CN115197940A - 使用铜-钛氧化物纯化核酸 - Google Patents

使用铜-钛氧化物纯化核酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用铜‑钛氧化物纯化核酸。本公开内容涉及纯化核酸的系统和方法。特别是，本公开内容涉及使用金属或金属氧化物组合物纯化核酸的系统和方法。

Description

使用铜-钛氧化物纯化核酸
本申请是申请日为2016年7月13日的中国专利申请201680053407.8“使用铜-钛氧化物纯化核酸”的分案申请。
相关申请的交叉参照
本申请要求2015年7月14日提交的美国临时申请系列号62/192,444的优先权，其全部内容通过引用结合到本文中。
技术领域
本公开内容涉及用于纯化核酸的系统和方法。特别是，本公开内容涉及使用金属或金属氧化物组合物纯化核酸的系统和方法。
背景技术
在细胞中发现的核酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸且可以是基因组DNA、染色体外DNA (如质粒和游离基因)、线粒体DNA、信使RNA、miRNA和转移RNA。核酸对宿主而言也可能是外源的，并作为病原体，如细菌、病毒、真菌或单细胞生物和感染性多细胞生物(寄生虫)污染细胞。最近，核酸存在的检测和分析对于鉴定单核苷酸多态性(SNP)、染色体重排、外源基因的插入和核酸甲基化状态的改变已经变得重要。这些包括感染性病毒例如HIV和其它逆转录病毒，跳跃基因例如转座子，和来自含有外来基因的重组工程改造的生物，例如Roundup Ready植物的核酸的鉴定。
核酸的分析具有一系列广泛的应用。例如，外来物质的存在可被用作一种医学诊断工具。癌组织的遗传组成的鉴定也可被用作一种医学诊断工具，证实组织是癌性的，和测定癌组织的侵袭性质。在基因表达中的染色体重排、SNP和异常变化可被用作具体的疾病状态的医学诊断。此外，遗传信息可被用来确定特定药物的有效性，称为药物基因组学的领域。
虽然许多核酸纯化程序是熟知的并且多年来一直存在，但这些程序可能是耗时的并且可能使用对执行纯化的那些人存在危险的试剂。例如，早已知道DNA可采用有机提取程序，容易地从试验样本以纯化的形式获得，但这样的程序可能需要数次提取，因而可能是耗时的。此外，一些有机溶剂的使用如果不采取适当的预防措施，则是不可取的和危险的。
因此，对分离制备用于分析的无细胞核酸的核酸的高效、有效和方便的方法，存在需要。
发明内容
本公开内容涉及纯化核酸的系统和方法。特别是，本公开内容涉及使用金属或金属氧化物组合物纯化核酸的系统和方法。
例如，在一些实施方案中，本公开内容提供一种从生物样本捕获DNA和/或RNA的方法，其包括：a) 使样本与包含金属或金属氧化物或用金属或金属氧化物涂布的颗粒和/或固体载体接触，以使样本中的DNA和/或RNA结合颗粒或固体载体；b) 洗涤颗粒或固体载体以除去污染物；和c) 从颗粒或固体载体洗脱DNA和/或RNA。在一些实施方案中，金属氧化物是CuTi。本公开内容不限于特定量的铜和钛。在一些实施方案中，CuTi以约2:1 Cu:Ti (例如，3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等)的比例存在。在一些实施方案中，金属或金属氧化物是AlTi、CaTi、CoTi、Fe2Ti、Fe3Ti、MgTi、MnTi、NiTi、SnTi、ZnTi、Fe2O3、Fe3O4、Mg、Mn、Sn、Ti或Zn (例如，无水或水合形式)。在一些实施方案中，颗粒的直径是0.3-2 µm (例如，0.5 µm、1.0 µm、1.5 µm、2.0 µm、5.0 µm、10.0 µm、20.0 µm、30.0 µm、40.0 µm、50.0 µm等)。在一些实施方案中，颗粒或固体表面是有磁性的(例如，顺磁性的，或铁磁性的) (如铁)、金属的、无机固体(例如，二氧化硅)、聚合物或其组合。在一些实施方案中，固体表面或颗粒具有平板、针状、立方形、管状、纤维状、柱状或无定形的形状。在一些实施方案中，颗粒优先地结合DNA(如单链或双链DNA)或RNA，这取决于金属或金属氧化物。在一些实施方案中，该方法还包括从颗粒洗脱DNA和/或RNA的步骤。在一些实施方案中，洗脱包括洗脱缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含0.5-20 mM (如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mM)浓度的磷酸盐(例如，无机磷酸盐或有机磷酸盐)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的浓度高于10 mM，在样本已经洗脱后被稀释至较低的浓度。在一些实施方案中，洗脱缓冲液的浓度高于10 mM，小的体积被用于测定以防止抑制作用。在一些实施方案中，RNA和/或DNA是病毒的、真核生物的或原核生物的RNA和/或DNA (例如，来自病原体)。在一些实施方案中，颗粒基本上不结合DNA。
在一些实施方案中，该方法还包括测定存在于样本中的RNA的身份和/或量(例如，使用一种或多种选自例如，扩增、杂交或测序的检测方法)的步骤。
进一步的实施方案提供系统和/或试剂盒，其包含：a) 包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒和/或固体载体；和b) 洗脱缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种试剂，其选自，例如，一种或多种核酸引物和一种或多种核酸探针、对照品、用法说明书、缓冲液(例如，结合和/或洗涤缓冲液)等。
另外的实施方案提供一种从生物样本捕获RNA的方法，其包括：a) 使样本与包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒和/或固体载体接触，以使样本中的RNA (而不是样本中的DNA)结合颗粒；b) 洗涤颗粒以除去污染物；和c) 从颗粒洗脱RNA。在一些实施方案中，颗粒结合样本中的少于20% (例如，少于19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的DNA。在一些实施方案中，DNA是基因组的、细菌的和/或病毒的DNA。
进一步的实施方案提供本文描述的试剂盒或颗粒在纯化RNA中的用途。
另外的实施方案在本文中描述。
附图说明
图1A-D显示通过CuTi颗粒的RNA结合的统计学分析。
图2A-G显示来自通过CuTi颗粒的RNA结合的信号。
图3A-D显示通过Cu和CuTi颗粒的RNA结合。
图4A-D显示来自通过CuTi颗粒的RNA结合的信号。
图5A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图6A-D显示使用不同磷酸盐浓度的缓冲液，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图7A-D显示使用不同磷酸盐浓度的缓冲液，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图8A-D显示使用不同磷酸盐浓度的缓冲液，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图9A-D显示使用不同磷酸盐浓度的缓冲液和Cu:Ti的比例，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图10A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图11A-D显示用不同的Cu:Ti比例，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图12A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图13A-D显示用不同的Cu:Ti比例，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图14A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图15A-D显示用不同尺寸的颗粒，RNA结合于CuTi涂布的颗粒的单向分析的结果。
图16A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图17A-D显示使用不同磷酸盐浓度的缓冲液，从CuTi涂布的颗粒洗脱RNA的单向分析的结果。
图18A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图19A-D显示RNA和DNA与CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒结合的比较。
图20A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图21A-D显示RNA和病毒DNA与CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒结合的比较。
图22显示与二氧化硅颗粒比较，RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒的回收率。
图23A-B显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图24A-B显示RNA和基因组DNA与CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒的结合的比较。
图25显示与二氧化硅颗粒比较，RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒的回收率。
图26A-B显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图27显示RNA与CuTi涂布的颗粒的结合。
图28显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图29显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图30显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图31显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图32A-B显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图33显示RNA和DNA从CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒洗脱的比较。
图34A-B显示RNA和DNA与CuTi涂布的颗粒、FeO3颗粒和二氧化硅颗粒的结合和从中洗脱的比较。
图35显示用Fe2O3、CuTi和二氧化硅分离HCV。
图36显示用CuTi颗粒分离RNA和DNA。
图37A-F显示从CuTi和二氧化硅分离HBV DNA。
图38A-I显示使用不同的裂解缓冲液条件，从CuTi分离HIV RNA。
图39A-F显示对于不同的金属颗粒的HIV结合数据。
图40A-F显示对于不同的金属颗粒的HBV结合数据。
图41显示用金属颗粒的HIV和HBV靶标的回收率。
图42A-F显示对于不同的金属颗粒的HIV结合数据。
图43A-F显示对于不同的金属颗粒的HBV结合数据。
图44显示通过颗粒上的金属氧化物和金属氧化物-钛氧化物组合的涂层的DNA和RNA结合。
详细描述
本公开内容涉及纯化核酸的系统和方法。特别是，本公开内容涉及使用金属或金属氧化物组合物纯化核酸的系统和方法。
定义
