JP2001523960A

JP2001523960A - ストレプトコッカス・ニゥモニエからのヒト補体ｃ３分解性プロテイナーゼ

Info

Publication number: JP2001523960A
Application number: JP54636198A
Authority: JP
Inventors: ケー．ホステッター，マーガレット; ダニー，ゲイリー; エス．ナンディワダ，ラクシュミ
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2001-11-27
Also published as: CN1253589A; BR9809405A; KR100544594B1; WO1998048022A9; AU740153B2; CA2283755A1; KR20010012096A; AU7156698A; WO1998048022A1; EP0977872A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により発現されたヒト補体Ｃ３分解性プロテイナーゼの１ファミリーの同定および使用に関する。このプロテイナーゼは１０％のポリアクリルアミドゲル上で測定して約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する。本発明の好ましいプロテイナーゼは配列番号：２のアミノ酸配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ストレプトコッカス・ニゥモニエからのヒト補体Ｃ３分解性プロテイナーゼ発明の分野本発明はストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関し、特に本発明はヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができるストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のタンパク質の同定に関する。発明の背景この出願は仮出願Ｎｏ．６０／０４４，３１６（出願日：１９９７年４月２４日、発明の名称「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのヒト補体Ｃ３分解性プロテイナーゼ」）の利益を請求する。細菌ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以後、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による呼吸器の感染は、毎年推定して５００，０００の肺炎の症例および４７，００００人の死に導く。菌血性肺炎球菌の感染の最高の危険性にある人は、２歳以下の乳児および中年すぎの人である。これらの個体群において、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（以後、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は細菌性肺炎および腹膜炎の主要な原因である。そのうえ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはすべての年齢の子供における耳の感染の主要な細菌の原因である。子供および中年すぎの人の双方は、細菌のコロニー化後、局所的または全身的感染後、または精製された多糖を使用するワクチン接種後、肺炎球菌の莢膜多糖に対する保護的抗体の合成を欠如する。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ＨＩＶ感染を有する成人および子供の双方における侵入性細菌の呼吸器疾患の主要な原因であり、そしてこれらの患者において血行性感染を生成する（Ｃｏｎｎｏｒ、ｅｔａｌ．、ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＡＩＤＳ１９８７；１：１８５−２０９およびＪａｎｏｆｆ、ｅｔａｌ．、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９９２；１１７（４）：３１４−３２４）。重度の感染のための最大の危険を示す個体は、現在の莢膜多糖のワクチンに対して抗体を作ることができない。その結果、現在臨床的実験において４つの複合ワクチンが存在する。複合ワクチンは、抗体の応答を増強することを試みてタンパク質の担体またはアジュバントに結合された肺炎球菌の莢膜多糖から成る。しかしながら、現在、臨床的実験において複合ワクチンを使用するとき、他の潜在的問題が存在する。例えば、米国において最も優勢な肺炎球菌の血清型は、イスラエル、西ヨーロッパ、またはスカンジナビアのような場所において最も普通の血清型と異なる。したがって、１つの地理的場所において有効であるワクチンは他の場所において有効でないことがある。現在入手可能な莢膜多糖の変換を変性するか、あるいは地理的血清型の変動性に適合させるための莢膜ワクチンのためのタンパク質複合体を開発するための潜在的必要性は、禁止的な財政上の問題および技術的な複雑化した問題を伴う。したがって、種々のビルレント血清型の中に世界的に保存される、免疫原性、表面暴露したタンパク質についての探索は、肺炎球菌の感染の予防および広く保護的な肺炎球菌のワクチンの処方に対して非常に重要である。そのうえ、世界的な基準のペニシリンおよびセファロスポリンに耐性肺炎球菌の出現は、有効なワクチンの必要性を危急なものとする（Ｂａｑｕｅｒｏｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９１；２８Ｓ；３１−８）。肺炎球菌の莢膜多糖に対する複合化のために、あるいはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫性を刺激する単一の免疫原として、いくつかの肺炎球菌のタンパク質が提案されてきている。気道の上皮細胞へのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの付着に関係することが報告されている表面タンパク質は、ＰａｓＡ、ＰｓｐＣ／ＣＢＰ１１２、およびＩｇＡｌプロテイナーゼを包含する（Ｓａｍｐｓｏｎｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．１９９４；６２：３１９−３２４、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄｅｔａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．１９９２；２６１−９、およびＷａｎｉ、ｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．１９９６；６４：３９６７−３９７４）。これらの付着に対する抗体は、呼吸器の上皮細胞に対する肺炎球菌の結合を阻害し、これによりコロニー化を減少させることができる。他の細胞質ゾルの肺炎球菌のタンパク質、例えば、ニューモリジン、オートリジン、ニューラミダーゼ、またはヒアルロニダーゼはワクチン抗原として提案される。なぜなら、抗体はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染した患者におけるこれらのタンパク質の毒性作用を潜在的にブロックすることができるからである。しかしながら、これらのタンパク質は典型的にはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの表面上に位置せず、むしろ細胞が溶解し、死ぬとき、それらは細菌から分泌または解放される（Ｌｅｅｅｔａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ１９９４；１２：８７８−８およびＢｅｒｒｙｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．１９９４；６２：１１０１−１１０８）。免疫原として、これらの細胞質ゾルのタンパク質を使用すると、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染の後期の結果を改善し、これらのタンパク質に対する抗体は肺炎球菌の死亡を促進しないか、あるいは初期のまたは引き続く肺炎球菌のコロニー化を防止しないであろう。肺炎球菌のワクチンとして試験されているプロトタイプの表面タンパク質は、肺炎球菌の表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）である。ＰｓｐＡは約７０〜１４０ｋＤａの異質タンパク質である。ＰｓｐＡの構造は、アミノ末端にアルファらせん、次いでプロリンに富んだ配列を含み、カルボキシ末端における１系列の１１のコリン結合反復において終止する。その構造に関する多数の情報は入手可能であるが、ＰｓｐＡは種々の肺炎球菌の血清型の中に構造的に保存されず、そしてその機能は完全に未知である（Ｙｏｔｈｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２；１７４：６０１−９およびＹｏｔｈｅｒ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９４；１７６：２９７６−２９８５）。研究により、動物におけるＰｓｐＡの免疫原性が確証された（ＭｃＤａｎｉｅｌｅｔａｌ．、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．１９９４；１７：３２３−３３７）。ＰｓｐＡの免疫原性にかかわらず、４つの構造的グループ（またはクレード）の中のその存在、およびその特性決定されていない機能は、ワクチン抗原として使用すべきその能力を複雑化する。型特異的多糖莢膜に対して保護的抗体を作ることができない患者において、補体の第２成分、Ｃ３、およびオールタネイト補体の経路のアソシエートしたタンパク質は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染の宿主の防御の第１系統を構成する。補体タンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの剛性細胞壁を貫通することができないので、肺炎球菌の表面上のオプソニンのＣ３ｂの沈着は肺炎球菌のクリアランスの主要なメディエイターである。Ｃ３のオプソニン活性フラグメントである、Ｃ３ｂの共有結合が食細胞の認識および摂取を開始するとき、肺炎球菌と血漿Ｃ３との相互作用は肺炎球菌の菌血症の間に起こることが知られている（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６９；１２９：１２７５−１２９０、ＨａｓｉｎＨＥ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７２；１０９：２６−３１およびＨｏｓｔｅｔｔｅｒｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１９８４；１５０：６５３−６１）。Ｃ３ｂは肺炎球菌の莢膜上に、ならびに細胞壁上に沈着する。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染を抑制する方法はかなり無効である。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのオプソニン化を増強する方法は、この微生物により誘導される疾患の過程を改善することができる。現在、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染を制限する方法および療法が強く要求されている。発明の要約本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにより発現されたヒト補体Ｃ３分解性プロテイナーゼの１ファミリーの同定および使用に関する。このタンパク質は１０％のポリアクリルアミドゲル上で測定して約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する。本発明は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの異なるＣ３分解性株から単離可能な多数のタンパク質を包含する。本発明の１つの面において、本発明は、配列番号：２の少なくとも８０％の同一性を含みかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができる単離されたタンパク質に関する。好ましい態様において、このタンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離されるか、あるいはタンパク質は組換えタンパク質である。好ましくは、タンパク質はヒト補体タンパク質Ｃ３に結合する。好ましい態様において、タンパク質は１０％のポリアクリルアミドゲル上で測定して約２ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２を含む単離されたタンパク質である。本発明は、また、本発明のＣ３分解性プロテイナーゼからのペプチド、好ましくは配列番号：２の少なくとも８０％の同一性を含みかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができる単離されたタンパク質からの少なくとも１５の順次のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくは配列番号：２からの少なくとも１５の順次のアミノ酸からなるペプチドに関する。タンパク質が組換えタンパク質である、請求項９に記載のタンパク質。本発明の他の面において、本発明は配列番号：２からの少なくとも１５の順次のアミノ酸からなるペプチドに関する。本発明のタンパク質は配列番号：２からなることができ、好ましくは１０％のポリアクリルアミドゲル上で測定して約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する。また、好ましくは、タンパク質はヒト補体タンパク質Ｃ３を分解する。