JP2002253270A - 組換え蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｎ末端メチオニンの除去された組換え蛋白質
を効率良く生産する方法。 【解決手段】 遺伝子組換え蛋白質発現のための発現ベ
クターにより形質転換された宿主の培養において培養液
中の溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御する。 【効果】 培養液中の溶存酸素濃度を低く制御すること
により、そのような制御をしない場合に比べてＮ末端メ
チオニンの付加されていない組換え蛋白質の発現割合が
増加する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え蛋白
質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え蛋白質（以下、単に「組換
え蛋白質」ということがある）の生産のための宿主とし
てはコスト等の面から大腸菌が最も広く用いられている
が、大腸菌で組換え蛋白質の発現を行った場合、動物細
胞で発現させた場合に見られるような正確なプロセッシ
ングがおこらない場合がある。大腸菌で発現させた場合
に見られる、開始コドンＡＴＧに由来するＮ末端のメチ
オニンの付加もそのような不正確なプロセッシングの一
つである。大腸菌で発現した組換え蛋白質のＮ末端に付
加されたメチオニンの除去は、通常、メチオニンアミノ
ペプチダーゼによって行われるが、この酵素はメチオニ
ンに続くアミノ酸がアルギニン、プロリンなどのアミノ
酸の場合にはほとんど作用しない。メチオニンに続くア
ミノ酸がセリン、アラニンなどの場合は比較的作用しや
すいものの、該組換え蛋白質の発現量が高い場合には、
発現した組換え蛋白質の大部分がＮ末端にメチオニンを
有したままであることが多い。Ｎ末端にメチオニンが付
加した組換え蛋白質とＮ末端にメチオニンが付加してい
ない組換え蛋白質を精製によって分離することが可能で
ある場合もあるが、通常、Ｎ末端メチオニンの有無しか
違わない両者を分離することは困難な場合が多く、精製
収率の点で不利となる。そのためＮ末端にメチオニンが
付加した組換え蛋白質の割合を低下させることは精製収
率の面においても効果が期待される。Ｎ末端にメチオニ
ンを付加した組換え蛋白質は、本来の活性が認められな
かったり、その組換え蛋白質を医薬品として用いる場合
には、抗原性が問題となることもある。Ｎ末端のメチオ
ニンを除去あるいは該メチオニンの付加していない組換
え蛋白質を生産する方法としてその他には、分泌発現を
行う方法（C.N. Changeら、Gene、189-196、55(198
7)）、融合タンパクとして発現させる方法（板倉ら、Sc
ience, 198, 1056(1977)）、発現後にアミノペプチダー
ゼを用いてメチオニンを除去する方法（中川ら、Biotec
hnology, 5, 824(1987)）などが知られている。しか
し、分泌発現を行う方法に関しては通常の発現に比べて
生産量が低いという不都合がある。また、融合タンパク
として発現させる方法および発現後にアミノペプチダー
ゼを用いてメチオニンを除去する方法に関しては、発現
させた後に、融合タンパクの切断又はメチオニンの除去
の操作が必要となり、操作が煩雑になるだけでなく、最
終的な収率・純度の低下を招き不都合である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】高発現下においても、
大腸菌を宿主として、効率的にＮ末端のメチオニンが除
去された組換え蛋白質を発現するための培養法の確立が
課題とされていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、遺伝子組
換え蛋白質発現のための発現ベクターにより形質転換さ
れた大腸菌の培養において、培養液中の溶存酸素濃度を
約１ｐｐｍ以下に制御し、溶存酸素濃度をこのような低
い状態で保ちながら培養を行うことにより、Ｎ末端のメ
チオニンが除去された組換え蛋白質を高効率に発現する
ことを見出し、本発明を完成した。

【０００５】すなわち、本発明は、（１）遺伝子組換え
蛋白質発現のための発現ベクターにより形質転換された
宿主の培養において、培養液中の溶存酸素濃度を約１ｐ
ｐｍ以下に制御することを特徴とする、Ｎ末端にメチオ
ニンの付加していない組換え蛋白質の製造方法、（２）
培養液中の溶存酸素濃度が、約０．０１〜１．０ｐｐｍ
である前記（１）記載の製造方法、（３）培養液中の溶
存酸素濃度が、０．０５〜１．０ｐｐｍである前記
（１）記載の製造方法、（４）培養液の攪拌回転数を調
節することにより溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御
することを特徴とする前記（１）記載の製造方法、
（５）宿主がエシェリヒア属菌である前記（１）記載の
製造方法、（６）培養液に、さらに発現誘導物質を添加
することを特徴とする前記（１）記載の製造方法、
（７）発現誘導物質がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシドである前記（６）記載の製造方法、
（８）発現誘導物質の培養液中の濃度が、約０．０１〜
１ｍＭである前記（６）記載の製造方法などを提供する
ものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明によれば、目的とする蛋白
質の遺伝子を大腸菌等の原核細胞の宿主に導入し、培養
液中の溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御して該組換
え原核細胞（好ましくは大腸菌）を培養することによ
り、Ｎ末端にメチオニンが付加されていない目的蛋白質
を効率良く得ることができる。

【０００７】本明細書において目的蛋白質は、ペプチド
標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端
がＣ末端（カルボキシル末端）である。目的蛋白質とし
ては、例えば、成長因子類（例、ＦＧＦ−９等）、イン
ターロイキン類（例、インターロイキン−２、インター
ロイキン−６等）、インターフェロン類、ケモカイン類
（例、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１等）、
生理活性ペプチド類〔例、副甲状腺ホルモン（ＰＴ
Ｈ）、ガラニンレセプターに対するリガンドペプチド
（ＧＡＬＰ）（ＷＯ ９９／４８９２０）、ＫｉＳＳ−
１ペプチド（ＷＯ ００／２４８９０）、ＲＦＲＰ−１
（ＷＯ ００／２９４４１）、ＰｒＲＰ（ＷＯ ９７／２
４４３６）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシ
トニン、コナントキン、コルチコトロピン放出因子、ダ
イノルフィン、エンドルフィン、エンケファリン、ガラ
ニン等〕、神経栄養因子類（例、ＧＤＮＦ等）、酵素類
（例、ＬＣＡＴ様リゾホスホリパーゼ等）などの真核生
物由来の蛋白質が挙げられる。これらの蛋白質はそれら
単独で用いられてもよく、またそれらのＣ末端側に塩基
性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦの誘導
体、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、
マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）、グリ
ーンフルオレッセントプロテイン（ＧＦＰ）などの他の
真核生物由来の蛋白質、原核生物由来の蛋白質またはポ
リヒスチジンなどのタグを融合して用いてもよい。目的
蛋白質は塩を形成していてもよく、目的蛋白質の塩とし
ては、とりわけ生理学的に許容されうる塩が好ましい。
この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リ
ン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例
えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン
酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安
息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との
塩などの酸付加塩などが用いられる。

