパク質(受託番
号AC006438)、LEA 76型１タンパク質(受託番号X9191
9)、非特異的脂質転移タンパク質(LTP1;受託番号M8056
7)、推定水チャネルタンパク質(受託番号AC005770)、T4
5998 EST、及びHVA22相同体(受託番号AB015098)と配列
同一性を示すcDNA(FL3-5A3、FL6-55、FL5-1N11、FL5-2O
24、FL5-2H15及びFL1-159)を見出した。

【００８７】また、cDNAマイクロアレイ分析によって合
計19個の低温誘導性遺伝子を同定した(表１及び表２)。
このうち９個は、rd29A、cor15a、kin1、kin2、rd17、e
rd10、erd7、erd4(Kiyosueら, 1994; Shinozaki及びYam
aguchi-Shinozaki, 1997, 1999, 2000; Tajiら, 1999;
Thomashow, 1999)の低温誘導性遺伝子並びにDREB1A(Liu
ら, 1998)として報告されているものである。

【００８８】同様に、残りの10個の新規な低温誘導性遺
伝子中には、推定低温順化タンパク質(受託番号AC00643
8)、フェリチン(受託番号X94248)、EXGT-A2(受託番号D6
3510)、β-アミラーゼ(受託番号AJ250341)、DC 1.2相同
体(受託番号X80342)、及びHVA22相同体(受託番号AB0150
98)と配列同一性を示すcDNA(FL3-5A3、FL5-3A15、FL5-3
P12、FL5-90、FL5-2I22及びFL1-159)を見出し、また、
ノジュリン様タンパク質(受託番号CAA22576)、イネ・グ
リオキサラーゼI(受託番号AB017042)及びLEAタンパク質
相同体(SAG21;受託番号AF053065)と配列類似性を示すcD
NA(FL5-1A9、FL5-95及びFL5-3M24)を見出した。

【００８９】また、本発明者らは、完全長cDNAマイクロ
アレイを使用して、DREB1A転写因子によって制御される
ストレス誘導性遺伝子を同定した。DREB1A標的遺伝子の
同定手順を図２に示す。CaMV 35Sプロモーターの制御下
でDREB1A cDNAを過剰発現するトランスジェニック・シ
ロイヌナズナ植物(35S:DREB1Aトランスジェニック植物)
から調製したmRNA及び野生型対照植物から調製したmRNA
を、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNAプ
ローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混合
し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。35S:
DREB1Aトランスジェニック植物における発現レベルが、
野生型対照植物における発現レベルの２倍を超える遺伝
子を、DREB1A標的遺伝子とした。

【００９０】cDNAマイクロアレイ分析によって合計12個
のDREB1A標的遺伝子を同定した(表１及び表２)。このう
ち６個は、rd29A/cor78、cor15a、kin1、kin2、rd17/co
r47及びerd10のDREB1A標的遺伝子として報告されている
ものである(Kasugaら, 1999)。同様に、残りの６個の新
規なDREB1A標的遺伝子中には、推定低温順化タンパク質
(受託番号AC006438)、DC 1.2相同体(受託番号X80342)、
エノラーゼ(受託番号X58107)及びペルオキシレドキシン
TPX1(受託番号AF121355)と配列同一性を示すcDNA(FL3-5
A3、FL5-2I22、FL5-94及びFL5-77)を見出し、また、サ
サゲ・システインプロテイナーゼ阻害剤(受託番号Z2195
4)と配列類似性を示すcDNA(FL3-27)及びerd4 cDNA(Kiyo
sueら, 1994; Tajiら, 1999)を見出した。同定された乾
燥誘導性遺伝子又は低温誘導性遺伝子を、以下の３つの
グループに分類した（図４）。

【００９１】1) 乾燥・低温誘導性遺伝子 2) 乾燥に特異的な誘導性遺伝子 3) 低温に特異的な誘導性遺伝子 以下の21個の遺伝子は、これら３つのグループへ分類す
るのが困難であったため、分類を行わなかった。