本発明の好ましいペプチドまたはポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜５０からなるタンパク質、および第１Ａ図の核酸１２４６〜１８６３からなる核酸フラグメントを包含する。本発明の他の面において、本発明は、ヒト補体タンパク質Ｃ３を分解するタンパク質に関し、ここでタンパク質をコードする核酸は６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化、変性されたサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下に配列番号：１にハイブリダイゼーションし、ここで前記サケ精子ＤＮＡは６５℃において一夜ハイブリダイゼーションさせ、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄し、次いで６５℃において約１５分間１回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されている。本発明は、また、有効量の免疫系刺激ペプチドまたはポリペプチドを含んでなり、前記ペプチドまたはポリペプチドは配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を含みかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができるタンパク質からの少なくとも１５アミノ酸からなる、免疫系刺激組成物に関する。好ましくは、タンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離可能である。１つの態様において、免疫系刺激組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの少なくとも１つの免疫刺激ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含む。本発明は、さらに、配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を含みかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができるタンパク質に特異的に結合することができる抗体に関する。１つの態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、そして他の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。他の態様において、抗体は抗体のフラグメントである。抗体または抗体のフラグメントは、マウス、ラット、ヒト、またはウサギから得ることができる。本発明は、また、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化、変性されたサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下に配列番号：１にハイブリダイゼーションすることができる核酸フラグメントに関し、ここで前記サケ精子ＤＮＡは６５℃において一夜ハイブリダイゼーションさせ、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄し、次いで６５℃において約１５分間１回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されている。１つの態様において、核酸フラグメントはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムから単離され、そして他の態様において、核酸フラグメントはタンパク質の少なくとも一部分をコードする。１つの態様において、タンパク質はヒト補体Ｃ３を分解し、そして他の態様において、核酸フラグメントはヒト補体Ｃ３を分解しないタンパク質をコードする。他の態様において、核酸フラグメントは核酸ベクターの中に存在し、そしてベクターはタンパク質の少なくとも一部分を産生することができる発現ベクターであることができる。また、核酸フラグメントを含有する細胞は本発明の範囲内に入る。１つの態様において、細胞は細菌または真核細胞である。本発明は、核酸配列ｇｃｔｃｃｃａｇｔａｔｇｃｇｔａｃｔｃｇｔａａｇｇｔａｇａｇｇｇａａｇａａａａａａａｃｔａｇｃｔａｇからなる単離された核酸フラグメントに関する。本発明の他の面において、本発明は、工程：治療的に有効量のタンパク質の少なくとも一部分を動物に投与し、ここで前記タンパク質をコードする核酸は６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化、変性されたサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下に配列番号：１にハイブリダイゼーションし、前記サケ精子ＤＮＡは６５℃において一夜ハイブリダイゼーションさせ、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄し、次いで６５℃ において約１５分間１回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されており；そして前記タンパク質に対する免疫応答を得る；を含む、動物におけるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫応答を生成する方法に関する。１つの態様において、免疫応答はＢ細胞の応答であり、そして他の態様において、免疫応答はＴ細胞の応答である。好ましい態様において、組成物はワクチン組成物である。好ましくは、タンパク質の少なくとも一部分は少なくとも１５アミノ酸の長さであり、また、好ましくは、組成物はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの少なくとも１つの他のタンパク質をさらに含む。１つの態様において、タンパク質は配列番号：２の少なくとも１５アミノ酸からなる。本発明のそれ以上の態様において、本発明は、挿入突然変異を含む細菌に関し、ここで挿入突然変異はヒト補体Ｃ３を分解することができるタンパク質をコードする遺伝子の中に存在する。１つの態様において、細菌は挿入重複突然変異を含む。さらに、本発明は、ヒト補体Ｃ３に結合しかつ分解することができるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの単離されたタンパク質に関し、そして工程：配列番号：２に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性をもつタンパク質に結合することができる抗体とＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細菌を接触させる、からなるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ仲介Ｃ３分解を阻害する方法に関する。本発明は、さらに、配列番号：１の核酸配列からなる単離された核酸フラグメント、および配列番号：１からなる二本鎖ＤＮＡ配列により転写されたＲＮＡフラグメントに関する。図面の簡単な説明第１Ａ図は遺伝子配列を提供し、そして第１Ｂ図は本発明のＣ３分解性プロテイナーゼのアミノ酸配列を提供する。第２図は、本発明による挿入重複突然変異の線図である。第３図は、本発明の挿入重複突然変異からのインサートの制限分析の線図である。好ましい態様の詳細な説明本発明は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルル上で抗体２８ｋＤａ（±５ｋＤａ）の分子量（配列番号：１に基づいて約２７．５ｋＤａの正確な大きさ）を有するＣ３分解性プロテイナーゼの同定および単離にに関し、そしてＣ３分解性プロテイナーゼをコードする核酸に関する。このタンパク質は、本来、Ｃ３を含浸させたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の肺炎球菌ライゼイトの電気泳動により同定された。いくつかの血清型からの肺炎球菌の指数的に増殖する培養物は、規定されたＣ３切断フラグメントを生成しないで、まずβ鎖を分解し、次いでα鎖を分解することができることが観察された（Ａｎｇｅｌ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１７０：６００−６０８、１９９４）。この切断を含まない分解のパターンは、他の微生物の産物、例えば、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエラスターゼ部分およびエンタメバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のシステインプロテイナーゼと実質的に異なる。本発明によるＣ３分解性プロテイナーゼをコードする遺伝子配列（配列番号：１）は第１Ａ図に提供されており、そしてタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）は第１Ｂ図に提供されている。用語「分解」は、本明細書において、タンパク質をアミノ酸、ペプチドおよび／またはポリペプチドのフラグメントに切断することができる酵素を言及するために使用する。本発明のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル上で観察して、特定の切断フラグメントを生成しないで、Ｃ３を分解する。野生型Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに比較してＣ３分解活性が増加したクローンを同定することによって、約２９ｋＤａのＣ３分解性プロテイナーゼは挿入的に中断された肺炎球菌の遺伝子のライブラリーから単離された。Ｃ３について本発明のＣ３分解性プロテイナーゼの少なくともいくつかの好ましさは、例えば、Ｃ３分解性プロテイナーゼが他のタンパク質、例えば、アルブミンを大きい程度に分解しないことである。挿入重複突然変異誘発を実施し、そして増加したＣ３分解活性をもつクローンを同定する、典型的な方法は実施例１に記載されている。Ｃ３分解性プロテイナーゼをコードする遺伝子は４つのオープンリーディングフレームを含む領域内に含有され、そして相同的組換えによる第３オープンリーディングフレームの中断はＣ３分解を高度に損なった。ＯＲＦ３は約７２６ヌクレオチドを含み、そして翻訳されたタンパク質の配列は、遺伝子バンク（ＧｅｎＢａｎｋ）またはスイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）のデータベースに登録されたタンパク質と実質的な相同性を共有しない。本発明のＣ３分解性プロテイナーゼをコードする全長の遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の発現のために遺伝子の発現ベクターの中に挿入した。実施例に記載するように、組換えＣ３分解性プロテイナーゼを単離した。当業者は認識するように、特定の遺伝子配列、例えば、第１図において提供されている配列が与えられると、遺伝子の発現に使用できる種々の発現ベクターが存在する。本発明の組換えタンパク質を生産し、単離するために使用できる、この分野において知られている種々の方法が存在し、そして当業者は認識するように、本発明のＣ３分解アッセイは、実施例に記載されている発現系に加えて、特定の発現系が、不都合な実験を使用しないで、機能するか否か決定するであろう。種々の分子の技術および免疫学的技術は、基本的技術のテキスト、例えば、下記のテキストの中に見出すことができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、１９８９、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮＹ、およびＨａｒｌｏｗｅｔａｌ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８８。本発明のＣ３分解性タンパク質をコードする遺伝子は、ＣＰ１２００株からの肺炎球菌のゲノムＤＮＡフラグメントを使用して作られたプラスミドのライブラリーを使用して同定された。プラスミドのライブラリーを得る種々の方法が存在するが、好ましい方法において、肺炎球菌のＣＰ１２００株（Ｄ．Ａ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、イリノイ州ケンブリッジ−ウルバナ、から入手した、そしてＨａｖａｒｓｔｅｉｎＬＦ、ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１９９５；９２：１１１４０−１１１４４に記載されている）からのＳａｕ３Ａ消化した肺炎球菌のゲノムＤＮＡフラグメント（０．５〜４．０ｋｂ）を使用して、プラスミドのライブラリーを構築し、組込みシャトルベクターｐＶＡ８９１（ｅｒｍｒ、ｃｍｒ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための複製起点を有する）のＢａｍＨＩ部位の中に挿入した。このライブラリーをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＬαＭＣＲ株の中に形質転換した。合計１４００の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体がエレクトロポレーションにより得られた。いくつかのランダムに選択された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体のプラスミドの抽出により、それらのすべてが組換えプラスミドを含有することが明らかにされた。プラスミドのライブラリーのＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から抽出し、そして挿入突然変異誘発相同組換えによりＣＰ１２００親肺炎球菌株を形質転換するために使用した。ＣＴＭ培地中でＨＣｌ手順を使用するｐＨシフトにより、肺炎球菌ＣＰ１２００株の細胞をコンピテントとした。必要とするまで、コンピテント細胞を−７０ ℃において小さいアリコートで凍結した。８，０００の肺炎球菌の形質転換体をこれらの方法により生成させた。