JP2001516763A - 迅速ｒｎａ単離方法 - Google Patents

迅速ｒｎａ単離方法

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JP2001516763A JP2000511773A JP2000511773A JP2001516763A JP 2001516763 A JP2001516763 A JP 2001516763A JP 2000511773 A JP2000511773 A JP 2000511773A JP 2000511773 A JP2000511773 A JP 2000511773A JP 2001516763 A JP2001516763 A JP 2001516763A
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Abstract

(57)【要約】 少なくとも＋２の原子価を有する遷移金属イオンを用いて試験試料から全ＲＮＡを単離し、さらに試験試料からｍＲＮＡを単離する迅速な方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は核酸の精製に関し、特にリボ核酸（ＲＮＡ）およびメッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）の精製に関する。
【０００２】 （背景技術） ＰＣＲやＬＣＲなどの核酸増幅反応が導入されて以来、血液や血清などの試験
試料から核酸を単離、もしくは精製する方法に対する関心が高まってきている。
様々な病気の検出に利用できるようにするために、これらの増幅反応の改良が行
われてきた。改良は病気の比較的迅速な検出を可能にする増幅方法に対して行わ
れてきたが、そうした方法によって増幅される核酸の調製は、増幅反応を基にし
たアッセイを用いて病気を検出する際に要する全体的な時間に関連して、制限因
子であり続けている。
【０００３】 多くの核酸精製方法が周知であり、ここ数年の間に実現されてきているが、こ
れらの方法は時間のかかるものであったり、精製を行う者にとって危険な試薬を
使用するものであったりする。たとえばＤＮＡおよびＲＮＡは、有機抽出法を用
いて、試験試料から容易に精製された状態で得られることが知られているが、そ
うした方法は何度かの抽出を必要とするために時間がかかる。さらに、有機溶媒
の使用は、適切な取り扱い注意に従わない限り、望ましくなく、危険でもある。
【０００４】 さらに最近では、カオトロピック試薬の存在下において、核酸が固体支持材料
、たとえばガラスに対して親和性を有することを利用した核酸の精製方法も知ら
れている。そのような方法によれば、細胞またはウィルス性物質を含む試験試料
をカオトロピック試薬および固体支持材料に接触させることができる。カオトロ
ピック試薬は試験試料中のあらゆる細胞を溶解して、細胞中に含まれる核酸を遊
離させ、該遊離された核酸が固体支持材料上に捕捉される。しかしながら、これ
らの方法によれば、ＲＮＡからＤＮＡを区別して精製するために、さらに別の工
程と試薬が必要になると思われる。
【０００５】 メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を他の核酸から選択的に精製するための１
つの方法としては、ｍＲＮＡの鎖上に典型的に見られるポリＡ尾部を利用するも
のがある。詳細には、ポリチミンオリゴヌクレオチドによって被覆された支持材
料を用いて、原試料中のあらゆるｍＲＮＡと結合させることにより、ｍＲＮＡを
ＤＮＡなどの他の核酸種から分離する。この目的のために、一般には「オリゴｄ
Ｔカラム」が用いられている。この種のカラムは効果的であるが、出発物質中に
は所望のｍＲＮＡに加えてＤＮＡおよびＲＮＡが存在するために、一般にかなり
粘性が高く、カラムを通過する物質量が相当に抑えられてしまう。ｍＲＮＡはよ
り多くの量の出発物質から精製することができるが、大量精製のための方法では
、通常、オリゴｄＴカラムによって全ＲＮＡからｍＲＮＡを分離する前に、ＤＮ
Ａから全ＲＮＡを単離するための予備的な有機抽出手順が行われる。有機溶媒の
使用による問題に加えて、ＤＮＡからＲＮＡから区別して分離する手順により、
ＲＮＡが不溶状態のままになってしまう。その結果、一旦全ＲＮＡをＤＮＡから
精製した後に、全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する前に該全ＲＮＡを再可溶化して
