JP2001512426A - ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼのリガンドおよびその複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 コラーゲンファミリーのメンバーはジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼであるＤＤＲ１およびＤＤＲ２のリガンドである。コラーゲンは細胞外ドメインと直接的に相互作用し、時間および濃度依存的様式で、ＤＤＲのチロシンリン酸化を誘導する。ＤＤＲ１のコラーゲン活性化は、Ｓｈｃホスホチロシン結合ドメインのドッキング部位のリン酸化を誘導した。それゆえ、（ａ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼもしくはその一部、およびコラーゲンもしくはその一部；または（ｂ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼもしくはその一部、およびＳｈｃもしくはＳｈｃのＰＴＢ結合ドメイン、またはＰＤＺドメインを含むタンパク質もしくはＰＤＺドメインを含む単離された複合体を記載する。ＤＤＲのコラーゲンとの相互作用に基づく組成物、方法および用途も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼのリガンドおよびその複合体発明の分野 本発明は、新規複合体、細胞におけるジスコイジンドメイン受容体チロシンキ ナーゼ（ＤＤＲ）媒介性シグナリング経路の活性化方法、およびこの経路に影響 を及ぼす物質の同定方法に関する。発明の背景 近年、哺乳動物受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のｃＤＮＡのクローニング によって、変形菌類Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍにおい て見出されたレクチン、ジスコイジンに関連する細胞外ドメインを有する受容体 の新たなサブファミリーが同定された。ジスコイジン反復を有する２つの異なる ＲＴＫ、すなわちジスコイジンドメイン受容体１（ＤＤＲ１）（ＤＤＲ、ＭＣＫ １０、Ｃａｋ、ＮＥＰ、ｔｒｋＥ、Ｐｔｋ３またはＲＴＫ６とも呼ばれる）（１ 〜７）およびジスコイジンドメイン受容体２（ＤＤＲ２）（ＣＣＫ２、ＴＫＴま たはＴｙｒｏ１０とも呼ばれる）（１、８、９）が同定されている。ＤＤＲ１は 主に上皮細胞において発現され（１）、マウス胚発生の間の感覚上皮細胞におい て特に豊富である（４）。高レベルのＤＤＲ１がヒト卵巣ガンおよび乳ガン試料 において検出されており、このことはＤＤＲ１の過剰発現が腫瘍発達に関与して いる可能性があることを示唆する（１、１０）。ＤＤＲ１の細胞外ドメインはモ チーフＲＸＲＲを有し、これはエンドプロテアーゼ切断の潜在的な認識部位であ る。実際、ＤＤＲ１のかなりの割合が、短縮型膜会合βサブユニットよび可溶性 αサブユニットにプロセシングされる（１）。 他の受容体チロシンキナーゼと比較すると、ＤＤＲ１は比較的長い膜近傍(jux tamembrane)領域を有し、これはオルタナティブスプライシングによって改変さ れて、２つの異なるＤＤＲ１アイソフォームを生じる。ＤＤＲ１ａアイソフォー ムは膜近傍領域中に１３９アミノ酸を有し、一方、ＤＤＲ１ｂアイソフォームは 、余剰のエキソンによってコードされる膜近傍領域中の３７アミノ酸のさらなる 伸張の組込みで、ａアイソフォームと異なる（７）。 ＤＤＲ受容体は、腫瘍形成に関与している可能性がある。ａおよびｂの両方の 特異的ＤＤＲ１ ＲＮＡ転写物が、種々のヒト卵巣（７）および乳ガン細胞株に おいて検出されている。いくつかのヒト初代乳ガンのインサイチュ分析によって 、ＤＤＲ１ ｍＲＮＡの発現が、隣接する正常上皮よりも腫瘍細胞において少な くとも３倍高くあり得ることが示されている(Ｂａｒｋｅｒら，Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ １１：５６９−５７５，１９９５)。両方の遺伝子用のプローブを使用する 、ヒト卵巣ガンまたは肺ガンの隣接切片に対するインサイチュハイブリダイゼー ションによって、ＤＤＲ１は腫瘍細胞自体において発現されるが、一方、ＤＤＲ ２は腫瘍の周囲の間質細胞において検出されることが示されている（Ａｌｖｅｓ ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：６０９−６１８，１９９５）。 ＤＤＲ１ｂ中のｂ特異的インサートは配列モチーフを提示し、これはこのイン サートがＤＤＲ１受容体の下流のシグナリングに関与し得ること示唆する（１） 。とりわけ、ｂアイソフォーム特異的インサートは配列ＬＬＳＮＰＡＹを含み、 これは潜在的に、Ｓｈｃアダプタータンパク質のホスホチロシン結合（ＰＴＢ） ドメインのドッキング部位として作用し得る。 