【０００８】目的とする蛋白質の遺伝子を宿主に導入す
るためのベクターとしては、ｐＢＲ３２２（ジーン（Ge
ne）、2、95 (1977)），pＢＲ３１３〔ジーン，２，７
５(１９７７)〕，pＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５（ジーン
（Gene）、4、121 (1978)），pＢＲ３２７，pＢＲ３２
８〔ジーン，９，２８７(１９８０)〕，pＢＲ３２９
〔ジーン，１７，７９(１９８２)〕，pＫＹ２２８９
〔ジーン，３，１(１９７８)〕，pＫＹ ２７００〔生化
学，５２，７７０(１９８０)〕，pＡＣＹＣ１７７，pＡ
ＣＹＣ１８４〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J
ournal of Bacteriology)，１３４，１１４１(１９７
８)〕，ｐＲＫ２４８，ｐＲＫ６４６，ｐＤＦ〔メソッ
ズ・イン・エン ジーモロジー(Methods in Enzymolog
y)，６８，２６８(１９７９)〕，ｐＵＣ１２（ジーン
（Gene）、19、259 (1982)），ｐＵＣ１３（ジーン（Ge
ne）、19、259 (1982)）、pＵＣ１８，pＵＣ１９〔ヤニ
シューペロンら，ジーン(Gene)，３３，１０３(１９８
５)〕などのエシェリヒア属菌などの原核細胞で複製可
能なベクターであればどのようなベクターでも用いるこ
とができる。目的とする蛋白質の遺伝子の転写のための
プロモーターとしては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプ
ロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Lプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプ
ロモーターなどがあげられる。必要によりＳＤ（シヤイ
ンアンドダルガーノ）配列をプロモーターの下流に挿入
してもよい。Ｔ７プロモーターの系を用いる場合には、
Ｔ７プロモーターとしては、Ｔ７ＤＮＡ上で見いだされ
ている１７種のプロモーター〔J. L. Oakley ら，Pro
c．Natl. Acad. Sci, U.S.A，74:4266-4270(1977)，M.
D. Rosa, Cell 16:815-825(1979)，N. Panayotatos
ら，Nature,280:35(1979)，J. J. Dunn ら，J. Mol. Bi
ol.,166:477-535(1983)〕のいずれでもよく、φ１０プ
ロモーター〔A. H. Rosenberg ら，Gene，56:125-135(1
987)〕が好ましい。プロモーターＤＮＡは公知の方法に
従って、ベクター中の適当な部位に挿入することができ
る。目的蛋白質をコードするＤＮＡの挿入のために、通
常プロモーターＤＮＡの下流に適当な制限酵素認識部位
を設けることができる。転写ターミネーターとしては、
大腸菌の系で作動するターミネーター、好ましくはＴφ
ターミネーター〔F. W. Studier ら，J. Mol. Biol.,18
9:113-130(1986)〕が用いられる。Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子としてはＴ７遺伝子〔F. W. Studier ら，J.
Mol. Biol.,189:113-130(1986)〕を用いることが出来
る。

【０００９】目的蛋白質の遺伝子は公知の方法に従っ
て、ベクター中のプロモーターＤＮＡの下流に挿入する
ことができる。ベクターには、以上の他に、所望により
選択マーカーを含有しているものを用いることができ
る。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性
遺伝子（Ａｍｐ^r）、テトラサイクリン耐性遺伝子、カ
ナマイシン耐性遺伝子等があげられる。目的蛋白質をコ
ードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを用いて、
宿主を形質転換させることによって形質転換体を製造す
ることができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア
属菌などの原核細胞が用いられる。エシェリヒア属菌の
具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）Ｋ１２、ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・
ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６
０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック
・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），
９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molec
ular Biology），１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ
１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネテ
ィックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕，
ＭＭ２９４，ＪＭ１０９，ＢＬ２１などが用いられる。
例えば、Ｔ７プロモーターの系を用いる場合、上記の菌
にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ（Ｔ７ＤＮＡ１）
〔F. W. Studierら，J. Mol. Biol. １８９：１１３−
１３０(１９８６)〕を組み込んだ大腸菌株、またはＴ７
ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ（Ｔ７ＤＮＡ１）を他のプ
ラスミドと共に組込んだ大腸菌株などが用いられる。好
ましくはＴ７ ＤＮＡ１を組み込んだλファージが溶原
化したＭＭ２９４（ＤＥ３），ＪＭ１０９（ＤＥ３），
ＢＬ２１（ＤＥ３）などが用いられる。

【００１０】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例
えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエ
ー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），６９巻，２１１０
頁（１９７２年）やジーン（Gene），１７巻，１０７頁
（１９８２年）などに記載の方法に従って行うことがで
きる。宿主が原核細胞である形質転換体を培養する際、
目的蛋白質の製造のための形質転換体の培養に使用され
る培地としては液体培地が適当であり、培地中には該形
質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他
が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコ
ース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コー
ンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、
大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、
無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水
素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。ま
た、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加
してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましく、約６〜
８がより好ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培
地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ
９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス
（Journal of Experiments in Molecular Genetics），
４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New
York１９７２〕が好ましい。培養液には、必要によ
り、プロモーターを効率よく働かせるために、発現誘導
物質を添加してもよい。発現誘導物質としては、例え
ば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）、３β−インドリルアクリル酸などが用い
られる。使用濃度は、約０．０１〜１．５ｍＭ、好まし
くは約０．０１〜１ｍＭである。発現誘導物質の添加時
期は、培養液中の溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御
する前後のいずれでもよく、好ましくは制御前である。
ＩＰＴＧは、例えば、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロ
モーターなどを用いる場合に用いられる。また、Ｔ７プ
ロモーター系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼＤＮ
Ａ（Ｔ７ ＤＮＡ１）がｌａｃプロモーターの下流に連
結されている場合においても、発現誘導物質としてＩＰ
ＴＧが用いられる。３β−インドリルアクリル酸は、例
えば、ｔｒｐプロモーターを用いた場合に用いられる。
ｒｅｃＡプロモーターをより効率良く働かせるため、す
なわちｒｅｃＡ遺伝子発現抑制機能を低下せしめるた
め、必要によりマイトマイシンＣ、ナルジキシン酸など
の薬剤の添加、紫外線照射、培養液のｐＨのアルカリ側
への変化などを行ってもよい。発現誘導は、発現誘導物
質の添加のみならず、培養温度を変化させることによっ
て行ってもよい。λｃＩｔｓリプレッサーおよびλＰＬ
−プロモーターを含有する発現ベクターを有する組換え
体を使用する場合、培養を、例えば約１５〜３６℃、好
ましくは約３０〜３６℃で行い、λｃＩｔｓリプレッサ
ーの不活化による発現誘導を、例えば約３７〜４２℃で
行うのが好ましい。Ｔ７プロモータの系においても、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ（Ｔ７ ＤＮＡ１）がλ
ＰＬプロモーターの下流に連結されている場合には、培
養の温度を上昇させることにより、生成するＴ７ファー
ジＲＮＡポリメラーゼ１により特異的にＴ７プロモータ
ーを作動させる。培養は通常約１５〜４３℃、好ましく
は、約２５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要によ
り、通気や撹拌を加えることもできる。培養液中の溶存
酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御する方法としては、例
えば攪拌回転数、通気量、通気する気体の種類などを選
択する方法が挙げられ、単独で調整してもよいし、複数
組み合わせて調整してもよい。このうち、攪拌回転数を
調整することにより溶存酸素濃度を制御する方法が好ま
しい。これらの条件は、発現誘導時の菌体濃度、発現誘
導物質の濃度、発酵槽の大きさ、攪拌翼の形状などによ
って異なるため、適宜選択されればよく、溶存酸素濃度
が１ｐｐｍに維持されればよい。また、溶存酸素濃度を
モニターし、溶存酸素濃度が好ましい値に維持されるよ
うに、自動的に攪拌回転数、通気量または通気する気体
の酸素分圧を制御してもよい。これらの制御に関しては
連続的に行ってもよいし、段階的に行ってもよい。具体
的な条件として、例えば、３〜５Ｌ容量の発酵槽を用い
た場合、約３７℃、通気量１〜３Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転
数約３００〜７００ｒｐｍで攪拌することにより溶存酸
素濃度を目的の濃度に設定できる。攪拌速度または通気
量を上げることにより溶存酸素濃度を上げることがで
き、逆に攪拌速度または通気量を下げることにより溶存
酸素濃度を下げることができる。本発明において培養中
に維持される溶存酸素濃度は、Ｎ末端にメチオニンの付
加していない組換え蛋白質の割合を多くする濃度であれ
ば、いずれの濃度でもよい。好ましくは、Ｎ末端にメチ
オニンの付加していない組換え蛋白質が、Ｎ末端にメチ
オニンの付加している組換え蛋白質よりも多量（例え
ば、得られる蛋白質の約６０％以上、好ましくは約７０
％以上、より好ましくは約８０％以上）に得られる濃度
であれば、いずれの濃度に変更してもよい。また、形質
転換細胞が目的蛋白質の生産に適した増殖を維持する限
り低くすることが好ましい。例えば、約１ｐｐｍ以下、
好ましくは、約０．７ｐｐｍ以下、さらに好ましくは約
０．５ｐｐｍ以下で、あり、例えば、約０．０１ｐｐｍ
以上、好ましくは約０．０５ｐｐｍ以上、さらに好まし
くは約０．１ｐｐｍ以上である。培養液中の溶存酸素濃
度の好ましい範囲は、例えば、約０．０１〜１．０ｐｐ
ｍ、好ましくは約０．０５〜１．０ｐｐｍ、さらに好ま
しくは約０．０５〜０．７ｐｐｍ、より好ましくは約
０．１〜０．５ｐｐｍである。上記と同様にして、エシ
ェリヒア属菌以外の原核細胞を形質転換し培養すること
ができる。このように、溶存酸素濃度を制御することに
より、得られる組換えタンパク質のうち、Ｎ末端にメチ
オニンの付加していない組換え蛋白質を通常、約６０％
以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０
％以上の割合で製造することができる。

