JP2001513325A - 遺伝子工学的に作製されるウキクサ - Google Patents

遺伝子工学的に作製されるウキクサ

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ニルマラ ラジバンダリ
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Abstract

(57)【要約】 ウキクサを効果的に形質転換するための方法及び組成物を提供する。好ましくは、当該方法は、衝撃法又はアグロバクテリウムによる形質転換を含む。この方法において、目的のヌクレオチド配列又は遺伝子が誘導されウキクサ植物体に発現する。形成転換されたウキクサ植物体、細胞、組織が提供される。形成転換されたウキクサ植物体組織培養と形成転換されたウキクサから蛋白とペプチド組換えを提供する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は米国環境保護庁から授与された認可番号Ｒ８３２５７０−０１−０１ の下に政府の支援によりなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有す
る。
【０００２】 発明の分野 本発明はウキクサの形質転換のための方法および組成物に関し、特に衝撃法（
ballistic bombardment）およびアグロバクテリウムを利用した形質転換の方法 に関する。
【０００３】 発明の背景 ウキクサ類は単子葉類科、ウキクサ科（Lemnaceae）の唯一の構成要素である 。４属と３４種はすべて小さな自由に流れる淡水植物であり、その地理的範囲は
全地球に及ぶ。ランドルト（Landolt）、ウキクサ科に関する生系統的調査：ウ キクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団（Stiftung Rubel）、地球植物
学研究所ＥＴＨ（１９８６）。形態的に縮小されたこの植物のほとんどは知られ
ているが、ほとんどのウキクサ種はすべて、根、茎、花、種および葉を含めて、
はるかに大きな植物の組織や器官を有する。ウキクサ種は広範囲にわたって研究
されており、それらの生態学、系統学、生活周期、代謝、疾患およびペスト感受
性、それらの生殖生物学、遺伝子構造、および細胞生物学を詳しく述べた重要な
文献が存在する。ヒルマン（Hillman）、Rot. Review 27,221(1961); ランドル ト、ウキクサ科に関する生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ル
ーベル財団、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６）。
【０００４】 ウキクサの生長習性は微生物培養法に理想的である。植物は酵母内の無性生殖
と類似の肉眼的仕方で新しい葉の栄養出芽により急速に増殖する。ウキクサは分
裂細胞からの栄養出芽により増殖する。分裂領域は小さく、葉の腹面上に見られ
る。分裂細胞は２つのくぼみ（pocket）にあり、くぼみは葉の中央脈の両側にあ
る。小さな中央脈領域は根が発する部位であり、それぞれの葉をその母葉に結合
する茎が生じる。分裂くぼみは組織弁により保護されている。葉はこれらのくぼ
みから交互に芽を出す。倍加時間は種により異なり、２０〜２４時間と短い。ラ
ンドルト、Ber. Schweiz. Bol. Ges. 67,271（1957); チャングら（Chang et al
.）、Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24, 19（1977); ダトコ（Datko）とムッド
（Mudd）、Plant Physiol. 65,16（1980); ヴェンカタラマンら（Venkataraman
et al.）、Z. Pflanzenphysiol. 62, 316（1970）。
【０００５】 ウキクサの集中培養により単位時間当たりの最高率のバイオマス蓄積が得られ
（ランドルトとキャンデラー（Kandeler）、ウキクサ科−形態研究。第２巻：植
物化学、生理学、応用、参考文献、チューリヒ、ルーベル財団、地球植物学研究
所ＥＴＨの刊行物（１９８７））、乾燥重量の蓄積率は新鮮重量の６〜１０％で
ある（チルベルクら（Tillberg et al.）、Physiol. Plant. 46,5（1979); ラン
ドルト、Ber. Schweis. Bot. Ges. 67,271（1957); Stomp, 未発表データ）。さ
まざまな条件下に増殖される多数のウキクサ種のタンパク質含量は１５〜４５乾
燥重量であることが報告されている（チャンら（Chang et al.）、Bull. Inst.
Chem. Acad. Sin. 24, 19（1977); チャンとチュイ（Chui）、Z. Pflanzenphysi
ol. 89,91（1978); ポラスら（Porath et al.）、Aquatic Botani 7, 272（1979
); アペンロスら（Appenroth et al.）、Biochem. Physiol. Pflanz. 177,251（
1982))。これらの値を用いると、ウキクサにおける培地１リットル当たりのタン
パク質産生レベルは、酵母遺伝子発現系と同じ程度となる。今までは、特異的ウ
キクサ系用の培地成分および最大の増殖やタンパク質含量のための培養条件の体
系的最適化は行われていない。
【０００６】 ウキクサの有性生殖は、光周期や培養密度を含めて培地成分および培養条件に
より調節される。同種による通常の実験室手順が開花誘導である。植物は通常、
自家受粉し、自殖は培養株を静かに振盪することで実験室において行うことがで
きる。この方法により、イボウキクサ（Lemna gibba）の近交系が開発されてい る。自然変異が確認される（スロヴィン（Slovin）とコーエン（Cohen）、Plant
Physiol. 86,522（1988))とともに、化学的およびガンマ線変異誘発（ＥＭＳま
たはＮＭＵを使用）を行って特徴が明確な変異株が得られている。Ｌ．ｇｉｂｂ
ａの異系統交配は冗長であるが、管理受粉により行うことができる。ウキクサの
ゲノムサイズは０．２５〜１．６３ｐｇＤＮＡ／２Ｃであり、染色体数は２０〜
８０であるとともに、ウキクサ科全体の平均は約４０である（ランドルト、ウキ
クサ科の生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団、地
球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６））。倍数性レベルは２〜１２Ｃ．Id.と推計 されている。ウキクサ内の遺伝子の多様性については、二次生成物、イソ酵素、
およびＤＮＡ配列を用いて調査されている。マククルール（McClure）とアルス トン（Alston）、Nature 4916, 311（1964); マククルールとアルストン、Amer.
J. Bot. 53, 849（1966); ヴァシュールら（Vasseur et al.）、Pl. Syst. Evo
l. 177, 139（1991); クロフォード（Crawford）とランドルト、Sys. Bot. 10,
389（1993)。
【０００７】 したがって、上述した特徴により、ウキクサは植物に基づく有効な発現系とし
て開発するための理想的な選択となる。
【０００８】 発明の開示 本発明はウキクサの有効な形質転換のための方法および組成物に関する。該方
法は、衝撃法、アグロバクテリウム、または形質転換ウキクサ植物体に目的のヌ
クレオチド配列を安定に誘導するとともに発現するための電気穿孔法の使用を含
む。この方法において、目的の遺伝子または核酸をウキクサ植物体内に誘導する
ことができる。形質転換ウキクサの細胞、組織、植物および種子も提供される。
【０００９】 第１の態様として、本発明は目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転
換するための方法を提供し、前記ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与
する遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含み、（ａ）ウキクサ標的組
織を備え、ウキクサ組織の細胞は細胞壁を含有するステップと、（ｂ）細胞壁を
穿刺し、組織の細胞内のヌクレオチド配列を析出するために十分な速度でウキク
サ標的組織でのヌクレオチド配列を射出するステップとを含む方法であって、ヌ
クレオチド配列は微小発射体により運搬されるとともに、ヌクレオチド配列は組
織での微小発射体を射出することにより組織で射出される方法を提供する。
【００１０】 第２の態様として、本発明は目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転
換するための方法を提供し、（ａ）ヌクレオチド配列を含むベクターであって、
ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なくとも１つ
の発現カセットを含むベクターを含むアグロバクテリウムをウキクサ植物体組織
に接種するステップと、（ｂ）アグロバクテリウムと組織を共生培養して形質転
換組織を生成するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】 第３の態様として、本発明は電気穿孔法によりウキクサを形質転換する方法を
提供する。
【００１２】 第４の態様として、本発明は上述した方法により生成される形質転換ウキクサ
植物体および形質転換ウキクサ組織培養株を提供する。
【００１３】 第５の態様として、本発明は形質転換ウキクサ植物体を用いて組換えタンパク
質またはペプチドを生成する形質転換ウキクサ植物体および方法を提供する。
【００１４】 ウキクサは植物に基づく理想的な遺伝子発現系を提供する。ウキクサ遺伝子発
現系は、多くの研究や商業的応用に有用であろう重要な技術を提供する。植物分
子生物学研究全体としては、酵母の実験室便宜品で操作できる分化植物系が、分
離遺伝子の発生や生理学上の役割を分析するためにきわめて迅速な系を提供する
。この目的のために、タバコやアラビドプシス（Arabidopsis）などモデル植物 が現在、植物分子生物学者により用いられている。これらの植物は増殖のために
温室や野外施設を必要とする（植物分子生物学者が得るには困難な場合が多い）
。代替の遺伝子発現系は細菌または細胞培養株に基づくものであるが、これらは
組織や発展的に調節される遺伝子発現効果が失われる。異種の遺伝子発現系も移
入前に目的の遺伝子の再構成とともに、高価で時間のかかる工程を必要とする。
ウキクサ系はこれらの問題をいずれも克服し、はるかに容易に増殖されるととも
に実験室環境下に維持される。発現されたタンパク質またはペプチド（もしくは
それにより生成される分子）を回収することが望ましい場合は、これは細胞の機
械的粉砕または敷設（laying）など技術上周知の適切な方法により行うことがで
きる。
【００１５】 有益なタンパク質の商業生産のために、ウキクサに基づく系が現存の細菌また
は細胞の培養系に対して多くの利点を有する。哺乳動物タンパク質の生産分野で
は、植物は哺乳動物細胞とほぼ同じ移植後過程を示し、哺乳動物細胞の細菌細胞
生成と関係した１つの大きな問題を克服する。ウキクサも哺乳動物細胞培養株よ
りもはるかに安価に生成される。すでに他の研究者（ヒアット（Hiatt）、Natur
e 334, 469（1990)）により、植物系は細菌系には欠乏していることが多い能力 である、複数サブユニットタンパク質を構成する能力を有することが示されてい
る。治療的タンパク質の植物生成は、哺乳動物細胞培養株や細菌系で生成される
動物ウイルスを含めて、汚染物質からのリスクをも制限する。汚染物質は治療的
タンパク質生成における主な関心事である。他に提案されている、大豆やタバコ
などの植物生成系とは異なり、ウキクサは発酵器／バイオレクタ管で増殖するこ
とができ、系が現存するタンパク質生産工業の基本的施設にはるかに容易に統合
される。
【００１６】 低コストの工業的な酵素や小分子のための製造標準として、ウキクサは高栄養
素廃水を用いた野外条件下に増殖できるため、ほとんどすべての量を容易に測定
可能であるという利点を提供する。廃水で増殖する遺伝子工学的に作製されるウ
キクサ系は有益な生成物を産生すると同時に再利用のために廃水を浄化する。こ
のような系は、正味資本損失（廃水の排出からの改善）を実際的な経済的均衡と
ともに化学的または酵素の生成に転換することになろう。野外作物における化学
的合成に対するウキクサの利点は、世界の増加する人口のために食品生産の増大
に必要な耕地に適した作物や灌漑水を必要としないということである。
【００１７】 本発明の以上の態様と他の態様を下記の本発明の説明の中でさらに詳細に開示
する。
【００１８】 図面の簡単な説明 図１は、ＧＵＳ遺伝子を含有するｐＢＩ１２１からの３．２ｋｂで放射線同位
体標識されたフラグメントを有する系Ｄの形質転換されていないウキクサＤＮＡ
と形質転換ウキクサＤＮＡのサザンハイブリダイゼイションにより生成されたオ
ートラジオグラフを示す。チャネル：１）分離された、未消化ｐＢＩ１２１ Ｄ ＮＡ。予想される主なバンドは１２．８ｋｂである。低分子量バンドは超らせん
プラスミドを示すと考えられる。２）ＨｉｎｄＩＩＩ消化された、ｐＢＩ１２１
ＤＮＡ。この消化はプラスミドを線状にするとともに予想される１２．８ｋｂ バンドを示す。低分子量バンドは不完全消化を示す。３）ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＥｃｏＲ１で消化されたｐＢＩ１２１ ＤＮＡ。消化は不完全であるが、予想さ れるバンドを生じた：１２．８ｋｂ（不完全消化から出た）、約９ｋｂバンド、
および不鮮明な超らせんバンド。３．２ｋｂバンドはこの曝露で可視のハイブリ
ダイゼイションを示すことはなかった。４）予想される９ｋｂおよび３．２ｋｂ
バンドを示す二重消化されたｐＢＩ１２１ ＤＮＡの１コピーと等価の形質転換 されていないウキクサのＤＮＡ。５）形質転換されていないウキクサＤＮＡ。６
）形質転換ウキクサ系Ｄの未消化ＤＮＡ。７）形質転換ウキクサ系ＤのＨｉｎｄ
ＩＩＩ。８）形質転換ウキクサ系ＤのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲ１消化ＤＮ
Ａ。
【００１９】 発明の詳細な説明 本発明はウキクサを形質転換するための方法に関する。好適実施例において、
該方法では衝撃法またはアグロバクテリウムを利用し、ウキクサ細胞を安定に形
質転換する。または、該方法では電気穿孔法を用いてウキクサを形質転換する。
本発明の方法および形質転換植物は、酵母の利点の多くを有する植物に基づく遺
伝子発現系として使用される。
【００２０】 発明人が知る限り、ウキクサの安定した遺伝子導入や形質転換ウキクサ植物体
の再生についてはこれまで報告されていない。今回の調査では、トランスジェニ
ックウキクサ植物体の生成には２つの方法が利用されていた。すなわち（１）外
来ＤＮＡを分裂葉細胞に直接、導入および挿入した後、無性生殖および自殖によ
りトランスジェニックウキクサを生成する方法（植物〜植物系）と、（２）未分
化カルス細胞の形質転換後、増殖カルスの選択、および葉再生の方法（カルス〜
植物系）である。Ｌ．ギッバ（L. gibba）およびＬ．ミノール（L. minor）から
カルス生成のための制限組織培養系が以前、チャン（Chan）らのグループ（チャ
ンとチュイ（Chui）、Bot. Bull. Academia Sinic 17, 106（1976); チャンとチ
ュイ、Z. Pflanzenphysiol. Bd. 89.S, 91（1978)）およびフリック（Frick, J.
Plant Physiology 137, 397（1991)）によりそれぞれ報告されている。今回の 調査は、葉を再生する組織的カルス系を開発することで同分野における研究を大
きく拡大した。
【００２１】 好ましくは、本発明ではウキクサを安定に形質転換するために２系、すなわち
微小発射体銃を用いた衝撃法とアグロバクテリウム媒介形質転換の１つを用いる
。ウキクサは単子葉植物であるためアグロバクテリウム形質転換に対して不応性
であることが予想されるが、ウキクサは意外にもアグロバクテリウムを用いて形
質転換できることがわかっている。本発明により形質転換されるウキクサ植物体
は電気穿孔法でも生成することができる。例えば、デキーサーら（Dekeyser et
al.）、Plant Cell 2, 591（1990); デ’ハルインら（D'Halluin et al.）、Pla
nt Cell 4, 1495（1992); デ’ハルインらに対する米国特許第 5,712,135号を参
照。電気穿孔法の１つの利点は、人工染色体を含む大部分のＤＮＡがこの方法で
ウキクサに形質転換できることである。適切なウキクサ細胞または組織型であれ
ば、本発明によりすべて形質転換することができる。例えば、核酸を組織培養株
のウキクサ細胞に導入することができる。または、ウキクサ植物体の小さいサイ
ズの水性増殖習性により、核酸を完全な胚、葉、根、および分裂組織など組織化
組織のウキクサ細胞に導入することができる。さらに別の代替として、核酸をウ
キクサカルスに導入することができる。
【００２２】 請求された方法により生成される形質転換ウキクサ植物体は正常な形態を示し
、有性生殖により稔性であることが好ましい。好ましくは、本発明の形質転換植
物は形質転換された核酸の単一コピーを含み、形質転換された核酸は顕著な転位
を示さない。また、形質転換された核酸のコピー数が少ないウキクサ植物体が好
ましい（すなわち、５コピーを超えないこと、または３コピーを超えないこと、
さらに別の代替として、形質転換細胞当たりの核酸のコピーが３未満であること
）。
【００２３】 本明細書中で用いる「ウキクサ」という語は、ウキクサ（Lemanaceae）科の構
成要素を指す。４属と３４種のウキクサが、以下の通り知られている。すなわち
、アオウキクサ（Lemna）属（Ｌ．エクイノクティアリス（aewuinoctialis）、 Ｌ．ジスペルマ（disperma）、Ｌ．エクアドリエンシス（ecuadoriensis）、Ｌ ．ギッバ（gibba）、Ｌ．ジャポニカ（japonica）、Ｌ．ミノール（minor）、Ｌ
．ミニスキュラ（miniscula）、Ｌ．オブスクラ（obscura）、Ｌ．ペルプシラ（
perpusilla）、Ｌ．テネラ（tenera）、Ｌ．トリスルカ（trisulca）、Ｌ．ツリ
オニフェラ（turionifera）、Ｌ．ヴァルジヴィアナ（valdiviana）；ウキクサ （Spirodela）属（Ｓ．インテルメジア（intermedia）、Ｓ．ポリルヒザ（polyr
rhiza）、Ｓ．プンクタタ（punctata）；ミジンコウキクサ（Wolffia）属（Ｗａ
．アングスタ（angusta）、Ｗａ．アルヒザ（arrhiza）、Ｗａ．アウストラリナ
（australina）、Ｗａ．ボレアリス（borealis）、Ｗａ．ブラジリエンシス（br
asiliensis）、Ｗａ．コルンビアーナ（columbiana）、Ｗａ．エロンガータ（el
ongata）、Ｗａ．グロボーサ（gulobosa）、Ｗａ．ミクロスコピカ（microscopi
ca）、Ｗａ．ネグレクタ（neglecta））およびウォルヒエラ（Wolfiella）属（ Ｗｌ．カウダータ（caudata）、Ｗｌ．デンティクラータ（denticulata）、Ｗｌ
．グラジアータ（gladiata）、Ｗｌ．ヒアリーナ（hyalina）、Ｗｌ．リングラ ータ（lingulata）、Ｗｌ．レプンダ（repunda）、Ｗｌ．ロツンダ（rotunda） 、およびＷｌ．ネオトロピカ（neotropica））である。ウキクサの他の属または
種も、それらが存在する場合は、本発明の態様である。イボウキクサ、レムナ・
ミノール、およびレムナ・ミニスキュラが好ましく、レムナ・ミノールおよびレ
ムナ・ミニスキュラが最も好ましい。アオウキクサ種は、ランドルフ（ウキクサ
科に関する生系統的調査：ウキクサ科−形態研究。チューリヒ、ルーベル財団（
Stiftung Rubel）、地球植物学研究所ＥＴＨ（１９８６））により報告された分
類学的シェーマを用いて分類することができる。
【００２４】 当業者には明らかなように、現在、ウキクサの有効な形質転換のために、本発
明の方法で目的の核酸を用いることができる方法が提供されている。例えば、ウ
キクサ植物体を工学的に作製し、疾患や昆虫耐性遺伝子のほか、栄養価を付与す
る遺伝子、抗真菌遺伝子、抗細菌遺伝子または抗ウイルス遺伝子等を発現させる
ことができる。または、治療的（例えば、獣医学的または医学的使用）または免
疫原性（例えば、ワクチン接種用）のペプチドおよびタンパク質を、本発明によ
る形質転換ウキクサを用いて発現させることができる。
【００２５】 同様に、この方法を用いて遺伝子発現を調節するための核酸も導入することが
できる。例えば、導入される核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードす
る。または、ウキクサを１つまたはそれ以上の遺伝子で形質転換し、化学合成（
例えば、プラスチック合成）用または他の工業的工程（例えば、ケラチナーゼ）
用の酵素経路を再生することができる。核酸はウキクサまたは別の生物（すなわ
ち、異種の）からのものでもよい。さらに、目的の核酸は原核生物または真核生
物（例えば、細菌、真菌、酵母、ウイルス、植物、哺乳動物）から得ることがで
き、または核酸配列を全体的または部分的に合成することができる。特に好まし
い実施例において、核酸は分泌されたタンパク質またはペプチドをコードする。
【００２６】 好ましくは、形質転換ウキクサで発現される導入核酸はタンパク質ホルモン、
増殖因子、またはサイトカインをコードし、さらに好ましくは、インスリン、成
長ホルモン（特に、ヒト成長ホルモン）、およびα−インターフェロンをコード
する。または、核酸はβ−グルコセレブロシドを発現することも好ましい。
【００２７】 また、コストまたはロジスティック制約、もしくはその両方のため、現存する
遺伝子発現系により有効に商業的生産ができないペプチドまたはタンパク質をコ
ードする核酸が好ましい。例えば、一部のタンパク質はそのタンパク質が哺乳動
物における細胞生存率、細胞増殖、細胞分化、またはタンパク質構成を妨害する
ため、哺乳動物系では発現することができない。このようなタンパク質には、細
胞芽腫タンパク質、ｐ５３、アンギオスタチンおよびレプチンが含まれるが、こ
れらに限定されるのではない。本発明は哺乳動物の調節タンパク質を生成するた
めに有利に実施することができ、高等植物と哺乳動物との間に大きな進化的隔た
りはあり得ないため、これらのタンパク質はウキクサにおける調節過程を妨害す
ることになる。トランスジェニックウキクサは、現存する発現系の生成利用可能
性を促す、血清アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）、ヘモグロビンおよび
コラーゲンなど大量のタンパク質を生成するためにも用いることができる。
【００２８】 最後に、以下にさらに詳細に述べるように、高等植物系を工学的に作製し、生
物学的に活性の多量体タンパク質（例えば、モノクローン抗体、ヘモグロビン、
Ｐ４５酸化酵素、およびコラーゲン等）を哺乳動物系よりもはるかに容易に生成
（すなわち、合成、発現、構成）することができる。当業者であれば、「生物学
的に活性」の語には、多量体タンパク質であって、該タンパク質が工業的または
化学的な工程における使用、または治療、ワクチン、もしくは診断の試薬として
の使用に重要である十分な活性を有する限り、生物学的活性が天然タンパク質（
例えば、抑制型または増強型）に比べて変化する多量体タンパク質が含まれるこ
とを理解するであろう。
【００２９】 ウキクサにおける生物学的に活性な多量体タンパク質を生成するための１つの
好適な方法では、ポリペプチドサブユニットのすべてをコードする遺伝子を含有
する発現ベクターを使用する。例えば、デュイリングら（During et al.）、（1
990）Plant Molecular Biology 15:281; ヴァン・エンゲレンら（van Engelen e
t al.）、（1994）Plant Molecular Biology 26:1701を参照。次にこのベクター
を、遺伝子銃またはアグロバクテリウム媒介形質転換など周知の形質転換法を用
いてウキクサ細胞に導入する。この方法により、多量体タンパク質を構成するた
めに必要なポリペプチドのすべてを発現するクローン細胞系が得られる。１つの
変法として、各ポリペプチドサブユニットをコードする独立のベクター構造体が
作製される。これらのベクターのそれぞれを用いて、必要なポリペプチドの１つ
のみを発現するトランスジェニック植物の分離クローン系を生成する。次にこれ
らのトランスジェニック植物を交差して、単一植物内の必要なポリペプチドのす
べてを発現する子孫を生成する。ヒアットら（Hiatt et al.）、（1989）Nature
342:76；ヒアットらに対する米国特許第 5,202,422号および第 5,639,947号。 この方法の変形が単一遺伝子構造体を作製し、これらの構造体からのＤＮＡとい
っしょに、このＤＮＡの混合体を衝撃法またはアグロバクテリウム媒介形質転換
、より好ましくは衝撃法を用いて植物細胞に射出する。さらに別の変形として、
ベクターの一部またはすべてが多量体タンパク質の１つまたはそれ以上のサブユ
ニットをコードする（すなわち、それにより多量体タンパク質のサブユニット数
よりも少ないウキクサクローンが交差される）。最後に、場合により、多量体タ
ンパク質のサブユニットのすべてよりも少なく生成すること、または例えば、工
業的または化学的な工程もしくは診断、治療またはワクチン接種の目的のために
形質転換ウキクサ植物体における単一タンパク質サブユニットであるが望ましい
。
【００３０】 Ａ． 発現カセット。 本発明によれば、導入される核酸は発現カセット内に含まれる。発現カセット
は核酸または目的の遺伝子に連鎖された転写開始領域を含有する。この発現カセ
ットは調節領域の転写調節下にある遺伝子または目的の遺伝子（例えば、目的の
１つの遺伝子、目的の２つの遺伝子等々）の挿入のための複数の制限部位を備え
る。好ましくは、発現カセットは目的の単一遺伝子をコードする。本発明の特別
な実施例において、導入される核酸は２つまたはそれ以上の発現カセットを含有
し、それぞれが少なくとも１つの目的の遺伝子（好ましくは目的の１つの遺伝子
）をコードする。
【００３１】 転写開始領域（例えば、プロモーター）は天然または異種もしくは宿主に対し
て外来または異種であってもよく、または自然配列もしくは合成配列でもあり得
る。外来により、これは転写開始領域が該転写開始領域が導入されない野生型宿
主に見出されないことが意図される。本明細書中で用いられる通り、キメラ遺伝
子がコード配列に対して異種である転写開始領域に操作可能に連鎖されるコード
配列を含む。
【００３２】 技術上周知の適切なプロモーターであれば、（細菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳
動物、および植物のプロモーターを含めて）本発明に従ってすべて用いることが
できる。植物プロモーターが好ましく、ウキクサプロモーターが最も好ましい。
好適なプロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター
、オパインシンテターゼプロモーター（例えば、ｎｏｓ，ｍａｓ，ｏｃｓ等々）
、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、リブロースビスリン酸（Ｒ
ｕｂＰ）カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、およびアルコールデヒ
ドロゲナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるのではない。ウ
キクサＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニットプロモーターが技術上周知であ
る。シルバートロンら（Silverthorone et al.）、（1999）Plant Mol. Biol. 1
5:49。植物、好ましくはウキクサに感染するウイルスからの他のプロモーターも
適切であり、サトイモモザイクウイルス、クロレラウイルス（例えば、クロレラ
ウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼプロモーター；ミトラら（Mitra et
al.）（1994）Plant Molecular Biology 26:85）、トマト黄化えそウイルス、 タバコ茎えそウイルス、タバコネクロシスウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマ
ト輪点ウイルス、キュウリモザイクウイルス、ピーナッツ根株（stump）ウイル ス、アルファルファモザイクウイルス、等が含まれるが、これらに限定されるの
ではない。
【００３３】 最後に、プロモーターは所望の調節レベルを与えるために選択することができ
る。例えば、場合により、構成的発現を付与するプロモーターを使用することが
有利であると考えられる（例えば、ユビキチンプロモーター、ＲｕｂＰカルボキ
シラーゼ遺伝子ファミリープロモーター、およびアクチン遺伝子ファミリープロ
モーター）。または、他の条件下には、特異的環境刺激（例えば、熱ショック遺
伝子プロモーター、乾燥誘導遺伝子プロモーター、病原誘導遺伝子プロモーター
、および明／暗誘導遺伝子プロモーター）または植物増殖調節剤（例えば、アブ
シジン酸オーキシン、サイトキニン、およびジベレリン酸により誘導される遺伝
子からのプロモーター）に反応して活性化するプロモーターを使用することが有
利であると考えられる。さらに別の代替として、組織特異的発現を示すプロモー
ター（例えば、根、葉および花の特異的プロモーター）を選択することができる
。
【００３４】 転写カセットは、５’−３’転写方向、転写および翻訳開始領域、目的のヌク
レオチド配列、植物の転写および翻訳末端領域機能に含まれる。技術上周知の適
切な末端配列であれば、本発明に従ってすべて用いることができる。末端領域は
転写開始領域を有する生（native）であっても、目的のヌクレオチド配列を有す
る生であってもよく、または別の起源に由来してもよい。有利な末端領域は、オ
クトピンシンテターゼやノパリンシンテターゼなどＡ．ツメフェシエンスのＴｉ
プラスミドから入手可能である。グエリネオウら（Guerieau et al.）、Mol, Ge
n. Gent. 262, 141 (1991); プラウドフット（Proudfoot）、Cell 64, 671 (199
1); サンファコンら（Sanfacon et al.）、Genes Dey. 5, 141 (1991); モーゲ ンら（Mogen et al.）、Plant Cell 2, 1261 (1990); ムンローら（Munroe et a
l.）、Gen 91, 151 (1990); バラスら（Ballas et al.）、Nucleic Acids Res.