【００９２】erd3、FL3-519、FL3-3A1、FL5-1F23、FL2-
1F6、FL3-5J1、FL5-1N11、FL5-2H15、FL5-2G21、FL5-2I
23、FL5-1C20、FL2-1H6、FL5-2E17、FL3-3B1、FL5-3E1
8、FL3-2C6、FL5-1P10、FL2-5G7、FL2-1C1、FL2-5A4、
及びFL5-3P12。その結果、同定された遺伝子は、20個の
乾燥・低温誘導性遺伝子、５個の乾燥特異的誘導性遺伝
子、及び２個の低温特異的誘導性遺伝子に分類された。
次に、乾燥・低温誘導性遺伝子をさらに２つのグループ
に分類した。

【００９３】1) DREB1A標的遺伝子 2) DREB1A標的遺伝子以外 16個の乾燥・低温誘導性遺伝子は、12個のDREB1A標的遺
伝子と4個のDREB1A標的遺伝子以外の遺伝子に分類され
た。

【００９４】(2) RNAゲルブロット分析 cDNAマイクロアレイ分析では、最小限の労力で適切なデ
ータを抽出することが重要である。本発明者らは、下記
の方法によってcDNAマイクロアレイ分析の有効性を評価
した。まず、発現比率(乾燥２時間／ストレス無し)がα
-チューブリンの２倍を超える80個の遺伝子を同定し
た。80個の推定乾燥誘導性遺伝子についてノーザンブロ
ット分析を行い、44個を実際の遺伝子として同定した。
マイクロアレイの結果とノーザンブロットの結果の不一
致は、1)遺伝子の低発現、2)高いバックグラウンド、3)
cDNAスポット上の塵や引っ掻き傷、及び4)比活性の低い
不良なcDNAプローブに起因するものであった。従って、
上述の実験データに印をつけ、その半分を後続の分析か
ら排除した。このようなデータ処理を行った後、cDNAマ
イクロアレイ分析に基づいて、44個の乾燥誘導性遺伝
子、19個の低温誘導性遺伝子、及び12個のDREB1A標的遺
伝子を最終的に同定した。次いで、RNAゲルブロット分
析を行って、cDNAマイクロアレイを用いて得られた結果
を確認した。マイクロアレイ分析によって得られた発現
データの結果は、44個の乾燥誘導性遺伝子、19個の低温
誘導性遺伝子、及び12個のDREB1A標的遺伝子が同定され
た点で、ノーザンブロット分析で得られた結果と一致し
た。

【００９５】図３では、６個の新規なDREB1A標的遺伝子
(FL3-5A3、FL3-27、FL5-2I22、FL5-94、FL5-77及びerd
4)についてマイクロアレイ分析の結果とノーザンブロッ
ト分析の結果とを比較した。６個の遺伝子は全て、乾燥
及び低温処理によって誘導され、ストレスを受けない条
件下では35S:DREB1A植物中で過剰発現した。

【００９６】乾燥処理を行った野生型植物(２時間又は1
0時間乾燥（ろ紙上に放置）)、低温処理を行った野生型
植物 (4℃にて２時間又は10時間冷却)、又は未処理の35
S:DREB1Aトランスジェニック植物(35S:DREB1A対照)由来
のサンプルをCy3-dUTPで蛍光標識し、未処理の野生型植
物(対照)由来のサンプルをCy5-dUTPで標識した。cDNAマ
イクロアレイとハイブリダイズさせて走査を行い、相対
発現比率を計算して図示した（図３）。野生型植物の乾
燥、低温処理及び35S:DREB1Aトランスジェニック植物に
対するノーザンブロット分析像を示した。２つのDREB1A
標的遺伝子(FL3-5A3とFL3-27)の完全長cDNA配列は、そ
れぞれGenBank, EMBL及びDDBJデータベースに受託番号A
B044404及びAB044405で登録されている。一方、同様に
して約7000個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長c
DNAマイクロアレイを用いることによって、301個の乾燥
誘導性遺伝子、54個の低温誘導性遺伝子及び211個の高
塩濃度ストレス誘導性遺伝子を単離した。

【００９７】(3) プロモーター領域の同定 プロモーター領域を同定した結果、約1300個のArabidop
sisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイにお
いて得られた8種の遺伝子（FL3-5A3，FL5-2H15，FL5-3M
24，FL5-90，FL5-2I22，FL6-55，FL1-159，FL5-2D23）
のプロモーター領域が得られた。これらのプロモーター
の配列を、それぞれ配列番号１〜８に示す。