【００１１】上記培養物から目的蛋白質を分離・精製す
るには、例えば、下記の方法により行うことができる。
目的蛋白質を培養菌体から抽出するに際しては、培養
後、公知の方法で菌体を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解など
によって菌体を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポ
リペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ
る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤や、トリトンＸ−１００^TMなどの界面活性剤が含ま
れていてもよい。培養液中に目的蛋白質が分泌される場
合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と
上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られ
た培養上清、あるいは抽出液中に含まれる目的蛋白質の
精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行う
ことができる。これらの公知の分離、精製法としては、
塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析
法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷
電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が用いられる。なお、目的とするＮ末端にメチオニンの
付加していない組換え蛋白質は、公知の方法を用いてＮ
末端にメチオニンの付加している組換え蛋白質と分離・
精製することができるが、分離・精製せずにそのまま使
用してもよい。

【００１２】かくして得られる目的蛋白質が遊離体で得
られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法
によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場
合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊
離体または他の塩に変換することができる。なお、組換
え体が産生する目的蛋白質を、精製前または精製後に適
当な蛋白修飾酵素を作用させることまたは化学反応によ
り、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去す
ることもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリ
プシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダー
ゼ、プロテインキナーゼなどが用いられる。化学反応と
しては、例えば、ブロムシアンを用いた切断反応、２−
ニトロ−５−チオシアノ安息香酸を用いた切断反応など
があげられる。

【００１３】抽出した目的蛋白質または分離・精製した
目的蛋白質は必要により、蛋白質のリフォールディング
に付される。リフォールディングは、例えばタンパク質
のフォールディング、R.H.Pain編、245-279(1995)、シ
ュプリンガーフェアラーク東京に記載された公知の方法
あるいはそれに準じる方法により実施する事が可能であ
る。抽出剤（例えば、グアニジン塩酸塩、尿素のような
カオトロピック可溶化剤、ｎ−ラウリルメチルグリシ
ン、ＳＤＳのような界面活性剤など）を含まないもしく
は低濃度の抽出剤を含む緩衝液で１段階もしくは他段階
での希釈や、半透膜を用いた透析、ゲル濾過を用いた緩
衝液の置換等により行うことが出来る。この場合、目的
蛋白質のアグリゲーションを防止するために、アルギニ
ン、ポリエチレングリコール、中性界面活性剤等を添加
することが出来る。蛋白質のジスルフィド結合形成のた
めに空気酸化、酸化還元緩衝液系等を用いることが出来
る。酸化還元緩衝液にはグルタチオン、システイン、ジ
チオスレイトール、２−メルカプトエタノール、または
システアミンをベースとしたものが挙げられる。

【００１４】得られた目的蛋白質は、該蛋白質の性質に
よって異なるが、たとえば医薬、試薬、原料、飼料など
として使用することができる。目的蛋白質を医薬として
使用する場合、常套手段に従って実施することができ
る。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠
剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤な
どとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学
的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤など
の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合
物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、
賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などととも
に一般に認められた単位用量形態で混和することによっ
て製造することができる。これら製剤における有効成分
量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにする
ものである。錠剤、カプセル剤などに混和することがで
きる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスター
チ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結
晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラ
チン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マ
グネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカ
リンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油または
チェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形
態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさら
に油脂のような液状担体を含有することができる。注射
のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活
性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油な
どを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤技術にした
がって製造することができる。注射用の水性液として
は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を
含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニト
ール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶
解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノー
ル）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤
（たとえばポリソルベート８０^TM、ＨＣＯ−５０）など
と併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油など
があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベン
ジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤
（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、
無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカ
インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポ
リエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジ
ルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配
合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプ
ルに充填される。このようにして得られる製剤は、例え
ば哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルな
ど）に対して投与することができる。

【００１５】本明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があ
り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとす
る。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｍ ：ＡまたはＣ Ｒ ：ＧまたはＡ Ｗ ：ＡまたはＴ Ｓ ：ＧまたはＣ Ｙ ：ＴまたはＣ Ｋ ：ＧまたはＴ Ｖ ：ＡまたはＧまたはＣ Ｈ ：ＡまたはＣまたはＴ Ｄ ：ＡまたはＧまたはＴ Ｂ ：ＧまたはＣまたはＴ Ｎ ：ＡまたはＣまたはＧまたはＴ ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム

