JP2001526647A

JP2001526647A - 眼科用非刺激性ヨウ素医薬および方法

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Publication number: JP2001526647A
Application number: JP54565498A
Authority: JP
Inventors: ケスラー，ジャック
Original assignee: シンボロン・コーポレイション
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-05-31
Publication date: 2001-12-18
Also published as: US5849291A; AU725930C; AU3288697A; EP0969814A1; AU725930B2; CN1248911A; CA2284696A1; BR9714631A; WO1998042313A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトの眼のような敏感な生体材料の内外汚染菌である病原生物の不活性化のための酵素的に生成させるヨウ素殺菌剤に関する。酵素反応由来の本殺菌剤は、最少濃度５ppmで生成し、モルベースで、存在する全ヨウ素種の最低２５％を構成する遊離ヨウ素分子である。

Description

【発明の詳細な説明】眼科用非刺激性ヨウ素医薬および方法発明の分野本発明は、１９９４年１０月１７日出願の出願番号０８／３２４３９１の一部継続出願である１９９５年１月１日出願の出願番号０８／５５１,４７８の一部継続出願であり、一般に、哺乳類眼組織内外の汚染菌である病原性微生物を不活性化する、非毒性および非刺激性殺菌性ヨウ素をベースにした殺菌剤の酵素的形成に関する。発明の背景本発明によれば、遊離ヨウ素分子は、哺乳類眼組織内外の病原性微生物の不活性化の目的で、殺生物剤として、ヨウ素とペルオキシドの間のペルオキシダーゼ触媒反応により、その場で生成される。よくある汚染菌は、細菌、ウイルスおよび真菌を含む。感染した目の処置に、現在抗生物質が使用されている。抗生物質は広いスペクトルの薬剤ではない。細菌、ウイルスおよび真菌に対して有効な抗生物質はない。抗生物質を広汎に使用したため抗生物質耐性病原菌が出現している。好ましい目の抗感染剤は、広いスペクトルのものであり、耐性病原菌を生成させないものである。非常に多様な化学殺菌剤が望ましくない細菌、ウイルスおよび真菌を不活性化するために、医者および生物医学産業で使用されている。これらの化学殺菌剤の多くは有機材料に毒性であるか破壊的であり、結果としてこれらの殺菌剤は、ヒトの眼のような敏感な生物材料に使用するのに適していない。米国特許第５,１８５,３７１号は、以下の組成物の一つに殺菌剤を希釈することからなる、血液製品の殺菌法を記載する：０.９％塩化ナトリウム水溶液、５％デキストロース水溶液、糖溶液または液体殺菌剤の血液および血液製品に対する化学的不適合性を改善する他の希釈剤。 F．A．Highsmith et al．（Journal of Infectious Diseases,volume 167，pa ge 1027，1993)は、化学修飾したポリビニルピロリドン−ヨウ素複合体を使用する方法を記載する。Highsmithに記載の組成物および方法は、血液製品の殺菌に使用されている。Highsmithの組成物は、遊離ヨウ素分子を含む多くのヨウ素種を含む。全ての先行技術は敏感な生物材料の、ヨウ素担体を使用したヨウ素による殺菌に関する。ヨウ素担体は、ポビドンヨウ素または他の化学錯体を使用するか、または高分子量ポリマーに結合したヨウ素を含む。ヨウ素担体の使用は、病原体の不活性化に必要なヨウ素種の絶対的濃度を、ヨウ素に結合する高分子量ポリマーを含まない遊離ヨウ素分子の組成物と比較して増加させる。ヨウ素担体は、全ての形のヨウ素が毒性であり得るため、敏感な生物材料の殺菌用ヨウ素の好ましい形ではない。感受性生存細胞に関する殺菌活性と毒性との衝突が、ヒトの眼でもそうであるように、存在する。この点に関して、先行技術は敏感な生物材料の殺菌のためのヨウ素の有効な使用に必要な臨界パラメーターを直接示していない。ヨウ素担体はヒトの眼の殺菌に使用されているが、遊離ヨウ素分子対他のヨウ素種の比が１／１００以下である。本発明によれば、遊離ヨウ素分子の濃度レベルを、複数のヨウ素種が同時に存在するとき、モル濃度ベースで少なくとも２５％が遊離ヨウ素分子である好ましい濃度で、遊離ヨウ素分子が他のヨウ素種に対して優勢な種であるように制御する。遊離ヨウ素分子の濃度は好ましくは５から３３０ppmの間であり、ペルオキシダーゼ、ヨウ化物および過酸化水素を水性媒体中で酵素反応させることにより、その場で形成させ得る。過酸化水素対ヨウ化物のモル比は、好ましくは４を超えないようにし、過酸化水素の最大濃度は、好ましくは殺菌剤をヒトの眼に投与する前は０.０１５％を超えないようにして、処置がヒトの眼の全ての望ましくない病原体を効果的に不活性化するようにすベきである。加えて、遊離ヨウ素分子の濃度レベルを、眼に破壊的もしくは刺激性でないｐＨおよびイオン強度の条件下に実質的に維持することが非常に好ましい。遊離ヨウ素分子を有効にするために、本殺菌剤のレベルは全ての望ましくない病原体を不活性化するのに十分な時間実質的に維持されなければならない。