JP2002000286A - 粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な製造方法 - Google Patents
粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な製造方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ポリヒドロキシアルカノエート生産能を有
する微生物からポリヒドロアルカノエート粒子を製造す
る方法において、その粒径を一定範囲内に制御する方法
を提供する。 【解決手段】 (１)上記微生物をその増殖に必要な炭
素源と無機成分を含む培地で増殖培養する工程、(２)工
程(１)で得られた増殖菌体を炭素源枯渇下で更に増殖培
養する工程及び(３)工程(２)で得られた増殖菌体よりポ
リヒドロキシアルカノエート粒子を抽出する工程を有す
る粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子
の生物学的な製造方法。また、該方法により粒径が制御
されたポリヒドロキシアルカノエート粒子。
する微生物からポリヒドロアルカノエート粒子を製造す
る方法において、その粒径を一定範囲内に制御する方法
を提供する。 【解決手段】 (１)上記微生物をその増殖に必要な炭
素源と無機成分を含む培地で増殖培養する工程、(２)工
程(１)で得られた増殖菌体を炭素源枯渇下で更に増殖培
養する工程及び(３)工程(２)で得られた増殖菌体よりポ
リヒドロキシアルカノエート粒子を抽出する工程を有す
る粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子
の生物学的な製造方法。また、該方法により粒径が制御
されたポリヒドロキシアルカノエート粒子。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、粒径が制御される
ポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な新規な
製造方法に関する。
ポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な新規な
製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ポリ３-ヒドロキシブチレート(ＰＨＢ)
に代表される微生物生産ポリエステル(ポリヒドロキシ
アルカノエート;以下ＰＨＡと記載)は、石油由来の合成
高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性
を有している。人類は長年にわたって合成高分子をプラ
スチック等として使用してきたが、それらのプラスチッ
クが廃棄物となった場合、その分解されにくいという性
質が災いし、廃棄物処理場に蓄積される。また、焼却処
理を行うことにより、ダイオキシンや環境ホルモン等の
有害物質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問
題となっている。一方、微生物生産ポリエステルは生分
解されることにより自然の物質循環に取り込まれるの
で、環境保全を可能とするプラスチックとして利用する
ことができる。また、医療用軟質部材としても今後有用
視される可能性を有している(特開平５-１５９号公
報)。
に代表される微生物生産ポリエステル(ポリヒドロキシ
アルカノエート;以下ＰＨＡと記載)は、石油由来の合成
高分子とは異なり、生物により分解されうるという特性
を有している。人類は長年にわたって合成高分子をプラ
スチック等として使用してきたが、それらのプラスチッ
クが廃棄物となった場合、その分解されにくいという性
質が災いし、廃棄物処理場に蓄積される。また、焼却処
理を行うことにより、ダイオキシンや環境ホルモン等の
有害物質の原因となり、環境汚染を引き起こすことが問
題となっている。一方、微生物生産ポリエステルは生分
解されることにより自然の物質循環に取り込まれるの
で、環境保全を可能とするプラスチックとして利用する
ことができる。また、医療用軟質部材としても今後有用
視される可能性を有している(特開平５-１５９号公
報)。
【０００３】これまで、多くの細菌がＰＨＢ或いはその
他のアルカノエートとのコポリマーを微生物内に生成・
蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチック
ハンドブック」(生分解性プラスチック研究会編;(株)エ
ヌ・ティー・エス)、p178-197)。特に、アルカリゲネス
・ユウトロファスＨ１６株(Alcaligenes eutrophus Ｈ
１６、ＡＴＣＣ Ｎo.17 699)及びその変異株はこれらポ
リマーの生産に関し詳細に研究されてきており、基質と
なる炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ
ブチレート(３ＨＢ)と３-ヒドロキシバレレート(３Ｈ
Ｖ)の共重合体または両者の各単位を共に含有成分とす
る共重合体を様々な割合で生成することが開示されてい
る(特公平６-１５６０４号公報、特公平７-１４３５２
号公報、特公平８-１９２２７号公報等)。
他のアルカノエートとのコポリマーを微生物内に生成・
蓄積することが報告されてきた(「生分解性プラスチック
