JP2001513985A

JP2001513985A - プレセニリン１遺伝子プロモーター

Info

Publication number: JP2001513985A
Application number: JP2000507694A
Authority: JP
Inventors: ヴィテク，ピー・マイケル; ミツダ，ノリアキ; ローズィズ，アレン・ディー
Original assignee: デューク・ユニヴァーシティ
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2001-09-11
Also published as: CA2302433A1; AU9295798A; WO1999010368A9; EP1009754A1; AU743143B2; AU743143C; US6255473B1; EP1009754A4; WO1999010368A1

Abstract

(57)【要約】哺乳動物細胞における下流異種ＤＮＡセグメント（プロモーターセグメント）のニューロン特異的転写を指令する単離されたＤＮＡ分子を開示する。この単離されたＤＮＡ分子は、マウスのゲノムプレセニリン１ＤＮＡからのプロモーターセグメント、またはこのようなＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ配列を含有し、哺乳動物細胞において下流異種ＤＮＡセグメントのニューロン特異的転写を指令する。このようなプロモーターセグメントを含むＤＮＡ構築物およびその種々の用途も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、国立予防衛生研究所からの補助金ＲＯ１ＡＧ−１３８３９の下で
政府の支持によりなされた。政府は本発明の権利を有している。

【０００２】（発明の分野）本発明は、ゲノムのプレセニリン１(Presenilin-1)遺伝子構築物、およびその
調節領域、および該プレセニリン１遺伝子構築物を用いる組換えＤＮＡ構築物に
関する。

【０００３】（発明の背景）アルツハイマー病（Alzheimer's disease; ＡＤ）は破壊的な神経学的疾患であって、痴呆症の最も通常の原因である。この障害の遺伝学的解析により、複数
遺伝子が関与していることが示唆されている。現在、第２１染色体上のアミロイ
ド前駆体タンパク質（Amyloid Precursor Protein; ＡＰＰ）（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３６０、６７２−６７４（１９９２）；Ｓｕｚｕｋｉ，
Ｎ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６４、１３３６−１３４０（１９９４））、第１９
染色体上のアポリポタンパク質Ｅ（Apolipoprotein-E: ＡＰＯＥ）遺伝子（Ｃｏ
ｒｄｅｒ，Ｅ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１、９２１−９２３（１９９３）
；Ｃｏｒｄｅｒ，Ｅ．Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７、１８０−１８４（１９
９４）；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０、１９７７−８１（１９９３））、第１４染色体
上のプレセニリン１（ＰＳ−１）遺伝子（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．ら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３７５、７５４−７６０（１９９５））および第１染色体上のプレ
セニリン−２（ＰＳ−２）遺伝子（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２６９、９７３−９７７（１９９５））を含む、４つの遺伝子の突然変異
がアルツハイマー病表現型に関連することが見いだされている。第１２染色体上
の未知の遺伝子が、後期開始ＡＤ患者の大きな割合に関連しているように見える
（Ｓｔｅｐｈａｎｓｏｎ，Ｊ．、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｏｃ．２７７、７７５
（１９９７））。家系性アルツハイマー病の大部分はＰＳ−１における突然変異
に関連付けられている。現在、３０を超える独立したＰＳ−１遺伝子における突
然変異が、若年性表現型を呈する非関連アルツハイマー病家族に記載されている
。これらの突然変異のほとんどは、その結果、単一のアミノ酸変化が起こるミス
センス突然変異である（Ｗａｓｃｏ，Ｗ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１、８４８（１
９９５）；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓＤｉｓｅａｓｅＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＧｒｏｕｐ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１、２１９−２２２（１９９５）；
Ｃａｍｐｉｏｎ，Ｄ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４、２３７３−２３７
７（１９９５）；Ｃｒｕｔｓ，Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４、２３
６３−２３７１（１９９５）；Ｂｏｔｅｖａ，Ｋ．ら、Ｌａｎｃｅｔ３４７、
１３０−１３１（１９９６）；Ｒｏｓｓｏｒ，Ｍ．ら、Ｌａｎｃｅｔ３４７、
１５６０（１９９６）；Ｋａｍｉｎｏ，Ｋ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．２
０８、１９５−１９８（１９９６））。

【０００４】エクソン４およびエクソン９で見いだされる欠失は、異なるスプライシングに
よって生起するＲＮＡ転写物のいくつかの先端欠損を行うのでさらなる突然変異
を引き起こす（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｕｒ，Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．７、２
９７−３０１（１９９５））。当該タンパク質内のこれらの突然変異のクラスタ
リングは、機能的に重要なドメインの位置を示唆するが、プレセニリンタンパク
質の正確な機能は活動的に調査されている事項である。

【０００５】遺伝子機能を見いだすための１つのプローチは、ＰＳ−１遺伝子発現の調節を
研究することである。in situハイブリダイゼーションを用い、我々及び他野研究者は、ＰＳ−１ｍＲＮＡが脳のニューロンにおいて非常に高度に発現されるこ
とを示した（Ｋｏｒａｃｓ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２、２２４−２２９
（１９９６））。免疫組織化学により、ＰＳ−１タンパク質がニューロンで豊富
であるが、アミロイドプラークおよびいくつかの膠細胞タイプにも関連すること
が明らかとなった（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２、８６４−
８７０（１９９６）；Ｌａｈ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７、１９７１
−１９８０（１９９７））。対照的に、Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎらは、ＰＳ−１
のｍＲＮＡが体全体の種々の器官で広く発現されることを報告した（Ｎａｔｕｒ
ｅ３７５、７５４−７６０（１９９５））。これは、何故ＰＳ−１遺伝子産物
における突然変異が、その末梢器官に対する明らかな影響を及ぼすことなく、家
系性アルツハイマー病患者において病気状態を付与するように見えるという疑問
を生起する。この状況は、さらに、複雑化する。なぜならば、ＰＳ−１のｍＲＮ
ＡおよびＦＡＤ患者および年齢にあった健康な対照からのタンパク質レベルは報
告されておらず、ＰＳ−１遺伝子発現の異常調節がこのような病気状態にさらに
寄与する可能性を開くからである。

【０００６】ＰＳ−１遺伝子のプロモーターおよび非タンパク質コーディング領域における
突然変異は知られておらず、遺伝子の野生型配列に関する報告が欠けている。同
様に、転写を促進する遺伝子の能力の機能的解析は報告されていない。ＰＳ−１
ノックアウトマウスが胚致死的であるという最近の報告（Ｓｈｅｎ，Ｊ．ら、Ｃ
ｅｌｌ８９、６２９−６３９（１９９７））と組み合わせて、ＰＳ−１遺伝子
配列およびその転写調節の知識は、正常および病気状態双方におけるＰＳ−１機
能を同定するのを助ける重要な手掛かりなはずである。

【０００７】（発明の概要）我々は、本明細書にマウスのプレセニリン１遺伝子の完全な配列を記載する。
この配列は、２つの独立した転写開始部位があることを示した。これらの開始部
位を囲むＤＮＡ領域の機能的テストは、それらが、共に、エクソン１Ａの＋１位
を含む単一の主要プロモーターによって明らかに制御されることを示した。この
プロモーターは、また、かなり興味深い。なぜならば、それはニューロン様細胞
で非常に活性が高いからである。今や、さらなる特徴付けは、陽性および陰性Ｄ
ＮＡエレメントおよびプレセニリン１遺伝子の発現を制御するように機能する転
写因子を完全に記載できる状態まで進行することができる。

【０００８】従って、本発明の第１の態様は、哺乳動物細胞において下流の異種ＤＮＡセグ
メントのニューロン特異的転写を指令する単離されたＤＮＡ分子であって、（ａ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−３２７位から−２０６位に
わたる配列（＋１位はエクソン１Ａの転写開始部位を示す）、（ｂ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−４４９位から＋１１７１位
にわたる配列、（ｃ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−９位から＋１６位にわたる
配列（配列AGGCCGGAAGTTGCGACACCGGTGA（配列番号１））、および（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列を有する単離されたＤＮＡにハ
イブリダイズし、哺乳動物細胞において下流の異種ＤＮＡセグメントのニューロ
ン特異的転写を指令するＤＮＡ配列からなる群から選択される配列を有する前記単離されたＤＮＡ分子である。

【０００９】「ニューロン特異的」とは、下流異種ＤＮＡがニューロンにおいて優先的に転
写されまたは発現される限り、任意のレベルの特異性を意味する。「ニューロン
」とは、当業者によく知られているように、シグナルを送る刺激可能な細胞を意
味する（例えば、脳皮質のニューロン）。

【００１０】本発明の第２の態様は、５’から３’の方向に、上述のＤＮＡ配列からなるプ
ロモーターセグメントと、該プロモーターセグメントから下流に位置し、それに
作動可能に結合した異種ＤＮＡセグメントとを含む、発現カセットを含むＤＮＡ
構築物である。