Ｓｈｃタンパク質は、Ｃ末端のＳＨ２ドメインおよび約１６０残基のＮ末端の ＰＴＢドメインの両方を含み、このＰＴＢドメインは、ＳＨ２ドメインとは異な り、コンセンサス配列：疎水性−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ−ｐＴｙｒを有するホ スホチロシン（ｐＴｙｒ）部位を認識する（１１〜１４）。そのようなリン酸化 モチーフは、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体の膜近傍領域、ならびに上皮増殖因 子（ＥＧＦ）受容体、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３のＣ末端テイルにおいて見出 すことができる（１５〜１８）。Ｓｈｃ ＰＴＢドメインの、活性化受容体との 相互作用は、Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメインによって認識されるモチーフ（ＹＶＮＶ ）内のＴｙｒ３１７におけるＳｈｃのリン酸化を刺激することができる（１９） 。リン酸化ＳｈｃのＧｒｂ２との会合によって、ＳｈｃがＲａｓ経路を刺激する ことができる機構が提供 される。増殖因子受容体に加えて、ポリオーマウイルスミドルＴ抗原およびＳＨ ＩＰ ＳＨ２含有イノシトールホスファターゼのような細胞質タンパク質は、リ ン酸化に際して潜在的にＳｈｃ ＰＴＢドメインに結合し得るＮＰＸＹモチーフ を含む（１５、２０）。 Ｓｈｃ ＰＴＢドメインおよびその結合部位の両方の分析によって、リン酸化 Ｔｙｒの３残基Ｎ末端側（−３位）のＡｓｎが結合に必須であり、Ｐｒｏが−２ 位において優先されることが示されている（２１〜２５）。これらの残基は、ホ スホチロシンをＰＴＢドメインの塩基性ボケットに配置するβターンの形成に重 要である（２６）。ホスホペプトドのＳｈｃ ＰＴＢドメインへの高親和性結合 にはまた、−５位における疎水性残基が必要とされる（１６、１８）。さらに、 −６位における疎水性残基は、ＰＴＢドメインと接触することができる（２６） 。ＤＤＲ１のｂアイソフォーム特異的インサート内のＬＬＳＮＰＡＹ配列は、Ｓ ｈｃ ＰＴＢ結合についてのこのコンセンサスに一致する。発明の要旨 本発明者らは、重要なことに、コラーゲンファミリーのメンバーが、ジスコイ ジンドメイン受容体チロシンキナーゼであるＤＤＲ１（ＭＣＫ−１０、ＤＤＲ、 ＮＥＰ、ｃａｋ、ｔｒｋＥ、ＲＴＫ６およびｐｔｋ３としても知られる）ならび にＤＤＲ２（ＣＣＫ−２、ｔｙｒｏ−１０およびＴＫＴとしても知られる）のリ ガンドであることを示した。コラーゲンは細胞外ドメインと直接的に相互作用し 、時間および濃度依存的様式で、ＤＤＲのチロシンリン酸化を誘導することが見 出された。特に、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンは、ＤＤＲ１の 良好なリガンドであることが示された。Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンは、ＤＤ Ｒ２の高度に強力なリガンドであることが示され；一方、ＩＩ型およびＶ型コラ ーゲンは、中程度の活性を示した。本発明者らはまた、コラーゲンのグリコシル 化がＤＤＲの活性化、特にＤＤＲ２の活性化に必須であることを示した。ＤＤＲ 受容体チロシンキナーゼ活性の刺激には、コラーゲンの天然の三重らせん構造が 必要とされた。 ＤＤＲ１のコラーゲン活性化は、Ｓｈｃホスホチロシン結合ドメインのドッキ ン グ部位のリン酸化を誘発し、その存在はオルタナティブスプライシングによって 制御されている。特に、本発明者らは、直接的証拠によって、Ｓｈｃアダプター タンパク質のＰＴＢドメインが、オルタナティブスプライシングされたｂ特異的 エキソンによってコードされるＬＬＳＮＰＡＹモチーフを利用して、ＤＤＲ１ｂ に選択的に結合することを示した。コラーゲンによるＤＤＲ２の活性化はまた、 マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）発現のアップレギュレー ションを生じることが示された。従って、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２は、細胞外マ トリックスに対する細胞性応答を制御することができる新規のコラーゲン受容体 である。 広く述べると、本発明は、ＤＤＲもしくはその一部、およびコラーゲンもしく はその一部を含む単離された複合体、またはＤＤＲもしくはその一部、およびＳ ｈｃまたはＰＤＺドメインを含むタンパク質を含む複合体を提供する。コラーゲ ンもしくはコラーゲンの一部と相互作用するか、またはＳｈｃもしくはＰＤＺド メインと相互作用するＤＤＲの結合ドメインに由来するペプチド、またはＤＤＲ もしくはその一部と相互作用するコラーゲンの結合ドメインに由来する分子もま た意図される。