JP2001525674A - Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの全身性獲得耐性をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シグナル伝達経路を介した植物における全身性獲得耐性(SAR)の伝達に関連する遺伝子に関する。遺伝子は、シグナル伝達経路においてサリチル酸よりも上流で作用するタンパク質をコードする能力により特徴づけられる。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 Arabidopsisの全身性獲得耐性をコードする遺伝子 発明の属する技術分野 本発明は、植物の全身性獲得耐性のためのシグナル伝達経路に特異的な遺伝子 に関する。 関連出願のクロス・リファレンス 本出願は、先に1997年５月14日に出願された同時係属中の米国仮出願第60/046 ,475号の恩典を主張する。 発明の背景 全身性獲得耐性(SAR)をもたらす植物におけるシグナル伝達経路は、多くの段 階からなる。第１段階は、植物が耐性である病原体の葉への最初の感染により壊 死病変の形成を引き起こす過敏反応(HR)が生じる、誘導段階または免疫化段階で ある。しかし、SARが壊死を伴わずに生じる例もいくつかある。Cameronら、“Bi ologically induced systemic acquired resistance in Arabidopsis thaliana ”Plant J 5:715-725(1994);Kellerら、“Physiological and molecular charac teristics of elicitin-induced systemic acquired resistance in tobacco”P lant Pysiol 110:365-376(1996)。この誘導段階の間に、一般にSAR遺伝子と呼ば れる病原関連(PR)タンパク質の遺伝子の集合を接種した葉における発現が、タバ コおよびキュウリ(Kuc'，J.，Bioscience 32:854-856(1982);Wardら、“Coordin ate gene activity in response to agents that induce systemic acquired re sistance”Plant Cell 3:49-59(1991))およびArabidopsis(Uknesら、“Acquired resistance in Arabidopsis”Plant Cell 4:645-656(1992);Uknesら、“Biolog ical induction of systemic acquired resistance in Arabidopsis”Mol Plant -Microbe Interact 6:692-698(1993))において生じる。この段階の間にサリチル 酸の蓄積(10から15倍増大)もおこなわれる。Yalpaniら、“Salicylic acid is a systemic signal and an inducer of pathogenesis-related proteins in vir us-infected tobacco”Plant Cell 3:809-818(1991);Malamyら、“Salicylic ac id:Alikely endogenous signal in the resistance response of tobacco to vi ral infection”Science 250:1002-1004(1990);Metrauxら、“Increase in sali cylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber”Sci ence 250:1004-1006(1990);Uknesら、Plant Cell 4:645-656(1992);Vernooijら 、“Salicylic acid is not the translocated signal responsible for induci ng systemic acquired resistance but is required in signal transduction” Plant Cell 6:959-965(1994)。 師部可動性シグナルは壊死をおこした葉から植物の他の部分に移動してSARを 確立することが報告されている。Jennes，AおよびKuc'，J.，“Grafttransmissi on of systemic resistance of cucumber to anthracnose induced by Colletot richum lagenarium and tobacco necrosis virus”Phytopathology 69:753-756( 1979);Guedesら、“Induced systemic resistance to anthracnose in cucumber as influenced by the location of the inducer inoculation with Colletotr ichum lagenarium and the onset of flowering and fruiting”Physiol Plant Pathol 17:229-233(1980);Tuzun，S.およびKuc'，J.，“Movement of a factor in tobacco infected with Peronospora tabacina Adam which systemically pr otects against blue mold”Physiol Plant Pathol 26:321-330(1985)。 ¹⁸Ｏ標識を利用したタバコモザイクウイルス(TMV)を接種したタバコの葉の研 究によって、植物全身の葉の中のサリチル酸の大部分が最初に感染した葉で合成 されたものであることが明らかになり、サリチル酸そのものが可動性SARシグナ ルであることを裏付けている。Shulaevら、“Is salicylic acid a translocate d signal of systemic acquired resistance in tobacco”Plant Cell 7:1691-1 701(1995)。しかし、キュウリを用いた他の研究(Rasmussenら、“Systemic indu ction of salicylic acid accumulation in cucumber after inoculation with Pseudomonas syringae pv．