17, 7891 (1989); およびジョシら（Joshi et al.）、Nucleic Aids Res. 15, 9
627 (1987）も参照。追加の好適な末端配列は、エンドウＲｕｂＰカルボキシラ ーゼ小サブユニット末端配列およびカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ末端配
列である。他の適切な末端配列は当業者には明白であろう。
【００３５】 または、目的の遺伝子を技術上周知の他の適切な発現カセットに供給すること
ができる。必要に応じて、形質転換される植物の発現増大のために最適化するこ
とができる。哺乳動物、酵母または細菌もしくは双子葉植物の遺伝子を本発明に
おいて用いる場合は、発現の改善のために単子葉植物またはウキクサ優先双子葉
植物を用いて、それらの遺伝子を合成することができる。技術上、植物優先遺伝
子を合成するための方法が利用可能である。例えば、本明細書中で参考として援
用する、米国特許第 5,380,831号、および第 5,436,391号、ならびにムレイら（
Murray et al.）、Nucleic Acids. Res. 17, 477 (1989）を参照。
【００３６】 発現カセットは、追加的に５’リーダー配列を含むことができる。このような
リーダー配列が作用して翻訳を強化することができる。翻訳リーダーは技術上周
知であり、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５
’非コード領域；エルロイ−シュタインら（Elroy-Stein et al.）、Proc. Nat.
Acad. Sci USA, 86, 6126 (1989)); ポチウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリ
ーダー（タバコエッチウイルス；アリソンら（Allison et al.）、Virology, 15
4, 9 (1986)); ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ；マカヤック（
Macajak）とサルナウ（Sarnow）、Nature 353, 90 (1991)); アルファルファモ ザイクウイルスの外被タンパク質ｍＲＮＡからの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮ Ａ４；ジョブリング（Jobling）とゲールケ（Gehrke）、Nature 325, 622 (1987
)); タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ；ガリー（Gallie）、MOLECULAR
BIOLOGY OF RNA, 237-56 (1989)); およびメイズクロロティックモットルウイル
スリーダー（ＭＣＭＶ；ロンメルら（Lommel et al.）、Virology 81, 382 (199
1))。デラ−チオッパら（Della-Cioppa et al.）、Plant Physiology 84, 965 (
1987）も参照。翻訳を強化することが知られている他の方法、例えば、イントロ
ン等も利用することができる。
【００３７】 目的の外来核酸は、目的のコードペプチドまたはコードタンパク質の発現を特
定の細胞コンパートメントに方向づける移行ペプチドをコードする核酸配列と追
加的に操作可能に関連づけることができる。高等植物ではクロロプラスト、ミト
コンドリア、液胞、および小胞体（細胞外の分泌用）にタンパク質の蓄積をター
ゲッティングする移行ペプチドが技術上周知である。好ましくは、移行ペプチド
は外来核酸から発現されるタンパク質をクロロプラストまたは小胞体にターゲッ
ティングする。タンパク質を小胞体にターゲッティングする移行ペプチドは、分
泌タンパク質の正確な処理に望ましい。クロロプラストへの（例えば、ＲｕｂＰ
カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子からの移行ペプチドを用いた）ターゲッ
ティングタンパク質の発現は、この細胞器官においてきわめて高濃度の組換えタ
ンパク質の蓄積をもたらすことが明らかにされている。ＲｕｂＰカルボキシラー
ゼ移行ペプチドをコードするウキクサ核酸はすでにクローン化されている。ステ
ィークマら（Stiekma et al.）(1983）Nucl. Asids Res. 11:8051-61; ヘレラ−
エストレラら（Herrera-Estrella et al.）に対する米国特許第 5,717,084号お よび第 5,728,925号も参照。エンドウＲｕｂＰカルボキシラーゼ小サブユニット
ペプチド配列が、植物に哺乳動物遺伝子を発現するとともにターゲッティングす
るための用いられている。ヘレラ−エストレラらに対する米国特許第 5,717,084
号および第 5,728,925号。または、哺乳動物の移行ペプチドを用いて、例えばミ
トコンドリアおよび小胞体へ組換えタンパク質発現をターゲッティングすること
ができる。植物細胞は、標的小胞体をターゲッティングする哺乳動物の移行ペプ
チドを認識することが明らかにされている。ヒアットらに対する米国特許第 5,2
02,422号および第 5,639,947号。
【００３８】 発現カセットは、形質転換植物体に導入されて発現されるべき１つまたはそれ
以上に遺伝子もしくは核酸配列を含むことができる。このため、各核酸配列は５
’および３’調節配列に操作可能に連鎖される。または、複数の発現カセットを
備えてもよい。
【００３９】 一般に、発現カセットは形質転換細胞の選択のための選択可能なマーカー遺伝
子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は形質転換された細胞または組織の選択の
ために利用される。選択可能なマーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランス
フェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）やハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰ
Ｔ）をコードするような抗生物質耐性をコードする遺伝子、および除草剤化合物
に対する耐性を付与する遺伝子を含む。除草剤耐性遺伝子は一般に除草剤に対し
て集中的な修飾標的タンパク質または作用する前に植物体内の除草剤を劣化また
は解毒する酵素に一般にコードする。デブロックら（DeBlock el al.）、EMBO J
. 6, 2523 (1987); デブロックら、Plant Physiol. 91, 691 (1989); フロムら （Fromm et al.）、BioTechnology 8, 833 (1990); ゴールドン−カムら（Gordo
n-Kamm et al.）、Plant Cell 2, 603 (1999）参照。例えば、グリリン酸または
スルホニル尿素除草剤に対する耐性が、変異標的酵素、５−エノールピルボイル
シキミ酸３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（Ａ
ＬＳ）の遺伝子コードを用いて得られている。グルホシ酸アンモニウム、ボロモ
キシニル、および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）に対する耐性
が、それぞれの除草剤を解毒するホスフィノチリシンアセチルトランスフェラー
ゼ、ニトリラーゼ、または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸モノオキシゲナーゼ
をコードする細菌遺伝子を用いて得られている。
【００４０】 本発明の目的のために、選択可能なマーカー遺伝子は、遺伝子コードすなわち
、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（フレイリーら（Frayley et al.
）、CRC Critical Reviews in Plant Science 4, 1 (1986)); シアナミドヒドラ
ターゼ（マイアー−グレイナーら（Maier-Greiner et al.）、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 88, 4250 (1991)); アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン 酸シンターゼ（パールら（Perl et al.）、BioTechnology 11, 715 (1993)); ｂ
ａｒ遺伝子（トキら（Toki et al.）、Plant Physiol. 100, 1502 (1992); メア
ガーら（Meagher et al.）、Crop Sci. 36, 1367 (1996); トリプトファンデカ ルボキシラーゼ（ゴジンら（Goddijn et al.）、Plant Mol. Biol. 22, 907 (19
93)); ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ；サザンら（Southern e
t al.）、J. Mol. Appl. Gen. 1, 327 (1982)); ヒグロマイシンホスホトランス
フェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ；シミズら（Shimizu et al.）、Mol. Cell. B
iol. 6, 1074 (1989)); ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＥＦＲ；クヴォクら（Kw
ok et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol, 4552 (1986)); ホスフィノチ リシンアセチルトランスフェラーゼ（デブロックら（DeBlock et al.）、EMBO J
. 6, 2513 (1987)); ２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（ブッハナ ン−ウォラトロンら（Buchanan-Wollatron et al.）、J. Cell Biochem. 13D, 3
30 (1989)); アセトヒドロキシアシドシンターゼ（アンダーソンら（Anderson e
t al.）に対する米国特許第 4,761,373号、ハウンら（Haughn et al.）、Mol, G
en, Genet, 221, 266 (1988)); ５−エノールピルボイルシキミ酸３−リン酸シ ンターゼ（ａｒｏＡ；コマイら（Comai et al.）、Nature 317, 741 (1988)); ハロアリルニトリラーゼ（スタルカーら（Stalker et al）に対する国際公開WO
87/04181号）；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（パーカーら（Parker et al
.）、Plant Physiol. 92, 1220 (1990)); ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓ
ｕｌＩ；ギュエリナウら（Guerineau et al.）、Plant Mol. Bio. 15, 127 (199
0)); および３２kＤａ光系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ；ヒルシュベルクら（Hi
rschberg et al.）、Science 222, 1346 (1983)）を含むが、これらに限定され るのではない。
【００４１】 また、クロラムフェニコール（ヘレラ−エステラら、EMBO J. 2, 987 (1983))
; メトトレキセート（ヘレラ−エステラら、Nature 303, 209 (1983); メイジャ
ーら、Plant Mol. Biol. 16, 807 (1991)); ヒグロマイシン（ウォルドンら、Pl
ant Mol. Bio. 5, 103 (1985); ジージアンら（Zhijian et al.）、Plant Scien
ce 108, 219 (1995); メイジャーら、Plant Mol. Bio. 16, 807 (1991); ストレ
プトマイシン（ジョーンズら（Jones et al.）、Mol. Gen. Genet. 210, 86 (19
87)); スペクチノマイシン（ブレターニュ−サグナードら（Bretagne- Sagnard
et al.）、Transgenic Res. 5, 131 (1996)); ブレオマイシン（ヒルら（Hikke
et al.）、Plant Mol. Biol. 7, 171 (1986)); スルホンアミド（ギュエリナウ ら（Guerineau et al.）、Plant Mol. Bio. 15, 127 (1990)); ブロモキシニル （スタルカーら、Science 242, 419 (1988)); ２，４−Ｄ（ステルバーら（Ster
ber et al.）、Bio/Technology 7, 811 (1989)); ホスフィノチリシン（デブロ ックら）、EMBO J. 6, 2513 (1987)); スペクチノマイシン（ブレターニュ−サ
グナードおよびチュポウ（Chupeau）、Transgenic Research 5, 131 (1996)）に
対して耐性の遺伝子コードも含まれる。
【００４２】 ｂａｒ遺伝子は、ホスフィノチリシン（ＰＰＴ）またはビアラフォス等のグル
フォシネート型除草剤に対して耐性の除草剤を付与する。上述した通り、ベクタ
ー構造体に用いられる選択可能な他のマーカーには、ビアラフォスおよびホスフ
ィノチリシン耐性のためのｐａｔ遺伝子、イミダゾリノン耐性のためのＡＬＳ遺
伝子、グリフォサーテ耐性のためのＥＰＳＰシンターゼ、Ｈｃトキシンに対して
耐性のためのＨｍ１遺伝子、および通常使用され、当業者には周知である選択可
能な他の薬剤が含まれるが、これらに限定されるのではない。一般には、ヤラン
トン（Yarranton）、Curr. Opin. Biotech. 3, 506 (1992); クリストファーソ ンら（Christpherson et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6341 (1992)
; ヤオら（Yao et al.)、Cell 71, 63 (1992); レズニコフ（Reznikoff）、Mol,
Microbiol. 6, 2419 (1992); バークレイら（BARKLEY ET AL.）、THE OPERON 1
77-220 (1980); フら（Hu et al.）、Cell 48, 55 555 (1987); ブラウンら（Br
own et al.）、Cell 49, 603 (1987); フィッジら（Figge et al.）、Cell 52,
713 (1988); ドイチュレら（Deutschle et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 5400 (1989); フューストら（Fuerst et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 2549 (1989); ドイチュレら、Science 248, 480 (1990); ラボウら（La
bow et al.）、Mol. Cell. Biol. 10, 3343 (1990); ザンブレッティら（Zambre
tti et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci; USA 89, 3952 (1992); バイムら（Baim
et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072 (1991); ヴボロスキーら（W
yborski et al.）、Nuc. Acids Res. 19, 4647 (1991); ヒレナンド−ヴィスマ ン（Hillenand-Wissman）、Topics in Mol. And Struc. Biol. 10, 143 (1989);
デーゲンコルブら（Degenkolb et al.）、Antimicrob. Agents Chemother. 35,
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フラヴカら（HLAVKA ET AL.）、HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY 78 (1
985); およびギルら（Gill et al.）、Nature 334, 721 (1988）参照。これらの
開示は本明細書中で参考として援用する。
【００４３】 選択可能なマーカー遺伝子の上記リストは限定することを意味するのではない
。適切なマーカー遺伝子であれば、本発明においてすべて用いることができる。
【００４４】 必要に応じて、導入される選択可能な遺伝子マーカーおよび他の遺伝子ならび
に目的の核酸は、ウキクサにおける最適な発現のために合成することができる。
すなわち、遺伝子のコード配列を改変し、ウキクサにおける発現を強化すること
ができる。合成核酸は形質転換された組織や植物において高レベルで発現される
ようにデザインされている。最適化された選択可能なマーカー遺伝子の使用によ
り、高い形質転換効率が得られる。
【００４５】 遺伝子の合成最適化の方法は技術上、利用可能である。ヌクレオチド配列はウ
キクサにおける発現のために最適化することができ、または単子葉類における最
適な発現のために改変することができる。植物優先コドンはウキクサにおいて発
現されるタンパク質で最高頻度のコドンから決定することができる。ウキクサや
他の単子葉類における発現のために最適化されている遺伝子が本発明の方法で使
用できることが認められている。例えば、本明細書中で参考として援用される、
欧州特許第 0 359 472号、欧州特許 0385 962号、国際公開第WO 91/16432号、パ
ーラックら（Perlak et al.）、proc. natl. Acad. Sci. USA 88, 3324 (1991) 、およびムレイら（Murray et al.）、Nuc, Acids Res. 17, 477 (1989)、等を 参照。さらに、遺伝子配列のすべてまたは一部が最適化され、または合成される
ことが認められている。換言すれば、完全に最適化された配列または部分的に最
適化された配列も使用することができる。
【００４６】 細胞宿主における遺伝子発現を強化する追加の配列改変法が周知である。これ
らには、疑似ポリアデニル化シグナル、エキソン−イントロンスプライス部位、
トランスポゾン状リピート、および遺伝し発現に対して有害であり得る十分に特
徴づけられた他の配列の制限が含まれる。配列のＧ−Ｃ含量は、宿主細胞におい
て発現される周知の遺伝子を参考に計算される所定の細胞宿主に平均レベルに調
整することができる。可能な場合は、配列を改変し、予測されるヘアピン二次ｍ
ＲＮＡ構造体を回避する。
【００４７】 Ｂ． 標的組織およびカルス。 本発明の方法はウキクサ植物体の細胞、好ましくは葉および分裂細胞を形質転
換するために有用である。これらの細胞には、ウキクサ植物体のいずれかの組織
を起源とするカルスも含まれる。好ましくは、カルスの開始で利用される組織は
分裂組織である。または、カルスは他の葉細胞のいずれか、または主にカルスの
形成能があるウキクサの他の組織を起源とすることができる。または、一定の後
続クローン繁殖能のある組織であれば、器官発生または胚子発生によるかに関係
なく、本発明に従ってウキクサを形質転換するために用いることができる。本明
細書中で用いる「器官発生」という語は、葉と根が連続的に分裂中心から発生す
る過程を意味する。また、本明細書中で用いる「胚子発生」という語は、葉と根
がいっしょに、体細胞か配偶子であるかに関係なく、集中的に（連続的にではな
く）発生する過程を意味する。
【００４８】 この方法を用いて細胞浮遊を形質転換することもできる。この細胞浮遊はすべ
てのウキクサ組織から形成することができる。
【００４９】 ウキクサは３種類のカルスを形成する。すなわち（ａ）緻密な半組織的カルス
（Ｉ型と呼ぶ）；（ｂ）破砕性の白色の未分化カルス（ＩＩ型と呼ぶ）；および
（ｃ）緑色の分化カルス（ＩＩＩ型と呼ぶ）である。組織培養では、カルスは２
つの経路、すなわち胚とシュート（ウキクサでは葉がシュート）形成を介しての
み植物を再生することができる。カルス誘導の方法が技術上周知であり、以下の
実施例で明らかにするように、使用される特定の条件を各ウキクサ種および所望
のカルス型のために最適化することができる。好ましくは、Ｉ型カルスおよびＩ
Ｉ型カルス、さらに好ましくはＩＩＩ型カルスを用いて本発明によるウキクサを
形質転換する。
【００５０】 カルスは植物増殖調節剤、すなわちサイトキニンおよびオーキシンを含有する
培地中のウキクサを培養することにより誘導することができる。ウキクサ組織か
らカルス誘導のための好ましいオーキシンには、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）およびナフトキシ酢酸（ＮＡＡ）が含まれる。好ましいオーキ
シン濃度は１〜３０μＭであり、さらに好ましく５〜２０μＭ、しかしさらに好
ましくは５〜１０μＭである。好ましいサイトキニンはベンジルアデニン（ＢＡ
）またはチジアズロン（ＴＤＺ）である。好ましいサイトキニン濃度は、０．１
〜１０μＭであり、さらに好ましくは０．５〜５μＭ、しかしさらに好ましくは
０．５〜１μＭである。別の好ましい実施例では、カルスはＢＡまたはＴＤＺお
よび２，４−ＤまたはＮＡＡのいずれかを含有する培地中のウキクサ組織を培養
することにより誘導される。一般に、低濃度のオーキシンまたは「弱い」オーキ
シン（例えば、インドール酢酸）はカルス形成ではなく葉増殖を促進し、高濃度
のオーキシンまたは「強い」オーキシン（例えば、２，４−Ｄ）はカルス形成を
促進する。カルス形成のための好ましい培地として、Ｎ６培地（チュら（Chu et
al.）、Scientia Sinica 18, 659 (1975)）およびムラシゲとスコッグ（Murash
ige and Skoog）培地（ムラシゲとスコッグ、Physiol. Plant. 15, 473 (1962) ）が挙げられ、ムラシゲとスコッグ培地がより好ましい。一般に、カルス形成頻
度にはばらつきがある。ウキクサ種では、カルスは培養液中２ないし３週間では
不可視であり、カルスが形質転換のために十分な大きさになるまでに４ないし８
週間かかるとみられる。好ましくは、カルス誘導は１〜１０週間で行われ、さら
に好ましくは２〜８週間であり、しかしさらに好ましくは３〜５週間である。カ
ルス増殖のために、好ましい培地はカルス誘導のためにであるが、オーキシン濃
度は低下される。
【００５１】 Ｃ． 衝撃法によるウキクサの形質転換。
【００５２】 本発明の１つの実施例は目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換す
る方法であって、該ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を
保持する少なくとも１つの発現カセットを含む。ヌクレオチド配列は微小発射体
により保持される。発明人が知る限り、バリスティック形質転換の手段により安
定に形質転換ウキクサを生成する既報は存在しない。
【００５３】 本発明の好適実施例によれば、バリスティック形質転換法は、（ａ）標的とし
てウキクサ組織を供給するステップと、（ｂ）細胞壁を穿刺し、組織の細胞内の
ヌクレオチド配列を析出するとともに、組織の細胞内にヌクレオチド配列を蓄積
するために十分な速度でウキクサ組織でヌクレオチド配列を保持する微小発射体
を射出し、形質転換組織を影響するステップとを含む。本発明の特定の実施例で
は、この方法は以下に述べるように、選択剤で形質転換組織を培養するステップ
をさらに含む。さらに別の実施例では、この選択ステップの後に形質転換組織か
ら形質転換ウキクサ植物体を再生するステップを行う。以下に述べるように、方
法はヌクレオチド配列を含有する液体溶液の代わりに、沈殿物（湿性または凍結
乾燥性）のみとしてのヌクレオチド配列で行うことができる。
【００５４】 すべてのバリスティック細胞形質転換装置を本発明の実施で用いることができ
る。好適な装置が、サンドフォードら（Sandford et al.）（Particulate Scien
ce and Technology 5, 27 (1988)）、クラインら（Klein et al.）（Nature 327
, 70 (1987)）、および欧州特許第 0 270 356号により開示されている。このよ うな装置がトウモロコシ細胞（クラインら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4
305 (1988)）、ダイズカルス（クリストウら（Christou et al.）、Plant Physi
ol. 87, 671 (1988)）、マクケイブら（MacCabe et al.）、BioTechnology 6, 9
23 (1988)、酵母ミトコンドリア（ジョンストン（Johnston et al.）、Science
240, 1538 (1988)）、およびクラミドモナス葉緑体（ボイントンら（Boynton et
al.）、Science 240, 1534 (1988)）を形質転換するために用いられている。
【００５５】 本明細書中で開示する調査では、デュポン社により製造された市販のヘリウム
遺伝子銃（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ）を使用した。または、クラインら（Nature
70, 327 (1987)）が報告した通りに構成された装置を利用することができる。 この装置は、調節可能な高さの阻止板により２つの分離区画に分割された衝撃室
（bombardment chamber）を含む。加速管が衝撃室の上部に取付けられている。 微小発射体を発射薬装入により阻止板の加速管に射出させる。阻止板には径が微
小発射体よりも小さい穿孔が形成されている。大発射体は（複数の）微小発射体
を保持するとともに、大発射体は穿孔を目指すとともに発射される。大発射体が
阻止板で阻止されると、（複数の）微小発射体は穿孔の中を射出される。標的組
織を衝撃室に位置決めされ、穿孔の中を射出される（複数の）微小発射体が標的
組織の細胞壁に貫入し、標的組織の細胞内に保持された目的のヌクレオチド配列
を蓄積する。衝撃室は部分的にのみ真空排気されるため、標的組織は衝撃中に乾
燥しない。約４００〜８００ミリメートル・マーキュリの真空が適切である。
【００５６】 別の実施例では、微小発射体を使用せずにバリスティック形質転換が達成され
る。例えば、沈殿物としての目的のヌクレオチド配列を含有する水溶液に大発射
体を保持させることもでき（例えば、表面張力で行われる、微小発射体のない大
発射体の板接触端に直接、水溶液を配置することにより）、水溶液のみが植物の
標的組織に射出される（例えば、上述した同じやり方で大発射体を加速管に射出
させることにより）。他の方法として、核酸沈殿物そのもの（「湿性」沈殿物）
または凍結乾燥ヌクレオチド沈殿物を微小発射体のない大発射体の板接触端に直
接、配置することが挙げられる。微小発射体の非存在下に、ヌクレオチド配列は
微小発射体により保持される場合には必要よりも大きな速度で標的組織で射出さ
れるか、またはヌクレオチド配列を短距離で標的組織に移動させなければならな
い（または両方を必要とする）と考えられる。
【００５７】 現在、微小発射体にヌクレオチド配列を保持させることが好ましい。微小発射
体は、粒子の速度と粒子が移動すべき距離であれば、細胞壁を射出されるべき十
分な速度と粘着性を有するすべての材料から形成することができる。微小発射体
を生成するための材料の非限定的例として、金属、ガラス、シリカ、氷、ポリエ
チレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、および炭素化合物（黒鉛、ダイア
モンドなど）が挙げられる。現在では金属粒子が好ましい。適切な金属の非限定
的例として、タングステン、金、およびイリジウムが挙げられる。粒子は標的組
織内で接触する細胞の過剰な分断を回避するのに十分に小さなサイズであるべき
であり、標的組織内の目的の細胞を貫入するのに必要な慣性を供給するのに十分
に大きくなくてはならない。粒子の直径範囲は約２分の１マイクロメートルから
約３マイクロメートルが適切である。粒子上の表面不規則性がＤＮＡ搬送能を強
化し得るため、粒子は球状である必要はない。
【００５８】 ヌクレオチド配列は沈降により粒子状に固定化することができる。使用する精
確な沈降パラメータは、技術上周知の通り、使用する粒子加速度手順など各要因
によって変動する。担体粒子はポリリシンなど被包性剤で最適に被覆し、欧州特
許第 0 270 356号（第８欄）で考察されている通り、粒子状に固定化されるヌク
レオチド配列の安定性を向上することができる。
【００５９】 標的組織のバリスティック衝撃後、形質転換体を選択するとともに、以下のＥ
節で述べる通り形質転換ウキクサ植物体を再生することができる。
【００６０】 Ｄ． アグロバクテリウム媒介形質転換。
【００６１】 本発明の１つの実施例では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium
rhizogenes）、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いてウ キクサが形質転換される。アグロバクテリウム媒介遺伝子導入は、ＤＮＡを植物
染色体に移入するＡ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲネスの自然能力を活用
するものである。アグロバクテリウムはＡ．ツメファシエンスおよびＡ．リゾゲ
ネスのＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡと呼ばれる領域にコー
ドされる一連の遺伝子を移入する植物病原体である。Ｔｉプラスミドの移入の典
型的な結果は、Ｔ−ＤＮＡが安定に宿主染色体に組込まれるクラウンゴールと呼
ばれる腫瘍増殖である。Ｒｉプラスミドの宿主染色体ＤＮＡへの組込みは、「毛
根病」として知られる症状の原因となる。宿主植物における疾患誘発能はＤＮＡ
の移入および組込みを損なうことなくＴ−ＤＮＡ内遺伝子の欠失により除去する
ことができる。導入すべきＤＮＡは組込みＴ−ＤＮＡのエンドポントを規定する
境界配列に付着される。
【００６２】 工学的に作製されたアグロバクテリウム株の手段による遺伝子導入は、多くの
双子葉耕作植物のためのルーチンとなっている。しかし、アグロバクテリウムを
用いて単子葉植物、特に穀類を形質転換するには大きな困難が経験されている。
発明人が知る限り、アグロバクテリウム媒介形質転換の手段により形質転換ウキ
クサを安定に生産することについてこれまで報告されていない。
【００６３】 以下の考察はＡ．ツメファシエンスを用いてウキクサにおける遺伝子導入を達
成することを焦点とするが、当業者にはこの考察がＡ．リゾゲネスにも十分等し
く適用されることが明らかであろう。Ａ．リゾゲネスを用いた形質転換はＡ．ツ
メファシエンスの形質転換と類似的に開発され、例えば、アルファルファ、ナス
（Salanum nigrum L.）、およびポプラを形質転換するために利用して成功して いる。リアルスら（Ryals et al.）に対する米国特許第 5,777,200号。ブルゲス
ら（Burgess et al.）に対する米国特許第 5,773,693号により記載されている通
り、安全化されたＡ．ツメファシエンス株を用いることが好ましい（以下に記載
）が、野生型Ａ．リゾゲネスを使用してもよい。Ａ．リゾゲネスの実例となる株
は１５８３４株である。
【００６４】 本発明の方法で利用されるアグロバクテリウム株は改変され、遺伝子または目
的の遺伝子、もしくは形質転換細胞で発現すべき核酸を含有させる。形質転換す
べき核酸はＴ領域に組み込まれ、Ｔ−ＤＮＡ境界配列によりフランキングされる
。各種のアグロバクテリウム株が特に双子葉植物用に技術上周知である。このよ
うなアグロバクテリウムを本発明の方法に用いることができる。例えば、フーユ
カース（Hooykaas）、Plant Mol. Biol. 13, 327 (1989); スミスら（Smith et
al.）、Crop Science 35, 301 (1995); クリントン（Chrinton）、Proc.Natl. A
cad. Sci. USA 90, 3119 (1993); モロニーら（Mollony et al.）、Monograph T
heor. Appl. Genet NY 19, 148 (1993); イシダら（Ishida et al.）、Nature B
iotechnol. 14, 745 (1996); およびコマリら（Komari et al.）、The Plant Jo
urnal 10, 165 (1996）を参照。これらの開示は、本発明明細書中で参考として 援用する。
【００６５】 Ｔ領域のほか、Ｔｉ（またはＲｉ）プラスミドはｖｉｒ領域を含有する。ｖｉ
ｒ領域は有効な形質転換のために重要であり、種特異的であると思われる。外来
ＤＮＡおよびｖｉｒ機能を保持する操作された安全化Ｔ−ＤＮＡが個別プラスミ
ド上に存在するバイナリーベクター系が開発されている。このようにして、外来
ＤＮＡ配列（導入すべき核酸）を含む改変Ｔ−ＤＮＡ領域が大腸菌（E. coli） で複製する小さなプラスミドにおいて構成される。このプラスミドは、ビルレン
ス遺伝子配列と親和性のプラスミドを含有するＡ．ツメファシエンスに三親交配
または電気穿孔法により共役的に導入される。ｖｉｒ機能はｔｒａｎｓに供給さ
れ、Ｔ−ＤＮＡを植物ゲノムに導入する。このようなバイナリーベクターが本発
明の実施に有用である。
【００６６】 本発明の好適実施では、Ｃ５８由来ベクターを使用し、Ａ．ツメファシエンス
を形質転換する。または、他の実施例では、スーパーバイナリーベクターが使用
される。例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第 5,591,615およ
び欧州特許第 0 604 662号を参照。このような、きわめて高い形質転換効率を示
すスーパービルレンスＡ．ツメファシエンスに含まれるＡ２８１Ｔｉプラスミド
ｐＴｉＢｏ５４２（ジンら（Jin et al.）、J. Bacteriol. 169, 4417 (1987)）
の高ビルレンス領域から発するＤＮＡ領域を含有するスーパーバイナリーベクタ
ーが構成されている（フッドら（Hood et al.）、Biotechnol. 2, 702 (1984);
フッドら、J. Bacteriol. 168, 1283 (1986); コマリら（Komari et al.）、J.