【００１６】 Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン

【００１７】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の
配列を示す。 ［配列番号：１］参考例２で用いられたプライマー１の
塩基配列を示す。 ［配列番号：２］参考例２で用いられたプライマー２の
塩基配列を示す。 ［配列番号：３］参考例２で用いられた合成ＤＮＡ１の
塩基配列を示す。 ［配列番号：４］参考例２で用いられた合成ＤＮＡ２の
塩基配列を示す。 ［配列番号：５］参考例２で用いられた合成ＤＮＡ３の
塩基配列を示す。 ［配列番号：６］参考例２で用いられた合成ＤＮＡ４の
塩基配列を示す。 ［配列番号：７］参考例３で用いられた合成ＤＮＡ５の
塩基配列を示す。 ［配列番号：８］参考例３で用いられた合成ＤＮＡ６の
塩基配列を示す。 ［配列番号：９］参考例３で用いられたプライマー３の
塩基配列を示す。 ［配列番号：１０］参考例３で用いられたプライマー４
の塩基配列を示す。 ［配列番号：１１］参考例３で用いられたプライマー５
の塩基配列を示す。 ［配列番号：１２］参考例３で用いられたプライマー６
の塩基配列を示す。 ［配列番号：１３］参考例３で用いられたプライマー７
の塩基配列を示す。 ［配列番号：１４］［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８
４）のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１５］［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８
４）をコードする遺伝子の塩基配列を示す。 ［配列番号：１６］ヒトＰＴＨ（１−３４）のアミノ酸
配列を示す。 ［配列番号：１７］ラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白
のアミノ酸配列を示す。 ［配列番号：１８］ラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白
をコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【００１８】後述の参考例１で得られた形質転換体エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＣＰＴＨは、２０００年７月２７日から日本
国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番
号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究
所 特許生物寄託センター（旧：通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−７２４５として、また１９９８年１月２３
日から日本国大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７−
８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６１５６として寄託されている。後述の参考例２
で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichi
a coli）ＪＭ１０９／ｐＧＦＰＮＰは、２０００年７月
１７日から独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物
寄託センター（旧：ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７２２３として、また２０００年４月２４日から財
団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６
４２６として寄託されている。後述の参考例４で得られ
た形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦＣＲＧＡＬは、２０００
年７月１７日から独立行政法人産業技術総合研究所 特
許生物寄託センター（旧：ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−７２２６として、また２０００年４月２４日
から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ
１６４２９として寄託されている。後述の参考例５で
得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦＣＳ４は、２００
０年７月１７日から独立行政法人産業技術総合研究所
特許生物寄託センター（旧：ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−７２２７として、また２０００年４月２４
日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦ
Ｏ １６４３０として寄託されている。後述の実施例２
で用いられたプラスミドｐＴＣＨＧＨ−Ｎａを保持する
形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、１
９９７年１２月１０日から独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（旧：ＮＩＢＨ）に寄託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８８８として、また１９９７年１
０月１６日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託
番号ＩＦＯ １６１２４として寄託されている。

【００１９】参考例１ ［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−
８４）産生組み換え大腸菌の調製 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨ（特
開平５−３０４９７６）より常法に従いプラスミドｐＥ
−Ｃ３５ＰＴＨを単離し、単離したプラスミドｐＥ−Ｃ
３５ＰＴＨをＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶで完全消化し、
［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）遺伝子、Ｔ７プロ
モーター及びＴ７ターミネーターを含むＤＮＡ断片を
得、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した。こ
のＤＮＡ断片を、ＳｃａＩで消化したｐＢＲ３２２にＴ
４ ＤＮＡリガーゼで接続し、テトラサイクリン耐性を
マーカーにもつ発現プラスミドｐＴＣＰＴＨ２を構築し
た（図１）。大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）にプラスミド
ｐＴＣＰＴＨ２を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）
／ｐＥ−Ｃ３５ＰＴＨを得た。

【００２０】実施例１ ［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−
８４）産生組み換え大腸菌の３Ｌジャーを用いた培養 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨ２を１０ｍ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）
１リットルで３０℃、１６時間振盪培養した。得られた
培養液を１．５Ｌの主発酵用培地（１．６８％リン酸一
水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素ナトリウム、
０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウ
ム、０．０２４％硫酸マグネシウム、０．０２％ニュー
ポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、
１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ３
Ｌ容ジャーに移植して、３７℃、通気量１．５Ｌ／ｍｉ
ｎ、攪拌回転数５００ｒｐｍで通気攪拌培養を開始し
た。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点
で、５．９５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧ
を添加した直後から、溶存酸素濃度が０．２５、０．
５、１．０及び２．０ｐｐｍになるように攪拌回転数を
制御して培養を行った。また、ＩＰＴＧ添加時に０．７
５％のグルコースを添加し、さらにＩＰＴＧ添加３０分
後から１時間当たり０．３％のグルコースを追加フィー
ドして、培養開始２４時間後まで培養を行った。ＩＰＴ
Ｇ添加後、経時的に培養液０．５ｍｌを抜き取り遠心分
離を行い、菌体を−２０℃に保存した。凍結保存してお
いた菌体に７Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭジチオスレイ
トール及び０．１％（Ｗ／Ｖ）トゥィーン２０を含む
０．１Ｍトリスヒドロキシアミノメタン緩衝液（ｐＨ
８．０）を０．５ｍｌを加え、十分に攪拌し、室温で３
分間超音波処理することにより菌体内容物の抽出を行っ
た後、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して抽出上清
液を得た。この上清液を０．１％（Ｖ／Ｖ）トリフルオ
ロ酢酸溶液で１０倍に希釈した後、１５０００ｒｐｍ、
１０分間遠心分離して得られた上清液０．１ｍｌをAsah
ipak C4P-50 4E（昭和電工社製）カラムクロマトグラ
フィーに供し、［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）及
びそのＭｅｔ付加体の定量を行った。カラムクロマトグ
ラフィーは溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、溶媒
Ｂ：８０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ
酢酸の濃度勾配による溶出により行った。図２に逆相Ｈ
ＰＬＣのチャートを示す。培養１４時間後の菌体抽出液
の［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）及びそのＭｅｔ
付加体の定量を行った結果を図３に示した。溶存酸素制
御値が低いほどＭｅｔの付加率は低下し、高い［Ｃｙｓ
³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）生産性が得られた。

【００２１】実施例２ ［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−
８４）産生組み換え大腸菌の５００Ｌ発酵槽を用いた培
養 大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＰＴＨ２を１０ｍ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）
１リットルで３０℃、１６時間振盪培養した。得られた
培養液を０．０２％ニューポールＬＢ−６２５及び５０
ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０ＬのＬＢ培地を仕
込んだ５０Ｌ容発酵槽に移植して、３７℃、８時間通気
攪拌培養を行った。この培養液を３６０Ｌの主発酵用培
地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン
酸二水素ナトリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．
０５％塩化ナトリウム、０．０２４％硫酸マグネシウ
ム、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００
５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミ
ノ酸）を仕込んだ５００Ｌ容発酵槽に移植して、３７
℃、通気量２６０Ｌ／ｍｉｎ、攪拌回転数１２０ｒｐｍ
で通気攪拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００
クレット単位（ＫＵ）になった時点で、５．９５ｍｇ／
Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧを添加した後に、攪
拌回転数を１２０及び１０５ｒｐｍに変更して培養を行
った。ＩＰＴＧ添加時に０．７５％のグルコースを添加
し、さらにＩＰＴＧ添加３０分後から１時間当たり０．
３％のグルコースをフィードして、培養開始２４時間後
まで培養を行った。ＩＰＴＧ添加後、経時的に培養液
０．５ｍｌを抜き取り遠心分離を行い、菌体を−２０℃
に保存した。凍結保存した菌体より、実施例１と同様の
方法で生産量及びＭｅｔ付加率を測定した（図４）。本
発明の培養法は、５００Ｌ容発酵槽を用いた培養におい
ても低いＭｅｔ付加率を示した。

