JP2001520748A

JP2001520748A - Ｊａｋ２／サイトカイン受容体結合の阻害剤を同定する方法

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Publication number: JP2001520748A
Application number: JP54579898A
Authority: JP
Inventors: ロバーズ，スティーブン・エル; ケイツ，ポール・エス
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 2001-10-30
Also published as: AU6568398A; WO1998043087A1; US6187552B1; EP0972197A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、喘息を治療するのに有用な治療薬を同定する方法を提供し、当該方法は、ヒトＪＡＫ２タンパク質の結合を阻害する同定化合物を、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体に接触させる工程を含む。ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体のシグナル伝達経路を遮断する化合物は、喘息の治療において使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】ＪＡＫ２／サイトカイン受容体結合の阻害剤を同定する方法発明の分野本発明は、サイトカイン受容体に対するヒトＪＡＫ２タンパク質の結合を阻害する化合物を同定するためのイン・ビトロ(in vitro)の方法に関する。発明の背景喘息は不可逆的な気道障害、気道炎症および種々の刺激に対する気道反応の上昇によって特徴付けられる[１]。喘息性気管支上皮における好酸球およびマスト細胞の数および活性化状態の上昇はよく報告されている[２]。加えて、気道Ｔリンパ球の活性化状態も上昇する[２]。吸入β２−アドレナリン作動性受容体アゴニストはある個人における急性気道充進反応(hyperresponsiveness)を制御するが、存在する慢性炎症には影響しない。慢性的に使用する場合、グルココルチコイドは、喘息を患う患者の肺における好酸球蓄積を低下させ、ずべてではないが大部分の場合、症状を緩和する。しかしながら、グルココルチコイドはすべての炎症細胞の活性化を阻害し、それは免疫抑制に起因する潜在的な副作用を生じる [３]。正常な個人においてではなく喘息を患う患者においては、脱顆粒化好酸球が肺上皮細胞中の基底膜下方で見出されている[４]。また、喘息患者においては、気管支肺胞洗浄流体および末梢血液中の好酸球の数が上昇し、これらのレベルが疾病の重度と相関する[４]。活性化した場合、好酸球は、好酸球カチオン性タンパク質、主要塩基性タンパク質、好酸球ペルオキシダーゼ、および好酸球−由来神経毒を含む細胞毒性メディエーターを放出する[５]。肺上皮に生じた障害は慢性炎症および喘息の症候に通じる。ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡを発現している細胞の数は喘息気道で増加する[６]。その結果、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ −ＣＳＦタンパク質のレベルは喘息気道においてありあまる程増加する[７,８] 。これら３種のサイトカインの機能は多くの点で重複する。ＩＬ−３およびＧＭ −ＣＳＦは骨髄における好酸球の発達および成熟に重要である[９]。ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦは骨髄からの好酸球の放出を誘導し、アポトーシスを防ぐことによってイン・ビトロ(jn vitro)の好酸球の生存を延ばす[１０，１１]。ＧＭ− ＣＳＦおよびＩＬ−５は、好酸球に対して、血小板活性化因子およびホルミル− Met−Leu−Phe[１２，１３］およびエオタキシン(eotaxin)[１４］のごときアクチベーターに対してより強く応答するように準備させ、これは肺炎症の動物モデルの気道で発見された[１５]。ＩＬ−５に対する抗体を、急性肺炎症の動物モデルにおける抗−炎症効果について試験した。モルモットにおいては抗−ＩＬ−５抗体は、抗体攻撃後、肺への好酸球の流入を完全に阻害したが[１６]、マウスおよびサルを用いた同様の実験においては該抗体は部分的にしか好酸球増加を低下しなかった[１７，１８］。ヒトの慢性喘息における抗−ＩＬ−５抗体またはＩＬ−５受容体アンタゴニスト[１９]の作用は知られていない。ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体は各サイトカイン受容体にユニークなαサブユニットと、共通のβサブユニット(β_c)とからなるヘテロダイマーである[２０]。高−親和性リガンド結合には、両方のサブユニットが必要とされる[２０]。これらの受容体のαサブユニットは、大部分、全体的に細胞外であり、サイトカイン結合後の細胞質シグナルの伝達に寄与する膜−橋渡し性のβ_c サブユニットを離れる。ＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦによるβ_cシグナル伝達の活性化は、チロシンキナーゼＪＡＫ２の自己リン酸化および有糸分裂促進物質−活性化タンパク質(ＭＡＰ)キナーゼ経路の活性化に通じる[２１−２５]。該β_cサブユニットは共通のタンパク質キナーゼドメインを含んでいない[２６ ]；しかしながら、β_cはＪＡＫ２に直接結合し[２１，２７]、これがシグナル伝達に関与する最も近位のキナーゼであることを示唆している。ＩＬ−３、ＩＬ− ５またはＧＭ−ＣＳＦのその受容体複合体に対する結合は、ＪＡＫ２の受容体の凝集およびＪＡＫ２の活性化に通じるようである[２８]。このことは、昆虫細胞でバキュロウィルスベクターを用いてＪＡＫ２を過剰発現させると、タンパク質の量が臨界レベルまで一旦蓄積するＪＡＫ２の自己リン酸化につながるという妥当な仮説である[２９]。自己リン酸化によってＪＡＫ２が活性化された後、それは受容体のβ_cサブユニットをリン酸化する。これは、受容体複合体上のチロシンホスフェートに対するそのＳＨ２ドメインの結合を介して、ＳＴＡＴ(signal transducers and acti vators of transcription)の補充につながる(図１)。ついで、該ＳＴＡＴはおそらくはＪＡＫ２によってリン酸化され、他のリン酸化ＳＴＡＴとダイマーを形成し、核に移動してそこでＤＮＡに直接結合する[３０，３１]。この機構を用いて、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦはＳＴＡ１、ＳＴＡＴ３および２っの形態のＳＴＡＴ５を活性化することができる[２１，３２，３３]。切頭および欠失突然変異導入により、β_c細胞質ドメインの離れた領域がＪＡＫ２およびＭＡＰキナーゼ経路を活性化することに寄与していることが示された [２４，２７，３４]。例えば、６２の膜−隣接細胞質アミノ酸[配列番号：３]は、ＪＡＫ２の活性化ならびにｃ−ｍｙｃおよびｐｉｍ−１の転写の上方調節に必要かつ十分である[２４]。Ｐｉｍ−１は、抗−アポトーシス活性を有するセリン／スレオニンキナーゼである[３５]。アミノ酸６２６−７６３を含むβ_cのよりＣ−末端の領域は、ＭＡＰキナーゼ経路の活性化ならびにｃ−ｆｏｓおよびｃ− ｊｕｎの転写の上昇に必要である[２４]。[配列番号：３]に示すβ_cの６２の膜 −隣接残基のみが、他の増殖因子がＭＡＰキナーゼ経路を活性化する場合の細胞の生存および増殖に必要である[３６]。この膜隣接領域には、多くのサイトカイン受容体内で低度で保存されている、Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２として知られている２種のモチーフが含まれる。Ｂｏｘ１の欠失またはモチーフ中の特異的なプロリンの突然変異がＪＡＫ結合を低下し得るため[３７]、Ｂｏｘ１はＪＡＫ結合に必要かもしれない。ＪＡＫ２は、ＩＬ−６およびＩＬ−１０に対する受容体を含む他のサイトカイン受容体[２８]、ならびにエリスロポイエチンおよび成長ホルモンによっても活性化される[３８，３９]。成長ホルモン受容体[３９]、および、そのうえおそらくは他の受容体に対する結合にも、ＪＡＫ２のＮ−末端領域が必要である。ＪＡＫ２欠失突然変異導入により、β_cに対する結合にはＮ−末端の２３９のアミノ酸が必要であること、およびβ_cに結合するためにはＮ−末端の２９４残基で十分であることが立証された[４０]。Ｎ−末端の欠失は、昆虫細胞中で発現させたＪＡＫ２のキナーゼ活性に影響しない[２９]。ＪＡＫ２のチロシンキナーゼ・ドメインは該タンパク質のＣ−末端付近に存在し[４１]、このドメインはＩＬ−３ −およびエリスロポイエチン−誘導した増殖および生存を支持するよう機能しているにちがいない[３８，４２]。喘息治療用の潜在的な治療剤を同定する持続している要望を考慮すれば、β_c とＪＡＫ２との結合に影響する化合物を同定する結合アッセイは価値のあるツールであろう。発明の概要本発明は、喘息を治療または予防するのに潜在的に有用な化合物のスクリーニング方法であり、当該方法は、候補化合物の存在下にて、[配列番号：５]に示すＪＡＫ２タンパク質の少なくともＮ−末端の２９４残基を含む第１分子と、[配列番号：３]に示すＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体のβ_cサブユニットの少なくとも６２の膜−隣接細胞質アミノ酸を含む第２分子とを接触させることを含む。この接触工程の後に、検出工程を行って該第１分子と該第２分子との間に複合体が形成されるか否かを判定して、候補化合物が複合体の形成を阻害するか否かを判定する。阻害されている場合には、候補化合物が喘息治療用に潜在的に有用であることを示している。本発明は、喘息を治療または予防するのに潜在的に有用な化合物をスクリーニングする第２の方法であり、当該方法は、候補化合物の存在下にて、[配列番号：５]に示すＪＡＫ２タンパク質の少なくともＮ−末端の２９４残基を含む第１分子と、[配列番号：１３−１９]に示すＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体のβ_cサブユニットの少なくとも１３の細胞質アミノ酸を含む第２分子とを接触させることを含む。この接触工程の後に検出工程を行って、該第１分子と該第２分子との間に複合体が形成されるか否かを判定して、候補化合物が複合体の形成を阻害するか否かを判定する。阻害されている場合には、候補化合物が喘息治療用に潜在的に有用であることを示している。好ましい具体例において、第１分子または第２分子のいずれかを標識して、候補化合物の同定を容易ならしめることができる。本発明で用いることができる標識技術の例には、蛍光標識またはラジオアイソトープ標識が含まれる。図面の説明図１はＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体を介したβ_c／ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達のモデルを図示する。詳細には、サイトカイン(三角)がその受容体に結合した後に、該受容体は密集すると考えられ、β_c−結合ＪＡＫ２分子を近接して近づけさせ、それらを互いにリン酸化させる。ついで、β_cサブユニットがリン酸化され、受容体複合体へのＳＴＡＴの補充につながる。リン酸化ＳＴＡＴはダイマーを形成し、それは核に移動されて、そこでＤＮＡに直接結合して特別の遺伝子の転写に影響する。図２はＩＬ−５で刺激した後のヒト好酸球中のβ_cのチロシンリン酸化を示す。示しているのは、(分で)示す時間につき、ＩＬ−５で刺激したヒト好酸球から免疫沈降させたβ_cの抗−ホスホチロシン・イムノブロットである。分子量標準( Ｍ_r×１０^-3)を示す。４４ｋＤａ未満のバンドは、免疫沈降している抗体の重鎖および軽鎖に対する抗−ホスホチロシン抗体の非特異的結合を表す。図３はヒトＴＦ−１細胞中のβ_cのチロシンリン酸化を示す。示しているのは、（分で）示す時間につき、ＩＬ−３(＋ＩＬ−３)またはビヒクル(−ＩＬ−３) で刺激したヒトＴＦ−１細胞から免疫沈降させたβ_cの抗−ホスホチロシン・イムノブロットである。７.５％アクリルアミドゲルを用いた。分子量標準(Ｍ_r× １０^-3)を示す。図４はヒトＴＦ−１細胞中のＪＡＫ２のチロシンリン酸化を示す。