Bacteriol. 166, 88 (1986); ジンら、J. Bacteriol. 169, 4417 (1987); コマ リ、Plant Science 60, 223 (1987); ATCC Accession第3794号。
【００６７】 当業者に周知の実例としてのスーパーバイナリーベクターとして、ｐＴＯＫ１
６２（本明細書中で参考として援用される、特願平（コカイ（Kokai）4-222527 、欧州特許第 504,869号、欧州特許第 604,662号および米国特許第 5,591,616号
）およびｐＴＯＫ２３３（本明細書中で参考として援用される、コマリ、Plant
Cell Reports 9,303 (1990); イシダら、Nature Biotechnology 14, 745 (1996)
）が挙げられる。他のスーパーバイナリーベクターが上記引例により記載された
方法により構成することができる。スーパーバイナリーベクターｐＴＯＫ１６２
は大腸菌およびＡ．ツメファシエンスにおける複製能がある。また、このベクタ
ーはｐＴｉＢｏ５４２のビルレンス領域からのｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子
およびｖｉｒＧ遺伝子を含む。プラスミドも抗生物質耐性遺伝子、選択可能なマ
ーカー遺伝子、および植物体に形質転換すべき目的の核酸を含有する。ウキクサ
ゲノムに挿入すべき核酸はＴ領域の２つの境界配列間に位置決めされる。ｐＴＯ
Ｋ１６２について上述した特徴を有する本発明のスーパーバイナリーベクターを
構成することができる。本発明の使用のためのスーパーバイナリーベクターおよ
び他のベクターのＴ領域は、射出すべき遺伝子の挿入のための制限部位を有する
ように構成される。または、生体内（in vivo）同種組換えを利用して形質転換 すべきＤＮＡをベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入することができる。ヘレラ−エ
ステレラら、EMBO J. 2, 987 (1983); ホルヒら（Horch et al.）、Science 223
, 496 (1984）を参照。このような同種組換えは、スーパーバイナリーベクター がｐＢＲ３２２または他の同様のプラスミドの領域と同種の領域を有するという
事実に依拠するものである。このため、この２つのプラスミドが結合すると、所
望の遺伝子が同種領域を介した遺伝子組換えによりスーパーバイナリーベクター
に挿入される。
【００６８】 ウキクサを形質転換するために適切なベクターはすべて本発明に従って使用す
ることができる。例えば、目的の異種核酸配列およびフランキングＴ−ＤＮＡを
ｖｉｒ領域を欠くバイナリーベクターにより搬送することができる。次にｖｉｒ
領域は安全化Ｔｉプラスミドまたは二次バイナリープラスミド上に供給される。
別の代替として、異種核酸配列およびＴ−ＤＮＡ境界配列を新しいＴ−ＤＮＡが
最初のＴｉプラスミドＴ−ＤＮＡを置換することによる二重組換え事象によりＴ
ｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ部位に配置することができる。ｖｉｒ領域はＴｉプ
ラスミドにより、またはバイナリープラスミド上で供給することができる。さら
に別の代替では、異種核酸配列およびフランキングＴ−ＤＮＡを、シルパーオー
ルトら（Shilperoort et al.）に対する米国特許第 4,940,838号により記載され
ている細菌染色体に組込むことができ、ｖｉｒ領域は次にＴｉプラスミドまたは
バイナリープラスミド上に供給することができる。
【００６９】 本発明のアグロバクテリウム媒介形質転換法は、いくつかのステップを含むも
のとして考えることができる。基本的なステップには感染ステップと共生培養が
含まれる。一部の実施例では、これらのステップの後に選択ステップを行い、他
の実施例では選択と再生のステップを行う。
【００７０】 最適な前培養ステップを感染ステップの前に含めることができる。前培養ステ
ップは、適切な培地で感染ステップの前にカルス、葉、または他の標的組織を培
養するステップを含む。前培養期間は約１日ないし２１日であり、好ましくは７
日ないし１４日であり得る。このような前培養ステップはトウモロコシ培養の形
質転換を予防するために見出された。例えば、欧州特許第 0 672 752号を参照。
【００７１】 感染ステップでは、形質転換すべき細胞をアグロバクテリウムに曝露する。細
胞は、典型的に液体培地でアグロバクテリウムと接触させる。上述した通り、ア
グロバクテリウムは目的の遺伝子または核酸を含有するために改変されている。
核酸はベクターのＴ−ＤＮＡ領域に挿入される。本発明でも用いられる一般の分
子生物学的方法は当業者には十分に周知である。例えば、サムブロックら（SAMB
ROOK ET AL.）、MOLECULR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1989）。
【００７２】 目的のプラスミドを含有するアグロバクテリウムは、好ましくは約−８０℃で
凍結した保存培養株とともにアグロバクテリウムマスタープレート上に維持する
。マスタープレートを用いて寒天プレートを培養し、次に感染工程で使用するた
めに培地に懸濁されるアグロバクテリウムを得ることできる。または、マスター
プレートからの細菌を用いて、形質転換前の対数期に増殖されるブロス培養株を
培養することできる。
【００７３】 感染ステップおよび共生培養ステップで用いられるアグロバクテリウムの濃度
は形質転換頻度に影響を及ぼすことがある。同様に、きわめて高い濃度のアグロ
バクテリウムは形質転換すべき組織に損傷を与え、カルス反応の低下の原因とな
ることがある。このため、本発明の方法で有効なアグロバクテリウムの濃度は利
用されるアグロバクテリウム株、形質転換される組織、形質転換されるウキクサ
種、等によって変動し得る。特定のウキクサ種または組織の形質転換プロトコー
ルを最適化するために、形質転換すべき組織はさまざまな濃度のアグロバクテリ
ウムで培養することができる。同様に、マーカー遺伝子発現および形質転換効率
のレベルをさまざまなアグロバクテリウム濃度について測定することができる。
アグロバクテリウムの濃度は変動し得るが、一般に濃度の範囲は約１ｘ１０３ｃ
ｆｕ／ｍｌないし約１ｘ１０１０を用い、好ましくは約１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍｌ
ないし約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの範囲であり、さらに好ましくは約１ｘ１０８ ｃｆｕ／ｍｌないし約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌが用いられる。
【００７４】 形質転換すべき組織は一般に形質転換効率を最適化するための濃度のアグロバ
クテリウムを含有する液体接触期にアグロバクテリウム浮遊液に添加する。接触
期はアグロバクテリウムの浮遊液と形質転換すべき組織の最大の接触を促進する
。感染は一般に共生培養ステップ前に１ないし３０分間継続させ、好ましくは１
〜２０分間、より好ましくは２ないし１０分間、さらに好ましくは３ないし５分
間継続させる。
【００７５】 当業者には、条件を最適化し、アグロバクテリウムによる最高レベルの感染お
よび形質転換を達成できることが明らかであろう。例えば、本発明の好適実施例
では、感染および共生培養時に細胞を浸透圧（例えば、０．６Ｍマニトール）に
かける。または、形質転換効率を強化するために、ＩＡＡなどオーキシンを含有
する培地に組織を培養し、細胞増殖を促進することができる（すなわち、アグロ
バクテリウムは有糸分裂時にゲノムに組込むと考えられている）。別の代替とし
て、組織創傷、真空圧、またはアセトシリンゴンを含有する培地での培養を用い
て形質転換効率を促進することができる。
【００７６】 共生培養ステップでは、形質転換すべき細胞をアグロバクテリウムと共生培養
する。典型的に。共生培養は固形培地で行われる。１％スクロースおよび０．６
％寒天を含有するシェンクとヒルデブラント（Shenk and Hildebrandt）培地（ シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）など適切な培地は いずれも利用することができる。最適な共生培養時間は個別の組織でばらつきが
ある。葉は約２ないし７日間、好ましくは２ないし７日間、さらに好ましくは３
ないし５日間、さらに好ましくは４日間アグロバクテリウムと共生培養される。
これに対して、カルスは０．５ないし４日間、さらに好ましくは１ないし３日間
、さらに好ましくは２日間アグロバクテリウムと共生培養される。共生培養は暗
条件または半暗光条件下で行い、形質転換効率を強化する。または、接種ステッ
プについて上述した通り、共生培養はＩＡＡまたはアセトシリンゴンを含有する
培地上で行うことができる。最後に、共生培養ステップは、細胞増殖を強化作用
のあるサイトキニンの存在下に実施することができる。
【００７７】 共生培養ステップ後、形質転換組織は最適な休止および脱汚染化ステップの対
象とすることができる。休止／脱汚染化ステップでは、形質転換細胞はアグロバ
クテリウムの増殖抑制能がある抗生物質を含有する第２の培地に移動される。こ
の休止期は異種核酸を含有する形質転換細胞の回復および増殖を可能とする選択
的圧力の非存在下に実施される。アグロバクテリウムの増殖を抑制するために抗
生物質が添加される。このような抗生物質は技術上周知であり、アグロバクテリ
ウムを抑制するとともに、セホタキシム、チメチン、バンコマイシン、カルベニ
シリン、等を含む。抗生物質の濃度は各抗生物質の標準に従って変動する。例え
ば、固形培地中カルベニシリン濃度の範囲は約５０ｍｇ／ｌないし約２５０ｍｇ
／ｌカルベニシリン、好ましくは約７５ｍｇ／ｌないし約２００ｍｇ／ｌ、さら
に好ましくは約１００〜１２５ｍｇ／ｌとなる。単子葉植物形質転換の当業者は
、抗生物質の濃度が不適切な実験なしに特定の形質転換プロトコールのために最
適化できることを認めるであろう。
【００７８】 休止期培養株は好ましくは暗所または半暗光下、好ましくは半暗光下で休止さ
せる。技術上周知の培地のうちいずれも休止ステップ用に利用することができる
。休止／脱汚染化ステップはアグロバクテリウムの増殖を抑制するとともに、選
択前に形質転換細胞の数を増大するために必要な期間、行うことができる。典型
的に、休止／脱汚染化ステップは選択ステップ前に１ないし６週間、好ましくは
２ないし４週間、さらに好ましくは２ないし３週間行うことができる。さらに好
ましい実施例では、選択期間は共生培養後３週間以内に開始する。一部のアグロ
バクテリウム株は他の株よりも抗生物質耐性である。耐性が低い株については、
脱汚染化は典型的に約５日ごとにカルスに新鮮脱汚染化培地を添加することで実
施される。耐性が高い株については、強力な抗生物質（バンコマイシンなど）を
１日おきにカルスに添加することができる。
【００７９】 共生培養ステップ後、または休止／脱汚染化ステップ後、以下のＥ節に述べる
通り、形質転換体を選択するとともにウキクサ植物体を再生することができる。
【００８０】 Ｅ． 形質転換体の選択と形質転換ウキクサ植物体の再生。
【００８１】 ウキクサ組織またはカルスは、上記のＣとＤの節でそれぞれ詳細に述べた通り
、例えばバリスティック衝撃法またはアグロバクテリウム媒介形質転換により、
本発明に従って形質転換される。形質転換ステップ後、形質転換組織は発現カセ
ットにより誘導される異種核酸からのポリペプチドを受容するとともに発現して
いる細胞を選択するために選択圧がかけられる。形質転換体用の選択剤により、
バリスティック衝撃法またはアグロバクテリウムで発現カセット内に位置決めさ
れ、搬送された少なくとも１つの選択可能なマーカー挿入物を含有する細胞の選
択的な増殖が選択される。
【００８２】 形質転換体（すべての組織型またはカルス由来）の選択が実施される条件は、
本明細書中で開示される方法のうち一般に最も重要な態様である。形質転換工程
では細胞にストレスをかけ、選択工程は形質転換体にさえも毒性であり得る。典
型的に、この問題に応じて、形質転換組織は最初に弱い選択にかけ、低濃度の選
択剤および半暗光（例えば、１〜５μｍｏｌ／ｍ２）を利用し、選択剤濃度の増
大および／または光度の増大により適用選択グラジエントを徐々に増大させる。
選択圧は一時は完全に除去して組織にストレス状態に見える場合は再び圧力をか
けることができる。または、形質転換組織には、選択圧を完全にかける前に、上
記のＤ節で述べた通り、「休止」期を与えることができる。選択培地は一般に、
１％ないし３％スクロースなど単純な炭水化物を含有するため、細胞は光合成を
行うことはない。また、選択は最初に半暗光条件下、または完全な暗所で実施し
、相対的に低レベルで細胞の代謝活性を維持するようにする。当業者には選択を
実施する特異的条件はウキクサのすべて種または株および不適切な実験をせずに
形質転換されるすべての組織型について最適化できることが明らかであろう。
【００８３】 選択ステップには特定の時間制限はない。一般に、選択は非形質転換体を殺傷
するとともに、再生ステップ前に十分なカルス量を生成するために非形質転換細
胞とほぼ同じ速度で形質転換細胞を増殖させるのに十分に長く行われる。このた
め、選択期間は低速度で増殖する細胞では長くなる。例えば、Ｉ型ウキクサカル
スは相対的に緩徐に増殖し、選択は再生前に８〜１０週間行われる。
【００８４】 形質転換された細胞およびカルスから特定の植物体を再生する方法は技術上周
知である。例えば、カモら（Kamo et al.）、Bot. Gaz. 146, 327 (1985); ウェ
ストら（West et al.）、The Plant Cell 5, 1361 (1993); およびダンカンら（
Duncan et al.）、Planta 165, 322 (1985）を参照。形質転換および選択後の葉
の再生は、ＩＩ型およびＩＩＩ型のカルスで最も確実に達成される。例えば、Ｉ
型カルスでの再生は、薄い黄色のカルス表面で出現する葉中心（葉が発生する部
位）で確認できる。典型的に、ウキクサの再生はカルスの増殖を支持する同じ培
地条件下で生じることはない。栄養分のない固体培地（例えば、水寒天または半
強度シェンクとヒルデブラント培地は０．５％スクロールおよび０．８％寒天を
含有する）が好ましい。しかし通常は、完全強度培地で短期間にわたって再生ウ
キクサカルスを断続的に培養し、再生細胞の栄養バランスを維持することが必要
である。場合によっては、株または種を緩徐に再生することにより、この工程は
葉が再生する前に数回反復する必要もある。典型的に、植物増殖調節剤は葉再生
培地に添加しない（葉の組織を抑制するため）が、ＢＡおよびリン酸アデニンな
どサイトキニンにより数種での葉再生を増大することができる。カルス培養株は
カルス培養の長期間にわたって葉の再生能を失うことはない。
【００８５】 再生工程時、技術上周知の方法をすべて利用し、再生植物体が実際に導入され
た目的の核酸で形質転換されていることを確認することができる。例えば、組織
化学的染色、酵素結合抗体免疫アッセイ（ELISA）、サザンハイブリダイゼイシ ョン、ノーザンハイブリダイゼイション、ウェスタンハイブリダイゼイション、
ＰＣＲ、等を用いて、染色組織または再生植物体の形質転換された核酸またはタ
ンパク質を検出することができる。
【００８６】 ここで、ウキクサがバリスティック衝撃法およびアグロバクテリウムを利用し
て形質転換できることが明らかにされた以上、本明細書中で述べた一般の方法の
変更を用いて、効率を増大し、または形質転換に対して何らかの抵抗を示す株を
形質転換することができる。形質転換の効率に影響を及ぼす要因として、ウキク
サの種、感染組織、組織培養の培地組成物、選択可能なマーカー遺伝子、上述し
たステップのうちいずれかの長さ、ベクターの種類、光／暗条件が挙げられる。
特にアグロバクテリウム媒介形質転換では、Ａ．ツメファシエンスまたはＡ．リ
ゾゲネスの濃度および株も考慮に入れる必要がある。したがって、これらや他の
要因は特定のウキクサ種または株の最適な形質転換プロトコールを決定するため
に変化させることができる。すべての種と株が形質転換条件に対して同じ反応を
示すわけではなく、本明細書中に開示したプロトコールのわずかに異なる変更を
必要とすることもある。しかし、それぞれの変数を変更することにより、すべの
ウキクサ系に対する最適なプロトコールを得ることができる。
【００８７】 以下の実施例は実例として提供され、限定されるものではない。実施例に用い
られている通り、“時（hr）”は時間を意味し、“秒（sec）”は秒数を意味し 、“ｇ”はグラムを意味し、“ｍｇ”はミリグラムを意味し、“ｌ”はリットル
を意味し、“ｍｍｏｌ”はミリモルを意味し、“ｍＭ”はミリモルを意味し、“
μＭ”はマイクロモルを意味し、“ｍ”はメートルを意味し、“ｍｍ”はミリメ
ートルを意味し、“ＢＡ”はベンジルアデニンを意味し、“２，４−Ｄ”は２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸を意味し、“ＮＡＡ”はナフタレン酢酸を意味する
とともに、“ＩＡＡ”はインドール酢酸を意味する。
【００８８】 実施例 組織培養： 本節ではウキクサカルスを作製する方法に属する実験を示す。多くの実施例で
はウキクサ株としてイボウキクサ（Lemna gibba）を使用し、この株は培養パラ メータ、すなわち（１）基礎培地調製、（２）植物増殖調節剤の種類と濃度、お
よび（３）導入スケジュールを最適化するために使用した。カルス生成の知見の
増大に伴い、これは他のウキクサ種にも適用された。ウキクサ種は３種類のカル
ス、すなわち（ａ）緻密な半組織的カルス（Ｉ型と呼ぶ）；（ｂ）破砕性の白色
の未分化カルス（ＩＩ型と呼ぶ）；および（ｃ）緑色の分化カルス（ＩＩＩ型と
呼ぶ）を生成する。組織培養では、カルスは２つの経路、すなわち胚とシュート
（ウキクサでは葉がシュート）生成を介してのみ植物を再生することができる。
以下に示したデータは、形質転換ウキクサ植物体が葉のカルス再生の周知の経路
すべてから再生し得ることを明らかに示している。
【００８９】 実施例１ オーキシン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、およびサイト
カイン、ベンジルアデニン（ＢＡ）の１８種類の組合わせを、ウキクサ種、イボ
ウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導に対する影響について試験した。
【００９０】 ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地
（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 28
8（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／
８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％
スクロース、０．１５％ゲルライト（Gelrite）および０．４％ジフコ（Difco）
バクト（Bacto）寒天を含有するムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基
礎培地（ムラシゲとスコーグ、Physiol. Plant. 15, 473（1962)）の１８種類の
１００ｍｌ部を、濃度１０、２０および５０μＭの２，４−Ｄおよび濃度０、０
．０１、０．１、１．０、２．０、および１０．０μＭのＢＡで調製し、２０分
間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１００ｍｌを４個の１００ｍｍ
ｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【００９１】 ３種類の２，４−Ｄ濃度ｘ６種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１
ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で１８処置）を
用いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸
側に配置した。７２個のプレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間
明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２７日後、ウキクサ組織
を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を
継続した。
【００９２】 カルス誘導の頻度で測定された結果（カルスを生成する＃葉／全＃葉）は培養
６２日後に３種類のカルス増殖を示した。（１）緻密な白色−黄色のカルスが確
認され、「Ｉ型」と呼んだ。約５％の低頻度の葉はこの型のカルスを増殖した。
（２）破砕性の白色のカルスが確認され「ＩＩ型」と呼んだ。（３）範囲が細胞
組織の程度の緑色のカルスが確認され、「ＩＩＩ型」と呼んだ。この型のカルス
は培養期間中に増殖した全葉の５０％より多く生成された。３種類のカルスはす
べて異なる頻度で１８種類の２，４−ＤとＢＡの組合わせですべて増殖を明らか
に示した。カルス増殖は、２０〜５０μＭの広範囲の２，４−Ｄ濃度、および０
．０１〜０．１μＭのＢＡ濃度で最も活発であった。
【００９３】 実施例２ オーキシン、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、およびサイト
カイン、ベンジルアデニン（ＢＡ）の４０種類を、イボウキクサ（Lemna gibba ）Ｇ３のウキクサ葉からのカルス誘導のためにオーキシンとサイトカインをより
最適化するために試験した。
【００９４】 ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地
（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 28
8（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／
８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％
スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有する
ムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基礎培地（ムラシゲとスコーグ、P
hysiol. Plant. 15, 473（1962)）の４０種類の１００ｍｌ部を、濃度２０、３ ０、４０、５０、６０、７０、８０、１００μＭの２，４−Ｄおよび濃度０．０
１、０．０５、０．１、０．５および１．０μＭのＢＡで調製した。全培地をｐ
Ｈ５．８に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１０
０ｍｌを４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【００９５】 ８種類の２，４−Ｄ濃度ｘ５種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１
ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で４０処置）を
用いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸
側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８
時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２７日後、ウキクサ組織を同じ
種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を継続し
た。
【００９６】 ６３日の培養後に得られた結果は３種類のカルス、すなわち（１）Ｉ型カルス
、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスが増殖していたことを示し
た。数値頻度データ（カルスを生成する＃葉／全＃葉）の回帰分析（二次反応表
面）は各種型のカルス誘導の葉反応の差を示した。ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型
カルスの頻度は２，４−ＤおよびＤＡの濃度により有意に影響を受けたが、Ｉ型
カルスの頻度は２，４−Ｄ頻度のみにより有意に影響を受けた。広範囲の植物増
殖調節剤で生じる最適なカルス誘導を証明する２，４−ＤまたはＢＡの特異的濃
度は認められなかった。葉の約５０％がＩＩ型カルスを生成し、約２５％がＩＩ
型カルスを生成するとともに、ＩＩＩ型カルスを生成せいたのは５％未満であっ
た。
【００９７】 実施例３ オーキシン、ジカンバ（dicamba）、およびサイトカイン、ベンジルアデニン （ＢＡ）の４０種類を、ウキクサ種、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカル ス誘導について２，４−Ｄに対するジカンバの相対効果を比較するために試験し
た。
【００９８】 ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド（Hoagland）培地
（ホアグランドとスニーダー（Snyder）、Proc. Amer. Soc. Hort. Sci. 30, 28
8（1933)）において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／
８時間暗の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％
スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有する
ムラシゲとスコーグ（Murashige and Skoog）基礎培地（ムラシゲとスコーグ、P
hysiol. Plant. 15, 473（1962)）の４０種類の１００ｍｌ部を、濃度２０、３ ０、４０、５０、６０、７０、８０、１００μＭジカンバおよび濃度０．０１、
０．０５、０．１、０．５および１．０μＭのＢＡで調製した。全培地をｐＨ５
．８に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、各１００ｍ
ｌを４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【００９９】 ８種類のジカンバ濃度ｘ５種類のＢＡ濃度、４種類の複製、１複製当たり１ペ
トリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚の全要因実験計画（全体で４０処置）を用
いた。カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側
に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時
間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養した。２８日後、ウキクサ組織を同じ種
類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下にさらに３５日間培養を継続した
。
【０１００】 ７３日の培養後に得られた結果は３種類のカルス増殖、すなわち（１）Ｉ型カ
ルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスの増殖が確認された。
全体として、カルス増殖は弱く、１０および２０μＭのジカンバ濃度で生じ、３
０μＭ以上ではカルス増殖が生じることはなかった。ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ
型カルスはジカンバに反応して増殖し、Ｉ型カルス増殖は稀であった。
【０１０１】 実施例４ ＢＡと組合わせた２，４−Ｄの２つの濃度を用いて、カルス増殖を維持するこ
とができ、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３で確認された３型からのカルス系 が確立できるかどうかを測定した。
【０１０２】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）において、実験 前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３
℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース、０．１５％ゲ
ルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲとスコーグ基礎培
地を１０および４０μＭ濃度の２，４−Ｄで調製した。全培地をｐＨ５．８に調
節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、それぞれ２００ｍｌ
を８個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１０３】 ４つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つ
の処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウ
キクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２７日間培養
した。４週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養
条件下にさらに４週間培養を継続した。
【０１０４】 ８週間の培養後に３種類のカルス増殖、すなわち（１）Ｉ型カルス、（２）Ｉ
Ｉ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスの増殖が確認された。３種類のカルス
型をそれまで配置されていたのと同一の組成の新鮮培地に移し、同一の培養条件
での培養を４週間の継代培養で継続した。さらに２か月の培養後、１０μＭ ２ ，４−Ｄと０．０１μＭ ＢＡでのＩ型カルスとＩＩＩ型カルスの健常が確立さ れ、カルス培養株を増殖していた。ＩＩ型カルスが増殖することはなかった。カ
ルス増殖は４週間の継代培養スケジュールで維持されたが、継代培養期間の第３
週目および第４週目でカルス低下が認められた。
【０１０５】 実施例５ カルス増殖を維持する継代培養スケジュールをイボウキクサ（Lemna gibba） Ｇ３で試験した。ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒル
デブラント培地（シェンクとヒルデブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)） において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース
、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有するムラシゲと
スコーグ基礎培地を３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０２μＭ ＢＡで調製し、ｐ
Ｈ５．８に調節するとともに、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するととも
に、２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１０６】 ２つの複製、複製当たり５ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つ
の処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウ
キクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養し
た。２週間後、プレートの半分（１０プレート）上のウキクサ組織を同じ種類の
新鮮培地に移し、移動していない組織と同じ温度と光培養条件下に培養を継続し
た。４週間後、組織のカルス増殖を評価した。３種類のカルス、すなわち（１）
Ｉ型カルス、（２）ＩＩ型カルス、および（３）ＩＩＩ型カルスが増殖した。移
動することなく４週間培養されたウキクサ組織と比較して、２週間の時点で移動
した組織間のカルスの種類および増殖に差は確認されなかった。
【０１０７】 Ｉ型カルスおよびＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３％
スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ
２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培養
を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培養
した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性における
突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持する
と成長力を失うことなく継続した。
【０１０８】 実施例６ ２つの異なる基礎培地、ムラシゲとスコーグおよびニッチュとニッチュ（Scie
nce 163, 85 (1969)）を試験し、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘 導の相対的有効性を比較した。
【０１０９】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３％スクロース
、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、３０μＭ ２，４− Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地およびニッチュ とニッチュ培地のそれぞれ５００ｍｌを調製し、ｐＨ５．８に調節するとともに
、２０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、２０個の１００ｍｍｘ１
５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１１０】 ２つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による２つ
の処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウ
キクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養し
た。２週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条
件下に培養を継続した。
【０１１１】 ４週間の培養後にすべてのプレート上の組織のカルス増殖を評価した。ニッチ
ュとニッチュ培地で培養した葉はカルスの有意量を増殖しなかった。この培地上
のウキクサ組織は色が薄く、黄色になり始めていた。ムラシゲとスコーグ培地で
培養したウキクサ葉は通常の３種類のカルス、すなわちＩ型カルス、ＩＩ型カル