为了便于本技术的理解，一些术语和短语在下文定义。另外的定义在整个详细描述中提出。
如本文所用的，“a”或“an”或“the”可意指一个或超过一个。例如，“a”部件可意指一个部件或多个部件。
"血源性微生物"打算涵盖可在血液中发现的任何微生物。血源性微生物的实例包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。
如本文所用的，术语"核酸分子"指任何含有核酸的分子，包括但不限于，DNA或RNA。该术语涵盖包含DNA和RNA的任何已知的碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于，4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙烷基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基2硫尿嘧啶、5羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6异戊烯基腺嘌呤、1甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1甲基鸟嘌呤、1甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2甲基腺嘌呤、2甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5甲基胞嘧啶、N6甲基腺嘌呤、7甲基鸟嘌呤、5甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基2硫尿嘧啶、βD甘露糖基queosine、5'甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5甲氧基尿嘧啶、2甲基硫代N6异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶5氧基乙酸甲酯、尿嘧啶5氧基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶5氧基乙酸甲酯、尿嘧啶5氧基乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6二氨基嘌呤。
术语"基因"指包含为生产多肽、前体或RNA (例如，rRNA、tRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可通过全长编码序列或通过编码序列的任何部分编码，只要全长或片段的所需活性或功能特性(例如，酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)被保留。该术语还涵盖结构基因的编码区和在5'和3'两端上位于编码区邻近(任何一端上约1kb或更长的距离)的序列，以使该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非-翻译序列。位于编码区的3'或下游并存在于mRNA上的序列被称为3'非-翻译序列。术语"基因"涵盖基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆含有编码区，其被称为"内含子"或"间插区"或"间插序列"的非-编码序列间断。内含子为被转录为核RNA (hnRNA)的基因片段；内含子可含有调节元件，例如增强子。内含子从核或初级转录物除去或"拼接"；因此内含子在信使RNA (mRNA)转录物中不存在。mRNA在翻译期间发挥功能，以规定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
术语"引物"指寡核苷酸，无论是在纯化的限制性消化物中天然存在的还是合成产生的，其当置于其中与核酸链互补的引物延伸产物的合成被诱导的条件下时(即，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下和在合适的温度和pH下)，能够用作合成的起始点。为最大扩增效率，引物优选为单链，但也可供选择地是双链。如果是双链，引物首先被处理以将其链分开，然后用来制备延伸产物。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下，引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
在核酸的上下文中的术语"扩增(amplifying或amplification)"指多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，通常从少量的多核苷酸(例如，少至单个多核苷酸分子)开始，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增涵盖各种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)期间，从目标或模板DNA分子的一个或几个拷贝生成多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增并不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录(RT)-PCR，从样本中的有限量的RNA生成多个cDNA分子是扩增的一种形式。而且，在转录过程中，从单个DNA分子生成多个RNA分子也是扩增的一种形式。
如本文所用的，术语“颗粒”指不溶于在核酸纯化或分离中使用的水性溶液的基底或其它固体材料。例如，在一些实施方案中，颗粒是在核酸纯化和分离中使用的基底。实例包括，但不限于，珠、球或其它形状的颗粒。在一些实施方案中，颗粒用提高核酸结合的材料(例如，CuTi化合物)涂布或官能化。
如本文所用的，术语“受试者”和“患者”指任何动物，例如狗、猫、鸟、家畜，和特别是哺乳动物，且优选人。
如本文所用的，术语“样本”以其最广泛的意义使用。在某种意义上，其意指包括从任何来源，包括生物和环境来源获得的代表性部分或培养物。生物样本可从动物(包括人)获得并涵盖液体、固体、组织和气体。生物样本包括血液产物，例如血浆、血清等。在一些实施方案中，样本包含细胞(例如，肿瘤细胞)或组织(例如，肿瘤或活检组织)或从这样的细胞或组织分离的核酸(例如，DNA或RNA)。环境样本包括环境材料例如表面物质、土壤、泥浆、淤泥、生物膜、水和工业样本。然而，这样的实例不应视为限制可适用于本公开内容的样本类型。
如本文所用的，术语“基本上结合”当提及基本上不结合DNA的颗粒时，指以低水平(例如，相对于由颗粒结合的RNA的水平)结合DNA的颗粒。在一些实施方案中，基本上不结合DNA的颗粒具有对于RNA比对DNA更高的亲和力。例如，在一些实施方案中，颗粒结合的DNA是RNA的不到30%、25%、20%、15%、10%或5%。在一些实施方案中，相对于RNA，颗粒具有对于DNA降低的亲和力(例如，降低20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)。
技术实施方案
虽然本公开内容在此涉及某些示例性实施方案，但应该理解这些实施方案是通过实例的方式，而不是通过限制的方式提出。
本公开内容的实施方案提供用于纯化RNA的金属(例如，CuTi或其它Ti颗粒)。例如，在一些实施方案中，颗粒被用于捕获存在于生物样本中的RNA (例如，来自微生物)。在一些实施方案中，RNA的存在然后使用合适的方法在生物样本中检测(例如，确定微生物(例如，病毒靶标)的存在、不存在或量)。
本文描述的实施方案表明，CuTi颗粒及其它方法捕获RNA，但与其它方法一样不捕获DNA。这意味着CuTi颗粒可选择性地捕获RNA。这例如在RNA病毒的测量方法中是重要的。在一些实施方案中，捕获DNA是不可取的，因为在提取中前-病毒DNA的存在可能给出病毒颗粒量的不精确的测定。
I. 捕获
本公开内容的实施方案提供选择性地捕获DNA或RNA的组合物和方法。在一些实施方案中，本公开内容的组合物和方法利用包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒和/或固体载体(见例如，美国专利6,936,414；通过引用以其整体结合到本文中)。本公开内容不限于特定的金属氧化物。在一些实施方案中，金属氧化物是铜钛氧化物。在一些实施方案中，CuTi以约2:1 Cu:Ti (例如，3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等)的比例存在。
在一些实施方案中，金属或金属氧化物是AlTi、CaTi、CoTi、Fe2Ti、Fe3Ti、MgTi、MnTi、NiTi、SnTi、ZnTi、Fe2O3、Fe3O4、Mg、Mn、Sn、Ti或Zn (例如，无水或水合形式)。
在一些实施方案中，颗粒的直径是0.5-50 µm (例如，0.5 µm、1.0 µm、1.5 µm、2.0µm、5.0 µm、10.0 µm、20.0 µm、30.0 µm、40.0 µm、50.0 µm等)。在一些实施方案中，颗粒和/或固体表面包含有机聚合物例如聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物或聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯，和这些材料的共聚物。在一些实施方案中，颗粒是多糖，特别是水凝胶例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖(Sephadex)、Sephacryl、壳聚糖、无机材料例如如玻璃或其它的金属氧化物和类金属氧化物(特别是式MeO的氧化物，其中Me选自例如，Al、Ti、Zr、Si、B，特别是Al2O3、TiO2、二氧化硅和氧化硼)或金属表面，如金。
在一些实施方案中，颗粒是有磁性的(例如，顺磁性的、亚铁磁性的、铁磁性的或超顺磁性的)。
在一些实施方案中，颗粒和/或固体表面可具有平板、针状、立方形、管状、纤维状、柱状或无定形的形状，虽然其它几何形状被特别地考虑。
在一些实施方案中，市售可获得的颗粒(例如，从ISK Magnetics,Valparaiso,Ind；Qiagen, Venlo，The Netherlands；Promega Corporation, Madison, WI；LifeTechnologies, Carlsbad, CA；Ademtech, NY, NY，和Sperotech, Lake Forest, IL获得)。
在一些实施方案中，RNA捕获包括使生物样本(例如，血液、血液产品、细胞、组织、尿、精液、唾液等)与金属氧化物颗粒接触的步骤。在一些实施方案中，样本在捕获之前被处理(例如，细胞溶解、纯化等)。在一些实施方案中，样本不被处理。
在一些实施方案中，本文描述的颗粒具有基本上不结合DNA (例如，基因组的、病毒的和/或细菌的DNA)或基本上不结合RNA的优点。例如在一些实施方案中，颗粒结合样本中少于20% (例如，少于19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)的DNA或RNA。
在DNA或RNA结合于颗粒后，洗涤颗粒以除去样本的未结合的组分(例如，使用洗涤缓冲液)。在一些实施方案中，利用市售可获得的缓冲液(例如，可从Qiagen, Venlo，TheNetherlands; Promega Corporation, Madison, WI；和Abbott, Abbott Park, IL获得)。在一些实施方案中，颗粒然后从样本分离(例如，使用磁体、离心或其它合适的技术，例如由上述商业公司描述的那些方法)。