示しているのは、（分で）示す時間につき、ＩＬ−３(＋ＩＬ−３)またはビヒクル(−ＩＬ −３)で刺激したヒトＴＦ−１細胞から免疫沈降させたＪＡＫ２の抗−ホスホチロシン・イムノブロットである。７.５％アクリルアミドゲルを用いた。分子量標準(Ｍ_r×１０^-3)を示す。図５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ヒトβ_c細胞質ドメインのヌクレオチド[配列番号：１]およびアミノ酸配列[配列番号：２]を示す。ＪＡＫ２の活性化[配列番号：３]またはＲａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化[２４]に必要なタンパク質の領域、ならびにＢｏｘ１およびＢｏｘ２ドメインを示す。切頭ＧＳＴ−β_c融合タンパク質構築物を作製するために用いたＢｇｌＩＩ、ＳａｃＩおよびＳｍａＩ制限サイトを示す。２っのＳａｃＩサイトのうちの最初のサイトで終了するＧＳＴ −β_c△ＳａｃＩ構築物を示す。ヌクレオチドの番号付けは、各ＧＳＴ−β_c融合タンパク質構築物で用いた最初のヌクレオチドからである。図６はイー・コリ（E．coli）で発現させたＧＳＴ−β_c融合タンパク質を示す。上図：３つのＧＳＴ−β_c融合タンパク質の模式図。左パネル：ＧＳＴ単独、ＧＳＴ−β_c△ＢｇｌＩＩおよびＧＳＴ−β_c△ＳａｃＩが主要な細胞タンパク質であることを示す、全イー・コリ抽出物のクーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲル。右パネル：ＧＳＴ−β_c△ＳｍａＩが産生されているが、より小さな形態に分解されていることを示す、抗−ＧＳＴ−β_c抗体で染色した左のものと同一のゲルのイムノブロット。分子量標準は各パネルの右手レーンに見え、それらの分子量（Ｍ_r×１０^-3）を示す。図７は精製したＧＳＴ−β_c融合タンパク質を示す。２μｇの精製ＧＳＴ−β_c 融合タンパク質およびＧＳＴ単独をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーで染色した。分子量標準（Ｍ_r×１０^-3）を示す。図８はＧＳＴ−β_c融合タンパク質に対する³⁵Ｓ−ＪＡＫ２の結合を示す。示しているのは、左レーンの５μｌのイン・ビトロ−翻訳³⁵Ｓ−ＪＡＫ２を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフィーである。残りのレーンは、５μ １の³⁵Ｓ−ＪＡＫ２とインキュベートし、つづいて洗浄した後の、示すように、可溶化グルタチオン−セファロース(Sepharose)ビーズ単独(ビーズ)またはＧＳＴまたはＧＳＴ−β_c融合タンパク質に結合したビーズを含む。このオートラジオグラフは６日間感光させた。図９は本発明で用いるサブクローン化ＪＡＫ２フラグメントのヌクレオチド配列[配列番号：４]を示す。図１０は本発明で用いるＪＡＫ２フラグメントの推定アミノ酸配列[配列番号：５]を示す。図１１はＪＡＫ２を活性化させるために必要かつ十分であるβ_cの６２の膜− 隣接細胞質アミノ酸[配列番号：３]を示す。図１２はトリチウム標識した完全長ＪＡＫ２[配列番号：２２]（Ａ）またはＮＪＡＫ２[配列番号：５]（Ｂ）およびβ_cペプチド１−６[配列番号：１１−１６ ]のＮ−末端切頭を用いたＳＰＡの結果を示す。両方のグラフにつき、＃０はビーズのみの対照であって、＃１−６はペプチド１−６[配列番号：１１−１６]との反応である。グラフＡについて、＃７はペプチド４[配列番号：１４]および５倍過剰量の非標識ＪＡＫ２との反応である。グラフＢについて、＃７はペプチド４[配列番号：１４]および１０倍過剰量の非標識ＪＡＫ２との反応である。図１３はビーズを添加する前に³Ｈ−ＪＡＫ２およびβ_cペプチドを混合することによって行ったＳＰＡの結果を示す。明細書中に記載するごとく、＃０はビーズのみの対照であり、＃１はペプチド１[配列番号：１１]との反応であり、＃２はペプチド４[配列番号：１４]との反応であって、＃３はペプチド６[配列番号：１６]との反応である。図１４は、３の異なる濃度の標識ＪＡＫ２（８.１２ｎＭ、１６.２５ｎＭおよび３２.５ｎＭ）を用いてペプチド４[配列番号：１４]を力価測定（６.２５から１６００ｎＭ）したＳＰＡの結果を示す。図１５はＳＰＡにおける対シグナル−ノイズ比に対するκ−カゼインの効果を示す。＃０はビーズのみの対照であって、＃１−６はペプチド１−６[配列番号：１１−１６]との反応である。実施例８の“材料および方法”で記載するごとく、グラフＡについての反応にはκ−カゼインが含まれておらず、グラフＢについての反応にはペプチドをビーズに結合させる工程で１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼインが含まれている。図１６はＳＰＡにおける対シグナル−ノイズ比に対するＢＳＡの効果を示す。グラフ中の＃０、２および４についての反応はビーズのみの対照である。＃１、３および５についての反応は、ビーズに結合した飽和未満のペプチド４[配列番号：１４]を有していた。＃０および１にはＢＳＡが含まれておらず、＃２および３には０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが含まれ、＃４および５には０.５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが含まれていた。図１７ＡおよびＢは、１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼイン存在下でビーズに結合した過剰量のペプチド４[配列番号：１４]を用いた結合曲線を示す。異なる量のＪＡＫ２を用いた：Ａにおいては０.７２−２１４ｎＭおよびＢにおいては５.５−３３ｎＭ。図１８はＳＰＡにおける標識ＪＡＫ２とのエアヒュージ(airfuge)したＪＡＫ２フラクションの競合をグラフで示している。ＳＰＡにおいて、エアヒュージ前のＪＡＫ２(出発ＪＡＫ２)または６時間のＪＡＫ２のエアヒュージ後の上清(エアヒュージからの上清)のいずれかの異なる量を標識ＪＡＫ２と混合し、シグナルにおける得られたパーセント低下をグラフに示す。図１９ＡおよびＢはＳＰＡにおける対シグナル−ノイズ比に対する種々の洗浄剤およびＤＴＴの効果を示す。ペプチド４[配列番号：１４]を含有するすべての反応は、飽和未満の量のペプチドを用いた。Ａについて、＃０はビーズのみの対照であって、＃１はペプチド４[配列番号：１４]の陽住対照である。Ａにおいては種々の洗浄剤を反応＃２−９に添加した。＃２および３には０.０１％のトリトン(Triton)を含ませた。＃４および５には０.００３％のツイーン２０(Tween 20)を含ませた。＃６および７には０.００２５％のブリジ３５(Brij 35)を含ませた。＃８および９には０.０１％のディジトニン（digitonin）を含ませた。Ｂについて、＃０はビーズのみの対照であって、＃１はペプチド４[配列番号：１４]の陽性対照である。０.００２５％のブリジ３５を反応＃２−５で用いた。０ .１ｍＭのＤＴＴを反応＃２および３で用い、１ｍＭのＤＴＴを反応＃４および５で用いた。図２０ＡおよびＢは、ペプチド４−被覆ＳＰＡビーズへの³Ｈ−ＪＡＫ２の結合に競合するストレプトアビジン−ペプチド４複合体の能力の試験を示す。Ａについて、＃０はビーズのみの対照である。ビーズに結合したペプチドを用いたすべての反応において、可溶性試料を添加する前に過剰量のペプチド４[配列番号：１４]をビーズに結合させた。＃１における反応物は、ペプチド４[配列番号：１４]またはストレプトアビジンを添加していない、ビーズに結合したペプチド４[配列番号：１４]のみである。＃２には１：１の比で可溶性ペプチド４／ストレプトアビジンが含まれていた。＃３には４：１の比で可溶性ペプチド４／ストレプトアビジンが含まれていた。＃４には可溶性ペプチド４として２０ｐＭのペプチド４が含まれていた。＃５には２０μＭのストレプトアビジンが含まれていた。Ａについての反応はκ−カゼインを含んでいなかった。Ｂについて、０はビーズのみの対照である。ビーズに結合したペプチドを用いたすべての反応において、可溶性試料を添加する前に、（実施例８の“材料および方法”で記載するごとく）１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼインの存在下にて過剰量のペプチド４をビーズに結合させた。＃１の反応物は、ペプチド４またはストレプトアビジンを添加していない、ビーズに結合したペプチド４のみである。＃２には４：１の比でペプチド１／ストレプトアビジンが含まれ、＃３には４：１の比でペプチド４／ストレプトアビジンが含まれていた。図２１ＡおよびＢは³Ｈ−ＪＡＫ２の結合に対するβ_cペプチドのＣ−末端欠失の効果を示す。Ａについて、＃０はビーズのみの対照である。Ａにおいて、反応＃１ではペプチド４を、反応＃２ではＣＴＤ−３[配列番号：１７]を、および反応＃３ではＣＴＤ−４[配列番号：１８]を用いた。１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼインの存在下では、過剰量のペプチドがビーズに結合した。３２.５ｎＭの標識ＪＡＫ２を各反応で用いた。Ｂについて、＃０はビーズのみの対照である。Ｂにおいて、反応＃１ではペプチド４を、および反応＃２ではペプチドＣＴＤ−５[配列番号：１９]を用いた。１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼインの存在下にて、過剰量のペプチドをビーズに結合させた。１０ｎＭの標識ＪＡＫ２を各反応で用いた。図２２ＡおよびＢは、本発明で用いるサブクローン化完全長ＪＡＫ２ｃＤＮＡのヌクレオチド配列[配列番号：２１]を示す。図２３は本発明で用いる完全長ＪＡＫ２タンパク質の推定アミノ酸配列[配列番号：２２]を示す。図２４Ａ−Ｆは固定化β_cペプチドに対するＪＡＫ２のＥＬＩＳＡ結合を示す。ストレプトアビジン被覆９６−ウェルプレートに固定化したペプチドに結合した種々の濃度のＪＡＫ２は、種々の度合いの結合を示した。発明の詳細な説明好酸球は喘息の病理において鍵となる役割を演じているようであり、ＪＡＫ２シグナル伝達経路は好酸球一活性化サイトカインＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ −ＣＳＦの活性に極めて重要なようである。前に注記したごとく、好酸球を補充し活性化するこれらのサイトカインの能力を低下させるために標的化し得る経路中の多くのポイントが存在し、これらは喘息の治療に有用であろう。受容体レベルでは、アンタゴニストを開発することができるが、３種すべてのサイトカインが喘息気道に存在するため、単一のアゴニストでは、２種の残るサイトカインが好酸球を活性化し続けてしまうであろう。ＪＡＫ２キナーゼ活性の阻害剤は、３種すべてのサイトカインの活性を阻害するであろうが、ＪＡＫ２はシグナル伝達の他の受容体によって使用されているため、かかる阻害剤は悪い効果を有し得る。さらに下流を活性化する(例えばＳＴＡＴ、ｐｉｍ−１のような)さらなるメディエーターは、ＪＡＫ２のように、他のシグナル伝達経路によって利用され、それをあまり望ましくない標的としている。しかしながら、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ機能に対してのみ必要であるこの経路の共通点は、β_cによるＪＡＫ２の活性化である。ＪＡＫ２はそれが結合するβ_cサブユニットの密集後の自己リン酸化によって活性化されると考えられるため、β_c／ＪＡＫ２結合の破壊は３種すべてのサイトカインによるシグナル伝達を破壊するにちがいない。ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦは他の細胞に効果を有するが、生存に対してそれらに依存することが知られている好酸球以外の細胞タイプは存在しない。したがって、かかるアプローチが、好酸球におけるより早期のアポトーシスに選択的に通じるであろうと予想される。ＪＡＫ２はＢｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフを含有する他の受容体によって活性化されるが、これらのモチーフは、β_c／ＪＡＫ２に対して特異的な結合阻害剤の同定が有望と思われる受容体の中で十分に異なる。本発明者らは、喘息を治療するための新たな分子機構として、β_cとＪＡＫ２との間の相互作用をブロッキングすることを考察する。