個々の肺炎球菌の形質転換体を、ＥＬＩＳＡにより、Ｃ３を分解する能力に基づいて変更された表現型特性についてスクリーニングした。細菌培養物をＣ３（０．８３μｇのＣ３／ｍｌの培養物）と約２〜４時間インキュベートし、そしてヒト補体Ｃ３に対して特異的なＨＲＰ結合ヤギポリクローナル抗体を使用する酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、試料中の残っている未分解Ｃ３の量を検出した。このアッセイを標準化して、未分解Ｃ３を含有するウェルがＯ．Ｄ．４９０＝約１．０を有するようにした。分解したＣ３を含有するウェルは、抗Ｃ３抗体と結合する能力が減少したために、光学密度を減少させた。突然変異株および親株の光学密度を、陰性の対照の光学密度と比較した。陰性の対照は異なる濃度のＣ３を含有する培地であった。試料／対照の光学密度として、Ｃ３分解活性の百分率を決定した。親ＣＰ１２００株からの約２９ｋＤａのＣ３分解性タンパク質の活性に比較して、増加したＣ３分解活性（約２〜２．２倍のより高い活性）により、４つの突然変異体（ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５およびＳＮ６）が同定された。この発見はウェスタンブロット分析により確証された。突然変異体ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５およびＳＮ６からの全体のＤＮＡを単離し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲの中へのエレクトロポレーションのために使用した。肺炎球菌のゲノム内の組込まれたプラスミドからのプラスミドＤＮＡの低い切除速度は少量の遊離プラスミドＤＮＡを生成することができ、そしてこのＤＮＡはＤＮＡが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中に形質転換されるとき回収することができる。さらに、これはプラスミドの特性決定を可能とする。肺炎球菌の中へ戻すプラスミドの再形質転換は、もとの突然変異体の表現型を証明する。陰性のＣ３分解性タンパク質および突然変異体ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５およびＳＮ６からのタンパク質の試料をＣ３とインキュベートし、還元性条件下に７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。Ｃ３に対するＨＲＰ結合抗体を用いるウェスタンブロット分析により、Ｃ３分解活性を評価した。突然変異体ＳＮ４および突然変異体ＳＮ４−４Ｇを他の実験において使用した。ＳＮ４からレスキューされた組換えプラスミドｐＬＳＮ４ａでＣＰ１２００を形質転換した後、突然変異体ＳＮ４−４Ｇが同定された。突然変異体ＳＮ４および突然変異体ＳＮ４ −４Ｇの双方は、４時間のインキュベーション後、Ｃ３を完全に分解した。自然Ｃ３分解性タンパク質は、４時間のインキュベーション後、Ｃ３を分解したが、匹敵する突然変異体ＳＮ４および突然変異体ＳＮ４−４Ｇと比較したとき、Ｃ３の分解は不完全であった。突然変異体ＳＮ４からのタンパク質をコードするプラスミドをそれ以上の実験のために選択した。プラスミドｐＬＳＮ４ａ（突然変異体ＳＮ４をコードする）を使用して、野生型ＣＰ１２００株を形質転換した。これにより、Ｃ３分解活性が増加した４８の肺炎球菌の突然変異体が生じた。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩを使用する消化は、プラスミドｐＬＳＮ４ａが約７．８ｋｂであり、そして約２．３ｋｂのインサートを含むことを示した。プラスミドｐＬＳＮ４ａをサザンハイブリダイゼーション実験においてハイブリダイゼーションプローブとして使用して、肺炎球菌の突然変異体からの染色体ｃＤＮＡ試料中のインサートの存在を証明した。これらの結果は、インサートをもつベクター（ｐＬＳＮ４ａ）およびまた突然変異体ＳＮ３およびＳＮ４中のインサートの起点が染色体ＤＮＡの中に組込まれた。ＳＮ３およびＳＮ４の双方は、大きさ約２．２ｋｂおよび約５．８ｋｂの２つのハイブリダイゼーションする結合フラグメントから成っていた。また、これらのフラグメントはそれらの親ＣＰ１２００株の中に存在した。約４．２ｋｂおよび約３．５ｋｂの２つの他のハイブリダイゼーションするフラグメントが存在し、そしてこれらの２つのフラグメントは一緒に約７．８ｋｂの合計を与えた（ｐＬＳＮ４ａは約７．８ｋｂである）。これらの２つのバンドもまたインサートの試料とともにベクターの中に存在した。インサートおよびベクターの双方はＥｃｏＲＩ部位を含み、組換えプラスミドを表す。分析により、遺伝子の重複がＳＮ４突然変異株の中に存在することが示され、したがって、改良されたＣ３分解活性はＳＮ４突然変異体中のＣ３分解性タンパク質の増加に帰属された。鋳型として全ｐＬＳＮ４ａプラスミドを使用して、２３３８ｂｐのインサートの約１ｋｂの配列を決定した。鋳型としてちょうどインサート（ＰＣＲ）を有する残りの配列（約１３３８ｂｐ）は、ＩＣＢＲ（ＵｎｉｖｅｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ）により配列決定された。双方の相補的鎖が配列決定された。それらの結果により、下記のスキームに記載する相対位置をもつ４つのオープンリーディングフレームが存在することが示された：上記オープンリーディングフレームの誘導されたアミノ酸配列と、試験したタンパク質のデータベースからのタンパク質配列との間に、有意な相同性は見出されなかった。本発明のＣ３分解性プロテイナーゼをコードするＯＲＦ３核酸配列を第１Ａ図に記載し、そして配列番号：１と表示する。このＣ３分解性プロテイナーゼのアミノ酸配列を第１Ｂ図に記載し、そして配列番号：２と表示する。インサート中のオープンリーディングフレーム（３つの全体および１つの部分的）のうちで、ＯＲＦ３は最大のインサートを含有したので、それ以上の実験のためにそれを選択した。ＯＲＦ３（ＰＣＲ生成物）領域の６２０ｂｐの内部の部分（第１Ａ図の核酸１２４６〜核酸１８６３）をｐＶＡ８９１のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中に結合し、そして構築物をＣＰ１２００コンピテント細胞の中に形質転換してプロテイナーゼ活性をノックアウトした。ウェスタンブロット分析によりＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上の分離後、形質転換体をＣ３を分解する能力について試験した。ＯＲＦ３崩壊突然変異体は、その親ＣＰ１２００株と比較して、低い活性を有した。全体のＯＲＦ３遺伝子（ＰＣＲ生成物）を、ｐｅｔ−２８ｂ（＋）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの中にクローニングした。ベクターはタンパク質のＮ−末端にＨｉｓ−Ｔａｇを配置する。プラスミド構築物を安定化のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨＬａＭＣＲ）株の中に形質転換させた後、それをタンパク質の発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１ＤＥ３）プロテアーゼ欠乏株の中に形質転換した。ＯＲＦ３タンパク質の発現のために、構築物（ＯＲＦ３をもつｐｅｔ２８ｂ（＋））を含むＢＬ２１ＤＥ３株を誘導させた。誘導および非誘導の培養物の全細胞タンパク質抽出物を、Ｃ３分解活性について試験した。不溶性タンパク質画分からの誘導された試料において、発現されたＨｉｓ標識化ＯＲＦ３タンパク質は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で約２９ｋＤａ（±５ｋＤａ）であった。試料を下記のもので処理することによって、誘導されたＢＬ２１ＤＥ３培養物からのＯＲＦ３タンパク質の可溶化を実施した：ａ）ＴＥＳ（５０ｍＭ、１ｍＭ、１Ｍ）；ｂ）６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ；ｃ）６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋１％のＴｗｅｅｎ２０；およびｄ）６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００。双方処理「ｃ」および「ｄ」は可溶性タンパク質を生じた。処理「ｃ」を使用して組換えＣ３分解性タンパク質を生成し、これをそれ以上のタンパク質の研究に使用した。発現されたＨｉｓ−標識化ＯＲＦ３タンパク質の試料から、透析によりグアニジン−ＨＣｌおよびＤＴＴを除去した。タンパク質をニッケルカラムの精製に付し、そして溶離されたＨｉｓ−標識化タンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で可視化した。ＯＲＦ３によりコードされる単離されたタンパク質を、ＰＢＳの存在下に３７ ℃においてヒト補体Ｃ３と４インキュベートした。タンパク質試料を含まない対照試料を比較の目的で陰性の対照として使用した。試料を還元性条件下にＳＤＳ −ＰＡＧＥゲル上で展開し、ヒト補体Ｃ３に対して抗体を使用するウェスタンブロット分析によりＣ３の構造について分析した。結果は、試料がＯＲＦ３領域によりコードされるタンパク質を含有し、そしてタンパク質がヒトＣ３タンパク質を分解することを示した。Ｃ３分子のα鎖およびβ鎖の双方は分解に対して感受性であった。これらの実験において、α鎖はほとんど完全に分解され、β鎖も分解されたが、その程度は多少低かった。本発明のＣ３分解性タンパク質をＣｐｐＡプロテイナーゼと表示し、そして本発明の遺伝子をｃｐｐＡと表示する。本発明のタンパク質は１０％のポリアクリルアミドゲル上で約２９ｋＤａ（±５ｋＤａ）の見掛けの分子量を有し、好ましくは約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する。前述したように、実施例５はプロテイナーゼがＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株を通じて保存されることを示す。しかしながら、当業者は認識するように、アミノ酸配列の多少の変動性は期待され、そしてこの変動性は本発明の範囲の中に包含される。例えば、保存された突然変異体は本発明から排除されず、また、約８０％のアミノ酸配列の同一性より少ない、好ましくは約９０％のアミノ酸配列の同一性より少ない、アミノ酸配列の同一性の変動性は排除されず、ここでタンパク質はヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができ、特にタンパク質はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌から単離されるか、あるいは本来それから得られる。多少のアミノ酸の変動性と同様に、株の間で多少の核酸配列の変動性が期待される。保存されたアミノ酸置換はこの分野において知られており、そして、例えば、アミノ酸が属するのと同一クラスの他のメンバーを使用するアミノ酸の置換を包含する。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを包含する。極性の中性のアミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを包含する。正に電荷した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを包含する。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する。このような変更は、ポリアクリルアミドゲルの電気泳動または等電点により測定して、見掛けの分子量に影響を与えることは期待されない。特に好ましい保存的置換は下記のものを包含するが、これらに限定されない：正の電荷を維持するためのＬｙｓとＡｒｇとの置換および逆もまた同じ；負の帯電を維持するためのＧｌｕとＡｓｐとの置換および逆もまた同じ；遊離の− ＯＨを維持するためのＳｅｒとＴｈｒとの置換；および遊離のＮＨ2を維持するためのＧｌｎとＡｓｎとの置換。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列をもつタンパク質を包含する。他のタンパク質はヒト補体タンパク質Ｃ３を分解しかつ前記タンパク質をコードする核酸を有するタンパク質を包含し、ここで前記核酸は６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化、変性されたサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下に配列番号：１にハイブリダイゼーションし、前記サケ精子ＤＮＡは６５℃において一夜ハイブリダイゼーションさせ、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄し、次いで６５℃において約１５分間１回洗浄し、次いで２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されている、前記タンパク質もまた本発明において考えられる。タンパク質のポリペプチドまたはペプチドのフラグメントをまた使用することができ、そして本発明の好ましいタンパク質は配列番号：２のアミノ酸１〜５０からなる。本発明のタンパク質は、組換えタンパク質として単離するか、あるいは製造することができる。すなわち、本発明のタンパク質、またはそのタンパク質の一部分をコードする核酸を発現ベクターの中に組込むか、あるいは細胞の染色体の中に組込んで細胞の中でタンパク質を発現させることができる。タンパク質を細菌または他の細胞、好ましくは真核細胞、より好ましくは動物細胞から精製することができる。また、タンパク質はそれを発現する細胞、例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞から単離することができる。ＣｐｐＡプロテイナーゼのペプチドがまた本発明において考えられる。ペプチドは好ましくは少なくとも１５アミノ酸の長さであり、そして好ましいペプチドは配列番号：２からの少なくとも１５のアミノ酸を有するペプチドである。