しかしながら、遊離ヨウ素分子の化学活性は、また目的の生物材料の完全性を実質的に維持するように制御すべきでもある。殺菌活性と生物学的適合性とは衝突する性質であるから、毒性および化学的非適合性は付与するが殺菌作用は付与しない他のヨウ素種は、除去するか最小化することが重要である。加えて、他の非殺菌細胞毒性化学物は、それらが刺激および非適合性の源となる可能性があるため、最小化すべきである。本明細書で意図される生物材料の圧倒的大多数に適合性のｐＨは、ｐＨ６.８から７.１である。ｐＨ７.０で眼材料を除染することは必ずしも必要ではないが、刺激の可能性を最小化するためにできるだけｐＨ７.０に近くｐＨを維持することが重要である。中性ｐＨは、殺菌における遊離ヨウ素分子の使用を複雑にする付加的因子を導入する。遊離ヨウ素分子は中性ｐＨでは不安定であり、結果として、処置時間が臨界パラメーターとなる。米国特許第５,１８５,３７１号に記載の殺菌剤の一つは１０％ポビドンヨウ素であり、これはしばしばPVP-I₂と示される。PVP-I₂はヨウ素とポビドンの錯体である。それは９.０重量％より少なくなく、１２重量％を超えないチオスルフェート滴定可能ヨウ素を含む。加えて、PVP-I₂は、典型的に６.６重量％を超えないヨウ素イオンを含む。ヨウ素酸および他の無機種が典型的にPVP-I₂に添加される。PVP-I₂は商品として多くの製造者から入手可能であり、これらの製品のｐＨは製造者毎に異なる。しかしながら、PVP-I₂は、典型的にｐＨ３.５から４.５の間の範囲で酸性条件で強い緩衝化処理される。 PVP-I₂のヨウ素種の分布は敏感な生物材料へのその使用に有利とならない。PV P-I₂は、このような組成物ではその中に含まれるヨウ素の０.２％以下が遊離ヨウ素分子の形であるため、生物材料の好ましい除菌剤ではない。加えて、これらの組成物のｐＨは、本願で投与を意図する細胞および組織のほとんどに毒性である。PVP-I₂は直接無傷の皮膚に投与するように構想された。哺乳類の表皮は、強い化学物質に生存細胞よりも感受性が少ない死滅細胞を含む米国特許第５,１８５,３７１号は、血液および血液製品の、０.０１％から０. ０５重量％の範囲の濃度のPVP-I₂による５分間以内の処置を記載している。この明細書は、PVP-I₂の１／２００から１／１０,０００希釈に対応するPVP-I₂の濃度範囲を規定する。PVP-I₂を通常の食塩水で１／２００に希釈したとき、得られる溶液のｐＨは４.６であり、遊離ヨウ素分子の濃度は１０ppmである。PVP-I₂を通常の食塩水で１／１０,０００に希釈したとき、得られる溶液のｐＨは５. ４であり、遊離ヨウ素分子の濃度は０−０.５ppmである。米国特許第５,１８５, ３７１号に記載の遊離ヨウ素分子、ｐＨおよび接触時間の組み合わせは、競合する生物荷重(bioburden)の存在下で目的の細菌およびウイルスのほとんどを効率よく不活性化するのには十分ではない。相当量のヨウ素および／または接触時間の延長が非脂質外膜ウイルスを完全に不活性化するのに必要であることが知られている(Highsmith F.A．et al.,Transfusion,volume 34，page 322，1994)。従って、現在、哺乳類眼組織のような敏感な生物材料を殺菌するヨウ素をベースにした方法の提供が必要である。ヨウ素をベースにした組成物は、敏感な生物材料の殺菌に処方されているが、これらの組成物にはいくつかの欠点がある。ヨウ素は有効な殺菌剤であり、他の殺菌剤と異なり、ヨウ素は適切なヒトの栄養および甲状腺機能に必要なものである。従来のヨウ素を基本にした組成物の難点は、ｐＨおよびイオン強度について好ましくない特徴を有すること、および、殺菌活性ヨウ素(即ち、遊離ヨウ素分子)が(ａ)殺菌剤ではない他の化学種と結合すること、および(ｂ)優勢ヨウ素種ではないことである。発明の要約本発明の目的は、遊離ヨウ素分子が５から３３０ppmの間の濃度で産生されるような条件下で、ヨウ素をベースにした殺菌剤を生成させることにより達成される。このようなヨウ素組成物は、眼組織と最も適合性が大となる水性環境で調製される。驚くべきことに、このような溶液は、生物学的材料を殺菌するだけでなく、目的材料に障害を与えることなく殺菌する。本発明の殺菌組成物は、ヒトの眼のような敏感な生物材料を安全にする、即ち、存在するかもしれない有害な細菌、ウイルスおよびウイルス様病原体を不活性化すると現在信じられている。ヨウ素を基本にした殺菌剤は当分野で既知である。本発明のヨウ素を基本にした殺菌剤の産生に使用する方法は、ヨウ素および過酸化水素と組み合わせたペルオキシダーゼの使用である。Kessler(米国特許第４,２２７,１６１号、米国特許第５,１６９,４４５号、米国特許第４,９９６,１４６号および米国特許第４,９３７,０７２号)、Orndoff(米国特許第４,３７０,１９９号)およびMontgomery(米国特許第４,５７６,８１７号)から、ペルオキシダーゼ、過酸化物およびヨウ素アニオンの組み合わせが水性環境で殺菌剤を形成することは既知である。本組み合わせの殺菌作用は、ペルオキシダーゼ、過酸化水素およびヨウ素が溶液中で反応したときに起こる酵素的反応に由来する。ペルオキシダーゼには、ヨウ化物から過酸化水素へ電子を伝達する作用のあることが知られている。過酸化水素は本反応により水に変わる。