在一些实施方案中，RNA和/或DNA从颗粒或固体载体洗脱(例如，使用洗脱缓冲液)。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含1-10 mM (如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mM)的浓度的磷酸盐(例如，无机磷酸盐或有机磷酸盐)。在一些实施方案中，选择金属或金属氧化物和/或磷酸盐浓度以优先结合和/或洗脱DNA或RNA (见例如，以下实施例10)。
在一些实施方案中，本公开内容提供用于捕获和纯化DNA和/或RNA的试剂盒和系统。在一些实施方案中，试剂盒和系统包含本文描述的颗粒、对照品、缓冲液、用法说明书、固体载体、分离组件(例如，磁体)等。在一些实施方案中，试剂盒和系统还包含用于捕获的RNA的下游分析的试剂(例如，用于执行下文描述的检测分析的试剂)。
在一些实施方案中，捕获的DNA或RNA经受进一步的分析，以确定DNA或RNA的身份和/或量(例如，使用一种或多种下述的检测方法)。在一些实施方案中，RNA是来自病原体病毒(例如，小麦黄花叶病毒(bymoviruses)、豇豆花叶病毒(comoviruses)、线虫传多面体病毒(nepoviruses)、诺达病毒(nodaviruses)、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)、马铃薯Y病毒(potyviruses)、南方菜豆花病毒(sobemoviruses)、黄化病毒(luteoviruses) (甜菜西黄病毒和马铃薯卷叶病毒)、微小核糖酸病毒样组(picorna like group)(Picornavirata)、香石竹斑驳病毒(carmoviruses)、香石竹病毒(dianthoviruses)、黄病毒(flaviviruses)、瘟病毒(pestiviruses)、番茄丛矮病毒(tombusviruses)、单链RNA噬菌体、丙型肝炎病毒和黄化病毒亚组(大麦黄矮病毒)—黄病毒样组(flavi like group)(Flavivirata)、甲病毒(alphaviruses)、石竹隐潜病毒(carlaviruses)、真菌传杆状病毒(furoviruses)、大麦病毒(hordeiviruses)、马铃薯X病毒(potexviruses)、风疹病毒(rubiviruses)、烟草脆裂病毒(tobraviruses)、雀麦病毒(tricornaviruses)、芜菁黄花叶病毒(tymoviruses)、苹果萎黄叶斑病病毒(apple chlorotic leaf spot virus)、甜菜黄化病毒(beet yellows virus)和戊型肝炎病毒—甲病毒样组(alpha like group)(Rubivirata)、双RNA病毒科(family Birnaviridae)、产黄青霉病毒科(familyChrysoviridae)、囊噬菌体科(family Cystoviridae)、内源核糖核酸病毒科(familyEndornaviridae)、减毒病毒科(family Hypoviridae)、巨大双分核糖核酸病毒科(familyMegabirnaviridae)、双分病毒科(family Partitiviridae)、小双节病毒科(familyPicobirnaviridae)、呼肠病毒科(family Reoviridae)—包括轮状病毒、全病毒科(familyTotiviridae)、灰葡萄孢菌RNA病毒1 (Botrytis porri RNA virus 1)、甜菜曲顶病毒1(Circulifer tenellus virus 1)、瓜类黄化相关病毒(Cucurbit yellows associatedvirus)、核盘菌衰退相关病毒(Sclerotinia sclerotiorum debilitation-associatedvirus)、三角苜猜跳虫病毒1 (Spissistilus festinus virus 1)、尼多病毒目(orderNidovirales)、动脉炎病毒科(family Arteriviridae)、冠状病毒科(familyCoronaviridae)—包括冠状病毒、SARS、海洋病毒科(family Mesoniviridae)、杆状套病毒科(family Roniviridae)、微小核糖核酸病毒目(order Picornavirales)、双顺反子病毒科(family Dicistroviridae)、传染性软化病毒科(family Iflaviridae)、海洋RNA病毒科(family Marnaviridae)、微小核糖核酸病毒科(family Picornaviridae)—包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒(普通感冒病毒)、甲型肝炎病毒，伴生豇豆病毒科(family Secoviridae)包括豇豆花叶病毒亚科(subfamily Comovirinae)、硅藻微小RNA病毒属(genusBacillariornavirus)、Labyrnavirus属(genus Labyrnavirus)、芜菁黄花叶病毒目(orderTymovirales)、甲型线形病毒科(family Alphaflexiviridae)、乙型线形病毒科(familyBetaflexiviridae)、丙型线形病毒科(family Gammaflexiviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(family Tymoviridae)、Alphatetraviridae科、Alvernaviridae科、星状病毒科(familyAstroviridae)、杆状RNA病毒科(family Barnaviridae)、雀麦花叶病毒科(familyBromoviridae)、杯状病毒科(family Caliciviridae)—包括诺瓦克病毒(Norwalkvirus)、卡尔莫四病毒科(family Carmotetraviridae)、长线形病毒科(familyClosteroviridae)、黄病毒科(family Flaviviridae)—包括黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒、光滑病毒科(family Leviviridae)，黄症病毒科(familyLuteoviridae)—包括大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus)，裸露核糖核酸病毒科(family Narnaviridae)、野田村病毒科(family Nodaviridae)、Permutotetraviridae科、马铃薯Y病毒科(family Potyviridae)，披膜病毒科(family Togaviridae)—包括风疹病毒，罗斯河病毒(Ross River virus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)，番茄丛矮病毒科(family Tombusviridae)、帚状病毒科(familyVirgaviridae)、甜菜坏死黄脉病毒属(genus Benyvirus)、Blunervirus属、悬钩子病毒属(genus Cilevirus)，肝炎病毒属(genus Hepevirus)—包括戊型肝炎病毒，Higrevirus属、悬钩子病毒属(genus Idaeovirus)、柑橘粗糙病毒属(genus Negevirus)、欧尔密病毒属(genus Ourmiavirus)、品红潜隐病毒属(genus Polemovirus)、南方菜豆花叶病毒属(genus Sobemovirus)、幽影病毒属(genus Umbravirus)、豌豆蚜病毒(Acyrthosiphonpisum virus)、蓝莓坏死环斑病毒(Blueberry necrotic ring blotch virus)、葡萄孢病毒F (Botrytis virus F)、犬微小双顺反子病毒(Canine picodicistrovirus)、蜜蜂慢性麻痹伴随卫星病毒(Chronic bee paralysis associated satellite virus)、极小病毒(Extra small virus)、环状异甲藻RNA病毒(Heterocapsa circularisquama RNA virus)、海藻扁蝇病毒(Kelp fly virus)、Le Blanc病毒(Le Blanc virus)、向日葵霜霉病病毒(Plasmopara halstedii virus)、奥赛病毒(Orsay virus)、白纹羽病病毒1 (Rosellinianecatrix fusarivirus 1)、桑特伊病毒(Santeuil virus)、红火蚁病毒2 (Solenopsisinvicta virus 2)、红火蚁病毒3 (Solenopsis invicta virus 3)、单负链病毒目(orderMononegavirales)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)—博尔纳病病毒(Borna diseasevirus)，丝状病毒科(family Filoviridae)—包括埃博拉病毒、马尔堡病毒，副粘病毒科(family Paramyxoviridae)—包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、RSV和NDV，弹状病毒科(family Rhabdoviridae)—包括狂犬病病毒，尼亚病毒科(familyNyamiviridae)—包括尼亚病毒，沙粒病毒科(family Arenaviridae)—包括沙粒病毒，布尼亚病毒科(family Bunyaviridae)—包括汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever)，蛇形病毒科(family Ophioviridae)，正粘病毒科(familyOrthomyxoviridae)—包括流感病毒，δ病毒属(genus Deltavirus)—包括丁型肝炎病毒，Dichorhavirus属、Emaravirus属，尼亚病毒属(genus Nyavirus)—包括尼亚玛尼病毒(Nyamanini)和中途病毒(Midway viruses)，纤细病毒属(genus Tenuivirus)、巨脉病毒属(genus Varicosavirus)、Taastrup病毒，或核盘菌负链RNA病毒1 (Sclerotiniasclerotiorum negative-stranded RNA virus 1)的RNA。
在一些实施方案中，颗粒在结合核酸时生成或调节电信号的传感器中找到用途。
II. 测定
在一些实施方案中，捕获后，RNA被检测和/或量化。本文描述了示例性的测定。
在一些实施方案中，所述测定是核酸检测分析(例如，扩增、测序、杂交等)。核酸扩增技术的示例性非-限制性实例包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录-介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)，和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认识到某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增之前将RNA逆转录为DNA (例如，RT-PCR)，而其它扩增技术直接扩增RNA (例如，TMA和NASBA)。