他の好ましいタンパク質フラグメントは、配列番号：２のアミノ酸１〜５０を含む。ＣｐｐＡプロテイナーゼをコードする核酸は、また、本発明の一部分である。配列番号：１は、ＣｐｐＡプロテイナーゼをコードする好ましい核酸フラグメントである。当業者は認識するように、いくつかの置換は、ＣｐｐＡプロテイナーゼの特性または特質が実質的に変更される程度に、ＣｐｐＡプロテイナーゼ配列を変更しないであろう。例えば、配列番号：１に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸は本発明において考えられる。特定の核酸配列が本発明の範囲内に入るかどうかを決定する方法は、特定の核酸配列がＣ３分解性プロテイナーゼをコードしかつ配列番号：１と少なくとも８０％の同一性を有するか否かを考えることである。ＣｐｐＡプロテイナーゼをコードする他の核酸配列は、ＣｐｐＡが配列番号：２と同一の配列またはそれと少なくとも９０％の配列の同一性を有するが、核酸配列に関してデジェネラシーを含む、ＣｐｐＡをコードする核酸を包含する。デジェネレイトコドンは、異なる３文字コドンを使用して同一のアミノ酸を特定することを意味する。例えば、この分野においてよく知られているように、各特定のアミノ酸を符号化するために、下記のＲＮＡコドン（したがって、対応するＤＮＡコドン、ＵをＴと置換する）を使用することができる：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）ＵＵＵまたはＵＵＣロイシン（ＬｅｕまたはＬ）ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡまたはＣＵＧイソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）ＡＵＵ、ＡＵＣまたはＡＵＡメチオニン（ＭｅｔまたはＭ）ＡＵＧバリン（ＶａｌまたはＶ）ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧセリン（ＳｅｒまたはＳ）ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣプロリン（ＰｒｏまたはＰ）ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧスレオニン（ＴｈｒまたはＴ）ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧアラニン（ＡｌａまたはＡ）ＧＣＵ、ＧＣＧ、ＧＣＡ、ＧＣＣチロシン（ＴｙｒまたはＹ）ＵＡＵまたはＵＡＣヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）ＣＡＵまたはＣＡＣグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）ＣＡＡまたはＣＡＧアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）ＡＡＵまたはＡＡＣリジン（ＬｙｓまたはＫ）ＡＡＡまたはＡＡＧアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）ＧＡＵまたはＧＡＣグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）ＧＡＡまたはＧＡＧシステイン（ＣｙｓまたはＣ）ＵＧＵまたはＵＧＣアルギニン（ＡｒｇまたはＲ）ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＣグリシン（ＧｌｙまたはＧ）ＧＧＵまたはＧＧＣまたはＧＧＡまたはＧＧＧ終止コドンＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡさらに、特定の細胞型について好ましいコドンを用いるために、特定のＤＮＡ配列を修飾することができる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための好ましいコドンの使用、ならびに動物およびヒトのための好ましいコドンの使用は知られている。これらの変化はこの分野において知られており、したがって、これらの遺伝子配列は本発明の一部分であると考えられる。他の核酸配列は、配列番号：１からの少なくとも３０核酸配列の長さの核酸フラグメントまたは少なくとも３０核酸配列の長さの他の核酸フラグメントを包含し、ここで後者の核酸フラグメントは６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化、変性されたサケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下に配列番号：１にハイブリダイゼーションし、前記サケ精子ＤＮＡは６５℃において一夜ハイブリダイゼーションさせ、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄し、次いで６５℃において約１５分間１回洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されている。本発明の核酸フラグメントは、すべてをコードし、まったくコードしない（すなわち、転写できるフラグメント、遺伝子の調節部分を含むフラグメント、またはその他）か、あるいは配列番号：２の一部分、好ましくは配列番号：２からの少なくとも９アミノ酸をコードする隣接する核酸フラグメントを含有する一部分をコードすることができる。ＣｐｐＡプロテイナーゼの一部分をコードする核酸フラグメントは本発明において考えられるので、核酸フラグメントはＣ３分解活性をもつタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするであろうことが理解されるであろう。さらに、本発明の核酸を突然変異させて、本発明のＣ３分解活性を除去するか、あるいはそうでなければ不活性化することができる。したがって、前述のハイブリダイゼーション条件を満足するＣ３分解活性を含まないフラグメントもまた考えられる。核酸配列を突然変異させるか、あるいはそうでなければ変更する方法はこの分野においてよく記載されており、免疫原性であるが、酵素的に不活性であるタンパク質を治療上の実用性について試験することができる。好ましい核酸フラグメントは、ｇｃｔｃｃｃａｇｔａｔｇを含む（請求項３４）。本発明の核酸フラグメントを核酸ベクターの中に組込むか、あるいは宿主ゲノムの中に安定に組込んで、組換えキメラタンパク質を包含する組換えタンパク質を生成することができる。種々の核酸ベクターはこの分野において知られており、そして多数の商業的に入手可能な発現プラスミドまたはウイルスベクターを包含する。これらのベクターの使用はこの分野において知られている範囲内に入る。典型的なベクターは実施例において使用されているが、本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。本発明は、また、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの、約２９ｋＤａのタンパク質、好ましくは約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａのタンパク質に特異的に結合することができる抗体に関し、好ましくはここでタンパク質はヒト補体Ｃ３を分解することができる。タンパク質の一部分またはタンパク質のすべてのに対して、ポリクローナル抗体を製造することができる。同様に、本発明の約２９ｋＤａのＣ３分解性タンパク質のすべてまたはペプチドフラグメントに対して、モノクローナル抗体を製造することができる。タンパク質に対する抗体を製造する方法はよく知られており、そして、例えば、Ｈａｒｌｏｗ、ｅｔａｌ．（前掲）により記載されている。好ましい例において、抗体はヒト由来、ラット由来、マウス由来またはウサギまたはであることができる。タンパク質結合性抗体フラグメントおよびキメラフラグメントもまた知られており、そして本発明の範囲内に入る。本発明は、また、免疫刺激組成物の使用に関する。用語「免疫刺激」または「免疫系刺激」は、免疫系の少なくとも１つの細胞の型を活性化する、本発明によるタンパク質またはペプチドの組成物を言及する。免疫系の好ましい活性化された細胞は、食細胞、例えば、マクロファージ、ならびにＴ細胞およびＢ細胞を包含する。本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含んでなる免疫刺激組成物は、動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染を研究するためのヒトまたは動物のモデルにおいて抗体を生産するために使用することができる。好ましい免疫刺激組成物は免疫刺激量の少なくともペプチドを含み、前記ペプチドはＣｐｐＡプロテイナーゼからの少なくとも１５アミノ酸を含む。免疫刺激組成物は、薬学上許容される緩衝剤、例えば、ＰＢＳまたは免疫系を刺激するために宿主の中にタンパク質を導入するために適当でありかつ安全であると認識されている他の緩衝剤の中に他のタンパク質をさらに含むことができる。免疫刺激組成物は、また、他の免疫系刺激タンパク質、例えば、アジュバントまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたは他の微生物からの免疫刺激タンパク質またはペプチドフラグメントを含むことができる。例えば、ペプチドフラグメントのカクテルはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染の制御に最も有効であることがある。好ましくは、１またはそれ以上の本発明のタンパク質をワクチンの製造において使用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニー化またはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのコロニー化の病原性結果に対して保護するか、あるいはそれらを制限する。本発明は、また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ仲介Ｃ３分解を阻害する方法に関し、この方法はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの細菌を、タンパク質、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの単離されたタンパク質に結合することができる抗体または他のタンパク質とを含有するさせることからなる。約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの単離されたタンパク質に結合することができるタンパク質は抗体またはそのフラグメントであることができるか、あるいはタンパク質はＣ３分解活性を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの単離されたタンパク質を特異的に認識することができる抗体からの、抗体結合ドメイン、例えば、可変ドメインを含むキメラタンパク質であることができる。本発明の単離されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質を単離し、精製し、そして単離されたタンパク質またはその免疫原性フラグメントを使用して抗体を生成することができる。Ｃ３分解活性をもたないタンパク質のペプチドフラグメントまたはポリペプチドフラグメントを、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの感染の作用を制限する能力について試験することができる。本発明のタンパク質を、例えば、突然変異により、修飾して、タンパク質のＣ３分解能力を中断または不活性化することができる。単離されたタンパク質をアッセイにおいて使用して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する抗体を検出するか、あるいはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ療法のためのワクチンの一部分または多価または多タンパク質またはペプチド含有ワクチンとして使用することができる。さらに、本発明のタンパク質は脊椎動物の細胞の表面で発現させ、そして、例えば、補体の沈着（または活性化）が問題となる場合、例えば、異種移植または補体仲介糸球体腎炎において、Ｃ３を分解するために使用することができることが考えられる。例えば、組換えタンパク質、またはその一部分を異種移植細胞の中に組込み、表面タンパク質として、あるいは分泌されたタンパク質として発現させて、補体の沈着（および／または補体仲介炎症）を防止または制限することができる。引用されたすべての参考文献および刊行物は、表現的に引用することによって本明細書の一部とされる。本発明の開示にかんがみて意図する本発明の首尾よい実行を可能とする、当業者に入手可能な種々の別の技術および手順が存在する。当業者は認識するように、本発明を特定の態様および実施例と関連して説明したが、本発明は必ずしもそのように限定されず、そして態様、実施例および使用からの他の態様、実施例、使用、変更および逸脱をこの出願の発明の領域から逸脱しないでなすことができる。実施例１挿入重複突然変異の発生および選択された突然変異体からの組換えプラスミドの回収好ましい実施例において、挿入重複突然変異誘発を使用して、本発明のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからＣ３分解性プロテイナーゼをコードする遺伝子を単離した。肺炎球菌のＣＰ１２００株（ＲＸＩの誘導体；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ａ．、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５６：２８１−２９０、１９８３）（本来の入手先：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士の実験室、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、シカゴ）の０．５〜４．