本発明はまた、この複合体およびペプチドに特異的な抗体を包含 する。 本発明はまた、細胞におけるジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ（ ＤＤＲ）媒介性シグナリング経路の調節（特に活性化）方法を提供する。この方 法は、細胞上のジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質または このタンパク質のアイソフォームもしくは一部を、コラーゲンもしくはコラーゲ ンの一部と反応させ、それによって細胞におけるシグナリング経路を調節する工 程を包含する。１つの実施態様において、このタンパク質またはタンパク質の一 部は、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼのオリゴマー化受容体また は細胞外ドメインまたはオリゴマー化細胞外ドメインを包含する。この経路はま た、本発明の複合体またはペプチドを用いることによって活性化されてもよい。 １つの実施態様において、本発明は、細胞における細胞外マトリックスの合成 、分解またはリモデリング応答の調節方法を意図する。この方法は、細胞上のジ スコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはこのタンパク質の 少なくとも２０個の連続するアミノ酸を有するこのタンパク質のアイソフォーム または一 部を、コラーゲンまたはコラーゲンの一部と反応させ、それによって細胞外マト リックスの合成、分解またはリモデリング応答を調節する工程を包含する。細胞 外マトリックスの合成、分解またはリモデリング応答は、本発明の複合体または ペプチドを使用して調節してもよい。 さらに、本発明は、化合物を、ＤＤＲ媒介性シグナリング経路を調節する能力 について評価する方法を提供する。例えば、ＤＤＲとコラーゲンとの相互作用を 阻害もしくは増強する物質、またはＤＤＲもしくはその一部またはコラーゲンも しくはコラーゲンの一部に結合する物質が評価され得る。 １つの実施態様において、本発明はＤＤＲ受容体チロシンキナーゼ媒介性シグ ナリング経路に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。この方法は： （ａ）コラーゲンと、少なくとも１つのジスコイジンドメイン受容体チロシン キナーゼタンパク質またはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一部と、試 験物質とを反応させる工程であって、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイ ン受容体チロシンキナーゼタンパク質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコ イジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質複合体を形成するように選択 される工程；および （ｂ）上記物質の非存在下のコントロールに対して比較して、物質の効果を決 定する工程、 を包含する。 特に、細胞におけるＤＤＲ受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路に 影響を及ぼす物質の同定方法が提供される。この方法は： （ａ）コラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質 複合体の形成を可能にする条件下で、コラーゲンまたはその一部と、少なくとも １つのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはこのタン パク質のアイソフォームもしくは一部と、試験物質とを反応させる工程であって 、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク 質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナ ーゼタンパク質複合体を形成するように選択される工程；および （ｂ）複合体、遊離物質、非複合体化コラーゲン、またはタンパク質の活性化 についてアッセイする工程を包含する。 上記方法の１つの実施態様において、上記物質は、コラーゲンの炭水化物部分 もしくはその模倣物、またはコラーゲンに結合するＤＤＲのドメイン由来のペプ チドもしくはその模倣物である。 本発明はさらに、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナ リング経路が関与する症状の処置または予防方法を提供する。