数種の可能性のある反応生成物がヨウ素アニオンに関して仮定され、それらは：１)ヨウ素遊離ラジカル(Nunez and Pommier，European Journal of Biochemistry，volume 7，pages 286-293，1969)；２)次亜ヨウ素酸イオン(Morrison and Schonbaum，Annual Review of Biochemistry，volume 45 ，pages 861-888，1976)；および３)ヨウジニウム(iodinium)イオン(Ohtaki，Na kagawa，Kimura and Yamazaki，Journal of Biochemistry，volume 256，pages 805-810，1981)を含む。ある条件下で、本反応は相当なレベルの遊離ヨウ素分子を産生し、該遊離ヨウ素分子が、存在する全てのヨウ素種の中で相当な割合を占めることが観察されている。“遊離ヨウ素分子”なる語句は、技術用語であり、チオ硫酸ナトリウムで滴定可能な、Ｉ₂として示される化学種である、元素状態のヨウ素を意味する。ペルオキシダーゼ、過酸化物およびヨウ化物を含む組成物を使用して、広いｐＨ範囲にわたり、所定レベルの遊離ヨウ素分子を産生することが可能であることが観察されている。これらの組成物中の利用可能な正確なヨウ素のレベルは、過酸化物、ヨウ化物、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、ｐＨおよび他の添加剤のレベルの関数である。ヒトの眼のような材料を殺菌する場合、毒性を最少化するために殺菌組成物は実質的に等張性でなければならないと理解されている。病原生物を効果的に不活性化するために必要な殺菌剤の濃度および時間は、最終環境中の遊離ヨウ素分子の濃度に依存する。遊離ヨウ素分子の適切な濃度は、疾病状態および処置レジメの関数である。一般的には、遊離ヨウ素分子の適切な濃度は５から３３０ppmの範囲である。病原生物の不活性化に必要な時間は、組成物中の遊離ヨウ素分子濃度、目的の病原体および生物材料のレベルの正の関数である。哺乳動物の眼を殺菌するために本発明を実施するには、いくつかの重要な検討事項がある。組成物は、ヒト涙液と等張にするのが非常に好ましい。あるいは、組成物のイオン強度を２８０から３００ミリオスモルの間に制御できる。当業者は、これらが、塩化ナトリウムのような試薬の組成物への添加により達成できることをよく理解している。ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースおよびポリビニルアルコールのようなポリマーは、当業者が熟知の多くの他のポリマーのように、眼科用組成物に頻繁に使用されている。それらの物質は、それらが所望の殺菌活性を達成するのに必要なよヨウ素の総濃度を実質的に増加させない形式で組み合わせる限り、本明細書に記載の組成物に適している。本明細書で意図される眼科用組成物は、ウイルス、細菌、真菌およびアカントアメーバーによる症状を含む。遊離ヨウ素分子は、遊離ヨウ素分子が目的の敏感な生体材料に接触した後、組成物中での加水分解を介して放散してゆく。あるいは、組成物中のヨウ素は、ヨウ素と結合するシクロデキストリンのような物質の添加、または組成物のヨウ素結合物質を含むカラムの通過、またはヨウ素をゆっくり還元させるのに作用するラクトースのようなヨウ素還元剤の組成物への添加を含む当業者が熟知の複数の手段により分離できる。発明の詳細な説明ヒトの眼の望ましくない病原生物の不活性化は、上昇した濃度の遊離ヨウ素分子が哺乳類の眼と適合性であるという予想外の発見に基づく。本発明によれば、遊離ヨウ素分子はその場で生成され、目的の眼組織と接触する。眼組織との接触が必要とされる遊離ヨウ素分子の濃度は、５から３３０ppm の間であり、これは２５ppmから１６６０ppmの間であるヨウ素アニオンの投入レベルに対応する。遊離ヨウ素分子の濃度は、存在するチオ硫酸滴定可能ヨウ素の少なくとも２５％はなければならない。当業者は、遊離ヨウ素分子対トリヨードの比および遊離ヨウ素分子対チオ硫酸滴定可能ヨウ素の比は可変であることを理解している。異なる濃度制約が、最少であれ最大であれ、遊離ヨウ素分子およびトリヨードの両方で、具体的適用に応じて存在し得ることも当業者は認識している。２５％が全ヨウ素に対する遊離ヨウ素分子の最少比として示されるが、存在できるチオ硫酸滴定可能ヨウ素の最大濃度に関して、本適用を含む本製剤に更なる限定を定めることも有用である。本限定は、本明細書における組成物の許容可能な毒物学的プロフィールを維持することに関して、有用である。チオ硫酸滴定可能ヨウ素の濃度は、遊離ヨウ素分子が、存在する全ヨウ素の４０％を超える場合でさえ、６５０ppmを超えてはならない。水性環境のｐＨは、ｐＨ５.０から７.１の間にあるように制御されなければならない。目的の生物材料を処置するための好ましいｐＨ範囲は、ｐＨ６.０から７.０である。遊離ヨウ素分子の適用頻度は広範囲に変わり得、組成物中の有機物質のレベルおよび疾病状態に依存する。具体的な疾病状態の処置における適用頻度は経験的に導くべきである。遊離ヨウ素分子は、ペルオキシダーゼ、ヨウ素および過酸化物源の使用により導入する。使用する遊離ヨウ素分子の濃度は、汚染病原体の不活性化に適切でなければならないことは明白である；しかしながら、主要な成分が遊離ヨウ素分子である、ヨウ素をベースにした殺菌剤を生成させることは、より明白でないが、同様に重要である。目的の材料と主に遊離ヨウ素分子を含むヨウ素組成物とを接触させることにより、化学的不適合性および毒性の可能性を減少させる。