おかなければならない。したがって、有機溶媒の使用による制限に加えて、これ
らの手順は、次の精製を可能にするために追加の工程を必要とする。
【０００６】 したがって、ＤＮＡから全ＲＮＡを分離するとともに、他の核酸種からｍＲＮ
Ａを分離するための、安全で効率がよく、便利な方法であって、精製されうる出
発物質の量による制限を受けないような方法が必要とされる。
【０００７】 （発明の開示） 本発明は、試験試料中の他の核酸から全ＲＮＡを分離するための方法を提供し
、さらに、全ＲＮＡからｍＲＮＡを分離するための方法を提供する。本発明で提
供される方法は、核酸種を分離するために有機溶媒を使用する必要がなく、大量
の試料の使用が可能であるという利点を有する。したがって、本方法は従来の方
法に比べて実施がより安全かつ簡単である。
【０００８】 １つの実施形態に従えば、本発明の方法は、試験試料中に存在するであろう他
の核酸種から全ＲＮＡを精製または分離するための方法であって、（ａ）試験試
料を、少なくとも＋２の原子価を有する遷移金属イオンと接触させて、沈殿と上
清とを形成させる工程と、（ｂ）上清から沈殿を分離する工程と、（ｃ）上清を
回収して、全ＲＮＡの精製溶液を得る工程とを含んで構成される。核酸が、ウィ
ルス粒子や細胞などの生物体に含まれている場合には、本発明の方法は、試験試
料を遷移金属イオンに接触させる前、同時、あるいは接触させた後に、溶菌試薬
で処理する追加の工程を採用してもよい。
【０００９】 他の実施形態に従えば、ｍＲＮＡをは試験試料中の他の核酸種から分離または
精製することができる。本実施形態に従えば、全ＲＮＡを上記のようにして回収
し、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから分離する。全ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離は、技術
上周知の方法を用いて実施することができ、この目的にはオリゴｄＴマトリック
スが適している。
【００１０】 （発明を実施するための最良の形態） 上述のように、本発明は試験試料中の全核酸から全ＲＮＡを分離する方法、な
らびに精製された全ＲＮＡからｍＲＮＡを分離することによって試験試料からｍ
ＲＮＡを分離する方法を提供する。
【００１１】 本明細書中で用いる「全ＲＮＡ」という用語は、試験試料中に存在するであろ
うすべてのＲＮＡを意味する。換言すると、たとえばゲノムＲＮＡ、サブゲノム
ＲＮＡ断片、ｍＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ）などを含んでいてもよいリボヌクレオチド単量体から成る核酸配列であ
る。本明細書中で用いる「全核酸」は、試験試料中に含まれる全ＲＮＡ、ならび
に、たとえばゲノムＤＮＡ、サブゲノムＤＮＡ断片およびＤＮＡ増幅反応による
産物などを含むデオキシリボ核酸単量体から成る核酸配列を意図する。
【００１２】 「試験試料」は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含むあらゆるものを意味する。試験
試料は、たとえば血液、血清、血漿、脳髄液、ミルク、腹水液、滑液、腹膜液、
羊水、組織、発酵培地、細胞培養などのあらゆる生物起源に由来するものである
か、あるいは由来しうる。試験試料は、（ｉ）その起源から得たものを直接、あ
るいは（ｉｉ）試験試料の特性を改変する前処理を行ってから、のいずれかで使
用することができる。したがって試験試料に対して、使用の前に、たとえば血液
から血漿を調製する、細胞またはウィルス粒子を破砕する、核酸を増幅する、固
体物質から液体を調製する、粘液を希釈する、液体をろ過する、液体を蒸留する
、液体を濃縮するなどの前処理を行うことができる。
【００１３】 本発明は、＋２以上の原子価を有する遷移金属イオンが、試験試料中に存在す
るであろう混入物（たとえば全ＲＮＡ以外の物質）を効果的かつ選択的に沈殿さ
せるという発見を活用したものである。たとえば、試料溶液が血液などの生物起
源に由来するものである場合、上記の特性を有する遷移金属イオンは、細胞残骸
や他のタンパク質などの混入物を効果的に沈殿させる。さらに、そのような混入
物が沈殿する一方で、全ＲＮＡは溶液中に残存し、この沈殿物質から容易に分離
することができる。これにより全ＲＮＡが回収され、この溶液をたとえばオリゴ