この方法は、それ を必要とする患者にシグナリング経路を妨害するために有効である量の物質を投 与する工程を包含し、上記物質は（ａ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキ ナーゼもしくはその一部；（ｂ）コラーゲンもしくはその一部；（ｃ）： （ｉ）コラーゲンと、少なくとも１つのジスコイジンドメイン受容体チロシン キナーゼタンパク質またはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一部と、試 験物質とを反応させる工程であって、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイ ン受容体チロシンキナーゼタンパク質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコ イジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質複合体を形成するように選択 される工程；および （ii）上記物質の非存在下のコントロールに対して比較して、物質の効果を決 定する工程、 によって最初に同定された物質である。 上記物質は、ＤＤＲおよびコラーゲンを含む単離された複合体；コラーゲンも しくはコラーゲンの一部と相互作用するか、またはＳｈｃもしくはＰＤＺドメイ ンと相互作用するＤＤＲの結合ドメインに由来するペプチド；ＤＤＲもしくはそ の一部と相互作用するコラーゲンの結合ドメインに由来する分子；またはこの複 合体およびペプチドに特異的な抗体であってもよい。 本発明はまた、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリ ング経路に影響を及ぼすために有効な量の精製および単離されたジスコイジンド メインサブファミリー受容体チロシンキナーゼタンパク質もしくはこのタンパク 質のアイソフォームもしくは一部、コラーゲンもしくはコラーゲンの一部、本発 明の複合 体、抗体、ペプチド、または本明細書に記載の物質、および医薬上許容される担 体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物に関する。この組成物は、ジスコイジ ンドメイン受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメイン、またはコラーゲンの炭水 化物部分もしくはその模倣物に結合する細胞外ドメインの一部を含んでもよい。 １つの実施態様において、上記組成物は、コラーゲンまたはその一部、好ましく はコラーゲンの炭水化物部分を含む。 本発明の方法および組成物は、哺乳物におけるトランスフォーメーションもし くは転移を変化させるために、鎖骨頭蓋骨形成不全症およびＳｉｃｋｌｅｒ症候 群のようなコラーゲンの構造的もしくは機能的脱調節が関与する症状、細胞外マ トリックスの合成、分解もしくはリモデリングの調節を必要とする症状を処置す るために、またはＭＭＰ−１発現の調節を必要とする症状を処置するために（例 えば、創傷治癒における使用のために）使用してもよい。 本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとな る。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示 すが、例示のみで与えられることを理解するべきである。なぜなら、本発明の精 神および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかと なるからである。図面の簡単な説明 ここで本発明を図面に関連して説明する。 図１Ａは、ホスホチロシンに対する抗体でプローブした、ＤＤＲ１ａ（ＭＣＫ １０ａ）またはＤＤＲ１ｂ（ＭＣＫ１０ｂ）をコードする発現プラスミドでトラ ンスフェクトし、オルトバナジン酸で刺激したヒト胚腎臓線維芽細胞２９３の細 胞溶解物からの抗Ｓｈｃ抗体での免疫沈降物のイムノブロットである。 図１Ｂは、ＤＤＲ１に対する抗体で再プローブした図１Ａのイムノブロットで ある。 図１Ｃは、Ｓｈｃに対する抗体で再プローブした図１Ｂのイムノブロットであ る。 図１Ｄは、抗ホスホチロシン抗体でのウエスタンブロッティングによって分析 し た図１Ａにおいて使用した全細胞溶解物のイムノブロットである。 図１Ｅは、Ｓｈｃ ＳＨ２ドメインまたはＳｈｃ ＰＴＢドメインを含むＧＳ Ｔ融合タンパク質に結合した溶解物(ＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂでトランスフ ェクトし、オルトバナジン酸で刺激しておいた２９３細胞由来)由来のタンパク 質のイムノブロットである。 図２Ａは、グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメイン融 合タンパク質を、ＤＤＲ１ｂ過剰発現２９３細胞由来の溶解物と、漸増濃度の競 合ペプチドＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡの非存在下または存在下でインキュ ベートすること、および結合したタンパク質をＤＤＲ１に対する抗体を用いるイ ムノブロッティングによって検出することを含む実験由来のイムノブロッティン グである。 