在一些实施方案中，利用核酸测序方法(例如，用于扩增的核酸的检测)。在一些实施方案中，本文提供的技术在第二代(也称为下一代或Next-Gen)、第三代(也称为再下一代(Next-Next-Gen))，或第四代(也称为N3-Gen)测序技术中找到用途，包括，但不限于，焦磷酸测序、通过连接的测序(sequencing-by-ligation)、单分子测序、通过合成的测序(sequence-by-synthesis, SBS)、半导体测序、大规模并行克隆(massive parallelclonal)、大规模并行单分子SBS (massive parallel single molecule SBS)、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics, 92:255 (2008)中提供了一些这样的技术的综述，通过引用以其整体结合到本文中。本领域普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中是不太稳定的且在实验中更易于受核酸酶攻击，RNA通常在测序前被逆转录为DNA。
许多DNA测序技术是合适的，包括基于荧光的测序方法(见，例如，Birren et al.,Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.；通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，所述技术在本领域了解的自动测序技术中找到用途。在一些实施方案中，本发明技术在分隔的扩增子的平行测序中找到用途(授权于KevinMcKernan等的PCT公布号：WO2006084132，通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，所述技术在通过并行寡核苷酸延伸的DNA测序中找到用途(见，例如，授权于Macevicz等的美国专利号5,750,341，和授权于Macevicz等的美国专利号6,306,597，两者通过引用以其整体结合到本文中)。所述技术用于的测序技术的另外的实例包括Church polony技术(Mitra et al., 2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure et al.,2005 Science 309, 1728-1732；美国专利号6,432,360、美国专利号6,485,944、美国专利号6,511,803；通过引用以其整体结合到本文中)，454 picotiter焦磷酸测序技术(Margulies et al., 2005 Nature 437, 376-380; US 20050130173; 通过引用以其整体结合到本文中)，Solexa单碱基添加技术(Bennett et al., 2005, Pharmacogenomics, 6,373-382；美国专利号6,787,308；美国专利号6,833,246；通过引用以其整体结合到本文中)，Lynx大规模并行签名测序技术(Lynx massively parallel signature sequencingtechnology) (Brenner et al. (2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634；美国专利号5,695,934；美国专利号5,714,330；通过引用以其整体结合到本文中)，和Adessi PCR集落技术(Adessi PCR colony technology) (Adessi et al. (2000). Nucleic Acid Res. 28,E87; WO 00018957；通过引用以其整体结合到本文中)。
下一代测序(NGS)方法共享大规模并行、高通量策略的共同特征，与老旧的测序方法比较具有较低成本的目标(见，例如，Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；各自通过引用以其整体结合到本文中)。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的那些和不使用模板扩增的那些方法。需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台被商品化的焦磷酸测序(例如，GS20和GS FLX), Life Technologies/Ion Torrent，由Illumina, GnuBio商品化的Solexa平台，和由Applied Biosystems商品化的Supported Oligonucleotide Ligation andDetection (SOLiD)平台。非-扩增方法，也称为单-分子测序，由Helicos BioSciences商品化的HeliScope平台，以及分别由VisiGen, Oxford Nanopore Technologies Ltd.和Pacific Biosciences商品化的新兴平台举例说明。
在焦磷酸测序(Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009;MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568；各自通过引用以其整体结合到本文中)中，模板DNA被片段化、末端-修复、连接于衔接子，并通过用携带与衔接子互补的寡核苷酸的珠捕获单模板分子原位克隆扩增。携带单模板类型的各个珠被隔开成油包水微泡，模板使用称为乳液PCR的技术进行克隆扩增。乳液在扩增后被破坏，珠在测序反应期间被沉积到用作流动池的picotitre板的各个孔中。4种dNTP试剂的每一种的有序重复引入在测序酶和发光报道子例如萤光素酶的存在下，在流动池中发生。在适宜的dNTP被加入到测序引物的3′端的情况下，生成的ATP生产在孔中引起发光脉冲，其使用CCD相机记录。达到大于或等于400个碱基的读取长度是可能的，并且可达到106个序列读数，产生至多500百万个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号6,833,246；美国专利号7,115,400；美国专利号6,969,488；各自通过引用以其整体结合到本文中)中，测序数据以较短-长度读数的形式产生。在这种方法中，单链片段化的DNA被末端-修复以生成5′-磷酸化钝端，接着经Klenow-介导的添加单一A碱基至所述片段的3′端。A-添加促进T-突出衔接子寡核苷酸的添加，其被随后用来捕获在镶嵌着寡核苷酸锚的流动池表面上的模板-衔接子分子。锚被用作PCR引物，但由于模板的长度及其接近其它附近的锚寡核苷酸，由PCR的延伸导致分子“拱起(arching over)”与邻近的锚寡核苷酸杂交，以在流动池的表面形成一种桥结构。这些DNA环被变性并裂解。然后正向链用可逆的染料终止子测序。掺入的核苷酸的序列通过检测掺入后荧光来确定，在下一轮dNTP添加之前除去各荧光和堵塞物。序列读取长度范围从36个核苷酸至超过250个核苷酸，每次分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术测序核酸分子(Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al., Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号5,912,148；美国专利号6,130,073；各自通过引用以其整体结合到本文中)也涉及模板的片段化，与寡核苷酸衔接子的连接，附接至珠，和经乳液PCR的克隆扩增。此后，携带模板的珠被固定在玻璃流动池的衍生化表面，与衔接子寡核苷酸互补的引物被退火。然而，不是利用这个引物用于3′延伸，而是用来提供5′磷酸基团，以连接至含有两个探针-特异性碱基，接着6个简并碱基和4个荧光标记之一的讯问探针。在SOLiD系统中，讯问探针具有在每个探针的3′端的两个碱基，和5′端的4种荧光之一的16个可能的组合。荧光色彩，及因而每个探针的身份，对应于规定的色彩-空间编码方案。多轮(通常7轮)的探针退火、连接和荧光检测，紧随其后的是变性，然后第二轮测序使用相对于初始引物偏移一个碱基的引物。用这种方式，模板序列可被计算重构，和模板碱基被询问两次，导致精确性增加。序列读取长度平均为35个核苷酸，和每次测序运行的总输出超过40亿个碱基对。
在某些实施方案中，所述技术在纳米孔测序中找到用途(见，例如，Astier etal., J. Am. Chem. Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705-10，通过引用结合到本文中)。纳米孔测序背后的理论必定与当纳米孔浸没在导电流体中且在其上施加电势(电压)时发生的情况有关。在这些条件下，可观察到由于离子通过纳米孔传导的轻微电流，电流量对纳米孔的尺寸极其敏感。当核酸的每个碱基通过纳米孔时，引起通过纳米孔的电流强度的变化，其对于4个碱基的每一个都是截然不同的，从而允许DNA分子的序列被确定。
在某些实施方案中，所述技术在Helicos BioSciences的HeliScope中找到用途(Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean et al.,Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号7,169,560；美国专利号7,282,337；美国专利号7,482,120；美国专利号7,501,245；美国专利号6,818,395；美国专利号6,911,345；美国专利号7,501,245；各自通过引用以其整体结合到本文中)。模板DNA被片段化和在3′端被多聚腺苷酸化，其中最后一个腺苷携带荧光标记。变性的多聚腺苷酸化模板片段被连接至流动池表面的聚(dT)寡核苷酸。捕获的模板分子的初始物理位置由CCD相机记录，然后裂解标记物并洗脱。测序通过添加聚合酶和系列添加荧光-标记的dNTP试剂实现。掺入事件产生对应于dNTP的荧光信号，并在每轮dNTP添加之前，用CCD相机捕获信号。序列读取长度范围从25至50个核苷酸，每次分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
Ion Torrent技术是基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的DNA测序方法(见例如，Science 327(5970): 1190 (2010); 美国专利申请公布号20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143，为所有目的通过引用以其整体结合到本文中)。微孔含有要测序的模板DNA链。微孔的层下面是高灵敏度的ISFET离子传感器。所有层均包含在CMOS半导体芯片内，类似于用于电子工业的芯片。当dNTP掺入生长的互补链中时，氢离子被释放，其触发高灵敏度的离子传感器。如果均聚物重复存在于模板序列中，多个dNTP分子将掺入单次循环中。这导致相应数量的释放的氢和按比例更高的电子信号。这种技术与其它测序技术的不同之处在于不使用修饰的核苷酸或光学仪器。IonTorrent测序仪的每个碱基的准确性对于50个碱基读数是~99.6%，每次运行生成~100 Mb-100Gb。读取-长度是100-300个碱基对。对于5个重复长度的均聚物重复的准确性是~98%。离子半导体测序的益处是快速测序速度和低的前期和操作成本。
所述技术在由Stratos Genomics, Inc.开发的另一种核酸测序方法中找到用途，且涉及Xpandomers的使用。这种测序过程通常包括提供由模板-指导的合成产生的子链。该子链一般包括对应于目标核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中偶合的多个亚单位，其中各个亚单位包含系链，至少一个探针或核碱基残基，和至少一个选择性地可裂解的键。选择性地可裂解的键被裂解以产生长度长于子链的多个亚单位的Xpandomer。Xpandomer通常包括系链和报道子元件，用于解析对应于目标核酸的全部或部分的连续核苷酸序列的序列中的遗传信息。然后检测Xpandomer的报道子元件。涉及基于Xpandomer的方法的另外的细节在例如，2008年6月19日提交的题目为“High Throughput Nucleic AcidSequencing by Expansion”的美国专利公布号20090035777中描述，其以其整体结合到本文中。
