JP2001524314A

JP2001524314A - ホルモン依存型のアデノ関連ウイルス、ｒｅｐタンパク質、これらをコードするｄｎａ配列、これらを含むベクター、およびこれらの細胞内活性の調節方法

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Publication number: JP2001524314A
Application number: JP2000522251A
Authority: JP
Inventors: トニアッティ、カルロ; リナウド、シラ; シリベルト、ジェナロ
Original assignee: イスチチュートデイリセルシュデイバイオロジアモレコラレピー．アンジェレッティソシエタペルアチオニ
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2001-12-04
Also published as: US6753419B1; AU733978B2; ITRM970724A1; CA2309755A1; AU1259699A; EP1032678A1; IT1297074B1; WO1999027110A1; CA2309755C

Abstract

(57)【要約】本発明の主題は、その特異的変異体とステロイドホルモン受容体のホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）との融合により得られる、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のホルモン依存型のＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８タンパク質、並びにこれらをコードするＤＮＡ配列である。本発明はまた、治療目的で、宿主ヒトゲノムの特異的領域に、ＤＮＡ配列の安定な組み込みを向けるために、ウイルスまたは非ウイルス系を使用して真核生物細胞中に挿入された、融合産物Ｒｅｐ７８／６８−ＨＢＤの活性のホルモン性調節のための方法に関する。融合産物Ｒｅｐ７８／６８−ＨＢＤはまた、ウイルスハイブリッドベクター（すなわち、アデノウイルスベクターＡＡＶ）を生成するため、および組換えベクターＡＡＶを生成するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、分子生物学の分野に関し、特に体細胞遺伝子治療のために重要な遺
伝子機能を精巧に制御する可能性に関する。さらに具体的には、本発明は、ステ
ロイドホルモン依存性のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のいくつかのＲｅｐタン
パク質の型を作成するためのシステムを提供する。本発明はまた、ヒト宿主細胞
ゲノムＤＮＡの特異的な領域内への、組換えＤＮＡ配列の組み込みを支配するた
めのＡＡＶＲｅｐタンパク質活性の調節に関する。

【０００２】（技術の現状）長期発現を伴う、活発に分裂する細胞および分裂していない細胞の特異的なＤ
ＮＡ部位への治療用遺伝子の組み込みは、体細胞遺伝子治療のための最適な方策
である。

【０００３】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、細胞ゲノムの限定された領域にそのウイル
スＤＮＡを優先的に組み込むユニークな能力を有しており、このため他のウイル
ス（例えば、全くランダムな位置に組み込まれるレトロウイルス）に付随する挿
入突然変異誘発のリスクが低減している。

【０００４】アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、反転していない１本鎖ＤＮＡを有し、パル
ボウイルスファミリーに属する、非病原性小ウイルスである（バラーグ（Balagu
e）ら、１９９７年）。ＡＡＶは、ヘルパーウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による同時感染を必要とするか、またはウイルス産生性感染を
受けるために遺伝毒性剤（例えば、熱ショック、ヒドロキシ尿素、紫外線および
Ｘ線）への宿主細胞の暴露を必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合、
ＡＡＶゲノムは、染色体ＤＮＡに組み込まれて、潜伏感染を起こす。潜伏感染細
胞からのＦＩＳＨ分析（蛍光プローブによるインシトゥハイブリダイゼーション
）のような、プロウイルス組み込みゲノムの隣接配列の分析によって、ＡＡＶゲ
ノムの組み込みが、第１９染色体のｑ末端（１９ｑ１３−ｑｔｅｒ）に位置する
特異的な部位（ａａｖｓ１と呼ばれる）を選択的に標的としていることが明らか
になった（アール・エム・コーティン（Kotin, RM）ら，1990, PNAS USA, 87:22
11-2215；アール・ジェイ・サムルスキ（Samulski, RJ）ら，1991, EMBO J. 10:
3941-3950）。組み込みの特異性は、使用する細胞株および実験条件に応じて、事例の６０％〜９４％の範囲に当てはまる。この特色は、ウイルスゲノムのラン
ダム組み込みに由来する挿入突然変異誘発の確率を低下させる。さらに、ＡＡＶ
ゲノムに強力な転写調節因子が存在しないため、ａａｖｓ１部位へのＡＡＶ組み
込みが、内因性染色体遺伝子の転写活性化を担っている可能性は低い。

【０００５】組み込みプロウイルスを含む細胞が、Ａｄのようなヘルパーウイルスにより重
感染されるならば、組み込みゲノムＡＡＶは、レスキューおよび複製しうる。

【０００６】ＡＡＶゲノムは、タンパク質（ＯＲＦ＝読み取り枠（Open Reading Frames））、３つのプロモーター（ｐ５、ｐ１９およびｐ４０）、およびゲノムの各末端
に位置するＩＴＲ配列（逆向き末端反復配列（Inverted Terminal Repeat seque
nce））をコードする２つの配列を含む、４６８０bp長の線状１本鎖ＤＮＡである。２つのＯＲＦは、それぞれ非構造（Ｒｅｐ）および構造（Ｃａｐ）タンパク
質をコードする（アール・エム・コーティン（Kotin, RM）ら，1990, PNAS USA,
87:2211-2215；アール・ジェイ・サムルスキ（Samulski, RJ）ら，1991, EMBO
J. 10:3941-3950）。

【０００７】ＡＡＶＯＲＦｒｅｐは、４つの重複タンパク質をコードする。さらに具体
的には、ｒｅｐをコードするＯＲＦは、マップ位置５（プロモーター５、ｐ５）
および１９（プロモーター１９、ｐ１９）に位置する２つのプロモーターを有す
る。これら２つのプロモーターのそれぞれ１つに由来する転写配列は、読み取り
枠の３’末端およびポリアデニル化部位の近くの共通イントロンを共有する。イ
ントロンは、産生されるＲＮＡメッセンジャーの亜集団においてのみ利用される
。従って、ｒｅｐのＯＲＦは、４つの異なるｍＲＮＡと対応するタンパク質（ｐ
５の制御下に発現されるＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８、およびｐ１９の制御下で
発現されるＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０）を生成させる。Ｒｅｐ６８とＲｅｐ４
０は、イントロン切除に至る「スプライシング」と呼ばれる成熟プロセスを経る
ＲＮＡ転写配列によりコードされる。突然変異分析によって種々のＲｅｐタンパ
ク質の機能的活性が証明された。

【０００８】Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８は、ＡＡＶ複製において決定的に重要な役割を演じる
多機能タンパク質である。Ｒｅｐ７８は６２１アミノ酸長であるが、一方Ｒｅｐ
６８は、５３６アミノ酸長である。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８は、これらのカルボ
キシ末端においてのみ異なっており、そして最初の５２９アミノ酸は、２つのペ
プチドで同一である。Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８は、類似の生化学的性質を共有し
、すなわち両方とも、ＩＴＲのＲＢＳ（Ｒｅｐ結合部位（Rep Binding Site））
に結合する能力、およびＩＴＲに存在するｔｒｓ（末端分割部位（terminal res
olution site））を１本鎖で部位特異的に切断する能力を含む、ＡＡＶＤＮＡ
複製に必要な活性を有する。さらに、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８は、ＤＮＡ−ＤＮ
ＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡヘリカーゼとして作用し、ＡＴＰアーゼ活性を有し、そ
してＡＡＶプロモーターと異種プロモーターの両方を正または負に調節すること
ができる。現在までに、Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８の間に、明らかな機能的差異は
観察されていない。Ｒｅｐ５２とＲｅｐ４０は、結合活性やエンドヌクレアーゼ
ＤＮＡ活性を示さないが、それにもかかわらず、これらがＡＡＶの１本鎖反転ゲ
ノムの蓄積を促進するため、ＡＡＶ感染サイクルのために重要である。

【０００９】非ウイルス産生性感染中のＡＡＶ組み込み機作は、完全には明らかになってい
ない。いずれにしても、未確認の細胞性因子の他に２つのウイルス要素が必要で
あることは明らかに確立された：ＩＴＲとＲｅｐ７８／６８（ビー・ジェイ・カ
ーター（Carter, BJ）「パルボウイルスのハンドブック（Handbook of Parvovir
uses）」、ピー・ティッサー（P. Tijsser）編、ＣＲＣプレス、１５５−１６８
頁、アール・サムルスキ（Samulski, R）ＷＯ９６／３６３６４）。この結論は、多くの観察の直接の結果である。第１に、ｒｅｐとｃａｐコード配列を欠いて
いる組換えＡＡＶベクターは、第１９染色体に特異的には組み込まれない。第２
に、ＲＢＳと潜在的に隣接するｔｒｓは、優先的なゲノム組み込み部位ａａｖｓ
１中には同定されず、Ｒｅｐ６８／７８は、同時にＩＴＲ及びａａｖｓ１中に存
在するＲＢＳに結合することができ、こうして２つのＤＮＡ配列を架橋する。さ
らに、エクスビボ測定法を利用して、ａａｖｓ１中のＲＢＳ及びｔｒｓを含む３
３bp配列は、エピソームとして増殖したＤＮＡへのＡＡＶの標的とされる組み込
みを達成するために必要な最も短い配列であることが証明された。さらに興味深
いことは、ＡＡＶ部位特異的組み込みに必要な２つの要素が、ウイルスゲノムコ
ンテクストの外側で利用されるときでさえ、かなり高い効率で機能するという観
察である。実際に、ｒｅｐ発現カセットを有するプラスミドは、細胞にトランス
フェクションされると、同一かまたは同時トランスフェクションされたプラスミ
ドのいずれかに含まれるＩＴＲ（組み込みカセット）が隣接するトランスジーン
の部位特異的な組み込みを促進しうることが証明された。

【００１０】これらの実験は全体的に、ＡＡＶゲノムのコンテクストとは異なるコンテクス
トにおいてＡＡＶ組み込み機作を利用することが可能であることを証明している
。体細胞遺伝子治療のためのＡＡＶ使用の主要な限界は、４．５Kbを超えられな
いというＡＡＶビリオンの低いパッケージング範囲であるため、このことは、体
細胞遺伝子治療の分野において大いに関連する。ヒト第１９染色体に特異的に組
み込むことができる組換えベクターＡＡＶは、その上Ｒｅｐ７８および／または
６８ｃＤＮＡ（約２０００nt）を含むはずであり、ＡＡＶベクターにより形質導
入可能な大きなＤＮＡ配列（例えば、転写調節領域５’および３’＋トランスジ
ーン）は、２〜２．５Kbより長いことはない。

【００１１】これらの大きさの限界は、ＩＴＲ隣接トランスジーンとｒｅｐ発現カセットを
非ウイルス系により形質導入するか、またはより広いクローニング能力を有する
ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイ
ルスなど）中へこれらの要素を導入するかのいずれかにより、克服することがで
きるであろう（イタリア特許出願ＲＭ９７Ａ０００２００、優先日１９９７年４
月８日に開示されるとおり）。選択される形質導入系が何であっても、機能性Ｒ
ｅｐ７８／６８タンパク質の厳重な調節が必要である。