ス、およびＩＩＩ型カルスを増殖した。
【０１１２】 Ｉ型カルスおよびＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３％
スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ
２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培養
を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培養
した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性における
突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持する
と成長力を失うことなく継続した。
【０１１３】 実施例７ ３つの異なる基礎培地、ムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、お
よびガムボルグＢ５（ガムボルグら、In Vitro 12, 473 (1976)）を試験し、イ ボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のカルス誘導の相対的有効性を比較した。
【０１１４】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３つの培地のそ
れぞれ５００ｍｌを３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフ
コバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡで調製し、ｐＨ５
．８に調節するとともに、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、
２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１１５】 ２つの複製、複製当たり１ペトリ皿および１ペトリ皿当たり葉５枚による３つ
の処置のランダムブロック実験計画を行った。カルス誘導については、５枚のウ
キクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養し
た。２週間後、ウキクサ組織を同じ種類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条
件下に培養を継続した。
【０１１６】 ４週間の培養後にすべてのプレート上の組織のカルス増殖を評価した。ガムボ
ルグＢ５で培養した葉は色が薄く、黄色の老化葉が存在した。明らかなカルス増
殖は生じなかった。シェンクとヒルデブラント培地で培養した葉は濃い緑色で変
状の葉を増殖し、明らかなカルス増殖は生じなかった。ムラシゲとスコーグ培地
で培養したウキクサ葉は通常の３種類のカルス、すなわちＩ型カルス、ＩＩ型カ
ルス、およびＩＩＩ型カルスを増殖した。
【０１１７】 Ｉ型カルスおよびＩＩＩ型カルスをオリジナルの葉から離して継代培養し、３
％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μ
Ｍ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ培地で培
養を継続した。増殖カルスを２週間間隔で同じ組成の新鮮培地に継続して継代培
養した。移動間の長い間隔により、２週間と３週間との間でカルス健常性におけ
る突然の低下が生じた。カルス増殖は、２週間の継代培養スケジュールを維持す
ると成長力を失うことなく継続した。
【０１１８】 実施例８ ４つの基礎培地、すなわちムラシゲとスコーグ（ＭＳ）、シェンクとヒルデブ
ラント（ＳＨ）、ニッチュとニッチュ（ＮＮ）、およびガムボルグＢ５（Ｂ５）
を用いて液体培地におけるイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のＩＩＩ型カルス 増殖を支持するそれぞれの有効性を比較した。
【０１１９】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３つの培地のそ
れぞれ５００ｍｌを３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジフ
コバクト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１μＭ ＢＡで調製し、ｐＨ５
．８に調節するとともに、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却するとともに、
２０個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１２０】 カルス誘導については、５枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配
置した。２０枚のプレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８
時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２週間後、ウキクサ組織を同じ種
類の新鮮培地に移し、同じ温度と光培養条件下に培養を継続した。
【０１２１】 ４週間後、ＩＩ型カルス組織を用いて、カルス浮遊培養液の液体培地を接種し
た。浮遊カルス確立のために、４つの基礎培地、ＭＳ、ＳＨ、ＮＮ、およびＢ５
のそれぞれ１００ｍｌを３％スクロース、１０μＭ ２，４−Ｄおよび０．０１ μＭ ＢＡで調製した。それぞれの培地をｐＨ５．８に調節し、４つの２５ｍｌ 部分標本を１２５ｍｌフラスコに配置するとともに、全１６フラスコの培地を１
８分間１２１℃で加圧滅菌した。冷却後、各フラスコを１〜２の小部分のＩＩ型
の破砕性の白色カルスを接種した。それぞれのフラスコをアルミフォイルで包む
とともに、暗所で１００ｒｐｍで一定に振盪して２週間、２３℃下に培養した。
【０１２２】 ２週間後にフラスコのカルス増殖を評価した。ムラシゲとスコーグ培地および
ニッチュとニッチュ培地ではわずかな量の増殖が認められた。培地を変更せずに
フラスコをさらに２週間培養し、さらにカルスの増殖は認められなかった。
【０１２３】 実施例９ ウキクサ科の遺伝的多様性を広範囲に代表する１５種にわたる３２のウキクサ
株を用いて、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３で開発されたカルス誘導のため の方法および培地が全科にわたって補外する程度を測定した。
【０１２４】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培
地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗
の光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、６つの基礎培
地すなわち、ムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント（シェンクとヒル
デブラント、Can. J. Bot. 50, 199 (1972)）、ニッチュとニッチュ、Ｎ６（チ ュら、Scientia Sinica 18, 659 (1975)）、ガムボルグＢ５、およびホアグラン
ドの培地を用いた。イボウキクサ（L. gibba）Ｇ３におけるカルス増殖を誘発す
ることが知られている２つの植物増殖調節剤の組合わせ、すなわち３０μＭ ２ ，４−Ｄと０．０２μＭ ＢＡ、および５μＭ ２，４−Ｄと２μＭ ＢＡを用い た。各株のために、それぞれの２００ｍｌの基礎培地を３％スクロース、０．１
５％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天で調製した。２００ｍｌを２個
の１００ｍｌ部分に分け、使用すべきそれぞれを２つの植物増殖調節剤濃度に調
製した。全培地のｐＨは５．８に調整し、３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却
するとともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１２５】 ６培地ｘ２植物増殖調節剤の組合せ、１２処置のランダムブロック実験計画を
用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当たり１個のペトリ皿とペト
リ皿当たり６枚の葉で４回反復した。カルス誘導については、アオウキクサ（Le
mna）、ウキクサ（Spirodela）およびウォルヒエラ（Wolfiella）種の大きな葉 の６枚のウキクサ葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。ミジンコウキク
サ内の株については、小さな葉の群ではなく、個々の葉のコーティングを技術的
に阻止した小さな葉を実験単位として用いた。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ ２ ・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４〜５週間培養した
。この時点で葉の一般的な健康状態（色：緑色〜黄色、および増殖の活力により
判定）および３型すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型のカルス開始の頻度を
評価した。
【０１２６】 結果は、カルス誘導培地に対する異なるウキクサ種の反応性にばらつきを示し
た。一般に、アオウキクサ（Lemna）属およびミジンコウキクサ（Wolffia）属の
種および株が最も反応であった。イボウキクサ（Lemna gibba）の５株はすべて 、５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含有するＭＳ、Ｂ５、およびＮ６培地
上で異なる程度のカルス誘導を示した。レムナ・ミノール（Lemna minor）の両 方の株は同じパターンに従い、イボウキクサ（Lemna gibba）株に対してより大 きな程度のカルス誘導を示した。レムナ・ミニスキュラ（Lemna minisculla）の
両方の株は高頻度のカルス誘導を示し、白色カルスの増殖がレムナ・ミノール（
Lemna minor）またはイボウキクサ（Lemna gibba）とはわずかに異なっていた。
レムナ・エクイノクチアリス（Lemna aequinoctialis）は、オーキシンの最高濃
度で葉のカーリングと膨張を示したが、真カルス培養株の増殖は確認されず、使
用したオーキシン濃度が十分に高くないことを示した。レムナ・ヴァルジヴィア
ーナ（Lemna valdiviana）はカルス誘導を示すことはなかった。ミジンコウキク
サ種では、ウォルヒア・アルヒザ（Wollfia arrhiza[ミジンコウキクサ]）が５ μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを含有するＢ５培地で少量のカルス増殖を示
した。ウォルヒア・ブラジリエンシス（Wolffia brasiliensis）およびウォルヒ
ア・コロンビナーナ（Wolffia columbinana）が５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ
ＢＡを補充したホアグランド培地でカルス誘導を示した。残りのミジンコウキ クサ種、ウォルヒア・オーストラリアーナ（Wollfia australiana）はカルス誘 導を示しことはなかったが、葉は膨張とわずかに異常な増殖を示した。ウォルヒ
エラ種とウキクサ（Spirodela）種はカルス誘導を示すことはなかった。ウキク サ種の葉は高濃度の２，４−Ｄで生存することはなく、低濃度で十分に増殖した
。この反応パターンはウキクサ種がアオウキクサ種やミジンコウキクサ種よりも
オーキシンに対して感受性であるとともに、低いオーキシン濃度はその後の実験
で用いてカルス形成を誘導するべきであるという解釈と一致している。
【０１２７】 表１ 属 種 株記号 起源国 スピロデラ ポリルヒザ [ヒメウキクサ] 7970 米国 [ウキクサ] 4240 中国 8652 中国 8683 ケニア スピロデラ プンクタータ 7488 米国 7776 オーストラリア スピロデラ インターメディア 7178 ウォルヒア アルヒザ 7246 南アフリカ [ミジンコウキクサ] 9006 日本 ウォルヒア オーストラリアーナ 7267 タスマニア 7317 オーストラリア ウォルヒア ブラジリエンシス 7397 ベネズエラ 7581 ベネズエラ 8919 ベネズエラ ウォルヒア コロンビアーナ 7153 米国 7918 米国 ウォルヒエラ リングラータ 8742 アルゼンチン 9137 ブラジル ウォルヒエラ ネオトロピカ 7279 ブラジル 8848 ブラジル ウォルヒエラ オブロンガータ 8031 米国 8751 アルゼンチン レムナ エクイノクチアリス 7558 米国 レムナ ギッバ [イボウキクサ] G3 米国 6861 イタリア 7784 8405 フランス 8678 カシミール レムナ ミノール [コウキクサ] 8744 アルバニア 8627 デンマーク レムナ ミニスキュラ 6600 カリフォルニア 6747 カリフォルニア レムナ ヴァルジヴィアーナ 8821 アルゼンチン 8829 アルゼンチン 実施例１０ ４種類のオーキシン、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−Ｄ、インドール酪
酸（ＩＢＡ）およびジカンバについて、３種類の基礎培地すなわちＳＨ、ＭＳお
よびＮ６でのイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉からのカルス誘導能を試験 した。
【０１２８】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３種類の培地す
なわちムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、およびＮ６を試験した
。サイトキニンとして１μＭの濃度でベンジルアデニンを用いた。オーキシン濃
度はオーキシンの種類でばらつきがあった。比較的強いオーキシン、２，４−Ｄ
およびジカンバの濃度は、０、１、５、１０および２０μＭであった。弱いオー
キシン、ＮＡＡおよびＩＢＡの濃度は０、５、１０、２０および５０μＭであっ
た。各用量反応実験では、２リットルの基礎培地をＢＡで調製し、ｐＨを５．８
に調整した。容量は２０、１００ｍｌ部分の部分標本に分けた。これらの部分の
それぞれに適量のオーキシンを添加し、培地を０．１５％ゲルライトおよび０．
４％ジフコバクト寒天に調整した。培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却
するとともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１２９】 ３培地ｘ４オーキシンｘ５濃度の組合せ、６０処置のランダムブロック実験計
画を用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当たり１個のペトリ皿と
ペトリ皿当たり５枚の葉で２回反復した。カルス誘導については、葉を培地の各
プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度
で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で５週間培養した。５週間後、それ
ぞれオリジナルの葉から発するウキクサ組織の新鮮重量を測定し、これらの組織
集団の誘導されたカルス数および生成されたカルス型について目視的に検査した
。
【０１３０】 結果には多くのトレンドが確認された。まず、低濃度のオーキシンと弱いオー
キシンが葉の増殖を促進する。この増殖はオーキシンなしの増殖度よりも大きい
。葉が増殖中、カルス誘導頻度は低い。高濃度のオーキシンまたは強いオーキン
では、葉のカーリングと増殖の大きな低下が確認された。カルス形成は葉のカー
リングと関係があった。オーキシンの種類（最大のカーリングから最小のカーリ
ングまで）は次の順であった：２，４−Ｄ、ジカンバ、ＮＡＡおよびＩＢＡ。Ｎ
６とＭＳはカルス形成を支持し、ＳＨは支持しなかった。Ｎ６はＭＳよりも大き
な増殖を支持した。Ｎ６ではＭＳ培地よりもカルス形成を誘導するために高濃度
のオーキシンを必要とした。緻密なＩ型カルス誘導について、２，４−Ｄ、ジカ
ンバ、およびＮＡＡはすべて同程度のカルス形成をＭＳ培地で示し、Ｎ６培地で
は２，４−Ｄおよびジカンバのみがカルスを生成した。最大のカルス誘導は１０
μＭ ＮＡＡを含有するＭＳ培地で確認された。
【０１３１】 実施例１１ ４種類のサイトキニン、すなわちベンジルアデニン（ＢＡ）、キネチン、チジ
アズロン（ＴＤＺ）、および２−ｉＰについて、３種類の基礎培地すなわちＳＨ
、ＭＳおよびＮ６でのイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉からのカルス誘導 能を試験した。
【０１３２】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間発育させた。カルス誘導については、３種類の培地す
なわちムラシゲとスコーグ、シェンクとヒルデブラント、およびＮ６を試験した
。オーキシンとしてとして２０μＭの濃度で２，４−Ｄを用いた。サイトキニン
濃度は０、０．０５、０．１、０．５、１および５μＭであった。各用量反応実
験では、２４００ｍｌの基礎培地を２，４−Ｄで調製し、ｐＨを５．８に調整し
た。容量は２０、１００ｍｌ部分の部分標本に分けた。これらの部分のそれぞれ
に適量のサイトキニンを添加し、培地を０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジ
フコバクト寒天に調整した。培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌し、冷却すると
ともに、４個の１００ｍｍｘ１５ｍｍのペトリ皿に混釈した。
【０１３３】 ３培地ｘ４サイトキニン種類ｘ６サイトキニン濃度の組合せ、７２処置のラン
ダムブロック実験計画を用いて各ウキクサ株を試験した。この計画は、複製当た
り１個のペトリ皿とペトリ皿当たり５枚の葉で２回反復した。カルス誘導につい
ては、葉を培地の各プレート上の背軸側に配置した。各プレートを約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で５週間培養し
た。５週間後、それぞれオリジナルの葉から発するウキクサ組織の新鮮重量を測
定し、これらの組織集団の誘導されたカルス数および生成されたカルス型につい
て目視的に検査した。
【０１３４】 結果には多くのトレンドが確認された。葉の増殖は２０μＭの２，４−Ｄ濃度
が高すぎたため全処置にわたって生じることがなかった。葉のカーリングは全処
置にわたって明らかであった。ＭＳとＮ６はカルス誘導を示し、ＭＳが明らかに
勝っていた。ＳＨ培地ではカルス誘導が生じることはなかった。ＴＤＺは広範囲
の濃度にわたってＭＳ培地で最大頻度のカルス誘導を示した。Ｉ型カルスとＩＩ
型カルスの誘導間には釣合が存在する。Ｉ型カルス誘導が高いと、ＩＩ型カルス
誘導は低い。
【０１３５】 実施例１２ コウキクサ（Lemna minor）株８７４４および８２６７が、イボウキクサ（Lem
na gibba）株よりも大きなカルス誘導と急速なカルス増殖を示したため（実施例
９および表１を参照）、Ｌ．ｍｉｏｒについてさらに培養条件の最適化を行った
。カルス誘導について試験した変数には、ａ）基礎培地組成物のスクリーニング
、ｂ）オーキシンの種類と濃度のスクリーニング、およびｃ）サイトキニンの種
類と濃度のスクリーニングが含まれた。
【０１３６】 基礎培地スクリーニングでは、３種類の培地、すなわちシェンクとヒルデブラ
ント、ムラシゲとスコーグ、およびフリック（Frick）により開発されたＦ培地 （フリック、（1991）J. Plant Physiol. 137:397-401）を試験した。３つの実 験で用いた保存葉は使用前に２週間、２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２ｉＰ
を補充したＦ培地で増殖させた。カルス誘導培地は実施例８の通り調製した。葉
を分離し、根を切断するとともに、半分を誘導培地に配置する前に（フリックの
方法に従い）強制的に濾過器に通し、残りの半分の葉をすべてコーティングした
。葉は６週間、実施例８に示した条件下に培養し、６週間の時点で、カルス誘導
の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形態について評価した。
【０１３７】 ムラシゲとスコーグ培地は両方のコウキクサ株で最良のカルス誘導を示した。
シェンクとヒルデブラント培地ではカルスは生成されず、Ｆ培地でのカルス誘導
は最小であった。コーティング前に強制的にふるいに通した葉にはカルス誘導に
対する効果は認められなかった。
【０１３８】 オーキシンの種類と濃度の実験では、４種類のオーキンシ、すなわち２，４−
Ｄ、ＮＡＡ、ＩＢＡおよびジカンバについて、それぞれ４種類の濃度すなわち２
、５、１０および２０μＭで、コウキクサ株８７４４および８６２７からのカル
ス誘導能について試験した。使用した基礎培地はＭＳであり、培地および実験プ
ロトコールは基本的に実施例１０に従った。実験で使用した葉は３種類の培養条
件、すなわち１）植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地、２）２４μＭ ２，４− Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＦ培地、および３）２４μＭ ２，４−Ｄおよび
２μＭ ２−ｉＰを含むＳＨ培地で、カルス誘導時のコーティング前に２週間増 殖させた。葉を分離し、根を切断するとともに誘導培地でコーティングした。こ
れらの葉を実施例８に示した条件下に６週間培養し、６週間の時点で、カルス誘
導の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形態について評価した。
【０１３９】 カルス誘導は誘導オーキシンがＮＡＡまたはＩＢＡである処置のいずれでも確
認されなかった。８７４４株について、５または１０μＭ濃度の２，４−Ｄ処置
では豊富なカルス誘導が確認され、５μＭ ２，４−Ｄで最良の誘導を示した。 カルス誘導はジカンバの最大濃度、２０μＭでも確認された。コウキクサ株８６
２７については、２，４−Ｄおよびジカンバでもカルス誘導は確認されたが、低
濃度では確認されなかった。２，４−Ｄでは、１および５μＭで最も豊富なカル
ス誘導が確認され、５μＭで最良の誘導を示した。カルス誘導のためのジカンバ
の有効な濃度は５および１０μＭであった。カルス誘導処置にかかわらず、カル
ス形成は植物増殖調節剤を含まないシェンクとヒルデブラント培地で予め増殖さ
れた葉からのみ生じた。
【０１４０】 サイトキニンの種類と濃度の実験では、４種類のサイトキニン、すなわちＢＡ
、キネチン、２−ｉＰ、およびチジアルロンについて、それぞれ５種類の濃度す
なわち０．０５、０．１、０．５、１および５μＭで、コウキクサ株８７４４お
よび８６２７からのカルス誘導能について試験した。使用した基礎培地はＭＳで
あり、培地および実験プロトコールは基本的に実施例１１に従った。実験で使用
した葉は３種類の培養条件、すなわち１）植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地、
２）２４μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＦ培地、および３）２４
μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ２−ｉＰを含むＳＨ培地で、カルス誘導時のコー
ティング前に２週間増殖させた。葉を分離し、根を切断するとともに誘導培地で
コーティングした。これらの葉を実施例８に示した条件下に６週間培養し、６週
間の時点で、カルス誘導の有無、カルスが増殖した程度、およびカルスの基礎形
態について評価した。
【０１４１】 ８７４４株については、２−ｉＰまたはチジアズロンのいずれかで、それぞれ
０．５または１μＭのいずれかで豊富なカルス誘導が確認された。カルス誘導培
地でのコーティング前のＦ培地で増殖させた葉でのみカルス誘導が確認された。
コウキクサ株８６２７についても、カルス誘導が２−ｉＰまたはチジアズロンの
いずれかで確認されたが、０．１または０．５μＭの低濃度であった。この株で
は、０．５および１μＭでＢＡを用いてもカルス誘導が確認された。
【０１４２】 実施例１３ コウキクサ株８６２７および８６４４を用いてカルス増殖および長期確立に対
する影響について基礎培地組成物を試験した。
【０１４３】 ３種類の培地組成物、すなわちＭＳ、Ｆ培地および半強ＳＨを、健常なカルス
増殖の維持能について試験した。全培地は３％スクロースを含有し、０．４％ジ
フコバクト寒天および０．１５％ゲルライトでゲル化した。ＭＳ培地は１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡを補充し、半強ＳＨ培地は１μＭ ＢＡを補充するとと
もに、Ｆ培地は９μＭ ２，４−Ｄおよび１μＭ ２−ｉＰを補充した。実施例
１２の通り以前のカルス誘導培地で増殖された株８７４４および株８６２７から
のカルス培養株を実験のために使用した。カルスは２週間の継代培養期間で増殖
させ、増殖、色および一般健康状態を評価した。
【０１４４】 コウキクサ株８７４４については、１μＭ ＢＡを補充した半強ＳＨがカルス の増殖および健康の維持で最良を示し、得られたカルスは組織化および変状の葉
再生の区域を示した。この培地では緑色から薄い黄色の色の区域が存在した。Ｍ
ＳまたはＦ培地でカルスを培養すると、きわめて迅速に増殖し、新鮮重量は６日
ごとに２倍になった。以上２種類の培地で増殖したカルスは、はるかに少ない組
織化と葉の再生を示した。株８６２７については、基礎培地の効果はほとんどな
く、カルス増殖は全３培地で同等に良好であった。株８７４４と同じく、１μＭ
ＢＡで補充した半強ＳＨで増殖させると、カルスはより多くの組織化を示した 。
【０１４５】 実施例１４ コウキクサ（lemna minor）はイボウキクサ（Lemna gibba）よりも大きなカル
ス誘導を示したため、葉の増殖速度およびタンパク質含量を除くすべてについて
、さらに３種類のコウキクサ株の追加のスクリーニングを行い、コウキクサ８７
４４および８６２７からのカルス誘導のプロトコールがこれら新しい株に補外で
きるかどうかを測定した。それぞれの株はコウキクサ（L. minor）７５０１、８
６２６、および８７４５とした。
【０１４６】 以前の実施例で開発されたカルス誘導系は以下の通りであった。３％スクロー
ス、５μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ ＢＡを補充するとともに、０．４％ジフコ
バクト寒天および０．１５％ゲルライトでゲル化したムラシゲとスコーグ培地を
カルス誘導のために用いた。葉は植物増殖調節剤を避けた液体ＳＨ培地で増殖し
、カルス誘導培地でコーティングする前に１％スクロースを補充した。葉をカル
ス誘導培地にコーティングし、５週間後にカルス誘導の相対頻度およびカルス増
殖の相対速度を評価した。
【０１４７】 株８６２６および８７４５については、５週間の誘導期間中にカルス誘導は生
じなかったが、その後の培養により低頻度のカルス増殖が得られた。株８６２６
および８７４５からのカルスの形態および色は、８７４４および８６２７から増
殖したものと変わりはなく、カルス維持培地に移すと十分に増殖した。株７５０
１は低頻度のカルス誘導を示し、カルスの形態は株８６２６および８７４５から
生成されたものとほぼ同じであった。
【０１４８】 実施例１５ レムナ・ミニスキュラ（Lemna minuscula）は最初のスクリーニング時に有意 なカルス誘導を示したため（実施例９参照）、レムナ・ミニスキュラ株６６００
および６７４７でカルス誘導を反復した。カルス誘導培地は実施例１４に記載通
りに調製するとともに葉を培養した。
【０１４９】 レムナ・ミニスキュラの両方の株、６６００および６７４７はきわめて高い頻
度のカルス誘導を示し、事実上すべての葉からカルス増殖が認められた。カルス
開始は、コーティング後２〜３週間に最初に確認されたカルスによりこれらの株
で迅速に生じた。カルスの色は薄く、コウキクサ株８７４４または８６２７から
生じたものよりも緩徐に増殖した（実施例１４参照）。
【０１５０】 実施例１６ 以前の実施例に記載した調査に基づき、ウキクサ科におけるカルスの誘導およ
び増殖の好ましい方法は以下の通りです。
【０１５１】 ウキクサ植物体からのカルスの誘導、増殖および葉の再生は、適切な培地およ
びカルスの形成、増殖および完全に分化された植物体への再組織化を促進する特
異的な発生段階での植物増殖調節剤の種類および濃度の操作により達成される。
典型的に、アオウキクサ属内の種については、カルス誘導の好ましい培地はＮ６
とＭＳであり、最も好ましいのはＭＳである。葉はオーキシンとサイトキニンの
存在下に培養され、好ましいオーキシンはＮＡＡと２，４−Ｄであるとともに好
ましいサイトキニンはＢＡとＴＤＺである。これらの植物増殖調節剤の濃度葉広
範囲にわたってばらつきがある。オーキシンについては、好ましい濃度は５〜２
０μＭであり、最も好ましいのは５〜１０μＭであるとともに、サイトキニンに
ついては、好ましい濃度は０．５〜５μＭであり、最も好ましいのは０．５〜１
μＭである。葉は両方の植物増殖調節剤を含有する培地上で３〜５週間の誘導期
間に培養され、この期間中にカルスが増殖する。
【０１５２】 カルス増殖については、好ましい培地はカルス誘導と同じであるが、オーキシ
ン濃度は低下する。オーキシンの好ましい濃度は１〜５μＭであり、サイトキニ
ンの好ましい濃度は０．５〜１μＭである。継代培養期間もカルス誘導で４〜５
週間から長期カルス増殖で２週間まで削減される。カルス増殖は寒天、ゲルライ
ト、または両方の組合せで、好ましい組合せは０．４％ジフコバクト寒天と０．
１５％ゲルライトゲル化した固形培地または液体培地のいずれかで維持すること
ができる。カルス培養はこの方法を用いた不定期間の健常な状態で維持すること
ができる。
【０１５３】 実施例１７ ミジンコウキクサ（Wolffia）内の株はアオウキクサ（Lemna）内の株と同じよ
うにカルス植物調節剤の濃度に対して反応する。したがって、選択したミジンコ
ウキクサ株のカルス増殖能をさらに調査した。
【０１５４】 ４種類のウォルヒア・アルヒザ株（Wolffia arrhiza）株、すなわち７２４６ 、８８５３、９０００、および９００６ならびに４種類のウォルヒア・ブラジリ
エンシス（Wolffia brasiliensis）、すなわち７３９３、７８５１、７５９１、
および８３１９について、植物増殖調節剤に対するカルス増殖能を試験した。基
礎培地は３％スクロース、５μＭ ２，４−Ｄ、それぞれ５μＭ ＢＡおよびキネ
チン、ならびに６５μＭ フェニルホウ酸を補充したＭＳを使用した。培養株を コーティングし、カルス誘導培地で５週間培養した後、カルス増殖について評価
した。
【０１５５】 カルス増殖は試験したいずれの株からも５週間培養期間中に確認されなかった
。しかし、ウォルヒア・アルヒザ８８５３、９０００、９００６およびウォルヒ
ア・ブラジリエンシス７５８１を含めて前カルス誘導形態がいくつかの株で容易
に確認された。これらの株では、葉の肥厚が明らかであり、カルス形成が明らか
になる前の葉に反応が頻繁に確認され、使用したオーキシン濃度がカルス増殖を
支持するには不十分であることを示している。
【０１５６】 形質転換： この選択は実際の遺伝子導入に用いられる方法に属する実験をカ
バーする。３種類の選択、すなわち（１）遺伝子銃を用いた葉の形質転換、（２
）ウキクサ葉を用いたアグロバクテリウム媒介形質転換、および（３）ウキクサ
カルスを用いたアグロバクテリウム媒介形質転換がある。葉の実験の形質転換を
用いて実際の遺伝子導入に影響を及ぼすパラメータ、すなわち（ａ）細菌増殖、
（ｂ）アセトシリンゴンの含有、（ｃ）細菌濃度、（ｄ）細菌の再懸濁溶液およ
び浸透圧ショックの影響、（ｅ）葉とカルスのための共生培地、（ｆ）接種期間
、（ｇ）葉とカルスのための共生培養時間、および（ｈ）共生培養時の光条件を
最適化した。葉で開発されたプロトコールを適用し、最適化組織培養手順を用い
て得られたカルス培養株を形質転換した。選択に採用されて再生により形質転換
葉を得るのがこの形質転換カルスである。
【０１５７】 遺伝子銃媒介形質転換： 実施例１８ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉を微小担体衝撃法（microcarrier bomb
ardment）の対象とし、外来遺伝子構成体の発現能を試験した。
【０１５８】 葉の増殖については、３％スクロースおよび８％寒天を補充した６０ｍｌの高
塩培地（デ・フォッサード（De Fossard）、TISSUE CULTURE FOR PLANT PROPAGA
TORS 132-52 (1976)）を調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃で２０分間、
加圧滅菌するとともに、これを用いて６個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入
した。１枚の葉を各ペトリ皿に接種した。この葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の
光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。
【０１５９】 衝撃法については、１．６μｍの金微小担体を調製し、プラスミドｐＲＴ９９
からの遺伝子を、メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の遺伝子銃プロトコールに従って
、微小担体上に沈降した。プラスミド、ｐＲＴ９９（トップファーら（Topfer e
t al.）、Nucleic Acid Res. 16, 8725 (1988)）は、いずれもＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの制御下にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子およびβグル
クロニダーゼ遺伝子をコードする（ＧＵＳ； ジェファーソンら、EMBO J. 6, 39
01 (1987)）。
【０１６０】 ウキクサ葉の背軸面を上向きにし、４種類のヘリウム圧力レベル、すなわち８
００、６００、および４００ibs/sq.インチでＤＮＡコーティングした微小担体 を衝撃した。ストンプ（Stomp）（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』 、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従い、基 質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ
−ｇｌｕｃ）を用いたＧＵＳのための組織化学的染色法を衝撃後２４時間に行っ
た。ＧＵＳ陽性染色中心の頻度は衝撃に用いた圧力に直接比例し、ＧＵＳ発現細