【００２２】実施例３ ［Ｃｙｓ³⁵］−ＰＴＨ（１−８
４）からのＰＴＨ（１−３４）の調製 本発明の培養法を用いて培養を行った菌体より、［Ｃｙ
ｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）を単離し、３５位のシス
テイン残基をシアノ化した後、切断を行い、ヒトＰＴＨ
（１−３４）を取得した。ＩＰＴＧ添加後の回転数を１
０５ｒｐｍとし、実施例２に記載した培養方法で培養を
行なった。得られた菌体３ｋｇの内容物を６Ｍグアニジ
ン塩酸塩及び０．１ｍＭ ＡＰＭＳＦを加えた0.1M Tris
-HCl(pH8.0) １０Ｌで抽出した。８０００ｒｐｍで２
０分間遠心分離を行い、得られた上清を１ｍＭ ＤＴＴ
を含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で約
４０倍に希釈した。希釈液を１００００ｒｐｍで連続遠
心分離を行い、不溶物（沈殿）を除去した。得られた上
清液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で平
衡化したＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラム（３０ｃｍ×
６３ｃｍ、東ソー社）に添加し、０から１．０Ｍ Ｎａ
Ｃｌの直線濃度勾配で溶出した。この溶出液をペリコン
カセットシステム（分画分子量：１０００、ミリポア
社）を用いて、０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮・脱塩を
行った。濃縮脱塩液２．５Ｌに尿素を6Mになるように加
えた後、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム
塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）を２．２ｇ添加し、室温で１５分
間反応し、Ｓ−シアノ化を行った。Ｓ−シアノ化を行っ
た溶液を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）
で平衡化したＳＰ−トヨパール６５０Ｍカラム（３０ｃ
ｍ×６３ｃｍ、東ソー社）に添加し、０．１から１．０
ＭＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。この溶出液をペ
リコンカセットシステム（分画分子量：１０００、ミリ
ポア社）を用いて濃縮・脱塩を行い、濃縮脱塩液２Ｌに
尿素を6Mになるように加えた後、終濃度が０．０５Ｎに
なるように１Ｎ ＮａＯＨを添加し、氷冷下１０分間、
Ｓ−シアノ化したシステイン部分での切断反応を行った
後、ｐＨが５以下になるように酢酸を添加し反応を停止
した。この液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ
５）で平衡化したトヨパールＨＷ−５０Ｆカラム（３０
ｃｍ×６３ｃｍ、東ソー社）を用いたゲル濾過クロマト
グラフィーに供した。溶出液を２Ｍ尿素を含む２０ｍＭ
酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化したＳＰ−
トヨパール６５０Ｓカラム（２０ｃｍ×３２ｃｍ、東ソ
ー社）に吸着させ、２Ｍ尿素を含む２０ｍＭ酢酸アンモ
ニウム緩衝液（ｐＨ５）と２Ｍ尿素及び０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ８）の直
線濃度勾配により溶出を行った。溶出液を３５％飽和硫
安を含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で平
衡化したフェニル−５ＰＷカラム（１０．８ｃｍ×２０
ｃｍ、東ソー社）に添加し、平衡化緩衝液及び２０ｍＭ
酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）の直線濃度勾配により
溶出を行った。溶出液を０．１％トリフルオロ酢酸で平
衡化したＯＤＳ−１２０Ｔカラム（３０ｃｍ×７５ｃ
ｍ、東ソー社）に添加し、８０％アセトニトリルを含む
０．１％トリフルオロ酢酸の直線濃度勾配により溶出を
行った。溶出液を２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ５）で１０倍に希釈した後、２０ｍＭ酢酸アンモニウ
ム緩衝液（ｐＨ５）で平衡化したＣＭ−トヨパール６５
０Ｍカラム（４ｃｍ×５０ｃｍ、東ソー社）に吸着さ
せ、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５）と１Ｍ
塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）の直線濃度勾配により溶出を行った。この溶出液を
蒸留水で平衡化したセファデックスＧ−１０カラム（１
４ｃｍ×６５ｃｍ、アマシャム ファルマシア・バイオ
テク社）に添加し、蒸留水で溶出を行い、ＰＴＨ（１−
３４）５．８８ｇを得た。ＰＴＨ（１−３４）を４％チ
オグリコール酸を含む６Ｎ塩酸で１１０℃、２４及び４
８時間気相加水分解し、アミノ酸分析計（日立Ｌ−８５
００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いてアミノ酸組成を
決定した。（表１、表中、Ｓｅｒ、Ｔｈｒは０ｈｒに外
挿した値を、その他のアミノ酸は２４、４８ｈｒ平均値
を示す。）Ｎ末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシ
ーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７
７Ａ）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡ塩基配列
から予想されるアミノ酸配列と一致し、Ｎ末端のメチオ
ニンの付加はみられなかった。（表２）

【００２３】

【表１】

【００２４】

【表２】

【００２５】参考例２ 至適化配列探索用プラスミドの
構築 １）プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｃの構築 ｐＧＦＰｕｖ（クロンテック社）のＧＦＰｕｖ構造遺伝
子内に存在するＮｄｅＩ切断部位を消失させるためにプ
ライマー１：CGTTATCCGGATCACATGAAACGGCATG（配列番
号：１）及びプライマー２：CATGCCGTTTCATGTGATCCGGAT
AACG（配列番号：２）を用いて部位特異的変異導入（Qu
ickChange^TM Site Directed MutagenesisKit, STRATAGE
NE社製）により７７番目のヒスチジンのコドンをＣＡＴ
からＣＡＣに置換し、プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｃを得
た。 ２）プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｄの構築 プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｃをＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒
造）及びＫｐｎＩ（宝酒造）で切断し、アガロース電気
泳動により約３．３ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよ
りQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてＤ
ＮＡを回収した。合成ＤＮＡ１：AGCTTCATATGTTCGAAGTA
CTAGATCTGGTAC（配列番号：３）及び合成ＤＮＡ２：CAG
ATCTAGTACTTCGAACATATGA（配列番号：４）各１００ｐｍ
ｏｌをＴＥ緩衝液に溶解し、９０℃で１０分間保持した
後に室温まで徐冷しアニーリングを行った。このアニー
リングを行ったＤＮＡ断片をｐＧＦＰｕｖｑｃのＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ部分にLigation kit ver.2（宝酒
造）を用いて挿入し、プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｄを得
た。 ３）プラスミドｐＧＦＰＮＰの構築 ＷＯ００／２０４３９の参考例１に記載のｐＴＣＨＧＨ
−ＮａのＴ７プロモーターを合成プロモーターＮＰ２に
置換したプラスミドｐＮＰＨＧＨを以下のように構築し
た。プラスミドｐＴＣＨＧＨ−ＮａをＥｃｏＲＩ（宝酒
造）及びＸｂａＩ（宝酒造）で切断し、アガロース電気
泳動により約４．６ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよ
りQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いてＤ
ＮＡを回収した。合成プロモーターＮＰ２を含む合成Ｄ
ＮＡ３：AATTCTATAAAAATAATTGTTGACATATTTTATAAATTTTGG
CATAATAGATCTAATTGTGAGCGGATAACAATTCTGCAGAAGCTTGAGCT
CGGTACCCGGGGATCCT（配列番号：５）及びその相補塩基
配列を含む合成ＤＮＡ４：CTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTC
AAGCTTCTGCAGAATTGTTATCCGCTCACAATTAGATCTATTATGCCAAA
ATTTATAAAATATGTCAACAATTATTTTTATAG（配列番号：６）
を各１００ｐｍｏｌをＴＥ緩衝液に溶解し、９０℃で１
０分間保持した後に室温まで徐冷しアニーリングを行っ
た。この二本鎖ＤＮＡ断片をｐＴＣＨＧＨ−ＮａのＥｃ
ｏＲＩ−ＸｂａＩ部分にLigation kit ver.2（宝酒造）
を用いて挿入し、プラスミドｐＮＰＨＧＨを得た。プラ
スミドｐＮＰＨＧＨをＢａｍＨＩ（宝酒造）で切断し、
DNA Blunting Kit（宝酒造）を用いて末端部分を平滑化
した。次にＮｄｅＩで切断した後、アガロース電気泳動
により約４．６ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよりQI
Aquick GelExtraction Kit（QIAGEN）を用いてＤＮＡを
回収した。プラスミドｐＧＦＰｕｖｑｄをＮｄｅＩ及び
ＳｔｕＩで切断し、アガロース電気泳動により約０．８
ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよりQIAquick Gel Ext
raction Kit（QIAGEN）を用いてＧＦＰｕｖの構造遺伝
子を含むＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＮＰＨ
ＧＨのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ（平滑化）部分にLigation
kit ver.2（宝酒造）を用いて挿入し、Ｎ末端至適化配
列選択用プラスミドｐＧＦＰＮＰを得た（図５）。プラ
スミドｐＧＦＰＮＰはＮＰ２プロモーターにより転写さ
れるＧＦＰｕｖ構造遺伝子を含み、ＧＦＰｕｖ構造遺伝
子の上流にＮｄｅＩ、ＳｃａＩ及びＡｇｅＩ切断部位を
有する発現プラスミドであり、これらの制限酵素部位を
利用してＤＮＡ断片を挿入することが出来る。プラスミ
ドｐＧＦＰＮＰを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換
し、大腸菌ＪＭ１０９／ｐＧＦＰＮＰを得た。