ヨウ素をベースにした殺菌剤が水性環境で活性化された後に、遊離ヨウ素分子はモルベースで、存在する全ヨウ素種の少なくとも２５％を含まなければならない。ヨウ化物のペルオキシダーゼ触媒酸化を含む反応物は、適切な結果を得るために制御しなければならない。この反応は、ヨウ素イオンを遊離ヨウ素分子に十分に変換するように確立すべきである。更に、過酸化水素の最初の濃度の少なくとも５０％が水に変換し、酵素反応の開始後に眼組織と接触し続ける過酸化水素の濃度が０.０１５％のレベルを超えないような反応条件を確立することが好ましい；これは眼の刺激を防止する。ヨウ化物を遊離ヨウ素分子に最適に変換させるためには、過酸化水素対ヨウ化物のモル比は、最初に１／２モル比で設定すべきである。このモル比が４を超えないように限定することが非常に好ましい。本発明の好ましい酸化剤は過酸化水素である。水性環境で混合したとき、過酸化水素源として作用するいかなる物質も本発明には適切である。本発明の目的で、および本明細書で使用するとき、“過酸化物源”なる用語は、金属過酸化物、過炭酸、過硫酸、過リン酸、過オキシエステル、過酸化尿素、過酸化酸、アルキル過酸化物、アシル過酸化物および過ホウ酸を含む、過酸化水素の前駆体として作用できるすべての物質の単独または組み合わせをも意味する。あるいは、メチル、エチルおよび他の分子量の多い過酸化物も過酸化水素源として使用できるが、これらは好ましくない。これらの物質の２種またはそれ以上の混合物も使用できる。過酸化水素の好ましい濃度は、ヨウ化物の酸化の開始前の最終組成物で０.００１から０.０１％の間である。本発明のドナー分子はヨウ素アニオンである。本発明に適するヨウ素アニオンの乾燥源は、ヨウ化ナトリウムおよびヨウ化カリウムおよび他のヨウ化物塩を含む。水性環境に溶解してヨウ素アニオンを産生する化合物がすべて本明細書で適している。ヨウ化物の単純な塩が好ましく、費用が安い点でも有利である。更に、それらは固体および液体状態で長い貯蔵寿命を有する。ヨウ素アニオンは、使用前に安定に保たれる場合、液体状態でシステムに提供される。特に、ヨウ素アニオンと過酸化水素を接触させないことが好ましい。ヨウ素を適当なレベルで産生するヨウ化物の濃度は、意図する製剤のｐＨに応じて変化する。加えて、必要なヨウ化物濃度は過酸化物対ヨウ化物の比に応じて劇的に変化する。１／２の過酸化水素対ヨウ化物の好ましい比で使用する場合、ヨウ素アニオンの好ましい範囲は、酵素反応開始前の最終再構成製剤中でリットル当り０.００１５から０.１０グラムの間である。しかしながら、眼の一般的防御についてのある疾病状態に関して、ヨウ化物を遊離ヨウ素分子へより低い効率で変換させ、従ってヨウ素アニオンの特に有効な範囲は、酵素反応開始前の最終再構成製剤でリットル当り０.０２５から０.３０グラムの間である。ｐＨおよび他の添加剤との組み合わせにおけるこれらのヨウ素アニオンの範囲は、５から３３０ ppmの遊離ヨウ素分子濃度を産生するものと予測される。本発明のペルオキシダーゼ酵素は、国際生化学連合および国際純正および応用化学連合により、酵素委員同定番号E.C．1.11.1.7と同定されているが、E.C．1. 11.1.8に属するものも使用し得る。ペルオキシダーゼのこれらのクラスは、乳( ラクトペルオキシダーゼ)、ダイズ、およびヒト白血球(ミエロペルオキシダーゼ )を含む種々の源から得ることができる。これらのE.C.2クラスの中で、さらに本明細書で定義した適切なペルオキシダーゼとして必要な要件は、４から７.１のｐＨ範囲でヨウ化物をヨウ素に酸化できることである。本適用に最も安価なペルオキシダーゼは、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびダイズペルオキシダーゼである。セイヨウワサビ、乳またはヒト白血球または他の源からクローン化されたペルオキシダーゼは、本適用のペルオキシダーゼの源として適していると予測される。加えて、化学修飾したペルオキシダーゼが本明細書での使用に適していることが観察されている。アミノ、カルボキシルまたは炭水化物部分への修飾により、本適用に包含させる適当な触媒的試薬が得られる。ペルオキシダーゼへの化学修飾は、酵素分子同士の、固体表面へのまたは他のタンパク質への架橋を含む。架橋に使用する化学試薬は、グルタールアルデヒド、マレイミド、スクシンイミド、カルボジイミド、ジカルボキシレート、活性化グリコール、イミドエステル、光反応性アジドおよび当業者に既知の他の試薬を含む。ペルオキシダーゼの前記の形態は、商業的に提供される凍結乾燥ペルオキシダーゼのような乾燥形態で、または大部分水性の環境下で提供される。ペルオキシダーゼが水性環境下で提供される場合、それは典型的にグリセロール、デキストランまたは他のポリオールのような安定性を増加させる媒体中に、または所望によりカルシウムを含む適当な緩衝性媒体中の糖に含ませる。本明細書のペルオキシダーゼは、それが乾燥状態でまたは水性環境中で供給されても、多種の添加剤と組み合わせ得る。ペルオキシダーゼを使用できる濃度範囲は、最終組成物中、０.００００５から０.０００５mg／mLの間である。好ましい範囲は最終組成物中、０.００５から０.０１mg／mLの間である。