本発明者らがこの発見の価値を実証することを助けるために、本発明者らは、好酸球およびＩＬ−３、ＩＬ−５、またはＧＭ−ＣＳＦ−依存性セルラインにおけるβ_c／ＪＡＫ２シグナル伝達経路の活性を示す生化学的な終点を最初に同定した。ついで、本発明者らは、例えばシンチレーション隣接アッセイ(scintillation proximity assay（ＳＰＡ）)、蛍光偏光またはＥＬＩＳＡを用いて、β_cおよびＪＡＫ２の組換え形態がイン・ビトロ(in vitro)で互いに結合し得ることを実証するための結合アッセイを開発した。この情報は、ブロッキング化合物を同定するための高−容量スクリーニングの開発を許容する。 β_c／ＪＡＫ２経路の活性の確認実施例１−ヒト末梢血液好酸球の単離好酸球は、Pharmacia and Upjohn社、Clinical Research Unit(Kalamazoo,Mic higan)から得たヒト全血または顆粒性白血球除去血輸血パックから単離した。＞５％の末梢血液好酸球を有していたドナーからの血液のみを用い、一方白血球除去血輸血ドナーは３−５％の好酸球を通常有していた。１ユニットの全血を５０ｍｌのポリプロピレン製遠心チューブに分け、室温(ＲＴ)、３００×ｇにて２０分間遠心した。血漿を除去し、５０ｍｌをＲＴ、２５００×ｇにて１５分間遠心して、血小板を除去した。得られた血小板をほとんど含まない血漿(ｐｐｐ)を正常食塩水中で１：４に希釈した。最初の遠心からの血球ペレットを正常食塩水中の６％デキストランＴ５００(D extran T500)（Pharmacia Biotech社製，Uppsala，Sweden）５ｍｌに各々懸濁し、さらなる正常食塩水を添加して５０ｍｌとした。チューブをよく混合し、ついで赤血球（ｒｂｃ）をＲＴにて６０分間沈殿させた。白血球（ｗｂｃ）を回収し、ＲＴ、３００×ｇにて１０分間遠心した。出発材料が白血球除去血輸血パックであった場合には、該白血球除去血輸血媒質中のデンプンが同様の様式でｒｂｃを沈殿させるため、デキストランを添加する必要はなかった。該細胞を遠心チューブに分配し、直ちにＲＴにて６０分間沈殿させた。回収したｗｂｃを遠心し、食塩水中で一回洗浄し、ＲＴ、３００×ｇにて５分間遠心して、血小板を除去した。血液または白血球除去血輸血パックのいずれかからのｗｂｃペレットをｐｐｐに再懸濁し(前記のごとく１：４に希釈し)、保存し、４本の５０ｍｌコニカル遠心チューブに各２０ｍｌを分配した。各チューブを１２．５ｍｌのＬＳＭ(リンパ球分離媒質＝Ficoll／Hypaque溶液,比重1.0770−1.0800 ｇ／ｍｌ，Organon Teknika Corporation社製，Durham，NC）で下層形成(underl ayered)し、ＲＴ、７５０×ｇにて２５分間遠心した。界面の単核細胞およびペレットに沈んだ全てのＬＳＭを除去した。出発細胞が白血球除去血輸血パックからのものである場合には、ＬＳＭグラジエント工程を繰返して、はるかに大きな単核細胞界面からのコンタミネーションを回避した。ペレット化した顆粒球を５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ) の合計保存容量に再懸濁し、氷浴に入れた。２０ｍｌの氷冷水を添加することによってｒｂｃを溶解し、その３０秒後に２０ｍｌの２ｘＰＢＳを添加した。ＲＴ、３００×ｇにて５分間の遠心によって顆粒球をペレット化し、ハンク・バランス塩類溶液[修飾ＨＢＳＳ＝カルシウムおよびマグネシウムを含まない１０ｍｌの１０×ＨＢＳＳ、１ｍｌの１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.３、０.４７ｍｌの７.５％重炭酸ナトリウム、１ｍｌの２００ｍＭＬ−グルタミン(すべてGibco BRLLife Technologies社製，GrandIsland，NY)、１０ｍｌの熱不活化ウシ胎仔血清(Irvi ne Scientific社製，Irvine，CA)、７７.５ｍｌの蒸留水]に再懸濁し、遠心によって一回洗浄し、２０ｍｌの修飾ＨＢＳＳに再懸濁し、計数した。好中球を除去するために、細胞濃度を８×１０⁷顆粒球／ｍｌに調整し、１：５０の３Ｇ８抗−ＣＤ１６抗体（NCIのDavid Segal博士から寄贈いただいたハイブリドーマ・セルライン、現在はATCC，Rockville，MDを介して入手可能）を添加した。該細胞を該抗体で４℃にて３０−６０分間ロック（rock）し、遠心し、ついで修飾ＨＢＳＳで２回洗浄した。細胞を修飾ＨＢＳＳに再懸濁し、洗浄した抗−マウスＩｇＧ被覆磁性ビーズ(PerSeptive Biosystems社製,Framingham，MA) を１０ビーズ／顆粒球の比および８×１０⁷顆粒球／ｍｌの最終濃度で添加した。細胞およびビーズを４℃にて３０分間ロックした。好中球／ビーズ複合体を強力な磁石（Advanced Magnetics社製，Cambridge，MA）を用いて、２回の５分間分離で取出した。サイトスピン．スラィド（cytospin slide）を調製し、Diff−Quik（Baxter S cientific Products社製，McGawPark，IL）で染色し、ついで異なる計数を行った。得られた精製好酸球調製物には、９０−９５％の好酸球が含まれていた。血液のユニットからはほぼ５０００万−１億個の好酸球が、また白血球除去血輸血パックからは１億−４億が得られた。実施例２−細胞のサイトカイン刺激およびイムノブロッティング精製後直ちに、好酸球を１％ウシ胎仔血清（FBS，GibcoRBL社製，Gaithersbur g，MD）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地(GibcoBRL社製，Gaithersburg，MD)中に２×１０⁷細胞／ｍｌで再懸濁し、３７℃にて２分間インキュベートした。０. １％のウシ血清アルブミンを入れたＰＢＳ中で希釈した組換えヒトＩＬ−５(Bio source社製，Camarillo，CA）を、データ点当たり１×１０⁷細胞を用いて、種々の時間に１２.５ｎｇ／ｍｌで添加した。チューブを氷上に置き、０.１ｍＭのオルト−バナジウム酸ナトリウムを入れた１０倍量のＰＢＳを各チューブに添加した。３００×ｇの遠心によって好酸球をペレット化し、プロテアーゼ・インヒビター（１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび０ .２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）を入れた０.６ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭのTris−Cl、ｐＨ７.４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、３％のトリトンＸ−１００）に再懸濁した。氷上にて１５分間インキュベートした後に、１６，０００×ｇにて遠心することによって夾雑物をペレット化した。抗−β_c抗体(Upstate Biotechnology社製，Lake Placid，NY)の１：３００希釈物と共に、４℃にて一晩回転させることによりライゼートからβ_cを免疫沈殿させた。２０μｌのタンパク質−Ａセファロース(Pharmacia Biotech社製，Uppsala，Sweden)を各ライゼートに添加し、インキュベートを１時間続けた。１ｍｌの冷溶解緩衝液と共に遠心することによってビーズを３回洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）負荷緩衝液[４４]中に再懸濁し、１０分間煮沸し、４−２０％アクリルアミド・グラジエントゲル（Integrated Separation Systems社製，Natick，MA）上の電気泳動によって分離した。Towbinら[４５]の方法によってタンパク質をオプチトラン(Optitran（Schleicher & Schuell社製，Keene，NH）)に移した。１％ウシ血清アルブミンを入れたＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭのＮａＣＬおよび０.０５％のツイーン−２０）中、３７℃にて１時間ブロッキングした後に、ペルオキシダーゼーコンジュゲート抗−ホスホチロシン抗体ＲＣ２０（Transduction Laboratories社製，Lexington，KY）を１：３０００の希釈で添加し、室温にて２時間インキュベートを続けた。そのブロットをＴＢＳ−Ｔ中、室温にて１０分間、３回洗浄し、SuperSignal HRP(Pierce Chemical社製,Ro ckford,IL)を用いて発色させた。ヒト赤白血病セルラインＴＦ−１[４６]はAmerican Type Culture Collection から入手し、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（GibcoBRL社製，Ga ithersburg，MD）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（GibcoBRL社製,Gai thersburg,MD）および２.５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−３（Biosource社製， Camarillo，CA）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。実験の前に、ＴＦ−１細胞を、ＩＬ−３を含まず１％ＦＢＳを入れたＲＰＭＩ１６４０培地中で一晩増殖させた。ついで、１％ＦＢＳを入れた新鮮なＲＰＭＩ１６４０中に２× １０⁷細胞／ｍｌで再懸濁し、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を用いかつ溶解緩衝液を２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.６、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、５ｍＭのＥＧＴＡおよび１％のトリトンＸ−１００とした以外は好酸球について前記したのと同様に処理した。ＩＬ−３なしに処理した細胞について、ＰＢＳ＋０.１％のＢＳＡをその代わりに添加した。１：３００の希釈の抗−ＪＡＫ２抗体（Upstate Biotechnology社製，LakePla cid，NY）と共に４℃にて一晩回転させることによって、ＪＡＫ２をライゼートから免疫沈降させた。２０μｌのタンパク質Ａ−セファロース（Pharmacia Biot ech社製，Uppsala，Sweden）を各ライゼートに添加し、インキュベートを１時間続けた。１ｍｌの冷溶解緩衝液と共に遠心することによってビーズを３回洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）負荷緩衝液[４４]中に再懸濁し、１０分間煮沸し、４−２０％のアクリルアミド・グラジエントゲル（Integrated Separation Systems社製，Natick，MA）上の電気泳動によって分離した。Towbinら[４５]の方法によってタンパク質をOptitran （Schleicher & Schuell社製，Keene，NH）に移した。１％ウシ血清アルブミンを入れたＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０.０５％のツイーン−２０）中、３７℃にて１時間ブロッキングした後に、ペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ホスホチロシン抗体ＲＣ２０（Transd uction Laboratories社製，Lexington，KY）を１：３０００の希釈で添加し、室温にて２時間インキュベートを続けた。そのブロットをＴＢＳ−Ｔ中、室温にて１０分間、３回洗浄し、SuperSignal HRP(Pierce Chemical社製,Rockford,IL)を用いて発色させた。実施例３−β_c／ＪＡＫ２経路は好酸球およびＴＦ−１細胞において活性である前に注記したごとく、幾分かの再懸濁した精製好酸球を、データ点当たり１× １０⁷細胞を用いて種々の時間、ヒトＩＬ−５に暴露した。３７℃にて１２.５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−５を用いた精製ヒト好酸球のこの刺激により、１分以内に β_cのチロシンリン酸化が生じた(図２)。チロシンリン酸化のレベルは刺激後５ −１０分でピークに達し、ＩＬ−５が続けて存在したにもかかわらず３０分までに脱リン酸化がはっきりと現れた。