【００１２】非ウイルス形質導入系では、細胞生理に及ぼすいかなる望ましくない影響を回
避するために、Ｒｅｐタンパク質が組み込みを達成するために必要とされる時に
のみ機能性であることが必要であろう。このことは、Ｒｅｐが細胞培養物に細胞
毒性−細胞増殖抑制効果を発揮するという観察に照らして特に真である（ヤン（
Yang）ら、１９９４年）。さらに、標的細胞に及ぼすＲｅｐ活性の厳重な制御も
、最初の組み込み事象に続く、起こりうるいかなるＲｅｐ依存性組換えを排除す
るために必要かも知れない。

【００１３】アデノウイルスベクター（Ａｄ）／ＡＡＶ、すなわち、ｒｅｐ６８／７８コー
ド配列、ＡＡＶＩＴＲおよびＡＡＶＩＴＲ中のトランスジーン（その調節配
列を含む）を含むＡｄベクターのようなハイブリッドウイルスベクターの作製に
おいて、Ｒｅｐ活性の調節は、少なくとも２つの理由から必要とされる。第１に
、Ｒｅｐは多くのウイルス（ＳＶ４０、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、およびアデ
ノウイルスなど）の増殖を抑制しうることが知られている。この最後の場合では
特に、Ａｄ増殖を阻害するＲｅｐの能力は、徹底的に性状解析されている：従っ
て、ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶウイルスを作成するために、アデノウイルスベク
ターのパッケージングを行う細胞株（ヒト胚腎から誘導される２９３細胞）に及
ぼすＲｅｐ活性を特異的に抑止することが必要であり、さもなければウイルス収
量は顕著に低くなるであろう。作製されるハイブリッドウイルスが何であっても
、パッケージングが起こる細胞株では、Ｒｅｐ活性を低く保持することが、ベク
ターゲノムの完全さを維持するためにも必要がある。実際、ウイルス増殖中に活
性であれば、ＲｅｐはＡＡＶＩＴＲとの相互作用により、ハイブリッドベクタ
ーゲノムからのトランスジーン切除（およびＡＡＶＩＴＲは真核生物細胞の複
製開始点として機能することが知られているため、おそらくその複製）を促進し
得るので、非均質なウイルス集団が生じる。逆に明らかに、Ｒｅｐ７８および／
またはＲｅｐ６８は、ａａｖｓ１部位への所望のトランスジーンの部位特異的な
組み込みを促進するのに必要な時間、標的細胞内で活性である必要がある。

【００１４】これら全ての考察は、その活性について外部から添加されたリガンドに依存す
る、Ｒｅｐタンパク質７８／６８の生成が、体細胞遺伝子治療の分野において極
めて有用であることを指摘する。

【００１５】特に、遺伝子治療に最も一般的に使用されるＡＡＶウイルスは、２型のＡＡＶ
ウイルス（ＡＡＶ−２）であるため、この特異的なＡＡＶ型ウイルスに依存性の
Ｒｅｐタンパク質のこのような生成を適用することは、さらに極めて有用であろ
う。

【００１６】（発明の概要）本発明の主題は、その特異的変異体とステロイドホルモン受容体のホルモン結
合ドメイン（ＨＢＤ）との融合により得られる、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）
のホルモン依存型のＲｅｐタンパク質７８およびＲｅｐ６８、並びにこれらをコ
ードするＤＮＡ配列である。これらの変異体型は、実際に、これらの核内の局在
を担当する配列（核局在化シグナル−ＮＬＳ）の欠失および切断型タンパク質と
ＨＢＤとの融合によって、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）Ｒｅｐタンパク質の活
性の翻訳後レベルでの調節のための系を得ることを可能にする。

【００１７】本発明が基礎をおく主要な発見は、未変性タンパク質Ｒｅｐ６８および７８の
活性の調節が不可能なことである。実際Ｒｅｐ６８とＲｅｐ７８の両方とも同じ
ＮＬＳを共有している。全野生型タンパク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８は、実
際、この相互共有領域が存在するために、細胞内局在と部位特異的な組み込みを
促進する能力との両方に関して、ステロイドホルモンに対するＨＢＤとの融合に
よって調節されることはない。その結果、部分的または全体的なＮＬＳ欠失を提
示するようにカルボキシ末端領域で切断されているＲｅｐタンパク質を、ステロ
イドホルモンに対するＨＢＤとの融合による調節に付す、本発明の方法の目的が
開発され、かつ以下に開示される。

【００１８】Ｒｅｐタンパク質６８またはＲｅｐ７８の１次配列のアミノ酸４８０〜５２０
を包含する領域に局在するＮＬＳの、部分的または全体的な不活性化は、異なる
突然変異（最も有効なものは、全ドメインまたはその一部の欠失に存在するもの
）により得ることができる。

【００１９】さらに具体的には、アミノ酸５０５〜アミノ酸５２０までが欠失したＲｅｐタ
ンパク質６８または７８の、部位特異的な組み込みを促進する能力は、ステロイ
ドホルモンに対するＨＢＤとの融合により調節することができる。

【００２０】好ましくは、ＨＢＤとの融合により調節されるという特質は、アミノ酸４９２
〜５２０の欠失、そしてさらに好ましくはアミノ酸４８５〜５２０の欠失により
得られる。

【００２１】変異体ｒｅｐペプチドの部位特異的組み込みを促進する能力の調節は、ｒｅｐ
変異体のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方における、ステロイドホルモン
に対するＨＢＤとの融合により達成することができ、好ましくは変異体ｒｅｐペ
プチドの活性の調節は、変異体ｒｅｐペプチドのカルボキシ末端とステロイドホ
ルモンに対するＨＢＤとの融合により達成される。

【００２２】好ましくは利用されるＨＢＤは、アミノ酸６４０〜９３３（ｈＰＲ−ＨＢＤ）
を含むヒトプロゲステロンに対する受容体のものであり、さらに好ましくは、Ｃ
末端の４２アミノ酸の欠失により誘導され、そのためアミノ酸６４０〜８９１（
ＰＲ８９１）からなる、その変異体の１つである。

【００２３】上述および本明細書の以下の開示事項から、本発明の主題は、残基４８０〜残
基５２０までを含む領域中に少なくとも１つの突然変異を含み、突然変異は、核
局在化シグナルを部分的または全体的に不活性化することができ、場合により野
生型Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８の残基５２１〜カルボキシ末端までの配列が存
在しており、ステロイドホルモンに対する結合ドメインと融合している、アデノ
関連ウイルスのＲｅｐタンパク質６８またはＲｅｐ７８のムテインである。

【００２４】詳細には、アミノ酸４８０〜アミノ酸５２０までを含む領域の少なくとも１つ
のアミノ酸の欠失によって、野生型タンパク質からムテインが誘導される場合が
考察される。さらに、欠失が、残基４８５〜５２０、４９２〜５２０および５０
５〜５２０を含む場合、および上述の欠失の１つが存在し、野生型Ｒｅｐ６８ま
たはＲｅｐ７８の配列のアミノ酸５２１〜カルボキシ末端までの領域が存在しな
い場合は、特に適当である。

【００２５】本発明のさらなる主題は、ステロイドホルモンに対する結合ドメインが、Ｒｅ
ｐ６８またはＲｅｐ７８ムテインのカルボキシ末端に位置し、かつプロゲスチン
受容体のホルモン結合ドメイン、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン、
グルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン、ミネラルコルチコイド受容
体のホルモン結合ドメインよりなる群から選択される場合、およびこれらの誘導
体化されたムテイン、特に受容体とホルモンが、哺乳動物起源であるもの、そし
て特にヒト起源のものである場合である。

【００２６】さらに具体的な場合は、プロゲステロンに対する受容体の結合ドメインが、残
基６４０〜残基９３３までのアミノ酸の配列に存在し、特に該ドメインが、４２
個のＣ末端アミノ酸の欠失について突然変異しており、従ってアミノ酸６４０〜
８９１からなり；ステロイドホルモンに対する結合ドメインが、Ｒｅｐ６８また
はＲｅｐ７８ムテインのカルボキシ末端に位置するムテインである。

【００２７】本発明はさらに、残基４８５〜残基５２０までのアミノ酸を含む領域に少なく
とも１つの突然変異と、上述の欠失の１つがあり、野生型Ｒｅｐ６８またはＲｅ
ｐ７８からの配列のアミノ酸５２１〜カルボキシ末端までの領域が存在しない突
然変異とを含む、アデノ関連ウイルスのＲｅｐタンパク質６８または７８のムテ
インに関する。

【００２８】さらに、特に関連するのは、ムテインが、残基４８０〜残基５２０までの領域
に少なくとも１つの突然変異を含む場合であり、場合により野生型Ｒｅｐ６８ま
たはＲｅｐ７８の残基５２１〜カルボキシ末端までの配列が存在している場合で
ある。

【００２９】さらに特に関連するのは、アデノ関連ウイルスが、２型のアデノ関連ウイルス
である場合である。

【００３０】本発明はまた、上述のムテインをコードするＤＮＡ配列、特にｃＤＮＡ、およ
びこれらを含むウイルス性またはプラスミド性のベクターにも関し、特に、Ｒｅ
ｐΔＮ−Ｐ、Ｒｅｐ１ΔＮ／ＰｎおよびＲｅｐ１ΔＮ／Ｐのような、本文または
例に記載の配列を含むベクターに関する。

【００３１】さらに、本発明のさらなる主題は、本質的に：ａ）部分的または全体的に不活性な核局在化シグナルを有する少なくとも１つ
の前記のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質をコードするＤＮＡ
配列であって、ステロイドＨＢＤまたはその誘導体をコードする配列に機能的に
結合しているＤＮＡ配列を、細胞を導入する工程；ｂ）ステロイドホルモン又は結合ドメインに結合することができるステロイド
ホルモン類似体を、細胞に添加する工程、の組合せを含んでなる、アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８ポリペプチドまたはＲ
ｅｐ７８ポリペプチドの細胞内活性を調節する方法である。

【００３２】特に関連するのは、前記ＤＮＡ配列が、前述のムテインをコードしており、か
つウイルスベクター感染、特に前述のベクターにより、または電気穿孔法、ＤＥ
ＡＥ−デキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＮＡガン、およびリポソーム介在性遺伝子形質導入からなる群から選択
されるＤＮＡの伝達法により、細胞に挿入される場合である。

【００３３】さらに関連する場合は、工程ａ）およびｂ）の結合ドメインが、前述のもので
ある場合である。

【００３４】本質的に：Ａ）ステロイドホルモンまたはその誘導体に対する結合ドメインをコードする
配列に融合している、部分的または全体的に不活性な核局在化シグナル（ＮＬＳ
）を有するＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテインを、細
胞に導入する工程；Ｂ）ステロイドホルモンまたは結合ドメインに結合することができるステロイ
ドホルモン類似物質を添加する工程、の組合せを含んでなる、アデノ関連ウイルスのポリペプチドＲｅｐ６８またはＲ
ｅｐ７８の細胞内活性を調節する類似した方法。

【００３５】この方法では、本明細書に記載のムテインの任意の１つが使用される。

【００３６】特に、ポリペプチドＲｅｐ６８またはＲｅｐ７８の細胞内活性の調節方法が、
真核生物細胞、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトに適用される場
合が考察される。例示される特定の場合は、２９３細胞の使用である。好適な実
施態様ではムテインは、リポソームにより細胞に挿入することができる。

【００３７】本発明は添付の図面によりさらに明白になろう。

【００３８】（発明の詳細な説明）２型のアデノ関連ウイルスは、遺伝子治療において最も一般的に用いられるた
め、本発明を、このような好適な応用を具体的に参照してさらに説明する。