ｄＴマトリックスなどに直接接触させることにより、有機溶媒を使用することな
く、あるいは全ＲＮＡをオリゴｄＴマトリックスに接触させる前に該全ＲＮＡを
再可溶化する必要もなく、ｍＲＮＡを上記溶液から精製することができる。
【００１４】 ＋２以上の原子価を有する遷移金属イオンは、伝統的に「遷移元素」と呼ばれ
ている元素であり、＋２以上の酸化状態を有している。これらの元素の多くが複
数の原子価を有するが、以下の元素の以下のイオン型が好ましい。コバルトイオ
ン（Ｃｏ＋２またはＣｏ＋３）、亜鉛イオン（Ｚｎ＋２）、銅イオン（Ｃｕ＋２ ）、バナジウムイオン（Ｖ＋２またはＶ＋３）、およびニッケルイオン（Ｎｉ＋ ２ ）。勿論、これらのイオンを、当該元素の塩の溶液であって、したがってこれ
らのイオンを含む溶液を用いて試験試料に接触させることができることは理解さ
れよう。たとえば、これらのイオンの硫酸塩および塩素塩は、容易に入手可能で
あり、また可溶化されて上記イオンの溶液を形成する。典型的には、これらのイ
オン濃度が５ｍＭより大きい溶液が用いられ、該イオン濃度は、好ましくは１０
ｍＭ〜５００ｍＭであり、より好ましくは１５ｍＭ〜１５０ｍＭである。
【００１５】 試験試料は、溶解された核酸だけを他の少量の混入物とともに含んでいてもよ
く、したがって比較的「清浄」なものであってもよいが、試験試料によっては、
核酸を遊離させるために必要な無傷の細胞またはウィルス粒子を含むこともある
。細胞およびウィルス粒子から核酸を遊離させるための様々な方法および試薬が
周知であり、それらは当業者による選択事項である。そのような試薬または方法
を本明細書中では「溶菌試薬」と呼ぶことにする。たとえば、細胞またはウィル
ス粒子を溶解するため化学的手法のいくつかは、細胞またはウィルス粒子を、カ
オトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）、洗剤または尿素などの変性剤を含む緩衝液
に接触させることを含むが、これに限定されることはない。そのような変性剤は
、約６〜８の中性ｐＨを有する緩衝化された溶液中における濃度が、通常、少な
くとも１Ｍであり、典型的には約２Ｍ〜約５Ｍである。さらに、約８．５より大
きいｐＨを有するアルカリ溶液は、様々な生物体の細胞壁またはウィルスコート
を破壊することが知られており、これもまた溶菌試薬として利用される。同様に
、約５未満のｐＨを有する酸性溶液もまた、細胞壁またはウィルスコートを破壊
することができるために、溶菌試薬として利用することができる。
【００１６】 化学的溶菌試薬を含む緩衝剤は、他の成分、たとえば細胞またはウィルス材料
から遊離された核酸に対する安定した環境を作り出すような成分を含んでいても
よい。そのような他の成分としては、酢酸リチウムや塩化ナトリウムなどの塩や
、Ｎ−ラウロイルサクロシンまたはトゥイーンなどの洗剤を含んでいてもよい。
【００１７】 あるいは、溶菌試薬は細胞またはウィルス粒子を溶解して核酸を遊離させる機
械的手段であってもよい。そのような手段は容易に利用することができ、ホモジ
ナイザー、超音波処理装置、またはビードビーターなどが含まれる。したがって
、本発明に従えば、試験試料は、該試験試料を＋２以上の原子価を有する遷移金
属イオンと接触させる前、同時、あるいは接触後に、核酸を含む内容物を変性さ
せるように処理することができる。
【００１８】 必要に応じて、核酸を含む内容物から核酸を遊離させ、試験試料を＋２以上の
原子価を有する遷移金属イオンと接触させて、ＤＮＡならびに必要ならば他の細
胞物質を沈殿させると、該沈殿から全ＲＮＡを分離することができる。上述のよ
うに、全ＲＮＡは溶液中に残存して上清の一部をなし、上清を回収することによ
り、全ＲＮＡの溶液が得られる。この全ＲＮＡの溶液をさらに精製すると、該全
ＲＮＡからｍＲＮＡを回収することができる。上清の分離および回収は、技術上
公知の様々な方法によって行うことができる。たとえば、上清の分離および回収
は、遠心分離、ろ過、あるいは単に沈殿物を沈殿させて、該沈殿から上清をピペ
ットで除去することにより実施することができる。
【００１９】 一旦、上清を分離し回収すると、この上清に対して更なる処理を行って、全Ｒ
ＮＡからｍＲＮＡを回収することができる。ｍＲＮＡは、固体支持材料に結合さ
せた特異的結合メンバーを用いて全ＲＮＡから回収することができる。本明細書
中で用いる「特異的結合メンバー」とは、異なる２つの分子から成る結合対であ