同様の実験を試みて、ＩＬ−５に応答したＪＡＫ２のチロシンリン酸化を見ようとしたが、好酸球における比較的低いレベルのＪＡＫ２がこれらの努力を妨害した。同様の実験を、増殖につきＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦに依存性であるヒト赤白血病セルラインであるＴＦ−１細胞[４６]において行った。３７℃ にて２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３でＴＦ−１細胞を刺激すると、好酸球で見られた時間と合致する時間経過でβ_cのチロシンリン酸化が生じた(図３)。加えて、ＪＡＫ２のチロシンリン酸化はＴＦ−１細胞においては容易に検出でき(図４)、その時間経過はβ_cのものと平行していた。応答時間は、２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ −３が両方のタンパク質のピークリン酸化を１分で生じたごとく、用量−依存性であった。ＩＬ−３について用いた希釈で、ＩＬ−３不存在下でＰＢＳ＋０.１％のＢＳＡを細胞に添加しても、β_cまたはＪＡＫ２のチロシンリン酸化は誘導できなかった(図３および４)。これらの実験により、β_c／ＪＡＫ２シグナル伝達経路が好酸球およびＴＦ− １細胞において活性であることが確認された。生存については両方ともＩＬ−３、ＩＬ−５またはＧＭ−ＣＳＦに依存性であるため、サイトカイン−刺激の生存および増殖をブロックするであろう化合物を同定するためのスクリーニングでいずれかの細胞タイプを理論的に用いることができる。しかしながら、増殖の阻害に基くいずれのスクリーニングも、細胞増殖の阻害で陽性として細胞毒性化合物を誤って同定する細胞毒性化合物も同定するであろう。したがって、これらの問題点を回避するために、本発明者らは、規定分子終点を有する無−細胞アッセイを開発することを決定した。かかるアッセイには、ヒトβ_cおよびＪＡＫ２のフラグメントがクローン化されかつ発現されていることが必要である。 β_c／ＪＡＫ２結合アッセイ実施例４−β_cタンパク質の生成およびβ_c−含有プラスミドの構築ヒトβ_cｃＤＮＡはＴＦ−１細胞からHayashidaらによってクローン化された[ ２６]。結合アッセイにおいて使用するタンパク質を生成するためには、ヒトβ_c の全細胞質ドメインをコードするｃＤＮＡをｐＧＥＸベクターにサブクローン化し、イー・コリで発現させた場合にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)融合タンパク質を生成させた。詳細には、ヒト赤白血病ヤルラインＴＦ−１[４６]はAmerican Type Culture Collection，Rockwell，Maryland（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−２００３）から得、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン(GibcoBRL社製，Gaithersburg，MD)および２.５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−３（Biosource International，Inc.社製，Camarillo，CA）を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。ＲＮＡは、製造業者指示書(Molecular Research Center，Inc.社製，Cincinna ti，Ohio）に従ってTri−Reagentを用いて、ＩＬ−３−依存性ＴＦ−１セルラインから調製した。合計ＲＮＡ（２．５μｇ／反応）を用い、“Superscript Prea mplification System for First Strand cDNA Synthesis”(GibcoBRL社製,Gaith ersburg,MD)を用いてｃＤＮＡを合成した。プライマーとしてオリゴ(ｄＴ)またはランダム・ヘキサマーのいずれかを用いて別々の反応を行い、ついで合した。 β_cの細胞質部分をコードするｃＤＮＡは、ヒトβ_cのヌクレオチド１４２１− １４３８に対応するセンス・プライマー(５'TCGAATTCATCTACGGGTACAGGCTG３'[配列番号：６])およびヌクレオチド２７１５−２７３２に相補的なアンチセンス・プライマー(５'TAGCGGCCGCTCAACACACCTCCCCAGG３'[配列番号：７])を用いて、ＴＦ−１細胞ｃＤＮＡから増幅させた。該センス・プライマーは、増幅したβ_cｃＤＮＡの５'末端にＥｃｏＲＩ制限サイトを加えるように設計され、該アンチセンス・プライマーは増幅したβ_cｃＤＮＡの３'末端にＮｏｔＩ制限サイトを加えるように設計された。ＰＣＲは製造業者指示書、ならびに９４℃にて５分間の後に、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、ついで７２℃にて３分間を３５サイクルし、つづいて７２℃にて１０分間の単一のインキュベートのサイクル・プロフィールに従ってTaq Extender（Stratagene社製，La Jolla，CA）を用いて行った。ついで、該フラグメントをｐＧＥＸ５Ｘ−１(Pharmacia Biotech社製，Uppsal a，Sweden)のＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間にクローン化して、β_c の細胞質ドメインとグルタチオン−Ｓ−トラスフェラーゼとの枠内（in-frame）融合体であるｐＧＥＸ５Ｘ-β_cを作製した。配列は、Applied Biosystems Sequencer Model No.ABI373Aを用いた蛍光色素停止配列決定法によって確かめた。形質転換ィー・コリを一晩培養物から、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したL Btoyh、ＬＢｒｏｔｈまたはＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（GibcoBRL 社製，Gaithersburg，MD）のいずれかに１：１００で希釈し、ほぼ０.５のＯＤ₅ ₅₀ まで３０℃にて増殖させた。ＩＰＴＧを添加して最終濃度１ｍＭとし、その培養物を２-４時間さらに増殖させた。遠心によって細胞を採取し、必要となるまで凍結細胞ペレットとして保存した。その細胞ペレットをＳＤＳ負荷緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、その後、Towbinらの方法[４５]を用いてすべてのタンパク質を、レーン当たりほぼ０.２ＯＤＵの細胞ライゼートで、ニトロセルロース（Optitran，Scleicher & S cheull社製，Keene，New Hampshire）に移した。そのニトロセルロース・フィルターを抗−β_c−ＧＳＴ(UBI社製，Lake Placid，New York)およびペルオキシダーゼ一結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ(Boehringer−Mannheim社製，Indianapolis，I ndiana)と共にインキュベートし、ＧＳＴまたはＧＳＴ／β_c融合タンパク質を表しているバンドを、記載されているごとく過酸化水素および４−クロロ−１−ナフトールを用いて視覚化した[４８]。残念ながら、ＧＳＴ融合タンパク質を用いたヒトβ_cの細胞質ドメインの発現は、該タンパク質が全イー・コリ抽出物中で悪く分解される結果となった。該分解は、イー・コリ菌株を変えることによっても、増殖温度を変えることによっても、あるいはＴ７プロモーターを利用してチオレドキシン−β_c融合タンパク質の発現を作動させる別の発現系を用いることによっても改善されなかった(データは示さず)。 β_cの膜−隣接の６２アミノ酸[配列番号：３]はＪＡＫ２のＧＭ−ＣＳＦ−誘導活性化および増殖の刺激について必要かつ十分であるため[３４]、３種の同様な融合タンパク質構築物を作製した。各構築物には、Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２ドメインが含まれる（図５）[３０]。Ｂｏｘ２ドメインのアミノ酸Ｃ−末端がＪＡＫ２のβ_cに対する最適結合について重要となり得るか否かがわからなかったため、無傷で精製し得る最大の融合タンパク質が得られるように３種の構築物を同時に作製した。 β_cについての３種の異なる３'切頭ミニ遺伝子は、各々、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩで、ならびにＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化し(図５に示す)、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(BRL社製)で平滑末端とし、ついで再環化させることによって、ｐＧＥＸ５Ｘ−β_cから構築した。３種の得られたプラスミド構築物をｐＧＳＴ−β_c△ＢｇｌＩＩ、ｐＧＳＴ−β_c△ＳａｃＩおよびｐＧＳＴ−β_c△Ｓｍａｌと命名する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現培養物の分析により、全細胞タンパク質の５−１０％に達する、正確なサイズのＧＳＴ−△β_cＢｇｌＩＩおよびＧＳＴ−β_c△ＳａｃＩ構築物についてのクーマシー染色バンドが示された(図６)。ＧＳＴ−β_c △Ｓｍａ構築物は、ウエスタン・ブロッティングによってのみ検出可能なより少量の無傷タンパク質を発現した。また、ウエスタン・ブロッティングは３種すべての発現タンパク質がイン・ビボ(in vitro)でタンパク質加水分解に付され、該タンパク質加水分解の程度が発現タンパク質のサイズとおおよそ相関することも示した。（前記したごとく）培養温度、誘導の時間、ＩＰＴＧの濃度を変化させること、およびプロテアーゼ欠失宿主株を用いることによるタンパク質加水分解の程度を制限するための試行は失敗した。３種すべての融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースアフィニティー・クロマトグラフィーによって容易に精製した(図７)。収率は培養物ＩＬ当たりほぼ１−２ｍｇであった。イー・コリ・ライゼートで見られた分解を超えるさらなる分解は認められなかった。これらのフラグメントはグルタチオン−セファロースに結合し、それから溶離することができるため、それらは融合物のＣ−末端 β_c部分内の切り抜きから生じるにちがいない。ＧＳＴ部分よりなるＮ−末端が分解した場合には、タンパク質はグルタチオン−セファロースに結合しないであろう。実施例５−組換えタンパク質の発現および精製上記に同定するプラスミド構築物を発現させるために構築したイー・コリの好適な菌株を生成するため、イー・コリ原株をAmerican Type Culture Collection から得、ＡＴＣＣｅ２３７１６と指定した。この菌株はλバクテリオファージに対して溶菌性であって、Ｆプラスミドをも有している(Bachmann，B.によるJ.B act.Rev.，36：525−557(1972))。 λ溶原菌は菌株から除去した。このことは、Miller，J.H.によりExperiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory(1972)中に記載されているＰｌｖｉｒバクテリオファージ形質導入技術によって行った。Ｐｌｖｉｒバクテリオファージは、Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor ，New Yorkから“Experiments with Gene Fusion Strain Kit”のパーツとして入手可能である。バクテリオファージＰｌｖｉｒは、Coli Genetic Stock CenterのBarbara Bac hmann博士，Yale University，New Haven，Connecticut気付から入手可能であるイー・コリＣＧＳＣ６０８０菌株で増殖させた。この菌株はλバクテリオファージに対して溶菌性でなく、（キノリン酸シンセターゼのＡタンパク質をコードする）ｎａｄＡ遺伝子中に挿入されたＴｎ１０エレメントを含み、λバクテリオファージの組込みサイトに隣接して位置する。