其它新兴的单分子测序方法包括通过使用VisiGen平台合成的实时测序(Voelkerding et al., Clinical Chem., 55: 641–58, 2009；美国专利号7,329,492；美国专利申请系列号11/671956；美国专利申请系列号11/781166；各自通过引用以其整体结合到本文中)，其中固定化的、引发DNA模板经受使用荧光-修饰的聚合酶和荧光受体分子的链扩增，在核苷酸添加时产生可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
在一些实施方案中，检测方法利用杂交分析。核酸杂交技术的示例性非-限制性实例包括，但不限于微阵列，包括，但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)。DNA微阵列，通常称为基因芯片、DNA芯片，或生物芯片，是为了表达分析或同时监测数千基因的表达水平的目的，附着于固体表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)的形成阵列的微小DNA斑点的集合。固定的DNA片段被称为探针，成千的探针可被用于单DNA微阵列。微阵列可通过比较疾病和正常细胞中的基因表达，用来鉴定疾病基因或转录物。微阵列可使用各种技术制作，包括但不限于：用细头针在玻片上打印；使用预制的掩模进行光刻；使用动态微镜设备进行光刻；喷墨打印；或在微电极阵列上的电化学。
DNA印迹法和RNA印迹法被用来分别检测特定的DNA或RNA序列。从样本提取的DNA或RNA被片段化、在基质凝胶上经电泳分离，并转移至滤膜。结合滤膜的DNA或RNA经受用与所提及的序列互补的标记探针的杂交。检测结合于滤膜的杂交探针。程序的变型是反向RNA印迹法，其中固定于膜的底物核酸是分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并被标记的RNA。
一个示例性检测方法，杂交保护测定法(HPA)包括使化学发光的寡核苷酸探针(例如，吖啶酯(acridinium ester)-标记的(AE)探针)杂交于目标序列，选择性地使在未杂交的探针上存在的化学发光的标记水解，并在光度计中测量从剩余探针产生的化学发光。见，例如，美国专利号5,283,174和Norman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing,Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J. Kricka ed., 2d ed. 1995，其各自通过引用以其整体结合到本文中)。
使荧光团附接于核酸探针是本领域熟知的并可通过任何可用的方式完成。例如，荧光团可共价连接于特定的核苷酸，和标记的核苷酸使用标准技术例如切口平移(nicktranslation)、随机引发(random priming)、PCR标记等掺入探针。或者，荧光团可经由接头共价连接于已被促转氨的探针的脱氧胞苷核苷酸。用于标记探针的方法描述于美国专利号5,491,224和Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications (2002), Y.-S.Fan, Ed., Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for GenomicTargets”, L. Morrison et al., p. 21-40, Humana Press，二者通过引用以对其标记探针的描述结合到本文中。
可用于标记探针的示例性荧光团包括TEXAS RED (Molecular Probes, Inc.,Eugene, Oreg.)、CASCADE蓝色乙酰叠氮化物(CASCADE blue aectylazide) (MolecularProbes, Inc., Eugene, Oreg.)、SPECTRUMORANGE™ (Abbott Molecular, Des Plaines,Ill.)和SPECTRUMGOLD™ (Abbott Molecular)。
可用于本文描述的方法的荧光团的实例是：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)；5-(和6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和6)-羧基荧光素；荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)；7-二乙基氨基香豆素-3-甲酸、四甲基-罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸酯；5-(和6)-羧基四甲基罗丹明；7-羟基-香豆素-3-甲酸；6-[荧光素-5-(和6)-甲酰胺基]己酸；N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-3-引达省(indacene)丙酸；曙红-5-异硫氰酸酯；赤藓红-5-异硫氰酸酯；5-(和6)-羧基罗丹明6G；和Cascades蓝色乙酰叠氮化物(Cascades blue aectylazide) (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.)。
探针可用荧光显微镜和对每个荧光团适宜的滤光器查看，或通过使用双重或三重带通滤光器装置以观察多个荧光团。见，例如，授权于Bittner等的美国专利号5,776,688，其通过引用结合到本文中。任何合适的显微成像方法可被用来显现杂交的探针，包括自动数字成像系统，例如从MetaSystems或Applied Imaging可获得的那些。或者，技术例如流式细胞术可被用来检查染色体探针的杂交谱。
探针也可例如通过本领域熟知的方法，用生物素或地高辛间接标记。然而，第二检测分子或进一步的处理然后被用来显现标记的探针。例如，用生物素标记的探针可通过缀合于可检测的标记，例如，荧光团的抗生物素蛋白检测。此外，抗生物素蛋白可被缀合到酶促标记物例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。这样的酶促标记物可在标准比色反应中使用针对酶的底物检测。用于碱性磷酸酶的底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑鎓。二氨基苯甲酸酯可被用作辣根过氧化物酶的底物。杂交的生物素或其它间接标记的探针的荧光检测可通过使用市售可获得的酪酰胺(tyramide)放大系统完成。
可使用其它试剂或染料代替荧光团作为含有标记的部分。可附接于探针的合适的标记包括，但不限于，放射性同位素、荧光团、发色团、质量标签、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发射冷光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。发光剂包括，例如，含有放射性发光的、化学发光的、生物发光的和发出磷光的标记的部分。或者，可使用通过间接方法显现的检测部分。例如，探针可使用本领域已知的常规方法，用生物素或地高辛标记，然后经进一步处理用于检测。含生物素的探针的可视化可经由随后结合于与可检测的标记缀合的抗生物素蛋白实现。可检测的标记可以是荧光团，在这种情况下，探针的可视化和辨别力可如上对ISH所述实现。
在一些实施方案中，探针被设计具有以共同间隔(例如，每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，一个标记基团)置于整个核酸中的标记。
在一些实施方案中，探针库包含具有不同的可检测标记(例如，不同色彩的荧光信号)的探针。
杂交至目标区的探针可供选择地通过标记部分与用于产生不溶性色彩产物的合适底物的酶促反应可视化。在一个装置内的含生物素的探针可经由随后与缀合至碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白和合适的底物一起孵育来检测。5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑鎓(NBT)用作碱性磷酸酶的底物，而二氨基联苯胺用作HRP的底物。
在使用荧光团-标记的探针或探针组合物的实施方案中，检测方法可涉及荧光显微术、流式细胞术或其它用于测定探针杂交的方式。任何合适的显微成像方法可与本发明的方法组合使用以观察多个荧光团。在使用荧光显微术的情况下，杂交的样本可在适合于激发每个荧光团的光照下并用适宜的一个或多个滤光器观察。自动数字成像系统例如MetaSystems、BioView或Applied Imaging系统可供选择地使用。
在一些实施方案中，本文描述的金属氧化物在生物传感器中找到用途。例如，在一些实施方案中，金属氧化物被用来涂布检测核酸的电传感器。在一些实施方案中，金属氧化物被用来捕获核酸(例如，如上所述)。然后使用靶标特异性探针检测捕获的核酸。在一些实施方案中，靶标特异性捕获序列被附接于金属氧化物，并被用来捕获特异性核酸靶标。在任一情况下，核酸与金属氧化物的结合生成可检测的信号。
具体实施方式
本发明还涉及以下实施方案：
1. 一种从生物样本捕获RNA和/或DNA的方法，其包括：
a) 使所述样本与包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒或固体表面接触，以使所述样本中的DNA和/或RNA结合所述颗粒；
b) 洗涤所述颗粒或固体表面以除去污染物；和
c) 从所述颗粒或固体表面洗脱RNA和/或DNA。
2. 实施方案1的方法，其中所述金属氧化物是CuTi。
3. 实施方案1或2的方法，其中所述CuTi以约0.5:1-5:1的Cu:Ti的比例存在。
4. 实施方案1-3的任一项的方法，其中所述金属或金属氧化物选自AlTi、CaTi、CoTi、Fe2Ti、Fe3Ti、MgTi、MnTi、NiTi、SnTi、ZnTi、Fe2O3、Fe3O4、Mg、Mn、Sn、Ti和Zn。
5. 实施方案1-4的任一项的方法，其中所述金属氧化物是所述金属氧化物的无水或水合形式。
6. 实施方案1-5的任一项的方法，其中所述颗粒的直径是0.5-50 µm。
7. 实施方案6的方法，其中所述颗粒的直径是1.0-5.0 µm。
8. 实施方案1-7的任一项的方法，其中所述颗粒或固体表面包含聚合物、磁性材料、金属材料、无机固体，或其组合。
9. 实施方案8的方法，其中所述无机固体是二氧化硅。
10. 实施方案1-9的任一项的方法，其中所述固体表面具有选自平板、针状、立方形、管状、纤维状、柱状和无定形的形状。
11. 实施方案1-10的任一项的方法，其中所述洗脱包括洗脱缓冲液。
12. 实施方案11的方法，其中所述洗脱缓冲液包含磷酸盐。
13. 实施方案12的方法，其中所述磷酸盐是无机或有机磷酸盐。
14. 实施方案12或13的方法，其中所述磷酸盐以0.5-20 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
15. 实施方案13或14的方法，其中所述磷酸盐以4-6 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
16. 实施方案13-15的任一项的方法，其中所述磷酸盐以5 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
17. 实施方案1-16的任一项的方法，其中所述RNA和/或DNA是真核生物的、原核生物的或病毒的RNA。