０ｋｂのフラグメントを使用して、プラスミドのライブラリーをつくり、ＢａｍＨＩシャトルベクターｐＶＡ８９１（ｅｒｍｒ、ｃｍｒＭａｒｃｉｎａ、Ｆ．Ｌ．、ｅｔａｌ．、Ｇｅｎｅ２５：１４５−１５０、１９８３、入手先：Ｍａｒｃｉｎａ博士、ＶｉｒｇｉｎｉａＣｏｍｍｏｎｗｅｌｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、バージニア州リッチモンド）の中に挿入した。ｐＶＡ８９１はエリスロマイシン（ｅｒｍ）およびクロラムフェニコール（ｃｍ）の耐性マーカーを有する。このベクターは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製起点を有するが、この起点はストレプトコッキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）において非複製的である。組換えプラスミドは相同組換えにより肺炎球菌の染色体ＤＮＡの中に組込むとき、生存することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲコンピテント細胞をバイオ・ラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のマニュアル（カリフォルニア州リッチモンド）に記載されている手順に従い作り、そしてバイオラド・パルサー（Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ）装置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州リッチモンド）を使用してエレクトロポレーションにより、ライブラリーをコンピテント細胞の中に形質転換した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を小さいアリコートでフリーザーのストックとして−８０℃において１０％のグリセロールの存在下にＬＢブロスの中に維持した。適当な抗生物質（エリスロマイシン２００μｇ／ｍｌまたはクロラムフェニコール１５または３０μｇ／ｍｌまたはカナマイシン３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢまたはＴＢブロスまたはＬＢ寒天平板中で、細胞を増殖させた。０．１ｃｍのクベット中の１〜２ｋＶ／ｃｍの電圧および２００Ωのキャパシタンスにおいて、エレクトロポレーションを実施した。クロラムフェニコール（ｃｍ、３０μｇ／ｍｌ）またはエリスロマイシン（ｅｒｍ、３００μｇ／ｍｌ）またはｅｒｍとｃｍとの組合わせ（２００μｇ／ｍｌ＋１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で、形質転換体を選択した。合計１４０００の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体がライブラリーから得られた。ランダムに選択された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体のプラスミド抽出および制限分析は、組換えプラスミドの存在を明らかにした。ポリエチレングリコール沈降手順（Ｋｒｅｉｇ、Ｐ．およびＭｅｌｔｏｎ、Ｄ．、ＰｒｏｍｅｇａＰｒｏｔｏｃｏｌｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｐ．１０６、１９８５−８６）または変更されたアルカリ性溶解ミニプレププロトコール（Ｘｉａｎｇ、Ｃ．、ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１７：３０−３２、１９９４）変更されたアルカリ性抽出手順（ＢｉｒｎｂｏｉｍＨＣおよびＪＤｏｌｙ、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１３ −１５２３、１９７９）またはＣｓＣｌ−臭化エチジウム勾配方法またはＱｉａｎキット（Ｐｌａｓｍｉｄｍｉｄｉｋｉｔ、カリフォルニア州チャースワース）により、プラスミドまたは組換えプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株から抽出した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット（ＢＩＯ１０１、カリフォルニア州ラジョラ）またはＱｉａｎキット（ゲルからのＤＮＡの抽出、カリフォルニア州チャートソース）により、ＤＮＡを含有する溶液をアガロースゲルから直接清浄した。ＤＮＡをＷｉｚａｒｄＤＮＡクリーン・アップ・キット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．、ウイスコンシン州マディソン）により清浄した。増幅された遺伝子産物を、また、ＷｉｚａｒｄＤＮＡクリーン・アップ・キット（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．、ウイスコンシン州マディソン）により清浄した。プラスミドを肺炎球菌の細胞の中に形質転換した。肺炎球菌の株は、常に小さいアリコートでフリーザーのストックとして、−８０℃において１０％のグリセロールの存在下にＴＨＢの中に維持した。ＣＡＴ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ａ．、ｅｔａｌ．、１９８３、前掲）またはＴＨＢ培地（ブロスまたは寒天）中で震盪しないで、肺炎球菌の細胞を増殖させた。形質転換実験のために、完全形質転換（ＣＴＭ）ブロス（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｄ．Ａ．、ｅｔａｌ．、１９８３）またはＴＨＢ＋０．５％酵母のブロス（ＹｏｔｈｅｒＪａｎｅｔ、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８：１４６３−１４６５、１９８６）を使用し、そしてＥＬＩＳＡ実験のために、ＳＭＰ、合成培地（表１参照）を使用した。肺炎球菌の突然変異体のための選択抗生物質マーカーとして、エリスロマイシン（０．０５μｇ／ｍｌ）を使用した。ＣＴＭ培地中の「ｐＨシフトによりコンピテントの誘導」（手順の入手先：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士の実験室、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、イリノイ州シカゴ）により、肺炎球菌のＣＰ１２００株の細胞をコンピテントとし、そして必要となるまで、コンピテント細胞を小さいアリコートで−７０℃ において凍結させた。この手順において、１２５ｍｌのＣＴＭに１．２０ｍｌの１ＭのＨＣｌ（最終濃度９ｍＭ）および４ｍｌの０．２のＯ．Ｄ．（５５０ｎｍ）の凍結した肺炎球菌のストック細胞を添加した。この培養物を３７℃においてインキュベートし、３時間のインキュベーション後に開始して２０分の間隔で培養物のＯ．Ｄ．の読みを取った。培養物が０．１５６のＯ．Ｄ．（５５０ｎｍ）に到達したとき、１．２ｍｌの１ＮＮａＯＨを３７℃において添加した。培養物をおだやかに混合した後、１ｍｌの培養物を「０」時点の試料として取出し、１００μｇのグリセロールと混合し、前もって冷却した金属ブロック上に保持した。同様に、１３、１７、２１および２５分の各時点において１０ｍｌの試料を抜き出し、試料を前もって冷却した１ｍｌのグリセロールに直接添加した。各時点の試料を小さいアリコートで−７０℃において凍結した。１μｌのＤＮＡ（約２５０ｎｇ）を１００μｌの細胞に添加し、そして形質転換のために３７℃において２５分間インキュベートすることによって、受容能を各時点の試料について試験した。形質転換培養物を希釈し、選択培地（エリスロマイシン０．０５μｇ／ｍｌ）上にプレートした。最高の形質転換効率を示す時点の試料を将来の形質転換実験のために使用した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から抽出された組換えプラスミドのライブラリーを肺炎球菌のＣＰ１２００株の中に形質転換すると、約８，０００の肺炎球菌の形質転換体が生じ、プラスミドが相同組換えによりＣＰ１２００染色体の中に挿入されたことが示された。ＤｏｎａｌｄＡ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士の実験室（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、シカゴ）において使用されている方法をわずかに変更した方法により、肺炎球菌の染色体ＤＮＡの抽出を実施した。肺炎球菌の細胞をＴＨＢ中で０．３〜０．４のＯ．Ｄ．（５５０ｎｍ）に増殖させ、次いで氷上で急冷し、０．５ＭのＥＤＴＡを１０ｍＭの最終濃度に添加し、細胞を４℃において１０，０００ｇで１０分間遠心し、ペレットを１：１０体積の冷ＳＴＥ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．１ＭのＮａＣｌ）の中に再懸濁させた。第２の遠心後、細胞を１／１００体積の冷の中に再懸濁させ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解し、自己消化のために３７℃において５〜１０分間インキュベートした。１％のＳＤＳを添加した後、細胞を水浴中で５０〜６０℃において５分間撹拌した。ＲＮアーゼ（１００μｇ／ｍｌ）およびプロテイナーゼＫ（５０μｇ／ｍｌ）を、それぞれ、２時間および１時間のインキュベーションとともに順次に添加した。細胞を１体積のフェノール／クロロホルムで２回抽出し、１体積のクロロホルムで１回抽出し、上清をエタノール沈降のために収集した。沈降物を７０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを収集し、ＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）または水の中に必要に応じて再懸濁させた。ポリエチレングリコール沈降手順（Ｋｒｅｉｇ、Ｐ．およびＭｅｌｔｏｎ、Ｄ．、１９８５、前掲）により、プラスミドのライブラリーＤＮＡをプールした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から抽出し、そしてＭｏｒｒｉｓｏｎ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、イリノイ州シカゴ）から入手した方法に従い、ＣＰ１２００、親の肺炎球菌株の形質転換に使用した。肺炎球菌の形質転換のために、凍結した肺炎球菌のコンピテント細胞を氷上で融解し、１００μｌのこれらのコンピテント細胞に、２００ｎｇ〜１０００ｎｇのプラスミドライブラリーを別々のエッペンドルフ管中で添加した。この管を水浴中の３７ ℃において約２５分〜３５分間インキュベートし、この混合物をＣＡＴ培地中で１／１０に希釈し、さらに約１〜１．７時間インキュベートした。最終のインキュベーション後、混合物をオーバーレイ手順によりプレートした（方法の入手先：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓ、イリノイ州シカゴ）。オーバーレイ手順は４つの異なる層の寒天（ＴＨＢまたはＣＡＴ）を次のようにして小さいペトリ皿の中に注ぐことを含んだ：ａ）第１すなわち塩基の層：３ｍｌの寒天；ｂ）第２すなわち細胞の層：１．５ｍｌの寒天と１．５ｍｌの必要な濃度の細菌細胞を含有するブロス；ｃ）第３層：３ｍｌの寒天；４）第４層すなわち上部層：３ｍｌの４×必要な濃度抗生物質（エリスロマイシン、０．０５μｇ／ｍｌ×４＝６μｇ／ｍｌ）を含有する寒天。プレートを３７℃においてインキュベートした。１００μｌのＴＨＢおよびエリスロマイシン（０．０５μｇ／ｍｌ）を含有するマイクロタイタープレートの個々のウェルに、穿刺接種により、個々の形質転換体を移した。マイクロタイタープレート中の回収された形質転換体をＳＭＰ培地中の１：１０に希釈し、初期の対数期まで増殖させ、ＥＬＩＳＡによりＣ３を分解する能力についてスクリーニングした。組換えプラスミドの自発的切除がこれらの種類の肺炎球菌の突然変異体において低い頻度で起こり、したがって、これらの突然変異体の染色体ＤＮＡ調製物は低いレベルのプラスミドＤＮＡをしばしば含んだ（ＰｅａｒｃｅＢ．Ｊ．、ｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．９（５）：１０３７−１０５０、１９９３）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のエレクトロポレーションは、それ以上の研究のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のプラスミド構築物を単離する高度に効率よい方法である。問題の個々の肺炎球菌の突然変異体からの染色体ＤＮＡ（２μｌの最終体積の１００ｎｇ〜２００ｎｇ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲコンピテント細胞の中にエレクトロポレーションして、組換えプラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を得た。回収された組換えプラスミドの１つ（ｐＬＳＮ４ａ）（表２参照）を、形質転換により野生型ＣＰ１２００肺炎球菌の株の中に導入し戻した。ＥＬＩＳＡにより、形質転換体ＳＮ４−４Ｇを再びＣ３分解活性について評価した。Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液またはＴｒｉｓ−酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液を使用するアガロースゲル（０．５％〜１．０％）中の水平電気泳動により、ＤＮＡフラグメントを分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．Ｅ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９）。