JP2002228663A - 蛍光免疫測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】標識蛍光物質の吸収最大値波長と蛍光最大値波
長とが近接している場合であっても、その吸収最大値波
長近傍の励起光を用いて効率的に励起発光させると共
に、放射された蛍光を効率的に集光検出することができ
る、新規な構成の蛍光免疫測定装置を提供する。 【構成】標識蛍光物質を励起することができる励起光を
出射するレーザ光源１と、レーザ光源から出射した励起
光を全反射させながら伝搬させ、これによって生ずるエ
バネッセント波により、その表面に抗原抗体反応によっ
て固定された標識抗体上の標識蛍光物質を励起して蛍光
発光させると共に、標識蛍光物質からの蛍光放射を全反
射させながら逆行して伝搬させる光導波管４と、光導波
路から出射された蛍光を受光してその強度を測定する検
出器７と、光導波路と検出器との間に設けられ、光導波
路を逆行した蛍光を実質的に透過させるが励起光を実質
的にカットするリジェクションフィルタ９と、を有して
なる蛍光免疫測定装置である。好ましくは、さらに、リ
ジェクションフィルタの入射光に対する角度を可変にす
る手段１０を備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応によ
って生成される免疫化学的複合体の標識抗体上の標識蛍
光物質を励起光で励起させ、これによって標識蛍光物質
から放射される蛍光強度を測定する蛍光免疫測定装置に
関する。

【０００２】

【従来の技術】このような蛍光免疫測定装置は、特公平
５−２１１８５号公報や特公平６−２７７４１号公報に
おいて既に公知である。これら公報記載の装置において
は、レーザ光源から出射された励起光を伝搬すると共
に、これによって励起された標識蛍光物質からの蛍光放
射を逆行して伝搬する光導波路として、主として光ファ
イバが用いられている。

【０００３】また、特公平８−３４６４号記載の装置も
同様の原理に基づくものであり、この装置における光導
波路としては平板状のスラブ型導波路が記載されてい
る。

【０００４】ところで、この種の蛍光免疫測定装置にお
いて、標識蛍光物質から放射された蛍光強度を正確に測
定するためには、標識蛍光物質の吸収最大値の波長で励
起し、蛍光最大値の波長で検出することが望ましい。

【０００５】このため、従来の装置においては一般にダ
イクロイックフィルタまたはダイクロイックミラーが用
いられている。これらは、励起波長より短い波長は透過
せず、それより長い波長の蛍光はできるだけ透過する性
質を有している。

【０００６】図６はダイクロイックフィルタを用いた装
置構成例であり、レーザ光源１からの励起光を集光レン
ズ２で集光した後、所定角度に設定された反射ミラー３
で反射させて光導波路４に全反射させながら伝搬する。
これによって生ずるエバネッセント波により、光導波路
４の表面に抗原抗体反応によって固定された標識抗体上
の標識蛍光物質（図示せず）が励起され、蛍光を発す
る。標識蛍光物質からの蛍光は光導波路４を逆行して伝
搬され、ダイクロイックフィルタ５を透過し、集光レン
ズ６で集光された後、検出器７で受光されて蛍光強度測
定を行う。

【０００７】標識蛍光物質として代表的なＣｙ５（amer
sham pharmacia bitech）を用いた場合、図２に示すよ
うに、その吸収最大値波長は６５０ｎｍであり、蛍光最
大値波長は６７０ｎｍである。したがって、レーザ光源
１からの励起光の波長を６５０ｎｍ近傍とし、ダイクロ
イックフィルタ５として、６５０ｎｍ近傍およびそれよ
りも短い波長光をカットし且つ６７０ｎｍ近傍およびそ
れよりも長い波長光（蛍光）を透過するものを用いるこ
とができれば、検出器で受光する受光成分からノイズを
除去し、高精度の蛍光測定が可能となる。