【００１１】本発明の第３の態様は、前記したＤＮＡ構築物を含有する神経細胞である。本発明の第４の態様は、トランスジェニック非ヒト動物を作出する方法である
。この方法は、動物細胞を前述の発現カセットにより形質転換し、次いで、この
形質転換動物細胞から動物を再生することを含む。

【００１２】本発明の第５の態様はトランスジェニック非ヒト動物であって、動物の全細胞
又は細胞のいくつかが前述の異種発現カセットを含有する。本発明の前記および他の目的および態様は、図面および以下の明細書で詳細に
説明する。

【００１３】（図面の簡単な説明）図１．マウス脳からの３つの異なるプレセニリン１転写物の構造。マウス脳ｃ
ＤＮＡの５’ＲＡＣＥのクローン化産物およびＤＮＡ配列決定により、垂直矢印
によってマークされた２つのユニークな転写開始部位に由来するように見える３
つの独立した転写物（Ａ、ＢおよびＣ）の存在が明らかにされた。２つの転写開
始部位の間の距離は４１０ｂｐである。エクソン１Ａ、１Ｂおよび１Ｃのサイズ
は、各々、１４１ｂｐ、３７１ｂｐおよび１３９ｂｐである。

【００１４】図２．クローニングおよび配列決定戦略はマウスのプレセニリン１遺伝子のエ
クソン−イントロン構造を解明する。

【００１５】図２Ａ．スクリーニング戦略。「スクリーニングＡ」は、プローブＡ（塗りつ
ぶした四角）としてマウスＰＳ−１ｃＤＮＡの断片を利用して、マウスＰＳ−１
ゲノムＤＮＡ（二本線として表す）のラムダファージクローンを同定した。「ス
クリーニングＢ」はＰＣＲプライマーを利用して、ハッチングを施した水平の四
角によって表されるように、マウスＰＳ−１遺伝子、Ｐ１−１０８０９のＰ１ク
ローンを同定した。

【００１６】図２Ｂ．配列決定戦略。ラムダファージクローンおよびＰ１−１０８０９を制
限酵素処理し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）ベクターにサブクロ
ーニングした。濃い線はＰ１−１０８０９で見出されるＰＳ−１ゲノムＤＮＡの
対応する領域からの個々のプラスミドサブクローンに対応する。二重矢印は、直
接的に配列決定したＰ１−１０８０９鋳型からのＰＣＲ産物を表す。制限エンド
ヌクレアーゼは、ＨはＨｉｎｄＩＩＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＮはＮｏｔＩ、ＸはＸ
ｈｏＩを略したものである。

【００１７】図２Ｃ．マウスＰＳ−１遺伝子のエクソン−イントロン構造。エクソンは四角
で囲まれ、二重線はイントロンを表す。塗りつぶした四角および塗りつぶさない
四角は、各々、タンパク質コーディング領域および非翻訳領域に対応する。翻訳
開始コドンＡＴＧは、位置＋１１，４２０で開始し、翻訳終止コドンＴＡＧは＋
４５，６２７にあり、推定ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＴＡＡ）は位置＋４
６，６１２にある。

【００１８】図３．マウスおよびヒトのプレセニリン１プロモーターの比較。マウスＰＳ−
１の転写は、エクソン１Ａの位置＋１の「Ｇ」で開始し、ヒトＰＳ−１の転写は
、「Ａ」で開始する（データは示さず）。ナショナルセンターバイオテクノロジ
ーインフォメーション（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から入手可能なＢＬＡＳＴネットワークサ
ービスによるＤＮＡ配列類似性検索によって、マウス／ヒト相同性の領域が両遺
伝子についての転写開始の周りで見出される。転写因子ＥＴＳ１およびＳＰ１に
ついてのコンセンサス結合部位には下線を施され、これらはマウスおよびヒト遺
伝子双方で保存されている。

【００１９】図４．マウスＰＳ−１プロモーター領域のヌクレオチド配列。垂直矢印でマー
クされた２つの転写開始部位の近傍のマウスＰＳ−１遺伝子の配列が示されてい
る。いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位に下線を施し、種々のプロモーター
エレメントは四角で囲み、ラベルを付す。エクソン１Ａおよびエクソン１Ｂは二
重に下線を施す。

【００２０】図５．マウスのプレセニリン１のプロモーター−レポーター構築物およびそれ
らの相対的ルシフェラーゼ活性（％ＲＬＡ）。

【００２１】図５Ａ．ＰＳ−１プロモーターの構造組織。頂部の線は、プロモーター活性に
ついて分析されたＰＳ−１遺伝子の領域を表し、エクソン１Ａおよびエクソン１
Ｂについての四角にラベルを付した。塗りつぶしていない四角は、プラスミドｐ
ＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のホタルのルシフェラーゼレポーター
遺伝子の上流にクローニングされたマウスＰＳ−１遺伝子（頂部線）に対応する
ゲノムＤＮＡ断片を表す。四角は、左側に、ＬＵＣ番号としてプロモーター−レ
ポータープラスミドの名称と、エクソン１Ａの開始における「Ｇ」である＋１に
基づいた断片の５’末端のヌクレオチド数とによるラベルを付けた。四角上方の
文字は、制限酵素切断部位を指す。四角のすぐ右の番号は、プロモーター断片の
３’末端を指す。右側の番号は、材料および方法に記載されたように計算された
相対的ルシフェラーゼ活性（％ＲＬＡ）のパーセントであり、かっこ内に構築物
が細胞にトランスフェクトされその活性が測定された回数が続く。

【００２２】図５Ｂ．ＰＳ−１プロモーターの微細構造マップおよびプロモーター−レポー
ター構築物活性戦略。頂部線は、推定プロモーターエレメント、エクソン１Ａ、
エクソン１Ｂおよびラベルの付けられた制限酵素部位の位置と共にＰＳ−１遺伝
子の領域を表す。プロモーター−レポーター構築物の四角は、（Ａ）と同様であ
る。四角の上方の文字は、図３に示したプロモーター断片の末端をいう。

【００２３】図６．細胞型特異的ＰＳ−１プロモーター活性。ＰＳ−１プロモーター−レポ
ーター構築物ＬＵＣ２９、ＬＵＣ２７、ＬＵＣ４、ＬＵＣ３およびＬＵＣ１を、
Ｎｅｕｒｏ２ａ神経芽細胞腫（Ｎ２ａ）、未分化Ｐ１９（Ｐ１９）、レチノイン
酸で分化したニューロン様Ｐ１９（Ｐ１９Ｎ）、ジメチルスルホキシドで分化し
た筋肉様Ｐ１９（Ｐ１９Ｍ）およびＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞に一過的にトラン
スフェクトした。ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）における
ＳＶ４０プロモーター駆動ホタル・ルシフェラーゼおよびｐＲＬ−ＴＫ（チミジ
ンキナーゼプロモーター駆動Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子）もまた、各
々、外部および内部対照として各細胞系に一過的にトランスェクトした。プラス
ミドの全ての組合せからのルシフェラーゼ活性を測定した後、相対的ルシフェラ
ーゼ活性の指標（ＩＲＬＡ）をＲＬＡ／ＲＬＡ_SV40として計算した（ここに、Ｒ
ＬＡ_SV40は外部対照におけるホタルのルシフェラーゼのシグナルを内部対照にお
けるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのシグナルで割った比率であり、異なる細胞
系における異なるプロモーター断片の活性を比較するためである）。Ｎ２ａ細胞
にトランスェクトしたプラスミドＬＵＣ２９は、我々が１００％活性と定義した
最大ＩＲＬＡ値を示した。

【００２４】（発明の詳細な記載）ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に、左から右に、一本鎖のみによっ
て明細書に示される。ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会に
よって推奨される方法で表される。

【００２５】本発明のニューロン特異的プロモーターの特別の例は、以下ののマウスのプレ
セニリン１遺伝子プロモーターセグメントを含むＤＮＡ分子を含んでなるが、こ
れらに、限定されるものではない。 −４４０位から＋９１位、 −３５２位から＋９１位、 −３２７位から＋９１位、 −２７６位から＋９１位、 −２６１位から＋９１位、 −２１５位から＋９１位、 −１９２位から＋９１位、 −１２４位から＋９１位、 −８７位から＋９１位、 −３２位から＋９１位のマウスのプレセニリン１遺伝子。

【００２６】 −２７６位から＋５１９位、 −２７６位から＋２０６位、 −２７６位から＋１４８位、 −２７６位から＋４１位のマウスのプレセニリン１遺伝子。

【００２７】 −８７位から＋４１位、 −９位から＋１６位、 −３２７位から＋２０６位のマウスのプレセニリン１遺伝子。

【００２８】また、ラット、ネコ、イヌ、サル、またはヒトのような他の哺乳動物種のプレ
セニリン１遺伝子からの対応する断片を使用して、下記に詳細に記載するように
本発明を実施することができる。