ハンドブック」(生分解性プラスチック研究会編;(株)エ
ヌ・ティー・エス)、p178-197)。特に、アルカリゲネス
・ユウトロファスＨ１６株(Alcaligenes eutrophus Ｈ
１６、ＡＴＣＣ Ｎo.17 699)及びその変異株はこれらポ
リマーの生産に関し詳細に研究されてきており、基質と
なる炭素源を変化させることによって、３-ヒドロキシ
ブチレート(３ＨＢ)と３-ヒドロキシバレレート(３Ｈ
Ｖ)の共重合体または両者の各単位を共に含有成分とす
る共重合体を様々な割合で生成することが開示されてい
る(特公平６-１５６０４号公報、特公平７-１４３５２
号公報、特公平８-１９２２７号公報等)。
【０００４】特許公報第２６４２９３７号には、シュー
ドモナス・オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)
ＡＴＣＣ 29 347株に、炭素源として非環状脂肪族炭化
水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３
-ヒドロキシアルカノエート(３ＨＡ)をモノマーユニッ
トとするポリエステルを生産することが開示されてい
る。
ドモナス・オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)
ＡＴＣＣ 29 347株に、炭素源として非環状脂肪族炭化
水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの３
-ヒドロキシアルカノエート(３ＨＡ)をモノマーユニッ
トとするポリエステルを生産することが開示されてい
る。
【０００５】特開平５-７４４９２号公報には、メチロ
バクテリウム(Ｍethylobacteriuｍ)属、パラコッカス(P
aracoccus)属、アルカリゲネス属、シュードモナス属の
バクテリアを、炭素数３から７の第一アルコールに接触
させることにより３ＨＢと３ＨＶの共重合ポリエステル
を生産せしめる方法が開示されている。
バクテリウム(Ｍethylobacteriuｍ)属、パラコッカス(P
aracoccus)属、アルカリゲネス属、シュードモナス属の
バクテリアを、炭素数３から７の第一アルコールに接触
させることにより３ＨＢと３ＨＶの共重合ポリエステル
を生産せしめる方法が開示されている。
【０００６】特開平５-９３０４９号公報、及び特開平
７-２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビエ
(Ａeroｍonas caviae)がオレイン酸やオリーブオイルを
炭素源として培養することにより３ＨＢと３-ヒドロキ
シヘキサノエート(３ＨＨx)の２成分共重合ポリエステ
ルを生産することが開示されている。
７-２６５０６５号公報には、アエロモナス・キャビエ
(Ａeroｍonas caviae)がオレイン酸やオリーブオイルを
炭素源として培養することにより３ＨＢと３-ヒドロキ
シヘキサノエート(３ＨＨx)の２成分共重合ポリエステ
ルを生産することが開示されている。
【０００７】特開平９-１９１８９３号公報には、コマ
モナス・アシドボランス(Ｃoｍaｍonas acidovorans)I
ＦＯ 13 852株が、炭素源としてグルコン酸及び１,４ブ
タンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロ
キシブチレート(４ＨＢ)をモノマーユニットに持つポリ
エステルを生産することが開示されている。
モナス・アシドボランス(Ｃoｍaｍonas acidovorans)I
ＦＯ 13 852株が、炭素源としてグルコン酸及び１,４ブ
タンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒドロ
キシブチレート(４ＨＢ)をモノマーユニットに持つポリ
エステルを生産することが開示されている。
【０００８】以上、様々なＰＨＢ或いはその他のアルカ
ノエートとのコポリマーが細菌によって生成されてい
る。これらのポリマーは微生物内で顆粒状(グラニュー
ル)となって存在しており、ポリマー粒子のままで抽出
しようとする試みがなされている。
ノエートとのコポリマーが細菌によって生成されてい
る。これらのポリマーは微生物内で顆粒状(グラニュー
ル)となって存在しており、ポリマー粒子のままで抽出
しようとする試みがなされている。
【０００９】Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiology １９、(1958)198-
209には、ポリマーを蓄積した微生物を次亜塩素酸ナト
リウムのアルカリ性溶液で処理することによって、ポリ
マーを分離精製する方法が示されている。
209には、ポリマーを蓄積した微生物を次亜塩素酸ナト
リウムのアルカリ性溶液で処理することによって、ポリ
マーを分離精製する方法が示されている。
【００１０】Ｊ.Ｂacteriology ８８、(1964)60-71に
は、微生物懸濁液にリゾチームを添加し、超音波をか
け、グリセロール上に載せ比重の違いによってポリマー
を分離精製する方法が示されている。
は、微生物懸濁液にリゾチームを添加し、超音波をか
け、グリセロール上に載せ比重の違いによってポリマー
を分離精製する方法が示されている。
【００１１】特開平５-３３６９８２号公報には、リゾ