ギブコ社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）からの１ｋｂのラダーまたはベーリンガー・マンヘイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）からのＨｉｎｄＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ラムダＤＮＡを、分子量標準として使用した。制限エンドヌクレアーゼ、仔ウシ腸ホスファターゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ニューヨーク州グランドアイランド、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インジアナポリス、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐ．、ウイスコンシン州マディソン、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ、マリイランド州ガイサーバーグ、またはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．、マサチュセッツ州ベバーリイ、から入手した）を、製造業者の使用説明書に記載されているように使用した。ＤＮＡフラグメントをサザンハイブリダイゼーションにより分析した。キットとともに提供された使用説明書に従い、ハイブリダイゼーションおよびＧｅｎｉｕｓ非放射性ＤＮＡ標識化および検出キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インジアナ州インジアナポリス）を使用して検出のために、ＤＮＡをゲルからＭＳＩ（マグナグラフ）Ｍａｇｎａｇｒａｐｈナイロン膜（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチュセッツ州ウェストボロ）に移した。前述の節に記載したように、肺炎球菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物から染色体またはプラスミドのＤＮＡを単離した。約１００ｎｇ〜４００ｎｇの各試料を必要な制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲル上で展開させ、マグナグラフ −ナイロン膜上に一夜トランスブロットした。手順の残りは製造業者の使用説明書に従い実施した。この実施例および引き続く実施例において使用した細菌の株およびプラスミドを、下記表２に要約する。実施例２変更されたＣ３分解活性を有する突然変異体の同定個々の肺炎球菌の形質転換体を、ＥＬＩＳＡにより、変更されたＣ３分解活性についてスクリーニングした。肺炎球菌の形質転換体を個々にＴＨＢ中でエリスロマイシン（０．０５μｇ／ｍｌ）の存在においてマイクロタイタープレート中で対数期まで増殖させ、ＳＭＰ培地（Ｏ．０５μｇのエリスロマイシン／ｍｌ）中で１／１０に希釈した。ＳＭＰ細菌培養物を対数期まで増殖させ、Ｃ３（０．８３μｇのＣ３／ｍｌの培養物）と２〜４時間インキュベートした。Ｃ３とインキュベートした後、、１００μｌの各個々の形質転換体をＥＬＩＳＡ結合プレートに移し、４℃において一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ（１０μＭのリン酸塩緩衝生理食塩水＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。ヒト補体Ｃ３（４８ｍｇ／ｍｌの１：１００００の希釈物）に対して特異的な１００μｌのＨＲＰ結合ヤギポリクローナル抗体を各ウェルに添加し、プレートを３７℃において１〜２時間インキュベートした。各マイクロタイタープレートを前述したようにＰＢＳで洗浄した。１００μｌの３０％ＯＰＤ（３０ｍｌのクエン酸塩緩衝液（２００ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4および１００ｍＭのクエン酸−ｐＨ５．０）、および１２μｌの３０％Ｈ2Ｏ2中の１２ｍｇのＯ−フェニレンジアミン（Ｚｙｍｅｄ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ））を各ウェルに添加し、プレートを暗所で３０分間インキュベートした。５０μｌの２．５ＭのＨ2 ＳＯ4を各ウェルに添加することによって、反応を停止させた。ヒト補体Ｃ３に対して特異的なＨＲＰ結合ヤギポリクローナル抗体により、試料の中に残った未分解のＣ３の量を検出した。未分解のＣ３を含有するウェルがＯ．Ｄ．＝４９０＝約１．０を有するように、このアッセイを標準化した。抗Ｃ３抗体の結合が減少するために、分解したＣ３を有するウェルのＯ．Ｄ．の読みは減少した。突然変異体および親の株の光学密度を陰性の対照（異なる濃度のＣ３を有する培地）の光学密度と比較して、Ｃ３分解活性の百分率を計算した。４つの突然変異体、ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５およびＳＮ６が存在し、これらはそれらの親株ＣＰ１２００の活性に比較して増加したＣ３分解活性（２．２倍−表３）を有した。その後、この発見は肺炎球菌の突然変異体ＳＮ４についてのウェスタンイムノブロッティングにより確証された。ＳＮ４−Ｓ１０（崩壊したｃｐｐＡ遺伝子）もまたＣ３分解活性が減少したＣＰ１２００の突然変異体であった。ＥＣＬウェスタンブロットプロトコールを使用して、イムノブロッティングを実施した（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、イリノイ州アーリントンハイツ）。プラスミドを含むか、または含まない肺炎球菌の突然変異体または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養物をフリーザーのストック培養物からＴＨＢまたはＬＢ中で対数期まで増殖させ、Ｃ３（０．８３μｇのＣ３／ｍｌ）と２〜４時間インキュベートさせ、培養物を回転し（２，５００ｒｐｍ、１５分間、室温または４℃）そして上清を収集した。培養物の光学密度を注意してモニターし、試料を同等化した後、Ｃ３とインキュベートした。未分解のＣ３を含有するすべての収集した上清の等しい量を、７．５％または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに還元性条件下に適用した。ゲルをニトロセルロース膜に１時間トランスブロットした（７５ボルト、４℃）。この実施例および引き続く実施例において、ヘッファー（Ｈｏｅｆｆｅｒ）転移装置によりＴｏｗｂｉｎ緩衝液（３．０３ｇのＴｒｉｓ、１４．４ｇのグリシンおよび２００ｍｌのメタノール、１リットルの体積、ｐＨ８．３；Ｔｏｗｂｉｎｅｔａｌ．（１９７９）ＰＮＡＳ：４３５０ −４３５４）中で７０ボルトにおいて、タンパク質をゲルからニトロセルロース膜に１時間移すか、あるいはゲルを５０％のメタノールおよび１０％の酢酸中で調製した０．１２５％のクーマッシー・ブリリアント・ブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）Ｒ−２５０（Ｏｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）で染色した。ブロットを１０％のスキムミルク（スキムミルク粉末）中で１時間（室温）または一夜（４℃）おだやかに震盪しながらインキュベートした。ブロットをＴＴＢＳ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１３７ｍＭの緩衝生理食塩水）中で数回洗浄し、３×ＴＴＢＳ＋ＢＳＡ中で調製したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＣ３、ポリクローナル抗体、ＩｇＧ画分（ＩＣＮＰｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｃａｐｐｅｌ、カリフォルニア州コスタメサ）の１：１０００希釈物とおだやかに震盪しながら１時間インキュベートした。インキュベートしたブロットを再びＴＴＢＳ中で数回洗浄し、化学発光試薬（１：１比の２×ルミノール／エンハンサーおよび２× 安定なペルオキシド溶液、Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）中で１分間インキュベートした。このブロットを暗所でフィルムに５秒〜数秒間露出し、フィルムを現像した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、２００ｋｄ〜１９ｋｄの範囲の前もって染色された高分子量のマーカー（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ、ｌｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州グランドアイランド）を常に含有した。洗浄およびインキュベーションを、特記しない限り、室温においておだやかに震盪しながら実施した。超活性の肺炎球菌の突然変異体、ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５およびＳＮ６からの染色体ＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲコンピテント細胞の中へのエレクトロポレーションは、レスキューされた組換えプラスミドを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を生じた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲ形質転換体、ＬＳＮ３、ＬＳＮ４、ＬＳＮ５、ＬＳＮ６、ＬＳＮ４Ｇはプラスミド（表２、それぞれ、肺炎球菌の突然変異体、ＳＮ３、ＳＮ４、ＳＮ５、ＳＮ６およびＳＮ４−４Ｇ突然変異体）。異なる構築物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の詳細は、表２（前掲）の中に列挙されている。制限分析（ＨｉｎｄＩＩＩ）は、インサートが事実組換えプラスミドであることを明らかにした。異なる大きさの組換えプラスミドを、各超活性の肺炎球菌の突然変異体から得た。組換えプラスミド、突然変異体ＳＮ３およびＳＮ４からのｐＬＳＮ３およびｐＬＳＮ４は同一の大きさ（約７．８ｋｂ）であり、そしてそれらのインサートの大きさは約２．４ｋｂであった。肺炎球菌の突然変異体ＳＮ５から得られた約１１ｋｂの組換えプラスミドｐＬＳＮ５のインサートの大きさは約５．６ｋｂであった。第４の肺炎球菌の突然変異体ＳＮ６は、異なる約６．５ｋｂおよび約１０．５ｋｂの組換えプラスミドｐＬＳＮ５ａおよびｐＬＳＮ５ｂを与え、これらは、それぞれ、１．１ｋｂおよび５．１ｋｂのインサートを有した。これらの肺炎球菌の突然変異体を、また、サザンハイブリダイゼーションにより検査した。超活性の肺炎球菌の突然変異体ＳＮ４をＣ３分解のそれ以上の研究において使用し、したがって、突然変異体ＳＮ４からレスキューされる組換えプラスミドｐＬＳＮ４を完全に研究した。プラスミドｐＬＳＮ４を肺炎球菌の突然変異体のＥｃｏＲＩ消化染色体ＤＮＡ試料に対するプローブとして使用し、これにより、突然変異体ＳＮ３およびＳＮ４中のベクター＋インサート（ｐＬＳＮ４）の組込みが確証された。ＳＮ３およびＳＮ４の双方の超活性突然変異体は、大きさ約２．２ｋｂおよび約５．８ｋｂの２つのハイブリダイゼーションするフラグメントを含み、これらは、また、親株ＣＰ１２００の中に存在した。約４．２および約３．５において２つのハイブリダイゼーションするベクター／インサートの結合フラグメントが存在し、これらの２つは一緒に合計約７．５ｋｂを与えた（ｐＬＳＮ４は約７．８である）。これらの２つのバンドは、また、ＥｃｏＲＩ消化ｐＬＳＮ４ＤＮＡの中に存在した。インサートおよびベクターの双方はＥｃｏＲＩ部位を有し、組換えプラスミドを表した。他の超活性突然変異体のパターンは、これらの突然変異体がそれらの組込まれた組換えプラスミドの中に異なるインサートを有することを示唆した。同一プラスミドｐＬＳＮ４を使用して親肺炎球菌株ＣＰ１２００を形質転換して、超活性にそれが関係することを確証した。期待されるように、得られた突然変異体ＳＮ４−４Ｇ（表２）において、増強されたＣ３分解の表現型を報告した。実施例３Ｃ３分解性遺伝子の単離および同定組換えプラスミドｐＬＳＮ４のインサート部分について、二本鎖ＤＮＡ配列を実施した。このインサートをＣ３分解性超活性とアソシエートさせたので、我々は対応する遺伝子の調節領域における挿入または遺伝子の重複を見ることを期待した；しかしながら、タンパク質のデータベースの検索に基づいて、調節領域における挿入の指示は存在しなかった。これは遺伝子の重複の可能性を示唆した。３つの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と１つの部分的オープンリーディングフレームが存在し、上記ＯＲＦの誘導されたアミノ酸配列とＧｅｎｅＢａｎｋ、ＢｌａｓｔおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの検索において提供されたタンパク質との間の有意な相同性が存在しなかった。予備的データ（ＣａｔｈｒｙｎＡ．Ｓ．、ｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７０：６００−６０８、１９９４）は、Ｃ３分解性プロテイナーゼアソシエートした細胞壁（輸送されたタンパク質）でありうることを示唆し、したがって、我々はシグナル配列、プロリンに富んだドメインまたはＬＰＸＴＧモチーフの存在を探した。４つのＯＲＦのいずれもこれらの配列のパターンをもたず、我々はＯＲＦ３、すなわち、最大のＯＲＦをそれ以上の分析のために選択した。ＣｓＣｌ勾配／臭化エチジウムの単離を使用して、プラスミドｐＬＳＮ４ａの二本鎖ＤＮＡを調製し、鋳型として使用した。アプライド・バイオシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）自動合成装置、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、またはＯｌｉｇｏ１０００ＭＤＮＡ合成装置（ＢｅｃｈｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．、カリフォルニア州ラブレア）により、オリゴヌクレオチドのプライマーを合成した。