って、前記分子の一方が、たとえば化学的若しくは物理的手段を介して、前記分
子の他方に特異的に結合するような結合対のメンバーのことをいう。抗原と抗体
との特異的結合対に加えて、他の特異的結合対としては、アビジンとビオチン、
ハプテンとハプテンに対する特異的抗体、ならびに、相補的核酸配列またはその
アナログが含まれるが、これらに限定されることはない。本明細書中で用いる「
固体支持材料」とは、不溶であるか、あるいはその後の反応によって不溶化でき
るようなあらゆる材料のことをいう。固体支持材料は、ポリヌクレオチドを誘引
し、固定化する内在能力によって選択することができ、あるいは固体相にポリヌ
クレオチドを誘引し、固定化する能力を有する別の受容体を保持させることもで
きる。したがって、固体相はラテックス、プラスチック、被覆プラスチック、磁
性または非磁性の金属、ガラスまたはシリコン表面、あるいは試験管の表面、ミ
クロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、および他の当業者周知
の構成のものとすることができる。固体支持材料は、多孔性材料、たとえば天然
の高分子炭水化物、およびそれらの人工的に修飾、橋かけまたは置換された誘導
体、たとえば寒天、アガロース、橋かけアルギン酸などから成るものであっても
よい。これら全ての材料は、たとえば、フィルム、シート、プレート、ビーズ、
微粒子などの適切な形状および形態で使用することができる。
【００２０】 したがって、固体支持体に結合させた特異的結合メンバーを用いることにより
、特定のｍＲＮＡ配列に対して特異的な配列が支持材料に結合されているような
場合に、全ＲＮＡから直接的にｍＲＮＡを単離することができる。あるいは、特
定のｍＲＮＡ配列に特異的な配列は、固体支持材料上の抗体に特異的に結合する
抗原などの他の特異的結合メンバーによって誘導化することもできる。典型的に
は約１０〜５０の範囲のチミン残基の配列を含む、固定化されたオリゴヌクレオ
チドを有する固体支持材料が、全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する目的には非常に
適している。特に、そのようなチミンポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ上に一般的
に見られるアデニンポリヌクレオチドに対する親和性試薬として働く。そのよう
な被覆された固体支持体の一例としてはオリゴｄＴカラムが挙げられる。
【００２１】 所望の場合には、特異的結合メンバーの作用により固体支持材料に結合したｍ
ＲＮＡを、当業者に周知の様々な方法を用いて、たとえば固体支持材料のおかれ
ている環境の温度またはイオン強度を変えることにより、該支持材料から溶出さ
せることができる。さらなる代替方法として、ｍＲＮＡは当業者周知の様々な技
術を用いてオリゴｄＴカラムから溶出させることができるが、ｍＲＮＡは単に水
によって溶出させることもできる。
【００２２】 以下に実施例は本発明をさらに説明するためのものであって、本発明を限定す
ることを意図したものではない。
【００２３】 （実施例） 以下の実施例では、本発明の迅速かつ効率的な方法によるｍＲＮＡの単離につ
いて実証を行う。本方法は、当該技術分野における２つの公知の方法と比較した
。公知の方法の１つ目は、全血液中の細胞からｍＲＮＡを単離するために、ＲＮ
ＡＺｏｌを用いる方法であり、２つ目はオリゴｄＴによって被覆された微粒子を
用いる方法である。前立腺リンパ節癌（ＬＮＣａＰ）細胞系列を実験用試料とし
て選び、すべての方法から得られる前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ｍＲＮＡ産物を
検出するためにＲＴ／ＰＣＲを用いた。ＲＴ／ＰＣＲ法においては、ＰＳＡ遺伝
子のエキソン２および３からのＰＳＡｍＲＮＡに特異的なＤＮＡオリゴプライマ
ーおよびプローブを使用した。
【００２４】 実施例１ ＬＮＣａＰ細胞試料の調製 前立腺リンパ節癌（ＬＮＣａＰ）細胞は、転移性の細胞系列からのヒト腺癌細
胞である。ＬＮＣａＰ細胞系列は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンＡＴＣＣ＃１７４０−ＣＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）
から得た。ＬＮＣａＰ細胞試料は、まず組織培養培地をデカンテーションで除去