【００９８】 遺伝子名 プロモーター領域の配列 FL3-5A3： 配列番号１ FL5-2H15： 配列番号２ FL5-3M24： 配列番号３ FL5-90： 配列番号４ FL5-2I22： 配列番号５ FL6-55： 配列番号６ FL1-159： 配列番号７ FL5-2D23： 配列番号８

【００９９】一方、プロモーター領域を同定した結果、
約7000個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNA
マイクロアレイにおいて得られた10種の遺伝子（FL05-0
8P24，FL05-09-G08，FL05-09-P10，FL05-10-N02，FL05-
18-I12，FL05-21-F13，FL06-10-C16，FL06-15-P15，FL0
8-10-E21及びFL09-11-P10）のプロモーター領域が得ら
れた。これらのプロモーターの配列を、それぞれ配列番
号９〜１８に示す。

【０１００】 遺伝子名 プロモーター領域の配列 FL05-08-P24 配列番号９ FL05-09-G08 配列番号１０ FL05-09-P10 配列番号１１ FL05-10-N02 配列番号１２ FL05-18-I12 配列番号１３ FL05-21-F13 配列番号１４ FL06-10-C16 配列番号１５ FL06-15-P15 配列番号１６ FL08-10-E21 配列番号１７ FL09-11-P10 配列番号１８

【０１０１】ところで、保存配列「PyACGTG(G or T)C」
（Pyはピリミジン塩基すなわちCまたはTを示す。）は、
多くのABA-応答性遺伝子においてABA-応答性エレメント
（ABRE）として機能することが知られている（Ingram,
J., and Bartels, D. (1996) Plant Mol. Biol. 47, 37
7-403.；Bray, E. A. (1997) Trends Plant Sci. 2,48-
54.；Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (1
999). Molecular responses to drought stress. Molec
ular responses to cold, drought, heat and salt str
ess in higher plants. Edited by Shinozaki, K. and
Yamaguchi-Shinozaki, K. R. G. Landes Company.）。
また、９塩基の保存配列「TACCGACAT」（乾燥応答性エ
レメント：DRE）は、乾燥、低温及び高塩濃度のストレ
ス条件下においてrd29A発現の誘導調節に必須である
が、ABA-応答性エレメント（ABRE）として機能しないこ
とが知られている（Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shi
nozaki, K. (1994) Plant Cell 6, 251-264.）。DRE及
びDRE関連コアモチーフ（CCCAG）であるCRT又はLTREは
また、乾燥及び低温誘導性遺伝子（例えばkin1, kin2,r
d17/cor47, cor15a）の領域内に存在することが知られ
ている（表３、Baker, S.S. et al., (1994) Plant Mo
l. Biol. 24, 701-713.；Wang, H. et al., (1995) Pla
nt Mol. Biol. 28, 605-617.；Iwasaki, T. et al., (1
997) Plant Physiol. 115, 1287.）。

【０１０２】

【表３】

【０１０３】表３において、a)、b)及びc)の意味は、そ
れぞれ以下の通りである。 a): ABRE、DRE及びCCGACコア配列は、単離された最も長
いcDNAの5’末端から1000bp上流に観察された配列であ
る。 b): 括弧内の数字は、単離されたcDNAの5'末端で始まる
ヌクレオチドを示す。マイナスの表示は、ヌクレオチド
が推定転写開始部位の5'末端よりも上流に存在すること
を意味する。 c): CCGACコアモチーフを含むこれら9塩基の配列は、互
いにオーバーラップしている。

【０１０４】本発明者は、12個のDREB1A標的遺伝子をcD
NAマイクロアレイ解析により同定した。9bpのDRE配列
は、FL3-5A3及びFL3-27のcDNAに対応する遺伝子のプロ
モーター領域に観察される（表３）。コアとなるCCGAC
配列は、FL3-5A3、FL5-2I22、FL5-77及びFL5-94のcDNA
に対応する遺伝子のプロモーター領域において観察され
る（表３）。ほとんどの乾燥及び低温誘導性遺伝子は、
DREB1A標的遺伝子であり、DRE/CRT シス作用性エレメン
トをプロモーター中に含んでいる（表３及び図４）。AB
RE配列（「PyACGTG(G or T)C」）は、同定した12個のDR
EB1A標的遺伝子のうち6個のプロモーター領域において
観察された（表３）。このことは、多くの乾燥及び低温
誘導性遺伝子が、ABA-依存性及びABA-独立の経路の両者
によって調節されていることを示すものである。しかし
ながら、いくつかの乾燥及び低温誘導性遺伝子（FL5-3M
24, FL5-3A15, FL5-1A9, FL5-2O24）は、35S:DREB1Aト
ランスジェニック植物において増加しなかった（図
４）。このことは、これらの遺伝子がDREB1A標的遺伝子
ではないことを示すものである。コア配列「CCGAC」
は、FL5-3M24のcDNAの5'末端側の2,000bp上流領域にお
いて観察されなかった。この結果は、乾燥及び低温誘導
性遺伝子発現に関与する新規シス作用性エレメントが、
FL5-3M24遺伝子のプロモーター領域に存在する可能性を
示すものである。