【０００８】図７はダイクロイックミラーを用いた装置
構成例であり、図６とほぼ同様の構成において、反射ミ
ラー３およびダイクロイックフィルタ５の機能を兼ね備
えるものとしてダイクロイックミラー８を用いたもので
ある。この装置構成例においても、標識蛍光物質として
Ｃｙ５を用いた場合、レーザ光源１からの励起光の波長
を６５０ｎｍ近傍とし、ダイクロイックミラー８とし
て、６５０ｎｍ近傍およびそれよりも短い波長光をカッ
トし且つ６７０ｎｍ近傍およびそれよりも長い波長光
（蛍光）を透過するものを用いれば、レーザ光源１から
の励起光を光導波路４に反射させることができ、且つ、
標識蛍光物質からの蛍光はダイクロイックミラー８を透
過して検出器７に受光させることができるので、ノイズ
のない高精度の蛍光測定が可能となる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ダイク
ロイックフィルタまたはダイクロイックミラーの透過率
曲線は図３に示すようになだらかに変化するため、励起
光を効率的にカットしながら蛍光を効率的に透過させる
という本来の機能を達成することが困難である。

【００１０】特にＣｙ５のように吸収最大値波長と蛍光
最大値波長とが近接している標識蛍光物質を用いる場合
は、励起光を標識蛍光物質の吸収最大値波長近傍に設定
してこれをダイクロイックフィルタ等でカットしようと
すると、蛍光最大値波長までもが相当量カットされてし
まい、検出器７において十分な検出感度を得ることがで
きない。

【００１１】このような事情から、特開平５−２０３５
７４号公報では、吸収最大値波長が６５０ｎｍ、蛍光最
大値波長が６７０ｎｍであるＣｙ５を標識蛍光物質とし
て用いることを前提とした蛍光測定装置において、蛍光
測定が励起光の迷光によって妨害されることを防止する
ために、励起光を吸収最大値波長よりも短波長側である
６３５ｎｍに設定しているが、標識蛍光物質の吸収最大
値波長から外れるため、蛍光発光が不十分となり、測定
精度を損なうものであった。

【００１２】また、Ｃｙ３，５を標識蛍光物質として用
いることもあり、これは吸収最大値波長と蛍光最大値波
長がそれぞれ５８１ｎｍ、５９６ｎｍであってその間隔
が１５ｎｍと非常に近接している。上記従来技術は、ダ
イクロイックフィルタ等を用いる場合は蛍光最大値波長
から３５ｎｍ程度離して励起光の波長を設定しないとノ
イズが大きくなってしまうことを意味しており、これに
よると、Ｃｙ３，５を用いた場合にはさらにそれらの吸
収最大値波長から離れた波長で励起させなければならな
いことになり、測定精度を大きく損なうことになる。

【００１３】

【課題を解決するための手段】そこで本発明は、従来技
術における上記問題を解決し、標識蛍光物質の吸収最大
値波長と蛍光最大値波長とが近接している場合であって
も、その吸収最大値波長近傍の励起光を用いて効率的に
励起発光させると共に、放射された蛍光を効率的に集光
検出することができる、新規な構成の蛍光免疫測定装置
を提供することを目的とする。

【００１４】この目的を達成するため、請求項１にかか
る本発明は、抗原抗体反応によって生成される免疫化学
的複合体の標識抗体上の標識蛍光物質を励起光で励起さ
せ、これによって標識蛍光物質から放射される蛍光強度
を測定する蛍光免疫測定装置であって、標識蛍光物質を
励起することができる励起光を出射するレーザ光源と、
レーザ光源から出射した励起光を全反射させながら伝搬
させ、これによって生ずるエバネッセント波により、そ
の表面に抗原抗体反応によって固定された標識抗体上の
標識蛍光物質を励起して蛍光発光させると共に、標識蛍
光物質からの蛍光放射を全反射させながら逆行して伝搬
させる光導波路と、光導波路から出射された蛍光を受光
してその強度を測定する検出手段と、光導波路と検出手
段との間に設けられ、光導波路を逆行した蛍光を実質的
に透過させるが励起光を実質的にカットするリジェクシ
ョンフィルタと、を有してなることを特徴としている。