【００２６】参考例３ ラットＧＡＬＰ発現用至適化配
列の探索 ｐＧＦＰＮＰをＮｄｅＩ（宝酒造）及びＳｃａＩ（宝酒
造）で切断し、アガロース電気泳動により約４．９ｋｂ
ｐのバンドを切り出し、ゲルよりQIAquick GelExtracti
on Kit（QIAGEN）を用いてＤＮＡを回収した。ラットＧ
ＡＬＰ（ラット・ガラニンレセプターに対するラット型
リガンドペプチド（１−６０）；ＷＯ９９／４８９２
０）のＮ末端部アミノ酸をコードするランダム塩基配列
は以下のように調製を行った。混合塩基を含む合成ＤＮ
Ａ５：AGGTAACCAGCACTATTTAAAGTCCANCCNCCNCGNCCNCGRTG
NGCNGGNGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG（配列番号：７）
及び合成ＤＮＡ６：AGGTAACCAGCACTATTTAAAGTCCANCCNCC
YCTNCCYCTRTGNGCNGGNGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG（配
列番号：８）を鋳型として、プライマー３：CTTTAAGAAG
GAGATATACATATG（配列番号：９）をプライマーとして用
いてPfu DNA polymerase （STRATAGENE）により二本鎖
ＤＮＡを調製した。該伸長反応液はPfu DNA polymerase
を5μL、添付の10ｘReaction buffer 及びdNTP mixtur
e（宝酒造）を各5μL、合成ＤＮＡ３（42.2 μmol/
L）、合成ＤＮＡ４（5 μmol/L）及びプライマー３（10
0 μmol/L）を各１μL、蒸留水を32μL加えて調製し
た。該伸長反応は94℃・30秒間−58℃・30秒間−70℃20
分間により行った。伸長反応後の反応液をマイクロコン
３０（日本ミリポア社）を用いて濃縮及び脱塩を行なっ
た後に、ＮｄｅＩ（宝酒造）により二本鎖ＤＮＡの切断
を行った。ＮｄｅＩによる二本鎖ＤＮＡの切断は以下の
ように行った。濃縮・脱塩後の反応液10μL、Buffer H
（宝酒造） 2μL、蒸留水7μL及びＮｄｅＩ １μLから
なる反応液を３７℃で３時間保持し切断反応を行った。
このＮｄｅＩ切断後の反応液からQIAquick Gel Extract
ion Kit （QIAGEN）を用いてＤＮＡ断片を精製した。こ
のＤＮＡ断片をｐＧＦＰＮＰのＮｄｅＩ−ＳｃａＩ部分
にLigation kit ver.2（宝酒造）を用いて挿入し、ＧＦ
ＰｕｖのＮ末端部分にラットＧＡＬＰのＮ末端部分アミ
ノ酸をコードするランダム塩基配列を有する発現プラス
ミドｐＧＦＰＮＰＲＧを構築した。（図６） この発現プラスミドｐＧＦＰＮＰＲＧを用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９株を形質転換し、１０ｍｇ／ｍｌのテトラサイ
クリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養
しコロニーを形成させた。形成したコロニーを３５４ｎ
ｍのＵＶランプ下で観察し、強い蛍光を発するコロニ
ー：２株、弱い蛍光を示すコロニー：１６株を選択し
た。このコロニーをプライマー４：TTCATACACGGTGCCTGA
CTGCGTTAG（配列番号：１０）及びプライマー５：TCAAC
AAGAATTGGGACAACTCC（配列番号：１１）を用いてコロニ
ーＰＣＲを行い、アガロース電気泳動により目的のＤＮ
Ａ断片の挿入を確認した。またコロニーＰＣＲの産物を
QIAquick PCR PurificationKit （QIAGEN）を用いて精
製し、プライマー４及びプライマー５を用いて塩基配列
分析を行った結果、表３に示す塩基配列が得られた。こ
れらのうちＮｏ．１及びＮｏ．２の塩基配列は強い蛍光
を示す大腸菌クローンから得られたものである。

【００２７】

【表３】 （Ｎ末端Ｍｅｔを残基番号：０とした）

【００２８】参考例４ 天然型塩基配列ラットＧＡＬＰ
発現株の構築 ラットＧＡＬＰ発現プラスミドは以下のように、Ｔ７プ
ロモータ−によりラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白
（ラットＧＡＬＰとヒトｂＦＧＦムテインＣＳ２３（Ｅ
Ｐ０２８１８２２）との融合蛋白）として発現が行われ
るプラスミドｐＴＦＣＲＧＡＬを構築した（図７）。Ｗ
Ｏ９９／４８９２０の実施例２１に記載のプラスミドｐ
ＴＦＣをＮｄｅＩ及びＡｖａＩで切断し、アガロース電
気泳動により約３．９ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲル
よりQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて
ＤＮＡを回収した。ラットＧＡＬＰ構造遺伝子をクロー
ニングしたプラスミドｐＧＲ２ＲＬ４（ＷＯ９９／４８
９２０の実施例１８）よりラットＧＡＬＰ構造遺伝子の
上流に開始コドンＡＴＧ及びＮｄｅＩ認識部位を有する
プライマー６：AGCATATGGCACCTGCTCACAGG（配列番号：
１２）及びＧＡＬＰ構造遺伝子の下流にシステインをコ
ードするＴＧＣ及びＡｖａＩ認識部位を有するプライマ
ー７：CCCTCGGGGCAGGTCATCCTTGGAGAG（配列番号：１
３）を用いてＰＣＲ反応によりラットＧＡＬＰ構造遺伝
子を含む断片を増幅した。この断片をTOPO TA Cloning
Kit を用いてクローニングを行いプラスミドpCR2.1TOPO
/rGALを取得した。プラスミドpCR2.1TOPO/rGALをＮｄｅ
Ｉ及びＡｖａＩで切断し、アガロース電気泳動により約
０．２ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよりQIAquick G
el Extraction Kit（QIAGEN）を用いてＤＮＡを回収し
た。このＤＮＡ断片をｐＴＦＣのＮｄｅＩ−ＡｖａＩ部
分にLigation kit ver.2（宝酒造）を用いてライゲーシ
ョンを行ない、プラスミドｐＴＦＣＲＧＡＬを得た。発
現プラスミドｐＴＦＣＲＧＡＬを用いて大腸菌ＭＭ２９
４（ＤＥ３）の形質転換を行い、ラットＧＡＬＰ−ＣＳ
２３融合蛋白発現能を有する大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＦＣＲＧＡＬを得た。

【００２９】参考例５ ラットＧＡＬＰ発現用至適化配
列を用いた発現 ｐＴＦＣＲＧＡＬのラットＧＡＬＰ構造遺伝子のＮ末端
部分の塩基配列を天然型塩基配列から参考例３で強い蛍
光を発するコロニーから得られた塩基配列への置換は以
下のように行った。（図８） 天然型塩基配列をコードするラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３
発現プラスミドｐＴＦＣＲＧＡＬをＸｂａＩ及びＥｃｏ
Ｏ６５Ｉで切断し、アガロース電気泳動により約４．５
ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲルよりQIAquick Gel Ext
raction Kit（QIAGEN）を用いてＤＮＡを回収した。参
考例３で得られたコロニーＮｏ．１の株を１０ｍｇ／Ｌ
のテトラサイクリンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃で
一晩培養し、得られた菌体よりQIAprep8 Miniprep Kit
（QIAGEN）を用いてプラスミドｐＧＦＰＮＰ／ｒＧＡＬ
１を精製した。このプラスミドｐＧＦＰＮＰ／ｒＧＡＬ
１をＸｂａＩ及びＥｃｏＯ６５Ｉで切断し、アガロース
電気泳動により約０．１ｋｂｐのバンドを切り出し、ゲ
ルよりQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用い
てＤＮＡを回収した。このＤＮＡ断片をｐＴＦＣＲＧＡ
ＬのＸｂａＩ−ＥｃｏＯ６５Ｉ部分にLigation kit ve
r.2（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、参考
例３で選択したNo.1のクローンから得られた塩基配列を
ラットＧＡＬＰのＮ末端部分に有するラットＧＡＬＰ−
ＣＳ２３融合蛋白の発現プラスミドｐＴＦＣＳ４を得
た。発現プラスミドｐＴＦＣＳ４を用いて大腸菌ＭＭ２
９４（ＤＥ３）の形質転換を行い、ラットＧＡＬＰ−Ｃ
Ｓ２３融合蛋白発現能を有する大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＴＦＣＳ４を得た。

【００３０】実施例４ ラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合
蛋白産生組み換え大腸菌の３Ｌジャーを用いた培養 上記の大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＦＣＳ４を１
０ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％
ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウ
ム）１リットルで３０℃、１６時間振盪培養した。得ら
れた培養液を１．５Ｌの主発酵用培地（１．６８％リン
酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素ナトリウ
ム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリ
ウム、０．０２４％硫酸マグネシウム、０．０２％ニュ
ーポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、
１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ3L
容ジャーに移植して、３７℃、通気量１．５Ｌ／ｍｉ
ｎ、攪拌回転数５００ｒｐｍで通気攪拌培養を開始し
た。培養開始後、溶存酸素濃度が２．０ｐｐｍ以下にな
った時点で、溶存酸素濃度が２．０ｐｐｍになるように
撹拌回転数を制御して培養を継続した。培養液の濁度が
約２４００クレット単位になった時点で、５．９５ｍｇ
／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド（ＩＰＴＧ）を添加した。ＩＰＴＧを添加した直後か
ら、１基は２．０ｐｐｍの溶存酸素濃度制御のまま培養
を継続し、別の１基は撹拌回転数を５５０ｒｐｍに固定
して培養液中の溶存酸素濃度を低く保った条件下で培養
を継続した。また、ＩＰＴＧ添加時に０．７５％のグル
コースを添加し、さらにＩＰＴＧ添加３０分後から１時
間当たり０．３％のグルコースをフィードして、培養開
始２４時間後まで培養を行った。ＩＰＴＧ添加後、経時
的に培養液０．５ｍｌを抜き取り遠心分離を行い、菌体
を−２０℃に保存した。凍結保存しておいた菌体を融解
した後、０．１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む20
mmol/L Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌに懸濁
し、その50μLをサンプルバッファー（125mM Tris-HC
l、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１５％グリセロー
ル、５％ 2−メルカプトエタノール、０．００５％ブ
ロムフェノールブルー）と混合し、マルチゲル15/25
（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルを
ラピッド CBB KANTO（関東化学社）で染色を行った。
その結果を図１０に示す。両培養条件において発現量に
大きな差は見られなかった。

【００３１】実施例５ 実施例４で発現を行ったラット
ＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白のＮ末端アミノ酸分析 実施例４で凍結保存しておいた菌体を融解した後、０．
１５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む20 mmol/L Tris
-HCl緩衝液（ｐＨ７）０．５ｍｌに懸濁し、超音波破砕
機（オリンパス社製）により菌体の超音波破砕を行い、
１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、封入体とし
て発現したラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白を得た。
この封入体をサンプルバッファー（125mM Tris-HCl、１
％ドデシル硫酸ナトリウム、１５％グリセロール、５％
2-メルカプトエタノール、０．００５％ブロムフェノ
ールブルー）に溶解した後、マルチゲル15/25（第一化
学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルより蛋白を
ＰＶＤＦ膜へ転写した後、ラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融
合蛋白に相当するバンドを切り取り、Ｎ末端アミノ酸を
気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステ
ムズ モデル４７２）を用いて決定し、Ｍｅｔ体及びＤ
ｅｓ−Ｍｅｔ体の割合を算出した。図１１に培養１７及
び２０時間後の測定結果を示す。溶存酸素濃度を２．０
ｐｐｍに制御して培養を行った場合には、約７０％にＭ
ｅｔの付加が見られたのに対し、ＩＰＴＧ添加後の撹拌
回転数を５５０ｒｐｍに固定して培養を行ったもので
は、約３０％までＭｅｔの付加が低下し、本培養法によ
るＮ末端Ｍｅｔの除去効果が見られた。

