JP2002306179A - Ａｌｓ２ｃｒ６遺伝子と、２型筋萎縮性側索硬化症の診断方法 - Google Patents

Ａｌｓ２ｃｒ６遺伝子と、２型筋萎縮性側索硬化症の診断方法

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JP2002306179A JP2001116973A JP2001116973A JP2002306179A JP 2002306179 A JP2002306179 A JP 2002306179A JP 2001116973 A JP2001116973 A JP 2001116973A JP 2001116973 A JP2001116973 A JP 2001116973A JP 2002306179 A JP2002306179 A JP 2002306179A
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穣衛 池田
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伸二 秦野
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ハイデン マイケル
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 遺伝性疾患筋萎縮性側索硬化症（ALS2）の発
病に関連するヒトゲノム遺伝子と、その変異遺伝子、並
びにALS2の診断方法を提供する。 【解決手段】 ヒト2番染色体q33領域に存在し、配列番
号２のアミノ酸配列を有するヒトGTPase調節因子をコー
ドするヒトALS2CR6遺伝子と、ALS2に関連する遺伝子で
あって、特定のアミノ酸配列を有する変異タンパク質を
コードするヒトALS2CR6変異遺伝子、およびこのALS2CR6
変異遺伝子またはその転写産物を検出することを特徴と
するALS2診断方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、その変異
が２型筋萎縮性側索硬化症の発病に関連するALS2CR6遺
伝子と、この遺伝子の変異を検出する２型筋萎縮性側索
硬化症の診断方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】筋萎縮性側索硬化症（amyotr
ophic lateral sclerois：以下「ALS」と記載すること
がある）は進行性神経変性疾患であり、遠位および近位
の運動ニューロンが選択的に変性する（文献１）。原因
は不明であり、多くは中年期以降に発症する。発病率は
10万あたり２〜６程度であるが、２次ニューロン障害と
しての小手筋の筋力低下や筋萎縮などから始まり、四肢
筋の萎縮、舌の萎縮、構語・嚥下および呼吸障害等の球
麻痺症状が出現する。治療法は確立しておらず、ほとん
どの例では発病から５年以内に死亡する。また、体細胞
劣性型の２型若年性筋萎縮性側索硬化症（ALS2：OMIM21
5100、文献２）は劣性遺伝病であり、発病の頻度は稀で
あるが、10代または20代に四肢、顔、咽頭の筋肉痙攣が
次第に発現し、同じく球麻痺症状によって慢性化する。
【０００３】以上のとおり、ALSは極めて重度の疾患で
あり、その早期発見や治療法の開発が切望されている。
この発明は以上のとおりの事情に鑑みてなされたもので
あり、遺伝性疾患ALS2の発病に関連するヒトゲノム遺伝
子と、その変異遺伝子を提供することを課題としてい
る。
【０００４】またこの出願は、この遺伝子変異を指標と
するALS2の診断方法を提供することを課題としている。
さらにこの出願は、このヒト遺伝子のマウス相同遺伝子
と、マウス遺伝子の操作によって作出したノックアウト
マウスを提供することを課題としてもいる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】ALS2は、ヒト２番染色体
q33領域のマイクロサテライトマーカーD2S116とD2S2237
で特定される1.7cMの領域の遺伝視座がマッピングされ
ている（文献３，４）。この出願の発明者らは、ALS2に
対する完全な候補領域をカバーする3Mbのゲノム領域のY
AC/BAC/PACを基にした物理的なマップを作成し（文献
５、６）、ESTとcDNAクローンの配列を広範囲に分析
し、この物理的なマップを用いて、10個の新規遺伝子を
含む42個の非重複転写ユニットをマップした（図１）。
【０００６】そしてこれらの遺伝子配列に基づいて計41
1対のプライマーをデザインし、ALS2家系の14人（図２
ａ）と血縁関係にない正常対照者6名のゲノムDNAをPCR
で増幅した。各々のPCR産物について配列を決定するこ
とにより、イントロンまたはエクソンの合計77個の塩基
配列多型を同定し、その中から、ALS2の発病に関係する
１塩基欠失変異を有する遺伝子を特定した。そして、こ
の遺伝子がGTPase転写因子をコードすることを見出して
この発明を完成させた。
【０００７】すなわち、この出願は、ヒト2番染色体q33
領域に存在し、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト
GTPase調節因子をコードするヒトALS2CR6遺伝子を提供
する。この遺伝子が転写するmRNAから合成されるcDNAは
配列番号１の塩基配列を有している。
【０００８】この出願は、前記のヒトALS2CR6遺伝子の
ゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精
製されたポリヌクレオチドを提供する。この出願は、前
記ヒトALS2CR6遺伝子または前記ポリヌクレオチドにス
トリンジェント条件下でハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドプローブを提供する。
【０００９】この出願は、前記ヒトALS2CR6遺伝子また
は請求項３のポリヌクレオチドをPCR増幅するオリゴヌ
クレオチドプライマーセットを提供する。この出願はま
た、２型筋萎縮性側索硬化症に関連する遺伝子であっ
て、前記ヒトALS2CR6遺伝子の１塩基欠失により、配列
番号３のアミノ酸配列を有する変異タンパク質をコード
するヒトALS2CR6変異遺伝子を提供する。
【００１０】この出願は、前記ヒトALS2CR6変異遺伝子
のゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から
精製されたポリヌクレオチドを提供する。この出願は、
前記ヒトALS2CR6変異遺伝子または前記ポリヌクレオチ
ドにおける塩基欠失部位を含む領域にストリンジェント
条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプロー
ブを提供する。
【００１１】この出願は、前記ヒトALS2CR6変異遺伝子
または前記ポリヌクレオチドにおける塩基欠失部位を含
む領域をPCR増幅するオリゴヌクレオチドプライマーセ
ットを提供する。このプライマーセットの具体的一例
は、配列番号６および７の塩基配列からなる１対の合成
オリゴヌクレオチド、または配列番号８および９の塩基
配列からなる１対の合成オリゴヌクレオチドである。
【００１２】この出願はまた、前記のそれぞれのポリヌ
クレオチドを保有する組換えベクターと、これらの組換
えベクターそれぞれによる形質転換体細胞を提供する。
この出願はさらに、前記ヒトALS2CR6遺伝子の発現産物
であって、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特
徴とするヒトGTPase調節因子を提供する。
【００１３】このヒトGTPas調節因子の一つの態様は、
前記形質転換体細胞によって産生される組換えタンパク
質である。この出願は、配列番号２における第１−46番
アミノ酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列
からなるペプチドと、配列番号２における第47−1657番
アミノ酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列
からなるペプチドをそれぞれ提供する。
【００１４】この出願は、前記のヒトALS2CR6変異遺伝
子の発現産物であって、配列番号３のアミノ酸配列から
なる変異タンパク質を提供する。この変異タンパク質の
一つの態様は、前記の形質転換体細胞によって産生され
る組換えタンパク質である。
【００１５】この出願は、前記のヒトGTPase調節因子を
認識する抗体を提供する。この抗体の具体的態様は、配
列番号２における第１−46番アミノ酸配列の連続５アミ
ノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原と
して調製された抗体、および配列番号２における第47−
1657番アミノ酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ
酸配列からなるペプチドを抗原として調製された抗体で
ある。
【００１６】この出願は、さらにまた、前記のヒトALS2
CR6変異遺伝子を検出することを特徴とする２型筋萎縮
性側索硬化症の診断方法を提供する。この診断方法の一
態様は、配列番号６および７の塩基配列からなる１対の
合成オリゴヌクレオチド、または配列番号８および９の
塩基配列からなる１対の合成オリゴヌクレオチドからな
るプライマーセットを用いて被験者細胞のゲノムDNAをP
CR増幅し、得られたDNA断片を制限酵素NarIで処理し、D
NA断片が２断片化した被験者を２型筋萎縮性側索硬化症
と判定する方法である。
【００１７】この出願はまた、前記のヒトALS2CR6変異
遺伝子の転写産物を検出することを特徴とする２型筋萎
縮性側索硬化症の診断方法を提供する。この診断方法の
態様においては、転写産物は、前記ヒトALS2CR6変異遺
伝子のmRNAまたはcDNA、もくしはこの変異遺伝子の発現
する変異タンパク質である。そして変異タンパク質を検
出する場合の一態様は、配列番号２における第１−46番
アミノ酸配列を認識する抗体が反応し、配列番号２にお
ける第47−1657番アミノ酸配列領域を認識する抗体が反
応しないタンパク質を検出する方法である。
【００１８】さらに、この出願は、配列番号５のアミノ
酸配列を有するマウスGTPase調節因子をコードするマウ
スALS2CR6遺伝子と、このマウスALS2CR6遺伝子のゲノム
DNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製され
たポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】この出願は、前記のマウスALS2CR6遺伝子
が実質的に機能欠失した遺伝子欠損マウスおよびその組
織をも提供する。以下、この出願によって提供される各
発明について、実施形態を詳しく説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】この発明に係るヒトALS2CR6遺伝
子は、イントロン33個とエクソン34個を有し、ヒト２番
染色体q33領域の多型性DNAマーカーD2S2309に近接した8
0.3kbのゲノムDNA内に存在し（図１参照）、配列番号２
のアミン酸配列を有するヒトGTPase調節因子をコードす
るゲノム遺伝子である。そしてこのALS2CR6遺伝子は、
そのcDNAが配列番号１の塩基配列を有している。
【００２１】なお、このALS2CR6遺伝子には、それがコ
ードするタンパク質の発現に対する制御領域（プロモー
ター／エンハンサー、サプレッサー等）も含まれる。こ
れらの発現制御領域は、新規ヒトGTPase調節因子の機能
やALS2CR6遺伝子の欠失変異等のメカニズムを解明する
ためにも有用である。
【００２２】このALS2CR6遺伝子は、例えば、配列番号
１の塩基配列またはその一部配列からなる精製ポリヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとしてヒ
トゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることに
よって単離するすることができる。得られたゲノム遺伝
子は、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、
NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）
法、TMA（Transcription-mediated amplification）法
およびSDA（Strand Displacement Amplification）法な
どの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することがで
きる。
【００２３】そして、このALS2CR6ゲノム遺伝子やこの
遺伝子が転写するmRNA、mRNAから合成したcDNAから精製
ポリヌクレオチド（DNA断片やRNA断片）を調製すること
ができる。例えば、cDNAはヒト細胞から抽出したポリ
(A)＋RNAを鋳型として合成することができる。ヒト細胞
としては、人体から手術などによって摘出されたもので
も培養細胞でも良い。cDNAは、公知の方法（Mol. Cell
Biol. 2, 161-170, 1982； J. Gene 25, 263-269, 198
3； Gene, 150, 243-250, 1994）を用いて合成すること
ができる。あるいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−
として、ヒト細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR
法を用いて、目的cDNAを合成することもできる。このよ
うにして調製されるcDNAは、具体的には配列番号１の塩
基配列を有している。これらのポリヌクレオチドは、例
えばヒトGTPase調節因子（ALS2CR6発現産物）の遺伝子
工学的な製造に使用することができる。
【００２４】この発明のオリゴヌクレオチドプローブ
は、前記ALS2CR6ゲノム遺伝子または前記ポリヌクレオ
チドにストリンジェント条件下でハイブリダイズするDN
A断片またはRNA断片である。例えば、配列番号１の塩基
配列における連続10〜100bpのDNA断片等である。ここ
で、ストリンジェント条件とは、ALS2CR6遺伝子または
ポリヌクレオチドとプローブとの特異的なハイブリッド
形成を可能とする条件であり、ハイブリダイゼーション
および洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアミ
ド等）の濃度、温度条件によって規定される。詳しく
は、米国特許No. 6,100,037等に詳しく規定されてい
る。
【００２５】この発明のプライマーセットは、前記のAL
S2CR6遺伝子やポリヌクレオチドをPCR増幅するための１
対のオリゴヌクレオチドである。これらのプライマーセ
ットは、配列番号１の塩基配列に基づき設計し、合成・
精製の各工程を経て調製することができる。なお、プラ
イマー設計の留意点として、例えば以下を指摘すること
ができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNA
との間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮
し、15-40塩基、望ましくは15-30塩基である。ただし、
LA（long accurate）PCRを行う場合には、少なくとも30
塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセ
ンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）
のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマ
ー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘア
ピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避ける
ようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保す
るためGC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-r
ichあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリ
ング温度はTm（melting temperature）に依存するの
で、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55-65℃で
互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにお
けるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜約１μMになる
よう調整する等を留意すうことも必要である。また、プ
ライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM
［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX
［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いること
もできる。
【００２６】この発明のヒトALS2CR6変異遺伝子は、ALS
2患者のゲノムDNAに存在しており、配列番号１の塩基配
列における第261番塩基aの欠失によるフレームシフトの
結果として、配列番号３のアミノ酸配列からなる変異タ
ンパク質をコードしている。このALS2CR6変異遺伝子
は、塩基欠失部位を含む領域にストリンジェント条件下
でハイブリダイズするプローブを用いて、ALS2患者の細
胞から調製したDNAライブラリーをスクリーニングしす
るなどの方法によって得ることができる。そしてこのAL
S2CR6変異遺伝子のゲノムDNA、mRNA、cDNAもしくはそれ
らの相補配列から精製ポリヌクレオチド（DNA断片また
はRNA断片）が得られる。例えば、ALS2CR6変異遺伝子cD
NAは、配列番号１の第261番塩基aが欠失したポリヌクレ
オチドである。このようなポリヌクレオチドは、ALS2CR
6変異タンパク質の遺伝子工学的な生産や、ALS2の診断
に使用することができる。
【００２７】このALS2CR6変異遺伝子における塩基欠失
部位を含む領域をPCR増幅するためのプライマーセット
は、例えば、配列番号６および７の塩基配列からなる１
対の合成オリゴヌクレオチドである。このプライマーセ
ットは、ALS2CR6遺伝子のエクソン３とその前後のイン
トロンを含む領域（339bp）をPCR増幅する。また、別の
プライマーセットは配列番号８および９の塩基配列から
なる１対の合成オリゴヌクレオチドであり、これらはRN
Aを鋳型としてALS2CR6遺伝子のエクソン2-4（302bp）を
PCR増幅する。そしていずれのPCR産物も、正常なALS2CR
6遺伝子由来の場合には制限酵素NarIによって切断され
ないが、ALS2CR6変異遺伝子由来の場合にはNarIによっ
て切断され、２断片となる（図２C参照）。
【００２８】この発明の組換えベクターはクローニング
ベクターまたは発現ベクターであり、インサートしての
ポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適
宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはそのORF領域
をインサートとしてALS2CR6タンパク質（GTPase調節因
子）またはその変異タンパク質を生産する場合には、イ
ンビトロ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の
原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細
胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することがで
きる。また、ALS2CR6遺伝子やその変異遺伝子のゲノムD
NAをインサートとする場合には、BAC（Bacterial Artif
icial Chromosome）ベクターやコスミドベクター等を使
用することもでき、こられらの組換えベクターは、例え
ば蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）による
染色体異常を診断するためのプローブとしても有用であ
る。さらには、正常なALS2CR6遺伝子由来のポリヌクレ
オチドをウイルスベクター等に組換え、これを遺伝子治
療に用いることもできる。
【００２９】この発明の形質転換体細胞は、例えば、AL
S2CR6タンパク質またはその変異タンパク質を製造する
場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫
細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することがで
きる。また、正常なALS2CR6遺伝子由来のポリヌクレオ
チドを組み換えたウイルスベクターによって形質転換し
たALS2患者由来の細胞（血液幹細胞等）はALS2の遺伝子
治療に用いることもできる。これらの形質転換体細胞
は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、
DEAEデキストラン法など公知の方法によって組換えベク
ターを細胞に導入することによって調製することができ
る。
【００３０】この発明のタンパク質は、ALS2CR6遺伝子
の発現産物（GTPase転写因子）またはALS2CR6変異遺伝
子の発現産物（ALS2CR6変異タンパク質）である。具体
的には、GTPase転写因子は配列番号２のアミノ酸配列を
有するポリペプチドであり、ALS2CR6変異タンパク質は
配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドであ
る。このタンパク質は、抗体作製のための免疫原とし
て、あるいはALS2の治療薬を開発するための標的分子等
として有用である。これらのタンパク質は、健常者また
はALS2患者の細胞から単離する方法、配列番号２または
配列番号３のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペ
プチドを調製する方法等によって得ることができるが、
好ましくは、前記の形質転換細胞から単離・精製する方
法によって大量に生産することができる。すなわち、形
質転換体細胞を培養し、その培養物から、例えば、尿素
などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵
素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾
過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー等によって単離、精製することによりGTPase転写因子
またはその変異タンパク質を大量に得ることができる。
なお、これらのタンパク質には、他の任意のタンパク質
との融合タンパク質も含まれる。例えば、グルタチン−
Ｓ−トランスフェラ−ゼ（GST）や緑色蛍光蛋白質（GF
P）との融合蛋白質などが例示できる。さらに、細胞で
発現したタンパク質は、翻訳された後、細胞内で各種修
飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたタンパ
ク質もこの発明のタンパク質の範囲に含まれる。このよ
うな翻訳後修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ
末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテア−ゼによる
限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化
などである。
【００３１】この発明の抗体は、前記GTPase転写因子を
認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体
である。具体的には、例えば、配列番号２における第１
−46番アミノ酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ
酸配列からなるペプチドを抗原として調製された抗体、
および配列番号２における第47−1657番アミノ酸配列の
連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるペプチ
ドを抗原として調製された抗体である。これら２種類の
抗体を用いることによってALS2CR6変異タンパク質の検
出が可能となる。この発明の抗体には、ALS2CR6タンパ
ク質のエピトープに結合することができる全体分子、お
よびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このよう
な抗体は、前記のALS2CR6タンパク質やペプチドを抗原
として用いて動物を免役した後、血清から得ることがで
きる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射
や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、
血清を採取することによって作製することができる。動
物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリ
などが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ
細胞をミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製す
れば、モノクロ−ナル抗体を産生することができる。
【００３２】次に、この発明のALS2診断方法につて説明
する。この発明の診断方法は、ALS2CR6変異遺伝子また
はALS2CR6変異遺伝子の転写産物を検出することによっ
てALS2発病の危険性を事前に判定する。診断はALS2家系
の者が主たる対象者となるが、それらに限定されるもの
ではない。
【００３３】ALS2CR6変異遺伝子を検出する場合には、
前記のプライマーセットのいずれかを用いて被験者のゲ
ノムDNAをPCR増幅し、得られたDNA断片を制限酵素NaIで
処理し、DNA断片が２断片化された被験者をALS2患者ま
たはALS2ハイリスクと診断することができる。すなわ
ち、ALS2CR6変異遺伝子は、エクソン３の１塩基欠失
（配列番号１の塩基配列からなるcDNAにおける第261番
塩基aの欠失）によってNarIサイトが形成されるためで
ある。
【００３４】その他にも、ALS2CR6変異遺伝子の検出
は、たとえばアリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ
法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Olig
onucleotide Ligation Assay）法、PCR-SSCP法、PCR-CF
LP法、PCR-PHFA法、インベーダー法、RCA（Rolling Cir
cle Amplification）法、プライマーオリゴベースエク
ステンション（Primer Oligo Base Extension）法によ
っても行うことができる。
【００３５】ALS2CR6変異遺伝子の転写産物を検出する
場合には、被験者のmRNAやそのcDNAの配列を決定するこ
とによって診断を行うことができる。また、被験者のAL
S2CR6遺伝子またはそのcDNAを発現ベクターに組換え、
細胞にトランスフェクションし、その発現タンパク質の
分子量を測定することによっても診断を行うことができ
る。すなわち、ALS2CR6変異遺伝子は、正常ALS2CR6遺伝
子の１塩基が欠失することによってフレームシフトを生
じ、変異タンパク質は配列番号２の第１−46アミノ酸残
基と、フレームシフトによって新たにコードされた３個
のアミノ酸残基（Pro-Ser-Glu）とからなる低分子タン
パク質（配列番号３）となるからである。さらには、こ
の発明によって提供される前記抗体を用いても診断を行
うことができる。すなわち、ALS2CR6変異タンパク質
は、配列番号２における第１−46番アミノ酸配列を認識
する抗体は反応するが、配列番号２における第47−1657
番アミノ酸配列領域を認識する抗体は反応しない。抗体
による診断は、例えばELIZA法等によって実施すること
ができる。
【００３６】次に、この発明のマウスALS2CR6遺伝子
は、ヒトALS2CR6遺伝子のホモログとして単離されたマ
ウスゲノム遺伝子であり、配列番号５のアミン酸配列か
らなるマウスALS2CR6タンパク質をコードし、そのcDNA
は配列番号４の塩基配列を有している。この遺伝子は、
ALS2CR6遺伝子のノックアウトマウスの作製に不可欠で
ある。
【００３７】このようなノックアウトマウスは公知の標
的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：Science
244:1288-1292, 1989）により、例えば以下のとおりに
作製することができる。
【００３８】先ず、マウスALS2CR6遺伝子のDNA断片を試
験管内にて遺伝子操作し、ALS2CR6遺伝子の開始コドン
を含むDNA断片に対して改変を施すなどの、ALS2CR6遺伝
子の機能を欠失させるような欠損DNA断片を作製する。
そして、この欠損DNA断片を用いて、マウス全能性細胞
（ES細胞）のALS2CR6遺伝子に変異を導入するためのタ
ーゲティングベクターを、公知の方法（例えば、Scienc
e 244:1288-1292, 1989）に準じて作製する。例えば、A
LS2CR6遺伝子のゲノムDNAの一部をG418等の細胞毒に対
する耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）に
置換することにより、もしくは細胞毒に対する耐性遺伝
子をALS2CR6遺伝子のゲノムDNAの一部に挿入すること
で、ALS2CR6遺伝子のゲノムDNAと相同な配列を両端に有
する欠損遺伝子を保有する組換えプラスミドDNA、すな
わちターゲティングベクターを作製する。なお、細胞毒
に対する耐性遺伝子には、その発現を制御するためのPG
K1プロモーター等の配列およびPGK1ポリアデニレーショ
ンシグナル等を連結することもできる。また、細胞毒に
対する耐性遺伝子により置換、または挿入されるALS2CR
6遺伝子のゲノムDNA部位は、開始コドンを含んだエクソ
ン領域を含むゲノムDNA領域であることが好ましい。
【００３９】上記ALS2CR6遺伝子のゲノムDNAの一部に変
異を導入するためのターゲティングベクターには、ALS2
CR6遺伝子のゲノムDNAに相同な配列を有すること以外に
は特に制限はなく、他の薬剤耐性遺伝子や、細胞選択用
遺伝子（例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子やヘルペスウ
イルスのサイミジンキナーゼ遺伝子）、プロモーター、
エンハンサー等の配列を適宜に組み合わせて使用するこ
とができる。
【００４０】次に、このターゲティングベクターを、公
知の方法に準じてマウスES（embryonic stem）細胞（Na
ture 292:154-156, 1981）に導入する。このような遺伝
子導入法としては、公知の電気パルス法、リポソーム
法、リン酸カルシウム法等も利用できるが、導入遺伝子
の相同遺伝子組換え効率を勘案した場合、ES細胞への電
気パルス法が好ましい。遺伝子導入された各ES細胞のDN
Aを抽出し、サザンブロット分析やPCRアッセイ等によ
り、染色体上に存在する野生型ALS2CR6遺伝子と導入し
たALS2CR6欠損遺伝子断片の間で正しく相同遺伝子組換
えが起こり、染色体上のALS2CR6遺伝子に変異が移った
細胞を選択する。
【００４１】こうして得た欠損遺伝子を持つES細胞を野
生型マウスのブラストシストに注入し、つづいてこのキ
メラ胚を仮親の子宮に移植する。出生した動物を里親に
つけて飼育させた後、ALS2CR6欠損遺伝子が生殖系細胞
に入ったキメラ動物を選別する。選別は毛色の違い、ま
たは体の一部（例えば尾部先端）からDNAを抽出し、サ
ザンブロット分析やPCRアッセイ等により行う。ALS2CR6
欠損遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ動物と野生型動
物の交配により得られる子孫について、さらに体の一部
（例えば尾部先端）からの抽出DNAを材料とした、サザ
ンブロット分析やPCRアッセイ等を行い、ALS2CR6欠損遺
伝子が導入されたヘテロ接合体を同定する。作出された
ALS2CR6欠損遺伝子を保有するヘテロ接合体は生殖細胞
および体細胞のすべてに安定的にALS2CR6欠損遺伝子を
保有しており、交配等により、ALS2CR6遺伝子が完全に
ノックアウトされたマウスを得ることができる。
【００４２】このようにして得られたノックアウトマウ
スは、ALS2の発病におけるALS2遺伝子の機能解析や、AL
S2モデル動物として治療薬のスクリーニングや治療法の
開発に使用することができる。
【００４３】以下、ALS2CR6遺伝子のクローニングとそ
の機能解析について行った実験の方法と結果を示す。 １．方法 1-1．ALS2家系 チュニス血族ALS2家系（文献２）から得られた8名の罹
患個体を含む16名を分析した。ALS2の特徴は手と足の遠
位筋萎縮を伴う肢と顔面の筋肉の進行性痙攣である。発
症年齢は3歳から10歳の間である（文献２）。神経・筋
肉バイオプシーと筋電計検査によれば、遠位運動ニュー
ロンが欠失していることが確認された（文献２）。臨床
検査値とあわせて多形性DNAマーカーの遺伝子型を分析
した結果、ALS2は明らかに常染色体性劣性疾患であっ
た。 1-2．転写マップ 対象領域内にマップされた転写DNAのシークエンスを判
別するために公開されているGenome Data Base（GDB）