し、組織培養中の付着性ＬＮＣａｐ細胞から調製した。細胞を生理食塩水でリン
スした後、３７℃で３分間トリプシン処理し、組織培養フラスコから取り除いた
。追加の組織培養培地（１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０）を
フラスコに添加し、細胞を再懸濁して遠心管に注いだ。細胞を室温にて２００×
ｇで５分間遠心分離した。ペレットとして現れた細胞を、０．５％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有する冷ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁した後、予め冷ＲＰ
ＭＩ−１６４０／ＢＳＡで湿らせておいたナイロンフィルタに通した。細胞は、
セルダイン（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ）自動化血液分析器上で計数し、リン酸緩衝生理
食塩水（ＰＢＳ）で希釈して１×１０５細胞／ｍｌに調整した。
【００２５】 単位量の全血液を１０分間振盪して、均一になるまで混合し、１００ｍｌのア
リコート４つに分割した。ＬＮＣａＰ細胞をＰＢＳ中で系列的に希釈して、全血
液のアリコートに加え、最終濃度を全血液１ｍｌ当たりのＬＮＣａＰ細胞数が１
、１０または１００個になるようにした。１００ｍｌの全細胞アリコートのうち
の１つには、ネガティブ・コントロールとして用いるために、ＬＮＣａＰ細胞を
加えなかった。すべての１００ｍｌアリコートについて混合し、さらに５ｍｌの
アリコートに分割した。
【００２６】 実施例２ 本発明の方法を用いてのｍＲＮＡの単離 細胞は、実施例１で調製した全血液１ｍｌ当たりに０、１、１０および１００
個のＬＮＣａＰ細胞を含む５ｍｌアリコート、それぞれ２つずつから、各アリコ
ートを同量の４．５Ｍグアニジンイソチオシアネート、１Ｍ酢酸リチウム、およ
び２％Ｎ−ラウロイルサルコシンから成る２×溶菌緩衝液と混合し、ボルテック
ス・ミキサーで撹拌することにより溶解した。次に、１×溶菌緩衝液（２．２５
Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．５Ｍ酢酸リチウム、１％Ｎ−ラウロイル
サルコシン）から成り、細胞混入物を沈殿させるための１００ｍＭ塩化コバルト
（ＣｏＣｌ２）を含む、沈殿溶液１０ｍｌ（ここまでの全体積に等しい）を加え
、ボルテックス・ミキサーで撹拌し、３０分間沈殿させた。混合物を１，０００
×ｇで３０分間遠心分離して、細胞残骸を含む沈殿を除去した。
【００２７】 可溶化されたｍＲＮＡを含む上清を、プロメガ・バクマン（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｖａｃ−Ｍａｎ： Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）真空多岐管に
担持させた２０ｍｇのオリゴ−ｄＴセルロースカラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｔｙｐｅ Ｔ３， ＃２０００
３， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）にかけた。カラムを５ｍｌの１×溶菌緩衝液で
洗浄後、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）に溶解した１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム５ｍｌで洗浄した。次にカラムを新しい微量管に移し、遠心分離して残存液体
を除去した。カラムを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）中に溶解した１００
ｍＭ塩化ナトリウム２００μｌで２回洗浄した。カラムを新しい微量管に移し、
それぞれ７５μｌの３倍容の分子生物学グレードの水（全量２２５μｌ）で溶出
した。上記の手順はすべて室温で行った。
【００２８】 実施例３ ＲＮＡＺｏｌを用いたｍＲＮＡの単離 実施例１において調製した全血液１ｍｌ当たりに０、１、１０および１００個
のＬＮＣａＰ細胞を含む５ｍｌのアリコート、２つずつから、フィコール−ハイ
パック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）を用いて単離し、１０ｍｌのＰＢＳで