【０１０５】(4) 各種ストレス処理時間と発現比率との
関係 上述したように単離された18種類の各種ストレス誘導性
遺伝子について、以下のように、各種ストレス処理時間
と発現比率との関係を検討した結果を図5〜図39に示
す。 遺伝子名 ストレス処理（結果を示す図） FL3-5A3： 低温処理（図5）、乾燥処理（図6）、高塩濃度処理（図7） FL5-2H15： 低温処理（図8）、乾燥処理（図9）、高塩濃度処理（図10） FL5-3M24： 乾燥処理（図11）、高塩濃度処理（図12） FL5-90： 低温処理（図13） FL5-2I22： 低温処理（図14）、乾燥処理（図15）、高塩濃度処理（図16） FL6-55： 乾燥処理（図17）、高塩濃度処理（図18） FL1-159： 乾燥処理（図19） FL5-2D23： 乾燥処理（図20）、高塩濃度処理（図21） FL05-08-P24： 乾燥処理（図22） FL05-09-G08： 乾燥処理（図23） FL05-09-P10： 乾燥処理（図24）、ABA処理（図25） FL05-10-N02： 高塩濃度処理（図26） FL05-18-I12： 乾燥処理（図27）、高塩濃度処理（図28）、ABA処理（図29） FL05-21-F13： 乾燥処理（図30）、低温処理（図31） FL06-10-C16： 乾燥処理（図32）、高塩濃度処理（図33）、ABA処理（図34） FL06-15-P15： 乾燥処理（図35）、高塩濃度処理（図36）、ABA処理（図37） FL08-10-E21： 乾燥処理（図38） FL09-11-P10： 高塩濃度処理（図39） これら図５〜図３９に示すように、本方法により単離さ
れたストレス誘導性遺伝子は、それぞれ異なるプロファ
イルであるが、各種ストレスの付加により発現誘導され
ていることが判る。