チーム等の溶菌酵素を微生物懸濁液へ添加して細胞壁を
溶菌し、プロナーゼ等の蛋白分解酵素によって顆粒皮膜
を除去することによってポリマーを分離精製する方法が
示されている。
チーム等の溶菌酵素を微生物懸濁液へ添加して細胞壁を
溶菌し、プロナーゼ等の蛋白分解酵素によって顆粒皮膜
を除去することによってポリマーを分離精製する方法が
示されている。
【００１２】以上のようにして分離精製したＰＨＢ或い
はその他のアルカノエートとのコポリマーは、直径約１
μｍ前後の微粒子であり、情報記録材料、医薬品、食
品、土木・建築材、塗料、化粧品等あらゆる分野におい
て利用が期待される。
はその他のアルカノエートとのコポリマーは、直径約１
μｍ前後の微粒子であり、情報記録材料、医薬品、食
品、土木・建築材、塗料、化粧品等あらゆる分野におい
て利用が期待される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】このように、微生物に
よって微生物内に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエ
ート(ＰＨＡ)は微粒子として抽出可能であるが、前記の
ような様々な分野で利用するためには、従来からこれら
の分野で利用されてきた合成高分子の粒子と同様に、そ
の粒径が一定範囲内に制御されていることが重要となっ
てくる。
よって微生物内に蓄積されたポリヒドロキシアルカノエ
ート(ＰＨＡ)は微粒子として抽出可能であるが、前記の
ような様々な分野で利用するためには、従来からこれら
の分野で利用されてきた合成高分子の粒子と同様に、そ
の粒径が一定範囲内に制御されていることが重要となっ
てくる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明では上記の課題を
解決するための一つの方法を提供する。即ち、本発明の
方法は、ポリヒドロキシアルカノエート生産能を有する
微生物からポリヒドロアルカノエート粒子を製造する方
法において、(１)該微生物をその増殖に必要な炭素源と
無機成分を含む培地で増殖培養する工程、(２)工程(１)
で得られた増殖菌体を炭素源枯渇下で更に増殖培養する
工程及び(３)工程(２)で得られた増殖菌体よりポリヒド
ロキシアルカノエート粒子を抽出する工程を有する粒径
が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物
学的な製造方法であり、また、該方法により粒径が制御
されたポリヒドロキシアルカノエート粒子である。
解決するための一つの方法を提供する。即ち、本発明の
方法は、ポリヒドロキシアルカノエート生産能を有する
微生物からポリヒドロアルカノエート粒子を製造する方
法において、(１)該微生物をその増殖に必要な炭素源と
無機成分を含む培地で増殖培養する工程、(２)工程(１)
で得られた増殖菌体を炭素源枯渇下で更に増殖培養する
工程及び(３)工程(２)で得られた増殖菌体よりポリヒド
ロキシアルカノエート粒子を抽出する工程を有する粒径
が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物
学的な製造方法であり、また、該方法により粒径が制御
されたポリヒドロキシアルカノエート粒子である。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明で用いる微生物としては、
微生物内でＰＨＡを生産・蓄積することができる微生物
であればいかなる微生物でもよく、例えば、バークホル
デリア(Ｂurkholderia)属、シュードモナス(Pseudoｍon
as)属、ラルストニア(Ｒalstonia)属、ロドバクター(Ｒ
hodobacter)属、バチルス(Ｂacillus)属、アルカリゲネ
ス(Alcaligenes)属、ノカルディア(Ｎocardia)属、コリ
ネバクテリウム(Ｃorynebacteriuｍ)属、ロドコッカス
(Ｒhodococcus)属、プロトモナス(Protoｍonas)属にす
る細菌等が挙げられる。
微生物内でＰＨＡを生産・蓄積することができる微生物
であればいかなる微生物でもよく、例えば、バークホル
デリア(Ｂurkholderia)属、シュードモナス(Pseudoｍon
as)属、ラルストニア(Ｒalstonia)属、ロドバクター(Ｒ
hodobacter)属、バチルス(Ｂacillus)属、アルカリゲネ
ス(Alcaligenes)属、ノカルディア(Ｎocardia)属、コリ
ネバクテリウム(Ｃorynebacteriuｍ)属、ロドコッカス
(Ｒhodococcus)属、プロトモナス(Protoｍonas)属にす
る細菌等が挙げられる。
【００１６】本発明における実施の形態において用いら
れる微生物は、バークホルデリア(旧属名シュードモナ
ス(Pseudoｍonas))・セパシア(Ｂurkholderia cepacia)
ＫＫ０１(ＦＥＲＭ ＢＰ-4235)、ラルストニア・ユウト
ロファ(Ｒalstonia eutropha)ＴＢ６４(ＦＥＲＭ ＢＰ-
6933)である。
れる微生物は、バークホルデリア(旧属名シュードモナ
ス(Pseudoｍonas))・セパシア(Ｂurkholderia cepacia)
ＫＫ０１(ＦＥＲＭ ＢＰ-4235)、ラルストニア・ユウト
ロファ(Ｒalstonia eutropha)ＴＢ６４(ＦＥＲＭ ＢＰ-