胞の最大数は８００ｐｓｉで認められ、頻度の範囲は４〜２０染色細胞／葉であ
った。全処置における衝撃法により半数を超す葉の破壊が生じた。
【０１６１】 実施例１９ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３の葉を微小担体衝撃法の対象とし、外来遺 伝子発現の頻度に対する微小担体サイズの影響を試験した。
【０１６２】 葉の増殖については、３％スクロースおよび８％寒天を補充した２００ｍｌの
高塩培地を調製し、ｐＨを５．８に調整し、１２１℃で２０分間、加圧滅菌する
とともに、これを用いて２０個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。１枚
の葉を各ペトリ皿に接種した。この葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６
時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で２週間培養した。２種類の微小担体サイ
ズ１．０および１．６μｍについて、デュポン社が製造したＰＤＳ−１０００／
Ｈｅ遺伝子銃を用いて３種類のヘリウム圧力レベル、すなわち４００、８００、
および１２００ｐｓｉで試験した。金の微小担体を調製し、プラスミドｐＲＴ９
９からの遺伝子を、メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の遺伝子銃プロトコールに従っ
て、微小担体上に沈降した。
【０１６３】 衝撃したウキクサ葉をストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』
、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の組織化学的染色 法を用いて衝撃後２４時間のＧＵＳ発現について評価した。ＧＵＳ発現の最大頻
度は１．６μｍの微小担体およびヘリウム圧力８００ｐｓｉで衝撃した葉に認め
られた。ＧＵＳ陽性事象の数は葉１枚当たり１〜２１の範囲であった。
【０１６４】 実施例２０ トランスジェニックウキクサ植物体は衝撃法（ballistic bombardment）によ り形質転換されたウキクサカルスから再生される。Ｉ型カルス培養株を以下の実
施例４２に記載通りに増殖させる。典型的に、直径約２〜４ｍｍのウキクサカル
ス２０〜３０個をＭＳ培地（実施例４２に記載したＭＳ培地）上の衝撃区域にわ
たって均等に広げる。実施例１８および実施例１９に記載した通りに金粒子（直
径１．６μＭ）および衝撃法（ヘリウム圧力８００ｐｓｉ）を用いる。衝撃法の
ためのＤＮＡは目的の遺伝子（例えば、ＧＵＳ、別のマーカー遺伝子、哺乳動物
タンパク質をコードする遺伝子、または選択可能なマーカー遺伝子、例えば、ｎ
ｐＩＩ（カナマイシン耐性）、ｈｐｔＩＩ（ヒグロマイシ耐性）、ｓｈ ｂｌｅ （ゾエシン耐性）、およびｂａｒ（ホスフィノトリシン耐性）のほか、遺伝子発
現に必要な他の配列（例えば、プロモーター配列、末端配列）を含む発現プラス
ミドからなる。８００ｌｂｓ／ｓｑ．インチでの衝撃後、カルスを暗所で２日間
（または必要に応じてさらに長く）培養した後、約３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の
光度下に４〜６週間培養した。カルスを２週間ごとに新鮮培地に移し、衝撃後２
〜４週間に選択可能剤を培地に添加した。耐性カルスの選択は、完全に耐性カル
スが生じるまで８〜１６週間継続する。トランスジェニック葉および植物体の再
生を実施例４２に記載した通りに行う。
【０１６５】 ウキクサ葉を用いたアグロバクテリウムによる形質転換： 実施例２１ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養用の２種 類の培地、シェンクとヒルデブラントおよびムラシゲとスコーグを用いたアグロ
バクテリウム・ツメファシエンスに対するウキクサの感受性を試験した。
【０１６６】 アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＴ６５６および非ビルレントＡ．
ツメファシエンス株Ａ１３６を用いてウキクサ葉を培養した。株ＡＴ６５６はｐ
ＴｉＢｏ５４２プラスミド上にｐＴｉＢｏ５４２ ｖｉｒ領域を含むＥＨＡ１０ ５株（フッドら（Hood et al.）、Transgenic Res. 2, 208 (1993)）から構成さ
れている。Ｔ−ＤＮＡはバイナリープラスミド、ｐＣＮＬ５６（リら（Li et al
.）、Pl. Mol. Biol. 20, 1037 (1992)）上に保持される。このバイナリープラ スミドはｐＢＩＮ１９由来であり、ノパリンシンテアーゼプロモーターの制御下
にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子とネオパリンシンテアーゼターミ
ネーター、およびｍａｓ２’−ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にβ−グル
クロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ジャンセンとガードナー（Janssen and Gardne
r）、Plant Mol. Biol. 14, 61 (1989)）およびオクトピンシンテアーゼターミ ネーター保持するように改変されている。ＧＵＳコード領域は遺伝子のコード配
列内にイントロンを含み、ＧＵＳの細菌発現を予防する（ヴァンキャニートら（
Vancanneyt et al.）、Mol. Gen. Genet. 220, 245 (1990)）。Ａ１３６株は広 範囲な宿主株、Ｃ５８由来である。Ｃ５８を３０℃以上の温度で増殖させると、
アビルレントＡ１３６となるＴｉ−プラスミドを喪失する。これら２つの株、Ａ
Ｔ６５６とＡ１３６を、２８℃で１．６％寒天で固形化するとともに１００μＭ
アセトシリンゴンを補充したＡＢ最小培地（クリントンら（Clinton et al.）、
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 3672 (1974)）で一夜増殖させた。
【０１６７】 ウキクサ葉は、３％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実
験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２
３℃で２週間発育させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒
天を含有するシェンクとヒルデブラント５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調
節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。１％スクロースおよ
び０．６％寒天を含有するムラシゲとスコーグ培地５００ｍｌも調製し、ｐＨを
５．８に調製し、３０分間１２１℃下に加圧滅菌するとともに冷却した。両方の
培地にアセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加し
た。２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。各細菌株に
ついて、１個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿からの細菌を以下の溶液すなわち、ガ
ムボルグＢ５塩、ムラシゲとスコーグビタミン、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アス
パラギン酸（２６６ｍｇ／Ｌ）、アルギニン（１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（
８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６．８５％）
、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）１００ｍ
ｌ中に使用の少なくとも１時間前に再浮遊した（ヒエイら（Hiei et al.）、The
Plant J. 6, 271 (1994)。この溶液を調製し、ｐＨを５．８に調整するととも に、細菌の添加前に濾過滅菌した。
【０１６８】 細菌株２ｘ共生培養培地２、複製５、複製当たりペトリ皿２およびペトリ皿当
たり葉２０枚の全要因実験計画（全体で４処置）を用いた。接種のために、ウキ
クサ葉を細菌溶液に数分間浮遊した。共生培養のために、上述した通り葉をシェ
ンクとヒルデブラント培地またはムラシゲとスコーグ培地のいずれかに移した。
葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３
℃で数日間培養した。次に葉をアセトシリンゴンが非存在であることを除き同じ
組成の新鮮培地に移し、チメチン５００ｍｇ／Ｌおよび硫酸カナマイシンを培地
に添加した。
【０１６９】 ストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収
103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従い、ＧＵＳ活性の組織化学的 染色を用いて、葉への遺伝子移入を確認した。Ａ１３６を接種した葉の染色を対
照として行い、細菌接種された葉の内在ＧＵＳ活性を試験した。接種後１０日に
行った染色は、共生培養に用いた基礎培地がＭＳまたはＳＨのいずれかに関係な
く、Ａ１３６接種対照ではＧＵＳ染色を示さず、ＡＴ６５６を接種した葉の染色
で高頻度を示した。元の接種葉の７０％を超える形質転換率が確認され、葉内部
におけるＧＵＳ陽性細胞の存在を示した。
【０１７０】 実施例２２ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵ Ｓ発現頻度に対する創傷の影響を測定した。
【０１７１】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培地
において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の
光期間下に２３℃で２週間増殖させた。共生培養のために、３％スクロースおよ
び０．６％寒天、２０μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、および２０ｍｇ／Ｌアセ
トシリンゴンを含有するムラシゲとスコーグ培地１リットルを調製し、ｐＨを５
．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリ
ンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。４０個の１０
０ｘ１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。
【０１７２】 接種のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を用いる
とともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン
を含有するＡＢ最小培地（クリントンら（Clinton et al.）、Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 71, 3672 (1974)）で２８℃下に一夜増殖させた。接種のために、実 施例２１に記載した通り１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿１個からの細菌を再浮遊
した。
【０１７３】 創傷処置２ｘ細菌接種２、複製５、複製当たりペトリ皿２およびペトリ皿当た
り葉２０枚の全要因実験計画（全体で４処置）を用いた。創傷処置のために、ウ
キクサ葉の塊をＳＨ培地から湿った滅菌濾紙に移した。塊を個々の葉に分離し、
葉の背軸面を上向きにするとともに、２つの方法、すなわち１）葉中心上を横に
切断し、左から右ヘ隣接分裂領域を切断するか、または２）中心の両側を切断し
、各分裂領域を縦に切断する方法の１つで葉を創傷した。細菌処置のために、両
クラスの創傷葉を、１）再浮遊ＡＴ６５６または２）細菌を含まない再浮遊液に
浮遊させた。接種のために、葉を１０〜３０分間浮遊させたままにした。
【０１７４】 共生培養のために、ウキクサ葉を細菌溶液に数分間浮遊した。共生培養のため
に、上述した通り葉を３％スクロースおよび０．６％寒天、２０μＭ ２，４− Ｄ、２μＭ ＢＡ、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するムラシゲと スコーグ培地に移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８
時間暗の光期間下に２３℃で４日間培養した。葉のサブサンプルをストンプ（St
omp）（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-1
14 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の方法に従ってＧＵＳについて染色した。接種
後４日の共生培養葉の染色は、創傷の方向がＧＵＳ染色による葉の頻度に影響を
及ぼすことはなく、平均約７０％であることを示した。細菌を含まない細菌再浮
遊溶液を接種した対照の創傷葉はＧＵＳ染色を示さなかった。分裂領域内の染色
葉の数は平均約４０％であった。
【０１７５】 実施例２３ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵ Ｓ発現頻度に対する細菌再浮遊培地における損傷葉の接種時間の影響を測定した
。
【０１７６】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実
験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２
３℃下に、１２５ｍｌフラスコ中培地２５ｍｌ当たり約１２０葉の密度で増殖さ
せた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含有するシェン
クとヒルデブラント培地１５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分
間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液
を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。６０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿
に各冷却培地から注入した。
【０１７７】 接種時間処置４、複製３、複製当たりペトリ皿５、およびペトリ当たり葉２５
枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、アグロバクテリウ
ム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を用いるとともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマ
イシンおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するＡＢ最小培地で２８℃下
に一夜増殖させた。接種のために、実施例２１に記載した通り１００ｍｍｘ１５
ｍｍペトリ皿１個からの細菌を再浮遊した。
【０１７８】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷し、細菌浮遊液に移すとともに、１５、３０、
４５、または６０分間培養した。共生培養のために、上述した通り、ウキクサ葉
をシェンクとヒルデブラント共生培地に移した。合計６０個のペトリ皿を約４０
μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間
培養した。各接種時間（１５、３０、４５、または６０分）からの共生培養葉の
サブサンプルを共生培養の２、３および６日後に採取した。サブサンプル葉をス
トンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-
114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した 。結果を表ＩＩに示す。
【０１７９】 表ＩＩ 共生培養期間 培養時間 複製 総＃葉 ＃染色 ２日 １５ １ ２７ ２７ ３０ １ ２７ ２７ ４５ １ ２８ ２６ ６０ １ ２８ ２６ ３日 １５ ２ ３０ ２９ ３０ ２ ２８ ２８ ４５ ２ ２５ ２４ ６０ ２ ２７ ２６ ６日 １５ ３ ２７ ２４ ３０ ３ ２６ ２２ ４５ ３ ２３ ２１ ６０ ３ ３０ ２８ 創傷幹端上のＧＵＳ染色は２日で明らかであったが、分裂領域内のＧＵＳ染色
は共生培養２日では明らかではなかった。分裂染色は共生培養３日で最大であり
、共生培養６日で減少した。細菌浮遊溶液でのウキクサ葉の接種時間は共生培養
後の全体的ＧＵＳ発現の頻度に対する有意な影響を示すことはなかった。
【０１８０】 実施例２４ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵ Ｓ発現頻度に対するアグロバクテリウム株および外来遺伝子構成物の影響を測定
した。
【０１８１】 アグロバクテリウム・ツメファシエンス株、すなわちＡＴ６５６およびＣ５８
ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を用いた。Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１は、安全化さ
れた広域宿主範囲Ｃ５８株であり、ｐＢＩ１２１が導入されている。バイナリー
プラスミド、ｐＢＩ１２１はｐＢＩＮ１９由来であり、そのＴ−ＤＮＡはノパリ
ンシンテターゼプロモーターおよびノパリンシンテターゼターミネーターの制御
下にネオマイシンホスホトラスフェラーゼ遺伝子をコードするとともに、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターおよびオクトピンシンテターゼターミネーターの制御下に
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子をコードするβグルクロニダーゼ遺伝子
をコードする。ＡＴ６５６を５０ｍｇ／Ｌで硫酸カナマイシン含有ＡＢ最小培地
で画線するとともに、Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１を５００ｍｇ／Ｌでストレ
プトマイシン、５０ｍｇ／Ｌでスペクチノマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌで硫酸カ
ナマイシン含有ＡＢ最小培地で画線した。両方の細菌株を２８℃下に一夜増殖さ
せた。
【０１８２】 ウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体ホアグランド培地において、実
験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２
３℃で４週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒
天を含有するシェンクとヒルデブラント培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６
に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴ
ンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度２０ｍｇ／Ｌまで添加した。２０個の１００ｘ
１５ｍｍペトリ皿に各冷却培地から注入した。
【０１８３】 ２細菌株処置、２複製、複製当たり５ペトリ皿、および当たり２５枚の葉によ
るランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンスＡＴ６５６株を用いるとともに、５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン
および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有するＡＢ最小培地で２８℃下に一夜
増殖させた。接種のために、実施例２１に記載した通り各株のＡＢプレート１枚
からの細菌を再浮遊した。
【０１８４】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷し、細菌浮遊液に移すとともに、１５〜３０分
間培養した。共生培養のために、上述した通り、ウキクサ葉をシェンクとヒルデ
ブラント共生培地に移した。合計４０個のペトリ皿を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒
の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で６日間培養した。葉のサブ
サンプルを共生培養６日で採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。ＡＴ６５６で
は、採取したウキクサ葉塊１３中１２がＧＵＳ染色を示したが、分裂領域では確
認されなかった。Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１では、すべてのウキクサ葉塊が
広範囲わたる染色を示した。
【０１８５】 硫酸カナマイシンを含有する新鮮培地に移入後１週間の残りのすべての葉につ
いて培養を継続した。増殖葉はカナマイシンに対する３つの反応カテゴリーを示
した。すなわち（１）細菌株ＡＴ６５６により最初に共生培養されたものから発
した葉の約２０％がカナマイシン存在下に活発な増殖を示すとともに、細菌株Ｃ
５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１により最初に共生培養されたものから発した葉の約
３０％がカナマイシン存在下に活発な増殖を示した、（２）葉の別の群が明らか
に増殖せず、クロロフィルが漂白するとともに死滅しかけていた、（３）葉の中
間群がカナマイシン存在下に相当の増殖するも葉が半分漂白し、カナマイシンに
対する感受性を示した。ＧＵＳ染色の結果は、活性酵素が依然、最初に共生培養
した葉に高頻度に存在することを示した。
【０１８６】 実施例２５ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵ Ｓ発現頻度に対するアグロバクテリウム株、外来遺伝子構成物、および葉前処置
の影響を測定した。
【０１８７】 アグロバクテリウム・ツメファシエンス株、すなわちＡＴ６５６およびＥＨＡ
１０１ｐＪＲ１を用いた。ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１は、野生型株、Ｂｏ５４２の高
ビルレンス領域を保持する安全化されたｐＴｉＢｏ５４２および強化されたアル
コールデヒドロゲナーゼ１、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＡＴ６５６と同
じく構成されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子を保持する小バイナリープラスミド
を含有するバイナリーアグロバクテリウム・ツメファシエンス株である。これら
２つの株を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むジャガイモデキストロース寒天上で
画線するとともに２８℃下に一夜増殖させた。
【０１８８】 ウキクサ葉は、増殖速度を増大するために十分な濃度の１０μＭインドール酢
酸（ＩＡＡ）の使用不使用とともに１％スクロースを含有する液体シェンクとヒ
ルデブラントで増殖させた。葉は実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１
６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下、１２５ｍｌ中培地の２５ｍｌ部分標
本内で増殖させた。共生培養のために、１％スクロースおよび０．６％寒天を含
有するシェンクとヒルデブラント培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節
し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾
過滅菌溶液のほか、アセトシリンゴンおよびインドール酢酸を適切な最終培地濃
度まで冷却培地に添加した。２０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から
注入した。
【０１８９】 細菌株処置２ｘ葉増殖培地２、複製５、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当た
り葉２０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、各株の細
菌を実施例２１に記載通りに別個に再浮遊した。接種のために、個々の葉を塊か
ら分離し、それぞれの背軸面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷
し、ＡＴ６５６またはＥＨＡ１０１ｐＪＲ１の細菌浮遊液に移すとともに、１０
〜１５分間培養した。共生培養のために、上述した通り１０μＭインドール酢酸
の使用不使用による１％スクロース、０．８％寒天および１００μＭアセトシリ
ンゴンを含む固形シェンクとヒルデブラント培地に葉の背軸面を下向きにして移
した。
【０１９０】 葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２
３℃で４日間共生培養した。４処置のそれぞれからのプレート２枚をＧＵＳにつ
いて染色した。表ＩＩＩにＧＵＳ染色の結果を示す。
【０１９１】 表ＩＩＩ 培地 株 総＃葉 ＃染色 ＳＨ ＡＴ ６１ １２ ＳＨ ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１ ６２ ４ ＳＨ＋ＩＡＡ ＡＴ ６６ ３２ ＳＨ＋ＩＡＡ ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１ ６８ ２ ＩＡＡの存在または非存在に関係なく、ＥＨＡ１０１ｐＪＲ１と共生培養した
葉はＧＵＳ発現を示す葉の頻度がはるかに低かった。培地におけるＩＡＡの影響
がＩＡＡ含有培地で検出され、ＧＵＳ発現を示す共生培養葉が４８％であったの
に対して、ＩＡＡを含まない培地で共生培養された葉では２０％であった。
【０１９２】 実施例２６ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を５つの異なる時間、すなわ ち１２．５、１８．５、４０．５、８２、および１１２時間、細菌株ＡＴ６５６
と共生培養し、共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する共生時間の影響を試験した
。
【０１９３】 ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体
シェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時
間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に２週間増殖させた。共生培養のために、
１％スクロース、０．８％寒天、１０μＭインドール酢酸、および２０ｍｇ／Ｌ
アセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント７５０ｍｌを調製し、ｐＨを
５．６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。ア
セトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を最終培地濃度まで添加し
た。３０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から注入した。細菌株ＡＴ６
５５をジャガイモデキストロース寒天上で画線するとともに２８℃下に一夜増殖
させた。
【０１９４】 培養時間５、複製６、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉６０枚による
ランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、細菌を実施例２１に記載通
りに再浮遊した。接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を
上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液
に移すとともに約１０〜１５分間培養した。共生培養のために、上述した通り固
形シェンクとヒルデブラント培地に葉の背軸面を下向きにして移した。葉を約４
０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で４日
間共生培養した。
【０１９５】 適切な時間で、葉１０枚をペトリ皿から取出し（６サンプル）、ＧＵＳについ
て染色した。表ＩＶにＧＵＳ染色の結果を示す： 表ＩＶ 時間（hr） 総＃葉 ＃染色 １２．５ ６１ ０ １８．５ ６１ ０ ４０ ６１ ０ ８２ ７５ ２４ １１２ ６７ ２５ 共生培養時間葉ＧＵＳ発現を有する葉の頻度に対して有意な影響を示した。４
０時間前にはＧＵＳ発現は検出不可能であった。３．５日（８２時間）でＧＵＳ
発現は容易に検出可能であった。長い共生培養はウキクサ葉におけるＧＵＳ発現
の頻度、強度、または組織関連パターンを有意に増大することはなかった。３．
５〜４日が遺伝子導入の最大頻度を示す最短共生培養期間であると結論された。
【０１９６】 実施例２７ ３種類の細菌培地、すなわちＡＢ最小、ジャガイモデキストロース、およびマ
ニトールグルタミンルリアブロス上で増殖させたＡＴ６５６株の細菌を用いて、
共生培養前にインドール酢酸の使用不使用により増殖されていたイボウキクサ（
Lemna gibba）Ｇ３を明と暗の状態下に共生培養し、共生培養後のＧＵＳ発現に 対するこれらの処置の影響を試験した。
【０１９７】 イボウキクサＧ３葉は、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌ部分標本に１％スクロ
ースを含有し、１０μＭインドール酢酸の使用不使用による液体シェンクとヒル
デブラントで実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗
の光期間下に２３℃で２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、
０．８％寒天、１０μＭインドール酢酸の使用不使用、および２０ｍｇ／Ｌアセ
トシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント９００ｍｌを調製し、ｐＨを５．
６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセト
シリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶液を最終培地濃度まで添加した。
３６個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に冷却培地から注入した。３種類の細菌培地
、すなわち１）１．６％寒天を含有するＡＢ最小（ＡＢ）、１．６％寒天を含有
するジフコジャガイモ培地（ＰＤＡ）、および１．６％寒天を含むマニトールグ
ルタミン（ロベルツとケール（Roberts and Kerr）、Physiol. Plant Path. 4,
81 (1974）ルリアブロス培地（ＭＧＬ；ミラー（Miller）、EXPERIMENTS IN MOL
ECULAR GENETICS 433 (1972)）を調製し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとと
もに冷却した。硫酸カナマイシンおよびアセトシリンゴンの濾過滅菌溶液をそれ
ぞれ最終培地濃度５０ｍｇ／Ｌおよび２０ｍｇ／Ｌまで冷却培地に添加した。こ
れらの３つの培地でＡＴ６５６を画線するとともに２８℃下に一夜増殖させた。
【０１９８】 細菌培地３ｘ植物培地２ｘ光条件処置２（全体で１２処置）、複製３、複製当
たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０〜２５枚による全要因実験計画を
用いた。接種のために、各培地からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した
。
【０１９９】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに
約１０〜１５分間培養した。培養後、上述した通りに固形シェンクとヒルデブラ
ント共生培地に葉を移した。葉を約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明
／８時間暗の光期間下に２３℃で４日間共生培養し、光処置または暗処置のため
に完全な暗所に配置した。共生培養後、全葉をストンプ（『β−グルコロニダー
ゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991
)）の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した。表ＶはＧＵＳ染色の結果を示 す： 表Ｖ 細菌 植物 明 総 総 ＃染色 培地 培地 または暗 ＃葉 染色 分裂 ＰＤＡ ＳＨ 暗 ６３ ６０ ５ ＰＤＡ ＳＨ 明 ６７ ６６ ８ ＭＧＬ ＳＨ 暗 ６６ ６５ ７ ＭＧＬ ＳＨ 明 ７０ ６５ ９ ＡＢ ＳＨ 暗 ５８ ５８ ７ ＡＢ ＳＨ 明 ６２ ６０ ６ ＰＤＡ ＳＨ＋ＩＡＡ 暗 ６１ ６１ １４ ＰＤＡ ＳＨ＋ＩＡＡ 明 ６８ ６３ １４ ＭＧＬ ＳＨ＋ＩＡＡ 暗 ６２ ６１ １１ ＭＧＬ ＳＨ＋ＩＡＡ 明 ４６ ３９ ２ ＡＢ ＳＨ＋ＩＡＡ 暗 ６２ ６１ ６ ＡＢ ＳＨ＋ＩＡＡ 明 ５８ ５３ ３ 細菌培地は共生培養４日後のＧＵＳ発現の頻度に対して有意な影響を示す。Ａ
Ｂ培地はＧＵＳ発現の最低頻度を示し、ＰＤＡは最高頻度を示した。接種前のイ
ンドール酢酸での葉の増殖は、共生培養後のＧＵＳ発現頻度を増大した。共生培
養時の光の存在はインドール酢酸を使用せずに増殖させた葉を用いた処置におけ
る共生培養後のＧＵＳ発現頻度に有意な影響を及ぼすことはなかったが、暗所で
の共生培養は、インドール酢酸の存在下に増殖させた葉を用いた処置における共
生培養後のＧＵＳ発現頻度を増大した。インドール酢酸を使用したシェンクとヒ
ルデブラント培地で増殖させたウキクサ葉のＰＤＡおよびＭＧＬからの平均頻度
葉、約１７％の分裂組織におけるＧＵＳ発現の頻度を示す。
【０２００】 実施例２８ ６回の共生培養および共生培養時の光の存在と非存在を、共生培養後のＧＵＳ
発現に対する影響について検査した。