（http;//www.gdbwww.gdb.org）とバイオテクノロジー
情報センター（NCBI）のUniGene（http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov）を検索した。ALS2の対象領域と重複しているゲ
ノムDNAのシークエンスをGenBankの「nr」または「htg
s」データベースから検索し、dbESTデータベースに対し
てBLAST検索をする際の被検対象として利用した。完全
長の転写体を単離するためにRT-PCR、5’-RACEおよびcD
NAライブラリースクリーニングを行った。また、Resear
ch Genetics社からESTクローンを購入し、クローン全体
の挿入を測定するためにDNAのシークエンスを行った。
２重鎖のDNAのシークエンスはBigDyeTerminator Cycle
Sequencing Kit（ABI）とAB1377DNAシークエンサーを用
いてジデオキシシークエンスすることにより決定した。
ESTデータ、PCR産物、cDNAクローンから得られたDNAの
全てを配列決定し、推定独立転写単位を確立した。次に
各々のユニットをPCR法で物理的なマップ上にマップし
た。 1-3．エクソンの同定 転写DNAのイントロン・エクソンの構成を決定するため
に、BLAST（文献28）と、文献（5、6）の記載に従いSeq
uencer Version 3.0（Gene Codes Corporation）プログ
ラムを用いてGenBankデータベースに公開されたゲノムD
NAシークエンスデータとcDNAのシークエンスを比較し
た。 1-4．PCR エクソンおよびイントロン／エクソン境界をPCR増幅し
た。ExTaqポリメラーゼ（TAKARA）を用い95℃で15秒、6
0℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回繰り返し、ゲ
ノムDNA約50ngをPCRにより増幅した。転写DNAの欠失形
を検出するためにRT-PCRを行った。ALS2家系の4名の患
者と2名のキャリアのリンパ球からトータルRNAを単離し
た。健康ヒト脳から抽出されたトータルRNAをClonetech
から購入した。製造業者のプロトコールに従いSuperScr
iptプレ増幅システム（Gibco-BRL）を用いてRT-PCRを行
った。これらのPCR反応用のオリゴヌクレオチドプライ
マーはPrimer 3.0（http://www-genome.wi.mit.edu）を
用いて設計した。 1-5．突然変異の分析 エクソンまたはイントロン・エクソン境界でのDNAシー
クエンスの変異を検出するためにエクソンPCR産物のDNA
シークエンスを決定した。同一オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いてエクソンPCR産物のDNAシークエン
スを分析した。公開されているデータベース中のシーク
エンスと患者、キャリア、健常人から得られたDNAシー
クエンスを比較し、ヌクレオチドの変化を判別した。
【００４４】また、エクソン2-4をRT-PCRで増幅する
か、あるいはエクソン3をPCR増幅することにより、NarI
処理後に新たなNarIサイトが形成（A261del）されるこ
とを確認した。エクソン3-PCRのためのプライマーは5’
-CCTAGTCATCCATGTGCTGG-3’（配列番号６）と5’-TCCCA
TACCTGACCTTCCAC-3’（配列番号７）を使用した。ま
た、エクソン2-4のRT-PCRのプライマーは5’-CTTGATAGA
CTTTCTGTAAAGAAG-3’（配列番号８）および5’-GGCTACT
TGGACAAATCTCCACTG-3’（配列番号９）を使用した。Nar
I分解産物は1.5％アガロースゲルで分離した。 1-6．ノーザンブロット分析 多数のヒト成人組織のノーザン（MTN）ブロット（Clont
ech）を68℃のPerfectHybハイブリダイズ液中（TOYOB
O）でALS2CR6の32p-dCTPでラベルしたエクソン4または
ヒトβ−アクチンcDNAとハイブリダイズした。メンブレ
ンを1%SDS含有0.1xSSCで洗い、X線フィルム（Bio-MAX、
Kodak）に供した。 1-7．MRNA in situハイブリダイゼーション アンチセンスおよびセンスcRNAプローブを２個のマウス
cDNAクローンm2-asおよびm2-sから調製した。これらの
マウスcDNAクローンは、マウスmALS2CR6 cDNAの一部
（配列番号４の第1,732-2,685番塩基：954 bp）をカバ
ーし、pCR2.1（Invitrogen社）に反対方向で挿入されて
いる。プローブは、製造者（Roche Molecular Biochemi
cals）のプロトコールに従い、ジゴキシゲニン標識UTP
とT7ポリメラーゼを混合したin vitro転写反応によって
調製した。試料の調製とin situハイブリダイゼーショ
ンの方法は文献(29)に従った。 1-8．データベース検索 DNAとアミノ酸シークエンスを各々BLASTNとBLASTPを用
いて重複していないヌクレオチドとタンパクのシークエ
ンスのデータベースと比較した。Genome Net Japan（ht
tp://www.genome.ad.jp）、BCMのサーチローンチャー
（http:www.hgse.hem.tmc.edu/Search.launcher）、NCB
IのCDサーチ（http://www.hcbi.nlm.nih.gov）のMOTIF
サーバでタンパクのモチーフとドメインを同定した。 ２．結果 発明者らは、ALS2に対する完全な候補領域をカバーする
3Mbのゲノム領域のYAC/BAC/PACを基にした物理的なマッ
プを作成ている（文献５、６）。ESTとcDNAクローンの
配列を広範囲に分析すると共に、この物理的なマップを
用いて、以前に解析した18個の遺伝子（KIAA0005、CLK
1、PP1L3、ORC2L、NDUFB3、CFLAR、CASP10、CASP8、FZD
7、NOP5、UBL1、BMPR2、FLJ10881、LOC57404、AIP-1、C
D28、CTLA4、AILIM）と、新規な10個の完全長転写産物
（ALS2CR1、ALS2CR2、ALS2CR3、ALS2CR4、ALS2CR5/MPP
4、ALS2CR6、ALS2CR7、ALS2CR8、ALS2CR9、ALS2CR12）
を含む43個の独立転写ユニットをマップした。これらの
遺伝子配列はALS2の遺伝子座に存在した（図１）。
【００４５】若年性ALS2は稀で、10代または20代に肢、
顔、咽頭の筋肉痙攣がしだいに発現するという前兆があ
る。ALS2が劣性遺伝することからこのALS2疾患が機能性
突然変異の喪失によって起こるらしいと推定されてい
る。PCRを基にしたSTS/EST含量のマッピングとサザンブ
ロット分析により、ALS2遺伝子座における大きな欠失ま
たは転座を検討したが、それらは検出されなかった。次
にエクソンまたはイントロン・エクソン境界での小さな
欠失または塩基の置換を検討した。これらの突然変異を
検出するために各々の遺伝子を分析し、それらののイン
トロン・エクソン境界を定めた。これまでに42個の遺伝
子から395個のエクソンを同定した。スプライシングド
ナーやアクセプターに対するコンセンサスシークエンス
を含むエクソンやそのフランキングシークエンスを増幅
させるため、合計411対のプライマーをデザインし、こ
れらのプライマーを使用してALS2家系の14人（図２ａ）
と血縁関係にない正常対照者10名のゲノムDNAをPCRで増
幅した。各々のPCR産物についての配列決定することに
より、イントロンまたはエクソンの合計77個の配列多型
を同定した。これら77個の多型のうち、4個の異なる遺
伝子に含まれる8個の変異がALS2に関係していた（表
１）。
【００４６】
【表１】
【００４７】これらの配列変異のうち、ALS2CR6のエク
ソン3に認められる1個のヌクレオチド欠失（A261del）
は読み取り枠を壊しており、この変異がタンパク質を変
異させていることが示唆された。疑わしい全てのヘテロ
接合性キャリアは、欠失部の後の最初のヌクレオチドか
ら始まる重複するシークエンスパターンを示す（図２
ｂ）。この欠失は明らかにALS2発現型と共に移動（図２
ｃ）し、人種的に様々な533人の正常対照個体には認め
られない（データ示さず）。他の配列変異にはALS2CR9
遺伝子のエクソン4におけるCからTへの1塩基置換が含ま
れる（C873T）。ただし、この変異は3番目のコドンに対
応し、従ってアミノ酸残基を変化させない。他の配列変
異による潜在的または顕在化したスプライシングエラー
を検出するために、患者と正常対照者のリンパ球から抽
出したトータルRNAを用いてRT-PCRを行ったが、mRNAの
配列変異は検出されなかった（データ示さず）。したが
って、イントロンまたはエクソン領域のALS2に関連した
変異は、スプライシングエラーを生じさせない。これら
の結果から、ALS2CR6のエクソン3における１塩基の欠失
（A261del、表１）がALS2に関連する突然変異でること
が確認された。
【００４８】ALS2CR6遺伝子はイントロン33個とエクソ
ン34個を含有し、多形性DNAマーカーD2S2309に近接した
80.3kbのゲノムDNA内に存在する（図１）。ALS2CR6遺伝
子の転写極性はテロメアから中心体への方向である。AL
S2CR6転写産物（mRNA）は、4974ヌクレオチド（124-5,0
97nt）長の単一オープン読み取り枠（ORF）を有する全
長6394bp（配列番号１）を有し、1,657個のアミノ酸残
基から成る184KDaのタンパクをコードしている。ポリア
デニル化推定シグナル（AATAAA:6.375-6.380nt）とポリ
（A）領域は明確である。また、396個のアミノ酸配列を
コードする1,191bp ORFを有する全長2,651bpの短いALS2
CR6転写産物も同定した。この短いバリアントは変異体
はエクソン4の後の5’ドナー部位をスプライスし、その
結果、イントロン4の25個のアミノ酸残基の後に停止コ
ドンが形成されている。これらの結果に一致して、ノー
ザンブロット分析により多くのヒト成人組織で約6.5kb
と2.6kbの2個の転写産物を同定した（図３a）。短い転
写産物が主に発現している肝を除いて、両方の転写産物
は、同様の発現パターンを示した。大きな6.5kbの転写
産物は2.6kbの転写体よりも僅かに高レベルで発現し、
小脳で最も多く発現することが確認された。この遺伝子
はまた、ALS2患者未血細胞において発現していることが
確認された（図３b）。
【００４９】また、ALS2CR6のマウスホモログを単離
し、mALS2CR6と命名した。mALS2CR6の転写産物は、4,95
6bp（124-5,076nt）の１個のORFを有する全長6,349bp
（配列番号４）であり、1651個のアミノ酸から成る183k
Daのタンパク質（配列番号５）をコードしている。ORF
全体はヒトとマウスの間で、DNAレベル（87％同一）、
タンパク質レベル（91%同一、94%類似、図４）で良好に
保存されており、ALS2CR6遺伝子は哺乳類の中で良く保
存されている遺伝子であることが示唆されている。
【００５０】マウスの脳と脊髄におけるmALS2CR6転写産
物の発現局在性を調べるため、mALS2CR6 cDNAの一部分
に対するリボプローブを用いたin situハイブリダイゼ
ーションを行った。その結果、図５に示したように、mA
LS2CR6転写産物は、脳から脊髄に至る神経細胞、特に海
馬および歯状回のニューロン、小脳プルキニエ細胞、大
脳皮質のニューロン、および前角細胞を含む脊髄灰白質
において、様々なレベルで発現していた。また、嗅球、
基底核および脳神経核のニューロンにも顕著な発現が認
められた。
【００５１】ヒトALS2CR6タンパク質は多くの興味深い
性質を示した（図６ａ）。その第一の性質はALS2CR6のA
末端側の領域にあり、これはRCC1（染色体濃縮の調節因
子：文献７）とRPGR（色素性網膜炎GTPase調節因子：文
献８）と高い相同性を示した（図６b）。RCC1とRPGRタ
ンパク質はRanのようなGTPaseのグアニンヌクレオチド
交換ファクター（GEF）として働く。第二の性質は、ALS
2CR6はDb1相同（DH）ドメインとpleckstrin相同（PH）
ドメインを有しているが、これらのどちらのドメインも
RhoGEFタンパク質に見られる典型的なドメインである
（文献９、10）。さらにVPS9ドメインもC末端領域に認
められる。VPS9ドメインはVps9（文献11）およびRabex-
5（文献12）を含む多数のGEFに認められ、各々空胞タン
パクの選別と食作用的輸送を仲介するとされる。さら
に、14個のアミノ酸からなる2個のMORNモチーフ（文献13）
も認められる。MORNモチーフを含むジャンクトフィリン
についての最近の研究によれば、このモチーフは血漿膜
の結合に寄与していることが示されている（文献13）。
GEFはGTPaseのGDP結合形と関連し、GDPの解離とGTPの結
合を促進し、それによりGTPaseを活性化することが知ら
れている。GEFが多数のシグナル伝達カスケード（文献1
4）、ニューロン形成（文献15）、膜輸送（文献16）お
よびアクチン細胞骨格の形成（文献17）で重要な役割を
演じることが知られているので（文献18、19）、ALS2CR
6はRan-関連GTPaseの調節因子／アクチベーターとして
働き、膜の形成を調節し、ニューロンを含む細胞の
（膜）輸送に作用していると考えられる。
【００５２】RT-PCR解析によれば、突然変異したALS2CR
6遺伝子の転写産物は患者の染色体（図２ｃ）から転写
され、C末端に3個の新規な残基（Pro-Ser-Glu）を有す
る49個のアミノ酸から成る変異タンパク質を生成する
（図６ａ）。この変異タンパクはALS2CR6タンパク質に
対する機能性ドメインを持たないことから、本来の機能
を喪失させると考えられる。従って、このALS2CR6に認
められるA261del突然変異はALS2が劣性遺伝することと
関係している。
【００５３】ALSは軸索の輸送と細胞骨格の形成の欠陥
（文献20、21、22）と関連するという最近の知見は、AL
S2CR6遺伝子がALS2に対応し、ALS2は膜の構造Ran-関連G
TPaseの調節機能の欠落による膜の構造の欠陥によって
発生するという仮説を導く。
【００５４】ALS2CR6遺伝子はALSでの銅・亜鉛スーパー
オキシドデスムターゼ（SDS-1）遺伝子の役割の決定に
続く第二のALS遺伝子である。SOD-1の突然変異は遅発性
常染色体優性の形態に関与している（文献23）。ALS2CR
6遺伝子の同定は生化学的と同様に、医学的な意義があ
る。ALSでの推定GTPase調節因子の解明は、ALS2ばかり
でなく、他の家族性、散発性ALS（文献24、25）の分子
的病理を理解するための新しい手がかりになるはずであ
る。
【００５５】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、ALS2の発病に関連する新規遺伝子が提供
される。これによって、ALS2の発症メカニズムの解明や
ALS2の治療法開発が大きく前進する。またこの出願の発
明によって、ALS2の発病の可能性を高精度で診断するこ
とが可能となる。さらにこの出願の発明によってマウス
ALS2遺伝子と、この遺伝子をノックアウトしてマウスが
提供される。このノックアウトマウスはALS2のモデル動
物として、ALS2治療薬のスクリーニング等に有用に使用
される。
【００５６】
【参考文献】