【０１０６】

【発明の効果】本発明により、ストレス応答性プロモー
ターが提供される。本発明のプロモーターは、環境スト
レス耐性植物の分子育種に使用できる点で有用である。

【０１０７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN TOYOTA MOTOR CORPORATION <120> A STRESS-RESPONSIVE PROMOTER <130> RJH13-061 <140> <141> <150> 2000-356652 <151> 2000-11-22 <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2072 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 tgggcttttg atccacatga cgatcatata gttctttcct tcaacacaaa acacttgaag 60 tgtatcttat caactaaact ctattccagc aaaattattt caaaattaga tatatgggag 120 aatttttaca ggccattcta gattttcatt aacgctgtga tttatccgtt aataagtacg 180 attaagagta aaacgacgtc gtttgcaatt gaaacaaaaa tccccaattc agaaataaga 240 aaccctagat cctcaaatct cttcttcttt tcttcttcga attcactcct gtattttgaa 300 atcaaagtga attgcaaggc acaaagttca tgctttaaag cactgcaaat ggcgaagtca 360 tgatttatat ggcatttttc ctgtttttgt ttcaattgca aacgacgtcg ttttgctctt 420 aaacggtctc attaacggat aaatcacatc ttctaattgc tctgtttatt cagttgatgt 480 tgtgactaat ttggctctgt caacgaaagt tagtgatttt atctgaagtc aacacgtaat 540 tgatgatttt aatcacaaag tacaaagttt atgtttaaag caccacaaat tgcgaagtcg 600 tgatttaaat gacatttttc ccgttctggt taaactaagt 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atctttgtag tcctgatttt gaatatttcg ttttagctaa 1440 atcagctcca atttttccca gttatcgttt gtcgaattca tattactgtt aatttagtta 1500 acttccgaag actattagta catgattctt caacaaagca aataaagaaa agaatcttga 1560 tgtcgttctc tcaacaattc aacaaaactt ggtctcgacg actcgaccgt gtgagatgtt 1620 tgagaagtca gaacaccaca cgtgtcgaca taaagcccgc accacgcacg cttttcgtct 1680 ggatatatcc aaattacttt acagaaatca tttgtattgt ttgttaataa aaactttgaa 1740 ccactttgat tactatatta tttttttgga atttattctg gtgacattaa tgttctatcc 1800 tccacgcggt tctcataaac cgacttggct tctttatttt tcctttatct ttctctatat 1860 atttacacac acacgcattt gtgcagagat attcaaagat tagaaacatt cttgatagat 1920 acaaaaaaca tttttcagac acaaaatcat aaaatctttg cctttagtag atcaaagttc 1980 tttacattaa tcgttagaag 2000 <210> 16 <211> 2000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 16 ttagctgggg caggtcggct tgatttcatt gaggatctgc ttgagcatca gaagacactt 60 ccacaaggta ggcgtgaggg tttcattgtt aggattataa tgttgtatgg caaggctgga 120 atgacgaagc aagcacttga tactttcttc aatatggatt tatacggttg caaaagatct 180 gttaagtcct tcaatgccgc tcttcaagtc ttatctttca atcctgatct ccacaccatc 240 tgggagttcc ttcacgacgc cccatcgaag tatggcattg atattgatgc ggtttctttt 300 aacattgcca ttaaatcttt ctgtgagctg ggtattcttg acggggccta tatggcaatg 360 agggagatgg agaaatcagg gttaacacca gatgtagtta catatactac acttatatcg 420 gcgttataca agcacgagag gtgtgtgatt ggaaatggat tgtggaacct tatggtcctc 480 aagggctgta agccgaacct caccactttt aatgttagga ttcagttttt agtgaatagg 540 agacgagctt gggatgcaaa tgatctgttg ctgttgatgc ctaaactcca ggtggaaccg 600 gacagcataa catataacat ggttatcaaa gggtttttcc ttgcgaggtt ccctgacatg 660 gcggaaagag tttatacagc gatgcatggt aaggggtaca aacccaattt gaagatatac 720 cagacgatga ttcactattt gtgcaaggca ggaaattttg atttggctta tacaatgtgc 780 aaggattgta tgagaaagaa gtggtaccca aacttggaca cagttgagat gttgctcaaa 840 gggcttgtga aaaaggggca gcttgatcag gctaagtcga tcatggagtt agttcacaga 900 agagtacctc ctttcaggtc aaaacagttg ctctccctta agtccatttt gtaatgttta 960 catgaaatgg aacaaatttg ctacatgtac