syringae”Plant Physiol 97:1342-1347(1991))、ま たは細菌性NahGサリチル酸水酸化酵素遺伝子を含む（そのため激減したサリチル 酸の量を示す）トランスジェニックタバコによる接木実験により、サリチル酸 は可動性シグナルではないことが示唆された。たとえば、NahGの台木は、TMVを 接種された場合、野生型の接ぎ穂で感知されてその接ぎ穂が次の病原体攻撃に対 して耐性となるような師部可動性シグナルを生産することが可能である。Gaffne yら、“Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acqui red resistance”Science 261:754-756(1993)。これらの結果は、サリチル酸がS ARの誘導/免疫化段階において必要でないことを示唆している。 SARに至るシグナル伝達経路の第２段階は確立段階であり、植物全身の葉にお ける可動性シグナルの感知を含む。この段階は、１次壊死病変の周りに誘導され たものと同じSAR遺伝子の集合の発現、および誘導の段階において最初の葉に誘 導されたものよりも低い量ではあるがサリチル酸の蓄積を特徴とする。 シグナル伝達経路における最後の段階は、植物が第２の、通常毒性の病原体に 攻撃されたときにおこり、その病原体に対して、あたかも非病原性のもののよう に反応する、発現の段階である。Kuc'，J.，Bioscience 32:854-856(1982)。 NahGサリチル酸水酸化酵素遺伝子生産物の発現のためにサリチル酸の量が非常 に低い植物を用いた最近の研究(Gaffneyら、Science 261:754-756(1993);Vernoo ijら、Plant Cell 6:959-965(1994);Delaneyら、Science 266:1247-1250(1994)) によって、サリチル酸はSARの確立段階および発現段階で必要なばかりではなく 、非適合性のHR相互作用の間においても、さらに病気の拡がりを制限するための 適合性相互作用の間でさえも必要であることが示された。Arabidopsis SAR-欠損 変異体nim1(Delaneyら、Science 266:1247-1250(1994))およびnpr1(Caoら、“Ch aracterization of an Arabidopsis mutant that is nonresponsive to inducer s of systemic acqired resistance”Plant Cell 6:1583-1592(1994))にも毒性 病原体に対する病気感受性の増加が見られ、一般的な病気に対する耐性における サリチル酸の役割を確認した。SAR遺伝子の発現量およびサリチル酸量の上昇し た変異体cpr1植物（PR遺伝子の恒常的発現株）は通常毒性の病原体に耐性がある ことが示され(Bowlingら、“A mutation in Arabidopsis that leads to consti tutive expression of systemic acquired resistance”Plant Cell 6:1845-185 7(1994))、病気耐性におけるサリチル酸の蓄積の重要性を支持して遺伝子上の証 拠をさらに提供している。 上に略述したように、そのSARを確立する能力に影響を受けた数多くのArabido psis変異体が単離された。しかしながら、これらの変異体は一般的な防御反応も また減少しており、そのため、これらの植物における病変はSARに特異的なもの ではない。 脂質転移タンパク質(LTP)もまた植物におけるSARの確立に重要であると確認さ れている。LTPは多くの植物種からクローン化されており、胚形成の発達および 上クチクラのロウの堆積を含むプロセスの範囲で機能すると言われている(Pyee およびKolattukudy，“The gene for the major cuticular wax-associated pro tein and three homologous genes from broccoli(Brassica oleracea)and thei r expression patterns”Plant Journal 7:49-59(1995);Toonenら、“At LTP1 l uciferase expression during carrot somatic embryogenesis”Plant Journal 12:1213-1221(1997))。本発明に関するところでは、LTPは既に植物の防御反応に 関与している。たとえば、２種類の単子葉植物種から得られたLTPは、抗菌活性 を有することが示され(Molinaら、“Lipid transfer proteins(nsLTPs)from bar ley and maize leaves are potent inhibitors of bacterial and fungal plant pathogens”FEBS Letters 316:119.122(1993))、オオムギLTPを発現するように 遺伝子操作したトランスジェニックタバコおよびArabidopsisは、病原体に対す る寛容の上昇を示した(MolinaおよびGarcia-Olmedo，“Enhanced tolerance to bacterial pathogens caused by the transgenic expression of barley lipid transfer protein LTP2”Plant Journal 12:669-675(1997))。これらの脂質転移 タンパク質がSARシグナル伝達において作用することは示されていない。 SAR変異体についての以前のスクリーニングは、SARシグナル伝達経路において サリチル酸と同じ位置またはこれよりも下流で作用することが示されている2,6- ジクロロイソニコチン酸(INA)を噴霧することにより植物全体にSARを誘導するこ とによって、SARに関与する最初のシグナル生成ステップを飛び越した。 SARにおけるサリチル酸の可能性のある役割に関する報告、および報告されたS AR遺伝子の発現とSARとの相関関係に関わらず、SARの誘導、転移および発現をお こすような分子メカニズムに関する利用可能な情報は実質的にない。このように 、SARシグナル伝達経路の一部であり、サリチル酸の作用部位の上流で作 用するタンパク質をコードする遺伝子の単離および特徴づけの必要があった。 ここで、シグナル伝達経路においてサリチル酸よりも上流で作用するタンパク 質をコードする遺伝子が植物におけるSARに影響を与えることが見いだされてお り、これらの遺伝子を単離する方法を本明細書で開示する。特に、シグナル伝達 経路に関与する新規の脂質転移タンパク質をコードするdir-1遺伝子を今回単離 および特徴づけした。