図２Ｂは、精製ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメインのミドルＴ抗原ホスホペプチ ドへの結合の、漸増量の、それぞれ、ＤＤＲ１ホスホペプチド（ＡＬＬＬＳＮＰ ＡｐＹＲＬＬＬＡ、白丸）またはＮＧＦ受容体ホスホペプチド（ＨＩＩＥＮＰＱ ｐＹＦＳＤ、黒丸）の存在下での表面プラズモン共鳴による分析を表すグラフで ある；ここで、チップ表面に結合したＳｈｃ ＰＴＢドメインの百分率を、競合 ペプチドの濃度に対してプロットする。 図３Ａは、ＤＤＲ１のインビボ標識αアイソフォームの二次元トリプシンホス ホペプチドマップである。 図３Ｂは、ＤＤＲ１のインビボ標識βアイソフォームの二次元トリプシンホス ホペプチドマップである。 図３Ｃは、図３Ｂおよび３Ｆにおけるホスホペプチドの図解である。 図３Ｄは、ＤＤＲ１ａアイソフォームのインビトロ標識タンパク質のトリプシ ンマッピングの結果を示す。 図３Ｅは、ＤＤＲ１ｂアイソフォームのインビトロ標識タンパク質のトリプシ ンマッピングの結果を示す。 図３Ｆは、ＤＤＲ１ａおよびＤＤＲ１ｂホスホペプチドのトリプシンマッピン グの結果を示す。 図４Ａは、ＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂ、ＤＤＲ２の混合物およびＴｒｋＡを、Ｉ 型 コラーゲンで刺激したか、または１００μＭ酢酸で処理した２９３細胞において 一過性に発現させ、全細胞溶解物をブロットし、αｐＴｙｒ抗体を用いてプロー ブする実験の結果のイムノブロットである[Ｓｉｇｍａ＃Ｃ−７６６１：ラット 尾Ｉ型コラーゲン]。 図４Ｂは、ＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂ、ＤＤＲ２およびＴｒｋＡを、Ｉ型もしく はＩＶ型コラーゲンで刺激した２９３細胞において一過性に発現させ、全細胞溶 解物をブロットし、αｐＴｙｒ抗体を用いてプローブする実験の結果のイムノブ ロットである[Ｓｉｇｍａ＃Ｃ３５１１：ウシ皮膚Ｉ型コラーゲン、Ｃ−７５２ １：ヒト胎盤ＩＶ型コラーゲン]。 図４Ｃは、ＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂおよびＴｒｋＡを、Ｉ型コラーゲンで刺激 した２９３細胞において一過性に発現させ、全細胞溶解物をブロットし、αｐＴ ｙｒ抗体を用いてプローブする実験の結果のイムノブロットである[Ｓｉｇｍａ ＃Ｃ−８８９７：ラット尾Ｉ型コラーゲン、Ｃ−７７７４：ヒト胎盤Ｉ型コラー ゲン]。 図５Ａは、異なる濃度のＩ型およびＩＶ型コラーゲンの存在下でＤＤＲ１ｂを 一過性に発現する２９３細胞由来の全細胞溶解物のα−ｐＹブロットである[Ｓ ｉｇｍａ＃Ｃ−７６６１：ラット尾Ｉ型コラーゲン、Ｃ−０５４３：マウスＩＶ 型コラーゲン]。 図５Ｂは、異なる濃度のＩ型およびＩＶ型コラーゲンで刺激したＤＤＲ２を一 過性に発現する２９３細胞由来の全細胞溶解物のα−ｐＹブロットである。 図５Ｃは、異なる濃度のＩ型コラーゲンの存在下でＤＤＲ２を一過性に発現す る２９３細胞由来の全細胞溶解物のα−ｐＹブロットである[ＣＢＰ：Ｃｏｌｌ ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ＃４０２３６： Ｉ型コラーゲン]。 図６は、Ｉ型コラーゲン[Ｃ−７６６１]、ＩＶ型コラーゲン［Ｃ−０５４３］ およびオルトバナジン酸で刺激したヒト乳ガン細胞の溶解物から免疫沈降された ＤＤＲ１ｂのα−ＰＹブロットである。 図７Ａは、抗ホスホチロシン抗体でプローブしたＤＤＲ１ｂでトランスフェク トし、異なる濃度のＭａｔｒｉｇｅｌで刺激したヒト腎臓線維芽細胞２９３の細 胞溶 解物の全タンパク質のブロットである。 図７Ｂは、剥離し、ＤＤＲ１に対して惹起された抗体で再プローブした図７Ａ のブロットである。 図７Ｃは、ＤＤＲ１ｂでトランスフェクトし、以下の試薬：４００μＭ酢酸（ ａ）、５０μｌ／ｍｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ｂ）、１０μｇ／ｍｌ ＩＶ型ラミ ニン（ｃ）、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ｄ）、塩酸グアニジウムでの抽 出によって（ｅ）または酢酸およびペプシンでの抽出によって（ｆ）Ｍａｔｒｉ ｇｅｌから部分精製したＩＶ型コラーゲン、１０μｇ／ｍｌマウスＩＶ型コラー ゲン、Ｓｉｇｍａ Ｃ−０５４３（ｇ）、１０μｇ／ｍｌヒトＩＶ型コラーゲン 、Ｓｉｇｍａ Ｃ−５５３３（ｈ）で処理した２９３細胞の細胞溶解物の抗ホス ホチロシンブロットである。 