acgacaatgc ggccaaaaga attctttctt 1020 tctttctcct gagtttattt tgtatagctg tggtggaact ggaaatggga tgtagcctca 1080 tattaggagg cacacttatc ttccaatcag attcaactat ttgttgttca atgtgaataa 1140 agcttaggat gatttggaaa cttcaatgga gggataccca gtaagtcatg gatgcctcta 1200 caatcttaag ttgtgatagc acagaactag tttacctttt gtaatgctac ttacaaaaca 1260 tgttgttgat ttcagctgga gagcaaaatg gcatacacaa agcagggacc atgtgctgaa 1320 gaaaccaaaa ggatcttcgt ctgacgatgc aaaagctctt gagcacctgg aaaaatgagt 1380 tatgttgtaa gcttcatcta gccaaattaa aagcactaaa catataacaa aggatatcaa 1440 cgttgatagc tttttcttga tatagcacga atgtaaacaa cagagaatag aacagagaca 1500 acattaccag caatgaatat ttttattatt atgtcgaata aatacatttt cccacaagtg 1560 acagagcaaa caaaattcac atatttttgt ctattacact ttggtgtcag actgacttgt 1620 tacgtagatt tatggcggtg gattataaca ttgtaacttt aaatatcttt taacgtaaga 1680 aacaaaactc caaaattggt gtttattttt aaaaataaaa atttgagggg gcatgtatgt 1740 ttgtttagtt gattcacgtg ttctttgtgt ctgaaaattc tgaatttgat gattttgaaa 1800 aaggaaaaaa agatacgagg tatcctcaat tccaaaagga tgaatgatac aactcatata 1860 tacaagatta tagtaaaaag aagggatgca tataaagaaa catagacatc atcgccatcc 1920 atcctcagat cagttccgta gtttactgga tcacgacaca cacacatata cacgtgtaca 1980 tataagccat tcttatcaaa 2000 <210> 17 <211> 2000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 17 cacatttgac ggcgaatcaa gcgattctag aagcgacgga gaagtcgaac aagattcaca 60 tcgtcgattt tggaatcgtt caaggtatac aatggcctgc tcttcttcaa gctctagcta 120 ctcgtacttc tggtaaaccc actcaaatcc gggtctcggg tatacccgct ccatctctcg 180 gtgaatctcc ggaaccgtcg ttaatcgcca ccggaaaccg cctccgtgat ttcgccaagg 240 ttctggatct gaatttcgat ttcatcccaa ttctcactcc catacattta cttaacgggt 300 caagtttccg ggtcgacccg gatgaagtac tggccgtgaa tttcatgctc cagctctaca 360 aattactcga cgagacgccg acgatagttg acaccgcact acggctcgcc aaatcgttga 420 acccgagggt cgtcactctc ggagaatacg aagtgagctt aaaccgggtc ggtttcgcta 480 accgggtaaa gaacgcgctt caattctatt ccgcggtttt cgaatccctt gaaccgaact 540 tggggcgtga ttcggaggag agagtgagag ttgagcgaga gttgttcggc cggagaatct 600 cgggtttgat tggaccggag aaaaccggaa ttcatagaga aagaatggaa gagaaagagc 660 aatggcgggt attaatggag aatgccggtt ttgaatcggt taagctgagt aattacgcag 720 tgagccaagc gaagattcta ttgtggaatt acaattacag caatttgtat tcaattgttg 780 aatctaagcc tggcttcatc tctttggcct ggaacgattt acctctcctc actctttctt 840 cctggcgata accaaaccaa accgatccgg tattcttagt tttgttttgt tttcaatgtt 900 atttttggtt agacaaatat tcaattgtta atatactccg tggtcagagt gttttgtttt 960 tcttttagtt cgaacgttga attaattcag gggtaggttt tgaattctct gaaccttatg 1020 tgttttttgg taacatcatt tggatttgtg aactaggttt aaaaactggt cttagtcttg 1080 ttgttttctc attagataat ttaaactggt ttgcttcttt atttttggtt ggataaagtg 1140 accggttctg gtcatctgtt tgagatgtaa ttactatttc ataaaattag gaagttgaaa 1200 gccaaatata tttgtaacta ctcttttatt tgtaattttg ctcaaaaaag tgatgaaatg 1260 tagttttgat atatgaatat ctaccattat acataagtat atctgaacat ggtacaactt 1320 atgaaagcta aatgtcaata cttgcaaaga tataacaaat acaagttaca tgaataagag 1380 atgtgtgttg aatttataag tgtcattttc ttttcacttt aaaacaaact tcatcttctt 1440 ttgtttctta tgtgtcaaag ttgccacagt tgctctattt gagtctttca gtgtcagtct 1500 cagtcactgt actgatttta cttttttttg ttgagtgtgc caatgatgac atcactccca 1560 cgtcctccat