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【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> ARS2CR6 gene and a method for diagnosing amyotrophic lateral sclerosis type 2 <130> NP01029-YS <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6394 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (124)..(5097) <400> 1 ggacccactg ggttgccaag ctcgcgccgg atgcggagcg cggtgctgcc ggtggagctt 60 caggtcttga tagactttct gtaaagaagg aatgatttgg tgatggagtg ttcccactga 120 ccg atg gac tca aag aag aga agc tca aca gag gca gaa gga tcc aag 168 Met Asp Ser Lys Lys Arg Ser Ser Thr Glu Ala Glu Gly Ser Lys 1 5 10 15 gaa aga ggc ctg gtc cat atc tgg cag gca gga tcc ttt ccc ata aca 216 Glu Arg Gly Leu Val His Ile Trp Gln Ala Gly Ser Phe Pro Ile Thr 20 25 30 cca gag aga ttg cca ggc tgg gga gga aag act gtt ttg cag gca gcc 264 Pro Glu Arg Leu Pro Gly Trp Gly Gly Lys Thr Val Leu Gln Ala Ala 35 40 45 ctc gga gtg aaa cat gga gtt ctt ctg act gaa gat ggt gag gtc tac 312 Leu Gly Val Lys His Gly Val Leu Leu Thr Glu Asp Gly Glu Val Tyr 50 55 60 agc ttt ggg act ctt ccc tgg aga agt gga cca gtg gag att tgt cca 360 Ser Phe Gly Thr Leu Pro Trp Arg Ser Gly Pro Val Glu Ile Cys Pro 65 70 75 agt agc ccc att cta gaa aat gcc ctg gtt ggg caa tat gtt att act 408 Ser Ser Pro Ile Leu Glu Asn Ala Leu Val Gly Gln Tyr Val Ile Thr 80 85 90 95 gtg gca aca gga agc ttc cat agt gga gca gtg aca gac aat ggt gtc 456 Val Ala Thr Gly Ser Phe His Ser Gly Ala Val Thr Asp Asn Gly Val 100 105 110 gcg tac atg tgg gga gag aat tct gct ggc cag tgt gca gta gcc aac 504 Ala Tyr Met Trp Gly Glu Asn Ser Ala Gly Gln Cys Ala Val Ala Asn 115 120 125 cag cag tat gtg ccg gaa cca aat cct gtc agc att gct gat tct gag 552 Gln Gln Tyr Val Pro Glu Pro Asn Pro Val Ser Ile Ala Asp Ser Glu 130 135 140 gcc agc cct ttg tta gca gtc agg att tta cag ttg gcg tgt ggc gag 600 Ala Ser Pro Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Gln Leu Ala Cys Gly Glu 145 150 155 gag cac act ctg gca ttg tca ata agc aga gag att tgg gca tgg ggt 648 Glu His Thr Leu Ala Leu Ser Ile Ser Arg Glu Ile Trp Ala Trp Gly 160 165 170 175 acc ggt tgt cag ttg ggt ctc att acc act gcc ttc cca gtg aca aag 696 Thr Gly Cys Gln Leu Gly Leu Ile Thr Thr Ala Phe Pro Val Thr Lys 180 185 190 ccg caa aag gta gaa cat ctt gct ggg cga gtg gtg ctt caa gtt gcc 744 Pro Gln Lys Val Glu His Leu Ala Gly Arg Val Val Leu Gln Val Ala 195 200 205 tgt ggt gct ttc cac agc tta gcc ctt gta caa tgc ctc cct tcc cag 792 Cys Gly Ala Phe His Ser Leu Ala Leu Val Gln Cys Leu Pro Ser Gln 210 215 220 gat ctg aag cca gtc cca gaa cga tgc aac cag tgc agc cag ctc ttg 840 Asp Leu Lys Pro Val Pro Glu Arg Cys Asn Gln Cys Ser Gln Leu Leu 225 230 235 att act atg act gac aaa gaa gac cat gtg att ata tca gac agt cat 888 Ile Thr Met Thr Asp Lys Glu Asp His Val Ile Ile Ser Asp Ser His 240 245 250 255 tgt tgc cca tta ggt gtg aca ctg aca gaa tct cag gca gaa aac cat 936 Cys Cys Pro Leu Gly Val Thr Leu Thr Glu Ser Gln Ala Glu Asn His 260 265 270 gcc agc act gct ctc agc ccc tcc act gaa acc ctt gac agg cag gaa 984 Ala Ser Thr Ala Leu Ser Pro Ser Thr Glu Thr Leu Asp Arg Gln Glu 275 280 285 gaa gta ttt gag aac act ctt gta gca aat gat cag tct gtt gct act 1032 Glu Val Phe Glu Asn Thr Leu Val Ala Asn Asp Gln Ser Val Ala Thr 290 295 300 gaa ctg aat gca gta agt gct cag atc aca agc agc gat gcc atg tcc 1080 Glu Leu Asn Ala Val Ser Ala Gln Ile Thr Ser Ser Asp Ala Met Ser 305 310 315 tct caa caa aat gtc atg gga aca act gaa att tcc tct gcc aga aac 1128 Ser Gln Gln Asn Val Met Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser Ala Arg Asn 320 325 330 335 ata cca tca tac cct gac acc caa gca gtc aat gaa tac cta cgg aaa 1176 Ile Pro Ser Tyr Pro Asp Thr Gln Ala Val Asn Glu Tyr Leu Arg Lys 340 345 350 ctg tca gat cat tca gta aga gag gac tca gag cat ggt gaa aag cca 1224 Leu Ser Asp His Ser Val Arg Glu Asp Ser Glu His Gly Glu Lys Pro 355 360 365 atg cca tct cag cct ctt tta gaa gaa gca att cct aat ctc cac agc 1272 Met Pro Ser Gln Pro Leu Leu Glu Glu Ala Ile Pro Asn Leu His Ser 370 375 380 ccg cct acc aca agc acc tca gcc cta aac agc ctg gtg gtc tct tgt 1320 Pro Pro Thr Thr Ser Thr Ser Ala Leu Asn Ser Leu Val Val Ser Cys 385 390 395 gca tct gct gtt ggt gtg aga gtg gct gct act tat gaa gct ggt gcc 1368 Ala Ser Ala Val Gly Val Arg Val Ala Ala Thr Tyr Glu Ala Gly Ala 400 405 410 415 ttg tca ctg aag aaa gtt atg aac ttt tat agt aca acc cct tgt gaa 1416 Leu Ser Leu Lys Lys Val Met Asn Phe Tyr Ser Thr Thr Pro Cys Glu 420 425 430 act gga gct cag gca ggc agt agt gcc att ggc ccc gaa ggt ttg aaa 1464 Thr Gly Ala Gln Ala Gly Ser Ser Ala Ile Gly Pro Glu Gly Leu Lys 435 440 445 gat agc agg gaa gaa cag gtt aaa cag gaa tca atg caa gga aag aaa 1512 Asp Ser Arg Glu Glu Gln Val Lys Gln Glu Ser Met Gln Gly Lys Lys 450 455 460 agt tca agt ctt gtg gat atc aga gaa gaa gaa aca gag gga ggc agt 1560 Ser Ser Ser Leu Val Asp Ile Arg Glu Glu Glu Thr Glu Gly Gly Ser 465 470 475 cga aga ctc tcc ctc cct gga ttg ttg tca caa gtt tcc ccc agg ctc 1608 Arg Arg Leu Ser Leu Pro Gly Leu Leu Ser Gln Val Ser Pro Arg Leu 480 485 490 495 tta aga aag gct gca cgg gtg aaa acg agg aca gtg gtt ctg acc ccc 1656 Leu Arg Lys Ala Ala Arg Val Lys Thr Arg Thr Val Val Leu Thr Pro 500 505 510 aca tac agt gga gaa gca gat gcg ctc ctg cct tct ctg aga aca gaa 1704 Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Asp Ala Leu Leu Pro Ser Leu Arg Thr Glu 515 520 525 gtg tgg acc tgg ggg aaa ggg aag gaa ggg cag ctg ggg cac ggc gat 1752 Val Trp Thr Trp Gly Lys Gly Lys Glu Gly Gln Leu Gly His Gly Asp 530 535 540 gtt ctg cct agg ctt caa ccg ttg tgt gta aaa tgt ctg gat ggc aaa 1800 Val Leu Pro Arg Leu Gln Pro Leu Cys Val Lys Cys Leu Asp Gly Lys 545 550 555 gaa gta atc cat ctg gag gca ggt ggt tac cat tct ctt gca ctt act 1848 Glu Val Ile His Leu Glu Ala Gly Gly Tyr His Ser Leu Ala Leu Thr 560 565 570 575 gcg aaa tcc cag gtt tac tca tgg ggt agc aat acc ttt ggt caa ctt 1896 Ala Lys Ser Gln Val Tyr Ser Trp Gly Ser Asn Thr Phe Gly Gln Leu 580 585 590 ggg cat tcc gat ttt cca aca aca gtt cct cgt ctt gca aag ata agc 1944 Gly His Ser Asp Phe Pro Thr Thr Val Pro Arg Leu Ala Lys Ile Ser 595 600 605 agt gaa aat gga gtc tgg agc ata gct gca ggc agg gat tat tcc ctg 1992 Ser Glu Asn Gly Val Trp Ser Ile Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Ser Leu 610 615 620 ttt tta gtg gat aca gaa gac ttc cag cct ggg tta tat tac agt ggc 2040 Phe Leu Val Asp Thr Glu Asp Phe Gln Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Gly 625 630 635 cga cag gac cct aca gaa ggt gac aac ctt cca gag aat cac agt ggt 2088 Arg Gln Asp Pro Thr Glu Gly Asp Asn Leu Pro Glu Asn His Ser Gly 640 645 650 655 tct aag act cca gta ctt ctc tcc tgt agt aag ctt gga tat ata agc 2136 Ser Lys Thr Pro Val Leu Leu Ser Cys Ser Lys Leu Gly Tyr Ile Ser 660 665 670 aga gtg aca gca gga aaa gat agc tat tta gcc ttg gtg gat aaa aac 2184 Arg Val Thr Ala Gly Lys Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Val Asp Lys Asn 675 680 685 att atg ggg tat att gcc agt ctc cac gag tta gct act aca gaa aga 2232 Ile Met Gly Tyr Ile Ala Ser Leu His Glu Leu Ala Thr Thr Glu Arg 690 695 700 cga ttc tat tca aaa cta agt gat atc aaa tct cag att ctc agg cct 2280 Arg Phe Tyr Ser Lys Leu Ser Asp Ile Lys Ser Gln Ile Leu Arg Pro 705 710 715 ctt ctc agt tta gaa aat ttg ggc act aca act aca gtc cag ctg ttg 2328 Leu Leu Ser Leu Glu Asn Leu Gly Thr Thr Thr Thr Val Gln Leu Leu 720 725 730 735 cag gag gtg gct agc cga ttc agc aag ctg tgt tac ctc att ggt cag 2376 Gln Glu Val Ala Ser Arg Phe Ser Lys Leu Cys Tyr Leu Ile Gly Gln 740 745 750 cat gga gcc tca ttg agc agc ttc ctt cat ggg gta aag gaa gcc agg 2424 His Gly Ala Ser Leu Ser Ser Phe Leu His Gly Val Lys Glu Ala Arg 755 760 765 agt ttg gtc atc ctg aag cat tca agt ctc ttc ttg gat agt tat aca 2472 Ser Leu Val Ile Leu Lys His Ser Ser Leu Phe Leu Asp Ser Tyr Thr 770 775 780 gag tat tgc aca tct att aca aat ttc ctg gtt atg gga gga ttc cag 2520 Glu Tyr Cys Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Val Met Gly Gly Phe Gln 785 790 795 ctt ctt gct aag cct gcc att gat ttc cta aat aaa aac caa gag ctg 2568 Leu Leu Ala Lys Pro Ala Ile Asp Phe Leu Asn Lys Asn Gln Glu Leu 800 805 810 815 ttg caa gat ttg tca gaa gtg aat gac gaa aac act cag ttg atg gaa 2616 Leu Gln Asp Leu Ser Glu Val Asn Asp Glu Asn Thr Gln Leu Met Glu 820 825 830 ata ctg aat act ttg ttt ttc ttg cca atc aga cga ctt cat aat tac 2664 Ile Leu Asn Thr Leu Phe Phe Leu Pro Ile Arg Arg Leu His Asn Tyr 835 840 845 gca aaa gtt ttg cta aag ctt gct act tgt ttt gaa gtg gca tct