図７Ｄは、以下の試薬：４００μＭ酢酸（ａ）、５０μｌ／ｍｌ Ｍａｔｒｉ ｇｅｌ（ｂ）、１０μｇ／ｍｌ ＩＶ型ラミニン（ｃ）、１０μｇ／ｍｌフィブ ロネクチン（ｄ）、塩酸グアニジウムでの抽出によって（ｅ）または酢酸および ペプシンでの抽出によって（ｆ）Ｍａｔｒｉｇｅｌから部分精製したＩＶ型コラ ーゲン、１０μｇ／ｍｌマウスＩＶ型コラーゲン、Ｓｉｇｍａ Ｃ−０５４３（ ｇ）、１０μｇ／ｍｌヒトＩＶ型コラーゲン、Ｓｉｇｍａ Ｃ−５５３３（ｈ） で処理した２９３細胞の細胞溶解物の抗ＤＤＲ１抗体ブロットである。 図８Ａは、１０μｇ／ｍｌマウスＩ型コラーゲン、１００ｎＭインスリンで刺 激するかまたは未刺激のままの、ヒトインスリン受容体（Ｉｎｓ−Ｒ）、ＤＤＲ １ａ、ＤＤＲ１ｂまたはＤＤＲ２をコードするプラスミドでトランスフェクトし た２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図８Ｂは、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２およびインスリン受容体に対する抗体の混合物 で再プローブした図８Ａのブロットである。 図９Ａは、ＤＤＲ１ｂでトランスフェクトし、異なる期間Ｉ型コラーゲンで刺 激した２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図９Ｂは、ＤＤＲ２でトランスフェクトし、異なる期間Ｉ型コラーゲンで刺激 した２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図９Ｃは、種々の期間Ｉ型コラーゲンで刺激したヒト乳ガンＴ−４７Ｄ細胞の 細 胞溶解物のＤＤＲ１免疫沈降物のブロットである。 図９Ｄは、ＤＤＲ１のＣ末端に特異的な抗体で再プローブした図９Ｃのブロッ トである。 図９Ｅは、過剰発現２９３細胞から免疫沈降させ、インビトロキナーゼ反応に 供したＤＤＲ１のブロットである。 図９Ｆは、Ｔ−４７Ｄ細胞から免疫沈降させ、インビトロキナーゼ反応に供し たＤＤＲ１のブロットである。 図１０Ａは、１０μｇ／ｍｌヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型コラーゲンおよ びウシＩＩ型コラーゲンで刺激した、ＤＤＲ１ｂでトランスフェクトした２９３ 細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図１０Ｂは、ＤＤＲ１に対する受容体特異的抗体で再プローブした図１０Ａの ブロットである。 図１０Ｃは、１０μｇ／ｍｌヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型コラーゲンおよ びウシＩＩ型コラーゲンで刺激した、ＤＤＲ２でトランスフェクトした２９３細 胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図１０Ｄは、ＤＤＲ２に対する受容体特異的抗体で再プローブした図１０Ｃの ブロットである。 図１０Ｅは、９０分間Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ型コラーゲンもしくはゼラ チンで刺激するか、または１ｍＭオルトバナジン酸で処理しておいたＴ−４７Ｄ 細胞から免疫沈降させたＤＤＲ１ｂの抗ホスホチロシン抗体ブロットである。 図１０Ｆは、ＤＤＲ１特異的抗体で再プローブした図１０Ｅのブロットである 。 図１０Ｇは、ＤＤＲ１ｂでトランスフェクトし、ヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよび Ｖ型コラーゲンと接触させておいた２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン 抗体ブロットである。 図１０Ｈは、ＤＤＲ２でトランスフェクトし、ヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ 型コラーゲンと接触させておいた２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗 体ブロットである。 図１１Ａは、マウスもしくはヒト組織から単離したＩ型コラーゲンまたはコラ ゲ ナーゼもしくはペプシンで処理したＢＳＡを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、 クマーシー染色で可視化したものを示す。 図１１Ｂは、コラゲナーゼまたはペプシンで処理したＩ型コラーゲンで刺激し た、ＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞の細胞溶解物の抗ホスホチロシン抗体ブ ロットである。 図１１Ｃは、ＤＤＲ２特異的抗体で再プローブした図１１Ｂのブロットである 。 