洗浄した。ベックマンＪ６遠心機において、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し
て、細胞をペレット化し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。再懸濁した細胞を微量
管に移し、５〜１０分間微量遠心を行うことにより、ペレット化させた。
【００２９】 ペレットを、製造業者の指示に従ってＲＮＡＺｏｌ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ， Ｉ
ｎｃ．， Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）に溶解し、以下の方法を用いてＲ
ＮＡを精製した。１００μｌの分子生物学グレードのクロロホルムを、１ｍｌの
ＲＮＡＺｏｌ混合液に加え、ボルテックス・ミキサーで５０秒間撹拌し、氷上に
５分間放置した。１５分間微量遠心分離した後、水相を除去し、新しい微量管に
移した。同量の冷イソプロパノールを加え、混合液をボルテックス・ミキサーで
１５秒間撹拌した後、−２０℃で一晩恒温放置してＲＮＡを沈殿させた。沈殿の
後、混合液を４℃にて１４，０００×ｇで３０分間微量遠心分離し、沈殿をペレ
ット化させた。ペレットに１ｍｌの冷７５％エタノールを加え、混合物をペレッ
トが浮遊するまでボルテックス・ミキサーで撹拌した後、４℃にて１４，０００
×ｇで１５分間微量遠心分離し、沈殿をペレット化させた。このペレットに、も
う一度１ｍｌ冷７５％エタノールを加え、混合物をボルテックス・ミキサーで撹
拌し、前回と同じようにして微量遠心分離した。デカンテーションおよび吸い取
りにより、微量管から余分な液体を除去した後、ペレットを３０分間風乾し、１
２μｌのＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。精製ＲＮＡは、２６０ｎｍおよび
吸光係数４０における吸光度の読み取り値を用いて、分光光度計によって定量し
た。試料は、ＲＮａｓｅを含まない水２５μｌ当たりに１μｇのＲＮＡが含まれ
るように希釈した。
【００３０】 実施例４ オリゴｄＴ微粒子を用いたｍＲＮＡの単離 実施例１において調製した、全血液１ｍｌ当たり０、１、１０および１００個
のＬＮＣａＰ細胞を含む５ｍｌのアリコート、２つずつから細胞を溶解した。細
胞の溶解は、各アリコートを溶解が起こるまで（約３０秒間）を同量の２×溶菌
溶液と混合することによって行った。この２×溶菌溶液は、２０ｍＭのＭＯＰＳ
（ｐＨ７．０）に溶解した４Ｍグアニジンイソチオシアナート、８ｍＭジチオス
レイトール、１％サルコシル、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭ塩化ナ
トリウムから成る。
【００３１】 それぞれの溶菌試料に、予め洗浄し、１×溶菌溶液（２Ｍグアニジンイソチオ
シアナート、４ｍＭジチオスレイトール、０．５％サルコシル、０．５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ塩化ナトリウムを１０ｍＭのＭＯＰＳ ｐＨ７．０
に溶解したもの）に再懸濁しておいたダイナル（Ｄｙｎａｌ）オリゴ（ｄＴ）２ ５ 磁性微粒子（Ｄｙｎａｌ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃６１０．０５， Ｏｓｌｏ
， Ｎｏｒｗａｙ）１２０μｌを加え、１５分間振盪することにより、ｍＲＮＡ
を単離した。試料を、ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心機において２，５００ｒｐｍで
５分間遠心分離した。ペレットとして得られた微粒子（ビーズ）を０．５ｍｌの
１×溶菌溶液に再懸濁することにより洗浄した。ダイナル磁性ラック（Ｄｙｎａ
ｌ ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃１９０．０２， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を用
いてビーズを捕捉し、洗浄液を吸引した。ビーズをさらに０．５ｍｌの１×溶菌
溶液で洗浄して捕捉し、洗浄液を吸引した。次に、ビーズを２００μｌの冷洗浄
液Ｂ（５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１