【０２０１】 イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を１％スクロースおよび１０ μＭインドール酢酸を含有するシェンクとヒルデブラントで実験前に約４０μｍ
ｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で１７日間間
増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、１％寒天、１０μＭインドー
ル酢酸、および２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント
１５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅
菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインドール酢酸の濾過滅菌溶
液を最終培地濃度まで添加した。この培地を用いて６個の１００ｘ１５ｍｍペト
リ皿に注入した。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＴ６５６株を５０ｍ
ｇ／Ｌおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンでカナマイシンを含有するＡＢ最小
培地で画線し、２３℃下に一夜増殖させた。
【０２０２】 培養時間６、複製６、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉３０枚による
ランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実
施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２０３】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに
１０分間培養した。共生培養のために、上述した通りシェンクとヒルデブラント
培地に移した。プレート３枚をアルミフォイルで包み、完全に暗くするとともに
約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下に
６回、すなわち１３、２３、３６、４９、７３．５、および９３時間培養した。
適切な時間の共生培養後、葉５枚をプレート６枚のそれぞれから取出す（暗サン
プル３枚および明サンプル３枚）とともにストンプ（『β−グルコロニダーゼの
組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)） の手順に従ってＧＵＳ発現のために染色した。
【０２０４】 結果は、ＧＵＳ発現が共生培養後２３時間で明らかとなり、幹の破損端でのみ
発現が検出されることを示した。３６時間では、創傷を囲む細胞および幹の破損
で端染色が検出された。染色は全体的に強かったが、染色強度は暗くして培養し
た葉でより大きかった。４９時間では、明処置に対して暗処置で染色強度および
染色パターンの差が明らかであった。染色は暗くして培養した葉でより大きかっ
たが、ＧＵＳ発現を示す葉の頻度および分裂領域を発現するＧＵＳの頻度は明と
暗の処置間に有意差はなかった。７５．５時間では、創傷組織の染色が暗処置で
より優勢であったことを除き、暗と明の処置間に有意差はなかった。９３時間で
は（約４日）、ＧＵＳ発現が最大数の分裂領域が検出され、暗処置は明らかに明
処置よりも勝っていた。強い染色は依然として創傷細胞に認められた。
【０２０５】 実施例２９ イボウキクサＧ３の葉を用いて、共生培養後のＧＵＳ発現に対する細菌浮遊溶
液、これらの溶液の浸透圧ポテンシャル、および葉創傷の影響を測定した。
【０２０６】 葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラントで実験前に約
４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃で増
殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％未洗浄水、および２０
ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含むシェンクとヒルデブラント１８００ｍｌを調製
し、ｐＨを５．６に調節し、培地を３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷
却した。濾過滅菌溶液として熱不安定アセトシリンゴンを加熱滅菌した冷却培地
に添加した。冷却培地を用いて７２個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
アグロバクテリウムＡＴ６５６株を５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含有するＡ
Ｂ最小培地上で画線し、２８℃下に一夜増殖させた。
【０２０７】 細菌浮遊溶液１２ｘ創傷処置２（全体で２４処置）、複製３、複製当たりペト
リ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０枚による全要因実験計画を用いた。２種類
の細菌浮遊溶液、すなわち１）ガムボルグＢ５塩、ムラシゲとスコーグビタミン
、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（２６６ｍｇ／Ｌ）、アルギニン（
１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミノ酸（５００ｍｇ／
Ｌ）、スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリ
ンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）、および２）１％スクロースを含有するシェンクとヒル
デブラント培地の組合を、それぞれ５種類のマニトール濃度、すなわち０、０．
２、０．４、０．６および０．８Ｍで遺伝子導入におけるそれぞれの効果につい
て試験した。また、２つの別の溶液、すなわち３）ガムボルグＢ５塩、ムラシゲ
とスコーグビタミン、グリシン（８ｍｇ／Ｌ）、アスパラギン酸（２６６ｍｇ／
Ｌ）、アルギニン（１７４ｍｇ／Ｌ）、グルタミン（８７６ｍｇ／Ｌ）、カサミ
ノ酸（５００ｍｇ／Ｌ）、スクロース（６．８５％）、グルコース（３．６％）
、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）、および４）スクロース（６．８５
％）、グルコース（３．６％）、およびアセトシリンゴン（２０ｍｇ／Ｌ）を試
験した。全細菌再浮遊溶液は使用前に濾過滅菌した。接種のために、ＡＢプレー
ト１枚からの細菌を少なくとも使用１時間前に１２の再浮遊溶液のそれぞれ１０
０ｍｌ中に再浮遊した。
【０２０８】 接種前に葉を創傷することの重要性についても試験した。創傷葉または未創傷
葉のいずれかについて、個々の葉をまず塊から分離した。創傷については、背軸
面を上向きにするとともに分裂領域に滅菌メスで傷をつけた。未創傷葉は個々の
葉に分離した後さらに処置した。
【０２０９】 接種のために、創傷６０および未創傷６０の葉１２０枚をそれぞれ１２の細菌
再浮遊培地に１０分間浮遊させ、創傷葉は未創傷葉から分離して接種した。共生
培養のために、上述した通りに固形シェンクとヒルデブラント培地に葉を移した
。全処置を暗所で４日間共生培養した。共生培養の４日後、各処置のプレート２
枚を無作為に取出すとともにＧＵＳ発現のために染色した。
【０２１０】 結果は、培地に関係なく、０．６マニトールが共生培養後のＧＵＳ発現の最高
頻度を示すことを示した。単純なシェンクとヒルデブラント培地調製液はガムボ
ルグＢ５塩を用いた複雑な培地と同じく良好な作用を示した。創傷は、統計的に
有意ではないものの、ＧＵＳ発現を示す頻度の測定可能な増大を示し、分裂領域
における染色頻度を増大することはなかった。
【０２１１】 実施例３０ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、共生培養後のＧＵ Ｓ発現頻度に対する接種時の細菌濃度の影響を試験した。
【０２１２】 ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体
シェンクとヒルデブラント培地において、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１
６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌの
部分標本内で使用前２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、１
％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および１０μＭインドール酢酸を含む
シェンクとヒルデブラント培地７５０ｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０
分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンおよびインド
ール酢酸の濾過滅菌溶液を添加し、最終培地濃度を得た。冷却培地を用いて３０
個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を
１．６％ジフコバクト寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、および５０ｍｇ／
Ｌ硫酸カナマイシンを含む半強ジフコジャガイモデキシトロース寒天−マニトー
ルグルタミンルリアブロス培地で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２１３】 細菌濃度処置１０、複製３、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり個
別の葉またはペトリ皿当たり植物２０塊によるランダムブロック実験計画を用い
た。接種のために、１ペトリ皿からの細菌を実施例２１に記載した通り再浮遊し
た。この細菌溶液は「非希釈」サンプルを構成するとともに以下の希釈、すなわ
ち、１／３、１０−１、１／３３、１０−２、１／３３３、１０−３、１／３３
３３、１０−４、１０−５の一連の希釈シリーズの開始となった。１／３希釈は
１．００６のＯＤ５４０ｎｍであり、これは約１．６ｘ１０９細菌／ｍｌに対応
した。
【０２１４】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。次に葉を１０種類の細菌再浮遊溶液濃度
のそれぞれに移すとともに約１０〜１５分間培養した。共生培養のために、上述
した通り、ウキクサ葉の背軸面を下向きにしてシェンクとヒルデブラント共生培
地に移した。葉を暗くして２３℃下、４日間共生培養した。共生培養後、ストン
プ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114
(S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従いＧＵＳ発現のために染色した。
【０２１５】 結果は、ＧＵＳ発現の頻度が細菌濃度全体で１０倍変動することを示した。Ｇ
ＵＳ発現の最大頻度は試験した最高細菌濃度で確認された。１０−３を超える希
釈ではＧＵＳ発現は検出されなかった。
【０２１６】 実施例３１ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３のウキクサ葉を用いて、最適化形質転換プ ロトコールを用いたＧＵＳ発現に対する４種類の共生培養培地の影響を試験した
。
【０２１７】 ウキクサ葉は、１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含有する液体
シェンクとヒルデブラント培地において、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１
６時間明／８時間暗の光期間下に２３℃下に増殖させた。共生培養のために４種
類の培地、すなわち１）２０μＭ ２，４−Ｄおよび０．１μＭ ＢＡを含むムラ
シゲとスコーグ培地（ＭＳ）（ＭＳ１）、２）２０μＭ ２，４−Ｄおよび１μ Ｍ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ２）、３）２０μＭ ２，４−Ｄおよび２μＭ Ｂ Ａを含むＭＳ培地（ＭＳ３）、および４）シェンクとヒルデブラント培地（ＳＨ
）を用いた。各培地について、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０
．４％ジフコバクト寒天を含有する１００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し
、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴ
ン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用
いて４個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ
／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデ
キシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２１８】 培地処置４、複製４、複製当たりペトリ皿１、およびペトリ皿当たり葉２０枚
によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細
菌を使用前の１時間、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセ
トシリンゴンを含む濾過滅菌ＳＨ培地１００ｍｌ中に再浮遊した。接種のために
、個々の葉を塊から分離し、再浮遊細菌に８〜１０分間浮遊した。共生培養のた
めに、上述した通りに共生培地（ＭＳ１、ＭＳ２、ＭＳ３、ＳＨ）に移した。葉
を暗くして２３℃下、４日間共生培養した。共生培養の４日後、全葉をＧＵＳ発
現のために染色した。
【０２１９】 ＧＵＳ発現を示す葉の頻度は全処置にわたって８０〜９０％の範囲であった。
共生培地はこの頻度に有意な影響を示さなかった。ＧＵＳ染色の強度は軽度ない
し強度の範囲であった。染色は根先端、幹、幹の破損端および創傷、分裂領域、
および葉縁に関連していた。
【０２２０】 実施例３２ アグロバクテリウムを用いた葉の形質転換は、接種前の葉の細胞分裂速度、ア
グロバクテリウムを増殖させる培地、アセトシリンゴンなど二次代謝産物を含む
共生培養パラメータの最適化、アグロバクテリウムの濃度、接種液の浸透圧、共
生培養の期間、および共生培養期間の光度の操作により達成される。
【０２２１】 これまでの実施例に述べた試験に基づき、葉の形質転換および選択の好ましい
方法は以下の通りである。典型的に、葉は葉の増殖速度を増大するオーキシンを
含有する培地で増殖させ、ＮＡＡ、ＩＢＡおよびＩＡＡが好ましいオーキシンで
あるとともに好ましい濃度は０．２〜１μＭの範囲である。アグロバクテリウム
は高栄養補充物を含まず、アセトシリンゴンなどの二次代謝産物を含む培地で増
殖され、好ましい培地としてはジャガイモデキシトロース寒天やマニトールグル
タミンルリアブロスである。形質転換の頻度は接種液の組成により決定され、好
ましい液体は０．６Ｍマニトールおよび１００μＭアセトシリンゴンを補充した
ＭＳまたはＳＨ基礎塩である。この接種液中に再浮遊されるアグロバクテリウム
の濃度は形質転換の頻度に影響を及ぼし、好ましい濃度はおよそ１ｘ１０９細菌
／ｍｌである。接種時間にはばらつきがあり、好ましい時間の範囲は２〜２０分
のである。共生培養時間も形質転換の頻度に影響を及ぼし、３〜４日が好ましい
時間である。共生培養は光または暗条件下に行うことができ、暗いこと（例えば
、半暗光）が好ましい。
【０２２２】 形質転換葉の増殖も好ましい条件に依存する。ＭＳおよびＳＨが好ましい培地
である。感染アグロバクテリウムからの葉の脱汚染化は、典型的に１００〜５０
０ｍｇ／Ｌの高濃度の適切な抗生物質を用いて行われ、好ましい方法は２〜４日
ごとに抗生物質を含む新鮮培地に移動することである。好ましい範囲が１〜５μ
ｍｏｌ／ｍ２・秒の低光度下の培養は、最初の休止／回復期間が３〜６週間が好
ましい。
【０２２３】 選択剤の存在下の増殖による選択は異なる時点で開始することができ、好まし
い時点は接種後１〜３週間である。低い光レベルおよび低い選択剤濃度での最初
の選択も好ましく、１〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の光レベルおよび低濃度の範囲が
特的薬剤の毒性試験から測定された選択剤に適している。硫酸カナマイシンの典
型的な範囲は２〜１０ｍｇ／Ｌである。
【０２２４】 実施例３３ ウキクサ１０種内の株、すなわち、レムナ・トリスルカ（Lemna trisulca）７
３１５、レムナ・ミノール（Lemna minor）７１０１、レムナ・ジャポニカ（Lem
na japonica）７４２７、レムナ・ツリオニフェラ（Lemna turionifera）６６０
１、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３、レムナ・ヴァルジヴィアナ（Lemna val
diviana）７００２、レムナ・エクイノクティアリス（Lemna aequinocitalis） ７００１、レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）６７１１、レムナ・オブ スキュラ（Lemna obscula）７３２５、およびスピロデラ・プンクタータ（Spiro
dela punctata）７３２７の葉について、イボウキクサＧ３で開発された形質転 換プロトコールを用いた共生培養後のＧＵＳ発現を示す能力を試験した。
【０２２５】 イボウキクサＧ３を除く全ウキクサ株を、１２５ｍｌフラスコ中２５ｍｌの部
分標本内で１％スクロースを含む液体シェンクとヒルデブラント培地で増殖させ
た。イボウキクサＧ３は１％スクロースおよび１０μＭインドール酢酸を含むシ
ェンクとヒルデブラント培地で増殖させた。全ウキクサ培養株を約４０μｍｏｌ
／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗の光期間下２３℃下で培養した。共生
培養のために、１％スクロース、０．９％寒天、および２０ｍｇ／Ｌアセロシリ
ゴンを含有するシェンクとヒルデブラント培地４００ｌを調製し、ｐＨを５．６
に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴ
ンおの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を得た。冷却培地を用い
て１０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム・ツメフ
ァシエンス株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫
酸カナマイシンを含有する半強マニトールグルタミンルリアブロス培地と混合し
た半強いジャガイモデキシトロース寒天で２８℃下一夜、画線した。
【０２２６】 ウキクサ株処置１０、複製１、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉２０
〜２５枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿
からの細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２２７】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに約１
０分間培養した。共生培養のために、上述した通りシェンクとヒルデブラント培
地に移すとともに２３℃下、暗くして４日間培養した。
【０２２８】 共生培養後、ＧＵＳ発現のために葉を染色した。試験した１０株中８株がイボ
ウキクサ（L. gibba）Ｇ３と同一のパターンであるとともに１４％ないし８０％
の範囲の頻度でＧＵＳ発現を示した。
【０２２９】 実施例３４ ウキクサ科（Lemnaceae）の４属からのウキクサ２０株をイボウキクサ（L. gi
bba）Ｇ３で開発された形質転換プロトコールを用いた共生培養後のＧＵＳ発現 を示す能力を試験した。２０株は、ウォルヒエラ・リングタータ（Wolffiella l
ingulata）株８７４２および９１３７、Ｗｌ．ネオトロピカ（Wl. neotropica）
株７２７９および８８４８、Ｗｌ．オブロガータ（Wl. oblogata）株８０３１お
よび８７５１、ウォルヒア・アルヒザ（Wolffia arrhiza）株７２４６および９ ００６、Ｗａ．オーストラリアーナ（Wa. australiana）７３１７、Ｗ．ブラジ リエンシス（Wa. brasiliensis）株７３９７、７５８１、および８９１９、Ｗａ
．コロンビアーナ（Wa. columbiana）株７１２１および７９１８、スピロデラ・
インターメジア（Spirodela intermedia）７１７８、Ｓ．ポリヒザ（S. polyrrh
iza）株７９６０および８６５２、Ｓ．プンクタータ（S. punctata）株７４８８
および７７７６、およびイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３であった。
【０２３０】 全株を、１％スクロース、ｐＨ５．６を含む液体シェンクとヒルデブラント培
地で実験前の２週間増殖させた。共生培養のために、１％スクロース、０．８％
寒天、および２０ｍｇ／Ｌアセロシリゴンを含有するシェンクとヒルデブラント
培地１，５００ｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、３０分間１２１℃で加圧滅
菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し
、最終培地濃度を得た。冷却培地を用いて６０個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に
注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／
Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下一
夜、増殖させた。接種のため、１ペトリ皿からの細菌を使用前の少なくとも１時
間、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含
むシェンクとヒルデブラント培地に再浮遊した。
【０２３１】 ウキクサ株処置２０、複製３、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たり葉２０
枚によるランダムブロック実験計画を用いた。スピロデラ株とウォルヒエラ株お
よびイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３の個々の葉を塊から分離した。ウォルヒア株
については、サイズが小さく個々の葉の分離が困難であるため塊として接種した
。接種のために各ウキクサ株の葉を細菌浮遊溶液に２〜５分間浮遊した。共生培
養のために、上述した通り固形シェンクとヒルデブラント培地に移した。スピロ
デラ株とウォルヒエラ株およびイボウキクサＧ３については、個々の葉をそれぞ
れ３個の複製皿に移し、ウォルヒア株については、２０の小さな葉塊をそれぞれ
３個の複製プレートに移した。全株を暗くして２３℃下に４日間共生培養した。
【０２３２】 共生培養後、各株のプレート２枚をＧＵＳ発現のために染色した。染色結果は
試験した１種以外のすべてと種内の大半のウキクサ株が共生培養後４日で相当の
ＧＵＳ発現を示すことを示した。試験した４つのウォルヒア種のうち、すべてが
異なる頻度のＧＵＳ発現を示した。Ｗ．ブラジリエンシス株の３つは範囲５０〜
７５％の最高頻度のＧＵＳ発現を示した。ウォルヒア属内の６株の全体にわたっ
て、ＧＵＳ発現頻度は５〜１２％と低かった。３つのスピロデラ種のうち２つは
１０および３５％のＧＵＳ発現を示し、３番目はＧＵＳ発現を示さなかった。陽
性対照として用いたイボウキクサＧ３は約５０％のＧＵＳ発現頻度を示した。
【０２３３】 カルス培養株を用いたアグロバクテリウムによる形質転換： 実施例３５ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉から生成されるＩ型カルスを用いて、イ ボウキクサ（L. gibba）Ｇ３葉で開発された最適化形質転換プロトコールを用い
たＧＵＳ発現能を試験するとともに真空浸潤の影響を試験した。
【０２３４】 Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、および２μ ＭＢＡ（ＢＡ）を含有するムラシゲとスコーグ培地で葉を増殖することで生成さ
れた。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・
秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊
を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを含む同じ培地で培養した。実験用
に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。 共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコ
バクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ
培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２０分
間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却培地
に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて１６個の１０
０ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリ
ンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒
天で画線し、２８℃下一夜、増殖させた。
【０２３５】 真空浸潤処置２、複製４、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たりカルス１０
個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．
６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシ
ェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。
細菌による接種は真空浸潤の使用不使用で行った。真空浸潤を使用しない場合は
、少数のＩ型カルスを細菌溶液に１０分間配置し、ブロッティングするとともに
、上述した通りＭＳ共生培地に移した。真空浸潤を使用する場合は、カルスを細
菌溶液に配置し、１０インチマーキュリーの真空を１０分間かけ、カルスをブロ
ッティングするとともにＭＳ共生培地に移した。全皿を２３℃で暗くして共生培
養した。
【０２３６】 共生培養の４、６および９日後に、それぞれ約４０、２０および２０個のカル
スをＧＵＳ発現のために染色した。結果は、ＧＵＳ発現を示すカルスの頻度が真
空浸潤に対して変化せず、共生培養の期間によっても頻度が変化しないことを示
した。全時点にわたって真空浸潤を使用しない場合、ＧＵＳ染色の範囲は２５〜
７８％であり、真空浸潤をした場合の頻度は２５〜７４％の範囲であった。ＧＵ
Ｓ染色の強度は、濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあり、処置との相関
を示さなかった。
【０２３７】 実施例３６ ４種類の共生培地について、アグロバクテリウム株ＡＴ６５６によるＩ型カル
スの共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する影響を試験した。
【０２３８】 Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ
培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３
℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カル
ス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを
含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカ
ルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２３９】 共生培養のために、４種類の培地、すなわち、２０μＭ ２，４−Ｄおよび０ ．１μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）（ＭＳ１）、２０μＭ ２
，４−Ｄおよび１μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ２）、２０μＭ ２，４−Ｄお
よび２μＭ ＢＡを含むＭＳ培地（ＭＳ３）、および植物増殖調節剤を含まない シェンクとヒルデブラント培地（ＳＨ）を試験した。３％スクロース、０．１５
％ゲルライトおよび０．４％ジフコバクト寒天を含有する各培地５０ミリリット
ルを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに
冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度
を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて２４個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注
入した。細菌株ＡＴ６５６を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ
硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一
夜増殖させた。
【０２４０】 共生培地処置２、複製２、複製当たりペトリ皿１、ペトリ皿当たりカルス２０
個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．
６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したＳ
Ｈ培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カ
ルス細菌溶液に８分間配置し、ブロッティングするとともに、４種類の共生培地
に移した。全プレートを２３℃で暗くして４日間共生培養した。共生培養後、全
カルスをＧＵＳ発現のために、ストンプ（『β−グルコロニダーゼの組織化学的
局在』、GUS PROTOCOLS所収 103-114 (S.R. Gallagher ed. 1991)）の手順に従 い染色した。
【０２４１】 共生培地はＧＵＳ発現を死すカルスの頻度に対して有意な影響を示すことはな
かった。全処置にわたって、ＧＵＳ発現頻度の範囲は７０〜８５％であった。Ｇ
ＵＳ発現の強度は濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあった。
【０２４２】 実施例３７ ２日と４日の２種類の共生培養期間について、アグロバクテリウム株ＡＴ６５
６によるＩ型カルス共生培養後のＧＵＳ発現頻度に対する影響を試験した。
【０２４３】 Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ
培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３
℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カル
ス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを
含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカ
ルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２４４】 共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジ
フコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシ
ゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分
間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を
各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて１６
個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を
２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャ
ガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増殖させた。
【０２４５】 共生培養期間２、複製２、複製当たりペトリ皿４、ペトリ皿当たりカルス１０
個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０．
６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシ
ェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。
接種のために、Ｉ型カルス細菌溶液に配置した。全プレートを２３℃で暗くして
４日間共生培養した。２日または４日のいずれかの共生培養後、全カルスをＧＵ
Ｓ発現のために染色した。
【０２４６】 結果は、ＧＵＳ発現頻度が共生培養期間に対して変化しないことを示した。全
処置にわたって、ＧＵＳ発現頻度の範囲は５０〜７０％であった。ＧＵＳ発現の
強度は濃いブルーから明るいブルーとばらつきがあった。しかし、細菌の強い過
剰増殖が共生培養の４日後に認められ、この細菌のコーティングがＧＵＳ染色を
抑制することがわかった。
【０２４７】 実施例３８ 異なる遺伝子構成物を用いて、別のアグロバクテリウム株、Ｃ５８ｓＺ７０７
ｐＢＩ１２１によるＩ型カルス共生培養プロトコールの効果を試験した。
【０２４８】 Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有するムラシゲとスコーグ
培地で葉を増殖することで生成された。カルス誘導およびその後の培養は、２３
℃および約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗とした。カル
ス誘導の４週間後、Ｉ型カルス塊を個別に濃度を１μＭに低下した２，４−Ｄを