該Ｔｎ１０エレメントはｎａｄＡ遺伝子を破壊し、細胞をニコチンアミドの外部供給に対し依存性とする。該Ｔｎ１０エレメントは、テトラサイクリン抵抗性をコードする遺伝子を運んでぃる。ＣＧＳＣ６１８０（ｎａｄＡ::Ｔｎ１０）からのＰｌｖｉｒライゼートを用い、テトラサイクリン抵抗性を選抜することによってｎａｄＡ::Ｔｎ１０対立遺伝子をＡＴＣＣｅ２３７１６に形質導入した。選抜からの多数のコロニーを、バクテリオファージＴ４ｒＩＩに対する感受性によって近位のラムダファージの組換え欠失につき試験した(Benzer，S．によるProc．Natl．Acad．Sci．USA，47：403 −408(1961))。ｎａｄＡ::Ｔｎ１０対立遺伝子は、正常ｎａｄＡ遺伝子を有し、かつ、ラムダに対して溶菌性でない(Coli Genetic Stock Center，New Haven，C onnecticutから入手可能な)Ｗ３１１０菌株上でＰｌｖｉｒを増殖させることによって除去した。正常ｎａｄＡ対立遺伝子についての選抜は、ニコチンアミドを補充していない培地上に細胞を平板することによって行った。つぎに、４μｇ／ｍｌのリファンピシン存在下にて細胞を複数継代間増殖させることによってＦプラスミドを除去した。Ｆプラスミドを欠失した細胞は、Ｆプラスミド−特異的バクテリオファージの増殖を支持するその能力によって同定した(Caro，L．G.およびM．SchnosによるProc.Natl.Acad.Sci.USA，56：126−131( 1966))。得られた菌株をＫ１２Ｓと命名した。 (陰性対照としての)ＧＳＴおよび実施例４からの３種のプラスミド構築物(ｐＧＳＴ−β_c△ＢｇｌＩＩ、ｐＧＳＴ−β_c△ＳａｃＩおよびｐＧＳＴ−β_c△ＳｍａＩ)のいずれかをコードするプラスミドは、アンピシリン抵抗性について選抜することによってコンピーテントＫ１２Ｓ細胞に形質転換した[４７]。これらの３種のタンパク質を発現する細胞は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補充したL BrothまたはTerrific Broth(GibcoBRL社製，Gaithersburg，MD)のいずれかの中に一晩培養物から１：１００で希釈し、ほぼ０.５のＯＤ₅₅₀まで３０℃にて増殖させた。ＩＰＴＧを添加して１ｍＭとし、ついで該培養物を２−４時間さらに増殖させた。遠心によって細胞を回収し、必要になるまで凍結細胞ペレットとして保存した。該細胞ペレットをＳＤＳ負荷緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した後、レーン当たりほぼ０.２ＯＤＵの細胞ライゼートでTowbinらの方法を用いて[４５ ]全タンパク質をニトロセルロース（Optitran，Schleicher & Scheull社製）に移した。該ニトロセルロース・フィルターを抗−β_c−ＧＳＴ(UBI社製)およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Boehringer−Mannheim社製，Inndia napolis，Indiana）とインキュベートし、ＧＳＴまたはＧＳＴ／β_c融合タンパク質を表すバンドを、記載されているごとく[４８]過酸化水素および４−クロロ −１ナフトールを用いて視覚化した。融合タンパク質は、Bulk GST Puirification Module（Pharmacia Biotech社製 ,Uppsala,Sweden)を用いたグルタチオン−セファロース上のアフィニティー・クロマトグラフィーによって精製した。イー・コリ細胞ペーストは、Pharmacia Bi otech社,Uppsala,Swedenによって記載されているごとく超音波処理および１％のトリトンX−100処理によってか、または１００μｇ／ｍｌのリゾチーム、１％のトリトンX−100および１００μｇ／ｍｌのＤＮアーゼで室温にて１０−３０分間処理することによって溶解した。実施例６−ＪＡＫ２タンパク質の生成およびヒトＪＡＫ２ｃＤＮＡフラグメントのクローニングＪＡＫ２のＮ−末端の２９４アミノ酸は、ＪＳＫ２がβ_cに結合するために十分である[４０]。最初の２９４アミノ酸をコードするＪＡＫ２ｃＤＮＡは、マウスＪＡＫ２配列に基くＰＣＲプライマーを用いてヒトＴＦ−１細胞ｃＤＮＡから増幅させた。好適なベクター（すなわち、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターサイトを含むいずれかのベクター）にサブクローニングした後に、ＪＡＫ２ｃＤＮＡをイン・ビトロ(in vitro)で転写させ、³⁵Ｓ−メチオニンの存在下で翻訳させて³⁵Ｓ−標識Ｎ−末端ＪＡＫ２を得た(図８)。実施例４と同様に、ＲＮＡは、製造業者指示書（Molecular Research Center ，Inc.社製，Cincinnati，Ohio）に従ってTri−Reagentを用いて（American Typ e Tissue Collection，Rockwell，Marykland，ATCC寄託番号CRL−２００３から入手した）ＩＬ−３依存性ＴＦ−１１７ルライン[４６]から調製した。全ＲＮＡ（２.５μｇ／反応）を用い、Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis（GibcoBRL社製,Gaithersburg,MD）を用いてｃＤＮＡを合成した。プライマーとしてオリゴ(ｄＴ)またはランダム・ヘキサマーのいずれかを用いて別々の反応を行い、ついで合した。ヒトＪＡＫ２のＮ−末端の２９４アミノ酸をコードするｃＤＮＡは、ヌクレオチド９４−１２３に対応する(センス鎖)、およびヌクレオチド９５７−９７５に相補的な(アンチセンス鎖)公開されたマウスＪＡＫ２ｃＤＮＡ配列[２３]に基くプライマーを用いてＴＦ−１細胞ｃＤＮＡから増幅させた。各々、以下のプライマーを用いた：ＭＪ２Ｆ１(5'AGGAATTCATGGGAATGGCCTGCCTTACAATGACAGAA3')[配列番号：８]およびＭＪ２Ｒ１(5'TAGCGGCCGCACCGTTTCCAGTTATAATGGTTGCAA3')[配列番号：９]。ＰＣＲの条件は前記したごときβ_cフラグメントと同一であった。得られたフラグメントは、T/A Cloning Kit（Invitrogen社製，San Diego，California）を用いてｐＣＲＩＩにクローン化して、プラスミドｐｈｊａｋ２−５'を得た。 Applied Biosystems Sequencer Model No．ABI373A上の蛍光色素停止配列決定法を用いてサブクローン化ＰＣＲフラグメントのヌクレオチド配列決定を行い、図９に示すヌクレオチド配列[配列番号：４]および図１０に示す推定アミノ酸配列[配列番号：５]を得た。ヒトＪＡＫ２ヌクレオチド配列のこの領域はラットＪＡＫ２配列に対して８７％同一であって、ヒトＪＡＫ２アミノ酸配列はこの領域においてラットＪＡＫ２に対して９７％同一であった[４９]。ｐＣＲＩＩ中のＪＡＫ２クローンの向きは、Ｔ７プロモーターからの転写によってセンス鎖ＲＮＡが得られる向きであった。実施例７−β_c／ＪＡＫ２イン・ビトロ結合アッセイ ³⁵Ｓ−標識Ｎ−末端ＪＡＫ２タンパク質フラグメントは、³⁵Ｓ−メチオニン（ Amersham Life Sciences社製，Arlington Heights，Illinois）存在下にてＴ７ＲＮＡ polymerase TNT kit（Promega社製，Madison，Wisconsin）を用いたｐｈｊａｋ２−５'プラスミドの結合したイン・ビトロ転写および翻訳によって生成した。精製したＧＳＴまたは３種の各ＧＳＴ−β_c融合タンパク質は、１ｍｌ充填ビーズ当たり０.５ｍｇのタンパク質を室温にて３０分間インキュベートすることによって、グルタチオン−セファロース(Pharmacia Biotech社製，Uppsala, Sweden)に非共有的に結合させた。プロテアーゼ・インヒビター、２５μｌのビーズおよび５μｌの³⁵Ｓ−ＪＡＫ２翻訳産物を入れた結合緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、０.１％のツイーン−２０）中で洗浄し、平衡化させた後に、プロテアーゼ・インヒビターを入れた６００μｌの結合緩衝液中、４℃にて一晩インキュベートした。ビーズを１ｍｌの冷結合緩衝液で３回洗浄した後に、結合した融合タンパク質および³⁵Ｓ−ＪＡＫ２をＳＤＳ −ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で可溶化し、１０分間煮沸した。各タイプのビーズに結合した³⁵Ｓ−ＪＡＫ２の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーの後に明らかになった。３種すべてのβ_c融合タンパク質は、ＧＳＴ−セファロースまたはセファロース・ビーズ単独よりも、より多くの³⁵Ｓ−ＪＡＫ２を再現性よく結合した(図８)。ＧＳＴ単独に対してＧＳＴ−β_c に対する³⁵Ｓ−ＪＡＫ２の特異的結合は、種々の結合緩衝液の存在下で再現性があった(データは示さず)。ＪＡＫ２に結合したＧＳＴ−β_c△ＳｍａＩ融合タンパク質分解産物ならびに無傷ＧＳＴ−β_c△ＢｇｌＩＩまたはＧＳＴ−β_c△ＳａｃＩタンパク質は、おそらくはβ_cの６２個またはより少ないアミノ酸のみがＪＡＫ２に結合するために必要であるためである[２４]。手にしたこれらの結果により、本発明者らは、シンチレーション隣接、蛍光偏光またはＪＡＫ２−β_c 結合の小−分子阻害剤を迅速にスクリーニングする同様のアッセイでＧＳＴ−β_c 融合タンパク質と組合せてＪＡＫ２を用いる大−容量スクリーニングアッセイにそれらを適合するように設定した。実施例８−β_c／ＪＡＫ２イン・ビトロ高処理量結合アッセイＡ．材料および方法１．完全長ＪＡＫ２発現構築物の生成ＢＬＡＳＴを用いたＩｎｃｙｔｅデータベースの検索[５０]によって、クローン１７９５２７がラットＪＡＫ２配列[４９]に対して高いホモロジー（２１７ｂｐにわたる８７％）を有することが判明した。ＷＯ９６／３８５９１号中に記載されている方法を用い、この配列情報を用いてプラスミドベクターｐＳＰＯＲＴ中に完全長ヒトＪＡＫ２ｃＤＮＡクローンを生成した。ヌクレオチド配列決定によって、天然ＪＡＫ２配列と比較して、ポジション９１８の保存チロシン残基のコドンをアスパラギンに変化させる単一ヌクレオチド突然変異が見出された。天然ＪＡＫ２[５４]（GenBank寄託番号AF005216)[配列番号：２１]の配列は、ヒトＴＦ−１細胞から独立して単離したＪＡＫ２ｃＤＮＡを配列決定することによって決定した。ＪＡＫ２の発現用の５'非翻訳配列を除去するために、プライマーＰＳＫ５６７(5'−GGATCCCCCGGGGGAATGGCCTGCCTTACGATGAC−3')[配列番号：２３]およびＰＳＫ５６８（5'-CATCAAGAAGAGGAGCTTCAGCAC−3'）[配列番号：２４]を用い、ＰＣＲを用いて、完全長クローンからＪＡＫ２コード配列の５'末端を増幅させた。この産物をＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化し、すでにＳｍａＩおよびＸｈｏＩで消化されたＪＡＫ２−ｐＳＰＯＲＴ構築物にサブクローン化した。ＪＡＫ２の３ '非翻訳領域を除去し、Ｃ−末端ＦＬＡＧタグ(Asp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp− Asp−Lys)を付加するために、プライマーＰＳＫ５６９(5'−GTTTTCTGGTGCCTTTGA AAGACCG−3')[配列番号：２５]およびＰＳＫ５７８(5'−CGCTATGGATCCCCCGGGCTA ATTTTTATCATCATCATCTTTATAATCTCCAGCCATGTTATCCCTTATTTG−3')[配列番号：２６] を用い、ＰＣＲを用いて完全長クローンからＪＡＫ２コード配列の３'末端を増幅させた。この産物をＢａｍＨＩで消化し、これもＢａｍＨＩですでに消化されている５'−修飾ＪＡＫ２−ｐＳＰＯＲＴ構築物にサブクローン化した。 U.S.E.突然変異誘発（Pharmacia Biotech社製,Uppsala,Sweden）を用い、突然変異を訂正するためのオリゴヌクレオチドＹ９１８Ｐｖｕ２(5'−GATTACGCCGACC AGCtgaaTaGCACACTCCCTTGTAC)[配列番号：２７]およびＳｐｈＩ制限サイトを除去するためのＳｐｈｌ（5'−GCTATGACGTCGCATCCACGCGTACGTAAGC）[配列番号：２８ ]を用いて、ほかのすべての残基のアミノ酸組成を維持しつつ、ヌクレオチド２７５２−２７５７を改変してチロシンについてのコドンを回復させた。