cca 2712 Ala Lys Val Leu Leu Lys Leu Ala Thr Cys Phe Glu Val Ala Ser Pro 850 855 860 gaa tat cag aaa ctg cag gat tcc agt tct tgt tat gag tgt ctt gct 2760 Glu Tyr Gln Lys Leu Gln Asp Ser Ser Ser Cys Tyr Glu Cys Leu Ala 865 870 875 ctc cat ctc ggc agg aaa agg aag gaa gca gaa tac aca ctg ggc ttc 2808 Leu His Leu Gly Arg Lys Arg Lys Glu Ala Glu Tyr Thr Leu Gly Phe 880 885 890 895 tgg aag acc ttc ccc gga aaa atg acg gat tcc ttg agg aag cca gag 2856 Trp Lys Thr Phe Pro Gly Lys Met Thr Asp Ser Leu Arg Lys Pro Glu 900 905 910 cgt cga ctg ctg tgt gag agt agt aac cga gcc ctg tct ctg cag cat 2904 Arg Arg Leu Leu Cys Glu Ser Ser Asn Arg Ala Leu Ser Leu Gln His 915 920 925 gct ggg agg ttt tcc gtg aat tgg ttc att ctc ttt aat gat gcc ctg 2952 Ala Gly Arg Phe Ser Val Asn Trp Phe Ile Leu Phe Asn Asp Ala Leu 930 935 940 gtc cat gcc cag ttc tcc acg cac cat gtt ttc cct ctg gcc acg ctg 3000 Val His Ala Gln Phe Ser Thr His His Val Phe Pro Leu Ala Thr Leu 945 950 955 tgg gca gag cca ctg tct gaa gaa gct ggt ggt gtg aat ggc tta aag 3048 Trp Ala Glu Pro Leu Ser Glu Glu Ala Gly Gly Val Asn Gly Leu Lys 960 965 970 975 ata act aca cct gag gag cag ttc act ctc att tca tct aca ccc cag 3096 Ile Thr Thr Pro Glu Glu Gln Phe Thr Leu Ile Ser Ser Thr Pro Gln 980 985 990 gaa aag aca aag tgg cta cga gct ata agc caa gcc gta gat cag gct 3144 Glu Lys Thr Lys Trp Leu Arg Ala Ile Ser Gln Ala Val Asp Gln Ala 995 1000 1005 ttg aga ggg atg tct gat ctc ccc cct tat gga agt ggt agc agt gtt 3192 Leu Arg Gly Met Ser Asp Leu Pro Pro Tyr Gly Ser Gly Ser Ser Val 1010 1015 1020 cag aga cag gaa cca ccc att tca cgc agt gcc aaa tat act ttc tac 3240 Gln Arg Gln Glu Pro Pro Ile Ser Arg Ser Ala Lys Tyr Thr Phe Tyr 1025 1030 1035 aag gat cct cgc cta aag gat gcc acc tat gat gga cgc tgg ctt tca 3288 Lys Asp Pro Arg Leu Lys Asp Ala Thr Tyr Asp Gly Arg Trp Leu Ser 1040 1045 1050 1055 ggg aag cct cat ggc aga ggg gtt ttg aag tgg cct gat gga aag atg 3336 Gly Lys Pro His Gly Arg Gly Val Leu Lys Trp Pro Asp Gly Lys Met 1060 1065 1070 tat tct ggc atg ttc agg aat ggc ttg gaa gat ggg tat gga gaa tac 3384 Tyr Ser Gly Met Phe Arg Asn Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Gly Glu Tyr 1075 1080 1085 aga atc cca aac aag gca atg aac aaa gaa gac cat tat gtg ggc cat 3432 Arg Ile Pro Asn Lys Ala Met Asn Lys Glu Asp His Tyr Val Gly His 1090 1095 1100 tgg aaa gaa gga aaa atg tgc ggt caa gga gtc tac agc tat gct tct 3480 Trp Lys Glu Gly Lys Met Cys Gly Gln Gly Val Tyr Ser Tyr Ala Ser 1105 1110 1115 ggt gaa gta ttt gag ggc tgt ttt caa gat aat atg cgt cat ggt cat 3528 Gly Glu Val Phe Glu Gly Cys Phe Gln Asp Asn Met Arg His Gly His 1120 1125 1130 1135 ggt ctt cta cga agt ggg aaa ttg acg tcc tct tct cct agt atg ttc 3576 Gly Leu Leu Arg Ser Gly Lys Leu Thr Ser Ser Ser Pro Ser Met Phe 1140 1145 1150 att ggc cag tgg gta atg gat aag aaa gca gga tat ggt gtc ttt gat 3624 Ile Gly Gln Trp Val Met Asp Lys Lys Ala Gly Tyr Gly Val Phe Asp 1155 1160 1165 gat atc act agg ggg gaa aag tat atg gga atg tgg caa gat gat gtg 3672 Asp Ile Thr Arg Gly Glu Lys Tyr Met Gly Met Trp Gln Asp Asp Val 1170 1175 1180 tgt caa ggg aat ggt gtg gtg gtt acc cag ttt gga tta tac tac gag 3720 Cys Gln Gly Asn Gly Val Val Val Thr Gln Phe Gly Leu Tyr Tyr Glu 1185 1190 1195 ggc aac ttt cac ctt aat aaa atg atg gga aat ggg gtt ttg ctt tcc 3768 Gly Asn Phe His Leu Asn Lys Met Met Gly Asn Gly Val Leu Leu Ser 1200 1205 1210 1215 gaa gat gat act atc tat gaa gga gaa ttt tca gat gac tgg act ctt 3816 Glu Asp Asp Thr Ile Tyr Glu Gly Glu Phe Ser Asp Asp Trp Thr Leu 1220 1225 1230 agt gga aag gga aca ctg act atg cca aat gga gac tac att gaa ggt 3864 Ser Gly Lys Gly Thr Leu Thr Met Pro Asn Gly Asp Tyr Ile Glu Gly 1235 1240 1245 tat ttt agt gga gaa tgg gga tct ggg ata aaa atc act gga acc tac 3912 Tyr Phe Ser Gly Glu Trp Gly Ser Gly Ile Lys Ile Thr Gly Thr Tyr 1250 1255 1260 ttc aaa cct agt cta tat gag agt gat aaa gac aga cct aaa gtt ttc 3960 Phe Lys Pro Ser Leu Tyr Glu Ser Asp Lys Asp Arg Pro Lys Val Phe 1265 1270 1275 agg aag cta gga aac ctg gca gtg cca gct gat gag aag tgg aaa gcg 4008 Arg Lys Leu Gly Asn Leu Ala Val Pro Ala Asp Glu Lys Trp Lys Ala 1280 1285 1290 1295 gtg ttt gac gaa tgt tgg cgc caa ctg ggc tgt gag ggc cca ggc caa 4056 Val Phe Asp Glu Cys Trp Arg Gln Leu Gly Cys Glu Gly Pro Gly Gln 1300 1305 1310 ggg gaa gtt tgg aaa gca tgg gac aat att gct gtg gcc ttg acc acc 4104 Gly Glu Val Trp Lys Ala Trp Asp Asn Ile Ala Val Ala Leu Thr Thr 1315 1320 1325 agt cgg cgc cag cac aga gac agt cca gaa ata ttg agt cgt tca cag 4152 Ser Arg Arg Gln His Arg Asp Ser Pro Glu Ile Leu Ser Arg Ser Gln 1330 1335 1340 act cag aca cta gag agt ttg gaa ttc att cca cag cat gtt ggt gcc 4200 Thr Gln Thr Leu Glu Ser Leu Glu Phe Ile Pro Gln His Val Gly Ala 1345 1350 1355 ttc tct gtg gag aaa tat gat gac atc agg aaa tat tta ata aag gcc 4248 Phe Ser Val Glu Lys Tyr Asp Asp Ile Arg Lys Tyr Leu Ile Lys Ala 1360 1365 1370 1375 tgt gac act cct ctg cac ccc ctg ggc agg ctt gtg gag aca ctg gtt 4296 Cys Asp Thr Pro Leu His Pro Leu Gly Arg Leu Val Glu Thr Leu Val 1380 1385 1390 gca gtg tat aga atg aca tac gtg ggc gta gga gcc aac cgc agg tta 4344 Ala Val Tyr Arg Met Thr Tyr Val Gly Val Gly Ala Asn Arg Arg Leu 1395 1400 1405 ttg cag gag gct gta aag gag att aag tcc tat ctt aag cga att ttc 4392 Leu Gln Glu Ala Val Lys Glu Ile Lys Ser Tyr Leu Lys Arg Ile Phe 1410 1415 1420 cag ctg gtg agg ttc tta ttt cct gag ctg cct gaa gaa ggc agc aca 4440 Gln Leu Val Arg Phe Leu Phe Pro Glu Leu Pro Glu Glu Gly Ser Thr 1425 1430 1435 att cct ctc tct gct cct ctg cca acc gaa agg aag tct ttt tgc act 4488 Ile Pro Leu Ser Ala Pro Leu Pro Thr Glu Arg Lys Ser Phe Cys Thr 1440 1445 1450 1455 ggg aag tca gat tcc cga tct gaa tca cca gag cca ggt tat gta gta 4536 Gly Lys Ser Asp Ser Arg Ser Glu Ser Pro Glu Pro Gly Tyr Val Val 1460 1465 1470 acg agt tct gga tta ttg ctt cct gtg ctg cta cct cgg ctc tac cca 4584 Thr Ser Ser Gly Leu Leu Leu Pro Val Leu Leu Pro Arg Leu Tyr Pro 1475 1480 1485 ccg ctg ttt atg ctt tat gct ttg gat aat gat cgc gag gaa gac att 4632 Pro Leu Phe Met Leu Tyr Ala Leu Asp Asn Asp Arg Glu Glu Asp Ile 1490 1495 1500 tac tgg gaa tgt gtc ctt cga cta aat aag cag cca gat att gct ctc 4680 Tyr Trp Glu Cys Val Leu Arg Leu Asn Lys Gln Pro Asp Ile Ala Leu 1505 1510 1515 ctg ggc ttt ctt ggg gtg cag agg aaa ttt tgg cca gca acc ttg tca 4728 Leu Gly Phe Leu Gly Val Gln Arg Lys Phe Trp Pro Ala Thr Leu Ser 1520 1525 1530 1535 atc ctt gga gag agt aaa aag gtt ttg cca acc acg aaa gat gct tgt 4776 Ile Leu Gly Glu Ser Lys Lys Val Leu Pro Thr Thr Lys Asp Ala Cys 1540 1545 1550 ttt gcc tca gca gta gaa tgt ctg cag cag atc agc aca aca ttt acc 4824 Phe Ala Ser Ala Val Glu Cys Leu Gln Gln Ile Ser Thr Thr Phe Thr 1555 1560 1565 cca tca gac aaa ctt aag gtc atc cag cag act ttt gag gag atc tct 4872 Pro Ser Asp Lys Leu Lys Val Ile Gln Gln Thr Phe Glu Glu Ile Ser 1570 1575 1580 cag agt gtc ctg gcg tca ctc cac gaa gac ttc ttg tgg tcc atg gat 4920 Gln Ser Val Leu Ala Ser Leu His Glu Asp Phe Leu Trp Ser Met Asp 1585 1590 1595 gac ttg ttt cct gtt ttc tta tat gtg gtg cta cgg gcc agg att agg 4968 Asp Leu Phe Pro Val Phe Leu Tyr Val Val Leu Arg Ala Arg Ile Arg 1600 1605 1610 1615 aat tta ggc tct gag gta cac ctc att gag gat cta atg gac ccc tat 5016 Asn Leu Gly Ser Glu Val His Leu Ile Glu Asp Leu Met Asp Pro Tyr 1620 1625 1630 ctt cag cat ggg gaa cag ggt ata atg ttc acc acc ttg aag gca tgt 5064 Leu Gln His Gly Glu Gln Gly Ile Met Phe Thr Thr Leu Lys Ala Cys 1635 1640 1645 tac tac cag att cag cgt gag aag ctt aac tag gctgcataac agcttgaaaa 5117 Tyr Tyr Gln Ile Gln Arg Glu Lys Leu Asn 1650 1655 ctggattatc tactacagag tgttataaca ccatctggag tcttcctgta gtggcaaaaa 5177 agaacagtgt tgaaattgga aaggactttg tgttatttag gttgttagaa tgagccttac 5237 caataataag