【００１５】請求項２は、請求項１記載の蛍光免疫測定
装置において、リジェクションフィルタがホログラフィ
ックフィルタよりなることを特徴としている。

【００１６】請求項３は、請求項１記載の蛍光免疫測定
装置において、リジェクションフィルタが多層膜誘電体
フィルタよりなることを特徴としている。

【００１７】請求項４は、請求項１ないし３のいずれか
記載の蛍光免疫測定装置において、さらに、リジェクシ
ョンフィルタの入射光に対する角度を可変にする手段を
備えることを特徴としている。

【００１８】

【発明の実施の形態】図１は本発明の一実施形態による
蛍光免疫測定装置の構成を示すものであり、従来技術で
ある図６および図７と実質的に共通する構成要素には同
一の名称と同一の符号が与えられている。

【００１９】レーザ光源１からの励起光を集光レンズ２
で集光した後、所定角度に設定された反射ミラー３で反
射させて光導波路４に全反射させながら伝搬する。これ
によって生ずるエバネッセント波により、光導波路４の
表面に抗原抗体反応によって固定された標識抗体上の標
識蛍光物質（図示せず）が励起され、蛍光を発する。標
識蛍光物質からの蛍光は光導波路４を逆行して伝搬さ
れ、リジェクションフィルタ９を透過し、集光レンズ６
で集光された後、検出器７で受光されて蛍光強度測定を
行う。

【００２０】図１の装置では光導波路として光導波管４
が用いられているが、これに限定されるものではなく、
光ファイバや平板状のスラブ型導波路を用いることも可
能である。

【００２１】リジェクションフィルタ９の分光透過率特
性を、前述のダイクロイックフィルタと比較して、図３
に示す。この図より明らかなように、ダイクロイックフ
ィルタが非常になだらかな透過率曲線を持つのに対し、
リジェクションフィルタは所定波長Ａより短い波長光を
ほとんど透過せず、所定波長Ｂ（Ｂ＞Ａ）より長い波長
光を７０％またはそれ以上透過し、しかもこれら波長
Ａ，Ｂの間隔が非常に小さい（１５ｎｍ以下）という特
性を有している。

【００２２】したがって、標識蛍光物質としてＣｙ５を
用いて、その励起最大値波長である６５０ｎｍを励起光
とした場合であっても、この波長の透過強度を１０万分
の１（ＯＤ５：透過率０．００１％）に減ずることがで
きるため、検出器７にはノイズが除去された蛍光のみが
入光することとなる。また、上記のようにリジェクショ
ンフィルタ９は１５ｎｍ程度しか離れていない波長光で
あってもこれを実質的に全透過させることができる特性
を有するため、６７０ｎｍでピークとなるＣｙ５の蛍光
がそのままリジェクションフィルタ９を透過して検出器
７で受光される。これらにより、ダイクロイックフィル
タ等を用いた従来技術に比較して１０倍以上の検出感度
向上が得られ、効率的且つ高精度の蛍光測定を行うこと
ができる。

【００２３】図１に示すように、リジェクションフィル
タ９の蛍光入射光に対する角度を可変にする手段１０を
設けることが好ましい。この角度調整手段１０を介して
リジェクションフィルタ９の角度を変えると、その分光
透過特性が波長軸に沿って短波長側にシフトするため、
使用する標識蛍光物質に最も適した励起光波長と蛍光波
長とを選択することが可能となる。

【００２４】図４には、リジェクションフィルタ９とし
てホログラフィックフィルタを用いた場合に、上記角度
調整手段１０を介してホログラフィックフィルタの角度
を変えたときの分光透過曲線の変化状態が示されてい
る。