【００３９】ＡＡＶ−２Ｒｅｐペプチドと、ＡＡＶ−２ＩＴＲが隣接する治療用トラン
スジーンを運ぶベクター（ウイルス性および非ウイルス性の両方）との組合せは
、実際に体細胞遺伝子治療の分野において利用することができる。この利用の基
礎は、ＡＡＶ−２のＲｅｐペプチド６８／７８が、ＩＴＲが隣接するＤＮＡカセ
ットの部位特異的な組み込みを、エクスビボとインビボの両方で媒介することが
できるという概念に基づいている。ＩＴＲが隣接するトランスジーン含有カセッ
トは、組換えウイルスにより、またはペプチド断片のリポソームのような非ウイ
ルス性粒子の形成により、ＡＡＶ−２のＲｅｐペプチドを発現する細胞に形質導
入することができた。これらのベクターは、インビボまたはエクスビボで患者に
投与して、標的細胞内へ所望の遺伝子を組み込むことができる。すなわち、この
方策を利用すると、欠損または遺伝的欠乏を、安定に修正することができる。

【００４０】本研究の目的は、ヒト第１９染色体上に位置する組み込み部位ａａｖｓ１に、
ＩＴＲが隣接するＡＡＶ−２の選択された配列を挿入するＡＡＶ−２Ｒｅｐペ
プチドの能力の活用を可能にすることである。ヒトゲノムの定まった部位への治
療用遺伝子の挿入は、興味ある遺伝子の存続と発現を延長し、それにより挿入突
然変異誘発のリスクを低減させる。

【００４１】本発明は、翻訳後レベルの融合タンパク質Ｒｅｐ７８／６８活性の調節系の開
発に関する。このアプローチは、ステロイドホルモンの受容体の結合ドメイン（
ＨＢＤ）が、多くの異種タンパク質をｃｉｓにおいてホルモン制御下に置くため
に、自律性調節カセットとして使用することができるという観察に基づいている
（ＷＯ９３／２３４３１）。ホルモンの非存在下では、融合タンパク質は不活性
状態で保持され、ホルモン添加により迅速に活性化される。融合タンパク質の異
種構造内における、機能の非リガンドホルモン結合ドメインによる不活性化は、
熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）を含む複合体により媒介されることが
仮説とされて、いくつかの場合では証明されている。ホルモン結合は、ＨＳＰ９
０複合体の放出とタンパク質活性化（または脱抑制）を引き起こす。従ってホル
モン可逆タンパク質の不活性化は、少なくとも２つの機作により作用しうる：一
つは、ＨＳＰ９０複合体による立体障害を含む相対的に非特異的な機作による。
従ってこの方法は、その機能がＨＳＰ９０による立体障害に感受性である任意の
タンパク質にも適用できるはずである。他の１つでは、核タンパク質に関して時
に第２レベルの調節が作動することである：実際に、ＨＳＰ９０は、主として細
胞質に存在するタンパク質であるため、通常細胞核の内側に存在する異種タンパ
ク質が、ホルモンの結合ドメインと融合すると、細胞質に閉じこめられる：特異
的なリガンドの添加によってのみ、ＨＳＰ９０との複合体により融合産物を放出
させることができ、それによって融合産物は核に自由に入ることができる。

【００４２】従って、この調節システムは、ＨＳＰ９０複合体の成分を持つ任意の生物のサ
イトゾルと核区画において作用するはずである。

【００４３】本発明は、その活性についてホルモンに依存するステロイドホルモン受容体の
結合ドメインに融合したＲｅｐ７８／６８タンパク質の作製に関する。ヒトプロ
ゲステロンの受容体（ｈＰＲ）（ＷＯ９３／２３４３１）のホルモン結合ドメイ
ンのカルボキシ末端が欠失した変異体の例を示すが、原則として、結果はいかな
るステロイドホルモン受容体のいかなるＨＢＤに拡大することができる。詳細に
は、ヒトプロゲステロンに対する受容体のカルボキシ末端でＨＢＤ欠失の変異体
は、ｈＰＲのアミノ酸６３０〜８９１を含む欠失に至るものである。このホルモ
ン結合ドメインは、プロゲステロンにはもはや結合しないが、代わりにＲＵ４８
６（ミフェプリストン（mifepristone））のようなその合成類似体（通常プロゲ
ステロンのアンタゴニストとして作用する）に結合する。ｈＰＲホルモンの結合
ドメインのこの変異体型を、以後本明細書でＰＲ８９１と呼ぶ。

【００４４】本発明は部分的には、完全なＲｅｐ７８とＲｅｐ６８タンパク質はＰＲ８９１
に融合すると、ＡＡＶ−２ＩＴＲが隣接するトランスジーン（組み込みカセッ
ト）の細胞内局在と部位特異的な組み込みを促進する能力との両方に関して、Ｒ
Ｕ４８６により調節することができなかった、という観察に基づいている。この
ことは、ホルモン結合ドメインが、カルボキシ末端までか、アミノ末端までか、
またはＲｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８の共有スプライシング部位レベルでクロー
ン化されたという事実に関わりなく、真であることが証明された。このことは、
Ｒｅｐ７８とＲｅｐ６８に関して、Ｒｅｐタンパク質７８／６８の１次配列のア
ミノ酸４８０〜５２０を含む領域中に位置する強力なＮＬＳの存在に帰された。
さらに、我々は、ＰＲ８９１に融合するとホルモンの非存在下でＨＳＰ９０複合
体による立体障害をさらに容易に受けるかもしれない、完全なタンパク質の全て
の機能を維持している短いＲｅｐ７８／６８バージョンの作成によって、Ｒｅｐ
７８／６８活性のより厳密な制御が達成できるかもしれないという仮説をたてた
。

【００４５】本発明は、１）天然タンパク質の全ての既知の機能活性を維持する最小Ｒｅｐ
７８／６８領域の同定；２）Ｒｅｐ７８／６８のＮＬＳの分析；３）その活性が
、適切なリガンドの添加により調節される、ステロイドホルモンに対する受容体
のホルモン結合ドメインと融合したＲｅｐ７８／６８変異体により構成される、
融合タンパク質の作製のためのこれら２群の情報の組合せを目的とする、Ｒｅｐ
変異体の生成に関する。

【００４６】従って本発明はまた、ＮＬＳにおける漸進性の欠失を含む、Ｒｅｐ７８／６８
タンパク質のＣ末端の欠失による変異体に関する。

【００４７】本発明はまた、その活性が、ＲＵ４８６のようなＰＲアンタゴニストにより調
節される、ＰＲ８９１の異なる部分に融合した、Ｒｅｐ７８／６８のカルボキシ
末端の欠失による変異体から構成される、キメラタンパク質に関する。

【００４８】本発明はまた、その活性が、ＲＵ４８６のようなＰＲアンタゴニストにより調
節される、ＮＬＳにおける突然変異を含むＲｅｐ７８／６８タンパク質により構
成され、かつＲＰ８９１の異なる部分に融合した、キメラタンパク質に関する。

【００４９】本発明はまた、Ｒｅｐ７８／６８、Ｒｅｐ７８／６８変異体およびＰＲ８９１
に融合したＲｅｐ７８／６８変異体のための発現ベクターの作製に関する。

【００５０】本発明の好適な実施態様において、Ｒｅｐ／ＰＲ８９１融合タンパク質は、リ
ン酸カルシウム法を使用して培養細胞中に挿入される。しかし、リポソーム、縮
合剤、ＤＮＡおよびウイルスベクターを利用する系などの任意の他の代替の送達
系を利用して同一のタンパク質をエクスビボおよびインビボで細胞へと送達して
もよいことは、当業者には直ちに明らかである。

【００５１】本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の発明に種々の置換と修飾
が適用されることは、当業者には直ちに明らかである。詳細にはＲｅｐ７８／６
８活性を調節するために、ステロイドホルモンに対する異なる受容体（プロゲス
チン受容体、エストロゲン受容体、グルココルチコイド受容体など）のホルモン
結合ドメインを使用することを、理論的に否定するものはない。さらに、非ヒト
ステロイド受容体のホルモン結合ドメインを利用することができる。

【００５２】本発明はまた、成熟ビリオン内の組換えＤＮＡの複製とパッケージングのため
のインビボ系を提供する。本明細書に記載される方法により得られる、成熟ビリ
オン内でキャプシド化していない組換えＤＮＡを含むウイルス調製物は、目的の
任意の細胞または組織内に遺伝情報を伝達するために利用することができる。

【００５３】材料と方法

【００５４】プラスミド作製Ｒｅｐ発現ベクターの作製およびＲｅｐ変異体の作製のための第１工程として
、Ｒｅｐ、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８をコードする領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ II ＳＫ（＋）プラスミド内に挿入した。

【００５５】鋳型として全ＡＡＶ−２ゲノム（サムルスキ（Samulski）ら、１９８７年）、
並びに配列番号１および配列番号２として添付の配列表に記載されるオリゴヌク
レオチドをそれぞれ正および逆のプライマーとして含む、プラスミドｐｓｕｂ２
０１を利用して、４つ全てのＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅ
ｐ５２およびＲｅｐ４０）をコードする全ｒｅｐ読み取り枠を、ポリメラーゼ連
鎖反応により増幅した。増幅した断片は、ＢｇｌII酵素で消化して、Ｔ７プロモ
ーターの転写制御下で単一のＢａｍＨＩ制限部位に挿入することにより、ＢＳ／
Ｔ７／Ｒｅｐプラスミドを得た。ｐｓｕｂ２０１中に含まれる、ＡＡＶ−２ゲノ
ムのヌクレオチド３２１〜ヌクレオチド２２５２までの全配列は、シーケナーゼ
配列決定キット（Sequenase sequencing kit）（ＵＳＢ）を利用するＤＮＡ配列
決定法により試験した。従ってｒｅｐをコードする部分を、ＢＳ／ＲｅｐＴ７
から５’ＳｍａＩ− ３’−ＸｂａＩ断片として切り出し、そしてＥｃｏＲＶ−
ＸｂａＩを用いて消化したｐｃＤＮＡIIIベクター（インビトロゲン（Invitroge
n））中にＣＭＶのプロモーター／エンハンサーの制御下で挿入した。このプラスミドをｐｃＲｅｐと呼んだ。

【００５６】ＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ７８プラスミドは、Ｒｅｐ７８のみをコードするｃＤＮＡ
を含む。これは、Ｒｅｐ５２／４０タンパク質の最初のメチオニンをコードする
９９３〜９９５位のＡＴＧコドンを、グリシンをコードするＧＧＡコドンにより
置換して得た；さらに、ドナーのスプライシング部位は、ｐｓｕｂ２０１に含ま
れるＲｅｐ読み取り枠のヌクレオチド１９０７のＧ塩基を置換して、Ａ塩基を導
入することにより除去した。ＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ６８プラスミドは、Ｒｅｐ６８
のみをコードするｃＤＮＡを含む。これは、Ｒｅｐ６８のカルボキシ末端領域を
コードし、かつｐＫＥＸ６８（ホラー（Horer）ら，J. Virol., 69, 5485-5496,
1995）から誘導されるＳｆｉＩ−ＸｂａＩ断片を、ＢＳ／ＲｅｐＴ７の対応するＳｆｉＩ−ＸｂａＩ断片により置換して作製した。従って、この配列は、ＢＳ
／Ｔ７／Ｒｅｐ７８のようなＭ２２５Ｇ置換、およびアミノ酸５２７〜終止コド
ンまでのそのカルボキシ末端におけるアミノ酸ＡＤＲＬＡＲＧＨＳＬ−終止配列
をコードする。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の発現ベクターを入手するために、
Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８のコード領域を、それぞれＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ７８
およびＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ６８から、５’−ＳｍａＩ／３’−ＸｂａＩ断片とし
て切り出し、５’−ＥｃｏＲ／３’−ＸｂａＩで消化した発現ベクターｐｃＤＮ
ＡIII（インビトロゲン（Invitrogen））内にＣＭＶプロモーター／エンハンサーの制御下でクローン化した。これら２つのプラスミドを、ｐｃＲｅｐ７８およ
びｐｃＲｅｐ６８と呼んだ。