図１１Ｄは、熱変性の前（四角）および後（菱形）の分光旋光度計中で融解さ せたマウスＩ型コラーゲン（１０ｍＭ酢酸中５００ｎｇ／ｍｌ）のスペクトルで ある。 図１１Ｅは、種々の温度でインキュベートしておいたマウスＩ型コラーゲンの アリコートで刺激した、ＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞の細胞溶解物の抗ホ スホチロシン抗体ブロットである。 図１２Ａは、アガロースに共有結合したコラーゲンに結合した、５０μｇ／ｍ ｌの可溶性Ｉ型コラーゲンの非存在下または存在下でインスリン受容体、ＤＤＲ １ｂまたはＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞の溶解物由来の物質のブロットで ある。 図１２Ｂは、種々の濃度のヨウ素化Ｉ型コラーゲンとインキュベートした後の 、ＤＤＲ１ａ（四角）、ＤＤＲ１ｂ（菱形）またはコントロールプラスミド（丸 ）でトランスフェクトした２９３細胞由来の結合リガンドの量を示すグラフであ る。 図１２Ｃは、ｍ−過ヨウ素酸ナトリウムで脱グリコシル化したＩ型コラーゲン で刺激したＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞由来の細胞溶解物の抗ホスホチロ シン抗体ブロットである。 図１３Ａは、ＤＤＲ１のＣ末端に対する抗体を用いて検出した、ＳｈｃのＰＴ ＢドメインのＧＳＴ融合タンパク質へ結合したＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂを過 剰発現する２９３細胞由来の溶解物由来のタンパク質のブロットである。 図１３Ｂは、競合量の、それぞれ、ＤＤＲ１ｂホスホペプチド（ＡＬＬＬＳＮ ＰＡｐＹＲＬＬＬＡ、白丸）またはＮＧＦ受容体ホスホペプチド（ＨＩＩＥＮＰ ＱｐＹＦＳＤ、黒丸）の存在下での表面プラズモン共鳴による、精製ＧＳＴ−Ｓ ｈｃＰＴＢドメインの、ミドルＴ抗原ホスホペプチド（ＬＳＬＬＳＮＰＴｐＹＳ ＶＭＲＳＫ）への結合の分析を表すグラフである。 図１４は、表示する期間Ｉ型コラーゲンまたはＴＰＡで刺激した親およびＤＤ Ｒ２過剰発現ＨＴ １０８０細胞由来の馴化培地のＭＭＰ−１に対する抗体を用 いるブロットである。 図１５Ａは、Ｋ６１８Ａ変異を有するＤＤＲ１ａがもはやコラーゲンによって 活性化されないことを示すイムノブロットである。 図１５Ｂは、Ｋ６１８Ａ変異を有するＤＤＲ１ａがもはやコラーゲンによって 活性化されないことを示すイムノブロットである。 図１６は、α１またはβ１インテグリンに対するブロッキング抗体がＤＤＲ１ の活性化を阻害しないことを示すブロットである。 図１７Ａは、ＤＤＲ１がインテグリンβ１欠損細胞においてコラーゲンによっ て活性化されることを示すブロットである。 図１７Ｂは、ＤＤＲ１がインテグリンβ１欠損細胞においてコラーゲンによっ て活性化されることを示すブロットである。 図１８は、インテグリンβ１欠損細胞におけるＤＤＲ１ｂ活性化が正常細胞に おけるように緩慢であることを示すグラフであり、このことは、ＤＤＲ１ｂの延 長された活性化がインテグリンの作用によらないことを示す。 図１９Ａは、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２受容体の活性化がＥＧＦ媒介性ＭＡＰＫ 活性化に影響を及ぼさないことを示すイムノブロットである。 図１９Ｂは、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２受容体の活性化がＥＧＦ媒介性ＭＡＰＫ 活性化に影響を及ぼさないことを示すイムノブロットである。 図１９Ｃは、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２受容体の活性化がＥＧＦ媒介性ＭＡＰＫ 活性化に影響を及ぼさないことを示すイムノブロットである。 図２０Ａは、ヒトＤＤＲ１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。これは Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５ ６７７，１９９５の図１である。 図２０Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２０８１７由来のＤＤＲ１のアミノ酸 配列を示す。 図２１は、ＤＤＲ１ａ、ｂおよびｃ配列のアラインメントを示し、ここでＤＤ Ｒ １の挿入領域中のＮＰＸＹモチーフに細線で下線を付し、推定のＳＨ３結合部位 に太線で下線を付す。これはＡｌｖｅｓら，１９９５，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０ ：６０９，１９９５の図１（ｃ）である。 図２２Ａは、ヒトＤＤＲ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。