含む同じ培地で培養した。実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとにカ
ルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２４９】 共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライトおよび０．４％ジ
フコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシ
ゲとスコーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調節し、２０分
間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅菌アセトシリンゴン溶液を
各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。各培地を用いて１６
個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７
０７ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌ硫酸ス
トレプトマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸
カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、２８℃で一夜増
殖させた。
【０２５０】 細菌株処置１、複製４、複製当たりペトリ皿４、ペトリ皿当たりカルス１０個
によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿からの細
菌をｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含
有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間
、細菌を再浮遊した。接種のために、Ｉ型カルス細菌溶液に８〜１０分間配置し
た。共生培養のために、カルスをブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地
に移した。全カルスを暗くして２３℃で２日間共生培養した。共生培養後、カル
ス２個を複製当たりプレート１枚から選択し（全体で８個）、ＧＵＳ発現のため
に染色した。
【０２５１】 全個のカルスは濃いブルーから明るいブルーのＧＵＳ発現を示した。残りのカ
ルスをＭＳ培地から最初の２週間はセホタキシム５００ｍｇ／Ｌ、その後はセホ
タキシムとカルベニシリンがそれぞれ５００ｍｇ／Ｌ含まれる同一のＭＳ培地に
移し、細菌汚染された組織を除去した。全カルスを２週間間隔でセホタキシムと
カルベニシリンを含む新鮮ＭＳ培地に移した。それぞれの移動時に、カルスのサ
ブサンプルをＧＵＳ発現のために染色した。ＧＵＳ発現頻度はわずかに低下した
が、相当のＧＵＳ発現を示す７０〜９５％と高いままであった。抗生物質培地に
対するカルスの目視的検査では、培養の４週間後に細菌汚染は示されなかった。
【０２５２】 実施例３９ ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスについて、アグロバクテリウム株ＡＴ６５
６の存在下における共生培養後にＧＵＳ発現を示す能力を試験した。
【０２５３】 両型のカルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバ
クト寒天、３０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０２μＭ ＢＡを含有するムラシゲ
とスコーグ培地において、２３℃で約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間
明／８時間暗下にイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を培養することにより誘 導された。４週間後、ＩＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスを元の葉から分離し、
同じ温度と光条件下にカルスの維持のために３％スクロース、０．１５％ゲルラ
イトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０１ μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコーグ培地に移した。実験用に十分なカ ルスが増殖するまで２週間ごとにカルスを新鮮培地に継代培養した。
【０２５４】 アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５
０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、
２８℃で一夜増殖させた。共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲル
ライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０ １μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）２００ｍｌを調製し、ｐＨ を５．６に調整し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅
菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌと
した。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
【０２５５】 カルス型処置２種類によるランダムブロック実験計画を用いた。ペトリ皿４枚
に移した４０塊の緑色のカルス、およびペトリ皿４枚に移した９塊の白色のカル
スを接種した。接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ
／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に
使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、緑色のカルスお
よび白色のカルスを細菌溶液に２〜５分間浸した。共生培養のために、カルスを
ブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地に塊として移した。全カルスを暗
くして２３℃で２日間共生培養した。
【０２５６】 共生培養後、プレート当たり白色の全カルスおよび緑色のカルス３個を無作為
に取出し、ＧＵＳ発現のために染色した。白色のカルス９塊のうち、７塊が異な
る強度のＧＵＳ発現を示した。緑色のカルス１２塊のうち、６塊が異なる強度の
ＧＵＳ発現を示した。
【０２５７】 実施例４０ イボウキクサ（Lemna gibba）の２種類の迅速増殖株（株６８６１および７７ ８４）および（lemna minor）の１株から確立されたＩ型カルスをＡＴ６５６と 共生培養し、イボウキクサＧ３を用いて確立されたプロトコールによる形質転換
頻度を測定した。
【０２５８】 アグロバクテリウム株ＡＴ６５６を、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５
０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガイモデキシトロース寒天上で画線し、
２８℃で一夜増殖させた。共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲル
ライトおよび０．４％ジフコバクト寒天、１０μＭ ２，４−Ｄ、および０．０ １μＭ ＢＡを含むムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）２００ｍｌを調製し、ｐＨ を５．６に調整し、２０分間１２１℃で加圧滅菌するとともに冷却した。濾過滅
菌アセトシリンゴン溶液を各冷却培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌと
した。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。
【０２５９】 接種のために、ｐＨ５．６で０．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシ
リンゴンを含有する濾過滅菌したシェンクとヒルデブラント培地に使用前の少な
くとも１時間、細菌を再浮遊した。接種のために、３種類のウキクサ株およびイ
ボウキクサ（陽性対照）からの約１０〜１５個のＩ型カルスを細菌溶液に２〜５
分間浸した。共生培養のために、各カルスをブロッティングし、上述した通り共
生培地のプレート２枚（各ウキクサ株用）に塊として移した。全カルスを暗くし
て２３℃で２日間共生培養した。
【０２６０】 共生培養後、２種類のイボウキクサ株の全カルスおよび（Lemna minor）株か らの３個のカルスを無作為に取出すとともにＧＵＳ発現のために染色した。全部
のカルスが共生培養後２週間にＧＵＳ染色細胞の多重小スポットを示し、成功し
た形質転換と一致した。
【０２６１】 葉を用いた選択： 実施例４１ イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３を用いて、ＧＵＳを発現するとともにカナ マイシン選択培地で増殖する葉の救済にたいする３種類の共生培地の影響を試験
した。
【０２６２】 葉は使用前に３日間、１％スクロース、および１０μＭインドール酢酸を含有
する液体シェンクとヒルデブラント培地で増殖させた。細菌株、ＡＴ６５６を２
０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むジャガ
イモデキシトロース寒天上で、２８℃下に一夜増殖させた。共生培養のために、
３種類の固形培地、すなわち１）３％スクロース、１％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセ
トシリンゴン、および１０μＭインドール酢酸を含有するシェンクとヒルデブラ
ント（ＳＨ）、２）３％スクロース、１％寒天、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン
、および５０μＭ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を含有する ムラシゲとスコーグ培地（ＭＳ）、および３）３％スクロース、１％寒天、５μ
Ｍ ２，４−Ｄ、１０μＭ ナフタレン酢酸、１０μＭ ジベレリン酸Ｇ３、およ び２μＭベンジルアデニンを含有するムラシゲとスコーグを用いた。培地を調製
し、ｐＨを５．６（ＳＨ）または５．８（２種類のＭＳ）に調整し、加圧滅菌し
、冷却し、濾過滅菌溶液として熱不安定成分アセトシリンゴン、インドール酢酸
およびジベレリン酸を添加するとともに、培地を１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿
に注入した。各培地のために、２０ペトリ皿（５００ｍｌ）を調製した。
【０２６３】 ３種類の共生培地処置、複製４、複製当たりペトリ皿５、ペトリ皿当たり葉２
０枚によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、１ペトリ皿から
の細菌を実施例２１に記載通りに再浮遊した。
【０２６４】 接種のために、個々の葉を塊から分離し、それぞれの背軸面を上向きにすると
ともに分裂領域に滅菌メスで創傷した。葉を細菌再浮遊溶液に移すとともに１０
分間培養した。共生培養のために、上述した通り３種類の共生培地に葉を移すと
ともに２３℃下、暗くして５．５日間培養した。
【０２６５】 共生培養後、培地当たりペトリ皿２枚からの葉をＧＵＳ発現のために染色した
。結果は、シェンクとヒルデブラント培地で共生培養された葉に広範囲に認めら
れるが、ムラシゲとスコーグ培地での葉にはほとんど染色が認められないことを
示した。各培地の他のプレート１８枚（１８プレートｘ３培地＝５４プレート）
からの残りの葉を、アセトシリンゴンを含まず、チメジン５００ｍｇ／Ｌを含む
同じ組成の固形と液体の培地に移した。プレート３枚からの葉を２５ｍｌの液体
培地を含むフラスコ３つに移すとともに、２３℃で約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の
光度で１６時間明／８時間暗下に増殖させた。固形培地のプレート１５枚の葉を
２群、すなわち１）元のプレート１０枚からの葉を新しいプレート１２枚に移し
、暗くして培養した（１２プレート）、２）元のプレート５枚からの葉を新しい
プレート６枚に移し、５μｍｏｌ／ｍ２・秒未満の光半暗光下に培養した群に分
けた。
【０２６６】 増殖の１１日後、葉のサブサンプルを採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。
結果は、光処置または培地処置に関係なく、ＧＵＳ発現が依然として存在するこ
とを示した。半暗光下に培養された葉はすべて培地に関係なく、最高強度のＧＵ
Ｓ発現を示した。暗くして培養した葉は中間レベルのＧＵＳ発現を示し、明るく
して培養した葉はきわめて低いレベルを示した。シェンクとヒルデブラント培地
で培養した葉は最高頻度のＧＵＳ陽性組織を示したが、新しく伸びる葉と関連し
ていた。
【０２６７】 カルス誘導のために調製されたムラシゲとスコーグ培地では、染色パターンは
単細胞およびきわめて小さい領域に限定されていた。２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ
３およびＢＡを含むＭＳ培地での葉は、２，４−Ｄのみを含むＭＳ培地で培養さ
れた葉よりも強い染色を示した。カルス形成のために調整した植物増殖調節剤を
含む両方のＭＳ基礎培地でのカルス形成は、暗い場合には生じなかったが、半暗
光下に２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ３およびＢＡを含むＭＳ培地では開始していた
。これらの結果に基づき、シェンクとヒルデブラント培地での葉は実験から除外
した。暗くした場合のＭＳ培地での残りの葉をすべて半暗光条件に移して培養を
継続した。全組織を同じ培地形成を維持したが、チメチンを含む新鮮培地に移す
とともに半暗光条件下に約５週間培養を継続した。
【０２６８】 共生培養後７週間に残りの組織をすべて新鮮培地に移し、１０ｍｇ／Ｌ（組織
の約２５％）または２ｍｇ／Ｌ（残りの組織の約７５％）のいずれかでカナマイ
シンを含めた。１週間後、両方のカナマイシン処置からの組織のサブサンプルを
ＧＵＳ発現のために染色した。３種類の染色、すなわち１）元の共生培養葉と関
連した染色、２）Ｉ型カルスと関連した染色、および３）ＩＩ型カルスと関連し
た染色が存在した。カルス染色の頻度は高くなく、推定で約５〜８葉であり、共
生培養された葉１００枚当たりのカナマイシン耐性培養株の上昇を示した。組織
の培養および継代培養を半暗光下にさらに５週間継続した。
【０２６９】 １２週間の時点で、残った組織はすべて２，４−Ｄ、ＮＡＡ、ＧＡ３およびＢ
Ａを含むＭＳ培地での培養株由来であった。この組織を１μＭ ２，４−Ｄ、２ μＭ ＢＡ、０．１５ｇ／Ｌゲルライト、０．４ｇ／Ｌジフコバクト寒天、５０ ０ｍｇ／Ｌチメチンおよび１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシンを含むムラシゲとスコ
ーグ培地に移した。熱不安定成分を濾過滅菌し、加圧滅菌した冷却培地に添加し
た。それぞれ最初に共生培養した葉から増殖していた健常組織を別個のペトリ皿
に移した。全組織を２３℃で培養するとともに、半暗光から全光度約４０μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒および１６時間明／８時間暗光期間に変更した。この時点で組織の
小サブサンプルをＧＵＳ発現のために染色し、結果はＩＩＩ型カルスと関連した
低頻度のＧＵＳ染色を示した。２週間後の目視観察のより、全光への変更がカナ
マイシン感受性組織からのカナマイシン耐性カルスの分離を強化することが明ら
かとなった。全生存組織を新鮮培地に移すことにより、カナマイシン上でのカル
スの増殖をさらに４週間継続し（全体で１６週まで）。
【０２７０】 共生培養後１６週間と２０週間との間で、カナマイシン耐性カルス系が確立し
た。これらの緻密なＩ型カルスおよびＩＩＩ型カルスは、明るくして１０ｍｇ／
Ｌカナマイシン上での増殖により特徴づけられた。８つのカナマイシン耐性培養
株が３６０の元の共生培養葉から増殖した。これら８つの系が発達したため、カ
ルスのサブサンプルを０．５％スクロースを含有する半強シェンクとヒルデブラ
ント培地に移し、葉を再生した。これら８つのうち、３つがカナマイシン非存在
下に葉を再生し、葉の再生はカナマイシン存在下には生じないとみられる。これ
らの葉のうち染色した場合にＧＵＳ発現を示すものはなかった。
【０２７１】 カルス培養株の選択および形質転換葉の再生： 実施例４２ Ｉ型カルスについて、アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１存
在下の共生培養後に示すＧＵＳ発現能および硫酸カナマイシン耐性能を試験した
。
【０２７２】 Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコ
ーグ培地において、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を増殖させることによ り得られた。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃下および約４０μｍｏｌ
／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ
型カルスを個別に２，４−Ｄ濃度を１μＭに低下させた同じ培地で培養した。こ
のカルスを実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとに新鮮培地に継代培
養した。
【０２７３】 共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコ
バクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ムラシゲとスコ
ーグ培地（ＭＳ）４００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２
０分間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却
培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて２０個の
１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７
ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌストレプト
マイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイ
シンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下に一夜、増殖させ
た。
【０２７４】 細菌株処置１、複製１、複製当たりペトリ皿２０、ペトリ皿当たりカルス約１
０個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．６で０
．６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌した
シェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した
。接種のために、Ｉ型カルス部分を細菌溶液に配置した。共生培養のために、こ
のカルス部分を、上述したＭＳ共生培地に移した。全カルス部分を暗くして２３
℃で２日間共生培養した。共生培養後、カルス部分のサブサンプルをＧＵＳ発現
のために組織化学的に染色した。結果は、異なる強度の高頻度のＧＵＳ発現を示
した。
【０２７５】 約２００の残りのカルス部分を脱汚染化培地に移した。脱汚染化のために、３
％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２ ，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ培地５００ｍｌを調製し、ｐＨを ５．６に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタ
キシムを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、最終培地濃度を５００ｍｇ
／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート２０枚に注入した。それぞれ１０個のカ
ルスを脱汚染化培地のペトリ皿２０枚に移した。全ペトリ皿を暗くして２３℃で
培養した。週１回カルス部分を同一の新鮮培地に継代培養し、カルスを同じ条件
下に培養した。５週の時点で、カルス組織の小サブサンプルをＧＵＳ発現のため
に染色した。発現は高頻度と異なる強度で存在した。
【０２７６】 ５週の時点で、残りのカルス部分を選択培地に移した。選択のために、３％ス
クロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４ −Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ５００ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に 調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシム、
カルベニシリン、および硫酸カナマイシンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に
添加し、最終培地濃度をそれぞれ５００、５００および２ｍｇ／Ｌとした。冷却
培地を用いてプレート２０枚に注入した。約９〜１０のカルス部分を選択培地の
ペトリ皿２０枚に移した。全カルスを約３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光度の
１６時間明／８時間暗下に２３℃で培養した。培養の１週間後、カナマイシン濃
度を１０ｍｇ／Ｌに増大したのを除き同じ培地に移した。カルス培養を同じ培養
条件下にさらに１週間継続し、組成が同一の新鮮培地に１回継代培養した。この
２週間のカナマイシン選択期間の最後に、約２５％の元のカルス部分は健常なカ
ルス増殖を示し、残りのカルスは衰えた。
【０２７７】 ７週の時点で、６４個の最も健常なカルス部分を、３％スクロース、０．１５
％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、
５００ｍｇ／Ｌ、それぞれカルベニシリン、およびセホタキシム、４種類の濃度
、すなわち１０、２０、４０、および８０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシン含む固形
ＭＳ培地に移した。１６０ｍｌの培地を調製し、ｐＨを５．６に調整し、加熱滅
菌するとともに冷却した。熱不安定抗生物質の濾過滅菌溶液を添加して適切な濃
度にした。次に冷却培地を用いて１６個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入し
た。約４個のカルス部分を各プレートに移し、プレート４枚をそれぞれカナマイ
シン濃度で調製した（カナマイシン濃度当たりカルス部分１６個）。カルスの培
養を半暗光下に２３℃で継続した。週１回の間隔で、それぞれのカナマイシン濃
度から１枚のプレート４枚を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の高光度に移した。９週の
時点で、光条件に関係なく、全カルスを以前の継代培養と同一の組成の新鮮培地
に移した。１２週まで、全カルスを４０μｍｏｌ／ｍ２・秒のよりも高い光度下
においた。カルス培養をさらに４週間（１６週まで）継続し、２週間間隔で新鮮
培地に継代培養した。
【０２７８】 １６週時点で、残りの健常カルスの小サブサンプルをＧＵＳ発現のために染色
した。健常カルス部分のすべてがＧＵＳ発現を示し、カルス部分全体が非発現カ
ルスからのＧＵＳ発現カルスの分離を示唆する均一の染色を示した。大部分のカ
ルスはこの時点までに死滅していたが、１０％を超えるカルスは異なる程度の健
常なカルス増殖を示した。３種類のカルス系、Ａ、ＢおよびＣが同一であり、培
地に移して葉再生を促進させた。さらに選択培地でカルス部分を増殖させる継代
培養時に、別の６つのカルス系、Ｄ−１が確認され、再生培地に移した。９系中
８系が１０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有培地で認められた。例外は、４０ｍｇ／Ｌ
カナマイシンで十分に増殖を示すＤ系であった。その後の継代培養時に、６つの
カルス系、すなわちＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩが継続して増殖した。
【０２７９】 確認された９系中２系は、染色時にＧＵＳ発現陽性であり、カナマイシンの存
在または非存在下に容易に増殖する葉を再生し続けた。再生のために、０．４％
ジフコバクト寒天および０．１５％ゲルライトを含む１００ｍｌの蒸留水から水
性寒天を調製し、ｐＨを５．６に調整するとともに、培地を１２１℃で１８分間
加圧滅菌した。この培地を用いて１０個の６０ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入し
た。Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、およびＩ系からの小部分のカルスをそれぞれ培地の２個の
ペトリ皿に移した。このカルスを約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明
／８時間暗の光期間下２３℃下に培養した。水性寒天でのカルス培養を６週間継
続し、２週間間隔で新鮮水性寒天に継代培養した。６週までに、全系からのカル
スは黄色または茶色に変色していた。このカルスを６週の最後に、０．５％スク
ロースおよび０．８％ジフコバクト寒天（固形培地のみ）を含有する固形または
液体のいずれかの半強シェンクとヒルデブラント培地に移した。４〜６週間後、
カルスは厚い葉状構造物に分化した緑色の結節体を組織化していた。葉はカルス
塊から検出できたため、それらの１％スクロースを含有する全強シェンクとヒル
デブラント培地に移し、約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間
暗の光期間下２３℃下に培養した。これらの葉の増殖は液体ＳＨ培地では不明確
であった。これらの葉はカナマイシンの存在または非存在でＳＨ培地で同等に十
分増殖した。葉の漂白はカナマイシンの存在下には確認されなかった。葉のサブ
サンプルを周期的に採取し、ＧＵＳ発現のために染色した。すべての葉がＧＵＳ
発現を示した。
【０２８０】 形質転換を確認するために、Ａ系およびＤ系から分離されたＤＮＡについてサ
ザンハイブリダイゼイション分析を行った。ウキクサＤＮＡ調製液をドイルとド
イルのＣＴＡＢ法（Doyle and Doyle）（Amer. J. of Botany 75, 1238 (1988) ）を用いて形質転換されていないイボウキクサ（L. gibba）Ｇ３および形質転換
されたＡ系とＤ系から調製した。分離ＤＮＡは制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎ
ｄ ＩＩＩ、および両方の酵素で消化され、フラグメントは０．７％アガロース ゲルで電気泳動により分離された。このゲルをサムブロック（Sambrook）の方法
に従ってナイロン膜にブロッティングした。サムブロックら、分子クローニング
（MOLECULAR CLONING）：実験マニュアル（A LABORATORY MANYUAL）（１９８９ ）。プローブのために、ｐＢＩ１２１からのプラスミドＤＮＡをサムブロックの
アルカリＳＤＳ法（同上）を用いて分離した。１２．８ｋｂプラスミドＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲ１およびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化し、β−グルクロニダーゼ遺 伝子からなる３．２ｋｂフラグメントおよびネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子を含む約９ｋｂフラグメントを生成した。両方のフラグメントは、ア
ガロースゲルから分離され、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅキット（プロメガ（Prom
ega））を用いたランダムプライミング法により同位体標識された。これらのプ ローブを用いて、形質転換されていないウキクサＤＮＡおよび形質転換されたＡ
系または形質転換されたＤ系のいずれかのＤＮＡを保持するブロットでハイブリ
ダイゼイションを行った。ハイブリダイゼイション反応はハイブリダイゼイショ
ンオーブンで一夜６５℃下に行った。膜を０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの 厳重な条件下に洗浄した。次にブロットをＢＩＯＭＡＸ ＭＳフィルム（コダッ ク）と接触させ、オートラジオグラフィに−７０℃で２日間曝露した。
【０２８１】 ハイブリダイゼイション実験結果は、ＧＵＳおよびＮＰＴＩＩハイブリッドＤ
ＮＡがウキクサ系ＡおよびＤには存在するが、形質転換されていないウキクサか
らのＤＮＡには存在しないことを示した（図１に示したＤ系の結果）。形質転換
ウキクサＤＮＡの二重消化は予想分子量でのハイブリダイゼイションを示した。
単一消化はハイブリダイゼイションが予想されない分子量のＤＮＡフラグメント
と関連していることを示し、ハイブリッドＤＮＡが細菌起源ではなく、植物ＤＮ
Ａに消化されることを示した。標識ビルレンス領域プローブによる同じブロット
のプロービングはハイブリダイゼイションの非存在を示し、陽性ＧＵＳおよびＮ
ＰＴＩＩシグナルが植物由来であり、細菌起源ではないことを示した。
【０２８２】 実施例４３ Ｉ型カルスについて、アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７ｐＢＩ１２１存
在下の共生培養後に示すＧＵＳ発現能および硫酸カナマイシン耐性能を試験した
Ｉ型カルスは、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバク
ト寒天、５μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含有する固形ムラシゲとスコ
ーグ培地において、イボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３葉を増殖させることによ り得られた。カルス誘導およびその後の培養は、２３℃下および約４０μｍｏｌ
／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗下とした。カルス誘導の４週間後、Ｉ
型カルスを個別に２，４−Ｄ濃度を１μＭに低下させた同じ培地で培養した。こ
のカルスを実験用に十分なカルスが増殖するまで２週間ごとに新鮮培地に継代培
養した。
【０２８３】 共生培養のために、３％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコ
バクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ムラシゲとスコ
ーグ培地（ＭＳ）７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、１２１℃下に２
０分間加圧滅菌するとともに冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を冷却
培地に添加し、最終培地濃度を２０ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いて３０個の
１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。アグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７
ｐＢＩ１２１を２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンおよび５００ｍｇ／Ｌストレプト
マイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイ
シンを含むジャガイモデキシトロース寒天で画線し、２８℃下に一夜、増殖させ
た。
【０２８４】 細菌株処置１、複製１、複製当たりペトリ皿３０、ペトリ皿当たりカルス約５
個によるランダムブロック実験計画を用いた。接種のために、ｐＨ５．８で０．
６Ｍマニトールおよび２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴンを含有する濾過滅菌したシ
ェンクとヒルデブラント培地に使用前の少なくとも１時間、細菌を再浮遊した。
接種のために、Ｉ型カルス部分を細菌溶液に配置した。共生培養のために、この
カルス部分をブロッティングし、上述した通りＭＳ共生培地に移した。全カルス
部分を暗くして２３℃で２日間共生培養した。共生培養後、カルス部分のサブサ
ンプルをＧＵＳ発現のために組織化学的に染色した。結果は、異なる強度の高頻
度のＧＵＳ発現を示した。
【０２８５】 約１５０の残りのカルス部分を脱汚染化培地に移した。脱汚染化のために、３
％スクロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２ ，４−Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ培地７５０ｍｌを調製し、ｐＨを ５．８に調整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタ
キシムおよびカルベニシリンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し、それ
ぞれ最終培地濃度を５００ｍｇ／Ｌとした。冷却培地を用いてプレート３０枚に
注入した。約５個のカルスをそれぞれ脱汚染化培地のペトリ皿３０枚に移した。
次にこのカルスを暗くして２３℃下に培養した。週１回カルス部分を同一の新鮮
培地に継代培養し、カルスを同じ条件下に培養した。
【０２８６】 カナマイシン耐性カルス系の選択は５週で開始した。選択のために、３％スク
ロース、０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４− Ｄ、および２μＭ ＢＡを含む固形ＭＳ７５０ｍｌを調製し、ｐＨを５．８に調 整し、１２１℃下に２０分間加圧滅菌するとともに冷却した。セホタキシム、カ
ルベニシリン、およびカナマイシンを含有する濾過滅菌溶液を冷却培地に添加し
、最終培地濃度をそれぞれ５００ｍｇ／Ｌ、５００ｍｇ／Ｌ、および２ｍｇ／Ｌ