【００５７】Ｒｅｐ７８／６８のカルボキシ末端欠失（ｐＲｅｐΔＣ−４８４、ｐＲｅｐΔ
Ｃ−４９１、ｐＲｅｐΔＣ−５０２、ｐＲｅｐΔＣ−５２０）は、ＰＣＲ方策に
より異なる位置へ終止コドンを挿入することにより、ｐＲｅｐ６８から誘導した
。全てのＰＣＲ断片を生成するために、全ての作製体について、添付の配列表に
配列番号３（ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにコード番号Ｊ０１９０１でファイル
されるＡＡＶ−２配列のヌクレオチド１０００〜１０２２を含む）として記載さ
れる、５’オリゴヌクレオチドに共通のプライマーを使用した。このオリゴヌク
レオチドは、ＧｅｎＥＭＢＬデータベースにコード番号Ｊ０１９０１でファイル
されるＡＡＶ−２配列の１７００〜１７０７位に存在する単一のＢｓｔＥII制限
部位に対して５’位にある。各変異体について、特異的プローブを利用して、３
’で人工終止コドンを挿入し、続いて所望の位置に制限部位ＸｂａＩを挿入した
。この方策によって、ＢｓｔＥII−ＸｂａＩ制限後、ＢｓｔＥII−ＸｂａＩ断片
の代用としてｐＲｅｐ６８カルボキシ末端に使用することができるＰＣＲ断片を
、各変異体について生成することができた。３’で利用される特異的なプローブ
のｐＲｅΔ４８４、ｐＲｅΔ４９１、ｐＲｅΔ５０２およびｐＲｅΔ５２０は、
添付の配列表に配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号７として
開示されている。

【００５８】全ての配列は、シーケナーゼＤＮＡ配列決定キット（Sequenase DNA sequenci
ng kit）（ＵＳＢ）を用いて行われるジデオキシ配列決定法によって確認した。

【００５９】ＲｅΔＮ−Ｐ融合タンパク質を作成するために、適切なオリゴヌクレオチドを
使用し、かつ鋳型としてｐＴ７ｂｈＰＲＢ−８９１を使用して、ｈＰＲのホルモ
ン結合ドメイン（アミノ酸６４０〜８９１を含む）をＰＣＲにより増幅した。Ｐ
ＣＲ断片を、ＲｅΔＣ−４８４をコードするｃＤＮＡと同期した５’−ＥｃｏＲ
Ｉ／３’−ＸｈｏＩ断片としてクローン化したが、これはプラスミドＢＳ／Ｒｅ
ΔＮ−Ｐ内で同様に制限された。得られたプラスミドは、ＢＳ／ＲｅΔＮ−Ｐと
呼んだ。

【００６０】最後に、ＲｅΔＮ−Ｐをコードする全読み取り枠を、ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片
としてプラスミドＢＳ／ＲｅΔＮ−Ｐから切り出して、５’−ＥｃｏＲＶ／３’
−ＸｈｏＩで制限した発現ベクターｐｃＤＮＡIII内に挿入し、プラスミドｐｃＲｅΔＮ−Ｐを得た。

【００６１】融合タンパク質ＲｅｐΔＮ／ＰｎをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドは、
以下のように得られた。最初に、ＲｅΔＣ−４９１をコードするｃＤＮＡをプラ
スミドＢＳΔＸｈｏＩ中に挿入した。従って終止コドンを除去して、ＰＣＲに基
づく突然変異誘発によってＸｈｏＩ部位により置換することにより、プラスミド
ＢＳ／ＲｅΔ４９Δｓｔｏｐを生成した。次に、適切な特異的プローブを使用し
、かつプラスミドｐＴ７ｂｈＰＲＢ−８９１を鋳型として使用して、ｈＰＲのホ
ルモン結合ドメイン（残基６３９〜８９１を含む）に対応するＰＣＲ断片を得た
。次にこの断片をその５’末端でＸｈｏＩにより消化し、３’末端でＸｂａＩに
より消化して、Ｒｅｐ４９１３’末端と同期して、同じ２つの酵素で制限切断
したプラスミドＢＳ／ＲｅΔ４９Δｓｔｏｐに挿入した。得られたプラスミドを
、ＢＳ／ＲｅｐＲｅΔＮ／Ｐｎと呼んだ。最後に、ＲｅｐΔＮ／Ｐｎをコードす
る全読み取り枠を、プラスミドＢＳ／ＲｅｐΔＮ／Ｐｎから断片ＳｍａＩ−Ｘｈ
ｏＩとして切り出して、５’−ＥｃｏＲＶ／３’−ＸｈｏＩ制限発現ベクターｐ
ｃＤＮＡIII（インビトロゲン（Invitrogen））内に挿入することにより、プラスミドｐｃＲｅｐΔＮ／Ｐｎを得た。

【００６２】ＲｅｐΔＮ−Ｐ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを、Ｒ
ｅｐΔＮ／Ｐｎと同一の方策により得たが、唯一の違いは、ＰＣＲにより得られ
るホルモン結合ドメインが、アミノ酸６４２〜アミノ酸８４１を包含することで
ある。この場合も同様に、全ＲｅｐΔＮ−Ｐ読み取り枠は、プラスミドＢＳ／Ｒ
ｅｐΔＮ−ＰからＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片として切り出し、５’−ＥｃｏＲＶ／
３’−ＸｈｏＩ制限発現ベクターｐｃＤＮＡIII（インビトロゲン（Invitrogen ））中に挿入することにより、プラスミドｐｃＲｅｐΔＮ−Ｐを得た。

【００６３】ヒトＰＲの切断型のホルモン結合ドメインとそのカルボキシ末端において融合
したＲｅｐ７８をコードする発現ベクターを得るために、以下の方策を採用した
。先ず最初に、ＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ７８プラスミド終止コドンを、ＰＣＲ方策に
よりＸｂａＩ部位により置換して、プラスミドＢＳ／Ｒｅｐ７ΔＳｔｏｐを作製
した。次に、ｈＰＲホルモンの結合ドメイン（アミノ酸６４０〜アミノ酸８９１
）を、適切な特異的プローブを使用してＰＣＲ反応により、ｐＴ７ｂｈＰＲＢ−
８９１プラスミド（アミノ酸１〜アミノ酸８９１までのヒトプロゲステロン受容
体の読み取り枠を含む）を使用して増幅した。得られた断片は、５’末端でＸｂ
ａＩにより、そして３’末端でＥｃｌXIにより消化して、プラスミドＢＳ／Ｔ７
／Ｒｅｐ７８内のＲｅｐ７８読み取り枠の３’末端に同期してクローン化するこ
とにより、そのカルボキシ末端でホルモン結合ドメインと融合したＲｅｐ７８（
Ｒｅｐ７８／ＰＲｃ）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＢＳ／Ｒｅｐ７８
／ＰＲｃを得た。Ｒｅｐ７８／ＰＲｃのｃＤＮＡは、ＢＳ／Ｒｅｐ７８／ＰＲｃ
から、ＳｍａＩとＮｏｔＩで消化して切り出して、５’−ＥｃｏＲＶ／３’−Ｎ
ｏｔＩ制限ｐｃＤＮＡIIIベクター中にサブクローン化して、プラスミドｐｃＲｅｐ７８／ＰＲｃを得た。

【００６４】切断型のヒトＰＲホルモンの結合ドメインとそのカルボキシ末端で融合したＲ
ｅｐ６８をコードする発現ベクターを得るために、以下の方策を採用した。最初
に、ＸｈｏＩ部位をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）から除去す
ることにより、プラスミドＢＳΔＸｈｏＩを得た。Ｒｅｐ６８コード領域をこの
ベクター中に挿入して、プラスミドＢＳΔＸｈｏＩ／Ｔ７／Ｒｅｐ６８を生成し
た。従って、ｈＰＲホルモンの結合ドメイン（アミノ酸６４０〜アミノ酸８９１
まで）を、適切な特異的プローブを使用してＰＣＲ反応により増幅して、前もっ
て同じ２つの酵素で消化したプラスミドＢＳΔＸｈｏＩ／Ｔ７／Ｒｅｐ６８中に
、読み取り枠のＲｅｐ６８の３’末端と同期させて、５’−ＸｈｏＩおよび３’
−ＸｂａＩ断片として挿入した。得られたプラスミドを、ＢＳ／Ｒｅｐ６８／Ｐ
Ｒｃと呼んだ。

【００６５】そのカルボキシ末端でｈＰＲホルモンの結合ドメインの６４０〜８９１領域と
融合したＲｅｐ６８をコードするｃＤＮＡを、ＢＳ／Ｒｅｐ６８／ＰＲｃから５
’ＳｍａＩ／３’−ＸｂａＩ断片として切り出して、前もってＥｃｏＲＶとＸｂ
ａＩで消化したベクターｐｃＤＮＡIII中に挿入した。得られたプラスミドを、ｐｃＲｅｐ６８／ＰＲｃと呼んだ。

【００６６】スプライシング部位レベルでホルモン結合ドメインと融合したＲｅｐ７８およ
びＲｅｐ６８をコードする発現ベクターを得るために、以下の方策を採用した。
両方の場合で、ホルモン結合ドメインを、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の読み取
り枠に存在するＡａｔII天然部位（ＮＴ１８６８〜１８７３）の内側に挿入した
。ホルモン結合ドメイン（アミノ酸６４０〜アミノ酸８９１まで）を、再びプラ
スミドｐＴ７ｂｈＰＲＢ−８９１を鋳型として使用してＰＣＲ反応により得て、
ＡａｔIIで消化して、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８読み取り枠と同期させて、Ｂ
Ｓ／Ｔ７／Ｒｅｐ７８およびＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ６８のＡａｔII部位においてク
ローン化することにより、プラスミドＢＳ／Ｒｅｐ７８／ＰＲｉｎｔおよびＢＳ
／Ｒｅｐ６８／ＰＲｉｎｔを生成したが、これはスプライシング部位のレベルで
ホルモンの結合ドメインと融合したＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８をコードするｃ
ＤＮＡを含む。両方の融合生成物をコードするｃＤＮＡを、５’−ＳｍａＩ／３
’−ＸｂａＩ断片として、前もってＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化したベクターｐ
ｃＤＮＡIIIの内側に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれｐｃＲｅｐ７８／ＰＲｉｎｔおよびｐｃＲｅｐ７８／ＰＲｉｎｔと呼んだ。