18. 实施方案17的方法，其中所述DNA和/或RNA来自真核生物的、原核生物的或病毒的病原体。
19. 实施方案1-18的任一项的方法，其中所述颗粒或固体表面优先地结合RNA或DNA。
20. 实施方案1-19的任一项的方法，其还包括测定存在于所述样本中的所述DNA和/或RNA的身份和/或量的步骤。
21. 实施方案20的方法，其中所述测定包括采用一个或多个选自扩增、杂交和测序的检测方法。
22. 一种试剂盒，其包含：
a) 包含金属或金属氧化物或用金属或金属氧化物涂布的颗粒或固体表面；和
b) 洗脱缓冲液。
23. 实施方案22的试剂盒，其中所述金属氧化物是CuTi。
24. 实施方案22或23的试剂盒，其中所述CuTi以约0.5:1-5:1的Cu:Ti的比例存在。
25. 实施方案22-24的任一项的试剂盒，其中所述金属或金属氧化物选自AlTi、CaTi、CoTi、Fe2Ti、Fe3Ti、MgTi、MnTi、NiTi、SnTi、ZnTi、Fe2O3、Fe3O4、Mg、Mn、Sn、Ti和Zn。
26. 实施方案22-25的任一项的试剂盒，其中所述金属氧化物是所述金属氧化物的无水或水合形式。
27. 实施方案22-26的任一项的试剂盒，其中所述颗粒的直径是0.5-50 µm。
28. 实施方案22-26的任一项的试剂盒，其中所述颗粒的直径是1.0-5.0 µm。
29. 实施方案22-28的任一项的试剂盒，其中所述颗粒或固体表面包含聚合物、磁性材料、金属材料、无机固体，或其组合。
30. 实施方案22-29的任一项的试剂盒，其中所述固体表面具有选自平板、针状、立方形、管状、纤维状、柱状和无定形的形状。
31. 实施方案22-30的任一项的试剂盒，其中所述洗脱缓冲液包含磷酸盐。
32. 实施方案31的试剂盒，其中所述磷酸盐是无机或有机磷酸盐。
33. 实施方案31或32的试剂盒，其中所述磷酸盐以0.5-20 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
34. 实施方案31或32的试剂盒，其中所述磷酸盐以4-6 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
35. 实施方案31或32的试剂盒，其中所述磷酸盐以5 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
36. 实施方案22-35的任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含选自将核酸结合到颗粒或固体表面的溶液和从所述颗粒或固体表面洗掉污染的材料的溶液的一种或多种组分。
37. 实施方案22-36的任一项的试剂盒，其还包含用于测定存在于所述样本中的DNA和/或RNA的身份和/或量的试剂。
38. 实施方案37的试剂盒，其中所述试剂是用于执行一种或多种选自扩增、杂交和测序的检测方法的试剂。
39. 实施方案37或38的试剂盒，其中所述试剂选自一种或多种核酸引物和一种或多种核酸探针。
40. 一种从生物样本捕获RNA的方法，其包括：
a) 使所述样本与包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒或固体载体接触，以使所述样本中的RNA而不是样本中的DNA结合所述颗粒；
b) 洗涤所述颗粒以除去污染物；和
c) 从所述颗粒或固体载体洗脱RNA。
41. 实施方案40的方法，其中所述颗粒结合所述样本中的少于20%的DNA。
42. 实施方案40的方法，其中所述颗粒结合所述样本中的少于15%的DNA。
43. 实施方案40的方法，其中所述颗粒结合所述样本中的少于10%的DNA。
44. 实施方案40-43的任一项的方法，其中所述DNA是基因组的、细菌的，和/或病毒的DNA。
45. 实施方案22-39的任一项的试剂盒在纯化DNA和/或RNA中的用途。
实验
实施例1
这个实施例描述CuTi涂布的颗粒的合成。比较不同量的铜和/或钛。还进行实验以确定为了金属沉淀在颗粒上是否需要磷酸盐。首先加入NaOH。中和本身应该沉淀金属。金属氧化物以及金属磷酸盐为不溶性的。此时磷酸盐可不沉淀任何金属，因为它们已经被沉淀。
试剂
常用名 供应商
氯化铜(II) Sigma-Aldrich
HCl 12 M Sigma-Aldrich
铁氧化物-黑色 Rockwood
磷酸氢二钾 Sigma-Aldrich
氢氧化钠50% Sigma-Aldrich
氢氧化钠5N Fisher
磷酸氢二钠 Sigma-Aldrich
氯化钛(III)溶液 Sigma-Aldrich
制备20 ml的1 M CuCl2和1升的10 mM NaOH。
颗粒使用以下试剂制得。
管 1 2 3 4
ml Ti 0.90 0.90 0.90 0.00
ml Cu 1.4 1.4 1.4 1.4
ml磷酸盐 3.6 1.8 0 0
ml NaOH 1.2 1.2 1.2 1.2
ml 12 M HCl 0 0 0 0.05
mM Ti 9.45 9.45 9.45 0
mM Cu 14 14 14 14
mM磷酸盐 18 9 0 0
mM NaOH 229.2 229.2 229.2 229.2
mM HCl 0 0 0 6
10 g颗粒(Rockwood BK5000AP)的4份等分液各自分配到125 ml PETG瓶中。将100ml水加入到每个瓶中并将各瓶放置在旋转器上以混合。将Cu和Ti溶液加入到每个瓶中，剧烈震摇并放在旋转器上。所有颗粒悬浮液均通过100微米尼龙滤器(Spectramesh #146488(Spectrum Labs))过滤。在倾倒在滤器上后，将50 ml水加入到瓶中，震摇，并倾倒在滤器上以合并。将NaOH加入到瓶中。将磷酸盐加入到#1和#2瓶中，洗涤颗粒，并以磁力捕获颗粒。
颗粒用100 ml水洗涤5次，并用10 mM NaOH再悬浮直至100 ml的总体积。颗粒用10mM NaOH稀释至1%。
用于RNA提取的试验颗粒。
下表显示测试的颗粒。
Figure 186459DEST_PATH_IMAGE001
进行CSC提取。将洗脱缓冲液稀释至5 mM磷酸盐、10 ml洗脱缓冲液和30 ml水。将IC加入到裂解缓冲液中 - 800 µl IC加入到70 ml LB中。使用无IC的LB洗涤颗粒。通过将洗脱缓冲液稀释至5 mM磷酸盐、10 ml洗脱缓冲液和30 ml水制备试剂。将样本制备(HCV和阴性对照)为30 IU/ml的最终稀释液。
颗粒设置如下显示 - 各CSC运行具有多种颗粒类型(42份总样本)。
设置提取柱。7套中的6套
装载 裂解缓冲液+ IC 如下所列的MMP 样本 作为洗涤1的LB 洗涤2 洗脱5 mM磷酸盐 温度
孔1-裂解液 1.5 ml 100 µl 0.5 ml 50C
孔2
孔3
孔4-洗涤1 0.7 ml
孔5-洗涤2A 0.8 ml
孔6-洗涤2B 0.8 ml
洗脱-5 mM磷酸盐 44 µl 73C
扩增后，数据使用MultiAnalyze分析。结果显示于图1A-D中。进一步的统计学分析使用JMP执行。结果显示于图2-3中。统计学分析(FAM-MR通过mmp单向分析，FAM-Ct通过mmp单向分析，VIC-Ct通过mmp单向分析，VIC-MR通过mmp单向分析)显示于图2A-D中。
关于另外的颗粒的更多数据(FAM-Ct通过MMP单向分析，FAM-MR通过MMP单向分析，和VIC-MR通过MMP单向分析)显示于图2E-F中。
结果表明，没有钛且只用铜氧化物制得的颗粒以及其它类型并未完成。它们并未很好地获得HCV且内部对照信号偏离~ 3 CT (10倍差异)。
只有CuTi颗粒的比较显示于图3A和B中。VIC MR显示于图3C-D中。
进一步的分析(FAM-Ct通过MMP单向分析，FAM-MR通过MMP单向分析，VIC-Ct通过MMP单向分析，和VIC-MR通过MMP单向分析)显示于图4A-D。
结果显示，不含磷酸盐制得的颗粒在其性能上与用磷酸盐制得的颗粒没有不同。在这些颗粒的生产中并不需要磷酸盐。
实施例2
这个实施例描述Ti和Cu在颗粒的金属氧化物涂层中的比例的分析。
试剂
常用名 供应商
氯化铜(II) Sigma-Aldrich
HCl 12 M Sigma-Aldrich
铁氧化物-黑色 Rockwood
磷酸氢二钾 Sigma-Aldrich
氢氧化钠50% Sigma-Aldrich
氢氧化钠5N Fisher
磷酸氢二钠 Sigma-Aldrich
氯化钛(III)溶液 Sigma-Aldrich
用HCl制备的CuCl2类似于TiCl3。准备1升10 mM NaOH、1升水，和2 ml的5N NaOH。Cu+Ti的总浓度=24 mM。分别地，Ti从24 mM至0 mM变化和Cu从0至24 mM变化。
下表显示Cu和Ti在生成的不同颗粒中的浓度。
瓶 1 2 3 4 5 6 7
ml Ti 2.29 1.90 1.52 1.14 0.76 0.38 0.00
ml Cu 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4
ml NaOH 3 3 3 3 3 3 3
mM Ti 24 20 16 12 8 4 0
mM Cu 0 4 8 12 16 20 24
mM NaOH 582 582 582 582 582 582 582
将10 g颗粒(Rockwood BK5000AP)的7份等分液分配至125 ml PETG瓶中并将100ml水加入到每个瓶中。将Cu和Ti溶液加入到每个瓶中，剧烈震摇和放置于旋转器上。在加入金属之前，不进行预混合。所有颗粒悬浮液通过100微米尼龙滤器(Spectramesh #146488(Spectrum Labs))过滤。在倾泻到滤器上后，将50 ml水加入到瓶中，震摇，并倒在滤器上以合并。将NaOH加入到各瓶中。用10 mM NaOH洗涤颗粒，然后在10 mM NaOH中再悬浮至10 %。这使得最终浓度更接近用于贮存的10 mM NaOH。颗粒经磁力捕获，倾析液体，并加入~100ml水(该步骤重复5-8次)。用10 mM NaOH使颗粒再悬浮直至100 ml的总体积，然后用10 mMNaOH稀释至1%。
用于RNA提取的试验颗粒。
提取试验使用0、2.5和5 mM磷酸盐洗脱执行。CSC提取使用稀释至5 mM磷酸盐、5ml洗脱缓冲液和15 ml水的洗脱缓冲液；稀释至2.5 mM磷酸盐、2.5 ml洗脱缓冲液和17.5ml水的洗脱缓冲液，和洗脱缓冲液0 mM磷酸盐-水执行。将IC加入到裂解缓冲液中(800 µlIC加入到70 ml LB)。洗涤1使用无IC的LB执行。
样本使用45 IU/ml的最终浓度的HCV和阴性对照制备。
每个CSC运行具有如下表所示的多种颗粒类型。
装载 裂解缓冲液+ IC 如下所列的MMP 样本 作为洗涤1的LB 洗涤2 洗脱5 mM磷酸盐 温度
孔1-裂解液 1.5 ml 100 µl 0.5 ml 50C
孔2
孔3
孔4-洗涤1 0.7 ml
孔5-洗涤2A 0.8 ml
孔6-洗涤2B 0.8 ml
洗脱-增加至45 45 µl 73C
提取后，使用30 µl样本、30 µl主混合物(master mix)执行HCV纯化分析，以反映所需的样本输入体积。
扩增后，数据使用MultiAnalyze分析。结果显示于图5A-B中。进一步的统计学分析使用JMP执行。样本ID的FAM-Ct (图6A)，样本ID的FAM-MR (图6B)，样本ID的VIC-Ct (图6C)，和样本ID的VIC-MR (图6D)的单向分析结果被显示。
对于所有的颗粒，0 mM磷酸盐具有差的回收率。结果显示需要磷酸盐以洗脱RNA。总之，这些数据证实，为从CuTi颗粒最佳洗脱RNA，需要磷酸盐。
钛水平和磷酸盐洗脱浓度
用0 mM磷酸盐没有靶标信号。Ti-phos的FAM-Ct (图7A)，Ti-phos的FAM-MR (图7B)，Ti-phos的VIC-Ct (图7C)，和Ti-phos的VIC-MR (图7D)的单向分析结果被显示。
结果显示2.5 mM洗脱不如5 mM磷酸盐那么好。