【００３２】

【発明の効果】本発明によりＮ末端のメチオニンが除去
された組換え蛋白質を高効率に発現することができる。

【００３３】

【配列表】 [SEQUENCE LISTING] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Method of Culture for Recombinant Escherichia coli. <130> P2001-184 <150> JP 2000-232389 <151> 2000-7-31 <160> 18 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 cgttatccgg atcacatgaa acggcatg 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 catgccgttt catgtgatcc ggataacg 28 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 agcttcatat gttcgaagta ctagatctgg tac 33 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 cagatctagt acttcgaaca tatga 25 <210> 5 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 aattctataa aaataattgt tgacatattt tataaatttt ggcataatag atctaattgt 60 gagcggataa caattctgca gaagcttgag ctcggtaccc ggggatcct 109 <210> 6 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 ctagaggatc cccgggtacc gagctcaagc ttctgcagaa ttgttatccg ctcacaatta 60 gatctattat gccaaaattt ataaaatatg tcaacaatta tttttatag 109 <210> 7 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 aggtaaccag cactatttaa agtccanccn ccncgnccnc grtgngcngg ngccatatgt 60 atatctcctt cttaaag 77 <210> 8 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 aggtaaccag cactatttaa agtccanccn ccyctnccyc trtgngcngg ngccatatgt 60 atatctcctt cttaaag 77 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 ctttaagaag gagatataca tatg 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 ttcatacacg gtgcctgact gcgttag 27 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 tcaacaagaa ttgggacaac tcc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 agcatatggc acctgctcac agg 23 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 ccctcggggc aggtcatcct tggagag 27 <210> 14 <211> 84 <212> PRT <213> Human <400> 14 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe Cys Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Pro Gly Ser 35 40 45 Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Lys Ser Gln 84 <210> 15 <211> 258 <212> DNA <213> Human <400> 15 atgtctgtgt ccgagattca gttaatgcat aaccttggca aacatttgaa ctcgatggag 60 cgtgtagaat ggctgcgtaa gaagttgcag gatgtgcaca atttttgcgc cttaggtgcc 120 ccattggctc ctcgtgatcc tggttcccaa agaccacgta aaaaggaaga caatgtctta 180 gttgagagcc atgaaaaatc cctaggcgag gcagacaagg ccgatgtgaa tgtattaact 240 aaagctaaat cccagtaa 258 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Human <400> 16 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe 34 <210> 17 <211> 204 <212> PRT <213> Rat <400> 17 Ala Pro Ala His Arg Gly Arg Gly Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Gly Pro Val Leu His Leu Ser Ser Lys Ala Asn Gln Gly 20 25 30 Arg Lys Thr Asp Ser Ala Leu Glu Ile Leu Asp Leu Trp Lys Ala Ile 35 40 45 Asp Gly Leu Pro Tyr Ser Arg Ser Pro Arg Met Thr Cys Pro Glu Asp 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg 65 70 75 80 Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly 85 90 95 Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln 100 105 110 Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala 115 120 125 Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys 130 135 140 Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu 165 170 175 Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln 180 185 190 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 195 200 204 <210> 18 <211> 612 <212> DNA <213> Rat <400> 18 gcaccagcgc atcgtgggcg tggtggttgg actttaaata gtgctggtta cctcctgggt 60 cctgtcctcc acctttcctc aaaggccaac cagggcagga agacagactc agctcttgag 120 atcctagacc tgtggaaggc catagatggg ctcccttatt cccgctctcc aaggatgacc 180 tgccccgagg atggcggcag cggcgccttc ccgcccggcc acttcaagga ccccaagcgg 240 ctgtactgca aaaacggggg cttcttcctg cgcatccacc ccgacggccg agttgacggg 300 gtccgggaga agagcgaccc tcacatcaag ctacaacttc aagcagaaga gagaggagtt 360 gtgtctatca aaggagtgag cgctaatcgt tacctggcta tgaaggaaga tggaagatta 420 ctagcttcta agtctgttac ggatgagtgt ttcttttttg aacgattgga atctaataac 480 tacaatactt accggtcaag gaaatacacc agttggtatg tggcactgaa acgaactggg 540 cagtataaac ttggatccaa aacaggacct gggcagaaag ctatactttt tcttccaatg 600 tctgctaaga gc 612

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＴＣＰＴＨ２の構築図である。

【図２】実施例１で得られた逆相クロマトグラムであ
る。Ｄｅｓ−Ｍｅｔ体は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−
８４）のピークを、Ｍｅｔ体は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ
（１−８４）のＭｅｔ付加体のピークを示す。

【図３】実施例１の培養２４時間後の［Ｃｙｓ³⁵］ヒト
ＰＴＨ（１−８４）及びそのＭｅｔ付加体の生産量を示
す。□は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）の、黒四
角は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）のＭｅｔ付加
体の生産量を示す。

【図４】実施例２の培養経過を示す。グラフ（上）にお
いて、−は溶存酸素濃度を、…は攪拌回転数を示す。グ
ラフ（下）において、○は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１
−８４）の、●は［Ｃｙｓ³⁵］ヒトＰＴＨ（１−８４）
のＭｅｔ付加体の生産量を示し、□は培養液の濁度（ク
レット単位（ＫＵ））を示す。

【図５】プラスミドｐＧＦＰＮＰの構築図を示す。

【図６】プラスミドｐＧＦＰＮＰＲＧの構築図を示す。

【図７】プラスミドｐＴＦＣＲＧＡＬの構築図を示す。

【図８】プラスミドｐＴＦＣＳ４の構築図を示す。

【図９】実施例４の培養経過を示す。グラフ（上）にお
いて、○は２．０ｐｐｍの溶存酸素濃度制御のまま培養
を継続した場合の攪拌回転数を、●は撹拌回転数を５５
０ｒｐｍに固定して培養を継続した場合の攪拌回転数を
示す。グラフ（下）において、○は２．０ｐｐｍの溶存
酸素濃度制御のまま培養を継続した場合の溶存酸素濃度
を、●は撹拌回転数を５５０ｒｐｍに固定して培養を継
続した場合の溶存酸素濃度を示す。

【図１０】実施例４で行われた、各培養経過時の培養液
の電気泳動像を示す。「２．０ｐｐｍ制御」は２．０ｐ
ｐｍの溶存酸素濃度制御のまま培養を継続した場合の培
養液を、「攪拌５５０ｒｐｍ」は撹拌回転数を５５０ｒ
ｐｍに固定して培養を継続した場合の培養液を示し、
「７」、「１０」、「１４」、「１７」、「２０」は培
養開始後の経過時間（ｈｒ）を示す。

【図１１】実施例４の培養１７及び２４時間後のラット
ＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白及びそのＭｅｔ付加体の割
合を示す。□はラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白の、
黒四角はラットＧＡＬＰ−ＣＳ２３融合蛋白のＭｅｔ付
加体の生産割合（％）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 BA01 BA80 CA02 CA07 CA20 DA06 EA04 FA01 FA10 GA11 GA19 HA03 4B064 AG01 AG15 CA02 CA19 CC03 CC06 CC09 CC10 CC12 CC15 CC24 CD09 CE03 CE06 CE08 CE10 DA01 DA13

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子組換え蛋白質発現のための発現ベ
   クターにより形質転換された宿主の培養において、培養
   液中の溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御することを
   特徴とする、Ｎ末端にメチオニンの付加していない組換
   え蛋白質の製造方法。
2. 【請求項２】 培養液中の溶存酸素濃度が、約０．０１
   〜１．０ｐｐｍである請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 培養液中の溶存酸素濃度が、０．０５〜
   １．０ｐｐｍである請求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】 培養液の攪拌回転数を調節することによ
   り溶存酸素濃度を約１ｐｐｍ以下に制御することを特徴
   とする請求項１記載の製造方法。
5. 【請求項５】 宿主がエシェリヒア属菌である請求項１
   記載の製造方法。
6. 【請求項６】 培養液に、さらに発現誘導物質を添加す
   ることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
7. 【請求項７】 発現誘導物質がイソプロピル−β−Ｄ−
   チオガラクトピラノシドである請求項６記載の製造方
   法。
8. 【請求項８】 発現誘導物質の培養液中の濃度が、約
   ０．０１〜１ｍＭである請求項６記載の製造方法。