【００２９】本発明のプロモーターはいずれかの動物種起源であってよいが、好ましくは哺
乳動物起源（例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、サル、ヒト）である。本発
明を実施するのに使用されるプロモーターは、一般に、前記したマウスのセグメ
ントに実質的に相同である。本明細書で用いるように、プロモーター機能に必要
なそれらのＤＮＡ結合能が本明細書に記載された種々のマウスのプロモーターセ
グメントに相同である場合、このような領域は「実質的に相同」である。一般に
、このような領域は本明細書に記載された種々のマウスのプロモーターセグメン
トに少なくとも７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％または９５％相
同である。前記配列に近傍の領域の他の配列断片、またはそれに対する少しの付
加、欠失または置換を調整することは可能であり、それらは、プレセニリン１遺
伝子プロモーターの機能を実行するであろうことは明らかであろう。また、それ
らは、特異的転写因子タンパク質へのそれらの結合および／または転写を促進す
るそれらの機能によって同定することもできる。

【００３０】ニューロン特異的遺伝子プロモーターをコードする天然ＤＮＡセグメントまた
は哺乳動物ＤＮＡセグメントのような他のＤＮＡセグメントは、前記した断片へ
のそれらの結合またはハイブリダイゼーションによって同定することができる。
このようなＤＮＡ配列が、本明細書に示したＤＮＡ配列にハイブリダイズするで
あろうハイブリダイゼーション条件は当該分野で公知である。例えば、このよう
な配列の本明細書で開示されたＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、４２℃で
１５分間の２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件にて、
４２℃で、１００μｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡおよび５％デキストラン硫酸を含む
、２５％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５×デンハルトの溶液中で行って、約６０
％相同性の配列のハイブリダイゼーションを可能とすることができる。より厳格
な条件は、標準的なハイブリダイゼーションアッセイを用いる６０℃または７０
℃における０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤ
Ｓの洗浄ストリンジェンシー（厳密性）によって表される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、１９８９）（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）参照）。

【００３１】本明細書で用いる「作動可能に結合した」という用語は、一方の機能が他方に
よって影響されるように連結された単一のＤＮＡ分子内に含有されるＤＮＡ配列
をいう。かくして、プロモーターは、遺伝子の発現に影響できる（すなわち、該
遺伝子がプロモーターの転写制御下にある）場合には、その遺伝子（または注目
する他のＤＮＡ）に作動可能に結合している。このようなプロモーターは、遺伝
子（または注目する他のＤＮＡ）から「上流」にあると言われ、該遺伝子は該プ
ロモーターから「下流」にあると言われる。

【００３２】本発明のＤＮＡ構築物、または「発現カセット」は、転写の５’から３’の方
向に、本発明のプロモーター、該プロモーターに作動可能に結合した異種ＤＮＡ
セグメント、および任意選択的に、終止シグナルおよびポリアデニル化シグナル
のような転写および翻訳終止領域を含む。これらの調節領域の全ては形質転換細
胞において作動することができるはずである。３’終止領域は、転写開始領域と
同一の遺伝子に、または異なる遺伝子に由来し得る。発現カセットは、少なくと
も１つのレプリコン系も有するＤＮＡ構築物中に設けることができる。

【００３３】本明細書で用いる「異種遺伝子」または「異種ＤＮＡセグメント」という用語
は、遺伝子工学技術によって細胞を形質転換するのに用いられ、細胞中で天然に
生じ得ない遺伝子（またはＤＮＡセグメント）を意味する。構造遺伝子は、タン
パク質、ポリペプチド、またはその一部を、恐らくは、リボソーム結合部位およ
び／または翻訳開始コドンをもコードするが、プロモーターを欠くＤＮＡセグメ
ントを含む遺伝子の部分である。この用語は、細胞内で天然に見いだされるが、
人工的に導入された構造遺伝子のコピーも言うことができる。構造遺伝子は、当
該遺伝子が導入される細胞タイプで通常は見いだされないタンパク質をコードす
ることができ、あるいはそれが作動可能に結合するプロモーターと組み合わせる
ことができる。本明細書で用いるように、異種ＤＮＡセグメントという用語は、
リボソームまたはアンチセンスＲＮＡのような非タンパク質産物をコードするＤ
ＮＡセグメントも包含する（例えば、米国特許第４，８０１，５４０号参照）。

【００３４】種々の構築物、発現カセット、マーカー等を含む種々の断片は、適当なレプリ
コン系の制限酵素切断および特定の構築物もしくは断片の利用可能な部位への挿
入によって順次に導入することができる。連結およびクローニングの後に、該Ｄ
ＮＡ構築物はさらなる操作のために単離することができる。これらの技術の全て
は文献で豊富に例示されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ１９８２）参照。

【００３５】本発明のプロモーターおよび種々の構築物は種々の異なる用途を有する。培養
で増殖した神経細胞は、本発明の構築物およびそこで発現された異種ＤＮＡで形
質転換して、タンパク質またはペプチドを生産することができ、次いで、このよ
うなタンパク質またはペプチドを引き続いての使用のために収集する（例えば、
このようなタンパク質またはペプチドは抗原をコードすることができ、これは、
診断アッセイで直接使用され、あるいは動物に注射されて抗原に対する抗体が生
産され、その抗体は診断アッセイで使用される）。トランスジェニック動物は、
後記で詳細に議論するように、本発明の構築物で生産することができる。該プロ
モーターは遺伝子治療ベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクターのようなウ
イルスベクターおよびレトロウイルスのようなＲＮＡウイルス。この場合、プロ
モーターセグメントおよび異種セグメントは、ＤＮＡ転写物として宿主細胞に挿
入されたＤＮＡのＲＮＡ転写物として、あるいはレトロウイルスの場合はプロウ
イルスとして存在する）を含むベクターで使用することができる。異種ＤＮＡは
、治療剤（例えば、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３：神経成長因子、繊毛神経栄養
因子等）をコードする。神経細胞における異種ＤＮＡの優先的発現が望まれる。
本発明のプロモーターについての多数の他の使用は当業者に明らかであろう。前記したように、トランスジェニック動物を作出する方法も本発明の態様であ
る。この方法はいずれの適当な動物対象に対しても行うことができるが、好まし
くは、非ヒト哺乳動物で行う。ネズミ種または齧歯類（例えば、マウス、ラット
）が特に好ましい。

【００３６】この方法は、動物形質転換ベクター中の前記した発現カセットで動物細胞を形
質転換し、次いで、形質転換動物細胞からトランスジェニック動物を再生するこ
とを含む。形質転換ステップは、後記で詳細に記載するいずれかの適当な手段に
よって行うことができ、再生ステップもやはり後記にて詳細に記載するいずれか
の適当な手段によって行うことができる。該プロセスによってキメラ動物が生産
される場合、全ての細胞（例えば、体細胞および生殖細胞を含む）が形質転換さ
れた動物（前記した発現カセットは細胞のゲノムに安定に組み込まれている）は
、当該分野で公知のように、形質転換された生殖細胞を有するキメラ動物から再
生することができる。

【００３７】トランスジェニック動物の生産は、試験管内受精と組み合わせた、前核マイク
ロインジェクション、レトロウイルスによる胚の感染、胚幹細胞媒介技術、全染
色体セグメントの導入および生殖細胞トランスフェクションのようないかなる適
当な技術によっても行うことができる。例えば、一般には、ＣｈａｒｌｅｓＲ
ｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ（Ｓｕｍｍｅ
ｒ１９９１）。

【００３８】本発明の発現カセットを担持するトランスジェニック動物は、Ｔ．Ｗａｇｎｅ
ｒら、米国特許第４，８７３，１９１号に記載されているように、接合体の遺伝
的形質転換によって生産することができる（出願人は、ここに引用された米国特
許文献の開示を引用することによって本明細書の一部とすることを意図する）。

【００３９】さらなる技術において、形質転換されるべき種からの多能性胚幹細胞を誘導し
、発現カセットを幹細胞に挿入し、１以上の幹細胞を形質転換すべき動物の胚盤
胞のような初期胚に挿入することができ、動物を適当な雌宿主中で誕生まで育て
ることができる（例えば、Ｍ．Ｅｖａｎｓ、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０３４３２）
。ＤＮＡおよび胚の混合物を電気放電に付すことによってトランスジェニック動
物を生産する方法は、Ｘ．Ｚｈａｏらに対する米国特許第５，５６７，６０７号
に記載されている。哺乳動物発現ベクターは、Ｊ．Ｓｉｍｉｔｈらに対する米国
特許第５，６２７，０３３号に記載されている。

【００４０】本発明の動物はプレセニリン１遺伝子の機能を研究するため、アルツハイマー
病の病因を研究するため、およびアルツハイマー病を治療する際に種々の薬物お
よび薬物候補の活性を研究するために実験室モデルとして有用である。このよう
な動物において、内因性プレセニリン１遺伝子は活性でも不活性でもよい。内因
性プレセニリン１遺伝子は、相同組換えのような公知の技術に従ってプレセニリ
ン１遺伝子の「ノックアウト」によって不活化することができる。例えば、Ｏ．
Ｓｍｉｔｈｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ３１７、３２０（１９８５）参照。