本明細書で意図する組成物中に包含させるのに適した緩衝剤は、グリシン−グリシン・ＨＣｌ、フタル酸水素カリウム−フタル酸、クエン酸−Ｎａ₂ＨＰＯ₄、クエン酸−ＫＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₃ＢＯ₃−ジエチルバルビツール酸−ＮａＰＨ、クエン酸−クエン酸ナトリウム、ジメチルグルタール酸−ジメチルグルタル酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、コハク酸−コハク酸ナトリウム、フタル酸水素カリウム−フタル酸二カリウム、カコジル酸ナトリウム−カコジル酸、マレイン酸水素ナトリウム−マレイン酸二ナトリウム、Ｎａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄、炭酸水素ナトリウム−５％ＣＯ₂、イミダゾール−イミダゾール・ＨＣｌ、ホウ酸−ホウ酸ナトリウム、および、良好な緩衝液として当業者に既知のトリス、MES、BIS -TRIS、ADA、ACESおよびPIPESで緩衝化された、水および水性アルコール混合物を含む。このヨウ素組成物は、哺乳類眼組織に接触させた後に眼から濯ぎ落とし得る。しかしながら、本明細書に記載の組成物の一つの利点は、遊離ヨウ素分子の濃度レベルが他の全ヨウ素種と対比して制御されるため、濯ぎ落とす必要がないことである。本明細書に含まれる例は、この事実を証明する。加えて、最大ヨウ素レベルおよび過酸化水素のレベルも、非刺激性治療を行えるように制御される。本明細書に記載の非刺激性殺菌剤は、過酸化水素対ヨウ化物のモル比が４を超えず、ヒトの眼に適用する前の最大過酸化水素濃度レベルが０.０１５％であるように、ペルオキシダーゼ、ヨウ化物および過酸化物を水性媒体中で酵素的に反応させて得られる、モルベースで少なくとも２５％の遊離ヨウ素分子を有し、遊離ヨウ素分子の濃度が５から３３０ppmの間のものである。３.５から８.５の範囲のｐＨの眼科用医薬も存在するが、眼科用医薬の好ましいｐＨは、４.５から７.１の間である。前記の本発明の操作上の原理および利点は、以下の詳細な実施例を考察して、より完全に認識されるであろう。実施例実施例１ヨウ素ベースの組成物を主に遊離ヨウ素分子からなるように調製した。これら組成物はpＨ５.５でセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ヨウ化ナトリウムおよび過酸化水素をインキュベーションすることにより、これらの物質を一定時間インキュベーションし、次いで得られる製剤の分析的特徴付けを実施して調製される。下記３つのヨウ素種の濃度を測定した：遊離ヨウ素分子、三ヨウ化物およびヨウ素陰イオン。遊離ヨウ素分子はGottardi(Gottardi W.，Fresenius Z．Anal．C hem.，volume 314，page 582，1983)の方法で電位差的に測定した。２つのコーニングモデル３４５ｐＨメーターを用い電位差測定を行った。用いられるコーニング電極には、標準的な白金電極、基準電極およびヨウ素イオン選択電極を含んだ。チオ硫酸ナトリウム滴定を用いて三ヨウ化物を測定し、総ヨウ素量を測定し、次いで総ヨウ素量から遊離ヨウ素分子量を差し引いた。ヨウ素イオン濃度はコーニングヨウ素イオン選択電極を用いて直接測定した。ｐＨ５.５のクエン酸バッファーを用い調査する条件は３つあった。全条件において、終濃度５μg／mLのセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いた。第一の条件(処理番号１)は、リッターあたり６０mgのヨウ化ナトリウム濃度を用い、過酸化水素源として過炭酸ナトリウム(０.０２５ｇ／ｌ)を用い確立した当モルの過酸化水素を用いた。条件２および３(処理番号２および３)は、２００および４５０mg／ｌのヨウ素化ナトリウムならびに０.０８３３および０.１８７ｇ／ｌの過炭酸ナトリウムをそれぞれ用いた。その溶液を６０分間インキュベートし、分析的測定を行った。結果を以下の表１に示す。表Ｉに示すデータから我々が導き出した結論は、遊離ヨウ素分子を主に含むペルオキシダーゼベースのヨウ素殺菌剤を得ることが可能であるということである。表のデータは、３つの優勢ヨウ素種：遊離ヨウ素分子、ヨウ素陰イオンおよび三ヨウ化物の濃度を示す。用いる条件下の次亜ヨウ素酸およびヨウ素酸の濃度は、表１に挙げた３つのヨウ素種濃度と比較すると殆ど無視できる。実施例２ヨウ素ベースの組成物を主に遊離ヨウ素分子からなるようにｐＨ７.０で調製した。これら組成物はｐＨ７.０でセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ヨウ化ナトリウムおよび過酸化水素をインキュベーションすることにより調製される。これらの成分を一定時間インキュベーションし、次いで分析的測定を得られた組成物で行った。用いる化学成分の重量および容量は、無水クエン酸０.２ｇ、ヨウ化ナトリウム４５０mg、３％過酸化水素１.３ml、重炭酸ナトリウム１００mgおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ３mgであった。組成物を１５分間インキュベートし、実験１に記載の分析的測定を行った。結果を以下に示す：我々が導き出した結論は、ｐＨ７.０において遊離ヨウ素分子を主に含むヨウ素ベースの殺菌剤を得ることが可能であるということである。実施例３実験１に記載の３つの製剤に試験を行い、生物負荷(bioburden)存在下、それらのバクテリア等の病原体の不活性化の有効性を測定した。１０⁶赤血球(RBC)/m L含むスタフィロコッカス・アウレウス懸濁液を調製した。RBCの細胞形態に対するこれら製剤の有する有効性を顕微鏡観察により評価した。