この遺伝子は植物におけるSARの確立に関するメカニズム を決定するための試薬として、また遺伝子操作により植物に病気に対する耐性を 獲得させるための試薬として有用である。SAR変異体の遺伝子スクリーニングの 方法も開発され、これによりSARシグナル伝達経路全体にわたるSAR-欠損変異体 、特にSARシグナル伝達経路においてサリチル酸の作用位置よりも上流で作用す るタンパク質をコードするSAR変異体の検出が可能になった。この遺伝子から翻 訳されたタンパク質は、そのタンパク質に対する抗体を生産するために有用であ る。この抗体は、植物をたとえばSARシグナル伝達遺伝子についてスクリーニン グするための試薬として有用である。 発明の概要 本発明は、植物の全身性獲得耐性を増大させることができるタンパク質をコー ドする核酸分子に関するものである。このタンパク質はシグナル伝達経路上のサ リチル酸の作用位置よりも上流で作用する。 本発明はまた、dir-1遺伝子を含むベクター核酸に関するものである。 本発明はまた、dir-1遺伝子を含むベクターで形質転換した植物細胞を更に含 む。 本発明はさらに、植物に全身性獲得耐性を与える方法からなる。 本発明はまた、シグナル伝達経路においてサリチル酸の上流で作用するタンパ ク質をコードするSAR変異体を単離する方法からなる。 本発明の上記および他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明および添 付の請求の範囲を参照することによりさらによく理解されるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、dir-1遺伝子のヌクレオチド配列を表す。 図２は、dir-1脂質転移タンパク質のアミノ酸配列を表す。 発明の詳細な説明 本発明は、SARシグナル伝達経路上のサリチル酸の作用位置よりも上流で作用 するタンパク質をコードし、SARシグナル伝達に関与する遺伝子の単離に関する 。経路上のサリチル酸の作用位置よりも上流で作用するタンパク質をコードし、 SARシグナル伝達に関与する遺伝子を単離するためには、以下の方法が用いられ る。すなわち、実施例１に記載されるような技術を用いて、野生型の植物および T-DNA形質転換した植物を成長させ、病気の症状について観察する。SAR変異体を 単離し、実施例１に記載される方法でSAR応答能試験をおこなう。次いで、実施 例１に記載されるように、SAR変異体について、経路におけるサリチル酸の作用 点との関係で変異体遺伝子の位置を決定するための試験をおこなう。SAR変異体 遺伝子と同型接合性であり、遺伝子が経路上のサリチル酸の作用部位よりも上流 で作用するタンパク質をコードすることが見いだされている植物からDNAを単離 してcDNAを単離するためにプローブし、実施例２に記載された技術を用いて配列 決定した。単離した遺伝子、たとえば、dir-1遺伝子は、SARを回復または増大さ せることにより病気への耐性を改善するために植物を形質転換するためのベクタ ーとして使用できる。本発明を適用できる植物には、商業的に重要な飼料用の豆 果(たとえば、これに限られるものではないが、アルファルファ)；種の大きな豆 果（穀実用豆果）(たとえば、これらに限られるものではないが、ダイズ、イン ゲンマメ(beans)、およびエンドウ)；ナス科植物(たとえば、これらに限定され るものではないが、タバコ、ジャガイモおよびトマト)；ならびに単子葉植物(た とえば、これらに限られるものではないが、トウモロコシ、コムギ、およびイネ )が含まれる。形質転換は、たとえばアグロバクテリウム(Shargool,Peter D.お よびNgo，That T.，Biotechnological Applications of Plant Cultures，1994, pp.61-76)、生物的な(biolistic)なプロセス(ShargoolおよびNgo，p38)または電 子穿孔法のような、公知のいかなる手段によっておこなわれてもよい。形質転換 した植物は当業者に公知の標準的なプロトコール、たとえば、リーフディスクか らの器官形成または体細胞胚形成によって再生される。形質転換した植物は有性 生殖により、または細胞あるいは組織培養により繁殖させてもよい。 本発明には、dir-1遺伝子のような単離された遺伝子から翻訳されたタンパク 質の発現が含まれる。これらのタンパク質、たとえば、dir-1脂質転移タンパク 質(dir-1 LTP)は、そのタンパク質に対する抗体を作るために有用である。抗体 は、dir-1遺伝子のような単離された遺伝子の発現について植物をスクリーニン グするプロセスで用いられる重要な試薬である。SARシグナル伝達経路遺伝子か らタンパク質を単離するために、単離された遺伝子の遺伝子生産物を実施例５に 記載する方法で発現する。タンパク質に対する抗体を実施例６に記載される方法 で生産する。タンパク質に対する抗体を、実施例６に記載される方法で、単離さ れた遺伝子の発現について植物をスクリーニングするための試薬として用いる。 本発明は、SARシグナル伝達経路全体にわたるSAR-欠損変異体をスクリーニン グする方法、特に経路上のサリチル酸が作用する位置よりも上流で作用するタン パク質をコードする遺伝子の変異体をスクリーニングする方法を含む。植物を形 質転換し、次いで実施例１に記載されるように、それらの植物の病気の症状を観 察した後、SAR変異体を単離する。次に、SAR変異体について、実施例１に記載さ れる方法で、経路においてサリチル酸が作用する点との関係で変異体遺伝子の位 置を決定するための試験をおこなう。 実施例１ dir-1変異体の単離および特徴づけ 植物および細菌の成長条件 Arabidopsis thaliana生態型Wassilewskija(Ws)およびFeldmanのT-DNA形質転 換された種子のプール(Arabidopsis biological Resource Center at Ohio Stat e University)を滅菌し、Murashige最小有機培地に植えた後、以前に記載された ように10日後に土壌に移した。Cameronら、Plant J 5:715-725(1994)。植物を発 育室に置き、22から24℃で、150μEm^-2秒^-1の光強度で９時間光照射して、4-5週 間成長させた。