【００２５】ホログラフィックフィルタは、従来はレー
ザーラマン分光装置などで強いレーリー散乱光（励起光
と同じ波長を持つ）を除去する目的で使用されているも
のであって、たとえば"Holographic Notch and Supe
rnotch Filter"（KAISER OPTICAL SYSTEMS INC.）
がある。

【００２６】ホログラフィックフィルタは、所定波長領
域Ａ１〜Ａ２の光をほとんど透過せず、所定波長Ｂ１
（Ｂ１＜Ａ１）より短い波長光および所定波長Ｂ２（Ａ
２＜Ｂ２）より長い波長光を７０％またはそれ以上透過
し、しかもこれら波長Ａ１とＢ１の間隔、Ａ２とＢ２の
間隔がいずれも非常に小さい（１５ｎｍ以下）という特
性を有している。

【００２７】したがって、図３に示すような分光透過曲
線を有するリジェクションフィルタを用いた場合と同様
に、Ａ２近傍（またはＡ２よりも若干短い波長）に励起
最大値波長を有し、Ｂ２近傍（またはＢ２よりも若干長
い波長）に蛍光最大値波長を有する標識蛍光物質を用い
れば、励起光によるノイズを除去すると共にピーク波長
での蛍光を検知することができるため、効率的且つ高精
度の蛍光測定を行うことが可能となる。

【００２８】リジェクションフィルタにおける波長Ａ，
Ｂ（図３）およびホログラフィックフィルタにおける波
長Ａ２，Ｂ２（図４）はフィルタ構造等によって定まる
が、角度調整手段１０を備えた装置構成とすることによ
り、使用する標識蛍光物質の吸収最大値波長と蛍光最大
値波長に応じてフィルタに対する蛍光入射角度を調整
し、これらフィルタにおける上記波長を最適な値にシフ
トさせることが可能となる。

【００２９】本発明の蛍光免疫測定装置におけるリジェ
クションフィルタ９として、誘電体多層膜フィルタ（干
渉フィルタ）を用いることもできる。誘電体多層膜フィ
ルタは多数層に膜を蒸着してなり、光が透過するときに
多層膜の間で光が干渉を起こすことによって、所定波長
領域の光だけを透過させ、それ以外の波長領域の光を透
過させない特性を持っている（図５参照）ことから、バ
ンドパスフィルタとも呼ばれている。

【００３０】この誘電体多層膜フィルタを用いて、標識
蛍光物質からの蛍光のみを選択的に透過させ、検出器７
で検出することができる。すなわち、図５において波長
ａの励起光を用いたとすると、この波長ａの励起光はほ
とんど誘電体多層膜フィルタを透過せず、一方、標識蛍
光物質からの蛍光が波長ｂ〜ｃ間の領域で発光している
とすれば、蛍光は誘電体多層膜フィルタを透過すること
ができる。

【００３１】誘電体多層膜フィルタにおいて、蛍光入射
角に対する角度を角度調整手段１０を介して変えると、
入射光に対して膜間の距離（光路長）が変わって干渉す
る条件も変わり、別な波長が干渉することになるため、
透過領域（波長ｂ〜ｃ）を波長軸に沿って移動させるこ
とができる。したがって、このフィルタを本発明装置の
フィルタ９として用いた場合も、励起光の波長を不透過
領域（波長ａ）としつつ、用いられる標識蛍光物質の蛍
光最大値波長が透過領域（波長ｂ〜ｃ）内となるような
フィルタ特性を持たせることは容易である。

【００３２】さらに、誘電体多層膜フィルタの製造時に
膜厚や層数をコントロールすることにより、その最大透
過波長や透過領域幅等の透過特性を変えることができ
る。たとえば、図２に示した標識蛍光物質Ｃｙ５の蛍光
スペクトル（図中斜線で示した部分）に合わせてそのピ
ーク波長やバンド幅を設定することが可能であり、励起
光をカットするだけでなく、測定したい試料以外の夾雑
物からの蛍光による妨害も排除または極小化することが
可能となる。