対照実験は１０％ＰＶＰ−Ｉ₂の希釈液を用いて行った：希釈は１／２０〜１／１０,０００の範囲である。全血液をFicollリンパ球単離方法により処理した。赤血球(RBC)を回収し、リン酸緩衝性塩水で一度洗浄し、５℃でA1severs溶液に濃度３.５×１０⁹RBC／mL で保った。ｐＨ７.０の０.２５モーラーリン酸バッファー(PBDW)５mLでスタフィロコッカス・アウレウスのスラントからの増殖を洗浄し、PBDW１００mLに加えることにより寒天プレートに接種した。この懸濁液１mLを７つの各栄養寒天プレートに加え、それを３５−３７で１８−２４時間インキュベートした。バクテリアコロニーをPBDW１mLおよび殺菌済み綿棒を用い寒天表面から取り除いた。この懸濁液を標準化し、Milton-Roy Spec20スペクトロホトメーターを用いて約１０⁹cfu／mLとした。各試験殺菌剤１００mLを水浴中２５℃にした。検定開始２分前、RBCを１０⁶RB C／mLの量で加えた。スタフィロコッカス・アウレウスを２.０×１０⁸cfu／mLの量で加えた。試料１mLを３０、６０、１２０および３００秒後回収し、０.５％チオ硫酸１０mLで中和した。中和試料１mLおよび０.１mLを４つ同じPlate Count Agarに注ぎ接種した。この実験では、少なくとも１０⁶cfu／ｍのスタフィロコッカス・アウレウスを不活性化する殺菌能を測定した。殺菌剤全てが、１／１,０００希釈の１０％ＰＶＰ−Ｉ₂(すなわち、総ヨウ素１０ppm)を除き、ある時間の枠内でスタフィロコッカス・アウレウスに有効であった。ペルオキシダーゼベースのヨウ素殺菌剤は、遊離ヨウ素分子量が６３および１１４ppmで３０秒以内にスタフィロコッカス・アウレウスを６対数(log)減少した：遊離ヨウ素分子量が１３ppmではペルオキシダーゼベースのヨウ素殺菌剤は、スタフィロコッカス・アウレウスを６対数不活性化するために５分必要であった。ペルオキシダーゼベースのヨウ素殺菌剤RBCで処理したRBCの顕微鏡観察では、形態変化および細胞数減少は見られなかった。１０％ＰＶＰ−Ｉ₂で処理したRBC は、１／１０００希釈した１０％ＰＶＰ−Ｉ₂試料を除いて、変色がみられ、数の減少なしに縮んだ。１０％ＰＶＰ−Ｉ₂の１／１０００希釈中の遊離ヨウ素分子量を測定すると６ppmであった。この実験から、主に遊離ヨウ素分子からなる厳密に制御された製剤が、両方とも有効な殺生物剤として、個々の細胞および組織などの感受性生体物質を非刺激性のままで作用することが明らかである。実施例４酵素ベースのヨウ素殺菌剤を試験し、生物負荷存在下のウイルス等の不活性病原体に対するその有効性を測定した。酵素ベースのヨウ素殺菌剤が得られ、ヒト血清中の赤血球の高濃度存在下、ウイルス不活性能を測定した。殺菌剤は、ｐＨ５.５の０.０５モーラークエン酸バッファー１Ｌにヨウ化ナトリウム４５０mgを溶解し、次いで同時にダイズペルオキシダーゼ１０mgを溶解することにより調整した。この溶液を１０分間インキュベートし、次いでこの製剤の殺ウイルス効力を測定した。全血液をFicollリンパ球単離方法により処理した。赤血球(RBC)を回収し、リン酸緩衝性塩水で一度洗浄し、５℃でAlsevers溶液で濃度６.５×１０⁹RBC／mL で保った。組織培養感染用量５０(TCID₅₀)は、一連の培養の５０％が感染するウイルス分子の濃度である。約１０⁷ユニットのTCID₅₀の水庖性口内炎ウイルスを１０⁶RBC ／mL含む保存したヒト血清試料に添加した。この試料を５分間４℃および２５℃ で殺菌剤と共にインキュベートした。５分後、ウイルス力価を以下のように測定した。同じもの４つにおいて、１０％ウシ胎児血清および０.１％チオ硫酸ナトリウムを含む最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸溶液に試料を連続的に５倍希釈した。希釈溶液を約８０％コンフルエントのVero細胞(ATCC CRL81)を含む９６ウェルプレートに接種した。この検定に用いる最も低い希釈は、もとの処理血清の１：５倍であった。培養は５％ＣＯ₂雰囲気下３７℃で３日間インキュベートし、各ウェルの細胞病理学的有効性を調べた。４℃および２５℃の両方における細胞病理学的効果は、偽感染およびヨウ素処理組織培養ウェルでは観察されなかった。これは、殺菌剤は感受性生体物質の存在下、脂質で覆われたウイルスの不活性化に有効であることを示唆する。赤血球の細胞形態におけるこれら製剤の有する作用を顕微鏡観察により評価した。赤血球の顕微鏡観察により、酵素ベースのヨウ素殺菌剤が形態的変化またはRBC数の減少の原因ではないことが示唆された。処理した細胞は変色も縮小も見られなかった。実施例５懸濁細胞(CEMリンパ芽球白血病細胞ATCC CCL-21)を、２０％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640で約２×１０⁶細胞／mLの定常期まで増殖させ、次いで遠心分離により濃縮した。次いで、細胞あたりの遊離ヨウ素分子が様々な割合となるように、これらの細胞を遊離ヨウ素分子で処理した(表５ａ参照)。付着細胞(Vero)をＴ−７５フラスコでコンフルエントまで増殖させた。細胞をトリプシン処理で取り除き、次いで遠心分離により濃縮した。次に、細胞あたりの遊離ヨウ素分子が様々な割合となるように、これらの細胞を遊離ヨウ素分子で処理した(表５ｂ参照)。細胞の生存能力の割合は、細胞あたりの遊離ヨウ素分子量に逆比例していると思われる。細胞あたりの遊離ヨウ素分子の割合の上限は明らかである。