6933)である。
【００１７】本発明の実施形態において用いる微生物の
一つであるシュードモナス・セパシアＫＫ０１株(ブタ
ペスト条約に基づく国際寄託の番号:ＦＥＲＭ ＢＰ-423
5、受託日:平成４年３月１１日)は特公平８-２４５８９
号公報においてフェノール、クレゾール等の芳香族化合
物を分解する菌として公告された菌株である。また、特
開平６-２９６７１１号公報において、フェノール等の
芳香族化合物を誘導物質としてＴＣＥ等の有機塩素化合
物を分解することが開示されている。尚、シュードモナ
ス属・セパシアの菌株は、現在分類学上バークホルデリ
ア・セパシアに変更されている。
一つであるシュードモナス・セパシアＫＫ０１株(ブタ
ペスト条約に基づく国際寄託の番号:ＦＥＲＭ ＢＰ-423
5、受託日:平成４年３月１１日)は特公平８-２４５８９
号公報においてフェノール、クレゾール等の芳香族化合
物を分解する菌として公告された菌株である。また、特
開平６-２９６７１１号公報において、フェノール等の
芳香族化合物を誘導物質としてＴＣＥ等の有機塩素化合
物を分解することが開示されている。尚、シュードモナ
ス属・セパシアの菌株は、現在分類学上バークホルデリ
ア・セパシアに変更されている。
【００１８】本発明の実施形態において用いる微生物の
一つであるラルストニア・ユウトロファＴＢ６４株(Ｒa
lstonia eutropha ＴＢ６４、特願平１０-３４４５０８
に開示)は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、以下のような特徴を示す。
一つであるラルストニア・ユウトロファＴＢ６４株(Ｒa
lstonia eutropha ＴＢ６４、特願平１０-３４４５０８
に開示)は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託されており、以下のような特徴を示す。
【００１９】 (１)形態観察 ――――――――――――――――――――――――― 試験項目 結果 ――――――――――――――――――――――――― 細胞の形 桿菌(0.3-0.5 × 1.0-2.0 ｍｍ) 胞子 無 鞭毛 有(周鞭毛) グラム染色性 １８時間 陰性 ２４時間 陰性 ３６時間 陰性 ――――――――――――――――――――――――― (２)生理・生化学試験 ――――――――――――――――――――――――― 試験項目 結果 ――――――――――――――――――――――――― 嫌気下での生育 陰性 カタラーゼ 陽性 オキシダーゼ 陽性 リトマスミルク アルカリ 硝酸塩の還元 陰性 Ｖ-Ｐ反応 陰性 Ｖ-Ｐ培地のpＨ 7.76 カゼインの分解 陰性 ゼラチンの分解 陰性 澱粉の分解 陰性 ＤＮＡの分解 陰性 尿素の分解 陰性 Ｔween２０の分解 陰性 Ｔween４０の分解 陰性 Ｔween６０の分解 陰性 Ｔween８０の分解 陰性 チロシンの分解 陽性 ――――――――――――――――――――――――― 試験項目 結果 ――――――――――――――――――――――――― 有機酸の利用 クエン酸 陽性 プロピオン酸 陽性 酢酸 陽性 フマル酸 陽性 Ｌ-リンゴ酸 陽性 コハク酸 陽性 無機窒素源の利用 アンモニウム塩 陽性 硝酸塩 陽性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 ――――――――――――――――――――――――― 試験項目 結果 ――――――――――――――――――――――――― 色素の生成 Ｐ agar 陰性 Ｆ agar 陰性 Ｋing Ａ agar 陰性 Ｋing Ｂ agar 陰性 ＮaＣl存在下での生育 ２％ 陽性 ５％ 陰性 ７％ 陰性 生育pＨ ５.０〜９.０ 生育温度 １０℃〜４０℃ 0.02％ アジ化ナトリウム 存在下での生育 陰性 0.001％ リゾチウム 存在下での生育 陽性 ＯＦテスト 陰性 ――――――――――――――――――――――――― 試験項目 結果 ――――――――――――――――――――――――― 糖からの酸の生成 グルコース 陰性 アラビノース 陰性 フラクトース 陰性 ガラクトース 陰性 マルトース 陰性 ラクトース 陰性 シュークロース 陰性 キシロース 陰性 トレハロース 陰性 グリセロール 陰性 マンニトール 陰性 ソルビトール 陰性 ソルボース 陰性 マンノース 陰性 ラムノース 陰性 アドニトール 陰性 ガスの生成 グルコース 陰性 アラビノース 陰性 キシロース 陰性 マンニトール 陰性 ――――――――――――――――――――――――― (３)キノン組成分析 ――――――――――――――――――――――――― キノン分子種 組成比(％) ――――――――――――――――――――――――― ユビキノン-８ 95.4 ――――――――――――――――――――――――― 以上の様な結果より、本菌株はラルストニア・ユウトロ
ファ(Ｒalstonia eutropha)と同定するのが適当とし、
ラルストニア・ユウトロファ(Ｒalstonia eutropha)Ｔ
Ｂ６４株として通産省工業技術院 生命工学工業技術研
究所に寄託した(寄託番号:ＦＥＲＭ ＢＰ-6933、受託
日:平成１０年９月３日)。
ファ(Ｒalstonia eutropha)と同定するのが適当とし、
ラルストニア・ユウトロファ(Ｒalstonia eutropha)Ｔ