【００６７】そのＮ末端で切断型のヒトプロゲステロン受容体のホルモン結合ドメインと融
合したＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８をコードする発現ベクターを得るために、以
下の方策を採用した。第１工程として、開始コドンＡＴＧをプラスミドＢＳ／Ｔ
７／Ｒｅｐから除去してＳｍａＩ部位で置き換えることにより、プラスミドＢＳ
／Ｔ７／ＲｅΔＡＴＧを得た。従って、鋳型プラスミドｐＴ７ｂｈＰＲＢ−８９
１上の適切なオリゴヌクレオチドを使用して、メチオニンとそれに続くヒトプロ
ゲステロン受容体のホルモン結合ドメインの６４０〜８９１領域から構成される
ホルモン結合ドメインを、ＰＣＲにより得た。このｍｅｔ−ＨＢＤを、５’−Ｃ
ｌａＬ／３’−ＳｍａＩの消化断片として、プラスミドＢＳ／Ｔ７／ＲｅΔＡＴ
Ｇ中のＲｅｐ読み取り枠の５’の前に、およびこれと同期させてクローン化する
ことにより、プラスミドＢＳ／Ｔ７／ＰＲ−Ｒｅｐを得た。最後に、Ｒｅｐ読み
取り枠のカルボキシ末端領域を、５’−ＢａｍＨＩ／３’−ＸｂａＩ断片として
ＢＳ／Ｔ７／ＰＲ−Ｒｅｐから切り出して、ＢＳ／Ｔ７／Ｒｅｐ７８またはＢＳ
／Ｔ７／Ｒｅｐ６８のいずれかから誘導した同様に制限切断された５’−Ｂａｍ
ＨＩ／３’−ＸｂａＩ断片として得たＲｅｐ７８またはＲｅｐ６８のカルボキシ
末端領域で置換した。得られたプラスミドを、それぞれＢＳ／Ｔ７／ＰＲ−Ｒｅ
ｐ７８およびＢＳ／Ｔ７／ＰＲ−Ｒｅｐ６８と呼んだ。

【００６８】そのアミノ末端でｍｅｔ−ＨＢＤと融合したＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８をコ
ードするｃＤＮＡを、それぞれＢＳ／Ｔ７／ＰＲ−Ｒｅｐ７８およびＢＳ−Ｔ７
／ＰＲ−Ｒｅｐ６８からの５’−ＥｃｏＲＶ／３’−ＸｂａＩ断片として、同様
に制限切断されたｐｃＤＮＡIII発現ベクター（インビトロゲン（Invitrogen））内にクローン化して、対応する発現ベクター、すなわちｐｃＰＲｎ／Ｒｅｐ７
８およびｐｃＰＲｎ／Ｒｅｐ６８を得た。

【００６９】インビトロ翻訳ｐｃＤＮＡIIIから誘導されたプラスミドから、赤血球溶解物（プロメガ（Pro
mega））と関連するＴＮＴ／Ｔ７系を使用して製造業者の説明書に従って、イン
ビトロで翻訳されたＲｅｐポリペプチドを合成した。１μgのプラスミドＤＮＡを用いて、４０μCiのＬ−³⁵Ｓメチオニンの存在下で３０℃で２時間、タンパク
質合成と放射性標識を行った。Ｒｅｐタンパク質は、８％ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上での電気泳動を経て、オートラジオグラフにより検出した。ＤＮＡ
およびエンドヌクレアーゼへの結合の種々の比較測定法において使用される、野
生型Ｒｅｐ７８／６８及びＲｅｐ変異体の量を標準化するために、ホスホリマジ
ャー（Phosphorimager）（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics））
を使用して行われる、ゲル濃度計の読みにより種々のＲｅｐタンパク質の相対濃
度を測定した。

【００７０】電気泳動移動度シフト測定法電気泳動移動度シフトの測定法は、一端で³²Ｐ標識した２００００cpm ＡＡＶ−２−ＩＴＲを用いて行った。反応混合物は、１０μl容量の、１０mMヘペス（Hepes）−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、８mM ＭｇＣｌ₂、４０mM ＫＣｌ、０．
２mM ＤＴＴ、１μgポリ（ｄｌ−ｄＣ）中に含まれ、インビトロで翻訳したタンパク質濃度を増大させた。

【００７１】ＤＮＡ結合反応物を、室温で２０〜３０分間インキュベートして、４％フィコ
ール（Ficoll）添加後、０．５×ＴＢＥを含む４％ポリアクリルアミドゲルに接
種した。

【００７２】ｔｒｓエンドヌクレアーゼの測定法ｔｒｓエンドヌクレアーゼ測定法を、以前に記述された（ディー・エス・イム
（D.S. Im）とエヌ・ムジツカ（N. Muzyczka）, Cell 1990, 61, 447-457）よう
に、１本鎖末端分離部位を有するＩＴＲに類似した基質を使用して実施した。プ
ラスミドｐｓｕｂ２０１を、ＸｂａＩとＰｖｕIIで消化し、ウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼで処理して、この断片を５’末端でポリヌクレオチドキナーゼによ
り標識した。次に標識断片を、６％配列決定ゲル上で電気泳動して精製した。エ
ンドヌクレアーゼ反応混合物は、２０μl容量中に、２５mMヘペス（Hepes）−Ｋ
ＯＨ（ｐＨ７．５）、５mM ＭｇＣｌ₂、０．２mM ＥＧＴＡ、１mM ＤＴＴ、０．４mM ＡＴＰ、０．２μg ＢＳＡ、１μgポリ（ｄｌ−ｄＣ）、一端で³²Ｐ
標識した１００００〜２００００cpmの基質を含有し、インビトロで翻訳されたタンパク質濃度を増大した。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、Ｋプロ
テイナーゼで６５℃で３０分間処理し、フェノール／クロロホルムで抽出して、
エタノール中で沈殿させた。従って反応生成物を、８％配列決定ゲルで使用した
。

【００７３】細胞培養およびトランスフェクション。２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位/mlペニシリンおよびストレプトマイシン、２mMグルタミンを補足したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ₂で維持した。２９３細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法により行った。

【００７４】ウェスタンブロット分析Ｒｅｐの発現を分析するために、３×１０⁵個の細胞を１０μgの発現プラスミ
ドによりトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞
をＰＢＳ中で洗浄して、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５mM ＥＤＴＡ
、１％ＳＤＳ中で１mlシリンジを用いて溶解した。溶解物を、１０％ＴＣＡ
により室温で１５分間、および氷中で５分間沈殿させた。１４０００rpmで１５分遠心分離後、沈殿物を１００％冷アセトン中で１５分間、次に１００℃で３分
間洗浄した。タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画して、
電気泳動転移装置を利用してニトロセルロース膜に移した。

【００７５】膜を、ＡＡＶ−２Ｒｅｐタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清と
共にインキュベートして、次に２次の抗ウサギＡＰ結合ＩｇＧと共にインキュベ
ートした。

【００７６】レスキュー複製測定法（ＲＲ）。トランスフェクションの２４時間前に、１．２×１０⁶個の細胞を１０mmプレートに接種して、５％ＣＯ₂中で３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの２時間前に、細胞をＡｄ２によりＭＯＩ１０まで感染させた。トラ
ンスフェクションは、種々の発現ベクター１０μgとＡＡＶ−２−ＩＴＲを含むプラスミド１０μgを使用して、リン酸カルシウム沈殿法により実施した。トランスフェクションの６０時間後、低分子量ＤＮＡを、ハート（Hirt）抽出法によ
り単離し、ＤｐｎＩにより広範に消化して、ＡＡＶ−２ＩＴＲに含まれる配列
に特異的な³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを使用してサザンブロッティングで分析した
。

【００７７】免疫蛍光測定法。免疫蛍光測定法を実施するために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞をスライドで培養して、前
記説明のとおりにトランスフェクションした。トランスフェクションから３６時
間後、細胞を室温で２０分間ＰＢＳ中３％ホルムアルデヒドにより固定し、ＰＢ
Ｓで洗浄して、ＰＢＳ中の０．１Ｍグリシン中で室温で１０分間インキュベート
した。細胞内着色を行うために、スライドを室温で５分間ＰＢＳ中の０．１％ト
リトンと共にインキュベートした。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、マウスモノクロ
ーナルＡｂ抗−Ｒｅｐ１：３０と共にＰＢＳ中の１０％ヤギ血清中でインキュベ
ートして、ＰＢＳ中で洗浄した。２０分のインキュベーション、そして２次ロー
ダミンと結合したヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベーション後、細胞をＰＢ
ＳおよびＨ₂Ｏ中で洗浄して、最後にスライドに載せた。Ｒｅｐカルボキシ末端欠失による変異体の細胞内局在は、ＡＡＶ−２Ｒｅｐに対するウサギポリクロ
ーナル抗体（ＰＢＳ中１０％のヤギ血清で１：２００）、および２次Ａｂとして
ヤギ抗ウサギＩｇＧと結合したフルオレセインを使用して視覚化した。

【００７８】部位特異的な組み込みのＰＣＲ測定法各測定法のために、トランスフェクションの２４時間前に１．２×１０⁶個の２９３細胞を１０mmプレート上に接種して、５％ＣＯ₂中で３７℃でインキュベートした。細胞を、リン酸カルシウム法により、種々の発現ベクター１０μg とＩＴＲが隣接するＤＮＡ配列を有するプラスミド１０μgにより同時トランスフェクションした。同時トランスフェクションの４８時間後、全ゲノムＤＮＡを
抽出して、２回のＰＣＲサイクルを行った。ＰＣＲ混合物は、５０ml容量中に、
ゲノムＤＮＡ５００ng、１０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０mM ＫＣｌ
、２．５mM ＭｇＣｌ₂、２００mMの各三リン酸デオキシヌクレオシド、１．２５Ｕアンプリタック・ゴールド・ポリメラーゼ（AmpliTaq Gold Polymerase）（
パーキンエルマー（Perkin Elmer））および５０pmolの各プライマーを含んでい
た。２回目のＰＣＲサイクルには、１０μlの１回目のサイクルを使用した。条件は、９４℃で１０分間の後に、９４℃で１分間、６０℃で１分間および６２℃
で２分間を２５サイクル行った。

【００７９】第１サイクルプローブ：ｐ１：ＡＡＶ−２（ＩＴＲ）ヌクレオチド４５１３〜４５２２でハイブリダイ
ズされる、配列番号８として配列表に記載されるオリゴヌクレオチド。

【００８０】ｐ２：第１９染色体のヌクレオチド１３２２〜１３４２（ＡＡＶＳ１）におい
てハイブリダイズされる、配列番号９として配列表に記載されるオリゴヌクレオ
チド。

【００８１】第２サイクルプローブ：ｐ３：ＡＡＶ−２ヌクレオチド４５３３〜４５５９においてハイブリダイズさ
れる、配列番号１０として配列表に記載されるオリゴヌクレオチド。

【００８２】ｐ４：第１９染色体のヌクレオチド１１６９〜１１９４においてハイブリダイ
ズされる、配列番号１１として配列表に記載されるオリゴヌクレオチド。

【００８３】ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲル上で分離し、次にフィルターに移し
て、特異的なＩＴＲまたはＡＡＶＳ１プローブ（プローブＩＴＲ：ヌクレオチド
４５６３〜４６７０、プローブＡＡＶＳ１：ヌクレオチド２１０〜１２０７）と
ハイブリダイズさせた。