とした。冷却培地を用いてプレート３０枚に注入した。約５個のカルスをそれぞ
れ選択培地のペトリ皿３０枚に移した。次にカルスを暗くして２３℃で培養した
。
【０２８７】 ６週目および７週目に、カナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌに増大した同一の新
鮮培地にカルスを移した。培養を２３℃で暗くして継続した。８週目の初めにカ
ナマイシン濃度を増大した。組成が以前の継代培養のものと同一のムラシゲとス
コーグ培地を半分はカナマイシン１０ｍｇ／Ｌを含有する培地ともう半分はカナ
マイシン４０ｍｇ／Ｌを含有する培地で調製した。約半分の残りのカルスを各カ
ナマイシン濃度に移した。培養の光条件も変更した。全カルスを約３〜５μｍｏ
ｌ／ｍ２・秒の半暗光度の１６時間明／８時間暗下に２３℃で培養した。カルス
をこれらの培地および培養条件下に２週間維持した。半暗光レベルで２週間後、
カルスを１０または４０ｍｇ／Ｌでカナマイシンを含有する同一の組成の新鮮培
地に移し、光度を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒に増大した。カルスを同一の培地およ
び培養条件の２週継代培養方式で維持した。
【０２８８】 １２週まで、約１０％のカルスは健常のまま増殖し続けた。残った１５の増殖
性カルス系のうち、半分は１０ｍｇ／Ｌ、残りは４０ｍｇ／Ｌのカナマイシンで
増殖し続けた。６系からのカルスの小サブサンプルの組織化学的染色は、カルス
部分の領域でＧＵＳ発現を示した。
【０２８９】 実施例４２の方法に従って葉を再生した。硫酸カナマイシンの存在下または非
存在下で増殖させると葉の増殖は正常であり、葉の漂白は確認されなかった。葉
は強度のＧＵＳ組織化学的染色も示した。サザンハイブリダイゼイション分析で
は、ＧＵＳ遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の予想フ
ラグメントのＤＮＡ配列の存在、およびｖｉｒ領域からのＤＮＡ配列の非存在が
示された。実施例４２における通り適切な制限酵素分析を行い、結果は植物ゲノ
ムへの外来遺伝子の組込みの所見と一致した。
【０２９０】 実施例４４ これまでの実施例に基づくと、アグロバクテリウムでウキクサカルスを形質転
換した後、形質転換植物体の選択と再生には以下の方法が好ましい。全体として
、コウキクサ（Lemna minor）が特に活発なカルス系であり、この種から形質転 換植物体が容易に再生される。
【０２９１】 典型的に、カルス形質転換、選択、および葉再生は十分に確立された系に依存
するとともに、方法の各ステップのために最適化された多くのパラメータに依存
する。活発に増殖するカルス培養株は実施例１６に記載した通りに維持される。
アグロバクテリウムは（適切な抗生物質および１００μＭアセトシリンゴンを含
むジャガイモデキストロース寒天で）増殖され、好ましい再浮遊培地がＳＨより
もＭＳであることを除き、実施例３２の通りに再浮遊される。カルス部分は再浮
遊細菌溶液中に最小３〜５分間浸けることで接種し、ブロッティングして過剰な
液体を除去するとともに、最適化されたオーキシンおよびサイトキニンを補充し
たＭＳからなる共生培地上にコーティングし、カルス増殖および１００μＭアセ
トシリンゴンを促進する。接種されたカルスは暗くして２日間培養する。
【０２９２】 共生培養後、抗生物質を含有する新鮮培地にカルスを移し、アグロバクテリウ
ムの感染から培養株を脱汚染化する。好ましい培地は、０．１５％ゲルライトお
よび０．４％ジフコバクト寒天および抗生物質でゲル化した、３％スクロース、
０．１５％ゲルライト、０．４％ジフコバクト寒天、１μＭ ２，４−Ｄ、およ び２μＭ ＢＡを含むＭＳである。３〜５μｍｏｌ／ｍ２・秒の半暗光下にカル スを培養する。カルスを２〜５日、好ましくは３日ごとに同じ組成の新鮮培地に
移す。総回復期間は２〜３週間、３〜６継代培養である。
【０２９３】 カルス選択は回復期間後に行う。１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ ＢＡ、３％スク
ロース、０．４％ジフコバクト寒天、０．１５％ゲルライト、および１０ｍｇ／
Ｌ硫酸カナマイシンを補充したＭＳ培地にカルスを移す。３〜５μｍｏｌ／ｍ２ ・秒の半暗光下にカルスを培養し、２週間ごとに同じ組成の新鮮培地に移す。こ
のようにしてカルスを４〜６週間維持する。次に同じ培地で４０μｍｏｌ／ｍ２ ・秒の全光下にカルスを培養する。選択は、カルスが選択剤上で活発な増殖を示
す場合に完全とみなす。
【０２９４】 選択剤の存在下にカルス維持培地で活発な増殖を示すカルスを再生培地に移し
、植物体を組織化するとともに、これを生成する。一般に、ウキクサは栄養分の
ない培地で再生する。コウキクサ（L. minor）では、これは１％スクロースを含
む半強ＳＨ培地であり、イボウキクサ（L. gibba）では水性寒天である。典型的
に、選択剤は再生培地には存在しない。カルスは全光下に再生培地上で葉が現れ
るまで２〜４週間培養される。完全に組織化された葉を１〜３％スクロースを含
み、植物増殖調節剤を含まないＳＨ培地に移すとともに全光下にさらにクローン
増殖のために培養する。
【０２９５】 実施例４５ 光度および硫酸カナマイシン濃度の影響について、コウキクサ（Lemna minor ）カルス培養株の形質転換頻度に対する影響を試験した。
【０２９６】 コウキクサ葉は、１％スクロースを含有する液体シェンクとヒルデブラント培
地において、実験前に約４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の光度で１６時間明／８時間暗
の光期間下に２３℃で２週間増殖させた。カルス誘導は、コウキクサ株８７４４
からの葉を用いた実施例１４の通りに行った。３％スクロース、１μＭ ２，４ −Ｄ、２μＭ ＢＡ、０．４％バクト寒天および０．１５％ゲルライトを含有す るＭＳ培地で共生培養前１３週間カルスを維持した。この１３週間２週間ごとに
新鮮培地にカルスを継代培養した。
【０２９７】 実施例２１に記載した通り、ＡＴ６５６株からのバイナリープラスミドを含有
するＴ−ＤＮＡを保持するアグロバクテリウム株Ｃ５８ｓＺ７０７を、５０ｍｇ
／Ｌ硫酸カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および５００ｍｇ／
Ｌストレプトマイシンを含有するＰＤアグロバクテリウムで２８℃下に２日間増
殖させた。共生培養のために、３％スクロース、１μＭ ２，４−Ｄ、２μＭ Ｂ
Ａ、０．４％バクト寒天、および０．１５ゲルライトを含む固形ＭＳ培地を調製
し、ｐＨを５．６に調整し、培地を１２１℃で２０分間加圧滅菌するとともに、
冷却した。アセトシリンゴンの濾過滅菌溶液を最終培地濃度１００ｍｇ／Ｌまで
冷却培地に添加した。冷却培地を用いて８個の１００ｘ１５ｍｍペトリ皿に注入
した。
【０２９８】 接種のために、０．６Ｍマニトールおよび１００μＭアセトシリンゴン、ｐＨ
５．６を含有する濾過滅菌ＭＳ培地に接種前の少なくとも１時間アグロバクテリ
ウムを再浮遊した。接種のために、カルス２０個のバッチで２〜５分間、細菌溶
液に約１６０個のＩ型カルスを浸けた。共生培養のために、カルス部分をブロッ
ティングし、共生培養培地に塊として移し、１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿当た
りカルス塊２０とした。全接種カルスを暗くして２３℃で２日間培養した。
【０２９９】 選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、３％スクロース、５００ｍ
ｇ／Ｌカルベニシリン、５００ｍｇ／Ｌセホタキシム、１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマ
イシン、０．４％バクト寒天および０．１５ゲルライトを含有するＭＳ培地２０
０ｍｌを調製し、ｐＨを５．６に調整し、培地を１２１℃で２０分間加圧滅菌す
るとともに、８個の１００ｍｍｘ１５ｍｍペトリ皿に注入した。注入直前に濾過
滅菌溶液としての冷却加圧滅菌培地に抗生物質を添加した。共生培養カルス塊を
新鮮選択培地に移し、ペトリ皿当たり２０カルス塊とした。８０個のカルス塊（
４プレート）を５μｍｏｌ／ｍ２・秒未満の半暗光下に培養するとともに、他の
８０個のカルス塊（４プレート）を４０μｍｏｌ／ｍ２・秒の高光度に移した。
３週間、抗生物質含有新鮮培地にカルスを週１回継代培養した。４週目に各光処
置からの半分（４０カルス塊）のカルスを、カナマイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌか
ら４０ｍｇ／Ｌに増大した新鮮培地に移した。残りの４０個のカルス塊を１０ｍ
ｇ／Ｌの元のカナマイシン濃度を維持する新鮮培地に移した。同一の半暗光また
は全光条件下およびカナマイシンの低濃度または高濃度下の培養をさらに２週間
、週１回の継代培養を含めて培養を継続した。接種後６週目に、全サンプルを新
鮮培地に移すとともに全光度下に培養した。この時点以降、継代培養を２週間間
隔とした。
【０３００】 カナマイシンでの培養１２週間後に、活発に増殖するカルスを新鮮再生培地に
移した。葉再生培地の構成は１％スクロース、０．４％バクト寒天、および０．
１５ゲルライトを含有する半強シェンクとヒルデブラント培地とした。カルス塊
を２週間ごとに同じ組成の新鮮培地に移した。葉は再生培地への移動後３〜６週
間にカルス塊から再生した。
【０３０１】 ２つの形質転換されたクローン葉系がこの実験から再生した。両方の系はＧＵ
Ｓ組織化学的染色示し、基質としてメチルウンベリフェロン−グルクロン酸（Ｍ
ＵＧ）を用いた可溶性アッセイで測定された通り異なるレベルのＧＵＳ酵素活性
（抽出可能なタンパク質の０．３１％と０．１４％）を示すとともに、酵素結合
抗体免疫アッセイ（ELISA）を用いて測定される通り、検出可能なレベルのネオ マイシンホスホトランスフェラーゼ酵素を示した。サザンハイブリダイゼイショ
ン分析では高分子量のＤＮＡにおける外来ＤＮＡ配列の存在が確認され、これは
適切な制限酵素で消化されると予想フラグメントサイズを示した。元のアグロバ
クテリウムのビルレンス領域を表すＤＮＡ配列を有するストリップトブロット（
stripped blot）の再プロービングでは検出可能なハイブリダイゼイションは示 されなかった。
【０３０２】 実施例４６ 形質転換された葉の救済頻度のコウキクサ（Lemna minor）遺伝子型の影響を 株８６２７からのコウキクサカルス培養株を用いて試験した。
【０３０３】 接種前のカルス維持、細菌株、接種のための細菌増殖、細菌再浮遊、カルス接
種法、および暗くした２日間の共生培養は実施例４５の通り行った。
【０３０４】 共生培養後のカナマイシン選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、
３％スクロース、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、５００ｍｇ／Ｌセホタキシム
、１０ｍｇ／Ｌ硫酸カナマイシン、０．４％バクト寒天および０．１５ゲルライ
トを含有するＭＳ培地に１８０個のカルス塊を移した。全カルスを５μｍｏｌ／
ｍ２・秒未満の半暗光下に培養した。接種後の第２週目に、カルスの半分をカナ
マイシン濃度を１０ｍｇ／Ｌから４０ｍｇ／Ｌに増大した新鮮選択培地に移し、
残りは１０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する新鮮培地に移した。週１回の継代
培養を接種後５週まで継続し、この時点で継代培養を２週間ごとに行った。
【０３０５】 形質転換葉を再生するために、１２週間後にカナマイシンで活発に増殖すると
ともに組織化学的染色を用いてＧＵＳ発現を示すカルス系を１％スクロース、０
．４％バクト寒天、および０．１５ゲルライトを含有する半強シェンクとヒルデ
ブラント培地に移した。葉は再生培地で３〜４週間後に再生した。再生葉は１％
スクロースを含むＳＨ培地で維持した。
【０３０６】 ３つの形質転換されたクローン葉系がこの実験で再生した。全３系はＧＵＳ組
織化学的染色示し、ＭＵＧアッセイで測定された通り異なるレベルのＧＵＳ酵素
活性（抽出可能なタンパク質の０．２％〜０．３％）を示すとともに、酵素結合
抗体免疫アッセイ（ELISA）を用いて測定された通りネオマイシンホスホトラン スフェラーゼタンパク質の検出可能なレベルを示した。サザンハイブリダイゼイ
ション分析を用いて、ウキクサＤＮＡへの外来ＤＮＡ配列の形質転換および組込
みを確認した。
【０３０７】 実施例４７ コウキクサ（L. minor）カルス培養株からの葉再生に対する培地組成物の影響
も試験した。７種類の培地調製液、すなわち（１）水性寒天、（２）１００μＭ
硫酸アデニンを含む水性寒天、（３）１０μＭ ＢＡを含む水性寒天、（４）１ ０μＭ ＢＡおよび１μＭ ＩＢＡを含む水性寒天、（５）半強ＳＨ、（６）１０
μＭ ＢＡを含む半強ＳＨ、および（７）１０μＭ ＢＡおよび１μＭ ＩＢＡを 含む半強ＳＨを試験した。実施例１２の通りこれまでのカルス誘導培地で増殖し
た株８７４４および株８６２７からのカルス培養株をこの実験に用いた。カルス
を７種類の培地で８週間培養し、葉の発生を継続的に観察した。
【０３０８】 葉再生は半強ＳＨ処置でのみ達成された。半強ＳＨに１０μＭ ＢＡのみを補 充すると、カルス増殖は植物増殖調節剤を含まない半強ＳＨ上にコーティングし
た場合よりも迅速であったが、再生は半強ＳＨよりも長くかかった。培地へのＩ
ＢＡの追加は、カルスの葉を再生する時機または能力に対する影響を示さなかっ
た。
【０３０９】 実施例４８ 哺乳動物の遺伝子発現のためのウキクサ系の有効性をヒトβ−ヘモグロビン遺
伝子構成物およびＰ４５０オキシダーゼ構成物を用いて試験した。
【０３１０】 ２つのアグロバクテリウム株を用いて、コウキクサ（Lemna minor）株８６２ ７のＩ型カルスを接種した。β−ヘモグロビン形質転換のために、３つのプラス
ミド、すなわち、ｐＧＶ３８５０、ｐＴＶＫ２９１、ｐＳＬＤ３４を保持する株
Ｃ５８ Ｃ１を用いた。ｐＴＶＫ２９１はｐＴｉＢｏ５４２からの超ビルレンス Ｇ遺伝子を含む。ｐＳＬＤ３４は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下にネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、およびスーパーマック（super-mac ）プロモーターにより駆動されるヒトβ−ヘモグロビンからなるｐＢＩＮ１９由
来のアグロバクテリウムバイナリープラスミドである。
【０３１１】 Ｐ４５０オキシダーゼ形質転換のために、３つのプラスミド、すなわち、ｐＧ
Ｖ３８５０、ｐＴＶＫ２９１、ｐＳＬＤ３４を保持する株Ｃ５８ Ｃ１を用いた 。Ｔ−ＤＮＡは、構造がｐＳＬＤ３４とほぼ同じであるバイナリープラスミド、
ｐＳＬＤ３５に保持されるが、例外として、ｐＳ：Ｄ３５はβ−ヘモグロビン遺
伝子を含まず、その代わりに３つのタンパク質、すなわちヒトＰ４５０オキシダ
ーゼ、オキシドレダクターゼ、およびシトクロムＢ５をコードするＤＮＡ配列を
含む。それぞれの遺伝子はスーパーマックプロモーターにより駆動される。ｐＳ
ＬＤ３５プラスミドはヒグロマイシンおよびカナマイシン選択可能なマーカー遺
伝子を含む。
【０３１２】 細菌株２種類ｘ早期選択時の光度２種類ｘ選択実験計画時（全体で８処置）の
カナマイシン濃度２種類、複製３、複製当たりペトリ皿２、ペトリ皿当たり１０
個のカルスの基礎実験計画によるいくつかの実験を行った。コウキクサ（Lemna
minor）株８６２７と８７４４およびイボウキクサ（Lemna gibba）Ｇ３から得ら
れたカナマイシン培養株をこれらの実験に使用した。接種前のカルス維持、細菌
株、接種のための細菌増殖、細菌再浮遊、カルス接種法、および暗くした２日間
の共生培養は実施例４５の通り行い、例外として、細菌は接種前に５０ｍｇ／Ｌ
カナマイシン、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、
および１００μＭアセトシリンゴンを含有するＰＤＡで増殖させた。
【０３１３】 共生培養後のカナマイシン選択のために、１μＭ ２，４−Ｄ、１μＭ ＢＡ、
５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、および２種類の濃度、すなわち１０ｍｇ／Ｌお
よび４０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＭＳ培地にカルス塊を移した。さら
にカルス培養株を培養時にカルス部分をそれぞれカナマイシン濃度の半分ずつに
分け、一方を半暗光に、もう一方を全光下に培養した。共生培養後の最初の４週
間は週１回の間隔で同じ組成の新鮮培地にカルスを継代培養した。５週目から全
培養株を全光度下にさらに６週間培養し、２週間ごとに新鮮培地に継代培養した
。
【０３１４】 葉再生は、実施例４２および実施例４７に記載した通りに、イボウキクサ（L.
gibba）Ｇ３またはコウキクサ（L. minor）からの葉再生のための適切な培地を
用いて行った。葉は再生培地で３〜４週間後に再生した。再生葉は１％スクロー
スを含むＳＨ培地で維持した。
【０３１５】 実験全体で２０を超す形質転換クローン葉系が救済された。選択濃度として４
０ｍｇ／Ｌに対して１０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを用いた方が多くの系が確認さ
れた。全系はカナマイシンで活発なカルス増殖を示し、酵素結合抗体免疫アッセ
イ（ELISA）を用いて測定される通り、検出可能でばらつきのあるレベルのネオ マイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質を示した。Ｐ４５０オキシダーゼ
およびβ−ヘモグロビンＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の存在は、そ
れぞれ、サザン、ノーザンおよびウエスタンハイブリダイゼイションなど技術上
周知の方法すべてによる安定に形質転換されたウキクサ植物体において検出され
る。
【０３１６】 本明細書中で言及された刊行物および特許出願のすべては、本発明が属する当
業者のレベルを示している。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物ま
たは特許出願が参考として援用されることを特別にかつ個別に示された同じ程度
に本明細書中で参考として援用される。
【０３１７】 上述の発明は理解を明確にする目的で図解および実施例により相当に詳細に述
べられているが、添付した請求事項の範囲内で一部の変更や修正を実施すること
もできる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ラジバンダリ ニルマラ アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 27606、ラレイグ、タータン サークル 509−21 Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD06 CD09 CD10 CD13 CD14 CD17 4B024 AA01 AA08 BA02 BA03 BA07 BA08 BA22 CA20 DA01 DA05 EA04 GA14 GA17 HA01 HA14 4B064 AG01 AG09 AG13 AG16 CA11 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA89X AB01 AC14 AC20 CA24 CA27 CA41 CA44 CA53 CA55

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換するための方
    法において、ヌクレオチド配列は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少
    なくとも１つの発現カセットを含み、 （ａ）ウキクサ標的組織を備え、ウキクサ組織の細胞は細胞壁を含有す
    るステップと、 （ｂ）細胞壁を穿刺し、組織の細胞内のヌクレオチド配列を析出するた
    めに十分な速度でウキクサ標的組織でのヌクレオチド配列を射出するステップと
    を含む方法であって、 ヌクレオチド配列は微小発射体により運搬されるとともに、ヌクレオ
    チド配列は組織での微小発射体を射出することにより組織で射出される方法。
  2. 【請求項２】 形質転換した組織を選択剤で培養するステップをさらに含む請求
    項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 形質転換したウキクサ植物体を再生するステップをさらに含む請
    求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 組織はカルス組織である請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 組織は分裂組織である請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 組織は葉組織である請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ウキクサ組織はウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ（W
    olffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna）属か
    らなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ウキクサ組織はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ・ ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種か
    らなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 微小発射体は金属粒子を含む請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 微小発射体は約２分の１マイクロメーターないし約３マイクロ
    メーターの直径を有する請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 複数の微小発射体を備え、各微小発射体はその上に固定された
    ヌクレオチド配列を有するとともに、各微小発射体は植物標的組織で射出される
    請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ヌクレオチド配列はインスリン、成長ホルモン、αインターフ
    ェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク
    質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択さ
    れるタンパク質又はペプチドをコード化する請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ヌクレオチド配列は多量体タンパク質の少なくとも１つのタン
    パク質又はペプチドサブユニットをコード化する請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 目的のヌクレオチド配列によりウキクサを形質転換するための
    方法において、 （ａ）ヌクレオチド配列を含むベクターであって、ヌクレオチド配列は選
    択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なくとも１つの発現カセットを含む
    ベクターを含むアグロバクテリウムをウキクサ植物体組織に接種するステップと
    、 （ｂ）アグロバクテリウムと組織を共生培養して形質転換組織を生成する
    ステップとを含む方法。
  15. 【請求項１５】 アグロバクテリウムの増殖を抑制するために十分な抗生物質を
    含む培地で形質転換組織を培養するステップをさらに含む請求項１４に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】 選択剤を含む培地で形質転換組織を培養するステップをさらに
    含む請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 形質転換組織から形質転換ウキクサ植物体を再生するステップ
    をさらに含む請求項１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 組織はカルス組織である請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 組織は分裂組織である請求項１４に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 組織は葉組織である請求に範囲第１４に記載に方法。
  21. 【請求項２１】 ウキクサ組織はウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウキクサ （Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Lemna） 属からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ウキクサ組織はアオウキクサ（Lemna）属から選択される請求 項１４に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 ウキクサ組織はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、レムナ ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gibba）種
    からなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 アグロバクテリウムはアグロバクテリウム・ツメファシエンス
    である請求項１４に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 アグロバクテリウムはアグロバクテリウム・リゾゲネスである
    請求項１４に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ベクターはスーパーバイナリーベクターである請求項１４に記
    載の方法。
  27. 【請求項２７】 ベクターハＣ５８由来ベクターである請求項１４に記載の方法
    。
  28. 【請求項２８】 選択剤に対して耐性を付与する遺伝子はｎｅｏ，ｂａｒ，ｐａ
    ｔ，ＡＬＳ，ＨＰＨ，ＨＹＧ，ＥＰＳＰおよびＨｍ１からなる群から選択される
    請求項１４に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ヌクレオチド配列は２つの目的の遺伝子を含む請求項１４に記
    載の方法。
  30. 【請求項３０】 ヌクレオチド配列はインスリン、成長ホルモン、αインターフ
    ェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク
    質、アンジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択さ
    れるタンパク質又はペプチドをコード化する請求項１４に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ヌクレオチド配列は、ヘモグロビン、コラーゲン、Ｐ４５０オ
    キシダーゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される多量体タンパク
    質の少なくとも１つのタンパク質又はペプチドサブユニットをコード化する請求
    項１４に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 目的のヌクレオチド配列によりウキクサ細胞を形質転換するた
    めの方法において、ヌクレオチド配列は選択剤に対して耐性を付与する遺伝子を
    含む少なくとも１つの発現カセットを含み、電気穿孔法によりウキクサ細胞内に
    ヌクレオチド配列を導入するステップを含む方法。
  33. 【請求項３３】 請求項３の方法により生成される形質転換ウキクサ組織培養株
    。
  34. 【請求項３４】 請求項１７により生成される形質転換ウキクサ組織培養株。
  35. 【請求項３５】 請求項３の方法により生成される形質転換ウキクサ植物体。
  36. 【請求項３６】 請求項１７の方法により生成される形質転換ウキクサ植物体。
  37. 【請求項３７】 請求項３２により生成される形質転換ウキクサ植物体。
  38. 【請求項３８】 そのゲノムに組込まれた目的の異種核酸を含む形質転換ウキク
    サ植物体。
  39. 【請求項３９】 前記目的の核酸はそのゲノムに組込まれたＴ−ＤＮＡ境界配列
    によりフランキングされている請求項２８に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  40. 【請求項４０】 前記ウキクサ植物体は前記目的の異種核酸の５つより少ないコ
    ピーを含む請求項３９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  41. 【請求項４１】 前記ウキクサ植物体はウキクサ（Spirodela）属、ミジンコウ キクサ（Wolffia）属、ウォルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ（Le
    mna）属からなる群から選択される請求項３８項３９に記載の形質転換ウキクサ 植物体。
  42. 【請求項４２】 前記ウキクサ植物体はアオウキクサ（Lemna）属から選択され る請求項３９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  43. 【請求項４３】 前記ウキクサ植物体はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、 レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gib
    ba）種からなる群から選択される請求項３９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  44. 【請求項４４】 前記核酸は選択剤に対する耐性を付与する遺伝子を含む少なく
    とも１つの発現カセットを含む請求項３９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  45. 【請求項４５】 選択剤に対する耐性を付与する前記遺伝子は、ｎｅｏ，ｂａｒ
    ，ｐａｔ，ＡＬＳ，ＨＰＨ，ＨＹＧ，ＥＰＳＯおよびＨｍｌである請求項４４に
    記載の形質転換ウキクサ植物体。
  46. 【請求項４６】 前記核酸は２つの目的の遺伝子を含む請求項３９に記載の形質
    転換ウキクサ植物体。
  47. 【請求項４７】 前記核酸はインスリン、成長ホルモン、αインターフェロン、
    βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アン
    ジオスタチン、レプチン、および血清アルブミンからなる群から選択されるタン
    パク質又はペプチドをコード化する請求項３９に記載の形質転換ウキクサ植物体
    。
  48. 【請求項４８】 前記核酸は、ヘモグロビン、コラーゲン、Ｐ４５０オキシダー
    ゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される多量体タンパク質の少な
    くとも１つのタンパク質又はペプチドサブユニットをコード化する請求項３９に
    記載の形質転換ウキクサ植物体。
  49. 【請求項４９】 組換えタンパク質又はペプチドを生成する方法において、 （ａ）少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドを発現する形質転換
    ウキクサ植物体を培養するステップと、 （ｂ）ウキクサ植物体から少なくとも１つのタンパク質又はペプチドを採
    集するステップとを含む方法。
  50. 【請求項５０】 形質転換ウキクサ植物体は廃水で増殖される請求項４９に記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 形質転換された植物は多量体タンパク質のサブユニットすべて
    を発現するとともにアセンブルする請求項４９に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 多量体タンパク質はコラーゲン、ヘモグロビン、Ｐ４５０オキ
    ダーゼ、およびモノクローン抗体からなる群から選択される請求項５１に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 形質転換ウキクサ植物体はバイオレアクタ管で増殖される請求
    項４９に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 １つの組換えタンパク質又はペプチドが生成される請求項４９
    に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドが治療的タンパ
    ク質又はペプチドである請求項４９に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドは、インスリン
    、成長ホルモン、αインターフェロン、βグルコセレブロシダーゼ、網膜芽細胞
    腫タンパク質、ｐ５３タンパク質、アンジオスタチン、レプチン、および血清ア
    ルブミンからなる群から選択される請求項４９に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドは酵素である請
    求項４９に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記ウキクサ植物体はウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォ
    ルヒエラ（Wolfiella）属、およびアオウキクサ属からなる群から選択される請 求項４９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  59. 【請求項５９】 前記ウキクサ植物体はレムナ・ミノール（Lemna minor）種、 レムナ・ミニスキュラ（Lemna miniscula）種、およびイボウキクサ（Lemna gib
    ba）種からなる群から選択される請求項４９に記載の形質転換ウキクサ植物体。
  60. 【請求項６０】 少なくとも１つの異種タンパク質又はペプチドは形質転換ウキ
    クサ植物体から選択される請求項４９に記載の方法。
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