Ｂ６４株として通産省工業技術院 生命工学工業技術研
究所に寄託した(寄託番号:ＦＥＲＭ ＢＰ-6933、受託
日:平成１０年９月３日)。
【００２０】これらの微生物は炭素源やリン源、窒素源
等の無機成分を含む培地において増殖しうる。
等の無機成分を含む培地において増殖しうる。
【００２１】用いる炭素源としては微生物が増殖しうる
成分を含んでいるものならいかなるものでもよく、例え
ばピルビン酸ナトリウム等を挙げることができる。ま
た、該炭素源の増殖時における濃度は０.１〜２質量％
であることが好ましい。
成分を含んでいるものならいかなるものでもよく、例え
ばピルビン酸ナトリウム等を挙げることができる。ま
た、該炭素源の増殖時における濃度は０.１〜２質量％
であることが好ましい。
【００２２】用いる無機塩培地としては、リン源(通常
はリン酸塩)、窒素源(通常はアンモニウム塩、或いは硝
酸塩)等、微生物が増殖しうる成分を含んでいるものな
らいかなるものでもよく、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培
地等を挙げることができる。本発明における実施の形態
で用いるＭ９培地の組成を以下に示す。 リン酸水素二ナトリウム(Ｎa2ＨＰＯ4):６.２g リン酸二水素カリウム(ＫＨ2ＰＯ4):３.０g 塩化ナトリウム(ＮaＣl):０.５g 塩化アンモニウム(ＮＨ4Ｃl):１.０g (培地１リットル中；pＨ７.０) 培養方法としてはバッチ式、流動バッチ式、連続培養
式、リアクター形式等、通常微生物を培養するいかなる
方法をも用いることができる。
はリン酸塩)、窒素源(通常はアンモニウム塩、或いは硝
酸塩)等、微生物が増殖しうる成分を含んでいるものな
らいかなるものでもよく、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培
地等を挙げることができる。本発明における実施の形態
で用いるＭ９培地の組成を以下に示す。 リン酸水素二ナトリウム(Ｎa2ＨＰＯ4):６.２g リン酸二水素カリウム(ＫＨ2ＰＯ4):３.０g 塩化ナトリウム(ＮaＣl):０.５g 塩化アンモニウム(ＮＨ4Ｃl):１.０g (培地１リットル中；pＨ７.０) 培養方法としてはバッチ式、流動バッチ式、連続培養
式、リアクター形式等、通常微生物を培養するいかなる
方法をも用いることができる。
【００２３】以上のような条件下で増殖した微生物を遠
心分離によって集菌し、その後、炭素源枯渇下で培養す
ることによって、ＰＨＡ粒子の粒径制御が可能となる。
増殖培養時においても微生物はある程度のポリマーを微
生物内に蓄積する。
心分離によって集菌し、その後、炭素源枯渇下で培養す
ることによって、ＰＨＡ粒子の粒径制御が可能となる。
増殖培養時においても微生物はある程度のポリマーを微
生物内に蓄積する。
【００２４】この状態の微生物を無機成分に関して増殖
培養時と同様な条件下、炭素源のみ制限することによっ
て増殖させることで、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素
源として消費し増殖する(炭素源枯渇培養)。従って、炭
素源枯渇培養での培養開始時の菌体濃度、培養温度等の
条件は、菌体が増殖し、菌体内のＰＨＡを消費するよう
に設定される。例えばこの炭素源枯渇培養における初期
の微生物数は培養時の増殖を促進させるために、増殖培
養後における微生物濃度より減少させることが望まし
い。希釈倍率としては特に５〜４０倍が好ましい。
培養時と同様な条件下、炭素源のみ制限することによっ
て増殖させることで、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素
源として消費し増殖する(炭素源枯渇培養)。従って、炭
素源枯渇培養での培養開始時の菌体濃度、培養温度等の
条件は、菌体が増殖し、菌体内のＰＨＡを消費するよう
に設定される。例えばこの炭素源枯渇培養における初期
の微生物数は培養時の増殖を促進させるために、増殖培
養後における微生物濃度より減少させることが望まし
い。希釈倍率としては特に５〜４０倍が好ましい。
【００２５】このように炭素源枯渇を経験し増殖した微
生物に次亜塩素酸ナトリウムの薬剤処理、ＳＤＳ等の界
面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理をすることによ
ってＰＨＡ以外の微生物内成分を除去し、ＰＨＡを粒子
として抽出する。
生物に次亜塩素酸ナトリウムの薬剤処理、ＳＤＳ等の界
面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理をすることによ
ってＰＨＡ以外の微生物内成分を除去し、ＰＨＡを粒子
として抽出する。
【００２６】なお、このような方法で得られたＰＨＡの
物理化学的性質には特に制限はないが、粒径の制御のし
やすさや樹脂製品原料としての品質要求から、分子量1
0,000〜10,000,000であることが好ましい。
物理化学的性質には特に制限はないが、粒径の制御のし
やすさや樹脂製品原料としての品質要求から、分子量1
0,000〜10,000,000であることが好ましい。
【００２７】
【実施例】以下に実施例を示す。
【００２８】[実施例１] ＴＢ６４株を用いたＰＨＡ粒
子の粒径制御 ピルビン酸ナトリウム０.５質量％を含むＭ９寒天培地
上のＴＢ６４株のコロニーを、ピルビン酸ナトリウム