【００４１】後述の実施例において、略語を用いる。Ｂｐは塩基対、ＰＥＡ−３はポリオー
マウイルスエンハンサーアクチベーター３(polyoma virus enhancer activator-
3)、ＰＳ−１はプレセニリン１(presenilin-1)、５’−ＲＡＣＥは５’−ｃＤＮ
Ａ末端の迅速増幅技術(rapid amplification of 5'-cDNA ends)、Ｎ２ａはＮｅｕｒｏ２ａ細胞、Ｐ１９Ｎはニューロン様分化Ｐ１９細胞、Ｐ１９Ｍは筋肉様分
化Ｐ１９細胞、ＲＬＡは相対的ルシフェラーゼ活性、ＩＲＬＡは相対的ルシフェ
ラーゼ活性の指標である。

【００４２】（実験手法）ゲノムクローンの単離および特徴付け−−標識オリゴヌクレオチドおよびマウ
スＰＳ−１ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、ゲノムＰＳ−１クローンについてのマウス
ライブラリーをスクリーニングするのにプローブとして用いた。マウスＰＳ−１
ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ４２１７７）に基づき、次の配列、 5'- CGGAGAGAGAAGGAACCAAC-3'（配列番号２）の上流プライマーおよび次の配列、 5'-TCAGCTCTTCGTCTTCCTCCTCATC-3'（配列番号３）の下流プライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってマウスＰＳ−１
ｃＤＮＡの一部を増幅するための鋳型として、ＱｕｉｃｋＣｌｏｎｅＭｏｕ
ｓｅＢｒａｉｎｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に用いられた。増幅反応
は、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ＭｇＣｌ₂（１．５ｍＭ）、ｄＡＴＰ、ｇＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．２ｍＭ、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、０．５μＭのＤＮＡプライマー、１μｌｃＤＮＡ鋳型
（０．１ｎｇ）およびＡｍｐｌｉ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット、
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する１００μｌ中で行った。反応サイクルは
、９５℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で２分間を合計３０サイクル行
った。このＰＣＲ産物をゲル精製し、アルファ−³²Ｐ−ｄＣＴＰおよびランダム
プライマーＤＮＡラベリングシステム（ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｒｓＤＮＡ
ＬａｂｅｌｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ）（Ｇｉｂｃｏ）で標識した。標識プロー
ブを用いて、記載されているように（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｒｏｔｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））、ＬａｍｂｄａＦｉｘ−ＩＩベクター（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）中のマウス株１２９／ＳＶＪゲノムライブラリーを通常にスクリ
ーニングした。スクリーニングは、４つのＰｈ−１、Ｐｈ−２、Ｐｈ−３および
Ｐｈ−４と命名される独立したファージクローンを同定した（図２）。ＮｏｔＩ
および／またはＥｃｏＲＩでの消化に続き、ＤＮＡ連結キット（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）を用い、制限酵素断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ−ＫＳ（＋）フ
ァジミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローンした。ＤＮＡ配列は
、製造業者によって推奨される染色ターミネーター化学およびプロトコルにてＡ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａ自動ＤＮＡ配列合成器を用
いて決定した。マウスＰＳ−１ｃＤＮＡの５’非翻訳領域からのさらなるオリゴ
ヌクレオチドプローブを³²Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標
識し、それを用いて、ハイブリダイゼーションによってプラスミドサブクローン
を同定した。ファージクローンＰｈ−２の部分配列に基づいて、 GATCACAGTCTAGGTTGCTGGTGTG（配列番号４）についてのＰＣＲプライマー１Ｃ−ＵＳおよび TGGGGCAAGGG ACACAAATAAG（配列番号５）についての１Ｃ−ＵＳ−ｒｅｖを用いて、ＰＣＲによってＰ１ベクター（Ｇｅｎ
ｏｍｅＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）においてマウスＥＳ−１２９／ＳＶＪゲノ
ムライブラリーをスクリーニングした。３つの同定されているＰ１クローンのう
ち、Ｐ１−１０８０９をＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化し、これらの制
限酵素断片をサブクローニングし、前記したように配列決定した。

【００４３】ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅、すなわちＲＡＣＥ：−−マウス−脳Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（雄ＢＡＬＢ／ｃ、９−１１週齢、Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）を用い、ＰＳ−１ｃＤＮＡの５’末端を同定した。略言すれば、０．２μ
ＭのＰＳ−１−特異的逆方向プライマーである TGGCTCAGGGTTGTCAAGTC（配列番号６）、０．２μＭのＣｌｏｎｔｅｃｈＡＰ１アダプタープライマーである CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号７）、２．５ｎｇのＭａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｇ
ｉｂｃｏ）、ＭｇＣｌ₂（１．５ｍＭ）、ＤＭＳＯ（５％）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．２ｍＭ）、およびＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼ（５ユニット、Ｇｉｂｃｏ）を含有する５０μｌのＰＣＲ反応を、４５秒
間の９５℃、３０秒間の５５℃および９０秒間の７２℃の反応サイクルに最初の
増幅工程において合計３０サイクルとして用いた。１００μｌの第２のＰＣＲ増
幅工程は、１５１〜１３０位の逆方向の０．５μＭのマウスＰＳ−１特異的逆方
向プライマーである CAAACCTCTTGGGATTCTTTC（配列番号８）および０．５μＭのネストされたＣｌｏｎｔｅｃｈアダプタープライマーＡＰ２
ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC（配列番号９）および０．０１μｌの第１のＰＣＲ増幅、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）、Ｍ
ｇＣｌ₂（１．５ｍＭ）、ＤＭＳＯ（５％）、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ（各々０．２ｍＭ）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５ユニッ
ト、Ｇｉｂｃｏ）を含有し、第１の増幅工程と同一のサイクリングパラメーター
を持つものであった。いくつかの第２のＰＣＲ反応において、ＰＳ−１逆方向プ
ライマー１０１〜８０位の逆方向の AAGACCTCGAAGGGCTGCTGTC（配列番号１０）を用いた。ＲＡＣＥ増幅産物を、ＴＡＥにて実行する２％アガロースゲル上の電
気泳動に付し、臭化エチジウムおよび紫外線で可視化し、ウィザードＰＣＲプレ
ップスＤＮＡ浄化システム（ＷｉｚａｒｄＰＣＲＰｒｅｐｓＤＮＡＰｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）でゲルマトリックス
から抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、コンピテント
ＤＨ５−アルファ細胞（Ｇｉｂｃｏ）に形質転換した。アンピシリン耐性クロー
ンを、上記のように制限酵素で消化し、種々のプライマー組合せでのＰＣＲ増幅
およびＤＮＡ配列決定によって特徴付けた。

【００４４】配列類似性の計算−−マウスＰＳ−１プロモーターと他の真核生物プロモータ
ー配列との比較は、ＢＬＡＳＴネットワークサービスおよびバイオテクノロジー
情報についてのナショナル・センターから入手可能なＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰ
ｒｏｍｏｔｅｒデータベース（ＥＰＤ）Ｒｅｌｅａｓｅ４５を用いて行った。

【００４５】ＰＳ−１プロモーター−ホタルルシフェラーゼのレポーターの構築：−−推定
ＰＳ−１プロモーターの一部を含有するマウスのゲノムＤＮＡ断片を、ホタルの
ルシフェラーゼ遺伝子の上流のプロモーターを持たないｐＧＬ３基本ベクター（
Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。ゲノムＤＮＡの配列に基づき、Ｘｈ
ｏＩ部位を順方向プライマーに、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を逆方向プライマーに組み
込むようにＰＣＲプライマーを設計した。ゲノムＤＮＡ（図２参照）における異
なる位置に対応するこれらのプライマーを用いて、上記のように断片をＰＣＲ増
幅し、これをＷｉｚａｒｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）で精製し、適当な制限酵素で消化し、Ｗｉｚａｒｄキットで再度精製
した。切断されたＰＣＲ産物を同一制限酵素で切断したｐＧＬ３プラスミドに連
結し、コンピテント細菌に形質転換し、挿入断片を持つプラスミドを含有するク
ローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。

【００４６】真核生物細胞培養およびトランスフェクション：−−マウスＮｅｕｒｏ２ａ−
神経芽細胞腫細胞、マウスＰ１９胚カルシノーマおよびマウスＮＩＨ／３Ｔ３繊
維芽細胞はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）から得た。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞は、Ｅａｒｌｅの塩（Ｇｉｂｃｏ
）＋１０％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｇｉ
ｂｃｏ）を含む最小必須培地でルーチン的に増殖させた。Ｐ１９細胞はアルファ
−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋２．５％胎児ウシ血清＋７．５％ウシ血清（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ）中でルーチン的に増殖させた。０．５μＭトランスレチノイン酸による
処理に続き、Ｐ１９細胞はニューロン様細胞に分化した（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌ
ｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２２７１−２２７９
（１９８３））。１％ジメチルスルホキシドでの処理に続き、Ｐ１９細胞は筋肉
様細胞に分化した（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３
、２２８０−２２８６（１９８３））。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞はＤＭＥＭ（Ｇｉｂ
ｃｏ）＋１０％胎児ウシ血清中でルーチン的に増殖させた。