０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄は、ボルテックス・ミキ
サーで穏やかに撹拌して再懸濁し、磁性ラックを用いてビーズを捕捉し、洗浄液
を吸引するというやり方で繰り返し行った。ｍＲＮＡの結合したビーズは、２０
ｎｇ／ｍｌの濃度になるように水で希釈された１６Ｓおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの
冷溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， ｃａｔａｌｏｇｕｅ ＃
２０６９３８， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）２５μｌに再懸濁した。
【００３２】 実施例５ ＲＴ／ＰＣＲによるＰＳＡｍＲＮＡの検出 上記実施例２、３および４の３種の方法によって調製した４つのアリコートの
それぞれに含まれるＰＳＡ ｍＲＮＡの量は、ここで参照として援用する米国特
許出願番号０８／５１４，７０４（１９９５年８月１４日出願）に記載の標識プ
ローブを用いたＲＴ／ＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーショ
ンによって決定した。標的特異的プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオ
チド・ハイブリダイゼーションＰＣＲによって、ＰＳＡ遺伝子のエキソン２およ
び３からのｍＲＮＡ標的配列（配列番号：１）が検出されるように設計した。上
流プライマー（配列番号：２）は、ＰＳＡ遺伝子のエキソン２の中に見られるも
のであり、下流プライマー（配列番号：３）は、エキソン２の３’末端にハイブ
リダイズするヌクレオチドと、ＰＳＡ遺伝子のエキソン３からの隣接ｍＲＮＡ領
域にハイブリダイズするヌクレオチドとの２つのヌクレオチドを含む。検出プロ
ーブ（配列番号：４）は、ＰＳＡ遺伝子のエキソン２の中に見られ、増幅された
ＰＳＡ標的配列に対する内部ハイブリダイゼーションプローブとして設計したも
のである。
【００３３】 プライマー配列は、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成し、こ
こで参照として援用する米国特許第５，４２４，４１４号に記載された標準的な
アミドリン酸シアノエチルカップリング化学を用いて、その５’末端においてア
ダマンタンによるハプテン化を行った。プローブ配列も同様に、標準的なオリゴ
ヌクレオチド合成方法を用いて合成し、ここで参照として援用する米国特許第５
，４６４，７４６号に記載の標準的なアミドリン酸シアノエチルカップリング化
学を用いて、その３’末端および５’末端においてカルバゾールによるハプテン
化を行った。
【００３４】 上記の実施例２、３および４によって得られたＲＮＡ試料について、以下に示
すようにして、逆転写、ＰＣＲ増幅、ならびに、上記ＰＳＡプライマーおよびＰ
ＳＡ検出プローブを用いた検出を行った。全反応液量０．２ｍｌ中、組換え型サ
ーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメ
ラーゼを１反応あたり５ユニットの濃度で、最終濃度がそれぞれ０．１５ｍＭの
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ、ならびに最終濃度が０．２ｍＭ
のｄＵＴＰとともに使用した。全ての反応は、５０ｍＭビシン、９２ｍＭ酢酸カ
リウム、１９ｍＭ水酸化カリウム、および０．８６８Ｍグリコールからなる５×
ビシン緩衝液（ｐＨ８．２４）を最終濃度が１倍になるように使用して実施した
。それぞれの反応混合液におけるプライマーの濃度は１２５ｎＭ、プローブ濃度
は５ｎＭ、酢酸マンガンの最終濃度は２．５ｍＭとした。試験は２５μｌの試料
について２回ずつ行った。
【００３５】 反応混合液をまず最初に６８℃で６０分間インキュベートして、ＲＮＡを逆転
写させ、続いて、９４℃で２分間インキュベートし、９４℃で６０秒間／６６℃
で８０秒間のサイクルを４０サイクル、パーキンエルマー４８０サーマル・サイ
クラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ４８０ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）