ジデオキシ連鎖停止法（ＳａｎｇｅｒＦ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：１０７４−１０７８、１９７７）およびセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）２．０（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）および［α−35Ｓ］ｄＡＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用し、装置：２０１１０マクロフォル電気泳動（ＭａｃｒｏｐｈｏｒＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ユニット（ＬＫＢＢｒｏｍｍａ）をセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２．０（ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）により示されるように用いて、配列決定を実施した。超活性の肺炎球菌の相同組換え突然変異体ＳＮ４から回収された、組換えプラスミドｐＬＳＮ４中のインサート（第３図参照）は、約２０の試験した酵素のうちでＨｉｎｃＩＩ、ＮｒｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩの制限部位を有するように思われ、そしてこのデータは配列のデータと相関した。配列決定データを概観した後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有するオーバーハングを使用する遺伝子の増幅（プライマーについて表４を参照）により、ｃｐｐＡ遺伝子（インサートのＯＲＦ３）の内部のフラグメントを発生させた。このフラグメントをベクターｐＶＡ８９１中のＨｉｎｄＩＩＩ部位の中にサブクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中にエレクトロポレーションし、インサートの存在について試験した。最後に、このサブクローンをｗｔＣＰ１２００肺炎球菌のコンピテント細胞の中に形質転換して、野生型ＣＰ１２００中のもとのｃｐｐＡ遺伝子を不活性化した。ハイバイド・オムニジーン（ＨｙｂａｉｄＯｍｎｉｇｅｎｅ）装置により、必要なＤＮＡフラグメントの５’および３’末端に対して相補的なプライマー（プライマーの配列および増幅サイクルの条件については表４を参照のこと）を使用して、ＤＮＡ増幅を実施した。双方の末端に制限部位を含むように、すべてのプライマーを構築した。増幅反応（最終体積０．１ｍｌの体積）において、１０ μｌの１０×ｖｅｎｔ緩衝液（最終濃度、１×は下記の成分を含有する：１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）２ＳＯ4、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、４μｌの１００ｍＭのＭｇＳＯ4（最終濃度４ｍＭ）、３μｌの１０ｍＭの各ｄＮＴＰ（最終濃度３００μＭ）、５０ｎｇの鋳型、１μＭのプライマーおよび１μｌの２０００単位／ｍｌのｖｅｎｔポリメラーゼ（最終濃度２単位；酵素を１０ｍＭのＫＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡ、１０μＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を水とともに１００μｌの最終体積で利用した。ｖｅｎｔポリメラーゼ酵素およびＭｇＳＯ 4をニュー・イングランド・バイオラブス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、マサチュセッツ州）から購入し、そして各ｄＮＴＰをギブコ社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）から購入した。アプライド・バイオシステムス３７３ｓ型ＤＮＡ配列決定装置（ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙ、ＩｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ（ＩＣＢＲ）、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ、フロリダ州ガインスヴィレ）を使用して、蛍光配列決定により、追加の配列を発生させた。サイクル配列決定反応において、ロボトロ・ワークステーション（ＲｏｂｏｔｌｏＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）（ＡＢＩＣａｔａｌｙｓｔ８００）およびパーキン・エルマー・セツス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）ＰＥＣ９６００温度計を使用した。鋳型、すなわち、プラスミドｐＬＳＮ４ａからの全インサートを表す増幅された遺伝子産物を、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キットにより０．７％のアガロースゲルから直接清浄した後、それを自動化配列決定に使用した。ＧＣＧソフトウェアパッケージで入手可能なプログラム（ファスタ、ブラストおよびその他のプログラム）を使用して、配列決定分析を実施した。実施例４Ｃ３分解性タンパク質の単離および研究超活性突然変異体およびそれらの親株の対数期培養物をＣ３と２〜４時間インキュベートし、培養上清を７．５％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル上で還元性条件下に開発させ、Ｃ３に対するＨＲＰ結合ポリクローナル抗体を使用するイムノブロッティングによりＣ３分解活性の増加について検査した。この実験において、突然変異体ＳＮ４およびＳＮ４−４Ｇ（ＳＮ４からレスキューされた組換えプラスミドｐＬＳＮ４を使用するＣＰ１２００の形質転換により得られた）は、Ｃ３分解においてそれらの親ＣＰ１２００株よりも活性であることが証明された。α鎖およびβ鎖の双方は４時間後突然変異体によりほとんど完全に分解されたが、分解は親株について不完全であった。ＣｐｐＡタンパク質はＣ３のα鎖を優先的に分解するように思われた。ｃｐｐＡ遺伝子の６２０ｂｐの内部のタンパク質をｐＶＡ８９１のＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させ、構築物をＣＰ１２００コンピテント細胞の中に形質転換した。得られた形質転換体をＣ３を分解する能力について試験した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により、Ｃ３分子のα鎖は分解され、その親ＣＰ１２００株と比較して、β鎖は分解の程度が少なかった。突然変異体中の活性の完全な非存在よりむしろ活性の減少は、突然変異体中の他のＣ３分解性プロテイナーゼをコードする他の完全に機能的な遺伝子の存在についての可能性を示した。全体のｃｐｐＡ遺伝子を増幅し、ｐｅｔ２８ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＩＮＣ．、ウイスコンシン州マディソン）のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位の中にクローニングし、そして遺伝子をＨｉｓ−ＴａｇでそのＮ−末端領域の中に組込んだ。全体の遺伝子はベクターの中にインフレームで位置することが配列決定により確証された。プラスミド構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲ株の中に安定化のために形質転換し、そしてインサートの存在を確認した後、ベクターおよびインサートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）プロテアーゼ欠乏株の中に発現のために形質転換した。プラスミド構築物を含有するコロニーを、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。小規模または大規模の製造のためのペット・システム（ＰｅｔＳｙｓｔｅｍ）マニュアル（ウイスコンシン州マディソン）に従い、タンパク質単離した。構築物（ｐｅｔ２８ｂ（＋）：：ＯＲＦ３（ｃｐｐＡ遺伝子）を含有するＢＬ２１ＤＥ３をＩＰＴＧにより誘導し、発現されたタンパク質ＣｐｐＡを可溶化した。可溶化のために、誘導された細菌培養物を遠心し、ペレットをＴＥＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）の中に再懸濁させた。この再懸濁液を氷上で超音波処理し（６×１５秒のパルス、高い出力：約５０ワット）、回転してペレットを集めた。ペレットをＴＥＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で２回洗浄し、最後にペレットを６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋１％のＴｗｅｅｎ２０で４℃において３時間処理した。可溶化されたタンパク質をＴＴＳ（１％のＴｗｅｅｎ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．７ＭのＨＣｌ）中で１：１０に希釈し、そしてＴＴＳ（１％のＴｗｅｅｎ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．７ＭのＨＣｌ）に対して透析してグアニジン−ＨＣｌ、ＤＴＴおよびＥＤＴＡを除去した。ニッケルカラムのクロマトグラフィーにより、ペット・システムのマニュアルの使用説明書（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＩＮＣ．、ウイスコンシン州マディソン）を使用して、透析されたＣｐｐＡタンパク質を精製した。ニッケルカラム（２．５ｍｌ）を注ぎ、グアニジン−ＨＣｌ、ＤＴＴおよびＥＤＴＡを除去した後、発現されたＨｉｓ標識化ＣｐｐＡタンパク質を精製のためにニッケルカラムに適用した。溶離された画分を、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマッシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染色により、Ｈｉｓ標識化ＣｐｐＡタンパク質について試験した。タンパク質を氷上で４℃に保持するか、あるいは必要となるまで小さいアリコートで−８０℃において凍結させた。ＣｐｐＡタンパク質（約６００ｎｇ／ｍｌの反応混合物）をヒト補体Ｃ３（０．８３μｇのＣ３／ｍｌの反応混合物）を３７℃においてＰＢＳの存在下に４時間インキュベートし、そしてタンパク質を含まない陰性の対照を同時に調製した。還元性条件下に７．５％または１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティング（ＥＣＬウェスタンブロッティングのプロトコール、ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、イリノイ州アーリントンハイツ）により、試料を分析した。前述したように、全ＯＲＦ３遺伝子のＰＣＲ生成物をＨｉｓ標識をもつペットベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウイスコンシン州マディソン）の中にアミノ末端位置においてサブクローニングし、そして構築物をプロテアーゼ欠乏大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２ｌＤＥ３（表２）の中に、それを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αＭＣＲ中で安定化した後、導入した。構築物を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３をＩＰＴＧにより誘導させた。発現されたＨｉｓ標識化ＯＲＦ３タンパク質（約２９ｋｄ）は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において、誘導されたタンパク質試料の不溶性画分の中において同定された。４℃において２時間または室温において１時間の可溶化のために、下記の試薬を使用した：ＴＥＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＮａＣｌ；（ｂ）６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ；（ｃ）６ｍＭのＧ −ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋１％のＴｗｅｅｎ２０；（ｄ）６ｍＭのＧ−ＨＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００。「ｃ」および「ｄ」の双方の処理は発現されたタンパク質を可溶性とし、ここでタンパク質は１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観測された。引き続く大規模調製のために、「ｃ」試薬を使用する処理を選択した。可溶化温度を透析し、次いでニッケルカラムを通して精製し、Ｃ３に対する機能について検査した。この実施例および前述の実施例において使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのために、全細胞タンパク質または可溶性または不溶性のタンパク質の画分をペット・システム・マニュアル（ウイスコンシン州マディソン）に従い抽出した。ＳＤＳ −ＰＡＧＥゲル（７．５％または１０％または１５％の分割ゲルおよび４．５％のスタッキングゲル）によりレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の不連続系（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ．Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５、１９７０）において、タンパク質を分離した。