Pseudomonas syringae pv tomato(Pst)株DC3000[pLAFR3](毒性) およびDC3000[pLAFR3+avrRpt2](非病原性)(Whalenら、“Identification of Pse udomonas syringae pathogens of Arabidopsis and a bacterial locus determing avirulence on both Arabidopsis and soybean”Pl ant Cell 3:49-59(1991))およびPs pv maculicola M4[pLAFR3+avrRpm1](非病原 性)(Debenerら、“Identification and molecular mapping of a single Arabid opsis thaliana locus determining resistance to a phytopathogenic Pseudom onas syringae isolate”Plant J 1:289-302(1991))を以前に記載された方法で 成長させた。Cameronら、Plant J 5:715-725(1994)。 SAR変異体の単離 ４から５週齢のT-DNA変異誘発した植物(M1世代)に、１つの植物あたり１枚の 葉に非病原性のPst(10⁷cfu/ml)を免疫化接種した後、２日後に毒性のPst(5x10⁵c fu/ml)で３枚の他の葉に攻撃接種した。植物を４から５日後に観察し、生態型Ws に非病原性(SARを誘導した)および毒性の処理をおこなった対照と症状を比較し た。病気の症状を示した植物をSAR変異体の可能性のあるものとして選択し、種 子をつけさせた。推定されるSAR変異体の30から40の後代をM2世代として以下に 記載するように再度スクリーニングした。 dir-1の遺伝子の特徴づけ 多数のdir-1 M2植物を野生型Wsに戻し交雑し、得られたF1、F2およびF3後代に ついて、dir-1変異が野生型に対して劣勢と優勢のどちらであるか、およびdir-1 表現型がT-DNA(カナマイシン耐性マーカー)と共分離するかどうかを決定するた めのSAR応答能試験（以下に記載する）をおこなった。 SAR応答能試験 dir-1および野生型Ws植物の両方に多数の感染処理をおこなった。対照の処理( M,M)として、植物あたり１枚の葉に10mM MgCl₂を一次接種した後、２日後に植物 あたり４枚の他の葉に10mM MgCl₂をもう一度接種した。非病原性の処理(M,A)と して、植物あたり１枚の葉に10mM MgCl₂を一次接種した後、２日後に植物あたり ４枚の他の葉に非病原性の接種物(10⁶cfu/ml)を接種した。毒性の処理(M,V)とし て、植物あたり１枚の葉に10mM MgCl₂を一次接種した後、２日後に 植物あたり４枚の他の葉に毒性の接種物(10⁶cfu/ml)を接種した。SAR処理(A,V) として、植物あたり１枚の葉に非病原性の細菌(10⁶cfu/ml)を一次接種した後、 ２日後に植物あたり４枚の他の葉に毒性の接種物(10⁶cfu/ml)を接種した。 それぞれの処理について病気の症状またはその欠如を観察し、それぞれの処理 からリーフディスクを集めて植物内(in planta)での細菌の成長を測定すること により結果を確認した。 植物内(in planta)での細菌の成長の定量 それぞれの植物から８枚のリーフディスク(直径4.0mm)を取り、10mM MgCl₂中 に解離した。10mM MgCl₂で適当に希釈し、接種物として用いたもの以外の細菌の 成長を防止するために100mg/lのリファンピシン(Sigma Chemical Co.，St.Louis ，MO.)および20mg/lのテトラサイクリン(Sigma)を含む、KingのＢ寒天に植え付 けた(Kingら、“Two simple media for demonstration of phycocyanin and flu orescein”J Lab Clin Med 44:301-307(1954))。 サリチル酸量の分析 0.5gのArabidopsisの葉の組織(20-30枚の葉)を液体窒素中ですりつぶした後、 0.04％ 2-メルカプトエタノールを加えた50％エタノール、次いで２倍の体積の0 .04％ 2-メルカプトエタノールを加えた100％エタノールに抽出することにより 、サリチル酸を測定した。エタノール抽出物を合わせて窒素雰囲気下でおよそ4m lの水が残るまで乾燥した後、１容量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル 相を窒素雰囲気下で乾燥し、乾燥した物質を200μlの100％メタノールに再懸濁 させた。サリチル酸を逆相HPLCで定量した。サンプル(20μl)を、4.6×250mm５ μm C-18シリカカラム(J.T.Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ)に注入し、外界温 度で95％ 20mM酢酸ナトリウム、pH5.0、５％メタノールで平衡化し、1.5ml/分の 流速で無勾配で流した。サリチル酸（保持時間約７分）は、Yalpaniら(1991)の 記載に従って、走査蛍光検出器(Model FP-920;JASCO，Easton，MD)を用いて、31 5nmの励起、405nmの発光で検出した。典型的なサンプルからのサリチル酸のピー クの同定は、発光スペクトルを真正のサリチル酸の標準的なものと比較す ることによって確認された。サリチル酸のピークはまた、多数の以前に決定され たサリチル酸サンプルをサリチル酸ヒドロキシラーゼ(Sigma)で消化して、この 処理の後にサリチル酸のピークが消えることを示すことによっても確認された。 総サリチル酸（遊離のサリチル酸＋グルコースコンジュゲート）は50μlのメタ ノール抽出物をβ-グルコシダーゼで消化することにより測定した。抽出過程に おけるサリチル酸の損失は36から50％の間で変化し、サリチル酸量(ng/g fwt)の 計算の間に修正した。 RNAの抽出および分析 冷凍した葉のサンプル（サンプルあたり3-4枚の葉）から、Verwoerdら、“A s mall scale procedure for the rapid isolation of plant RNAs”Nucleic Acid Res 17:23 8 2(1989)の小規模手順を用いてRNAを単離した。総RNAのサンプル(5 μg)をホルムアルデヒド-アガロースゲルで電気泳動をおこなって分離し、Sambr ookら、Molecular Cloning，Alaboratory Manual，2nd ed．Cold Spring Harbor Laboratory Press，pp.7.43-7.46(1989)に記載されるように、Hybond-Nナイロ ン膜(Amersham Corp.,Arlington Heights,IL)にブロットした。電気泳動の後に 紫外線照射によって同じサンプルであることを確認するために、サンプル緩衝液 に臭化エチジウム(40μg/ml)を加えた。PR-1、PR-2およびPR-5のArabidopsis c DNAクローン(Uknesら、Plant Cell 4:645-656(1992))を、Random Primer Kit(Am ersham)を用いたランダムプライミングにより³²P-標識した。