ccgtcttctt ttaacggtca cgtggctccc accctctttt ctcgatgtct 1620 ttaccgactt gttctagccc aacttacttg ggccatttag attttttggt ggcccaagtt 1680 gctaaaagag gatttatcat agaaatctga acccgttgca gcgctcaaca catgtcacag 1740 tcctgacaaa cacgtattca aatccttgtt aagtcccgcc acctgtcacc agagcaccac 1800 gaggcaaact ctgatcagga caccgtcgta ctattatgtc ggaagacagg aaagcttaat 1860 taagcttaaa cctgacgtat ttaacttcgt taactctacc ttactaaagg gttttaattt 1920 aaaacttatc atctcctcgt aagaataaaa actacttact ctataaattt aagcttcaag 1980 aaacctccaa aagcagagaa 2000 <210> 18 <211> 2000 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 18 gggggttcca caatgcattg attgagtttg tgctgatgca gttacaactt gcttccgtct 60 ttttcacgtt tcagctcggg acaaaaacac attactacgg aaggacattg tttcatggag 120 gcgcagagta tagaggaact ggtcgagggt ttgtggtctt ccacgcgaaa tttgctgaga 180 actataggtt ctattcccgt agtcactttg tgaagggcat tgaacttatg attcttctac 240 tggtatatca gatctttggt caatcatata ggggtgtggt tacttatatt ctgatcactg 300 tttcgatatg gttcatggtg gtgacatggc tctttgctcc tttccttttc aatccgtctg 360 gttttgagtg gcaaaagatt gttgatgact ggacagactg gaacaaatgg atttataacc 420 gaggaggaat tggtgtccct cctgagaaga gttgggaatc ttggtgggag aaagagttag 480 aacatcttag acattcaggg gttcgtggta tcacccttga gatctttttg gccttgcgct 540 tcttcatctt tcaatatgga cttgtgtatc atctcagtac cttcaaagga aaaaatcaga 600 gcttttgggt aagctaacct tataactact tccctgtgaa tggtgaaact cttgattatt 660 gaacgataat gactctgttt tcaggtttat ggagcgtcat ggtttgtgat cttattcatt 720 ctactgattg tgaaggtatg aatctttaag cacattcaca tttcaatttc ttgccaaatc 780 ttaacattgt gttgctttct tctatgtaac gatcattgca gggtttgggc gttggaaggc 840 gaagattcag cacgaatttc cagcttctat tcagaatcat aaagggtctt gtgttcctca 900 catttgtggc aattctcata actttcctcg cacttcctct gataacaatc aaagacttat 960 tcatctgcat gcttgccttc atgccaactg gatggggaat gcttctcgta agtctttctc 1020 ctccatcaaa ctcctctatt tgtatctaag ataccagttt tgtctggttt ttgtgacagt 1080 tgctttgttt tgtcctccac gtcagattgc acaagcgtgt aagcctctga tccaacagct 1140 agggatatgg tcatcagtta ggacgctagc tcgaggctac gagatcgtga tgggcttgct 1200 tctgttcaca ccagttgcgt ttttggcctg gtttcctttt gtgtctgagt tccagacaag 1260 aatgctcttt aaccaagcct ttagtagagg tctacaaatc tctcgtattc ttggtggtca 1320 aagaaaagac cggtcttcaa aaaacaagga gtgacatgta cacatgtaaa tggcgtatgt 1380 gtagatttaa tggttatctg ttattgtttc cttcccaagt aatctatagt tagaaagttc 1440 ctgtaacttt catagatata tgttaattat tttccatttc cataagttcg cgtccattat 1500 aatagaaagt gcatgagacg tatctttttc atatggaaga cgaaaacatt ggttctccat 1560 tctaaaagtc aaaaagaaaa tgtatatcac ttgaactttt ccacataggt catgataaag 1620 acaggactaa tcaatcattc attgttgata atggtctcaa ttacctgttg ctagttattt 1680 ctacatttgt atagtgcaat actgtttttt tttcctcttc caaataaaaa ctacagtact 1740 aaaagaaagt tggtaatcat aaaagttata aaactcaaat aaaagcaatt actctgtttc 1800 tttttcactc ttattttata tgactgaaat gaaattgtct atatgttgtt tttgtttgta 1860 tgttcattga tatgtaaaca tcaaatctgc aaaaaacaac cgcaagtttg gatttatacg 1920 atgaagcgtt tatctagtga gcgtcatcgc agacgtcaca agttatgtgg tacaattttg 1980 cgtatgtttg atgaatacgc 2000 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 19 cgccagggtt ttcccagtca cga 23 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 20 agcggataac aatttcacac agga 24