このアプローチにより、チロシン／アスパラギン突然変異がチロシンに変化して戻ったプラスミドが首尾よく得られた。バキュロウイルス発現構築物を作製するために、５'および３'ＪＡＫ２ｃＤＮＡ配列がｐＶＬ１３９３マルチクローニングサイトのいずれかの末端に貼られるように、ＰＣＲプライマー(ＭＫＯ−５5'−GATGATGATAAAAATTAGCCCGGCCGCTGCA GATCTGATCC−3'[配列番号：２９]およびＭＫＯ−６ 5'−GTAAGGCAGGCCATTCCCCCG GCCGCTCCGGAATTCTAG−3'[配列番号：３０]を用いて、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３を増幅させた。ＰＣＲ条件は、buffer １とExpand PCR Kit（Boehr inger Mannheim社製，Indianapolis， Indiana）をあいまいに用いた、９５℃にて５分間；つづいて、９４℃にて１０秒間、６５℃にて３０秒間、６８℃にて８分間を１０サイクル；ついで各サイクルを２０秒間延長した、９４℃を１０秒間、６５℃を３０秒間、６８℃を８分間を２０サイクル；ついで６８℃にて７分間につづいて４℃であった。この産物をＳｃａＩで消化して、別々の半分で存在する５'および３'バキュロウイルス組換え配列を有する、２つの配列片を生成した。これらの産物ならびにＳｍａＩで消化しｐＳＰＯＲＴベクターから離して精製した５'および３'−修飾ＪＡＫ２ｃＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、（前記と同じ条件で）ＰＣＲに付して、バキュロウイルス組換え配列によって挟まれたＪＡＫ２ｃＤＮＡを含有するＤＮＡの線状片を生成した。この生成物をBaculo Goldbaculovirus(Pharmingen社製,SanDiego,Caliornia) と共に用い、標準Lipofectin(Gibco−BRL社製,Gaithersburg,MD)トランスフェクション・プロトコール[５１]を用いて、着生Ｓｆ９昆虫細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクション上清を５日後に採取し、つづいてプラークアッセイに付して各プラークを単離した[５１]。これらのプラークのうちの１０（ウイルス）を増幅させ、それを用いて昆虫Ｓｆ２１細胞を感染させ、っいでＪＡＫ２ＤＮＡおよびタンパク質発現用のＰＣＲおよびウェスタン・ブロッティングによってスクリーニングした。バキュロウイルスはＪＡＫ２インサートを有することを示し、っいでＪＡＫ２タンパク質発現を１リットルに拡大し、ＤＮＡ配列決定用にウイルスＤＮＡを単離した。８０,０００×ｇ(２４,０００ｒｐｍ、ＳＷ２８ローター)、４℃にて９０分間の遠心によって、１.０リットルのウイルス・ストックのうちの９０ｍｌからウイルス粒子をペレット化することによって、放出ウイルスをウイルスＤＮＡ精製用に単離した。ウイルスＤＮＡは、以下の修飾でQiagen Genomi cDNA Purificat ion Kit（QIAGEN社製，Santa Clara，California）を用いて精製した：放出ウイルスペレットを１０−３０秒間ボルテックス攪拌（最高速度）することによって５ｍｌのBuffer G2に再懸濁し、ついで９５μｌのQiagen Proteaseを添加し、５０℃ にて６０分間ィンキュベートしてタンパク質を除去し、ウイルスＤＮＡに暴露させた。カラム精製は、製造業者プロトコールに従って、midi prepカラムGiagen tip−100/G上で行った。収量はＡ_260nmによって測定して、〜０.５μｇウイルスＤＮＡ／ｍｌウィルス・ストックであった。このＤＮＡを配列決定して、最終バキュロウイルス構築物の確実性を確かめた。２．免疫アフィニティー精製組換えヒトＪＡＫ２の超遠心 Flagアフィニティー標識（DYKDDDDK）[配列番号：２０]を含有する組換えＪＡＫ２タンパク質を、記載したごとくＳＦ９またはＨＩ−５細胞のいずれかで発現させた。細胞は１ｘリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、ｐＨ７.５、４℃のダウンス・ホモジネーション(２０ストローク)によって溶解した。清澄化した抽出物を抗−Flag免疫アフィニティーカラム(Kodak社製，NewHaven，Connecticut) を通し、精製組換えＪＡＫ２を、１ｘＰＢＳ中の２５０μｇ／ｍｌの濃度のFlag ペプチドの溶液と競合させることによって溶出した。純度はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一バンドによって特徴付けた。幾つかの実験については、ＪＡＫ２タンパク質(０.１５ｍｇ／ｍｌ)を７の等量のチューブに分注し、ついでＡ −１１０ローターを用いたエアヒュージ（Airfuge）中、平均１６４,０００ｘｇ、常温にて６時間の超遠心に付した。0時間およびその後の各時間に、分析（ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタン・ブロッティング）用にＪＡＫ２のチューブを取出した。３．超遠心後の可溶性画分に残る組換えＪＡＫ２タンパク質の決定前記の上清のアリコットを取出し、ＥＬＩＳＡアッセイに付した。各溶液を０ .１Ｍの炭酸ナトリウム、ｐＨ９.０で１：５０に希釈し、ついで複数の濃度で９６ウェルプレートに適用した。一晩インキュベートした後に、各ウェルを１ｘＰＢＳ、ｐＨ７.５中の０.１％ＢＳＡ（洗浄緩衝液）で洗浄し、つづいて４℃にてさらなる時間インキュベートを続けた。ついで、ウェルを１５０μｌの洗浄緩衝液中のＣ２０抗−ＪＡＫ２抗体（Santa Cruz Biotechnology社製，Santa Cruz， California）と４℃にて１時間インキュベートし、つづいて洗浄緩衝液でよく洗浄した。二次抗体(１：２０００の希釈のアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗 −ウサギＩｇＧ(Promega社製，Madison，Wisconsin))を４℃にて１時間適用し、つづいて緩衝液でよく洗浄した。最後に、ウェルを０.１Ｍのトリス−ＨＣ１.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、ｐＨ９.５でインキュベートし、ついで５ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート(ｐＮＰＰ)を含有する同一の緩衝液(１５０μ１)と共にインキュベートした。発色は、４０５ｎｍの吸光度に設定したSpectraMax 250 プレートリーダーによって判読した。各画分の上清に残存している組換えＪＡＫ２の相対的量を算出するために、各濃度曲線の線形フェーズを各時点(０、１、２、３、４、５および６時間の超遠心)について選択した。４．³ＨでのＪＡＫ２の標識 ³Ｈ−Ｎ−スクシンイミジルプロピオナート(³Ｈ−ＮＳＰ、Amersham Life Sci ences社製，Arlington Heights，Illinois)を用いて３つの異なる標識反応を行った。１つの反応は、１５０μｌの反応容積および１ｍＣｉの乾燥³Ｈ−ＮＳＰ( 窒素ガス流を用いてトルエンを除去した)を用いて氷上にて１時間のインキュベート[５２]で、０.１Ｍのホウ酸緩衝液、ｐＨ８.５中の０.５ｍｇの精製ＪＡＫ２を用いて行った。それによって、約１８Ｃｉ／ミリモルの比活性を有する標識ＪＡＫ２を得た。もう１つの反応は、０.１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８.０および前記と同一容量を用いて行った。１.２ｍｌのリン酸緩衝液中の１ｍgのＪＡＫ２を、氷上にて３時間インキュベートした。この反応により、２３Ｃｉ／ミリモルの比活性が得られた。３番目の反応は、０.１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８.０中の２.５ｍｇの精製ＪＡＫ２および２.５ｍｌの容量を用いて行った。それを５ｍＣｉの乾燥³Ｈ−ＮＳＰと、氷上にて２時間インキュベートした。それによって、３９Ｃｉ／ミリモルの比活性が得られた。２０ｍＭのトリス、ｐＨ８ .０、０.１５ＭのＮａＣｌで予め平衡化させたＰＤ−１０カラム(Pharmacia Bio tech社製,Uppsala,Sweden)を用いて、取込まれなかった標識から３種すべての生成物を分離した。これら３つの標識の結果から、ホウ酸緩衝液よりも良好でない場合にはリン酸緩衝液の使用が標識が良好に得られ、ならびに１時間を超えるインキュベートが比活性を上昇させないという結論を描いた。２倍量の³Ｈ−ＮＳＰを使用すると、得られる比活性も２倍となった。標識ＪＡＫ２のタンパク質濃度は、密閉し、Molecular Devices Thermo Maxプレートリーダー上で判読する９６−ウェルプレート中にて、製造業者指示書どおりにMicro BCAタンパク質アッセイ（Pierce Chemical社製，Rockford，IL）を用いて算出した。５．ビオチニル化ペプチドの合成ａ．Ｂｏｃ−保護アミノ酸からのペプチドの合成段階固相ペプチド合成[５３]は、Applied Biosystems社製(Foster City，CA)4 30Aペプチドシンセサイザー上で行った。Ｎ^a−アミノ保護基としてｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用い、一時的な側鎖保護基は以下のとおりであった：Ａｒｇ(Ｔｏｓ)、Ｃｙｓ(４−ＣＨ₃Ｂｚｌ)、Ｇｌｕ(ＯＢｚｌ)、Ｈｉｓ(Ｂｏｍ)、Ｌｙｓ(Ｃｌ−Ｚ)、Ｓｅｒ(Ｂｚｌ)、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）およびＴｙｒ(Ｂｒ−Ｚ)。他のアミノ酸の側鎖は保護しなかった。各残基を二重カップリング（d ouble coupled）し、ついで次の二重カップリング・サイクルの前に無水酢酸でキャップした。Ｎ−末端Ｂｏｃ基を除去した後に、ＮＨＳ−ビオチン（Pierce C hemical社製，Rockford，IL）およびＤＭＦ中のＤＩＥＡを室温にて２４時間用いて樹脂結合ペプチドをビオチニル化した。ついで、ＨＦ／アニソール／１,４ −ブタンジチオール（１０：２：１）で−５℃にて１時間処理することによって、そのビオチニル化樹脂結合ペプチドを樹脂から切断し、一時的側鎖保護基を除去した。水／アセトニトリル勾配を用い、各相が０.１％のＴＦＡを含むVydacC −18カラム(２７.５ｘ２５０ｍｍ)（Vydac社製,Hesperia,California）上の分取型逆相クロマトグラフィーによって、粗製ペプチドを精製した。分析用ＨＰＬＣによって測定して清澄な画分を保存し、アセトニトリルを減圧下にて蒸発させた。ついで、水性相を凍結乾燥した。その精製したペプチドは、オープンアクセス型(open access)電子スプレー質量分析機によって特徴付けた。ｂ．Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸からのペプチドの合成段階固相ペプチド合成を前記のごとく行った。９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)基をＮ^a−アミノ保護基として用いた。一時的側鎖保護基は：Ａｒｇ(Ｐｍｃ)、Ａｓｎ(Ｔｒｔ)、Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)、Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)、Ｓｅｒ (ｔＢｕ)、Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)、Ｔｙｒ(ｔＢｕ)であった。他のアミノ酸の側鎖は保護しなかった。各残基は、ＨＢＴＵ／ＮＭＰプロトコールを用いて単一カップリングした。Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基を除去した後に、ＮＨＳ−ＬＣビオチンを用いた以外は前記と同様に樹脂結合ペプチドをビオチニル化した。９５％ＴＦＡ／５％スキャベンジャー(エチルメチルスルフィド／アニソール／１,２−エタンジオール，１：３：１)で室温にて２時間処理することによって、ビオチニル化樹脂結合ペプチドを樹脂から切断し、一時的側鎖保護基を除去した。