Church，G.M.およ びGilbert，W.，“Genomics equencing”Proc Natl Acad Sci USA 81:1991-1995 (1984)に記載される方法でハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなった。rD NAプローブを用いてそれぞれのレーンに同量の合計RNAを載せたことを再確認し た。 Arabidopsis dir-1変異体の単離および遺伝子の特徴づけ スクリーニングされた11,000のT-DNA形質転換した(MI)植物の系統のうち、200 のSAR変異体と推定されるものが回収された。M2世代において再試験した後、dir -1遺伝子が真のSAR欠損変異体であることが証明された。M2 dir-1植物 の２つの別のSAR試験において、SAR欠損表現型は、3:1の比(カイ二乗値p＞0.9お よびp＞0.8)で、SAR欠損植物とSAR応答能のある(野生型)植物に分離した。これ らの結果はdir-1変異は、野生型SAR遺伝子の機能に対して優性であることを示し ている。 dir-1変異の優性な性質を確認するために、３種の異なるM2 dir-1植物を野生 型Wsバックグラウンドに戻し交雑した。それぞれの交雑の後代（およそ10の植物 ）について、再度SAR応答能を試験した(植物内(in planta)での細菌の成長に関 するデータについては表１を参照されたい)。それぞれの交雑から得られたすべ ての後代がSAR欠損であって、dir-1変異の優性な性質を確認する結果となった。 表１： dir-1×Ws F3後代¹についての植物内(in planta)での 細菌成長(cfu/リーフディスク) ¹それぞれの処理から８枚のリーフディスク（２つの複製）を集めて、２つの複 製の平均を記載した。² (M,M)-一次接種-MgCl₂;２回目の攻撃接種-MgCl₂ (M,A)-一次接種-MgCl₂;２回目の接種-非病原性Pst;２回目の攻撃の後に接種し たまたは接種しなかった葉を集める。 (M,V)-一次接種-MgCl₂;２回目の接種-毒性のPst;２回目の攻撃の後に接種した 葉を集める。 (A,V)-一次接種-非病原性のPst;２回目の接種-毒性のPst;２回目の攻撃の後に 接種した葉を集める。³ (A,V),A＝PstavrRpt2 ⁴ (A,V),A＝PsmavrRpml 戻し交雑されたdir-1の系統は種をつけるままにして、カナマイシンを含む培地 に植えて(250-500個の種)、SAR欠損表現型がT-DNA上に存在するカナマイシン耐 性遺伝子と分離するかどうかを決定し、dir-1変異がT-DNAのdir-1遺伝子への挿 入の結果であるかどうかを決定した。７つの戻し交雑したF2系統を解析した。分 離の比（カナマイシン耐性対カナマイシン感受性）は７から3.3の範囲であって 、１植物あたり１以上のT-DNAの挿入が同時にあったことを示している。これら の系統にT-DNAの２つの機能的な複製が存在するとすれば、カナマイシン耐性植 物対感受性植物の比は15:1となるはずである。これらのF2系統(カナマイシン耐 性および感受性)を土壌に移し、４週間成長させた後、病気の症状および細菌の 成長レベルを測定することによってSAR応答性を試験した。カナマイシン感受性 の植物で土壌に移したときに成長したものはごくわずかしかなかったが、これら の植物の大部分はSAR応答能があった。カナマイシンの存在下で成長したF2系統 からの植物は100％SAR欠損と推測されるものから80％SAR欠損までの範囲であり 、dir-1変異と関連していない後代のいくつかにおいて機能的カナマイシン耐性 遺伝子が存在したことを示している。 SAR欠損、カナマイシン耐性F2植物およびSAR応答能のあるカナマイシン感受性 F2植物の両方から、DNAを単離した。それぞれのサンプルから得たDNAを、EcoR1 で消化し、電気泳動、ブロッティング、およびT-DNA構築物中に含まれるpBR322 プラスミドでのプロービングを行った。Errampalliら、“Embryonic lethals an d T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis,”Plant Cell 3:149-157(19 91)。多数のF2 SAR欠損、カナマイシン耐性植物は、SAR応答能を有するカナマイ シン感受性の植物には見られないT-DNAに相当するバンドを有する。結合してい ないT-DNA配列を排除するために、これらのdir-1 F2カナマイシン耐性植物の多 くを、再度野生型Wsに戻し交雑した。 多数のdir-1×Ws戻し交雑のF2系統群は、カナマイシン耐性に関して3:1に分離 した。カナマイシンを含む培地で成長した二つの系統群に属する個体に対してSA R応答能試験をおこなった。T-DNAがdir-1表現型と共分離する場合には、 すべての個体はSAR欠損である。両方の系統群に属するそれぞれの個体(およそ12 0)は、表現型および細菌を定量することによって測定したところ、SAR欠損であ った。これらの結果は、dir変異体の表現型がカナマイシン耐性およびT-DNAの挿 入によって分離したことを確認するものであった。多くのF2個体から得たF3種子 を集めてdir-1同型接合植物を単離するために用いた。すべてのカナマイシン感 受性F3植物はdir-1に対して同型接合野生型であり、SARを発現した。以上のよう に、遺伝子解析によりdir-1変異はT-DNAの挿入によって引き起こされることが示 され、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による中断された遺伝子をクローニング する方法を容易にするものである。 INAによるdir-1表現型の救出 Arabidopsisに2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)を噴霧することにより、毒性 の真菌および細菌の病原体に対するSARを誘導することができる。Uknesら、Mol Plant-Microbe Interact 6:692-698(1993)。INAはSARシグナル伝達経路において サリチル酸と同じ点またはその下流で作用すると考えられている(Vernooijら、1 995)。そこで、dir-1 M2植物にINAを噴霧した後、４日後に10⁶cfu/mlの毒性の細 菌で攻撃をおこなった。植物を３日後に観察して症状を記録した。毒性の対照処 理(M,V)はWsおよびdir-1植物の両方に病気の症状を生じたのに対して、SAR処理( A,V)はdir-1植物に病気を生じ、Ws植物には耐性またはSARを生じた。