【００４７】一過性トランスフェクションでは、Ｎｅｕｒｏ２ａ、Ｐ１９、レチノイン酸処
理−Ｐ１９、ＤＭＳＯ−処理Ｐ１９およびＮＩＨ／３Ｔ３細胞をウェル当たり９
×１０⁴細胞にて６ウェル組織培養皿中で平板培養し、１日間回収させた。次いで、製造業者のプロトコルに記載されているＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ手法（Ｇｉｂ
ｃｏ）を用い、ＰＳ−１−プロモーター−レポーター構築物を含有する細胞を、
０．３ピコモルのプロモーター−ホタルのルシフェラーゼプラスミドのうちの１
つであるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の上流にＳＶ４０プロモーターを含有す
るｐＧＬ３基本的ベクター、またはｐＧＬ３プロモータープラスミド（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ）、およびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の上流に単純疱疹ウイル
スチミジンキナーゼプロモーターを含有する０．３ピコモルのｐＲＬ−ＴＫプラ
スミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）で共トランスフェクトした。

【００４８】相対的ルシフェラーゼ活性尺度−−トランスフェクトした細胞を２４時間培養
し、２ｍｌのＣａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないＰＢＳで２回洗浄し、Ｐａｓｓｉｖ
ｅ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させた。デュアル−ルシフェラーゼレポ
ーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒ
ＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびモデルＴＤ−２０Ｅ
Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎ）を用いて、ホタルルシ
フェラーゼおよびＲｅｎｉｌｌａ（ｓｅａｐａｎｓｙ）ルシフェラーゼ活性を
順次測定した。ホタルルシフェラーゼのシグナル（ＬＡ_F）およびＲｅｎｉｌｌａ（ｓｅａｐａｎｓｙ）ルシフェラーゼのシグナル（ＬＡ_F）を測定した後、相対的ルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）を以下のように計算した：ＲＬＡ＝ＬＡ_F ／ＬＡ_R（ここに、相対的ＲＬＡはパーセントとして計算した、すなわち、％ＲＬＡ＝ＲＬＡ／（ＲＬＡ）_max）。ある細胞系における相対的ルシフェラーゼ活性をもう１つの細胞系におけるものと比較するために、相対的ルシフェラーゼ活
性の指標を以下のように計算した：ＩＲＬＡ＝ＲＬＡ／ＲＬＡ_SV40（ここに、Ｒ
ＬＡ_SV40はｐＧＬ３におけるＳＶ４０プロモーターでホタル・ルシフェラーゼの
シグナルをｐＲＬ−ＴＫにおけるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼのシグナルで割
った比率である。

【００４９】（結果）ＲＡＣＥは複数の転写物を検出する：−−ＰＳ−１プロモーターのクローニン
グに先駆けて、ｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）技術の迅速増幅によってマウス脳ＰＳ
−１ｍＲＮＡの正確な５’末端を同定した。マウスＰＳ−１のエクソン２で見い
だされるアンチセンスオリゴヌクレオチド「１０１−８０−ｒｅｖｅｒｓｅ」を
持つ５’−ＲＡＣＥは、マウス脳ｍＲＮＡと相補的な一本鎖ｃＤＮＡ鋳型２１０
ｂｐの主たる広いバンドおよび４３０ｂｐの小さい方のバンドを与える（Ｍａｒ
ａｔｈｏｎＲｅａｄｙｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，データは示さず）。
これらのバンドの各々をアガロースゲルから単離し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、配列決定した。配列決定は、２つのユニ
ークな転写開始部位に由来するようである３つの異なるＰＳ−１転写物の存在を
明らかとした（図１）。この情報は、ＰＳ−１遺伝子が２つのプロモーターを含
有し得ること、および異なるスプライシングが複数の転写物を生じることを示唆
する。

【００５０】マウスＰＳ−１遺伝子の単離−プローブＡ、ネズミＰＳ−１ｃＤＮＡクローン
のエクソン２、３および４に対応する³²Ｐ−標識ＰＣＲプローブで、Ｌａｍｂｄ
ａ−ＦＩＸＩＩ中のマウスゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（
図２Ａ）。ポジティブにハイブリダイズするファージクローンのうち、４つが図
２Ｂに示したＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩでの制限マッピングのため選択された。
１つのファージクローン、Ｐｈ−２（図２Ｂ）のみが、マウスＰＳ−１ｃＤＮＡ
の５’非翻訳領域からのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。ファージア
ームからのプライマーは、ゲノムＤＮＡ挿入断片への配列決定を可能とした。図
２Ａに示すように、インサートの配列は、ＰＣＲプライマー対「１Ｃ−ＵＳ−順
方向および１Ｃ−ＵＳ−逆方向」が、マウスＰＳ−１ゲノムＤＮＡのＰ１クロー
ンを同定するのに選択され使用されるのを可能とする。クローンＰ１−１０８０
９は、これらのプライマーでの陽性ＰＣＲ反応生成物およびＰＳ−１ｃＤＮＡ断
片プローブＡに対するハイブリダイゼーションを介して同定した（図２）。次い
で、Ｐ１−１０８０９を制限酵素処理し、マップを作成し、図２Ｂにおける濃い
線によって示されるように、この全配列を複数のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ
−ＫＳ−（＋）プラスミドベクターにサブクローニングした。製造業者によって
供給されたプロトコルを用い、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３７３Ａ
自動ＤＮＡ配列決定器で各サブクローンを配列決定した。

【００５１】ＰＳ−１遺伝子のエクソン−イントロン構造の特徴付け−−Ｐ１−１０８０９
クローンのほとんど５０ｋＢｐの配列を、マウスＰＳ−１ｃＤＮＡ配列およびＭ
ａｃＶｅｃｔｏｒＤＮＡ分析プログラム（ＩＢＩ、ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＴ
）で整列させた相同性の領域と比較した。ＲＮＡ転写物の５’末端の最初のヌク
レオチドは、通常、遺伝子のエクソン１のヌクレオチド＋１と命名される。我々
の場合、ＰＳ−１は、我々が転写物Ａ、転写物Ｂおよび転写物Ｃと命名した３つ
の異なる長さのＲＮＡ転写物と会合した２つの異なる５’末端配列を有するよう
に見える。転写物Ａとゲノム配列との整列は、エクソン１における位置＋１とし
て慣用的に命名される「Ｇ」は転写開始部位に相当することを示す。プレセニリ
ン遺伝子のエクソン１Ａは位置＋１から＋１４１まで伸び、これは、その５’末
端が位置＋１１，２１０で開始して転写物Ａを与えるエクソン２にスプランシン
グされる。転写物ＢとゲノムＤＮＡとの整列は、位置＋１４１における「Ｃ」が
別の転写開始部位に対応することを示す。我々は、この第２の開始部位を、位置
＋４１１から＋７８１に伸び、エクソン２にスプライシングされて（位置＋１１
，２１０）転写物Ｂを与えるエクソン１Ｂで始まるものと定義する。転写物Ｃと
ゲノムＤＮＡとの整列は、別の転写開始部位と同一の位置＋４１１における「Ｃ
」を示す。我々は、エクソン１Ｃを、位置＋１１，２１０においてエクソン２に
スプランシングされて転写物Ｃを与える位置＋４１１から＋５４９に伸びるもの
と定義する。図２Ｃに示し、表１にまとめるように、エクソン３の一部と共に、
エクソン１Ａ、エクソン１Ｂ、エクソン１Ｃおよびエクソン２はＰＳ−１ＲＮＡ
転写物の５’非翻訳領域を含む。

【００５２】

【表１】

【００５３】 ¹各エクソンの５’末端および３’末端の位置は、位置＋１と定義されるエクソン１Ａの転写開始部位から計算した。これは配列番号１７の番号付とは異なる
ことに注意されたい。遺伝子のタンパク質コーディング部分は、エクソン３において翻訳が開始され
る位置＋１１，４２０のＡＴＧコドンで開始され、エクソン１２においてＴＡＧ
コドン（位置＋４５，６２７）で終わるまでタンパク質の残りをコードするエク
ソンが続く。このＴＡＧ停止コドンから９８３ｂｐ下流に、位置＋４６，６１２
における推定ポリアデニル化シグナルＡＡＴＴＡＡがある。興味深いことには、
エクソン１およびエクソン２の間のイントロンは約１０ｋｂｐであり、エクソン
３およびエクソン４の間は約１２ｋｂｐであり、エクソン５およびエクソン６の
間は約８ｋｂｐである。全マウスＰＳ−１遺伝子配列はここに配列番号１７とし
て記載されるが、エクソン１Ａはヌクレオチド２２３４で開始する。配列番号１
７において、全ての転写物についての開始コドンのＡ、すなわち、Ａ、Ｂおよび
Ｃはエクソン番号における位置１３６５３であり、全ての転写物についての停止
コドンのＴはエクソン１２における同一位置４７８６０にあり、全ての転写物に
ついてのポリアデニル化シグナルは同一位置４８８４５にある。従って、全ての
転写物についての翻訳は同一である。