agccctgagc ccagaaaaaa ggactgtata gtttaaaggg aggattgaaa 5297 gggaggtaaa aaatcagatt agaccagttc ttggcctatg ataagttcca aaaataccat 5357 ttatctacta tttgaaaaaa gaagaggata tcccttccta cagtaaaggg tatgtcagct 5417 acatgaagtt gtaagaaaag cttccagtag agcttcttat attaaagaag ttgatggata 5477 tttttgaatt tctggtttgc ctgaatccac ctgcagttac cccgatccgt ttgcaagaac 5537 cagatcgtac ttgaaactat agtggccaca ctctgccttc ctgagtccct tccagtcatg 5597 tgtgcatcat gtctctttgc caagggaggg gagaaaggaa cttttaaact gcagttttaa 5657 ctttttctaa gctgtttctt gatgggagag gttctgtgca aaactaccac attctgtccc 5717 caaaatgtgg aatgcatcca aataggagtc ttctgcctct taacttaaaa gaacatagga 5777 attttgtttt tggtttcttt atcatgctac agagagtgaa tacactggaa ttcagacacc 5837 gactctgagc tgctaggaac ctcatttgtc catgtgcaaa cgctgtattc caaggcctgt 5897 gaatggcagc ctgaggaagt tttgcatgca ggctgtgttt tcgagcagga ctaacaactg 5957 ggaaataagc aaaaaactgc atcgatcccc agcctggtgt tgttcttccc tatacttcac 6017 actgaactca ggatgggaag aaaaaggaaa caagctttgg ctttttccat ctcaaaagta 6077 ttgtggcacc tcaacatttc agtgttttgc tttttaaaaa atgccctatt gtaagttgtt 6137 ggtttatact gtataagtaa cactagtagc tgttttgaat aacataggtg ctcttcctca 6197 tctcatctcc tacaccgtgg tgagcataca gagtgtcctg atttgtgtta agtgactgag 6257 aagatgttaa ttacttttga aaaaggatca tggtttttgc tctactttat aatcaagaca 6317 agtgtttatt aaaatactgt tttggaatgt tggctgtaat gtaacagcaa ttttcataat 6377 aaaaggcatt catcttt 6394 <210> 2 <211> 1657 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Lys Lys Arg Ser Ser Thr Glu Ala Glu Gly Ser Lys Glu 1 5 10 15 Arg Gly Leu Val His Ile Trp Gln Ala Gly Ser Phe Pro Ile Thr Pro 20 25 30 Glu Arg Leu Pro Gly Trp Gly Gly Lys Thr Val Leu Gln Ala Ala Leu 35 40 45 Gly Val Lys His Gly Val Leu Leu Thr Glu Asp Gly Glu Val Tyr Ser 50 55 60 Phe Gly Thr Leu Pro Trp Arg Ser Gly Pro Val Glu Ile Cys Pro Ser 65 70 75 80 Ser Pro Ile Leu Glu Asn Ala Leu Val Gly Gln Tyr Val Ile Thr Val 85 90 95 Ala Thr Gly Ser Phe His Ser Gly Ala Val Thr Asp Asn Gly Val Ala 100 105 110 Tyr Met Trp Gly Glu Asn Ser Ala Gly Gln Cys Ala Val Ala Asn Gln 115 120 125 Gln Tyr Val Pro Glu Pro Asn Pro Val Ser Ile Ala Asp Ser Glu Ala 130 135 140 Ser Pro Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Gln Leu Ala Cys Gly Glu Glu 145 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cat gtc tgg cag gca gga tcc ttt tct cta aca 216 Glu Arg Gly Leu Val His Val Trp Gln Ala Gly Ser Phe Ser Leu Thr 20 25 30 cca gag agg ttg cca ggc tgg ggt gga aag aca gtt ctt cag gca gcc 264 Pro Glu Arg Leu Pro Gly Trp Gly Gly Lys Thr Val Leu Gln Ala Ala 35 40 45 ctt ggt gtg agg cat gga gtt ctt ctg act gaa gat ggt gag gtc tac 312 Leu Gly Val Arg His Gly Val Leu Leu Thr Glu Asp Gly Glu Val Tyr 50 55 60 agc ttt ggg act ctt ccc tgg aaa agt gaa tca gca gaa att tgt cca 360 Ser Phe Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Glu Ser Ala Glu Ile Cys Pro 65 70 75 agc agc ccc ctt cta gaa agt gcc ctg gtt ggg cat cat gtt att act 408 Ser Ser Pro Leu Leu Glu Ser Ala Leu Val Gly His His Val Ile Thr 80 85 90 95 gtg gca aca ggg agc ttc cac agt gga gca gtg aca gag agc ggg gtg 456 Val Ala Thr Gly Ser Phe His Ser Gly Ala Val Thr Glu Ser Gly Val 100 105 110 gtg tac atg tgg gga gag aat gct gcc ggg cag tgt gcg gta gct aac 504 Val Tyr Met Trp Gly Glu Asn Ala Ala Gly Gln Cys Ala Val Ala Asn 115 120 125 cag cag tat gtg ccg gag ccg agt cct gtc agc att tct gac tcg gag 552 Gln Gln Tyr Val Pro Glu Pro Ser Pro Val Ser Ile Ser Asp Ser Glu 130 135 140 acc agc ccg tca tta gca gtt agg att ctg caa ttg gca tgt ggc gag 600 Thr Ser Pro Ser Leu Ala Val Arg Ile Leu Gln Leu Ala Cys Gly Glu 145 150 155 gaa cac aca ctg gca ttg tca ctc agc aga gag atc tgg gca tgg ggc 648 Glu His Thr Leu Ala Leu Ser Leu Ser Arg Glu Ile Trp Ala Trp Gly 160 165 170 175 acc ggc tgt cag ctg ggc ctc atc acc acc act ttc cca gtg aca aag 696 Thr Gly Cys Gln Leu Gly Leu Ile Thr Thr Thr Phe Pro Val Thr Lys 180 185 190 cca cag aag gtg gaa cac ctt gct gga cga gtg gtg ctc cag gtg gcc 744 Pro Gln Lys Val Glu His Leu Ala Gly Arg Val Val Leu Gln Val Ala 195 200 205 tgc ggt gca ttc cac agc ctt gca ctt gtg cag tgc ctc cct cct cag 792 Cys Gly Ala Phe His Ser Leu Ala Leu Val Gln Cys Leu Pro Pro Gln 210 215 220 gat ctg aag cca gtc cca gag aga tgc aat cag tgc agc cag ctg ctc 840 Asp Leu Lys Pro Val Pro Glu Arg Cys Asn Gln Cys Ser Gln Leu Leu 225 230 235 atc acc atg aca gac aaa gag gac cat gtg ata ata tcg gac agc cat 888 Ile Thr Met Thr Asp Lys Glu Asp His Val Ile Ile Ser Asp Ser His 240 245 250 255 tgc tgc cct tta ggt gtg aca ttg tcc gag tct caa gca gaa aag cat 936 Cys Cys Pro Leu Gly Val Thr Leu Ser Glu Ser Gln Ala Glu Lys His 260 265 270 gcc agc cct gct ccc agc cct cac cca gag gca ctg gat gag cag gga 984 Ala Ser Pro Ala Pro Ser Pro His Pro Glu Ala Leu Asp Glu Gln Gly 275 280 285 gag gtg ttt gag aac acg gtg gta gaa gct gaa ctg aac atg gga agc 1032 Glu Val Phe Glu Asn Thr Val Val Glu Ala Glu Leu Asn Met Gly Ser 290 295 300 agt cag acc aca agt ggc agt gcc att tcc acc cag cag aac atc gtg 1080 Ser Gln Thr Thr Ser Gly Ser Ala Ile Ser Thr Gln Gln Asn Ile Val 305 310 315 gga aca gct gaa gtg tct tct gcc aga aca gct ccg tca tac cca gac 1128 Gly Thr Ala Glu Val Ser Ser Ala Arg Thr Ala Pro Ser Tyr Pro Asp 320 325 330 335 acc cat gcg gta act gca tac ctg cag aag ctg tca gag cat tcg atg 1176 Thr His Ala Val Thr Ala Tyr Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Ser Met 340 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aag cca gag cgc cgg ctg ctg tgt gag 2856 Lys Met Thr Asp Ser Leu Arg Lys Pro Glu Arg Arg Leu Leu Cys Glu 900 905 910 agc agt aac cga gcc ctc tcc ctg cag cat gcc ggc agg ttt tct gtg 2904 Ser Ser Asn Arg Ala Leu Ser Leu Gln His Ala Gly Arg Phe Ser Val 915 920 925 aat tgg ttc att ctc ttc aat gat gcc ctg gtc cat gct cag ttc tct 2952 Asn Trp Phe Ile Leu Phe Asn Asp Ala Leu Val His Ala Gln Phe Ser 930 935 940 aca cac cac gtg ttc cct ttg gcc aca ctc tgg gca gag cca cta tct 3000 Thr His His Val Phe Pro Leu Ala Thr Leu Trp Ala Glu Pro Leu Ser 945 950 955 gaa gaa gct ggt agc gtg aat ggc tta aag ata act aca cct gaa gaa 3048 Glu Glu Ala Gly Ser Val Asn Gly Leu Lys Ile Thr Thr Pro Glu Glu 960 965 970 975 caa ttc aca ctc att tct tca aca ccc cag gaa aag acc aag tgg ctt 3096 Gln Phe Thr Leu Ile Ser Ser Thr Pro Gln Glu Lys Thr Lys Trp Leu 980 985 990 cgg gct att agc caa gct gtg gat cag gct ttg agg ggg acg tcc gat 3144 Arg Ala Ile Ser Gln Ala Val Asp Gln Ala Leu Arg Gly Thr Ser Asp 995 1000 1005 ttc cca 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Glu Val Phe Glu Gly 1105 1110 1115 tgc ttt caa gat aac atg cgc cat ggg cat ggt ctg ctc cgg agt gga 3528 Cys Phe Gln Asp Asn Met Arg His Gly His Gly Leu Leu Arg Ser Gly 1120 1125 1130 1135 aaa ctg act tct tct tct cct agc atg ttc att ggc cag tgg gta atg 3576 Lys Leu Thr Ser Ser Ser Pro Ser Met Phe Ile Gly Gln Trp Val Met 1140 1145 1150 gat aag aaa gca gga tat ggc gtc ttt gat gat atc acc agg gga gaa 3624 Asp Lys Lys Ala Gly Tyr Gly Val Phe Asp Asp Ile Thr Arg Gly Glu 1155 1160 1165 aag tac atg gga atg tgg cag gat gat gtg tgc caa ggg aat ggg gta 3672 Lys Tyr Met Gly Met Trp Gln Asp Asp Val Cys Gln Gly Asn Gly Val 1170 1175 1180 gta gtc acc cag ttt ggg tta tac tac gaa ggc aac ttc cac ctg aat 3720 Val Val Thr Gln Phe Gly Leu Tyr Tyr Glu Gly Asn Phe His Leu Asn 1185 1190 1195 aag atg atg gga aat ggg gtt ttg ctt tct gaa gat gat acc atc tat 3768 Lys Met Met Gly Asn Gly Val Leu Leu Ser Glu Asp Asp Thr Ile Tyr 1200 1205 1210 1215 gaa gga gaa ttt tcc gat gac tgg aca ctt agt gga aag gga acg ctg 3816 Glu Gly Glu Phe Ser Asp Asp Trp Thr Leu Ser Gly Lys Gly Thr Leu 1220 1225 1230 act atg cca cat gga gat tat att gaa ggt tat ttt agt gga gaa tgg 3864 Thr Met Pro His Gly Asp Tyr Ile Glu Gly Tyr Phe Ser Gly Glu Trp 1235 1240 1245 gga tct ggg ata aaa atc act ggg