Ti-phos的FAM-Ct (图8A)，Ti-phos的FAM-MR (图8B)，Ti-phos的VIC-Ct (图8C)，和Ti-phos的VIC-MR (图8D)的单向分析结果被显示。结果表明，5 mM磷酸盐洗脱显示Cu-Ti组合功效优于100% Cu或100% Ti。
% Ti的FAM-Ct的单向分析，% Ti的FAM-MR的单向分析，% Ti的VIC-Ct的单向分析，和% Ti的VIC-MR的单向分析的结果显示于图9A-D中。
5 mM磷酸盐洗脱显示，Cu-Ti组合功效优于100% Cu或100% Ti。33% Ti、66 % Cu功效最好，用内部对照最明显地见到。
实施例3
这个实施例描述Cu-Ti比例的进一步的分析。
Cu+Ti的总浓度是24 mM。分别地，Ti从11 mM至5 mM变化和Cu从13至19 mM变化。
试剂
常用名 供应商
氯化铜(II) Sigma-Aldrich
HCl 12 M Sigma-Aldrich
铁氧化物-黑色 Rockwood
磷酸氢二钾 Sigma-Aldrich
氢氧化钠50% Sigma-Aldrich
氢氧化钠5N Fisher
磷酸氢二钠 Sigma-Aldrich
氯化钛(III)溶液 Sigma-Aldrich
类似于TiCl3，用HCl制备CuCl2。制备1升10 mM NaOH。通过在加入到颗粒之前，将CuCl2和TiCl3混合至单一管中来制备Cu-Ti溶液。在过滤颗粒后，加入NaOH。下表显示Cu和Ti在不同的测试样本中的浓度。
Figure 634758DEST_PATH_IMAGE002
通过称量出10 g颗粒(Rockwood BK5000AP)的6份等分液，并将每份分配到125 mlPETG瓶中，并向每瓶加入100 ml水来制备颗粒。将Cu-Ti溶液加入到每个瓶中，剧烈震摇并放置在旋转器上。通过100微米尼龙滤器(Spectramesh #146488 (Spectrum Labs))过滤所有颗粒悬浮液。在倾泻到滤器上后，将50 ml水加入到各瓶中，震摇，并倒在滤器上以合并。将颗粒返回到干净的PETG瓶中。将3 ml的50% NaOH加入到每个瓶的颗粒中并将瓶置于旋转器上。颗粒经磁力捕获，倾析液体，并用100 ml水洗涤颗粒5次。用~100 ml的10 mM NaOH执行第6次洗涤。倾析液体并使颗粒再悬浮于总体积100 ml的10 mM NaOH中。
测试颗粒的RNA结合。4 mM磷酸盐被用于洗脱。IC在裂解缓冲液中。以~3X LOD制备样本(HCV的最终浓度是45 IU/ml)。
如下表所述执行提取。
Figure 680074DEST_PATH_IMAGE003
扩增后，数据使用MultiAnalyze (图10A-B)和JMP分析。mMCu:mMTi的FAM-Ct的单向分析，mMCu:mMTi的FAM-MR的单向分析，mMCu:mMTi的VIC-Ct的单向分析，和mMCu:mMTi的VIC-MR的单向分析显示于图11A-D中。
FAM信号没有显著不同，这是由于样本的低滴度和在该水平下测定的可变性。最低总CT值是在16 mM Cu:8 mM Ti或2:1的Cu:Ti比例。这些颗粒还显示用于内部对照的最低的CT值。
实施例4
这个实施例描述使用16:08 Cu:Ti比例的沉淀总量分析。
试剂
常用名 供应商
氯化铜(II) Sigma-Aldrich
HCl 12 M Sigma-Aldrich
铁氧化物-黑色 Rockwood
磷酸氢二钾 Sigma-Aldrich
氢氧化钠50% Sigma-Aldrich
氢氧化钠5N Fisher
磷酸氢二钠 Sigma-Aldrich
氯化钛(III)溶液 Sigma-Aldrich
类似于TiCl3用HCl制备CuCl2。制备8 ml的CuCl2和3.8 ml TiCl3溶液。下表显示各样本中Cu和Ti的量。
Figure 75283DEST_PATH_IMAGE004
通过称量出10 g颗粒(Rockwood BK5000AP)的6份等分液，并将每份分配到125 mlPETG瓶中，并向每瓶加入100 ml水来制备颗粒。将Cu-Ti溶液加入到每个瓶中，剧烈震摇并放置在旋转器上。通过100微米尼龙滤器(Spectramesh #146488 (Spectrum Labs))过滤所有颗粒悬浮液。在倾泻到滤器上后，将50 ml水加入到瓶中，震摇，并倒在滤器上以合并。将颗粒返回到干净的PETG瓶中。将计算量的50% NaOH加入到每个瓶的颗粒中。将所有瓶放置在旋转器上。颗粒经磁力捕获，倾析液体，并用100 ml水洗涤颗粒5次。用~100 ml的10 mMNaOH执行第6次洗涤。倾析液体并使颗粒再悬浮于总体积100 ml的10 mM NaOH中。
使用5 mM磷酸盐用于洗脱，测试颗粒的RNA洗脱。如上所述制备试剂。IC是在裂解缓冲液中。以~3X LOD制备样本(HCV的最终浓度是45 IU/ml)。
如下表中所述执行提取。
Figure 889656DEST_PATH_IMAGE005
扩增后，数据使用MultiAnalyze (图12A-B)和JMP分析。mM CuTi的FAM-Ct的单向分析，mM CuTi的FAM-MR的单向分析，mM CuTi的VIC-Ct的单向分析，和mM CuTi的VIC-MR的单向分析显示于图13A-D中。
结果显示FAM信号没有显著不同，这是由于样本的低滴度和在该水平下测定的可变性。最佳IC值是具有14.4 mM CuTi的颗粒。
实施例5
这个实施例描述用17 mM和14 mM CuTi制得的颗粒对比用24 mM CuTi制得的颗粒的分析。下表显示测试的样本。
Figure 712118DEST_PATH_IMAGE006
执行HCV捕获。扩增后，数据使用MultiAnalyze (图14A-B)和JMP分析。mM CuTi的FAM-Ct的单向分析，mM CuTi的FAM-MR的单向分析，mM CuTi的VIC-Ct的单向分析，和mMCuTi的VIC-MR的单向分析显示于图15A-D中。
对于FAM信号，在3批颗粒之间没有显著差异。对于VIC信号，在3批颗粒之间对于VIC CT没有显著差异，但14和17 mM CuTi颗粒具有比24 mM CuTi颗粒更高的MR。
磷酸盐浓度和洗脱
进行实验以测试从颗粒洗脱靶标需要的磷酸盐量。使用水制备洗脱缓冲液的稀释液。如上所述执行提取和HCV捕获测定。使用Multianalyze (图16A-B)和JMP分析数据。样本ID的FAM-Ct的单向分析，样本ID的FAM-MR的单向分析，样本ID的VIC-Ct的单向分析，和样本ID的VIC-MR的单向分析显示于图17A-D。
结果显示，FAM和VIC CT和MR在4、5和6 mM磷酸盐时是相同的。
实施例6
这个实施例描述CuTi涂布的颗粒结合DNA和RNA的情况分析。HBV DNA和HCV RNA被用作靶标。结果与铁氧化物和二氧化硅颗粒比较。所有的样本使用5.7 mM磷酸盐缓冲液洗脱。
HBV提取和测定
靶标HBV CalB 6.6 log IU/ml和IC以每样本36 µl (10X浓度)使用。提取用58℃裂解温度进行。
扩增后，数据使用MultiAnalyze (图18A-B)和JMP分析。方法的FAM-Ct的单向分析，方法的FAM-MR的单向分析，方法的VIC-Ct的单向分析，和方法的VIC-MR的单向分析显示于图19A-D中。
结果显示来自CuTi颗粒的HBV DNA具有高于二氧化硅方法差不多7 CTs的CT值。这表示约100倍的差异(=2^6.7)。每个CT表示2倍的差异。
Fe2O3方法具有1.7 CT差异，其表示3倍以上的差异。与二氧化硅方法比较，Fe2O3捕获33%的DNA，而CuTi捕获1%的HBV DNA。
对于内部对照，CuTi方法具有高于二氧化硅方法5.5 CT的CT值。这表示约50倍的差异(=2^5.5)。此外，一个样本没有读数并且基本上没有回收，因此回收率甚至少于2%。
Fe2O3方法具有1.5 CT差异，其再次表示超过3倍差异。与二氧化硅方法比较，Fe2O3捕获33%的DNA，而CuTi捕获少于2%的内部对照DNA。
如上重复提取，除了HCV样本以100 IU/ml连同标准量的HCV内部对照一起处理外。
先将HCV AT稀释至1000 IU/ml，然后使用阴性稀释剂稀释至100 IU/ml。如上进行设置，除了17.1 µl的HCV内部对照加入到每个裂解室中外。
FAM分析的结果显示于图20A-B中。方法的FAM-Ct的单向分析，方法的FAM-MR的单向分析，方法的VIC-Ct的单向分析，和方法的VIC-MR的单向分析显示于图21A-D中。
对于HCV FAM信号，CuTi颗粒和二氧化硅颗粒具有基本上相同的CT和MR值。Fe2O3颗粒具有仅仅稍高于其它条件(其比其它信号低40%)的CT值。对于所有3种条件的MR值没有显著不同。
对于内部对照信号，CuTi颗粒和Fe2O3颗粒的CT值相称，而二氧化硅颗粒具有稍微升高的CT值，其为少于30%差异。
对于HCV RNA和内部对照RNA (南瓜)二者，CuTI颗粒显示至少与Fe2O3和二氧化硅颗粒同样好的RNA回收率。
整体总结：
CuTi颗粒及其它方法捕获RNA，但与其它方法一样不捕获DNA。这意味着CuTi颗粒可选择性地捕获RNA。这在RNA病毒的测量方法中是重要的。捕获DNA不是合乎需要的，因为在提取中存在前-病毒DNA可造成病毒颗粒量的不精确的测定。
图22和下表显示与二氧化硅比较的CuTi回收率。
Figure 775889DEST_PATH_IMAGE007
实施例7
这个实施例描述CuTi颗粒结合基因组DNA的情况分析。基因组DNA、HBV DNA和HCVRNA被用作靶标。结果与铁氧化物和总核酸方法(二氧化硅颗粒)比较。
一些样本被再洗脱以测试加热的洗涤步骤。对于Fe2O3和CuTi方法，样本用水洗脱(加热洗涤模拟)，然后用磷酸盐洗脱。对于TNA-二氧化硅方法，不执行第二次洗脱。
使用HBV CalB、HCV CalB和基因组DNA制备靶标。第一次提取是CuTi颗粒，移去洗脱管并用空白管替代，颗粒经手动捕获并返回到自动样本制备设备中。执行第二次洗脱，而颗粒是通过移液再悬浮的颗粒。它们被放置在加热块的后面，孵育10分钟，然后经手动捕获颗粒。所有的提取用176 µl洗脱进行并用3次测定，HCV、HBV和MYD88基因组DNA运行。
如上执行从Fe2O3颗粒的提取，除了洗脱是用50 µl 20 mM磷酸盐接着用126 µl水的两阶段洗脱外。
二氧化硅TNA提取使用单阶段176 µl水洗脱执行。不执行第二次洗脱。
扩增后，HBV数据使用MultiAnalyze (图23A-B)和JMP分析。样本ID的FAM-Ct的单向分析和样本ID的FAM-MR的单向分析显示于图24A-B中。
洗涤步骤并不改善任何HBV信号。
接着，第一次磷酸盐洗脱与二氧化硅处理进行比较(图25)。样本ID的FAM-Ct的单向分析和样本ID的FAM-MR的单向分析显示于图26A-B中。
Fe2O3处理和CuTi处理以及TNA方法不分离DNA (见下表)。
HBV FAM CT CT diff X倍 % TNA
CuTi 28.33 2.6 6.062866 16%
Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub> 27.07 1.34 2.531513 40%
二氧化硅 25.73
当用基因组DNA处理时，Fe2O3方法分离40%的HBV信号。与二氧化硅颗粒TNA方法比较，CuTi方法仅分离16%的DNA。
用HCV重复测定和分析。图27显示HCV的FAM结果。样本ID的FAM-Ct的单向分析和样本ID的FAM-MR的单向分析显示于图28A-B中。洗涤步骤并不改善任何HBV信号。
第一次磷酸盐洗脱与二氧化硅处理比较(图29)。样本ID的FAM-Ct的单向分析和样本ID的FAM-MR的单向分析显示于图30A-B中。结果显示Fe2O3方法比该实验中的CuTi方法或者二氧化硅方法分离更多的HCV RNA。CuTi方法比二氧化硅TNA方法分离更多的RNA。所有3种方法有效地分离RNA。