【００５４】マウス・プレセニリン１プロモーターの特徴付け−−転写物Ａについての転写
部位の＋１位置の上流に位置するＤＮＡ配列の２３００ｂｐを、そのヒトＰＳ−
１ゲノムＤＮＡ対応物と比較した（図３）。ヒトとの最大類似性の領域は、マウ
ス配列において位置−３９から＋１１７に伸びる。この領域はグアノシン（Ｇ）
およびシトシン（Ｃ）残基が豊富であり、Ｅｔｓ１−３エレメント（Ｆｉｓｈｅ
ｒ，Ｒ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６、２２４９−２２５４（１９９１））に似た
配列モチーフGCCGGAAGT（配列番号１１）および通常は他の遺伝子のプロモーターで見いだされるＳｐ−１ヘキサヌクレオチドエレメントに似たGGGCGGG（配列番号１２）モチーフを含有する。この領域の上流のマウス配列はヒト配列と類似
性を有さず、あるいは最も通常の真核生物プロモーターエレメントＴＡＴＡボッ
クスも含有しない（図４）。代わりに、このユニークなマウス配列は、他の真核
生物プロモーターで見いだされるＣＡＡＴボックスに似た位置−３６５および−
２８１における２つのＣＡＡＡＴＡモチーフを含有する。このユニークな領域は
、位置−８０におけるＡｐ−２結合エレメント（CCCAGCCC）（配列番号１３）お
よび位置−２２０における熱ショック誘導性エレメント（CTCGAATCGCAG）（配列
番号１４）に似た配列も含有する。配列GGGCGG（配列番号１５）またはCCGCCC（
配列番号１６）を有する推定Ｓｐ−１ヘキサヌクレオチド結合部位は、１つのＳ
ｐ１モチーフを含有するエクソン１Ａおよび５つのモチーフを含有するイントロ
ン１Ａでの転写開始の＋１部位から下流で見出される。また、Ｃａｐ（転写開始
）の下流には、２つのさらなるＡｐ−２およびもう１つのＥｔｓ１−３モチーフ
がある。

【００５５】これらのエレメントが転写を促進するように機能するか否かをテストするため
に、我々は、デュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ
−ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＲｅｐｏｒｔｅｒＡｓｓｅｙＳｙｓｔｅｍ）（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）を使用した。一般に、我々は、これらのＤＮＡ断片を、プラスミ
ドｐＧＬ３中の基本的なプロモーターを有さないホタル・ルシフェラーゼ・レポ
ーター遺伝子の前に挿入することによって、ＰＳ−１の転写開始部位の近傍のＤ
ＮＡのプロモーター活性を検定した。ウミシイタケ(sea pansy)ルシフェラーゼの発現を駆動する一定量のＰＳ−１プロモーター断片を含有するｐＧＬ３および
一定量の単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターを含
有するｐＲＬ−ＴＫプラスミドを一定数の細胞に共トランスフェクトした。２４
時間後、トランスフェクトされた溶解物を引き続いてホタル・ルシフェラーゼ（
ＬＡ_F）およびウミシイタケルシフェラーゼ活性（ＬＡ_R）を、ウミシイタケ活性
に対するホタルの比がその相対的ルシフェラーゼ活性またはＲＬＡとして各ＰＳ
−１プロモーター断片につき計算できるように検定した。テストした全ての断片
のうち、断片−３２７ないし＋２０６を持つプラスミドＬＵＣ２９は、我々が１
００％として定義するウミシイタケ活性に対するホタルの最大比を示した（図５
および表２）。ＬＵＣ１（−２２３２ないし＋１４３６）、ＬＵＣ３（−４９９
ないし＋１１７１）およびＬＵＣ１６（−２７６ないし＋５１９）におけるより
大きい断片は、ＬＵＣ２９活性の小パーセントを呈するに過ぎず、これは、見か
け上それらの活性を低下させる陰性エレメントの存在を示唆する。興味深いこと
には、ＬＵＣ２９の高活性は、共に有意なプロモーター活性を欠くＬＵＣ２（−
２２３２ないし−４９６）およびＬＵＣ２３（＋１８８ないし＋５１９）のよう
なそのフランキング断片では見出されない。ＬＵＣ２３の結果は特に興味深い。
なぜならば、別の転写開始部位はエクソン１Ｂ／エクソン１Ｃの位置＋４１１で
始まり、明らかに、有意義なプロモーター活性を欠くからである。

【００５６】

【表２】

【００５７】 ²ＬＵＣ２９およびＬＵＣ２７を一過的に細胞系にトランスフェクトして、各々、プロモーター全体およびコアプロモーターの活性を測定した。ｐＧＬ−３基
本的プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のホタルルシフェラーゼを駆動するＳＶ４
０プロモーターもまた対照としてトランスフェクトした。相対的ルシフェラーゼ
活性（ＩＲＬＡ）の指標を、ＩＲＬＡ＝ＲＬＡ／ＲＬＡ_SV40としてプロモーター
全体およびコアプロモーターにつき計算した。

【００５８】プロモーター活性を付与する最小またはコア領域をより正確に定義するために
、我々は、非常に詳細にＰＳ−１遺伝子の−３２７ないし＋２０６領域を研究し
た。配列比較は、この領域がＣＡＡＴボックス（−２８１）、熱ショックエレメ
ント（−２２０）、ＡＰ２部位（−８０）、ＰＥＡ−３部位（−５３）、Ｅｔｓ
１−３部位（−７）およびＳｐ１部位（＋２５、＋１１９および＋１６１）を含
有することを示した。これらのエレメントおよび／または新しいエレメントのう
ちのいずれが機能的に活性であるかを見出すために、我々は、切除実験を行って
プロモーター活性につき、この領域内のより小さい断片をテストした。ＬＵＣ２
４およびＬＵＣ２３は有意な活性を欠くので、我々は、最初に、図４に示された
−４４０から＋９１の断片に焦点を当てた。−２８１におけるＣＡＡＴボックス
はＰＳ−１プロモーターにおいて活性役割を演じる。なぜならば、ＬＵＣ８（−
２６１ないし＋９１）はこのＣＡＡＴボックスを含有するＬＵＣ６（−３２７な
いし＋９１）よりも小さい活性を有するからである。陰性エレメントはこのＣＡ
ＡＴボックスの上流になければならない。なぜならば、ＬＵＣ４（−４４０ない
し＋９１）の活性はＬＵＣ６（−３２７ないし＋９１）の約半分だからである。
−２２０における熱ショックエレメントはＰＳ−１プロモーター活性において役
割を演じないかも知れない。というのは、このエレメントを含有する（ＬＵＣ８
、−２６１ないし＋９１）および欠く（ＬＵＣ１０、−１９２ないし＋９１）断
片は同様の活性を有するからである。−８０におけるＡＰ２部位および／または
−５３におけるＰＥＡ−３部位は、ＰＳ−１プロモーター機能において積極的な
役割を演じるように見える。というのは、ＬＵＣ１２（−８７ないし＋９１）は
これらの部位を欠くＬＵＣ１３（−３２ないし＋９１）の４倍大きい活性を有す
るからである。同様に、位置−７におけるＥｔｓ１−３は、７．９％におけるＬ
ＵＣ１４（−９ないし＋９１）および０．７％におけるＬＵＣ１５（＋４２ない
し＋９１）のＲＬＡ活性によって判断されるように、積極的な役割を演じる。Ｌ
ＵＣ１７（−２７６ないし＋２０６）をＬＵＣ１８（−２７６ないし＋１４８）
と比較すると、位置＋１６１におけるＳｐ１部位は寄与するようには見えない一
方で、＋２５および＋１１９におけるＳｐ１部位は、ＬＵＣ２６（−９ないし＋
４１）をＬＵＣ２７（−９ないし＋１６）と比較し、およびＬＵＣ７（−２７６
ないし＋９１）をＬＵＣ１８（−２７６ないし＋１４８）に比較すると、各々、
陰性および陽性エレメントとしてＰＳ−１プロモーターにおいて非常に活性であ
るように見える。

【００５９】これらの実験に基づき、我々は、−８７ないし＋４１の領域がコアプロモータ
ー活性を含有するか否かを２つの方法でテストした。まず、ＬＵＣ２５（−８７
ないし＋４１）は２８％のＲＬＡプロモーター活性を有した。第２に、ＬＵＣ３
０を与えるこの領域の欠失（−３２７ないし＋２０６から−８７ないし＋４１を
欠失）は、活性を１００％（ＬＵＣ２９）から０．２％（ＬＵＣ３０）まで減少
させた。一緒にすると、これらの結果は、Ａｐ２、ＰＥＡ−３、Ｅｔｓ１−３お
よびＳｐ１エレメントは領域−８７ないし＋４１におけるＰＳ−１プロモーター
の主要な機能的エレメントを含むことを強く示唆する。