このデータは、抗菌的であるが細胞毒性とはならない濃度の遊離ヨウ素分子に感受性の生体物質をさらすことが可能であることを強く示す。実施例６酵素ベースのヨウ素殺菌剤が得られ、３ヶ月のオスおよびメスのニュージーランド白ウサギの目で細菌不活性能を評価した。殺菌剤は処理１に記載の組成物と同一であり、実施例１においてｐＨ６.０に調節するために十分な過炭酸ナトリウムを添加し、それにより４６〜３２ppmの遊離ヨウ素分子量に低下させた。殺菌剤の試験滴下の前、全試験および対照の目には重大な目の炎症はないと診断された。事前に存在する角膜の傷を検出または確認するために、目をフルオレセイン染色し、紫外線で暗室で観察した。少量の殺菌剤試料(０.１ml)を、各ウサギの左目の低いほうの結膜嚢に滴下し、１秒間まぶたを閉じさせた。各ウサギの反対の目は処置しないままとし、比較対照とした。目は、試験物滴下後１時間目に目の反応を調べ、再び１、２、３、４、７、１４および２１日目に調べた。フルオレセイン染色の方法は時間をあけて各時点で行った。フルオレセイン１滴を点眼剤で投与し、組織損傷を評価した。１、１４および２１日目のこれら試験の結果を以下の表６に示す。角膜の濁りまたは虹彩炎は試験期間中、何れの動物にも観察されなかった。最小限の一時的な結膜炎が処置後２４時間以内に２／６の動物に観察された。この病状は２日までには治まった。目の組織周辺の付随する目の腫瘍または炎症は何れの動物にも観察されなかった。導かれる結論は、殺菌剤は目の刺激の原因とはならないことであった。２番目の実験は、１０⁶コロニー形成単位のスタフィロコッカス・アウレウスを含む塩水０.１mlを直接上記使用の各ウサギの左目に滴下するものであった。五分経過後、それぞれの目に殺菌剤０.１mLを滴下した。殺菌剤を６時間ごとに、２４時間滴下し、その後各ウサギの左目を綿棒で拭った。綿を寒天プレートに接種し、その寒天プレートを３７℃で５日間インキュベートした。何れのウサギの目からもスタフィロコッカス・アウレウスのコロニーは観察されなかった。実施例７この実験から、この出願の明細書の範囲内であれば高濃度の遊離ヨウ素分子が必ずしも目の刺激物ではないことが明らかである。実施例１に記載の３つの酵素的ヨウ素組成物を３０試料づつを調製し、各製剤型の試料２つを３日間毎日新たに再構成した。各試料の遊離ヨウ素分子濃度を測定し、遊離ヨウ素分子の平均濃度が次のように測定された：処理１では５３ppm；処理２では１６２；および処理３では３２４。３日間に渡り、２つの異なる投与レジメを用いＮＺアルビノウサギにおける遊離ヨウ素分子の目の刺激性の測定に、これら３つの異なる処置型 (１、２および３)を用いた。ウサギを６つのグループに分けた：各グループは４匹のウサギからなる。グループＩおよびIIは、遊離ヨウ素分子５３ppmを含むヨウ素組成物処理Ｉを投与した。グループIIIおよびIVは、遊離ヨウ素分子１６２ppmを含むヨウ素組成物処理 IIを投与した。グループＶおよびVIは、遊離ヨウ素分子３２４ppmを含むヨウ素組成物処理IIIを投与した。処理グループＩ、IIIおよびＶは、３日間２時間ごとに４滴投与した；これら動物の１日あたりの投与数の合計は４回、すなわち１６滴であった。処理グループII、IVおよびVIは３日間１時間ごとに８滴投与した；これら動物の１日あたりの投与数の合計は８回、すなわち３２滴投与した。 Draize試験(Draize J．H.，G．Woodward,H．0．Calvery，J．Pharmacol，Exp ．Ther．Vol．82，pp．377-390，1944)に定義され、結膜の充血および結膜浮腫、目やに、虹彩炎および角膜(cornneal)混濁を含む目の損傷を評価する尺度を用い目を調べた。目の刺激全体の大きさは０〜１１０であり、以下の分位を含む：０.０−０.５(刺激せず)、０.６−２.５(事実上非刺激)、２.６−１５.０(最小限の刺激)、１５.１−２５.０(わずかな刺激)、２５.１−５０.０(中程度の刺激 )、５０.１−８０.０(強度の刺激)、８０.１−１００.０(極度の刺激)および１００.１−１１０.０(最大限の刺激)。刺激結果を以下の表７ａに示す。ベタジン希釈液の既知の目の染色との比較により目の染色をもまた評価した。希釈してないベタジンおよび７つに分けた水によるベタジンの連続二倍希釈液を、範囲０〜４.０の尺度として染色の比較基準に用いた。この検討の結果から、処置した何れの日においても試験した何れの型または処置レジメのために角膜または結膜何れも染まらなかったことが明らかである。この検討で試験した遊離ヨウ素分子の調剤によりＮＺウサギの目は最小限の刺激となった。これら調剤は、遊離ヨウ素分子濃度または処置レジメにかかわらず、何れのウサギの角膜にも全く損傷を与えなかった。遊離ヨウ素分子の最も高い濃度で試験した３つの処置型において最も刺激が見られたが、その刺激の程度は最小限であった。処置レジメの間全く異なる刺激はなかった(３日間の４滴と８滴において)。これらの調剤で誘発される最小限の目の刺激のうち幾つかは、異なる製剤の低いｐＨが原因であるかもしれない。これら調剤のｐＨは酸性の範囲である(処置１-ｐＨ＝４.７５、処置２-ｐＨ＝４.９０、処置３-ｐＨ＝５.０１) 。これら定義された遊離ヨウ素分子組成物により、いつでも何れのウサギの目の角膜または結膜は染まらなかった。全角膜は透明のままであり、全結膜は白いままであった。３つの処置製剤の色がヨウ素染色測定に使用するベタジン希釈液、Ｉ₂の組成物３２４ppm(処置III)の色と適合することから、０.