INAを噴霧 された後毒性の細菌で攻撃された野生型Wsおよびdir-1植物は両方共症状がない ままであり、これはINAがdir-1植物においてSARを誘導したことを示している。 このことは、dir-1変異はSARシグナル伝達経路においてINAの上流であることを 証明している。INAのようにサリチル酸とよく似た作用を有する、アスピリン(ア セチルサリチル酸)、サリチル酸メチル(methysalicylate)、およびベンゾチアゾ ールのような(ただし、これらに限られない)物質もまた使用できる。 Arabidopsis dir-1変異体におけるSAR遺伝子の発現とサリチル酸量 非病原性のpstを接種（SAR処理）した後のdir-1×Ws F2の後代（カナマイ シン耐性、SAR欠損）の予備実験では、SAR遺伝子PR-1、PR-2およびPR-5の発現は 、野生型の植物と比較してSARの発現段階において減少した。しかし、サリチル 酸は野生型の植物に観察される量と同等またはそれ以上の量で蓄積され(表2)、 サリチル酸の蓄積はArabidopsisにおいて、SARのみでなく、過敏反応(HR)および 一般的な防御反応にも関与していることを示す以前の知見と一致している(Delan eyら、Science 266:1247-1250(1994);Cameronら、未発表)。さらに、免疫化の一 次接種として別の非病原性の細菌(Psm M4 avrRpm1)を用いた場合には、SARはdir -1変異体に誘導されず、このことはさらに、dir-1変異体植物における病変はSAR シグナル伝達経路に特異的であることを示している。 表２： Wsおよびdir-1(F2後代)における遊離サリチル酸(ng/gfw) ¹(M,M-接種)-一次接種-MgCl₂;２回目の攻撃接種-MgCl₂;サリチル酸量は２回目の 接種から集められた葉で測定した。^2,3 (M,A)-一次接種-MgCl₂;２回目の接種-非病原性のPst;２回目の攻撃の後に接 種したまたは未接種の葉を集めた。⁴ (A,V)-一次接種-非病原性のPst;２回目の接種-毒性のPst;２回目の攻撃の後接 種した葉を集めた。 実施例２ dir-1遺伝子の単離および特徴づけ ゲノムDNAをdir-1同型接合系統の葉から標準的な方法によって単離した(Sambr ookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harb or Laboratory Press(1989))。T-DNAの右端の配列(RB)に特異的なプライマーを 用いて、熱非対称交差(thermal assymetric interlaced)(TAIL)PCR(Liuら、 “Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert j unctions by thermal assymetric interlaced PCR”Plant Journal 8:457-463(1 995))を適用したところ、RBを含むクローン化された配列が得られたが、植物の 隣接するDNAではなく、逆方向のT-DNA配列が見いだされ、このことは、２つの左 端の配列(LB)のインサートを招く、T-DNA内での再配列がおこったことを示して いる。次に、T-DNAのLBにアニールするようにデザインされたプライマーを用い てTAIL-PCRをおこなった。LBおよび植物のゲノムの隣接する配列からなる二つの 特定の配列が増幅された。 野生型およびdir-1 Arabidopsisから得たゲノムDNAを用いてPCRとサザンブロ ット分析を組み合わせておこなうことにより、TAIL-PCRによって増幅された二つ の配列は、野生型Arabidopsisのゲノム中で連続しており、一つのT-DNAの挿入に よって中断されることが示された。この挿入は遺伝子の非翻訳3'領域、Phaseolu s vulgaris由来の非特異的脂質転移タンパク質(LTP)の配列と顕著な配列同一性 を有するオープンリーディングフレームでおこる。T-DNA挿入の向こう側の隣接 するDNAの配列決定により(LTPの3'-末端から離れて、外側に)、1.1KB以上の配列 上にオープンリーディングフレームがないことが明らかになった。さらに、LTP の転写レベルはdir-1系統由来の合計RNA生成物において強く抑制され、このこと は、T-DNAの挿入は実際にdir-1遺伝子の発現を妨害することを示唆している。標 準的な方法(Sambrookら、Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd ed.，C old Spring Harbor Laboratory Press(1989))により、ゲノムLTP配列から得たプ ローブを用いて完全なLTPをコードしたcDNAを単離した。 DNA配列解析 Sangerのジデオキシ配列決定法によってDNAを配列決定した(Sangerら、Proc N atl Acad Sci USA 74:5463-5467(1977))。Taqジデオキシターミネーターサイク ル配列決定キット(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)を使用説明書に 従って用いた。生成物を6％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、データをABI37 3A自動DNAシークエンサーによって処理した。自動化されたシステムか ら得られた生のデータの操作はすべて、PC Gene DNA解析ソフトウェア(Intellig enetics，Mountain View，CA)でおこなった。 ヌクレオチド配列を配列番号１に示す。 dir-1によってコードされるArabidopsis LTPは、病気に対する全身性植物免疫 を確立するためのシグナル伝達に関与する新規なタンパク質であるという証拠が ある。第１に、遺伝子スクリーニングの性質が、局所的な反応よりも全体的な反 応における変異を標的としており、これは、dir-1遺伝子生産物それ自体が抗微 生物作用を有する場合におこるような、dir-1変異が非病原性の病原体への局所 反応または病原体に接触したことのない植物における毒性の病原体に対する感受 性のレベルに影響を与えないという事実から生じるものである。第２に、INAの ようなSARの誘発物質は、dir-1表現型を救出し、これは、dir-1がnpr1、INAに対 する応答性をなくす変異のような他のシグナル機能の上流にあることを示してい る(Caoら、“Characterization of an Arabidopsis mutant that is nonrespons ive to inducers of systemic acquired resistance”Plant Cell 6:1583-1592( 1994))。