【００６０】細胞特異的転写：−−ヒト脳スライスに対するin situハイブリダイゼーションを用い、我々は、ＰＳ−１ＲＮＡがニューロンで最も豊富であり、他の脳細胞
における検出の限界未満であることを見出した。この結果は、ＰＳ−１プロモー
ターがニューロンで優先的に機能し得ることを示唆する。この考えをさらにテス
トするために、我々は、異なる細胞タイプにおいて、プロモーター断片／レポー
タープラスミドＬＵＣ１、ＬＵＣ３、ＬＵＣ４、ＬＵＣ２７およびＬＵＣ２９の
活性を比較した。前記で報告したように、神経外胚葉系列のＮｅｕｒｏ−２Ａ細
胞系はＬＵＣ２７、ＬＵＣ３およびＬＵＣ１からよりもＬＵＣ２９およびＬＵＣ
４からのより大きなＲＬＡプロモーター活性を支持する（図６および表２）。対
照的に、マウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞系は、これらのプロモーター／レポー
ター構築物（ＬＵＣ２９、ＬＵＣ２７、ＬＵＣ４、ＬＵＣ３およびＬＵＣ１）の
各々を持つ最小プロモーター活性を支持するに過ぎない。ＰＳ−１プロモーター
活性はニューロンで大きいという考えをさらにテストするために、我々は、これ
らのレポーター構築物で胚性カルシノーマ細胞系Ｐ１９をトランスフェクトした
。Ｐ１９細胞は、レチノイン酸処理でニューロン様表現型に（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉ
ｌｌｅｎｅｕｖｅ，Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２２７１−２２
７９（１９８３））あるいはジメチルスルホキシド処理によって筋肉様表現型（
Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２２８０−２２８
６（１９８３））にユニークに分化する。レチノイン酸処理したＰ１９細胞は、
未処理Ｐ１９細胞と比較して、プラスミドＬＵＣ２９よりも２．５倍大きい相対
的ルシフェラーゼ活性を支持する。未処理Ｐ１９細胞は、ジメチルスルホキシド
処理Ｐ１９細胞と比較して、１．３倍大きい相対的ルシフェラーゼ活性を支持す
る。

【００６１】（考察）プロモーターからポリアデニル化シグナルにかけて、マウスのプレセニリン１
遺伝子およびそのエクソン−イントロン構造の全配列は、そのユニークな機能の
記載する段階をセットする。報告されたＰＳ−１ｃＤＮＡ配列とは対照的に、５
’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Rapid Amplification of cDNA Ends) は、２つのユニークな転写開始部位を保有する３つの異なるｍＲＮＡ転写物を増
幅することによって我々を驚かせた。配列解析は、転写物Ａはエクソン１Ａで開
始し、他方、転写物Ｂおよび転写物Ｃはエクソン１Ｂで開始することを示した。
エクソン１Ｃは位置＋４１１においてその５’末端を保有するが、位置＋５４９
まで伸びるに過ぎないエクソン１Ｂの断片である。複数のＲＮＡ転写物を生じる
エクソン１Ｂ対エクソン１Ｃにおける択一的スプライシングのこの例は、当該分
野でよく知られており、ヒトＰＳ−１遺伝子においてエクソン９につき記載され
てきた（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｕｒ，Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．７、２９７−
３０１（１９９５））。しかしながら、２つの区別される転写開始部位は、ヒト
のカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（Ｔｅｎｈｕｎｅｎ，Ｊ．ら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３、１０４９−１０５９（１９９４））、マウ
スのニューロトロフィン３（Ｌｅｉｎｇａｒｔｎｅｒ，Ａ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎ
ｅｕｒｏｓｃｉ．２２３、１１４９−１１５９（１９９４））およびラット芳香
族Ｌアミノ酸デカルボキシラーゼ（Ａｌｂｅｒｔ，Ｖ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９、２０５３−１２０５７（１９９２））
を含めた数個の遺伝子について報告されているに過ぎない。これらの場合、転写
開始部位当たり１つのプロモーターの化学量論が観察されるように、各転写開始
部位を別個のプロモーターと組み合わせた。

【００６２】しかしながら、ＰＳ−１遺伝子についてのプロモーター活性の我々の特徴付け
は、多くの異る状況を明らかとした。内部標準としてウミシイタケＲｅｎｉｌｌ
ａルシフェラーゼと共にホタルルシフェラーゼレポーターにカップリングプロモ
ーター断片を用い、我々は、−３２７から＋２０６の断片（ＬＵＣ２９）がＰＳ
−１プロモーター活性のほとんどを含有することを見出した。この活性を明らか
に含有する公知の配列モチーフはＣＡＡＴボックス（−２８１）、Ａｐ２部位（
−８０）、ＰＥＡ−３部位（−５３）、Ｅｔｓ１−３部位（−７）およびＳｐ１
部位（＋２５）である。この領域はエクソン１Ａのいくつかと重複する一方で、
ＬＵＣ３０における−８７から＋４１の領域の欠失はプロモーター活性を５０倍
減少させる。エクソン１Ｂおよびエクソン１Ｃ中の位置＋４１０における別の転
写開始部位については、我々は、Ｓｐ１、Ａｐ２およびＥｔｓ１〜３部位を含有
するＬＵＣ２３（＋１１８から＋５１９）をテストし、それが、エクソン１Ａプ
ロモーター付近の活性の約１％を呈することを見出した。これらの結果は、エク
ソン１Ａの＋１位置の付近の領域が転写物Ａ、転写物Ｂおよび転写物Ｃの発現を
促進し得ることを我々に示唆した。あるいは、エクソン１Ｂ／エクソン１Ｃ中の
位置＋４１０における転写開始を制御する弱いプロモーターは、位置＋１におけ
る転写開始の１％に達するに過ぎない。５’ＲＡＣＥの産物の全てをプラスミド
ベクターにクローニングし、エクソン１Ｃを担うクローンの数を数えることによ
って、我々は、ＰＳ−１転写物の全ての３０％に近づく転写物Ｃの豊富さを見積
もり、これは、さらに、＋１における主要プロモーターは＋１および＋４１０の
両方の部位からの転写開始を制御するように機能することを支持する。転写物Ａ
、転写物Ｂおよび転写物Ｃの定量的測定は、この論点をさらに解決するのを助け
るであろう。マウスＰＳ−１遺伝子についての複数の開始部位および択一的スプ
ライシングの我々の記載と組み合わせて、ヒトおよびマウスプロモーター間の高
い相同性は、合理的に、いかにヒトＰＳ−１プロモーターが機能し得るかを示唆
する（図６）。

【００６３】最近、ＰＳ−１は中枢神経系のニューロンで支配的に発現されると報告されて
いる（Ｋｏｖａｃｓ，Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｍａｄ．２、２２４−２２９（１９９６
））。この結果は、in situハイブリダイゼーションによって、ＰＳ−１ＲＮＡがニューロンにおいて強く発現され、他の細胞型では検出不可能なレベルで発現
されるという我々のデータと合致する。同様に、いくつかの免疫組織化学的研究
は、主として、アミロイドプラークの弱い染色を持つＰＳ−１タンパク質および
それらのプラークの回りのいくつかの神経膠のニューロンの位置を報告する。他
方、Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎらは、異なる器官からのＲＮＡのノーザンブロット
が全てＰＳ−１ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズしたことを示しており、これ
は、ＰＳ−１ＲＮＡが普遍的に発現されることを示唆する。現在、これらの研究
は容易には受け入れられない。

【００６４】我々のデータは、ＰＳ−１発現の細胞型特異的パターンを支持するニューロン
様細胞における優先的プロモーター活性を示す。我々は、マウスＮｅｕｒｏ２ａ
神経芽細胞腫細胞系においてＰＳ−１プロモーター活性の最大量を見出し、続い
てＰ１９胚性カルシノーマ細胞系であり、マウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞系で
はほとんど活性はなかった（表２）。この知見をさらに確認するために、我々は
、ジメチルスルホキシド処理に続く筋肉様表現型（ａｋａ．Ｐ１９−ＤＭＳＯ筋
肉）、または全てのトランスレチノイン酸処理に続くニューロン様表現型（ａｋ
ａ．Ｐ１９−ＲＡニューロン）に分化するそのユニークな能力のため、Ｐ１９マ
ウス胚性カルシノーマ細胞系を使用した（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，
Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２２７１−２２７９（１９８３）；
Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｍ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、２２８０−２２８
６（１９８３））。ＰＳ−１プロモーター活性はニューロン様細胞で好ましいと
いう我々の仮説を前提とすると、我々は、レチノイン酸でニューロン様細胞に分
化したＰ１９細胞はジメチルスルホキシドで筋肉様細胞に分化したＰ１９細胞よ
りも大きいＰＳ−１プロモーター活性を呈するであろうと予測する。図５および
表２に明瞭に示されるように、Ｐ１９−ＲＡ−ニューロン細胞は最大のＰＳ−１
プロモーター活性を呈し、続いて未処理Ｐ１９細胞であり、Ｐ１９−ＤＭＳＯ筋
肉細胞では最低の活性である。Ｎｅｕｒｏ２ａおよびＮＩＨ／３Ｔ３結果と組み
合わせたこれらの結果は、ニューロンで好ましいＰＳ−１プロモーター活性の明
瞭なパターンを示す。