０.５質量％含む２００ｍLのＭ９液体培地に植菌し、３
０℃で２４時間培養した(増殖培養)。
子の粒径制御 ピルビン酸ナトリウム０.５質量％を含むＭ９寒天培地
上のＴＢ６４株のコロニーを、ピルビン酸ナトリウム
０.５質量％含む２００ｍLのＭ９液体培地に植菌し、３
０℃で２４時間培養した(増殖培養)。
【００２９】次に遠心分離によって微生物を集菌し、炭
素源を含まないＭ９培地によって５、１０、２０、４０
倍希釈した後、３０℃で培養した(炭素源枯渇培養)。
素源を含まないＭ９培地によって５、１０、２０、４０
倍希釈した後、３０℃で培養した(炭素源枯渇培養)。
【００３０】２４時間後に遠心分離によって集菌したＴ
Ｂ６４のペレットを凍結乾燥した。次にこの凍結乾燥ペ
レットを５ｍLの次亜塩素酸ナトリウムに懸濁し、３０
℃で１時間攪拌した後、遠心分離、凍結乾燥することに
よってＰＨＡ粒子を抽出した。
Ｂ６４のペレットを凍結乾燥した。次にこの凍結乾燥ペ
レットを５ｍLの次亜塩素酸ナトリウムに懸濁し、３０
℃で１時間攪拌した後、遠心分離、凍結乾燥することに
よってＰＨＡ粒子を抽出した。
【００３１】増殖培養後及び５、１０、２０、４０倍希
釈し炭素源枯渇を経験させた後のコロニー形成単位(Ｃo
lony Ｆorｍation Ｕnit,ＣＦＵ)、乾燥微生物重量(Ｃe
llＤry Ｗeight,ＣＤＷ)、ポリマー収量(Ｐolyｍer Ｄr
y Ｗeight,ＰＤＷ)及び乾燥微生物に対する含有ポリマ
ーの割合(ＰＤＷ/ＣＤＷ)を表１に示す。例えば１０倍
希釈の場合、増殖培養後ＣＦＵが２.３×１０8/ｍLであ
ったのに対し、炭素源枯渇後には３.２×１０8/ｍLとな
った。また、ＰＤＷ/ＣＤＷは増殖培養後に 82.7％であ
ったのに対し、炭素源枯渇後では 32.0％に低下してお
り、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素源として増殖して
いることが判明した。
釈し炭素源枯渇を経験させた後のコロニー形成単位(Ｃo
lony Ｆorｍation Ｕnit,ＣＦＵ)、乾燥微生物重量(Ｃe
llＤry Ｗeight,ＣＤＷ)、ポリマー収量(Ｐolyｍer Ｄr
y Ｗeight,ＰＤＷ)及び乾燥微生物に対する含有ポリマ
ーの割合(ＰＤＷ/ＣＤＷ)を表１に示す。例えば１０倍
希釈の場合、増殖培養後ＣＦＵが２.３×１０8/ｍLであ
ったのに対し、炭素源枯渇後には３.２×１０8/ｍLとな
った。また、ＰＤＷ/ＣＤＷは増殖培養後に 82.7％であ
ったのに対し、炭素源枯渇後では 32.0％に低下してお
り、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素源として増殖して
いることが判明した。
【００３２】更に各培養後、次亜塩素酸ナトリウムによ
ってＰＨＡ粒子を抽出した。増殖培養後得られたＰＨＡ
粒子の平均粒径は 0.39μｍ、標準偏差が 0.12μｍ、標
準偏差/平均粒径は 0.31 であった。これに対し１０倍
希釈し、炭素源枯渇培養を行った後のＰＨＡ粒子の平均
粒径は 0.31μｍ、標準偏差が 0.07μｍ、標準偏差/平
均粒径は 0.23 となり、炭素源枯渇培養を行うことによ
り粒径がより小さく均一化された。
ってＰＨＡ粒子を抽出した。増殖培養後得られたＰＨＡ
粒子の平均粒径は 0.39μｍ、標準偏差が 0.12μｍ、標
準偏差/平均粒径は 0.31 であった。これに対し１０倍
希釈し、炭素源枯渇培養を行った後のＰＨＡ粒子の平均
粒径は 0.31μｍ、標準偏差が 0.07μｍ、標準偏差/平
均粒径は 0.23 となり、炭素源枯渇培養を行うことによ
り粒径がより小さく均一化された。
【００３３】
【表１】
【００３４】[実施例２] ＫＫ０１株を用いたＰＨＡ粒
子の粒径制御 ピルビン酸ナトリウム０.５質量％を含むＭ９寒天培地
上のＫＫ０１株のコロニーを、ピルビン酸ナトリウム
０.５質量％含む２００ｍLのＭ９液体培地に植菌し、３
０℃で２４時間培養した(増殖培養)。
子の粒径制御 ピルビン酸ナトリウム０.５質量％を含むＭ９寒天培地
上のＫＫ０１株のコロニーを、ピルビン酸ナトリウム
０.５質量％含む２００ｍLのＭ９液体培地に植菌し、３
０℃で２４時間培養した(増殖培養)。
【００３５】次に遠心分離によって微生物を集菌し、炭
素源を含まないＭ９培地によって５、１０、２０、４０
倍希釈した後、３０℃で培養した(炭素源枯渇培養)。
素源を含まないＭ９培地によって５、１０、２０、４０
倍希釈した後、３０℃で培養した(炭素源枯渇培養)。
【００３６】２４時間後に遠心分離によって集菌したＫ
Ｋ０１のペレットを凍結乾燥した。次にこの凍結乾燥ペ
レットを５ｍlの次亜塩素酸ナトリウムに懸濁し、３０
℃で１時間攪拌した後、遠心分離、凍結乾燥することに
よってＰＨＡ粒子を抽出した。
Ｋ０１のペレットを凍結乾燥した。次にこの凍結乾燥ペ
レットを５ｍlの次亜塩素酸ナトリウムに懸濁し、３０
℃で１時間攪拌した後、遠心分離、凍結乾燥することに
よってＰＨＡ粒子を抽出した。
【００３７】増殖培養後及び５、１０、２０、４０倍希
釈し炭素源枯渇を経験させた後のコロニー形成単位(Ｃo
lony Ｆorｍation Ｕnit,ＣＦＵ)、乾燥微生物重量(Ｃe
llＤry Ｗeight,ＣＤＷ)、ポリマー収量(Ｐolyｍer Ｄr
y Ｗeight,ＰＤＷ)及び乾燥微生物に対する含有ポリマ