第３に、病原性に関連した(PR)タンパク質および微小-HRs、全身の葉に おけるSARの確立のための分子標識(Caoら、“Characterization of an Arabidop sis mutant that is nonresponsive to inducers of systemic aquired resista nce”Plant Cell 6:1583-1592(1994);Alvarezら、“Reactive oxygen intermedi ates mediate a systemic signal network in the establishment of plantimmu nity”Cell 92:773-784(1998))の全身性誘導はdir-1において抑制される。 dir-1の非翻訳3'領域へのT-DNAの挿入は、対応する転写物量の減少を招き、そ のため機能的dir-1 LTPの量の減少をおこす。その結果、これは一次感染した葉 から植物の全身の葉へのシグナル伝達を遮断する。翻訳生成物としてdir-1 LTP を有するdir-1遺伝子の同定により、脂質中間体がSARにおける全身性シグナルと して作用することが示される。 dir-1 LPTのアミノ酸配列は、PC Geneソフトウェアを用いて得られ、配列番号 ２として記載されている。 実施例３ dir-1遺伝子を含むベクターの構築 完全長のArabidopsis dir-1 cDNAを含む断片、または別の植物種から得たdir- 1の機能的ホモログを、バイナリーベクタープラスミドに、たとえば、バイナリ ーベクタープラスミドpBI121.1(R.A.Jefferson，T.A.Kavanagh，M.W.Bevan，“G US fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion mar ker in higher plants”The EMBRO Journal 6:3901-3907(1987))の中のGUS遺伝 子の場所に、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（または他の植物 細胞中で活性な恒常的に発現したまたは誘導可能なプロモーター）およびノパリ ン合成酵素ターミネーター（または他の植物細胞中で活性な転写終結シグナル） の制御のもとに、クローン化する。クローン化およびベクターの構築は、E.coli 株HB101またはDH5aにおける標準的な組換えDNA技術を用いて、Sambrook，J.，Fr itsch，E.F.&Maniatis，T．（1989）Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2 nd Ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New Yorkの記載にしたがって おこなう。インサートの方向付けは制限地図によって確認され、それぞれの構築 物の5'末端は35Sプロモーターまたは当業界で用いられることが知られている他 のプロモーターから得たオリゴヌクレオチドプライマーから配列決定することに より確認する。 実施例４ 植物の形質転換およびトランスジェニック植物の作製における dir-1遺伝子ベクターの利用 タバコおよびアルファルファ植物を、dir-1遺伝子構築物をつなげたA.tumefac iens株LBA4404を用いてリーフディスク法により形質転換する。トランスジェニ ックタバコ植物(Nicotiana tabacum cv．Xanthi NF)を、以前に記載された方法 で(Rogersら、“Gene transfer in plants:Production of transformed plants using Ti plasmid vectors”Methods Enzymol 118:627-640(1986))、カナマイシ ンで選択した再生により、発生させる。トランスジェニックアルファルファ植物 を、刊行物に記載された方法(Binghamら、“Breeding alfalfa which regenerates from callus tissue in culture”Crop Sci 15:719-721(1975))を 改善した方法に従って、応答能のあるアルファルファ栽培変種植物Regen SY(Bin gham，E.T.，“Registration of alfalfa hybrid Regen-SY germplasm for tiss ue culture and transformation research”Crop Sci 31:1098(1991))の形質転 換および再生により発生させる。簡単に述べると、若い三葉の葉から得たリーフ ディスクに、バイナリー構築物をつなげたアグロバクテリウムの懸濁液を接種し て、固相B5hプレート(Brown，0.C.W．and Atanassov，A.，“Role of genetic b ackground in somatic embryogenesis in Medicago”Plant Cell Tiss Organ Cu lt 4:111-122(1985))上で４日間（24℃で16時間光照射）インキュベートする。 次に、外植片を水で２回洗浄して細菌を除き、新しいB5hプレート上でさらに４ 日インキュベートする。次いで、外植片を水で２回洗浄し、選択プレート（B5h プレートに100mg/Lのチメンチン(timentin)(Smith-Kline Beecham，Philadelphi a，PA)および25mg/Lのカナマイシン(Sigma，St.Louis，MO)を加えたもの）に移 す。２週間後にカルスおよび場合によっては胚ができ、新しい選択プレートに移 して、カルスが確実に拡がるようにする。プレートをさらに１週間インキュベー トしてさらに胚が発生するのを待つ。次に、カルスおよび胚をB5プレート（ホル モンは入っていないが前と同じように抗生物質を含む）に移す。２週間後、カル スおよび胚を新鮮なB5プレート（抗生物質入り）に移す。１から２週間後、それ ぞれの胚を抗生物質の入った(50mg/Lチメンチンおよび25mg/Lのカナマイシン)MS プレート上で(Murashige，T.，and Skoog，F.，“Arevised medium for rapid g rowth and bioassays with tobacco tissue culture”Physiol Plant 15:473-49 7(1962))培養する。１から３週間で、場合によっては根を有する小植物が形成さ れる。これらを、MS寒天培地および抗生物質の入ったプラスチックの箱(Magenta Corp，Chicago，IL)に移す。植物を抗生物質を含むMS培地上で維持し、挿し木 によって増殖させる。