【００６５】ニューロン特異的プロモーター活性を制御するメカニズムは余り理解されてい
ない。最も直接的なメカニズムは、ニューロン特異的プロモーターを単一に活性
化する、ニューロン細胞にだけ存在するポジティブレギュレーターについてであ
ろう。あるいは、非ニューロン細胞にのみ存在するネガティブレギュレーターは
、ニューロン細胞を除く全ての細胞においてニューロン特異的プロモーターを全
体的に抑制できるであろう。プロモーター内の正確なＤＮＡエレメントに依存し
て、転写活性のポジティブおよびネガティブな制御のいくつかの組合せもまたニ
ューロンで好ましいプロモーター機能を生じるであろう。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に
おいてＰＳ−１プロモーター活性を付与する領域の我々の特徴付けを超えて、我
々は、今や、ＤＮＡエレメントのいずれがニューロンに好ましいプロモーター機
能を付与し得るかを示唆するデータを見ることができる。Ｎｅｕｒｏ２ａニュー
ロン様細胞において最高の活性を示す領域は、−３２９位から＋２０６位まで（
ＬＵＣ２９）、−２８１位におけるＣＡＡＴボックス、−２１８位における熱シ
ョック誘導性エレメント、−８０位におけるＡｐ２部位、−５３位におけるＰＥ
Ａ−３部位、−７位におけるＥｔｓ１−３部位、および＋２５位におけるＳｐ１
部位を含有する。ＣＡＡＴボックスは、恐らくは、ニューロン特異的活性の陽性
制御の１／３を支持する。というのは、その欠失は、ＬＵＣ６（−３２７ないし
＋９１）をＬＵＣ８（−２６１ないし＋９１、図４）と比較した場合に約１／３
だけプロモーター活性を減少させるからである。熱ショックエレメントは、恐ら
くは、正常条件下で（ストレスがない条件下）ニューロン特異的活性に寄与しな
い。というのは、その欠失は、ＬＵＣ８（−２６１位から＋９１位）をＬＵＣ１
０（−１９２位から＋９１位、図４）と比較した場合にプロモーター活性に影響
しないからである。ＬＵＣ１３（−３２位から＋９１位）と比較したＬＵＣ１２
（−８７位から＋９１位）の４倍大きい活性に基づき、Ａｐ２部位およびＰＥＡ
−３部位は共にニューロン特異的プロモーター機能のポジティブな制御について
の良好な候補であるように見える。Ａｐ２部位は神経提系列の細胞において活性
なプロモーターで最も頻繁に見出され、ニューロン特異的活性と関連するいくつ
かの例が存在する（Ｓａｔｏ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１０
３１４−１０３２２（１９９５）；Ｐｅｔｅｒｓｏｈｎ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７０、２４３６１−２４３６９（１９９５）；Ｃｈｉｎ，Ｌ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１８５０７−１８５１３（１９９４））。
対照的に、ＬＵＣ２７（−９位から＋１６位）と比較してＬＵＣ２６（−９位か
ら＋４１位）が活性が５倍低いのは、ニューロン特異的プロモーター機能のネガ
ティブレギュレーターとしての＋２５位におけるＳｐ１部位を意味する。また、
これらの同一データは、恐らくは、−９位から＋１６位のコアプロモーターエレ
メントの一部としての、ポジティブな機能を有するＥｔｓ１−３部位と解釈し得
る。ＬＵＣ２７（−９位から＋１６位）の直接的測定は、Ｎｅｕｒｏ２ａおよび
Ｐ１９−ＲＡニューロン細胞がＰ１９−ＤＭＳＯ筋肉またはＮＩＨ／３Ｔ３非ニ
ューロン細胞よりも大きい活性をすることを示し、これは、この２５ｂｐ領域が
ニューロンに好ましいプロモーター活性に寄与するという考えを支持する。位置
＋１における主要な転写開始部位は、この提案されたコアプロモーターエレメン
ト中に位置する。ＥＴＳ−１転写因子は、ＰＥＡ−３結合部位よりも、５／１の
比率だけ、このコアで見出されるＥｔｓ１−３結合部位への結合を好む（Ｆｉｓ
ｈｅｒ，Ｒ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６、２２４９−２２５４（１９９１））。こ
の知見は特に興味深い。というのは、ＥＴＳ−１転写因子は、Ｂ細胞および免疫
系の休止Ｔ細胞につき特異的であると考えられ、これはニューロン細胞では従前
には記載されていなかった。Ｓｐ１結合部位は、全ての細胞型の全てのプロモー
ターで普遍的に分布しているように見え、陰性エレメントとして機能するそれら
の能力は新規であるように見える。

【００６６】前記したのは本発明の例示であり、それを制限するものと解釈されるべきでは
ない。本発明は、前記特許請求の範囲に含まれる同等のものと共に、特許請求の
範囲によって規定される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ミツダ，ノリアキアメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，スノウクレスト・トレイル 1411 (72)発明者ローズィズ，アレン・ディーアメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，ストリンリー・コート 10 Ｆターム(参考） 4B024 BA21 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B065 AA91X AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−３２７位
から−２０６位にわたる配列、（ｂ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−４４９位から＋１１７１位
にわたる配列、（ｃ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−９位から＋１６位にわたる
配列、および（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列を有する単離されたＤＮＡにハ
イブリダイズし、哺乳動物細胞において下流の異種ＤＮＡセグメントのニューロ
ン特異的転写を指令するＤＮＡ配列からなる群から選択される配列を有する哺乳動物細胞において下流の異種ＤＮＡ
セグメントのニューロン特異的転写を指令する単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】 −４４０位から＋９１位、 −３５２位から＋９１位、 −３２７位から＋９１位、 −２７６位から＋９１位、 −２６１位から＋９１位、 −２１５位から＋９１位、 −１９２位から＋９１位、 −１２４位から＋９１位、 −８７位から＋９１位、 −３２位から＋９１位の哺乳動物のプレセニリン１遺伝子プロモーターの配列を有する請求項１に記載
の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】 −２７６位から＋５１９位、 −２７６位から＋２０６位、 −２７６位から＋１４８位、 −２７６位から＋４１位の哺乳動物のプレセニリン１遺伝子プロモーターの配列を有する請求項１に記載
の単離されたＤＮＡ。
【請求項４】 −８７位から＋４１位、 −９位から＋１６位、 −３２７位から＋２０６の哺乳動物のプレセニリン１遺伝子プロモーターの配列を有する請求項１に記載
の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】 −３２７位から＋２０６位のマウスのプレセニリン１遺伝子
プロモーターの配列を有する請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項６】５’から３’の方向に、請求項１に記載のＤＮＡからなるプ
ロモーターセグメントと、該プロモーターセグメントから下流に位置し、それに
作動可能に結合した異種ＤＮＡセグメントとを含んでなる、発現カセットを含む
ＤＮＡ構築物。
【請求項７】プラスミドを含む請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】前記異種ＤＮＡセグメントが、タンパク質をコードする請求
項６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含有する細胞。
【請求項１０】請求項６に記載のＤＮＡ構築物を含む遺伝子伝達ベクター
。
【請求項１１】発現カセットを含むＤＮＡ構築物を含有する細胞を含むト
ランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、前記ＤＮＡ構築物が、５’から３’
の方向に、ニューロン特異的プロモーターセグメントと、該プロモーターセグメ
ントから下流に位置し、それに作動可能に結合した異種ＤＮＡセグメントとを含
み、前記ニューロン特異的プロモーターが、（ａ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−３２７位から−２０６位に
わたる配列、（ｂ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−４４９位から＋１１７１位
にわたる配列、（ｃ）マウスのゲノムのプレセニリン１遺伝子の−９位から＋１６位にわたる
配列、および（ｄ）前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列を有する単離されたＤＮＡにハ
イブリダイズし、哺乳動物細胞において下流の異種ＤＮＡセグメントのニューロ
ン特異的転写を指令するＤＮＡ配列からなる群から選択される配列を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】前記哺乳動物が、マウスである請求項１１に記載のトラン
スジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】前記発現カセットが、それを含有する該細胞のゲノムに安
定に組み込まれる請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】前記発現カセットが、その体細胞および生殖細胞によって
担持される請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】前記異種ＤＮＡセグメントが、タンパク質をコードする請
求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１６】前記異種ＤＮＡセグメントが、その細胞中で転写される請
求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１７】前記異種ＤＮＡセグメントが、その神経細胞中で優先的に
転写される請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。