ーの割合(ＰＤＷ/ＣＤＷ)を表２に示す。例えば１０倍
希釈の場合、増殖培養後ＣＦＵが２.０×１０8/ｍLであ
ったのに対し、炭素源枯渇後には５.０×１０8/ｍLとな
った。また、ＰＤＷ/ＣＤＷは増殖培養後に78.5％であ
ったのに対し、炭素源枯渇後では 30.0％に低下してお
り、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素源として増殖して
いることが判明した。
釈し炭素源枯渇を経験させた後のコロニー形成単位(Ｃo
lony Ｆorｍation Ｕnit,ＣＦＵ)、乾燥微生物重量(Ｃe
llＤry Ｗeight,ＣＤＷ)、ポリマー収量(Ｐolyｍer Ｄr
y Ｗeight,ＰＤＷ)及び乾燥微生物に対する含有ポリマ
ーの割合(ＰＤＷ/ＣＤＷ)を表２に示す。例えば１０倍
希釈の場合、増殖培養後ＣＦＵが２.０×１０8/ｍLであ
ったのに対し、炭素源枯渇後には５.０×１０8/ｍLとな
った。また、ＰＤＷ/ＣＤＷは増殖培養後に78.5％であ
ったのに対し、炭素源枯渇後では 30.0％に低下してお
り、微生物は微生物内のＰＨＡを炭素源として増殖して
いることが判明した。
【００３８】更に各培養後、次亜塩素酸ナトリウムによ
ってＰＨＡ粒子を抽出した。増殖培養後得られたＰＨＡ
粒子の平均粒径は 0.36μｍ、標準偏差が 0.12μｍ、標
準偏差/平均粒径は 0.33 であった。これに対し１０倍
希釈し、炭素源枯渇培養を行った後のＰＨＡ粒子の平均
粒径は 0.30μｍ、標準偏差が 0.08μｍ、標準偏差/平
均粒径は 0.27 となり、炭素源枯渇培養を行うことによ
り粒径がより小さく均一化された。
ってＰＨＡ粒子を抽出した。増殖培養後得られたＰＨＡ
粒子の平均粒径は 0.36μｍ、標準偏差が 0.12μｍ、標
準偏差/平均粒径は 0.33 であった。これに対し１０倍
希釈し、炭素源枯渇培養を行った後のＰＨＡ粒子の平均
粒径は 0.30μｍ、標準偏差が 0.08μｍ、標準偏差/平
均粒径は 0.27 となり、炭素源枯渇培養を行うことによ
り粒径がより小さく均一化された。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【発明の効果】本発明の方法により、ポリヒドロキシア
ルカノエート生産能を有する微生物を (１)増殖に必要な炭素源と無機成分を含む培地で増殖培
養する工程 (２)微生物濃度を減少させ、炭素源枯渇下で増殖培養す
る工程 (３)微生物よりポリヒドロキシアルカノエート粒子を抽
出する工程 を経ることにより粒径が制御されたポリヒドロキシアル
カノエート粒子の製造が可能となった。
ルカノエート生産能を有する微生物を (１)増殖に必要な炭素源と無機成分を含む培地で増殖培
養する工程 (２)微生物濃度を減少させ、炭素源枯渇下で増殖培養す
る工程 (３)微生物よりポリヒドロキシアルカノエート粒子を抽
出する工程 を経ることにより粒径が制御されたポリヒドロキシアル
カノエート粒子の製造が可能となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 7/62 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/62 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 7/62 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:365） Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 7/62 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:05） Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:365） Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｆターム(参考） 4B064 AD64 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 BA18 CA02 CC03 CD02 CD07 CE02 DA16 4B065 AA01X AA12X AA15X AA41X AA45X AC14 BB02 BB03 BB08 BD01 CA11 CA54
Claims (11)
- 【請求項１】 ポリヒドロキシアルカノエート生産能を
有する微生物からポリヒドロキシアルカノエート粒子を
製造する方法において、 (１)該微生物をその増殖に必要な炭素源と無機成分を含
む培地で増殖培養する工程、 (２)工程(１)で得られた増殖菌体を炭素源枯渇下で更に
増殖培養する工程及び (３)工程(２)で得られた増殖菌体よりポリヒドロキシア
ルカノエート粒子を抽出する工程 を有する粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエー
ト粒子の製造方法 - 【請求項２】 該微生物が、バークホルデリア(Ｂurkho
lderia)属、シュードモナス(Pseudoｍonas)属、ラルス
トニア(Ｒalstonia)属、ロドバクター(Ｒhodobacter)
属、バチルス(Ｂacillus)属、アルカリゲネス(Alcalige