冷ジエチルエーテルでその粗製ペプチドを切断溶液から沈殿させた。その沈殿したペプチドを焼結ガラス漏斗上に収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、希酢酸中に溶解し、減圧下にて蒸発乾固させた。その残渣を酢酸に溶解し、凍結乾燥させた。ついで、その粗製ペプチドを精製し、前記のごとく特徴付けた。６．ＳＰＡアッセイアッセイは、合計アッセイ容量２００μｌ／ウェルを用いた９６−ウェルプレート（Wallac社製，カタログ番号1450−401，Turku，Finland）中に配置した。各データ点につき３回反応を行った。すべてのアッセイで用いた緩衝液は３５ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０、１０％のグリセリンであった。ビオチニル化ペプチドを、飽和未満のペプチドまたは過剰量のペプチドのいずれかを入れたストレプトアビジン−被覆ＳＰＡビーズ（Amersham Lif e Sciences社製，Arlington Heights，Illinois，カタログ番号＃ＲＰＮＱ０００６）へ結合させた。反応当たりに用いた４００μｇのＳＰＡビーズについて、４９ピコモルのビオチンを結合する能力があった(１２１ピコモルのビオチン／ｍｇビーズの結合能力を与える)。飽和未満の条件下では、ビーズと４０ピコモルのペプチドをアッセイプレート・ウェルに添加し、６００ｒｐｍにてTiterプレート．シェイカー（Lab−Line Instruments，Inc.社製，Melrose Park，Illinois ）上にて穏やかに振とうしつつ１時間インキュベートし、洗浄しなかった。過剰量のペプチドの条件下では、ビーズとペプチド(４００μｇのビーズ当たり８０ピコモルのペプチド)を、“結果およびディスカッション”で記載したごとく１ｍｇ／ｍｌのκ−カゼインを入れるかまたは入れないでバッチで混合し、回転させつつ１時間インキュベートし、緩衝液で３回洗浄し、ウェルに分注した。³Ｈ −ＪＡＫ２または³Ｈ−ＮＪＡＫ２および試験すべきいずれかの他のコンポーネントを添加し、その反応物を混合し、暗所下、室温にて１時間インキュベートした。ついで、そのプレートを、トリチウムに起因するシンチレーションを判読するように設定したMicroBeta（Wallac社製）上で判読した。７．ＥＬＩＳＡ法提唱したＪＡＫ２結合ドメインに対応するβ_cペプチド（表１）を逐次希釈し、ストレプトアビジン被覆９６−ウェルプレート(Boehringer Mannheim社製，In dianapolis，Indiana)に室温にて１６時間結合させ、ついでＰＢＳ中の１％ウシ胎仔血清で３７℃にてブロックした。ＪＡＫ２タンパク質をプレート上で逐次希釈し、室温にて１時間結合させた。プレートは、インキュベート間にＥＬＩＳＡ洗浄液（０.０４％のツイーン２０を入れたＰＢＳ）で洗浄した。検出は、抗− ＦＬＡＧ抗体（１０μｇ／ｍｌ、Kodak社製，New Haven，Connecticut）につづくペルオキシダーゼ・コンジュゲート抗−マウスＩｇ（１：５０００希釈、Boeh ringer Mannheim社製）および１ｍｇ／ｍｌの２,２’−アジノビス(３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸)(Sigma社製)、０.００３％のＨ₂Ｏ₂、２８ｍＭのクエン酸、４４ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄を介した。Ｂ．結果およびディスカッション１．ＳＰＡの最適化２つのＳＰＡを行って、１〜６と番号付けしたβ_cペプチド(表１)[配列番号：１１〜１６]の結合における³Ｈ−ＪＡＫ２および³Ｈ−ＮＪＡＫ２の活性を比較した。これらのＳＰＡにおいて、ビーズおよびペプチド（反応当たり４０ピコモル）を、“材料および方法”で記載したごとくプレートのウェル中で混合し、ィンキュベートした。³Ｈ−ＪＡＫ２または³Ｈ−ＮＪＡＫ２のいずれかをウェルに添加し、インキュベートした後にシグナルを測定した。その結果を図１２に示す。これらの結果は、両方の形態のＪＡＫ２が同一の活性プロフィールでペプチドに結合することを示している（すなわち；ペプチド４＞ペプチド３＞ペプチド５＞ペプチド６＞シグナルを全く供しなかったペプチド１および２）[各々、配列番号：１４，１３，１５，１６，１１および１２]。このことは、ＪＡＫ２のＮ −末端部分がβ_cに結合する領域を含むという結論を支持している。これらの反応において５ないし１０倍過剰量の非標識ＪＡＫ２を添加することによって、競合反応も行った。図１２に示す結果は、標識ＪＡＫ２の結合が５倍の非標識ＪＡＫ２によって顕著に競合し、標識ＮＪＡＫ２結合が１０倍の非標識ＪＡＫ２によってバックグラウンドにまでほぼ低下することも実証している。このことは、結合が競合し得ることを示しており、ペプチド結合を有するビーズがすべてのＪＡＫ２をただ非特異的に吸着しないことを立証している。ＳＰＡビーズを添加する前に１時間混合したペプチドと標識ＪＡＫ２を試験し、標識ＪＡＫ２を添加する前１時間、ビーズに対する結合ペプチドを比較した。 “材料および方法”で記載したごとく、対照反応を配置し、ビーズを添加する前に、ペプチドと標識ＪＡＫ２とを混合することによって試験反応を配置した。これらは、連続して混合することなく１時間インキュベートし、ついでビーズを添加し、混合し、標準配置についてのごとく１時間インキュベートした。結果を表１３に示す。混合したペプチドおよびＪＡＫ２はペプチド１、４および６[配列番号：１１、１４および１６]につき同一の活性プロフィールを最初は与えたが、より低い全体シグナルおよび対シグナル−ノイズ比を与えた。したがって、“ 材料および方法”に記載したプロトコールを標準として採用した。１のアッセイを行って、アッセイで用いることができるペプチドとＪＡＫ２との量を最小化させたが、なお良好なシグナルを得た。３種の異なる量のＪＡＫ２を変化する量のペプチドで力価測定した。結果を図１４に示す。アッセイにおけるＪＡＫ２の最終濃度が３２.５ｎＭから１６.２５ｎＭまで低下した場合、得られたシグナルは顕著に低下した。したがって、これらの条件下で用いることができるＪＡＫ２の最小量は反応当たり０.８６μｇまたは６.５ピコモルのＪＡＫ２である。それは、プレート当たり８２μgのＪＡＫ２であって、１０００プレートにつき８２ｍｇのＪＡＫ２である。したがって、このアッセイを用いて高処理量スクリーニングを行うために十分なＪＡＫ２の生成が実行可能である。しかしながら、κ−カゼインを後記のごとく用いる場合には、なおより少ないＪＡＫ２が必要である。４.５の対シグナル−ノイズ比を得るためには、このアッセイの条件下では反応当たり４０ピコモルのペプチド４(０.１７μｇ)で十分である。これは、κ−カゼインを用いることによって、さらに最適化することができる。最適化なしでは、４.５の対シグナル−ノイズ比を得るためにアッセイはプレート当たり１６μｇのペプチドまたは１０００プレート当たり１６ｍｇを必要とする。したがって、さらなる最適化なしに、このアッセイは、当該アッセイに必要であるペプチドおよびＪＡＫ２の予想量からの高処理量スクリーニングに適する。ＳＰＡにおけるブロッキング剤の使用を試験して、対シグナル−ノイズ比をさらに改善した。２つのＳＰＡを行って、κ−カゼイン含有または非含有のビーズ上のペプチドの量を最大化させる試験を行った。ペプチド１および６[配列番号：１１および１６]を用いるアッセイ全体を通してκ−カゼインを含ませた場合、非常に小さなシグナルしか得られなかったことも判明した(データは示さず)。したがって、ビーズに対する非特異的結合をブロックするκ−カゼインの能力を試験するために、“材料および方法”で記載したごとく、ビーズに過剰量のペプチドが結合する間にそれを添加し、アッセイでビーズを用いる前に洗い去った。これらの２つのアッセイの結果を図１５に示す。それらは、ペプチドの同一活性プロフィールを示し、このように用いたκ−カゼインがシグナルおよびバックグラウンドの両方を低下させることを立証している。ペプチド４[配列番号：１４] を用いてκ−カゼインを含まない場合の対シグナル−ノイズ比は１０であり、κ −カゼインを含む場合は３５である。したがって、κ−カゼインは対シグナル− ノイズ比を改善する。ペプチド４[配列番号：１４]を用いる潜在的ブロッキング剤としてＢＳＡも試験した。ＢＳＡを、０.１ｍｇ／ｍｌまたは０.５ｍｇ／ｍｌのぃずれかで、反応のすべてのステージに添加した。結果を図１６に示す。いずれの濃度のＢＳＡでも、対シグナル−ノイズ比は添加しない場合の４から５へと増加した。ＢＳＡはシグナルに対してわずかにプラスの効果を有していたが、バックグラウンドに対しては何ら効果を有していなかった。８.０のアッセイｐＨではＢＳＡはマイナスに帯電し、κ−カゼインは正味中性の電荷を有し、このことは、κ−カゼインがＳＰＡビーズ上の疎水性サイトをブロックすることによってバックグラウンドをブロックし得ることを示唆している。２．ＳＰＡにおいて認められた結合の特徴付け図１７のパネルＡは飽和未満のペプチド４[配列暗号：１４]と変化する濃度の標識ＪＡＫ２とを用いた結合曲線を示す。図は、ＪＡＫ２の増加に伴うシグナルの増加が急な曲線を描くことを示しており、このことは結合が非常に低い見かけＫｄで起きていることを示している。曲線は、ビーズ上に存在するペプチドの量と相関する約４０ピコモルのＪＡＫ２にて結合が飽和に達することも示している。飽和濃度未満のＪＡＫ２を用いたもう１つのアッセイを行った。そのアッセイの結果を図１７のパネルＢに示す。曲線は、ＪＡＫ２の量の増加に伴う結合の線状上昇を示す。それは、再度、結合性が非常に強力であることを示している。また、それは、５.５ｎＭもと少量のＪＡＫ２が存在するκ−カゼインを用いると１４の対シグナル−ノイズ比が得られたことも示している。したがって、前記したごとく、κ−カゼインを含まないよりも、κ−カゼインを含む場合の方がより少ないＪＡＫ２しか必要としない。その高い溶解性にもかかわらず、ＪＡＫ２はサイズ排除クロマトグラフィーによって測定されるごとき程度の凝集を示した(データは示さず)。より低度に凝集したかまたはモノマーＪＡＫ２からより高度に凝集したＪＡＫ２を超遠心によって分離することができるか否かを調べるために、規定濃度の新たに精製したＪＡＫ２の試料を“材料および方法”で記載したごとくエアヒュージ中で遠心した。試料を６時間にわたって７の異なる時点で採取して、上清相に残存するＪＡＫ２の量を評価した。可溶性相に残存するＪＡＫ２の判定は、表２に示すごとくＥＬＩＳＡによって確かめた。１６４,０００ｘｇにて１時間後に、元のＪＡＫ２の４０から５０％が検出され、この値はこの実験におけるさらなる５時間まで、比較的一定のままであった。これらのデータは、残りは顕著に低度の凝集状態であるが、試料の約半分がほぼ直ちに沈殿するのに十分な塊であることを示唆している。ピペット操作によってメニスカスの下側から上清を取出したため、分子量の決定はこの実験で確立できなかった。前記実験で生成した沈殿の量は確立されなかったが、ＥＬＩＳＡによって規定されたごとき５０％しか可溶性として残存していなかったため、残りの５０％が沈殿したと考えた。ＳＰＡを行って、超遠心１時間後の上清−対−元のＪＡＫ２溶液を試験して、最も高度に凝集した材料がＳＰＡアッセイの結果に影響する沈殿によってどのように最も高度に凝集した材料をどのように除去するかを調べた。異なる量の出発材料または上清のいずれかを用いて、非標識および標識ＪＡＫ２を混合し、それをＳＰＡビーズに結合したペプチド４[配列番号：１４]に添加することによって、標識ＪＡＫ２との結合について競合させた。シグナルにおける％低下を決定した；結果を図１８に示す。上清からのＪＡＫ２は出発材料よりもより低い程度で効果的に競合した。これらのデータは、より低度に凝集したＪＡＫ２がより凝集したＪＡＫ２よりもより高い見かけＫｄを有することを意味している。上清に残存していたより低度の凝集タンパク質が凝集当たりほとんどβ_c 結合サイトを有していなかったため、より低い見かけの親和性はどうも低いアビジティーから生じたようである。別法として、高度に凝集した形態のＪＡＫ２上の結合サイトがβ_cペプチドに対してより高いアフィニティーを有することも可能である。ＪＡＫ２凝集から生じる高いアビジティーに関連する問題点を回避するためには、凝集物をビオチニル化し、β_cペプチドをラジオアイソトープ標識して、シンチレーション隣接アッセイにおいて各コンポーネントの役割を逆転することができる。アッセイを行って、ＳＰＡ中に洗浄剤またはジチオスライトールが含まれるか否かが、ＪＡＫ２凝集物を破壊することによるシグナルに影響を有するかを試験した。