また、植物を温室内の土壌に移す。 実施例５ dir-1 LTPの単離 Arabidopsis dir-1遺伝子の生産物を、文献に記載された方法でE.coli SB221 細胞で発現させる(BS ShorroshおよびRA Dixon，“Molecular cloning of a put ative plant endomembrane protein resembling vertebrate protein disulfide isomerase and phosphatidylinositol-specific phospholipase C”Proc Natl Acad of Sci USA 88:10941-10945)。発現したタンパク質をポリアクリルアミド ゲル電気泳動によって分解する(Laemmli，U.K.，“Cleavage of structural pro teins during the assembly of the head of bacteriophage T4”Nature 227:68 0-685(1970))。dir-1によってコードされたタンパク質のバンドは、クーマシー ブリリアントブルーで染色することにより場所を決めて、12のゲルレーンからの 領域を切除して小さい断片に分け、50％(v/v)イソプロパノール/3％(w/v)SDSに 一晩つけて完全に脱色し、水で洗い流し、真空乾燥させ、液体窒素中ですりつぶ し、最後にリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させる。 実施例６ dir-1 LTPタンパク質に対する抗体の生産および使用 メスのニュージーランドシロウサギ(New Zealand White rabbit)を免疫化する ことによって抗血清を得る。一次免疫化として、およそ30μgのdir-1 LTPを2.7m lの完全フロイントアジュバント中に含むものを、背中の９か所の異なる部位に 皮下注射する(部位あたり300ml)。追加免疫注射には、６つの切除したゲルレー ンから得たdir-1 LTP(およそ15μg)を不完全フロイントアジュバント中に含むも のを、１次免疫注射から４および６週間後に投与する。血清を−20℃で保存する 。 抗体を、ウェスタンブロット分析においてトランスジェニック植物のdir-1 LT Pを検出するための試薬として用いる。葉と茎のタンパク質をpH8.8の0.2Mホウ酸 緩衝液に抽出して、標準的な方法で(Ausubelら、1994．Current Protocols in M olecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，New york)、変性ポリアクリル アミドゲル電気泳動をおこなう。タンパク質を、pH8.3の25mM Tris-HCl、192mM グリシン、および20％メタノール中のImmobilon-P膜(Millipore，Milford，MA) に移す(Towbinら、1979．“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applicat ions”Proc Natl Acad Sci USA 9:4350-4354)。膜に対する非特異的結合を抑え 、１次抗体(抗-dir-1)および２次抗体、たとえば、アルカリホスファターゼをTT BS(0.1％ Tween-20をTris-緩衝生理食塩水に入れたもの)中の3％ BSAに入れたも ののような検出系と結合したヤギ抗-ウサギIgG、を用いてプロービングした(Aus ubelら、Curruent Protocols in Molecular Biology(1994))。 特定の好ましい形態を参照しながら、本発明についてかなり詳細に記載したが 、別の形態での実施も可能である。したがって添付した請求の範囲の趣旨および 範囲は、ここに含まれる好ましい形態の記載に限定されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラム，クリスタファ、ジェイ アメリカ合衆国キャリフォーニア州92122、 サン・ディエイゴゥ、ファーリ・ドライヴ 6444番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．SARシグナル伝達をおこなうことができる脂質転移タンパク質をコードする 領域を含む核酸分子。 ２．前記領域が、配列番号１に示すヌクレオチド１〜約439を含む、請求項１記 載の核酸分子。 ３．配列番号１に示すヌクレオチド１〜約439を含む、植物のベクターとして機 能することができる組換えDNA分子。 ４．配列番号１に示すヌクレオチド１〜約439を実質的に含む組換え核酸分子に よって形質転換された植物細胞および植物。 ５．前記組換え核酸分子が、植物の染色体DNAに組み込まれている、請求項４記 載の植物細胞および植物。 ６．請求項１の核酸領域から翻訳されたタンパク質。 ７．請求項２の核酸領域から翻訳されたタンパク質。 ８．配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。 ９．請求項１の核酸分子を含むベクター。 10．請求項２の核酸分子を含むベクター。 11．請求項10のベクターを含む形質転換された植物。 12．請求項11のベクターを含む形質転換された植物。 13．植物に全身性獲得耐性を導入することができる脂質転移タンパク質をコード した核酸領域からなるベクターによって植物を形質転換することからなる、植物 に全身性獲得耐性を与える方法。 14．前記核酸領域が配列番号１のヌクレオチド１〜439を含む、請求項12の方法 。 15．前記タンパク質が配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、請求項12の方法 。 16．a) 挿入型突然変異誘発物質によって植物を形質転換し、 b) 病気の症状を観察し、 c) SAR変異体を選択し、 d) 該変異体にサリチル酸様物質を噴霧し、 e) 該変異体の表現型を観察し、 f) 該噴霧の結果として野生型の表現型が回復した該変異体を選択することから なる、 シグナル伝達経路上のサリチル酸が作用する点よりも上流で作用するようなタン パク質をコードする領域を有するSAR変異体を単離する方法。 17．請求項6、7、または８のタンパク質を特異的に結合することができる抗体。 18．配列番号１に示されるヌクレオチド領域を含む実質的に純粋なcDNA。 19．配列番号２に示されるアミノ酸配列またはそれと機能的に等価なものをコー ドする実質的に純粋なcDNAであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列または それと機能的に等価なものをコードしないcDNAを実質的に含まない、cDNA。