において実施することにより、ＰＣＲ増幅を行った。反応混合液の熱サイクル終
了後、混合液を９７℃で５分間保持し、約２分間の間に１５℃まで温度を下げる
ことにより、プローブのオリゴハイブリダイゼーションを行った。プローブのハ
イブリダイゼーションの後、試料を試験するまでの間１５℃に保持し、最長でも
２４時間以内に試験を行った。
【００３６】 反応産物は、アボットＬＣｘ（登録商標）システム（アボット・ラボラトリー
ズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，
ＩＬ）より入手可）上で検出した。抗カルバゾール抗体によって被覆された微粒
子の懸濁液、および抗アダマンタン抗体／アルカリホスファターゼ結合体（これ
ら全てはアボット・ラボラトリーズより市販されている）をＬＣｘ（登録商標）
と共に使用して、反応産物を捕捉し検出した。本実験の結果（数／秒／秒；ｃ／
ｓ／ｓ）を表１に示す。使用した様々な方法によるＬＮＣａＰからのＰＳＡｍＲ
ＮＡの検出結果についても示されている。
【００３７】
【表１】
【００３８】 本発明の方法は、１ＬＮＣａＰ細胞／ｍｌの濃度で最もＬＣｘ（登録商標）速
度が大きかったことから、３つの方法の中で最もＰＳＡのｍＲＮＡの検出に対す
る感受性が高いことが証明された。本方法は、処理する試料の量が最も少なくて
済むとともに、迅速に実施することができる。すなわち、本発明の方法によれば
ｍＲＮＡが約９０分以内に単離されたが、ＲＮＡＺｏｌ方法（実施例３）では２
日を要し、オリゴｄＴ微粒子法（実施例４）では終了までに約２時間を要した。
【００３９】 本発明は、特定の実施形態を参照して詳細に説明してきたが、そのような実施
形態に対して、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りにおいて様々な変更お
よび修正を行ってもよいことは、当業者によって明らかであろう。
【配列表】

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＲＮＡの精製方法において、 （ａ）試験試料を少なくとも＋２の原子価を有する遷移金属イオンと接触させ
    て、沈殿および上清を形成させる工程と、 （ｂ）沈殿を上清から分離する工程と、 （ｃ）上清を回収して、全ＲＮＡの精製溶液を得る工程と、 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 前記全ＲＮＡからｍＲＮＡを分離する工程をさらに含むこと
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記分離工程は、前記上清をオリゴｄＴマトリックスに接触
    させることを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記分離工程は、前記上清を固体相に結合させた特異的結合
    メンバーに接触させることを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記特異的結合メンバーは、特定のｍＲＮＡ配列に特異的な
    核酸配列、またはそのアナログであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記２価の金属イオンは、Ｃｏ＋３、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、
    Ｃｕ＋２、Ｖ＋２、およびＮｉ＋２からなる群より選択されることを特徴とする
    請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記２価の金属イオンは、５ｍＭより高濃度であることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 工程（ａ）に先だって、あるいは同時に、前記試験試料を溶
    菌試薬と接触させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記溶菌試薬は、カオトロピック試薬、塩および洗剤を含む
    ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
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