nes)属、ノカルディア(Ｎocardia)属、コリネバクテリ
ウム(Ｃorynebacteriuｍ)属、ロドコッカス(Ｒhodococc
us)属、プロトモナス(Protoｍonas)属に属する細菌であ
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該微生物が、バークホルデリア(旧属名
シュードモナス(Pseudoｍonas))・セパシア(Ｂurkholde
ria cepacia)ＫＫ０１(ＦＥＲＭ ＢＰ-４２３５)、ラル
ストニア・ユウトロファ(Ｒalstonia eutropha)ＴＢ６
４(ＦＥＲＭ ＢＰ-６９３３)である請求項２に記載の方
法。 - 【請求項４】 該炭素源が、ピルビン酸ナトリウムであ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 該無機成分が、リン酸水素二ナトリウ
ム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化アン
モニウムのいずれか１つ以上からなる請求項１〜４のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１の(１)の工程における該炭素源
濃度が、０.１〜２質量％である請求項１〜５のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項７】 該炭素源枯渇下で培養するときの希釈倍
率が、５〜４０倍である請求項１〜６のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項８】 該炭素源枯渇下で培養する際の培地が、
炭素源を除く増殖に必要なリン酸水素二ナトリウム、リ
ン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化アンモニウ
ムのいずれか１つ以上からなる無機成分を含む培地であ
る請求項１〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 該微生物からのポリヒドロキシアルカノ
エート粒子の抽出が、次亜塩素酸ナトリウムを添加し微
生物を可溶化することである請求項１〜８のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項１０】 前記ポリヒドロキシアルカノエートの
分子量が１０,０００〜１０,０００,０００である、請
求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれかに記載の方
法により得られた、粒径が制御されたポリヒドロキシア
ルカノエート粒子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000192755A JP2002000286A (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | 粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000192755A JP2002000286A (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | 粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002000286A true JP2002000286A (ja) | 2002-01-08 |
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ID=18691839
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000192755A Pending JP2002000286A (ja) | 2000-06-27 | 2000-06-27 | 粒径が制御されたポリヒドロキシアルカノエート粒子の生物学的な製造方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2002000286A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106501195A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-15 | 中国科学院南京地理与湖泊研究所 | 基于水体悬浮颗粒物吸收系数的湖泊富营养化评价方法 |
-
2000
- 2000-06-27 JP JP2000192755A patent/JP2002000286A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106501195A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-15 | 中国科学院南京地理与湖泊研究所 | 基于水体悬浮颗粒物吸收系数的湖泊富营养化评价方法 |
| CN106501195B (zh) * | 2016-10-13 | 2019-10-25 | 中国科学院南京地理与湖泊研究所 | 基于水体悬浮颗粒物吸收系数的湖泊富营养化评价方法 |
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