【００３３】本発明について図１の実施形態を中心に説
明したが、本発明はこの実施形態に限定されるものでは
なく、特許請求の範囲の請求項に記載された発明の範囲
内において様々な形態を取ることができる。

【００３４】

【発明の効果】以上に説明したように、本発明によれ
ば、蛍光免疫測定装置において従来用いられていたダイ
クロイックフィルタ等に代えて、所定波長Ａより短い波
長光をほとんど透過せず、所定波長Ｂ（Ｂ＞Ａ）より長
い波長光を７０％またはそれ以上透過し、しかもこれら
波長Ａ，Ｂの間隔が非常に小さい（１５ｎｍ以下）とい
う特性を有するリジェクションフィルタを用いているた
め、標識蛍光物質の吸収最大値波長と蛍光最大値波長と
が近接している場合であっても、その吸収最大値波長近
傍の励起光を用いて効率的に励起発光させると共に、放
射された蛍光を効率的に集光検出することができ、検出
感度および測定精度を飛躍的に向上させることが可能と
なる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施形態による蛍光免疫測定装置の
構成例を示す概略図である。

【図２】蛍光免疫測定に用いられる代表的な標識蛍光物
質であるＣｙ５の吸収および蛍光スペクトルを示す図で
ある。

【図３】ダイクロイックフィルタとリジェクションフィ
ルタの分光透過率特性を比較して示す図である。

【図４】図１の装置においてリジェクションフィルタと
してホログラフィックフィルタを用いた場合においてそ
の蛍光入射光に対する角度を変えたときの分光透過曲線
の変化状態を示す図である。

【図５】誘電体多層膜フィルタの分光透過率特性を示す
図である。

【図６】ダイクロイックフィルタを用いた従来技術によ
る蛍光免疫測定装置の構成例を示す概略図である。

【図７】ダイクロイックミラーを用いた従来技術による
蛍光免疫測定装置の構成例を示す概略図である。

【符号の説明】

１ レーザ光源 ２ 集光レンズ ３ 反射ミラー ４ 光導波路 ５ ダイクロイックフィルタ ６ 集光レンズ ７ 検出器 ８ ダイクロイックミラー ９ リジェクションフィルタ １０ 角度調整手段

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗原抗体反応によって生成される免疫化学
   的複合体の標識抗体上の標識蛍光物質を励起光で励起さ
   せ、これによって標識蛍光物質から放射される蛍光強度
   を測定する蛍光免疫測定装置であって、 標識蛍光物質を励起することができる励起光を出射する
   レーザ光源と、 レーザ光源から出射した励起光を全反射させながら伝搬
   させ、これによって生ずるエバネッセント波により、そ
   の表面に抗原抗体反応によって固定された標識抗体上の
   標識蛍光物質を励起して蛍光発光させると共に、標識蛍
   光物質からの蛍光放射を全反射させながら逆行して伝搬
   させる光導波路と、 光導波路から出射された蛍光を受光してその強度を測定
   する検出手段と、 光導波路と検出手段との間に設けられ、光導波路を逆行
   した蛍光を実質的に透過させるが励起光を実質的にカッ
   トするリジェクションフィルタと、を有してなることを
   特徴とする蛍光免疫測定装置。
2. 【請求項２】リジェクションフィルタがホログラフィッ
   クフィルタよりなることを特徴とする請求項１記載の蛍
   光免疫測定装置。
3. 【請求項３】リジェクションフィルタが多層膜誘電体フ
   ィルタよりなることを特徴とする請求項１記載の蛍光免
   疫測定装置。
4. 【請求項４】さらに、リジェクションフィルタの入射光
   に対する角度を可変にする手段を備えることを特徴とす
   る請求項１ないし３のいずれか記載の蛍光免疫測定装
   置。