低下したアビジティー効果に通じる、ビーズに対してペプチドを結合させる単−ＪＡＫ２基上の利用可能であろう結合サイトがほとんど存在しないであろうため、凝集の破壊がより弱いシグナルを生じるという仮定を想定した。図１９のパネルＡに示すごとく４種の洗浄剤を試験した。シグナルの上昇を生じる洗浄剤で見られた反対の効果、および、ブリジ３５での、その上のバックグラウンドにおける低下は、対シグナル−ノイズ比を改善しているが、おそらくはＪＡＫ２凝集を破壊していない。ＳＰＡを共に用いる生化学なしでは、洗浄剤で何が起きているかを判定したり、またはＪＡＫ２の凝集を破壊する洗浄剤または条件を探索するすることは不可能である。ブリジ３５および２の濃度のジチオスライトールを用いた第２のＳＰＡを図１９のパネルＢに示す。再度、ジチオスライトールの明らかなさななる効果なしに、シグナルは上昇し、バックグラウンドは低下した。ＪＡＫ２の結合について競合する過剰量のペプチド４[配列番号：１４]の能力を試験した。ビオチニル化ペプチド４は、溶液中のストレプトアビジンに結合して、ビーズに結合したペプチド４の条件を模倣した。１：１（ペプチド４：ストレプトアビジン）の比および４：１の比でそれを用いて、１のストレプトアビジン分子に対して複数のペプチドを有することがＪＡＫ２の結合およびそれ故の競合のより良好な仕事を行い得るか否かを調べた。図２０のパネルＡに示す結果は、最低限の、たぶん競合しか見られなかったことを示している。ストレプトアビジン単独を使用した場合には、結合したペプチド４[配列番号：１４]とストレプトアビジンよりもより大きな程度でシグナルを低下した。このことは、遊離ストレプトアビジンが幾分かのペプチド４[配列番号：１４]をビーズから引き離すことに起因し得る。ストレプトアビジンに結合しているか否かに関係なく、溶液中のペプチド４[配列番号：１４]は結合しているＪＡＫ２につきＳＰＡビーズ上のペプチド４[配列番号：１４]とほとんど競合しないいうのが結論である。これらの結果の解釈は、多くのペプチドが、溶液中のペプチドが模倣しない非常に強固な結合を生じるＪＡＫ２凝集によってビーズの表面に結合するというものである。４：１の比でストレプトアビジンに結合させたペプチド４[配列番号：１４]またはペプチド１[配列番号：１１]を用いてもう１つＳＰＡを行った。ペプチド１[ 配列番号：１１]に対してペプチド４[配列番号：１４]を比較することにおいて、本発明者らは、不活性ペプチドに対する活性ペプチドを比較している。結果を図２０のパネルＢに示す。これらの結果は、溶液中のペプチド４[配列番号：１４]が結合しているＪＡＫ２について実際に競合するが、それは非常に弱いことを示している。ストレプトアビジンに結合したペプチド１[配列番号：１１]でのシグナルにおける低下は、すべてのサイトがペプチド１によって占められていないであろうため、ビーズ上に存在した幾分かのペプチド４[配列番号：１４]に結合するストレプトアビジン上のサイトの利用可能性の結果のようである。再度、結論は、溶液中のペプチド４[配列番号：１４]はほとんどＪＡＫ２に結合しないということであり、このことは、ＪＡＫ２のモノマーがビーズ上のペプチド４[ 配列番号：１４]に結合しても、その結合は実際には弱いであろうことを意味している。アミノ酸４５８−５１７を含むβ_cの膜隣接領域、特に２個のプロリン（ＰＸＰ）ならびに最初のプロリンに対して−１および−５に存在する２個の疎水性残基が、ＪＡＫ２に対する受容体の結合に必須であることが示された(Raoによる19 95，Zhaoによる1995)。これは、ＪＡＫ２に結合する受容体間に保存されているアミノ酸を含むＢｏｘ１として知られている領域を含む(Tannerによる，1995，J iangによる1996)。ＳＰＡにおいては、ペプチド４[配列番号：１４]はペプチド３[配列番号：１３]よりも良好に結合する。このことは、アミノ酸４５１−４５７（文献記載のＢｏｘ１領域のアミノ酸Ｎ−末端）が結合しているＪＡＫ２に寄与し得ることを示している。ペプチド４[配列番号：１４]のＣ−末端のどのアミノ酸が結合について必須であるかを判定するために、ペプチド４[配列番号：１４]のカルボキシ末端からアミノ酸の増加する欠失を有する３種のペプチドを表１に示すごとく設計した。ＣＴＤ−３[配列番号：１７]においては、Ｂｏｘ１の２番目の保存プロリン(Tannerによる1995)はそのＣ−末端側の３個のさらなるアミノ酸と共に無傷である。ＣＴＤ−４[配列番号：１８]においては、その保存プロリンは欠失している。ペプチドＣＴＤ−５[配列番号：１９]においては、両方の保存プロリンが欠失している。これらのペプチドを用いたＳＰＡの結果を図２１に示す。ＣＴＤ−４[配列番号：１８]において僅かな低下が存在するようであるが、しかしながら、ＣＴＤ−５[配列番号::１９]はペプチド４[配列番号：１４] と同様に活性であった。このことは、保存プロリンはイン・ビボ(in vitro)のシグナル伝達において役割を果たしているかもしれないが、それらはイン・ビトロ (in vitro)におけるＪＡＫ２結合について必要でないことを示唆している。他の欠失または突然変異も、β_cにおける結合サイトをさらに規定するために助けとなり得る。３．ＥＬＩＳＡ結果ビオチニル化β_cペプチドをストレプトアビジン９６−ウェルプレート上に固定化し、ＪＡＫ２を結合させた場合、ＥＬＩＳＡアッセイが最良に働いた。β_c ペプチド−対−ＪＡＫ２の二重力価測定を行った(図２４)。ペプチド１[配列番号：１１]（図２４Ａ）およびペプチド２[配列番号：１２]（図２４Ｂ）は結合活性を与えなかったが、ペプチド３−６[配列番号：１３−１６]（図２４Ｃ−Ｆ）はプレート中のＪＡＫ２を捕捉した。０.４μＭのペプチドが各ウェル中のビオチン結合サイトの数を飽和させると算出されたため、ＪＡＫ２結合の量はこの量のペプチドを飽和させるであろうと予想した。このことはペプチド３および４ [配列番号：１３および１４]（図２４ＣおよびＤ）で見られたが、ペプチド５および６［配列番号：１５および１６］(図２４ＥおよびＦ)は飽和を示さなかった。したがって、ペプチド３および４[配列番号：１３および１４]がＥＬＩＳＡにおける使用に最適のようである。注目に値するのは、これらのペプチドがＳＰＡにおいても最も最適な２種であったということである。いずれのアッセイにおいても、少なくともＮ-末端の２９４アミノ酸を含有するヒトＪＡＫ２の全部または一部分をイー・コリ、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１）または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞）のごとき宿主細胞中で発現させ、ついで精製した。（米国特許第４,５６８,６４９号中で教示されているごとき）シンチレーション隣接アッセイについては、タンパク質を¹²⁵ Ｉまたは³Ｈのごときラジオアイソトープで標識する。ついで、ビオチンのごときアフィニティー・タグを、実施例７に記載したいずれかのＧＳＴ融合タンパク質または実施例８に記載したペプチドのごとき、ＪＡＫ２-結合ドメインを含むβ_cサブユニットの部分に結合させる。結合は、ストレプトアビジンで被覆したシンチラント-含有ビーズの存在下にてビオチニル化β_cサブユニットとラジオアイソトープ標識ＪＡＫ２とをインキュベートし、ついで適当な検出器でシンチレーションの量を定量することによって検出する。非特異的な結合は、アッセイにおいてＧＳＴ-β_c融合タンパク質をＧＳＴに置換えることによって定量化する。ＪＡＫ２／β_c結合を破壊する化合物の能力は、種々の化合物の存在または不存在下にて該アッセイを行い、シンチレーションにおける変化を測定することによって定量化することができる。別法として、ＪＡＫ２タンパク質をビオチニル化することができ、β_cタンパク質をこのアッセイの運転中にラジオアイソトープ標識することができる。サイズの異なる２種のタンパク質を使用する同様のアッセイは、蛍光偏光アッセイである。この場合においては、２つのタンパク質のうちの小さい方(例えば、β_cの１３アミノ酸)を蛍光分子で標識し、遥かに大きなタンパク質（例えば、ＪＡＫ２の２９４またはそれを超えるアミノ酸）とインキュベートする。より小さなタンパク質へのより大きなタンパク質の結合は、後者の回転の比率を変化させ、したがって、適当な波長で励起させた後に蛍光タグから放出される光の偏光を変化させる。偏光におけるこの変化は、適当な検出器で測定することができる。ＪＡＫ２／β_c結合を破壊する化合物の能力は、種々の化合物の存在または不存在下でアッセイを行い、蛍光偏光における変化を測定することによって定量化することができる。本開示全体を通して、別段指摘しない限り、制限酵素およびＤＮＡ−修飾酵素はGibcoBRL社,Gaithersburg,MDからのものであって、他のすべての試薬はSigma 社，St．Louis，MOからのものであった。前記明細書中に言及したすべての刊行物および特許は出典明示して本明細書の一部とみなす。本発明の記載した方法および系の種々の修飾物および変形物は、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を特異的な好ましい具体例と関連させて記載したが、特許請求する発明がかかる特異的な具体例に不当に制限されるべきでないことは理解されるべきである。実際には、分子生物学または関連分野における当業者に明らかである本発明を行うための前記様式の種々の変形は、後記請求の範囲の範囲内にあることを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．(ａ)候補化合物の存在下にて、[配列番号：５]に示すＪＡＫ２タンパク質の少なくともＮ−末端の２９４残基を含む第１分子と、[配列番号：３]に示すＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦ受容体のβ_cサブユニットの少なくとも１３個の膜−隣接細胞質アミノ酸を含む第２分子とを接触させ；ついで、 (ｂ)該第１分子と該第２分子との間で複合体が形成されるか否かを検出して、該候補化合物が該複合体の形成を阻害するか否かを判定することを含み、ここに該阻害が、該候補化合物が喘息を治療するために潜在的に有用であることの指標であることを特徴とする、喘息を治療または予防するために潜在的に有用な化合物をスクリーニングする方法。２．さらに、該接触工程の前に、該第２分子を蛍光分子で標識する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。３．該検出工程が、蛍光偏光における変化を測定することを含むことを特徴とする請求項２記載の方法。４．さらに、該接触工程の前に、該第１分子をラジオアイソトープで標識し、かつ、該第２分子をアフィニティー・タグで標識する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。５．該検出工程が：シンチラント−含有基体上で、該標識第１分子と該第２分子とをインキュベートすることを含むことを特徴とする請求項４記載の方法。６．さらに、該接触工程の前に、該第１分子をアフィニティー・タグで標識し、かつ、該第２分子をラジオアイソトープで標識する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。７．該検出工程が：シンチラント−含有基体上で、該標識第１分子と該第２分子とをインキュベートし；ついでシンチラントにおける変化を測定することを含むことを特徴とする請求項６記載の方法。８．さらに、該接触工程の前に、該第１分子を固体支持体に固定化する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。９．該検出工程が：該第２分子と該固定化第１分子とをインキュベートし；酵素結合イムノアブソーバントアッセイによって、該第２分子が該固定化第１分子に結合しているか否かを判定することを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。１０．さらに、該接触工程の前に、該第２分子を固体支持体に固定化する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。１１．該検出工程が：該第１分子と該固定化第２分子とをインキュベートし；酵素結合イムノアブソーバントアッセイによって、該第１分子が該固定化第２分子に結合しているか否かを判定することを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。