【００８４】ＰＣＲ反応陽性生成物の末端をクレノー（Klenow）ポリメラーゼ活性でふさぎ
、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫベクター中にクローン化して配列決定した。

【００８５】ここまでは、本発明についての一般的な説明を示した。本明細書後述の例の助
けにより、本発明の適用の目的、特色、利点および方法のより明らかな理解を与
えることを目的としてその具体的な実施態様をさらに詳細に説明する。これらの
例は、単に例示的なものであり、添付の請求の範囲により明確にされる本発明の
範囲を限定するものではない。

【００８６】例１ステロイドホルモン受容体に属するホルモン結合ドメインとのその融合の後に
、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８が、ホルモン調節を受けるかどうかを試
験するために、ヒトプロゲステロン受容体（ｈＰＲ）に対するホルモン結合ドメ
インと融合させた。さらに具体的には、我々は、プロゲステロンと結合しないが
、むしろ通常プロゲステロンのアンタゴニストとして作用するＲＵ４８６のよう
な、その合成類似体のいくつかと結合し、かつこれらにより活性化されるＰＲホ
ルモンであるｈＰＲの結合ドメインのカルボキシ末端（アミノ酸６４０〜８９１
）が切断された型を利用した。

【００８７】６つの異なる融合タンパク質（３つはＲｅｐ７８、そして３つはＲｅｐ６８に
ついて）を作成した。基本的に、ホルモン結合ドメインは、アミノ末端、カルボ
キシ末端、またはＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８のスプライシング接合部のレベルに
入れた。融合タンパク質の図式的構造は、図１に表示する。これらのキメラタン
パク質をコードするｃＤＮＡは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー
／プロモーターの制御下で適切な発現ベクター内に入れた。全ての融合生成物の
発現を試験するために、対応する発現ベクターをヒト２９３細胞中でトランスフ
ェクションした。トランスフェクションの４８時間後、全細胞抽出物を調製して
、ウェスタンブロッティング法により分析した。多くの参照が２９３細胞で行わ
れたのは、２９３細胞がＡｄベクターパッケージングのための細胞であるためで
あることを強調することが重要である。本測定法を使用すると、ホルモン結合ド
メインがカルボキシ末端またはＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８のスプライシング部位
のレベルで挿入された融合体は明らかに目立つ。逆に、２つのＮ末端融合のため
の発現ベクターを２９３細胞においてトランスフェクションしたとき、予測分子
量より低いバンドがスポットされた。これは、このタンパク質が不安定であるか
、または翻訳が人工的に挿入したものとは異なる内部メチオニンから開始したこ
とを示すのであろう。対照実験は、細胞内でトランスフェクションした同じ発現
ベクターを使用するインビトロ翻訳実験により、所望の大きさのＮ末端融合体を
産生できたことを証明した。このことは、観察された細胞の小ささが、おそらく
Ｎ末端融合産物が細胞内プロテアーゼによって部分的に分解されるという事実の
ためであることを強く示唆している。

【００８８】例２次にレスキュー複製測定法において融合タンパク質活性を試験した。Ｒｅｐ７
８／６８が、Ａｄ感染細胞において、組換えプラスミドからの遊離と、ＡＡＶ−
２ＩＴＲに含まれる各ＤＮＡ配列の複製を促進することができることは知られ
ている（図２を参照のこと）。この測定法において、細胞で正しく発現される４
つの融合タンパク質（Ｒｅｐ７８／ＰＲｃ、Ｒｅｐ６８／ＰＲｃ、Ｒｅｐ７８／
ＰＲｉｎｔ、Ｒｅｐ６８／ＰＲｉｎｔ）が、外部から添加されるＲＵ４８６によ
り調節されるかどうかを試験するために、本明細書の後述の実験を行った。１０
μgの種々の発現ベクターを、Ａｄ感染１９３細胞において、１０μgのいわゆる
「複製基質」、すなわち、ＡＡＶ−２ＩＴＲ内に位置するいずれかのＤＮＡセ
グメント（この具体的なケースでは、ベータ−ガラクトシダーゼ酵素（β−Ｇａ
ｌ）とヒグロマイシン（Hygromycin）耐性遺伝子をコードする配列）を含むプラ
スミドと共に同時トランスフェクションした。対照実験では、細胞を、Ｒｅｐ７
８とＲｅｐ６８のための発現ベクターでトランスフェクションした。トランスフ
ェクションの５時間後、細胞を洗浄して培地を交換した。各作製体について、２
つのプレートのトランスフェクションした細胞を、１００mMおよび１μMのＲＵ４８６で処理して、一方未処理細胞を基底活性レベルの対照として使用した。ト
ランスフェクションの６０時間後、低分子量ＤＮＡを単離して、ＤｐｎＩ制限酵
素で消化した。この酵素は、認識配列の両方のアデノシンがメチル化されると、
はるかに大きな活性を有する：残基のアデニンメチル化は、真核生物メチラーゼ
によって行われないため、ＤｐｎＩ耐性への変換は、半メチル化またはメチル化
が存在しないことは、真核生物宿主における１回または２回のＤＮＡ複製サイク
ルの結果であることを示す。ＤｐｎＩ消化ＤＮＡを、ｂ−ＧａｌｃＤＮＡに対
して特異的な³²Ｐ標識ＤＮＡプローブを使用して、サザンブロットにより分析し
た。Ｒｅｐ融合タンパク質のＲＵ４８６による基底活性レベルおよびホルモン誘
導性の評価は、種々の実験条件で複製されるプラスミドに対応するバンドの強度
を比較して行った。図２に示す結果は、これらの実験条件下でＲｅｐ７８および
Ｒｅｐ６８融合タンパク質は、実質的にＲＵ４８６により影響されない、かなり
高い基底活性レベルを有することを示している。

【００８９】例３次に、融合タンパク質が、ＩＴＲが隣接するＤＮＡ配列のヒト第１９染色体に
おける部位特異的な組み込みを促進することができるかどうか試験することにし
た。これは、ホルモン結合ドメインの存在が、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の組
み込み能力に負に影響するかどうかを決定するために行った。このために、短期
組み込み測定法を開発した。これらの実験条件下では、細胞は、Ｒｅｐのための
発現ベクターとＡＡＶＩＴＲに含まれるＤＮＡ配列を含むプラスミド（この場
合、フック（Hook）抗体（インビトロゲン（InVitrogen）（登録商標））とネオ
マイシン耐性遺伝子）により、同時トランスフェクションされる。対照実験では
、細胞は組み込みカセットだけでトランスフェクションする。トランスフェクシ
ョンの２日後、細胞を回収して、高分子量ＤＮＡを抽出して、ＩＴＲ−ａａｖｓ
１接合部に隣接するはずのプライマーを使用するＰＣＲ反応の鋳型として使用す
る。最初の増幅は、ＩＴＲに対するプライマー（ヌクレオチド４５１３〜４５２
２、ｐｓｕｂ２０１ベクターの右側ＩＴＲ）を、ａａｖｓ１領域ヌクレオチド１
３３２〜１３４２に対する特異的プライマーと組合せて使用して実施した。従っ
てこの増幅産物の一部は、ＩＴＲ（ｎｔ４５３３〜４５５９）とａａｖｓ１（ｎ
ｔ１１６９〜１１９４）の両方に対する、他の特異的なオリゴヌクレオチド（こ
れらは、内部であり、従って以前に使用したものとは異なる）を使用する２回目
のＰＣＲ反応（ネステッドＰＣＲと呼ばれる）に付した。この最後の増幅産物を
、アガロースゲルの電気泳動にかけて、ａａｖｓ１−およびＩＴＲ−誘導プロー
ブとハイブリダイズする：両方のプローブにより同定されるシグナルは、ＩＴＲ
−ａａｖｓ１接合部の特異的な増幅に由来するものと考えられ、従って真の部位
特異的な組み込みの発生と評価される。典型的な実験を表す図４に示されるよう
に、Ｒｅｐを含まない組み込みカセットでトランスフェクションした細胞では、
全くシグナルが検出されない；逆に、正のシグナル、すなわち、部位特異的な組
み込みの発生が、ＡＡＶ−ＩＴＲが隣接する遺伝子カセットを含むベクターと、
Ｒｅｐ６８および７８両方のための発現ベクターで同時トランスフェクションし
た細胞では両方のプローブにより検出される。同様の結果が、２９３細胞、Ｈｅ
ｐＧ２、ＨｅｌａおよびＨｕｈ７で得られた（データは示していない）。正のシ
グナルがアガロースゲル上の幅として出現するという事実は、部位特異的な組み
込みが、ヒト第１９染色体の少なくとも１００bpを包含する領域で起こりうると
いう観察と矛盾がなく、従って増幅ＩＴＲ−ａａｖｓ１接合部が、種々の大きさ
のものであることが予想される。

【００９０】例４Ｒｅｐ７８／ＰＲｃ、Ｒｅｐ６８／ＰＲｃ、Ｒｅｐ７８／ＰＲｉｎｔ、Ｒｅｐ
６８／ＰＲｉｎｔの組み込み能力は、２９３細胞で行われる短期組み込み測定法
で試験した。得られた結果（表１に要約）は、本測定法で測定すると、全ての融
合産物が、部位特異的な組み込みを促進できることを示している。しかしこの場
合もまた、ホルモン制御は全く観察されなかった。

【００９１】

【表１】

【００９２】例５融合タンパク質の核局在を、免疫蛍光実験により確認した。受容細胞として、
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を選択した。すなわち、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ
６８およびこれらのキメラ誘導体のための発現ベクターでトランスフェクション
した：これら後者のタンパク質について、トランスフェクションした細胞を、１
μM ＲＵ４８６で処理したか、またはしなかった。トランスフェクションの３６時間後、適切な条件下で固定して、細胞内Ｒｅｐ分布を、Ｒｅｐ７８／６８に
対するウサギポリクローナル抗血清と、フルオレセインと結合したヤギ抗ウサギ
ＩｇＧで連続的にインキュベートすることによりモニターした。得られた結果を
表２に要約する。

【００９３】

【表２】

【００９４】結果は、特異的な表現型のＲｅｐペプチドを発現する細胞の百分率として与え
られる：Ｎ＞Ｃ：主として核内にＲｅｐを発現する細胞；Ｎ＜Ｃ：主として細胞質にＲｅｐを発現する細胞；Ｎ＝Ｃ：Ｒｅｐ発現が、支配的な細胞内局在を示さない細胞。

【００９５】これらの実験から、いくつかの明快な結論が引き出された：１）予想されるよ
うに、野生型Ｒｅｐ６８とＲｅｐ７８は、ほぼ独占的に核内に局在する；２）融
合タンパク質の細胞内の局在は、ＲＵ４８６により調節される；３）カルボキシ
末端にホルモン結合ドメインを有する融合タンパク質（Ｒｅｐ６８／ＰＲｃとＲ
ｅｐ７８／ＰＲｃ）では制御が厳密である：しかしこのケースではまた、未処理
細胞の核内に少量の溶液生成物が存在する；４）ＲＵ４８６が存在しない場合で
も、少量の融合産物が核内に存在するという証拠は、なぜ全ての融合産物が、レ
スキュー複製測定法と組み込み測定法の両方で強い基底活性を有するかというこ
とを、少なくとも部分的に説明しうる。