【図面の簡単な説明】

【図１】低温ストレス下における遺伝子発現のcDNAマイ
クロアレイ分析結果を示す写真である。

【図２】乾燥誘導性遺伝子又は低温誘導性遺伝子及びDR
EB1A標的遺伝子の同定手順を示す図である。

【図３】新規なDREB1A標的遺伝子及びDREB1A遺伝子のcD
NAマイクロアレイと、ノーザンブロット分析との比較を
示す写真である。

【図４】同定された乾燥誘導性遺伝子又は低温誘導性遺
伝子を、RNAゲルブロット分析並びにマイクロアレイ分
析に基づいて４つのグループに分類した結果を示す図で
ある。

【図５】FL3-5A3について低温処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図６】FL3-5A3について乾燥処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図７】FL3-5A3について高塩濃度処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図８】FL5-2H15について低温処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図９】FL5-2H15について乾燥処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図１０】FL5-2H15について高塩濃度処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図１１】FL5-3M24について乾燥処理時間と発現比率と
の関係を示す特性図である。

【図１２】FL5-3M24について高塩濃度処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図１３】FL5-90について低温処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図１４】FL5-2I22について低温処理時間と発現比率と
の関係を示す特性図である。

【図１５】FL5-2I22について乾燥処理時間と発現比率と
の関係を示す特性図である。

【図１６】FL5-2I22について高塩濃度処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図１７】FL6-55について乾燥処理時間と発現比率との
関係を示す特性図である。

【図１８】FL6-55について高塩濃度処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図１９】FL1-159について乾燥処理時間と発現比率と
の関係を示す特性図である。

【図２０】FL5-2D23について乾燥処理時間と発現比率と
の関係を示す特性図である。

【図２１】FL5-2D23について高塩濃度処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図２２】FL05-08-P24について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図２３】FL05-09-G08について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図２４】FL05-09-P10について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図２５】FL05-09-P10についてABA処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図２６】FL05-10-N02について高塩濃度処理時間と発
現比率との関係を示す特性図である。

【図２７】FL05-18-I12について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図２８】FL05-18-I12について高塩濃度処理時間と発
現比率との関係を示す特性図である。

【図２９】FL05-18-I12についてABA処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図３０】FL05-21-F13について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図３１】FL05-21-F13について低温処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図３２】FL06-10-C16について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図３３】FL06-10-C16について高塩濃度処理時間と発
現比率との関係を示す特性図である。

【図３４】FL06-10-C16についてABA処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図３５】FL06-15-P15について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図３６】FL06-15-P15について高塩濃度処理時間と発
現比率との関係を示す特性図である。

【図３７】FL06-15-P15についてABA処理時間と発現比率
との関係を示す特性図である。

【図３８】FL08-10-E21について乾燥処理時間と発現比
率との関係を示す特性図である。

【図３９】FL09-11-P10について高塩濃度処理時間と発
現比率との関係を示す特性図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 関 原明 茨城県つくば市高野台３丁目１番地１ 理 化学研究所 筑波研究所内 (72)発明者 楠城 時彦 茨城県つくば市二の宮４−６−１−６− 305 Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD04 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 DA01 FA02 GA11 HA12 4B065 AA89X AA89Y AC14 BA02 CA24 CA53

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環
   境ストレス応答性プロモーター。 (a) 配列番号１〜８から選ばれるいずれかの塩基配列か
   らなるDNA (b) 配列番号１〜８から選ばれるいずれかの塩基配列に
   おいて１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加
   された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プロ
   モーターとして機能するDNA (c) 配列番号１〜８から選ばれるいずれかの塩基配列か
   らなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイ
   ズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能
   するDNA
2. 【請求項２】 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環
   境ストレス応答性プロモーター。 (a) 配列番号９〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列
   からなるDNA (b) 配列番号９〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列
   において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付
   加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プ
   ロモーターとして機能するDNA (c) 配列番号９〜１８から選ばれるいずれかの塩基配列
   からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
   イズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機
   能するDNA
3. 【請求項３】 環境ストレスが低温ストレス、乾燥スト
   レス、塩ストレス及び強光ストレスからなる群から選択
   される少なくとも１つである請求項１又は請求項２記載
   のプロモーター。
4. 【請求項４】 請求項１〜３いずれか一項記載のプロモ
   ーターを含む発現ベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターに、さらに
   任意の遺伝子が組み込まれた発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載の発現ベクターを含
   む形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項４の発現ベクター又は請求項５記
   載の記載の組換えベクターを含むトランスジェニック植
   物。
8. 【請求項８】 植物が、植物体、植物器官、植物組織又
   は植物培養細胞である請求項７記載のトランスジェニッ
   ク植物。
9. 【請求項９】 請求項７又は８記載のトランスジェニッ
   ク植物を培養又は栽培することを特徴とするストレス耐
   性植物の製造方法。