６２５％ベタジンに相当すると思われ、Ｉ₂の組成物１６２ppmは０.３１２５％ベタジンに相当すると思われ、そしてＩ₂の組成物５３ppmは０.１５６２５％ベタジンに相当すると思われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/18 Ａ６１Ｋ 47/18 47/22 47/22 47/42 47/42 Ａ６１Ｐ 27/02 Ａ６１Ｐ 27/02 31/04 31/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．遊離ヨウ素分子が殺菌剤に存在する主要ヨウ素種であるように過酸化水素対ヨウ化物のモル比が約０.５と４.０の間で維持され、過酸化水素の最大濃度が０.０１５％であり、チオ硫酸滴定可能ヨウ素の最大濃度が６５０ppmである、複数のヨウ素種を有する非刺激性水性殺菌剤を生成させるために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミレロペルオキシダーゼおよびダイズペルオキシダーゼからなる群から選択されたヨウ化物酸化ペルオキシダーゼ、過酸化水素源およびヨウ素源を必須として含む組成物を水性媒体中で混合させる段階を含んでなる、哺乳動物の眼の病原微生物を殺菌するための治療的処置法。２．遊離ヨウ素分子がモルベースで複数のヨウ素種の少なくとも２５％を構成する、請求項１記載の方法。３．該組成物が更に該殺菌剤のｐＨをｐＨ４.５から７.１に維持するための緩衝剤を含む、請求項２記載の方法。４．ｐＨが６.０から７.１の間で維持される、請求項３記載の方法。５．該緩衝剤がグリシン、フタル酸、クエン酸、リン酸、ホウ酸、バルビツール酸、グルタール酸、ジメチルグルタール酸、酢酸、酢酸ナトリウム、コハク酸 −コハク酸ナトリウム、カコジル酸、マレイン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウムまたは、溶液中に炭酸を発生させる他の試薬、イミダゾールおよび良好な緩衝剤として当業者に既知の以下の緩衝剤トリス(トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン)、ＭＥＳ(２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸)、BIS-TRIS(ビス [２−ヒドロキシエチル]イミノ−トリス[ヒドロキシメチル]メタン：２−ビス[ ２−ヒドロキシエチル]アミノ−２−[ヒドロキシメチル]−１,３−プロパンジオール)、ＡＤＡ(Ｎ−[２−アセトアミド]−２−イミノジ酢酸；Ｎ−[カルバモイルメチル]イミノジ酢酸)、ACES((２−[(２−アミノ−２−オキシエチル)−アミノ]エタンスルホン酸；Ｎ−[２−アセトアミド]−２−アミノエタン−スルホン酸)およびPIPES(ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス[２−エタンスルホン酸]およびピペラジンジエタンスルホン酸)からなる群から選択される、請求項３記載の方法。６．遊離ヨウ素分子が該混合物注に生成する主要ヨウ素種であるように過酸化水素対ヨウ化物のモル比が約０.５と４.０の間であり、過酸化水素の最大濃度が０.０１５％である、水との混合物中に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミレロペルオキシダーゼおよびダイズペルオキシダーゼからなる群から選択されたヨウ化物酸化ペルオキシダーゼ、過酸化水素源およびヨウ素源を含んでなり、該混合物の過酸化水素の最大濃度が０.０１５％であり、チオ硫酸滴定可能ヨウ素の最大濃度が６５０ppmである、眼の処置用の眼科用非刺激性ヨウ素抗感染薬。７．遊離ヨウ素分子がモルベースで複数のヨウ素種の少なくとも２５％を構成するように複数のヨウ素種が殺菌剤中で形成される、請求項６記載の眼科用非刺激性ヨウ素医薬。８．遊離ヨウ素分子が５から３３０ppmの間である、請求項７記載の眼科用非刺激性ヨウ素医薬。９．該組成物が更に該殺菌剤のｐＨをｐＨ４.５から７.１に維持するための緩衝剤を含む、請求項８記載の眼科用非刺激性ヨウ素医薬。１０．ｐＨが６.０から７.１の間で維持される、請求項９記載の眼科用非刺激性ヨウ素医薬。１１．該緩衝剤がグリシン、フタル酸、クエン酸、リン酸、ホウ酸、バルビツール酸、グルタール酸、ジメチルグルタール酸、酢酸、酢酸ナトリウム、コハク酸−コハク酸ナトリウム、カコジル酸、マレイン酸水素ナトリウム、炭酸水素ナトリウムまたは、溶液中に炭酸を発生させる他の試薬、イミダゾールおよび良好な緩衝剤として当業者に既知の以下の緩衝剤トリス(トリス(ヒドロキシメチル) アミノエタン)、ＭＥＳ(２−[Ｎ−モルホリノ]エタンスルホン酸)、BIS-TRIS(ビス[２−ヒドロキシエチル]イミノ−トリス[ヒドロキシメチル]メタン：２−ビス [２−ヒドロキシエチル]アミノ−２−[ヒドロキシメチル]−１,３−プロパンジオール)、ΛＤＡ(Ｎ−[２−アセトアミド]−２−イミノジ酢酸；Ｎ−[カルバモイルメチル]イミノジ酢酸)、ACES((２−[(２−アミノ−２−オキシエチル)−アミノ]エタンスルホン酸；Ｎ−[２−アセトアミド]−２−アミノエタン−スルホン酸)およびPIPES(ピペラジン−Ｎ,Ｎ'−ビス[２−エタンスルホン酸]およびピペラジンジエタンスルホン酸)からなる群から選択される、請求項１０記載の眼科用非刺激性ヨウ素医薬。