acc tac ttc aaa cct agc ctg tat 3912 Gly Ser Gly Ile Lys Ile Thr Gly Thr Tyr Phe Lys Pro Ser Leu Tyr 1250 1255 1260 gag agc gat aag gac aag ccc aaa gcc ttc agg aag ctg ggg aac ctg 3960 Glu Ser Asp Lys Asp Lys Pro Lys Ala Phe Arg Lys Leu Gly Asn Leu 1265 1270 1275 gcc gtg gca gca gac gag aaa tgg aga gca gtg ttt gaa gaa tgc tgg 4008 Ala Val Ala Ala Asp Glu Lys Trp Arg Ala Val Phe Glu Glu Cys Trp 1280 1285 1290 1295 cac cag ctg ggc tgt gag agc cca ggc caa ggg gag gtt tgg aaa gca 4056 His Gln Leu Gly Cys Glu Ser Pro Gly Gln Gly Glu Val Trp Lys Ala 1300 1305 1310 tgg gat aat att gct gtg gcc ttg acc acg aac cgt cgc cag cat aaa 4104 Trp Asp Asn Ile Ala Val Ala Leu Thr Thr Asn Arg Arg Gln His Lys 1315 1320 1325 gac agt cca gaa ata cta agc cgc tct cag act cag acc ctg gag agt 4152 Asp Ser Pro Glu Ile Leu Ser Arg Ser Gln Thr Gln Thr Leu Glu Ser 1330 1335 1340 ttg gag tac att ccc cag cac att ggc gcc ttc tct gtg gag aaa tat 4200 Leu Glu Tyr Ile Pro Gln His Ile Gly Ala Phe Ser Val Glu Lys Tyr 1345 1350 1355 gat gac atc aag aag tat tta ata aag gcc tgt gat act cct ctg cac 4248 Asp Asp Ile Lys Lys Tyr Leu Ile Lys Ala Cys Asp Thr Pro Leu His 1360 1365 1370 1375 cca ctg ggc agg ctt gtg gag acc ctg gtt gcg gtg tat aga atg aca 4296 Pro Leu Gly Arg Leu Val Glu Thr Leu Val Ala Val Tyr Arg Met Thr 1380 1385 1390 tat gtg ggt gta ggg gcc aac cgc cgg tta ctg cag gaa gct gtg aag 4344 Tyr Val Gly Val Gly Ala Asn Arg Arg Leu Leu Gln Glu Ala Val Lys 1395 1400 1405 gag att aaa tct tat ctc aag agg att ttc cag ctt gtg agg ttc ttg 4392 Glu Ile Lys Ser Tyr Leu Lys Arg Ile Phe Gln Leu Val Arg Phe Leu 1410 1415 1420 ttt cct gag ctt cct gag gag ggc agc aca att cct ctt tct gct cct 4440 Phe Pro Glu Leu Pro Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Leu Ser Ala 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cacatgtgag gaagcaggga gctacagtgg ccctcagccc agtctgcggg 5959 tcttccctct acctcacact gaactcagaa gggaaggaag gagagacgca catgggattc 6019 tcccacctca gaagtattgt gacagcaccg cataaccacg gtttgctctt ttacaagcag 6079 cctcacaagt gtgggttgtg ggtgtgcgct ggagcagtgc cactcgtagc tgtttggata 6139 ccacaggtgc tcttccgtct catctgctgt actcggaggc gagcgcagtg gcctgactca 6199 tgggaaatga ctcagcaggc ggcaactact tttgaaaagg atcatgattt ccgagctact 6259 ttataatcaa gacaagcatt tgttaacata ctgttttgga atgttggctg taatgtaaca 6319 gcagttttca taataaatga cattcatctc 6349 <210> 5 <211> 1651 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Asp Ser Lys Lys Lys Ser Ser Thr Glu Ala Glu Gly Ser Lys Glu 1 5 10 15 Arg Gly Leu Val His Val Trp Gln Ala Gly Ser Phe Ser Leu Thr Pro 20 25 30 Glu Arg Leu Pro Gly Trp Gly Gly Lys Thr Val Leu Gln Ala Ala Leu 35 40 45 Gly Val Arg His Gly Val Leu Leu Thr Glu Asp Gly Glu Val Tyr Ser 50 55 60 Phe Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Glu Ser Ala Glu Ile Cys Pro Ser 65 70 75 80 Ser Pro Leu Leu Glu Ser Ala Leu Val Gly His His Val 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Ser 290 295 300 Gln Thr Thr Ser Gly Ser Ala Ile Ser Thr Gln Gln Asn Ile Val Gly 305 310 315 320 Thr Ala Glu Val Ser Ser Ala Arg Thr Ala Pro Ser Tyr Pro Asp Thr 325 330 335 His Ala Val Thr Ala Tyr Leu Gln Lys Leu Ser Glu His Ser Met Arg 340 345 350 Glu Asn His Glu Pro Gly Glu Lys Pro Pro Gln Val Gln Pro Leu Val 355 360 365 Glu Glu Ala Val Pro Asp Leu His Ser Pro Pro Thr Thr Ser Thr Ser 370 375 380 Ala Leu Asn Ser Leu Val Val Ser Cys Ala Ser Ala Val Gly Val Arg 385 390 395 400 Val Ala Ala Thr Tyr Glu Ala Gly Ala Leu Ser Leu Lys Lys Val Met 405 410 415 Asn Phe Tyr Ser Thr Ala Pro Cys Glu Thr Ala Ala Gln Ser Gly Ser 420 425 430 Ala Ser Thr Gly Pro Glu Ser Leu Lys Asp Leu Arg Glu Glu Gln Val 435 440 445 Lys Gln Glu Ser Leu Gln Gly Lys Lys Ser Ser Ser Leu Met Asp Ile 450 455 460 Arg Glu Glu Glu Ser Glu Gly Gly Ser Arg Arg Leu Ser Leu Pro Gly 465 470 475 480 Leu Leu Ser Gln Val Ser Pro Arg Leu Leu Arg Lys Ala Ala Arg Val 485 490 495 Lys Thr Arg Thr Val Val Leu Thr Pro Thr Tyr Ser Gly Glu Ala Asp 500 505 510 Ala Leu Leu Pro Ser Leu Arg Thr Glu Val Trp Thr Trp Gly Lys Gly 515 520 525 Lys Glu Gly Gln Leu Gly His Gly Asp Val Leu Pro Arg Leu Gln Pro 530 535 540 Leu Cys Val Lys Cys Leu Asp Gly Lys Glu Val Ile His Leu Glu Ala 545 550 555 560 Gly Gly Ser His Ser Leu Ala Leu Thr Ala Lys Ser Gln Val Tyr Ser 565 570 575 Trp Gly Ser Asn Thr Phe Gly Gln Leu Gly His Ser Glu Phe Pro Thr 580 585 590 Thr Val Pro Arg Leu Ser Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly Val Trp Ser 595 600 605 Val Ala Ala Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Phe Leu Val Asp Thr Glu Asp 610 615 620 Phe Gln Pro Gly Leu Tyr Tyr Ser Gly Arg Gln Asp Arg Ala Glu Gly 625 630 635 640 Asp Thr Leu Pro Glu Asn Pro Ser Gly Thr Lys Thr Pro Val Leu Leu 645 650 655 Ser Cys Ser Lys Leu Gly Tyr Ile Ser Arg Val Thr Ala Gly Lys Asp 660 665 670 Ser Tyr Leu Ala Leu Val Asp Lys Asn Ile Met Gly Tyr Ile Ala Ser 675 680 685 Leu His Glu Leu Ala Ser Thr Glu Arg Arg Phe Tyr Ser Lys Leu Ser 690 695 700 Glu Ile Lys Ser Gln Ile Leu Arg Pro Leu Leu Ser Leu Glu Asn Leu 705 710 715 720 Gly Thr Val Thr Thr Val Gln Leu Leu Gln Glu Val Ala Ser Arg Phe 725 730 735 Ser Lys Leu Cys Tyr Leu Ile Gly Gln His Gly Ala Ser Leu Ser Ser 740 745 750 Tyr Leu Gln Gly Met Lys Glu Ala Ser Ser Leu Val Ile Met Lys His 755 760 765 Ser Ser Leu Phe Leu Asp Ser Tyr Thr Glu Tyr Cys Thr Ser Val Ser 770 775 780 Asn Phe Leu Val Met Gly Gly Phe Gln Leu Leu Ala Lys Pro Ala Ile 785 790 795 800 Asp Phe Leu Asn Lys Asn Gln Glu Leu Leu Gln Asp Leu Ser Glu Val 805 810 815 Asn Asp Glu Asn Thr Gln Leu Met Glu Ile Leu Asn Met Leu Phe Phe 820 825 830 Leu Pro Ile Arg Arg Leu His Asn Tyr Ala Lys Val Leu Leu Lys Leu 835 840 845 Ala Thr Cys Phe Glu Val Thr Ser Pro Glu Tyr Gln Lys Leu Gln Asp 850 855 860 Ser Ser Ser Cys Tyr Glu Ser Leu Ala Leu His Leu Gly Lys Lys Arg 865 870 875 880 Lys Glu Ala Glu Tyr Thr Leu Ser Phe Trp Lys Thr Phe Pro Gly Lys 885 890 895 Met Thr Asp Ser Leu Arg Lys Pro Glu Arg Arg Leu Leu Cys Glu Ser 900 905 910 Ser Asn Arg Ala Leu Ser Leu Gln His Ala Gly Arg Phe Ser Val Asn 915 920 925 Trp Phe Ile Leu Phe Asn Asp Ala Leu Val His Ala Gln Phe Ser Thr 930 935 940 His His Val Phe Pro Leu Ala Thr Leu Trp Ala Glu Pro Leu Ser Glu 945 950 955 960 Glu Ala Gly Ser Val Asn Gly Leu Lys Ile Thr Thr Pro Glu Glu Gln 965 970 975 Phe Thr Leu Ile Ser Ser Thr Pro Gln Glu Lys Thr Lys Trp Leu Arg 980 985 990 Ala Ile Ser Gln Ala Val Asp Gln Ala Leu Arg Gly Thr Ser Asp Phe 995 1000 1005 Pro Leu Tyr Gly Gly Gly Ser Ser Val Gln Arg Gln Glu Pro Pro Ile 1010 1015 1020 Ser Arg Ser Ala Lys Tyr Thr Phe Tyr Lys Asp Thr Arg Leu Lys Asp 1025 1030 1035 1040 Ala Thr Tyr Asp Gly Arg Trp Leu Ser Gly Lys Pro His Gly Arg Gly 1045 1050 1055 Val Leu Lys Trp Pro Asp Gly Lys Met Tyr Ser Gly Met Phe Arg Asn 1060 1065 1070 Gly Leu Glu Asp Gly Tyr Gly Glu Tyr Arg Ile Pro Asn Lys Ala Leu 1075 1080 1085 Asn Lys Glu Asp His Tyr Val Gly His Trp Lys Glu Gly Lys Met Cys 1090 1095 1100 Gly Gln Gly Val Tyr Ser Tyr Ala Ser Gly Glu Val Phe Glu Gly Cys 1105 1110 1115 1120 Phe Gln Asp Asn Met Arg His Gly His Gly Leu Leu Arg Ser Gly Lys 1125 1130 1135 Leu Thr Ser Ser Ser Pro Ser Met Phe Ile Gly Gln Trp Val Met Asp 1140 1145 1150 Lys Lys Ala Gly Tyr Gly Val Phe Asp Asp Ile Thr Arg Gly Glu Lys 1155 1160 1165 Tyr Met Gly Met Trp Gln Asp Asp Val Cys Gln Gly Asn Gly Val Val 1170 1175 1180 Val Thr Gln Phe Gly Leu Tyr Tyr Glu Gly Asn Phe His Leu Asn Lys 1185 1190 1195 1200 Met Met Gly Asn Gly Val Leu Leu Ser Glu Asp Asp Thr Ile Tyr Glu 1205 1210 1215 Gly Glu Phe Ser Asp Asp Trp Thr Leu Ser Gly Lys Gly Thr Leu Thr 1220 1225 1230 Met Pro His Gly Asp Tyr Ile Glu Gly Tyr Phe Ser Gly Glu Trp Gly 1235 1240 1245 Ser Gly Ile Lys Ile Thr Gly Thr Tyr Phe Lys Pro Ser Leu Tyr Glu 1250 1255 1260 Ser Asp Lys Asp Lys Pro Lys