实验用基因组DNA重复。图31显示FAM结果。样本ID的CY5-Ct的单向分析和样本ID的CY5-MR的单向分析显示于图32A-B中。
此外，洗涤似乎并未改善信号。
第一次磷酸盐洗脱与二氧化硅处理进行比较(图33)。样本ID的CY5-Ct的单向分析和样本ID的CY5-MR的单向分析显示于图34A-B和下表中。
Figure 974789DEST_PATH_IMAGE008
结果显示Fe2O3方法分离32%的基因组DNA。与二氧化硅颗粒TNA方法比较，CuTi方法仅分离12%的DNA。
小结：
当用基因组DNA处理时，Fe2O3方法分离40%的HBV信号。与二氧化硅颗粒TNA方法比较，CuTi方法仅分离16%的DNA。
Fe2O3方法比该实验中的CuTi方法或者二氧化硅方法分离更多的HCV RNA。CuTi比二氧化硅TNA方法分离更多的RNA，136%。所有3种方法有效地分离RNA，如通过对FAM的扩增曲线可见到的。在曲线中有大量的重叠且CT值可能不反映类似性(图35)。
Fe2O3方法分离32%的基因组DNA。与二氧化硅颗粒TNA方法比较，CuTi方法仅分离12%的DNA。
CuTi颗粒及其它方法捕获RNA，但与其它方法一样不捕获DNA。这意味着CuTi颗粒可选择性地捕获RNA。这在RNA病毒的测量方法中是重要的。捕获DNA不是合乎需要的，因为在提取中存在前-病毒DNA可造成病毒颗粒量的不精确的测定(图36和下表显示与二氧化硅比较的CuTi回收率)。
Figure 643668DEST_PATH_IMAGE009
实施例8
这个实施例描述使用CuTi分离DNA。
HBV以低于LOD样本(10 cps/ml)的浓度使用。对于CuTi提取，使用不含乙醇的裂解缓冲液用于裂解和洗涤1，使用水用于洗涤2，并使用5 mM洗脱缓冲液。对于二氧化硅提取，裂解和洗涤1使用加入到70 ml裂解缓冲液的70 ml乙醇。对于洗涤2，70 ml乙醇被加入到25ml洗涤2 (水)中。
样本是最终浓度10 IU/ml的HBV。下表显示不同的测试样本和测定方案。
8份样本 8份样本 8份样本 8份样本
20 ul IC 20 ul IC 20 ul IC 20 ul IC
总共1500 ul裂解缓冲液 总共1500 ul裂解缓冲液 总共500 ul裂解缓冲液 总共500 ul裂解缓冲液
50 ul PK 50 ul PK 50 ul PK 50 ul PK
150 ul LB 150 ul LB 150 ul LB 150 ul LB
200 ul样本 200 ul样本 200 ul样本 200 ul样本
25 ul二氧化硅MMP 25 ul二氧化硅MMP 100 ul CuTi 100 ul CuTi
500洗涤1 500洗涤1 500洗涤1 500洗涤1
800洗涤2A 800洗涤2A 800洗涤2A 800洗涤2A
800洗涤2B 800洗涤2B 800洗涤2B 800洗涤2B
55 ul洗脱 55 ul洗脱 55 ul洗脱 55 ul洗脱
300 sec pk孵育 300 sec pk孵育 300 sec pk孵育 300 sec pk孵育
10 min裂解 10 min裂解 10 min裂解 10 min裂解
10 min洗脱 10 min洗脱 10 min洗脱 10 min洗脱
提取完成后，如上设置测定并运行。分析后，将数据转移至如上所述的MultiAnalyze和JMP。结果显示于图37A-F中。结果显示用CuTi颗粒和二氧化硅颗粒二者，所有样本(10 IU/ml)被检出。例如，对于CuTi颗粒检出40/40和对于二氧化硅颗粒检出24/24。在两个实验中，靶标HBV信号在统计学上是相同的，虽然对于CuTi的MR倾向高于二氧化硅颗粒。在第一次实验中的内部对照具有对于CuTi颗粒的较高的CT值，但比在第二次实验中的二氧化硅颗粒更低。HBV靶标用CuTi颗粒制剂在低于LOD下以100%检测而检出，内部对照也以与二氧化硅处理可比较的水平检出。
实施例9
这个实施例描述用CuTi颗粒的DNA和RNA捕获。测试不同的裂解缓冲稀释液以确定任何不同的DNA和RNA回收率。总共8份裂解缓冲液浓度被测试。HIV (1000个分子/ml)和HBV核酸被测试。GITC是裂解缓冲液的主要组分。下表显示裂解缓冲液条件。
Figure 637032DEST_PATH_IMAGE010
Multianalyze5被用来分析数据。结果显示于图38 A-I中。百分回收率使用最低的CT作为最大值来计算。每个CT越高，表示CT的½回收率越低(循环阈值是从一个扩增循环至下一个循环的差别，每个循环导致扩增子的量翻倍)。对于RNA和DNA回收率，计算CT差异并在每个GITC水平下计算百分回收率(图38H-I)。
DNA回收率在高水平的GITC (2.33 M GITC和以上)时是最高的，而RNA回收率在1.35 M GITC和以上时是高的。在1.35 M GITC，使用上述提取条件(58℃，1 ml样本和1.5ml裂解缓冲液)，对于上述RNA和DNA靶标，有几乎最大的RNA回收率，但少于10% DNA回收率。
实施例10
这个实施例描述由金属颗粒的DNA和RNA结合。这个实验的目的是除了CuTi颗粒制剂之外，扩大对RNA和DNA结合所测试的金属氧化物。
制备以下颗粒：
金属氯化物
1 AlCl3
2 氯化钙1.0 M
3 CoCl2
4 氯化铬(III)
5 氯化铜(II)
6 FeCl2-氯化铁(II)
7 FeCl2-氯化铁(III)
8 氯化锰(II)
9 MgCL2
10 NiCl2
11 SnCl2
12 氯化钛(III)溶液
13 氯化锌
在125 ml PETG瓶中用1g颗粒制备颗粒。将100 ml水加入到各瓶中。瓶1具有0.5ml的AlCl3-HCl；瓶2具有0.5 ml CaCL2 + 0.5ml 3M HCl；瓶3具有0.5 ml CoCl2-HCl；瓶4具有0.5 ml CuCl2-HCl。将各瓶在旋转器上孵育50分钟。然后用0.63 ml 50% NaOH中和颗粒。
使用以下试剂，测试颗粒的HIV和HBV提取。
Figure 656940DEST_PATH_IMAGE011
在开始提取前，将颗粒(100 µl)手动加入到裂解孔中。
Figure 393952DEST_PATH_IMAGE012
Figure 917337DEST_PATH_IMAGE013
第二次提取与第一次相同，除了洗脱缓冲液是未稀释的20 mM磷酸盐和两步骤洗脱(25 ul的20 mM，然后75 ul水)外。
提取后，使用上述的实时测定法测定颗粒对HBV和HIV的结合。
图39A-F显示不同的颗粒的HIV数据。图40A-F显示不同的颗粒的HBV数据。
不同的金属氧化物显示对HIV和HBV的不同的结合。一些洗脱液显示在反应中的抑制作用，如可从HBV的IC信号中所见到的。镍和钴氧化物显示抑制作用。Cu和Fe2也显示抑制作用。为比较RNA和DNA的相对回收率，循环阈值(CT)被用来计算靶标相对给出最佳回收率的颗粒的相对回收率。例如，如果一种氧化物具有20的CT，和另一种具有21的CT值，则第二种氧化物回收½的第一种氧化物的量。如果另一种具有22的CT值，则它仅回收¼的第一种氧化物的量。计算是与最低值(最佳回收率)(其然后用作2X的指数)的CT差异。
Figure 347182DEST_PATH_IMAGE014
Figure 119966DEST_PATH_IMAGE015
如可从图41见到的，各种金属氧化物以不同的程度回收HIV和HBV靶标。Al、Ca、Co、Cu、Fe2、Mg和Ni氧化物颗粒及其它金属氧化物不回收任一种靶标。Fe3和Ti氧化物既回收RNA又回收DNA，Mn氧化物涂布的颗粒回收比RNA更多的DNA，而Sn和Zn氧化物颗粒回收比DNA更多的RNA。裂解条件是58℃和1:1.5的样本:裂解液体积比，磷酸盐洗脱液是5和20 mM。其它温度和其它样本体积比例可改变相对回收率。用来洗脱靶标的磷酸盐的量也可对靶标回收率有影响。
进行另外的实验以再次测试金属氧化物和金属-钛氧化物。以下颗粒被测试：
Mg、Mn、Sn、Ti、Zn氧化物涂布的颗粒
Fe3O4颗粒
Al-Ti、Ca-Ti、Co-Ti、Cu-Ti、Fe2-Ti、Fe3-Ti、Mg-Ti、Mn-Ti、Ni-Ti、Sn-Ti和Zn-Ti氧化物涂布的颗粒。
如上所述制备和测试颗粒。图42A-F显示HIV数据。图43A-F显示HBV数据。金属氧化物和金属氧化物-钛氧化物沉淀物涂布的颗粒显示不同的RNA和DNA结合。为比较RNA和DNA的相对回收率，循环阈值(CT)被用来计算靶标对给出最佳回收率的颗粒的相对回收率。如于图44所示的，磁性颗粒上的特定金属氧化物和金属氧化物-钛氧化物的组合的涂层具有不同的DNA和RNA结合特性。在该实验中测试的所有氧化物显示一些核酸回收。在测试条件下用于纯化RNA的最佳氧化物涂层是Cu-Ti、Mg-Ti、Sn和Zn氧化物。在测试条件下用于纯化DNA的最佳氧化物涂层是Fe3-Ti和Mn氧化物。在测试条件下用于纯化RNA和DNA二者的最佳氧化物涂层是Mn-Ti和Sn-Ti氧化物。回收率依赖于金属氧化物在测试条件下结合核酸，在洗涤条件下保留核酸以及在洗脱条件下释放结合的核酸的能力。
Figure 395089DEST_PATH_IMAGE016
本说明书中提及的所有专利、专利申请公报、杂志文章、教科书和其它出版物是本公开内容所属领域技术人员的技术水平的指示。所有这样的出版物均通过引用结合到本文中，如同各个独立的出版物特别地和单独地指明通过引用结合到本文中的相同程度。

Claims (13)

1.一种试剂盒，其包含：
a) 包含金属氧化物或用金属氧化物涂布的颗粒或固体表面，其中所述金属氧化物选自由Cu氧化物-Ti氧化物和Mg氧化物-Ti氧化物组成的组；和
b) 洗脱缓冲液；
其中所述洗脱缓冲液包含以0.5-20 mM的浓度的磷酸盐。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述金属氧化物是Cu氧化物-Ti氧化物。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述Cu氧化物-Ti氧化物以0.5:1-5:1的Cu氧化物:Ti氧化物的比例存在。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述金属氧化物是所述金属氧化物的无水或水合形式。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述颗粒的直径是0.5-50 µm。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述颗粒的直径是1.0-5.0 µm。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述颗粒或固体表面包含聚合物、磁性材料、金属材料、无机固体，或其组合。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述无机固体是二氧化硅。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述固体表面具有选自平板、针状、立方形、管状、纤维状、柱状和无定形的形状。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述磷酸盐是无机或有机磷酸盐。
11.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述磷酸盐以4-6 mM的浓度在于所述洗脱缓冲液中。
12.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述磷酸盐以5 mM的浓度存在于所述洗脱缓冲液中。
13.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述颗粒或固体表面优先结合RNA。
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