【００９６】例６融合タンパク質Ｒｅｐ７８／６８をホルモン制御に付すために、１）全タンパ
ク質と同じ活性を有するＲｅｐ７８／６８最小領域の同定；２）Ｒｅｐ７８／６
８ＮＬＳの正確なマッピング；３）ホルモン依存性Ｒｅｐ／ＰＲ融合タンパク
質の作製のためのこれら２つの実験から得られた情報の利用、とを目的とするＲ
ｅｐ７８／６８突然変異誘発を行うことにした。

【００９７】Ｒｅｐ７８／６８核局在化シグナル（ＮＬＳ）は、他の研究グループによりほ
ぼアミノ酸４８０と５２０の間にあることが突きとめられた。この情報に基づき
、我々は、Ｒｅｐ７８／６８の４つのカルボキシ末端欠失体を作製した。これら
は、全ての推定ＮＬＳを含むＲｅｐΔＣ−５２０（Ｒｅｐ７８／６８の最初の５
２０個のＮ末端アミノ酸を含む）；ＮＬＳの一部を構成するであろう、第１群の
正に荷電した残基が欠失しているＲｅｐΔＣ−５０２；第２群の正に荷電したア
ミノ酸が除去されているＲｅｐΔＣ−４９１、および最後にＲｅｐΔＣ−４８４
である。これらの構造は、図３に図式的に示す。これらが、実際にＲｅｐ６８の
カルボキシ末端欠失として考えうることが注目された。これらの変異体をコード
するｃＤＮＡを、適切な真核生物発現ベクター中に挿入して、インビトロおよび
インビボで試験した。

【００９８】インビトロ実験に関して、４つの変異体並びに野生型タンパク質をインビトロ
翻訳により産生して、ＤＮＡへのこれらの結合活性およびエンドヌクレアーゼ活
性について測定した。ＤＮＡ結合に関して、ＥＭＳＡ（電気泳動移動度シフト測
定法）において、ＡＡＶ−２ＩＴＲに含まれるＲｅｐ結合部位を包含する２本
鎖オリゴヌクレオチドに結合するこれらの変異体の能力を測定した。図４に示す
ように、弱いＤＮＡ結合活性を示したＲｅｐΔＣ−４８４を唯一の例外として、
全てのＲｅｐΔＣ変異体は、野生型Ｒｅｐ６８と同様にＤＮＡ上のこれらの認識
配列と結合した。

【００９９】同じ変異体を、明確な測定法（材料と方法を参照のこと）を使用して、鎖特異
的および部位特異的にＡＡＶ−２ＩＴＲを切断するこれらの能力について試験
した。この場合も、ＲｅｐΔＣ−４８４だけが、野生型Ｒｅｐ６８に比較して（
明白に識別可能ではあるが）弱い活性を示した（図５を参照のこと）。

【０１００】従ってこれら４つの変異体の機能的特性を、トランスフェクションした細胞で
試験した。第１シリーズの実験では、上に示したプロトコールを利用して、これ
ら４つの欠失変異体の細胞内局在を測定した。結果は表３に要約する。

【０１０１】

【表３】

【０１０２】予測されるように、ＲｅｐΔＣ−４８４は、全く核局在ではなかった：他の変
異体については、核内にタンパク質を発現するトランスフェクションした細胞で
百分率の漸進的増大がある。ＲｅｐΔＣ−４９１変異体は、既に部分的に核に局
在している：詳細には、トランスフェクションした細胞の１７％で、タンパク質
は専ら核内に局在し、トランスフェクションした細胞の４２％では、タンパク質
は核と細胞質の両方に見い出された。ＲｅｐΔＣ−５０２変異体に関しては、ト
ランスフェクションした細胞のわずか１％で、タンパク質は専ら細胞質に局在し
た。ＲｅｐΔＣ−５２０は、野生型Ｒｅｐ６８と同様に挙動した。全体として、
これらの実験では、ＲｅｐＮＬＳは、少なくとも３つの領域に機能的に細分す
ることができる：アミノ酸４８４〜４９１を含むＮ１；アミノ酸４９１〜５０２
を含むＮ２、およびアミノ酸５０２〜５２０を含むＮ３。Ｎ１が、単独でもＲｅ
ｐタンパク質の核内局在を促進するのに充分であることを認めることが重要であ
る。さらに、免疫蛍光実験による細胞内局在の数値評価は、我々の目的（すなわ
ち、Ｒｅｐ７８／６８のＮＬＳのマッピング）のためには非常に有用ではあるも
のの、測定法の相対感度により制限されるという事実は強調する必要がある：こ
のことは、それらの核局在について陰性であると考えられる細胞においても、検
出不可能な核内Ｒｅｐレベルが実際には存在しうるということを、我々は（考慮
から）除外できないということを意味する。

【０１０３】従ってＲｅｐΔＣ変異体を、上記したプロトコールにより、レスキュー複製測
定法で測定した。

【０１０４】結果を図６に示す。ＲｅｐΔＣ−４８４は、ＩＴＲが隣接する配列のレスキュ
ー複製を促進できない：この結果は、レスキュー複製が、細胞核において起こり
、そこにこの変異体が移動できないことが知られているため、予測された。逆に
、全ての他の変異体は、野生型Ｒｅｐ６８のように活性である。全ての変異体が
、異なる強さの核局在化シグナルを含有するにもかかわらず、レスキュー複製測
定法において同じ活性を有するという事実は、驚くべきことではない：実際、非
常に低いレベルの核内Ｒｅｐであっても、なお効率的なレスキュー複製を促進す
ることができ、そして上に証明されるように、免疫蛍光実験によるＲｅｐタンパ
ク質細胞内局在の定義は、いくつかの限界を与える。

【０１０５】最後に、ＲｅｐΔＣ変異体の能力を、短期組み込み測定法により証明した。結
果は図７に示すが、そこでは平易さのために、ａａｖｓ１プローブハイブリダイ
ゼーションだけを示す。予想通り、核に入らないＲｅｐΔＣ４８４を唯一の例外
として、すべての変異体は、部位特異的な組み込みを促進することができた。

【０１０６】データ分析を容易にするために、４つのＲｅｐΔｃ変異体を用いてインビトロ
およびインビボで得られた結果を、表４に要約する。

【０１０７】要約すると、これら全ての実験により、野生型Ｒｅｐ６８の全ての活性を含む
最小Ｒｅｐ領域は、最初の４９１個のアミノ末端アミノ酸を包含するもの（Ｒｅ
ｐΔＣ−４９１）であることが証明される：このタンパク質は、インビトロＲｅ
ｐ６８と同じ活性（ＤＮＡへの結合およびエンドヌクレアーゼ活性）を有してお
り、かつ機能性の観点から重要なＮＬＳ領域を含む。

【０１０８】例７カルボキシ末端部分の欠失による変異体により得られた結果に基づき、ｈＰＲ
ホルモンの結合ドメインで融合した、異なるＲｅｐ６８欠失変異体により構成さ
れる、３つのさらなるＲｅｐ／ＰＲ融合タンパク質を作製することにした。詳細
には我々は、全活性をなお維持し、部分的に損傷したＮＬＳを有するＲｅｐ６８
の小領域であるＲｅｐΔ４９１を、ホルモン結合ドメインにおいて融合すること
にした。これは、核局在に関して、融合生成物のホルモン依存性を強化すること
が予想される：さらに、Ｒｅｐタンパク質の大きさの減少は、リガンドが存在し
ない場合の融合生成物上のホルモン結合ドメインが示す立体障害を促進すること
が予想される。

【０１０９】第一の融合は、ＲｅｐＮＬＳの一部（領域Ｎ１、上記を参照のこと）を含有
するアミノ酸１〜４９１を含むＲｅｐ領域を、６３９から８９１の残基を含むｈ
ＰＲ領域と同期させて接合して行った。この変異体は、Ｒｅｐ１ΔＮ／Ｐｎと呼
んだ：この構造の図式的表示を、図８に示す。同じ図では、クローン化（clonat
ion）の結果による理由により、２つの擬似のアミノ酸の挿入（すなわち、ロイシン残基とグルタミン酸残基が、Ｒｅｐ領域とホルモン結合ドメインの間に）が
検出されたことを示している。さらに、図８は、ホルモン結合ドメインの選択さ
れた領域が、ＰＲに通常存在する３つの核局在化シグナルのうちの１つの部分と
考えられる、２つのリジン残基（Ｋ６４０とＫ６４１）を含むことを示している
。

【０１１０】第二の融合は、アミノ酸１〜４９１を含むＲｅｐ領域を、６４２から８９１ま
での残基を含むｈＰＲ領域と同期させて接合して行った：この最後の領域は、リ
ジン残基Ｋ６４０とＫ６４１を含まない。この変異体はＲｅｐ１ΔＮ／Ｐと呼ん
だ。その構造を、図８に図式的に示す：この場合も、Ｒｅｐ領域とホルモン結合
ドメインの間に、１つのロイシン残基と１つのグルタミン酸の挿入がある。

【０１１１】第３の融合は、ＲｅｐΔＣ４８４（このタンパク質は、ＤＮＡへの結合とエン
ドヌクレアーゼ活性に関して、野生型Ｒｅｐ７８／６８活性を部分的に維持して
いるが、核局在化シグナルを持たないため、インビボ活性は全く有しない）を使
用して行った。従って我々は、アミノ酸１〜４８４を含むＲｅｐ領域を、６３５
から８９１までの残基を含むｈＰＲ領域と同期させて接合して、第３の融合を生
成した：この最後の領域は、ｈＰＲに存在する３つの核局在化シグナルのうちの
１つを含む。この変異体は、ＲｅｐΔＮ−Ｐと呼んだ。その構造を、図８に図式
的に示す：この場合、Ｒｅｐコード配列を、ホルモン結合ドメインと直接同期さ
せて接合する。

【０１１２】３つの融合の全ては、対応する発現ベクターと適切なプラスミド基質によるＡ
ｄ感染２９３細胞のトランスフェクションを実施する、レスキュー複製測定法に
より試験した。図９に示すように、これらの実験条件下では、ＲｅｐΔＮ−Ｐは
、完全なホルモン依存性を明示した：ホルモンの非存在下では全く活性が観察さ
れなかったが、１μM ＲＵ４８６により明白な活性化が観察された。異なる実験により、この活性化が用量依存性である（１０pM ＲＵ４８６では低活性が観
察され、１０μMで変動の少ない（プラトー）レベルであった）ことが証明された（データは示していない）。どのケースでも融合産物の活性は、野生型Ｒｅｐ
６８の活性ほど高くなかった：これは、ＲｅｐΔＣ−４８２の低い活性によるも
のと考えられる。

【０１１３】図１０に示すように、他の２つの融合産物もまた、ホルモンで調節される。こ
の場合、ＲＵ４８６の非存在下では基底活性があった：しかしこの活性は、ホル
モン添加により著しく増強された。興味深いことに、ホルモン結合ドメインが、
どの核局在化シグナルも含まないＲｅｐΔ１Ｎ／Ｐでは、制御はより厳密であっ
た。

【０１１４】最後に３つの変異体は、上述のように２９３細胞で行う短期組み込み測定法で
試験した。ａａｖｓ１誘導プローブによるハイブリダイゼーションフレームを示
す図１１に示すように、ＲｅｐΔＣ４８４から誘導された融合生成物ＲｅｐΔＮ
−Ｐは、ＲＵ４８６の存在下でも、部位特異的な組み込みを促進することができ
ない。ＲｅｐΔＮ−Ｐ融合体が、レスキュー複製は促進できるが、部位特異的な
組み込みはできないという観察は、レスキュー複製（ＲＲ）が、はるかに高感度
測定法から証明されるという事実により高い確率で説明される。実際、ＲＲでは
初めの事象であるＩＴＲが隣接する配列の遊離は、遊離断片のそれに続く複製に
より主として増幅される。