Ala Phe Arg Lys Leu Gly Asn Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Val Ala Ala Asp Glu Lys Trp Arg Ala Val Phe Glu Glu Cys Trp His 1285 1290 1295 Gln Leu Gly Cys Glu Ser Pro Gly Gln Gly Glu Val Trp Lys Ala Trp 1300 1305 1310 Asp Asn Ile Ala Val Ala Leu Thr Thr Asn Arg Arg Gln His Lys Asp 1315 1320 1325 Ser Pro Glu Ile Leu Ser Arg Ser Gln Thr Gln Thr Leu Glu Ser Leu 1330 1335 1340 Glu Tyr Ile Pro Gln His Ile Gly Ala Phe Ser Val Glu Lys Tyr Asp 1345 1350 1355 1360 Asp Ile Lys Lys Tyr Leu Ile Lys Ala Cys Asp Thr Pro Leu His Pro 1365 1370 1375 Leu Gly Arg Leu Val Glu Thr Leu Val Ala Val Tyr Arg Met Thr Tyr 1380 1385 1390 Val Gly Val Gly Ala Asn Arg Arg Leu Leu Gln Glu Ala Val Lys Glu 1395 1400 1405 Ile Lys Ser Tyr Leu Lys Arg Ile Phe Gln Leu Val Arg Phe Leu Phe 1410 1415 1420 Pro Glu Leu Pro Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Leu Ser Ala Pro Leu 1425 1430 1435 1440 Pro Thr Gly Arg Arg Ser Phe Cys Thr Gly Lys Leu Asp Ser Arg Ser 1445 1450 1455 Glu Ser Pro Glu Pro Gly Tyr Val Val Thr Ser Ser Gly Leu Leu Leu 1460 1465 1470 Pro Val Leu Leu Pro Arg Leu Tyr Pro Pro Leu Phe Met Leu Tyr Ala 1475 1480 1485 Leu Asp Asn Asp Arg Glu Glu Asp Ile Tyr Trp Glu Cys Val Leu Arg 1490 1495 1500 Leu Asn Lys Gln Pro Asp Ile Ala Leu Leu Gly Phe Leu Gly Val Gln 1505 1510 1515 1520 Lys Lys Phe Trp Pro Ala Thr Leu Ser Ile Leu Gly Glu Ser Lys Lys 1525 1530 1535 Val Leu Ser Thr Thr Lys Asp Ala Cys Phe Ala Ser Ala Val Glu Cys 1540 1545 1550 Leu Gln Gln Ile Ser Thr Thr Phe Thr Pro Ser Asp Lys Leu Lys Val 1555 1560 1565 Ile Gln Gln Thr Phe Glu Glu Ile Ser Gln Ser Val Leu Ala Ser Leu 1570 1575 1580 Gln Glu Asp Phe Leu Trp Ser Met Asp Asp Leu Phe Pro Val Phe Leu 1585 1590 1595 1600 Tyr Val Val Leu Arg Ala Arg Ile Arg Asn Leu Gly Ser Glu Val His 1605 1610 1615 Leu Ile Glu Asp Leu Met Asp Pro Phe Leu Gln His Gly Glu Gln Gly 1620 1625 1630 Ile Met Phe Thr Thr Leu Lys Ala Cys Tyr Phe Gln Ile Gln Arg Glu 1635 1640 1645 Lys Leu Asn 1650 <210> 6 <221> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 6 cctagtcatc catgtgctgg 20 <210> 7 <221> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 7 tcccatacct gaccttccac 20 <210> 8 <221> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 8 cttgatagac tttctgtaaa gaag 24 <210> 9 <221> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence: Synthesized Oligonucleotide <400> 9 ggctacttgg acaaatctcc actg 24
【図面の簡単な説明】
【図１】ALS2候補領域を含むヒト染色体2q33の3Mb領域
の転写マップである。D2S116からD2S2237の間の白抜き
の四角部分はALS2候補領域中の重要な部分である（文献
４）。既に報告されている物理マップを基に7個のSTSマ
ーカー、12個の多形性DNAマーカーおよび42個の独立転
写ユニットの位置を示す。38個の転写ユニットの極性を
矢印で示す。
【図２】ALS2の突然変異の検出過程を示す。aはチュニ
ジアのALS2家系の１例である。家族構成メンバーの遺伝
子型は報告されている結果（文献４、５）を基に示し
た。bはALS2家系のゲノムDNA中の突然変異（A261del）
の配列決定の結果を示す。患者10797はホモ接合型A261d
elであり、キャリア10784はヘテロ接合型である。配列
決定はPCR産物について行った。cはALS2家系でのA261de
l突然変異の遺伝子の制限酵素NarIによる切断の結果で
ある。エクソンPCRでは、正常遺伝子産物（339bpのフラ
グメント）が、変異遺伝子産物では２つのフラグメント
（225bp、113bp）に切断される。RT-PCR産物については
正常産物（302bpフラグメント）が変異産物では２つの
フラグメント（195bp、106bp）に切断される。
【図３】ALS2CR6mRNAのノーザンプロット分析の結果で
ある。ａは、多数の成人ヒト組織のポリA+mRNA 2μgを
含有するノーザンブロットをALS2CR6 cDNAクローンのエ
クソン4とハイブリダイズさせた。下の図はRNAの性質と
比較ロードを確認するため、同一のブロットをヒトβ−
アクチン cDNAとハイブリダイズさせたものである。左
にALS2CR6転写体の大きさを示す。ｂは、正常な全脳か
ら得たトータルRNA10μgと患者および健常者（10788
人）のリンパ球から得た20μgのトータルRNAを含むノー
ザンブロットをALS2CR6 cDNAのエクソン４とハイブリダ
イズさせた。右パネルは、RNAサンプルのアガロースゲ
ル電気泳動を示す。
【図４】ヒトALS2CR6およびマウスホモログmALS2CR6の
アミノ酸配列の比較である。同一の残基は枠に囲って示
した。変異タンパク質の特異な3個のアミノ酸残基の位
置（47番目のアミノ酸残基から始まる）とALS2CR6遺伝
子の短いバリアント部分25個のアミノ酸残基（372番目
の残基から始まる）の位置を示す。
【図５】成体マウスの脳および脊髄におけるmALS2CR6 m
RNAの発現である。ａはアンチセンスmALS2CR6リボプロ
ーブを用いたRNA/RNA in situハイブリダイゼーション
の矢状全体像であり、ｂはセンス鎖プローブを用いたコ
ントロール像である。海馬と歯状回のニューロン（ｃお
よびｇ）、小脳のプルキニエ細胞（ｄおよびｈ）、大脳
皮質ニューロン（ｅおよびｉ）、前角細胞を含む脊髄灰
白質（ｆおよびｊ）に顕著な発現が認められた。スケー
ルバーは10μmの長さを示す。
【図６】アミノ酸シークエンス分析の結果である。aは
正常および変異ALS2CR6タンパク質中のドメインとモチ
ーフの模式図である。RCC1は 染色体縮合の調節因子、
DHはDb1の相同ドメイン、PHはプレクストリン相同ドメ
イン、MORNは膜の構造と認識ネクサス、VPS9は9個のド
メインを区分させる空胞タンパク質である。bは、ヒトA
LS2CR6、マウスmALS2CR6、ヒトRCC1、ヒトRPGRおよびマ
ウスRPGRのそれぞれのRCC1リピート含有領域のアミノ酸
配列の比較である。白抜きで示されたアミノ酸残基は同
一であることを示す。また、保存アミノ酸残基も多く含
まれている。RCC1に対する７つのブレード（blade）の
位置は、文献(30)に従って示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (72)発明者 池田 穣衛 東京都目黒区上目黒５−31−１ (72)発明者 秦野 伸二 神奈川県厚木市長谷898−５ (72)発明者 マイケル ハイデン カナダ ブイ５ゼット ４エイチ４， ブ リティッシュ コロンビア，バンクーバ ー， アベニュー28，ウェスト980 ユニ バーシティ オブ ブリティッシュ コロ ンビア アンド チルドレンズ アンド ウィメンズ ホスピタル，デパートメント オブ メディカル ジェネティクス ア ンド セントレフォー モレキュラー メ ディシン アンド セラピュティクス内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA19 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 DA75 EA50 FA72 FA74

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト2番染色体q33領域に存在し、配列番
    号２のアミノ酸配列を有するヒトGTPase調節因子をコー
    ドするヒトALS2CR6遺伝子。
  2. 【請求項２】 cDNAが配列番号１の塩基配列を有する請
    求項１のヒトALS2CR6遺伝子。
  3. 【請求項３】 請求項１のヒトALS2CR6遺伝子のゲノムD
    NA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製された
    ポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 請求項１のヒトALS2CR6遺伝子または請
    求項３のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下で
    ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ。
  5. 【請求項５】 請求項１のヒトALS2CR6遺伝子または請
    求項３のポリヌクレオチドをPCR増幅するオリゴヌクレ
    オチドプライマーセット。
  6. 【請求項６】 ２型筋萎縮性側索硬化症に関連する遺伝
    子であって、請求項１のヒトALS2CR6遺伝子の１塩基欠
    失により、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異タン
    パク質をコードするヒトALS2CR6変異遺伝子。
  7. 【請求項７】 請求項６のヒトALS2CR6変異遺伝子のゲ
    ノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製
    されたポリヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 請求項６のヒトALS2CR6変異遺伝子また
    は請求項７のポリヌクレオチドにおける塩基欠失部位を
    含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズす
    るオリゴヌクレオチドプローブ。
  9. 【請求項９】 請求項６のヒトALS2CR6変異遺伝子また
    は請求項７のポリヌクレオチドにおける塩基欠失部位を
    含む領域をPCR増幅するオリゴヌクレオチドプライマー
    セット。
  10. 【請求項１０】 プライマーセットが、配列番号６およ
    び７の塩基配列からなる１対の合成オリゴヌクレオチド
    である請求項９のオリゴヌクレオチドプライマーセッ
    ト。
  11. 【請求項１１】 プライマーセットが、配列番号８およ
    び９の塩基配列からなる１対の合成オリゴヌクレオチド
    である請求項９のオリゴヌクレオチドプライマーセッ
    ト。
  12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドを保有す
    る組換えベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項７のポリヌクレオチドを保有す
    る組換えベクター
  14. 【請求項１４】 請求項１２の組換えベクターによる形
    質転換体細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１３の組換えベクターによる形
    質転換体細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項１の遺伝子の発現産物であっ
    て、配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とす
    るヒトGTPase調節因子。
  17. 【請求項１７】 請求項１４の形質転換体細胞によって
    産生される請求項１６のGTPase調節因子。
  18. 【請求項１８】 配列番号２における第１−46番アミノ
    酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からな
    るペプチド。
  19. 【請求項１９】 配列番号２における第47−1657番アミ
    ノ酸配列の連続５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列から
    なるペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項６のヒトALS2CR6変異遺伝子の
    発現産物であって、配列番号３アミノ酸配列からなる変
    異タンパク質。
  21. 【請求項２１】 請求項１５の形質転換体細胞によって
    産生される請求項２０の変異タンパク質。
  22. 【請求項２２】 請求項１６のヒトGTPase調節因子を認
    識する抗体。
  23. 【請求項２３】 請求項１８のペプチドを抗原として調
    製された請求項２２の抗体。
  24. 【請求項２４】 請求項１９のペプチドを抗原として調
    製された請求項２２の抗体。
  25. 【請求項２５】 請求項６の遺伝子を検出することを特
    徴とする２型筋萎縮性側索硬化症の診断方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１０または１１のオリゴヌクレ
    オチドプライマーセットを用いて被験者細胞のゲノムDN
    AをPCR増幅し、得られたDNA断片を制限酵素NarIで処理
    し、DNA断片が２断片化した被験者を２型筋萎縮性側索
    硬化症と判定する請求項２５の診断方法。
  27. 【請求項２７】 請求項６の遺伝子の転写産物を検出す
    ることを特徴とする２型筋萎縮性側索硬化症の診断方
    法。
  28. 【請求項２８】 転写産物が、請求項６の遺伝子のmRNA
    またはcDNAである請求項２７の診断方法。
  29. 【請求項２９】 転写産物が、請求項２０の変異タンパ
    ク質である請求項２７の診断方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２２の抗体が反応し、請求項２
    ３の抗体が反応しないタンパク質を検出する請求項２９
    の診断方法。
  31. 【請求項３１】 配列番号５のアミノ酸配列を有するマ
    ウスGTPase調節因子をコードするマウスALS2CR6遺伝
    子。
  32. 【請求項３２】 請求項３１のマウスALS2CR6遺伝子の
    ゲノムDNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精
    製されたポリヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】 請求項３１の遺伝子が実質的に機能欠
    失した遺伝子欠損マウスおよびその組織。
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