簡単に述べると、試料を負荷緩衝液（試料中の最終濃度は７．５７ｍｇ／ｍｌのＴｒｉｓ、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロールおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルー、±５％のβ−メルカプトエタノールであった）と一緒にし、５分間沸騰させるか、あるいは分割ゲル上に直接負荷した。前もって染色された高分子量標準（タンパク質マーカー（ｋｄ）：リゾチーム、１４，３００；β−ラクトグロブリン、１８，４００；炭酸脱水素酵素、２９，０００；オバルブミン、４３，００；ウシ血清アルブミン、６８，０００；ホスホリラーゼＢ、９７，４００；ミオシン、２００，００（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州グランドランド）をゲル上に含めた。大きいＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１５ｍＡにおいて１４時間、あるいは１０ｍＡにおいて２０時間電気泳動させた。ミニゲルを一定電圧（１００ボルト）において約２〜３時間電気泳動させた。発現されたタンパク質をＣ３とインキュベートし、そしてＣ３の存在量をウェスタンイムノブロッティングにより評価した。イムノブロッティング分析は、発現されたタンパク質を含有する試料はＣ３分子を分解することを示唆した。ヒト補体Ｃ３に対して特異的なポリクローナル抗体により未分解のＣ３を検出し、そしてこれは陰性試料この場合において、現像されたフィルム上に明瞭に見られた。Ｃ３分子のα鎖およびβ鎖の双方は、ＯＲＦ３タンパク質を含有しない陰性の対照と比較して、ＯＲＦ３タンパク質の活性に対して感受性であるように思われた；しかしながら、ＯＲＦ３試料において、 α鎖はほとんど完全に分解されたが、β鎖は部分的に分解された。実施例５臨床分離株におけるＣ３分解性遺伝子の保存遺伝子ｃｐｐＡの保存を検査するために、異なる臨床的（血清型）の肺炎球菌の分離株のＥｃｏＲＩ分解ゲノムＤＮＡ中の遺伝子ＣｐｐＡの存在をサザンハイブリダイゼーションにより決定するためのプローブとして、ＣｐｐＡの内部のフラグメントを使用した。同一の実験において、肺炎球菌のＣＰ１２００株および超活性突然変異体ＳＮ４およびＳＮ４−４Ｇ（双方の突然変異体は同一プラスミドを含有する一表２参照）をまた添加して突然変異体中のｃｐｐＡ遺伝子の重複を確証した。プローブとして遺伝子の非反応性ＤＩＧ標識化内部フラグメントを使用して、サザンハイブリダイゼーションを実施した。臨床分離株、１型、３型、１４Ｆ型およびビルレント２３Ｆ型は約２３ｋｂのハイブリダイゼーションしたバンドを示し、このバンドはまた対照の肺炎球菌のＣＰ１２００株およびＳＮ４突然変異体の中に存在した。この共通のバンドはｃｐｐＡ遺伝子がすべての試験した分離株の中に存在したことを示す。ＳＮ４突然変異体は、また、約３．５ｋｂの大きさを有するバンドを含有し、これにより遺伝子の重複の存在が示された。この３．５ｋｂの大きさは、プラスミドｐＬＳＮ４が２つのＥｃｏＲＩのエンドヌクレアーゼ認識部位を有し、１つがインサート領域の中に存在し、そして第２がベクターの中に存在するという観測と一致する。それゆえ、ＥｃｏＲＩを使用する制限消化は、組換えプラスミドからの約４．１７５ｋｂ（ベクターの３．５３１ｋｂ＋インサートの０．６４９）および３．５３９ｋｂ（インサートからの約１．６７ｋｇ＋ベクターからの約１．８６９ｋｇ）の２つのフラグメントを生成する。ｃｐｐＡ遺伝子はインサートの１．６７ｋｂの部分上に位置し、それゆえ、組換えプラスミドの約３．５３９ｋｂの制限フラグメントはｃｐｐＡ遺伝子を含有し、そしてこのバンドのみはｃｐｐＡ遺伝子の内部のフラグメントであるプローブに対してハイブリダイゼーションするであろう；したがって、重複ｃｐｐＡ遺伝子をもつ突然変異体の場合において、約３．５ｋｂにおける第２ハイブリダイゼーションしたバンドは重複ｃｐｐＡ遺伝子を表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 9/52 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:46） 9/52 (Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:46） 5/00 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:46）Ｃ１２Ｒ 1:46） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ダニー，ゲイリーアメリカ合衆国，ミネソタ 55116，セントポール，マウントカーブブールバード 507 (72)発明者ナンディワダ，ラクシュミエス. アメリカ合衆国，ミネソタ 55120，メンドタハイツ，レキシントンアベニュサウス 2330，アパートメント 210

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２と少なくとも８０％の同一性を有しかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができる単離されたタンパク質。２．前記タンパク質がストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離される、請求項１に記載のタンパク質。３．前記タンパク質がヒト補体タンパク質Ｃ３に結合する、請求項１に記載のタンパク質。４．前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。５．前記タンパク質が単離されたタンパク質である、請求項１に記載のタンパク質。６．１０％ポリアクリルアミドゲル上で測定して約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質。７．請求項１に記載のタンパク質からの少なくとも１５の連続のアミノ酸を含むペプチド。８．配列番号：２からなる単離されたタンパク質。９．配列番号：２からの少なくとも１５の連続のアミノ酸を含むペプチド。１０．前記タンパク質が１０％ポリアクリルアミドゲル上で測定して約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの分子量を有する、配列番号：２を含むタンパク質。１１．前記タンパク質がストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離される、請求項１０に記載のタンパク質。１２．前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１０に記載のタンパク質。１３．前記タンパク質がヒト補体タンパク質Ｃ３を分解する、請求項１０に記載のタンパク質。１４．配列番号：２のアミノ酸１〜５０を含むタンパク質。１５．第１Ａ図の核酸１２４６〜１８６３を含む核酸フラグメント。１６．ヒト補体タンパク質Ｃ３を分解するタンパク質であって、該タンパク質をコードする核酸は６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化及び変性化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１にハイブリダズし、ここで該サケ精子ＤＮＡは６５℃で一晩ハイブリダイズされ、そして２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温で約１０分間１回洗浄され、次いで６５℃で約１５分間１回洗浄され、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温で少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されていることを特徴とするタンパク質。１７．有効量の免疫系刺激ペプチドまたはポリペプチドを含んでなる免疫系刺激組成物であって、前記ペプチドまたはポリペプチドは配列番号：２と少なくとも８０％の配列同一性を有しかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができるタンパク質からの少なくとも１５アミノ酸を含むことを特徴とする免疫系刺激組成物。１８．前記タンパク質がストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離可能である、請求項１７に記載の組成物。１９．ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの少なくとも１つの別の免疫刺激ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をさらに含む、請求項１５に記載の免疫系刺激組成物。２０．配列番号：２と少なくとも９０％の配列同一性を有しかつヒト補体タンパク質Ｃ３を分解することができるタンパク質に特異的に結合することができる抗体。２１．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体。２２．前記抗体が抗体のフラグメントである、請求項２０に記載の抗体。２３．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項２０に記載の抗体。２４．前記抗体がマウス、ラット、ヒト、またはウサギから得られた抗体である、請求項２０に記載の抗体。２５．６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、および１００μ ｇ／ｍｌのフラグメント化及び変性化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１にハイブリダイズすることができる核酸フラグメントであって、該サケ精子ＤＮＡは６５℃で一晩、ハイブリダイズされ、そして、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温で約１０分間１回洗浄され、次いで６５℃で約１５分間１回洗浄され、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で室温で少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されていることを特徴とする核酸フラグメント。２６．ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のゲノムから単離された請求項２５に記載の核酸。２７．核酸フラグメントがタンパク質の少なくとも一部分をコードする、請求項２５に記載の核酸。２８．タンパク質がヒト補体Ｃ３を分解する、請求項２７に記載の核酸。２９．核酸フラグメントがヒト補体Ｃ３を分解しないタンパク質をコードする、請求項２７に記載の核酸フラグメント。３０．核酸ベクター中にある請求項２５に記載の核酸。３１．前記ベクターがタンパク質の少なくとも一部分を産生することができる発現ベクターである、請求項３０に記載の核酸。３２．請求項２５に記載の核酸を含む細胞。３３．細胞が細菌または真核細胞である、請求項３２に記載の細胞。３４．核酸配列：ｇｃｔｃｃｃａｇｔａｔｇｃｇｔａｃｔｃｇｔａａｇｇｔａｇａｇｇｇａａｇａａａａａａａｃｔａｇｃｔａｇを含む単離された核酸フラグメント。３５．動物においてストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を生成する方法であって、治療に有効な量のタンパク質の少なくとも一部分を哺乳動物に投与するステップであって、該タンパク質をコードする核酸は６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌのフラグメント化及び変性化サケ精子ＤＮＡのハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１にハイブリダイズし、ここで該サケ精子ＤＮＡは６５℃において一晩ハイブリダイズされ、そして２ ×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温において約１０分間１回洗浄され、次いで６５℃において約１５分間１回洗浄され、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温において少なくとも３〜５分間少なくとも１回洗浄されているステップと、前記タンパク質に対する免疫応答を得るステップと、を含む方法。３６．前記免疫応答がＢ細胞の応答である、請求項３５に記載の方法。３７．前記免疫応答がＴ細胞の応答である、請求項３５に記載の方法。３８．タンパク質の少なくとも一部分が少なくとも１５アミノ酸の長さである、請求項３５に記載の方法。３９．組成物がストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの少なくとも１つの別のタンパク質をさらに含む、請求項３５に記載の方法。４０．前記タンパク質が配列番号：２の少なくとも１５アミノ酸を含む、請求項３５に記載の方法。４１．挿入突然変異がヒト補体Ｃ３を分解することができるタンパク質をコードする遺伝子の中にある、挿入突然変異を含む細菌。４２．細菌が挿入重複突然変異を含む、請求項４１に記載の細菌。４３．ヒト補体Ｃ３に結合しかつ分解することができるストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの約２４ｋＤａ〜約３４ｋＤａの単離されたタンパク質。４４．ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が媒介するＣ３分解を阻害する方法であって、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質に結合することができる抗体に、ストレプトコッカス・ニゥモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細菌を接触させるステップを含む方法。４５．配列番号：１の核酸配列を含む単離された核酸フラグメント。４６．配列番号：１を含む二本鎖ＤＮＡ配列により転写されたＲＮＡフラグメント。