【０１１５】興味深いことに、他の２つの融合体Ｒｅｐ１ΔＮ／ＰとＲｅｐ１ΔＮ／Ｐｎは
、両方とも部位特異的な組み込みを促進することができた（図１１を参照のこと
）。この場合、ホルモンの非存在下では何のシグナルも観察されなかったが、１
μM ＲＵ４８６の存在下では特異的なシグナルが検出された。結果の妥当性をさらに試験するために、我々は、ａａｖｓ１およびＩＴＲプローブと同時ハイブ
リダイズするだけでなく、アガロースゲルの臭化エチジウムによる染色後、明ら
かにわかる、各変異体に１つの、２つの増幅接合部をクローン化して配列決定し
た。Ｒｅｐ１ΔＮ／ＰとＲｅｐ１ΔＮ／Ｐｎについて得られた接合配列は、図８
に示される：両方とも、ＡＡＶ−２感染細胞により誘導された接合の配列と良好
に一致している。

【０１１６】要約すると、得られた結果は、タンパク質の大きさとその天然ＮＬＳ（核局在
化シグナル）の強度を低減させることにより、ホルモン依存性Ｒｅｐ７８／６８
型を作製することが可能であることを証明している。

【０１１７】（引用文献） Balaque, C., M. Kalla,およびW.-W-Zhang (1997). アデノ関連ウイルスＲｅｐ７８タンパク質および末端反復は、細胞ゲノムへのＤＮＡ配列の組み込みを強
化する。J. Virol. 71: 3299-3306. Kotin, RM,ら, 1990, PNAS USA, 87:2211-2215. Samulski, RJら, 1991, EMBO J. 10:3941-3950. Carter, BJ. 「パルボウイルスのハンドブック」（"Handbook of Parvoviruse
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ンパク質を誘導可能に発現する細胞株の性状解析。J. Virol. 68: 4847-4856.

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８とプロゲステロンＨＢＤとの融合により得られた
種々の融合タンパク質の図式的な表示を示す。

【図２】ｒｅｐ６８およびｒｅｐ７８からプロゲステロンＨＢＤとの融合により得られ
た種々の融合タンパク質を使用して得られた、レスキュー複製実験の結果を報告
する、電気泳動ゲルの写真を示す。

【図３】Ｃ末端領域中の欠失により得られたｒｅｐ６８／７８ムテインの図式的な表示
を示す。Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３は、核局在化ドメインの領域を同定する。

【図４】Ｃ末端領域中の欠失により得られたｒｅｐ６８／７８ムテインと、ＡＡＶ−２ＩＴＲｓ内に含有される認識配列を有するＤＮＡとの特異的結合実験の結果を
報告する、電気泳動ゲルの写真を示す。

【図５】Ｃ末端領域中の欠失により得られたｒｅｐ６８／７８ムテインのエンドヌクレ
アーゼ活性実験の結果を報告する、電気泳動ゲルの写真を示す。

【図６】Ｃ末端領域中の欠失により得られたｒｅｐ６８／７８ムテインのレスキュー複
製実験の結果を報告する、サザンブロットの写真を示す。

【図７】Ｃ末端領域中の欠失により得られたｒｅｐ６８／７８ムテインにより仲介され
る、具体的にａａｖｓ１部位上の組み込み活性実験の結果を報告する、サザンブ
ロットの写真を示す。

【図８】プロゲステロンＨＢＤとの融合により、ｒｅｐ６８と７８ムテインにより得ら
れる種々の融合タンパク質の図式的表示を示す。

【図９】Ｃ末端領域中の欠失により得られた１つのｒｅｐ６８／７８ムテインとプロゲ
ステロンＨＢＤと融合した対応するムテインとを用いる、ＲＵ４８６の存在に依
存する、レスキュー複製実験の結果を報告する、サザンブロットの複数の写真を
示す。

【図１０】Ｃ末端領域中の欠失により得られた複数のｒｅｐ６８／７８ムテインとプロゲ
ステロンＨＢＤと融合した対応するムテインとを用いる、ＲＵ４８６の存在に依
存する、レスキュー複製実験の結果を報告する、サザンブロットの１枚の写真を
示す。

【図１１】Ｃ末端領域中の欠失により得られ、プロゲステロンＨＢＤと融合したｒｅｐ６
８/７８により仲介される、ＲＵ４８６の存在に依存する、部位特異的組み込み実験の結果を報告する、サザンブロットの写真を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月２８日（２０００．２．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項３６】ムテインは、リポソームにより細胞内に挿入される、請求
項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１４日（２０００．１２．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１８

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者シリベルト、ジェナロイタリア国ローマ、ビアレコリポルツエンシ、 242 パル、６Ｆターム(参考） 4B024 BA01 BA63 CA04 DA02 EA02 EA04 GA13 GA14 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ79 QR32 QR40 QR56 QR62 QR77 QR80 QS05 QS24 QS25 QS33 QS34 QS36 QX01 4B065 AA92X AA92Y AA95Y AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA13 NA13 NA14 ZB212 ZC031 ZC032 4H045 AA10 BA10 BA41 CA01 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７
８タンパク質のムテインであって、残基４８０〜残基５２０までを含む領域に少
なくとも１つの突然変異を含み、該突然変異は、核局在化シグナルを部分的また
は全体的に不活性化することができ、場合により野生型Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ
７８の残基５２１〜カルボキシ末端までの配列が存在しており、ステロイドホル
モンに対する結合ドメインと融合している、上記ムテイン。
【請求項２】突然変異は、残基４８０〜残基５２０までを含む領域の少な
くとも１つのアミノ酸の欠失に存在する、請求項１に記載のＲｅｐ６８タンパク
質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項３】欠失は、残基４８５〜残基５２０までである、請求項２に記
載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項４】欠失は、残基４９２〜残基５２０までである、請求項２に記
載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項５】欠失は、残基５０５〜残基５２０までである、請求項２に記
載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項６】野生型Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８の残基５２１〜カルボキ
シ末端までの配列が存在しない、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＲｅｐ６
８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項７】ステロイドホルモンに対する結合ドメインは、プロゲスチン
受容体のホルモン結合ドメイン、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン、
グルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメインおよびミネラルコルチコイド
受容体のホルモン結合ドメインからなる群から選択される、請求項１〜６のいず
れか１項に記載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン
、およびこれらの誘導体化されたムテイン。
【請求項８】受容体およびホルモンは、哺乳動物起源である、請求項７に
記載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項９】受容体およびホルモンは、ヒト起源である、請求項７に記載
のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項１０】ホルモン受容体の結合ドメインは、プロゲステロンに対す
る受容体の結合ドメインである、請求項７または９に記載のＲｅｐ６８タンパク
質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項１１】ドメインは、残基６４０〜残基９３３までのアミノ酸の配
列に存在する、請求項１０に記載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タン
パク質のムテイン。
【請求項１２】ドメインは、４２個のＣ末端アミノ酸の欠失について突然
変異しており、アミノ酸６４０〜８９１からなる、請求項１１に記載のＲｅｐ６
８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項１３】ステロイドホルモンに対する結合ドメインは、Ｒｅｐ６８
またはＲｅｐ７８ムテインのカルボキシ末端に位置する、請求項１〜１２のいず
れか１項に記載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテイン
。
【請求項１４】残基４８０〜残基５２０までの領域に少なくとも１つの突
然変異を含んでなり、場合により野生型Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８の残基５２
１〜カルボキシ末端までの配列が存在している、Ｒｅｐ６８タンパク質またはＲ
ｅｐ７８タンパク質のムテイン。
【請求項１５】アデノ関連ウイルスは、２型のアデノ関連ウイルスである
、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７
８タンパク質のムテイン。
【請求項１６】請求項１〜１５のいずれか１項に記載のムテインからなる
群から選択されるムテインをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１７】配列は、ｃＤＮＡから構成される、請求項１６に記載のム
テインをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１８】ＲｅｐΔＮ−Ｐをコードする配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項１９】Ｒｅｐ１ΔＮ／Ｐｎをコードする配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項２０】Ｒｅｐ１ΔＮ／Ｐをコードする配列を含むＤＮＡ配列。
【請求項２１】請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含
むベクター。
【請求項２２】ベクターはウイルスベクターである、請求項２１に記載の
ベクター。
【請求項２３】ベクターはプラスミドベクターである、請求項２１に記載
のベクター。
【請求項２４】アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８ポリペプチドまたはＲｅ
ｐ７８ポリペプチドの細胞内活性を調節する方法であって、本質的に：ａ）部分的または全体的に不活性な核局在化シグナルを有する少なくとも１つ
のＲｅｐ６８タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質をコードするＤＮＡ配列で
あって、ステロイドホルモンまたはその誘導体に対する結合ドメインをコードす
る配列に機能的に結合しているＤＮＡ配列を、細胞内に導入する工程；ｂ）ステロイドホルモンまたは結合ドメインに結合することができるステロイ
ドホルモン類似体を、細胞に添加する工程、の組合せを含んでなる、上記方法。
【請求項２５】工程ａ）のＤＮＡ配列は、請求項１６〜２０に記載の配列
の１つである、請求項２４に記載の、アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８ポリペプ
チドまたはＲｅｐ７８ポリペプチドの細胞内活性を調節する方法。
【請求項２６】工程ａ）およびｂ）の結合ドメインは、請求項７〜１０に
記載の結合ドメインの１つである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】ＤＮＡ配列は、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の
ベクターによる感染によって、細胞に挿入される、請求項２４〜２６のいずれか
１項に記載の方法。
【請求項２８】ＤＮＡ配列が、電気穿孔法、ジエチルアミノエチルデキス
トラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）によるトランスフェクション、リン酸カルシ
ウムトランスフェクション、ＤＮＡガンおよびリポソーム介在性遺伝子形質導入
からなる群から選択されるＤＮＡの伝達法により、細胞に挿入される、請求項２
４〜２７に記載の方法。
【請求項２９】アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８ポリペプチドまたはＲｅ
ｐ７８ポリペプチドの細胞内活性を調節する方法であって、本質的に：Ａ）ステロイドホルモンまたはその誘導体に対する結合ドメインをコードする
配列に融合している、部分的または全体的に不活性なＮＬＳを有するＲｅｐ６８
タンパク質またはＲｅｐ７８タンパク質のムテインを、細胞内に導入する工程；Ｂ）ステロイドホルモンまたは結合ドメインに結合することができるステロイ
ドホルモン類似物質を添加する工程、の組合せを含んでなる、上記方法。
【請求項３０】工程Ａ）のムテインは、請求項１〜１５に記載のムテイン
である、請求項２９に記載の、アデノ関連ウイルスのＲｅｐ６８ポリペプチドま
たはＲｅｐ７８ポリペプチドの細胞内活性を調節する方法。
【請求項３１】細胞は、真核生物細胞である、請求項２４〜３０のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項３２】細胞は、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】細胞は、ヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】細胞は、２９３細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】ムテインは、リポソームにより細胞内に挿入される、請求
項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。