これは ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４７６４である。 図２２Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４７６４由来のヒトＤＤＲ２のアミ ノ酸配列を示す。発明の詳細な説明 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ（ＤＤＲ）およびコラーゲン 本明細書において使用する用語「ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナー ゼ（ＤＤＲ）媒介性シグナリング経路」は、コラーゲン受容体チロシンキナーゼ タンパク質複合体を形成し、それによって、例えば、遺伝子発現、細胞分裂、細 胞骨格構造、、細胞代謝、移動、細胞−細胞相互作用、空間的配置、細胞外マト リックスの合成および分解およびリモデリング、タンパク質の発現（例えば、Ｍ ＭＰ−１のアップレギュレーション）、ならびに／または細胞接着を制御するこ とによって、細胞に影響を及ぼす細胞中の一連の下流調節経路を活性化する、ジ スコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質のコラーゲンまたはその 一部との相互作用をいう。そのような下流調節経路の例は、ＧＡＰ／Ｒａｓ経路 、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を介してポリホスホイノシチドの分解を調節する 経路ならびにＳｒｃ／チロシンキナーゼおよびＲａｓ経路である。この経路はＤ ＤＲタンパク質の細胞内シグナリング分子（ＳｈｃまたはＰＤＺドメインを有す るタンパク質を含む）との相互作用を含む。 「ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ（ＤＤＲ）タンパク質」は、 その細胞外ドメイン中にジスコイジンＩモチーフを含む受容体チロシンキナーゼ のファミリーをいう。細胞外領域の構造は、リガンド結合特異性を決定する。細 胞内領域は、膜近傍および触媒キナーゼドメインを含む。受容体媒介性シグナル 伝達は、受容体を発現している細胞において、細胞外ドメインへのリガンドの結 合によって開 始され、これは受容体の二量体化および自己リン酸化を促進する。 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼの特徴は、ジスコイジンドメイ ン受容体１（ＤＤＲ１）（Ｄｉ Ｍａｒｃｏら，１９９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．２６８：２４２９０；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５６７７，１９９３；Ｚｅｒｌｉｎら，１９９３ Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ ８：２７３１；Ｌａｖａｌら，１９９４ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗ ｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５：１１７３，Ｐｅｒｅｚら，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ ９：２１１；Ｓａｎｃｈｅｚら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１８１９；Ａｌｖｅｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０， ６０９，１９９５；Ｓｈｅｌｌｉｎｇら，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５： ５８４；Ｖａｌｅｎｔら，１９９６，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．９８：１２）お よびジスコイジンドメイン受容体２（ＤＤＲ２）（Ｋａｒｎら，１９９３，Ｏｎ ｃｏｇｅｎｅ ８：３４３３；Ａｌｖｅｓら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０，６０９ ，１９９５ ＬａｉおよびＬｅｍｋｅら；１９９４）によって例示される。ａ、 ｂおよびｃと称する３つの異なる形態のＤＤＲ１が存在し、これらは共通の一次 遺伝子転写物のオルタナティブスプライシング改変体を表す。ＤＤＲ１およびＤ ＤＲ２は高い程度の類似性を有し、約１５０アミノ酸長のアミノ末端ジスコイジ ンＩドメイン内で７８％一致する。ＤＤＲ１はエンドペプチダーゼであるフュー リンの可能な切断シグナルを表すコンセンサス配列ＲＸＲＲを３０４〜３０７位 に含む。ＤＤＲ２受容体の膜近傍ドメインは１４８アミノ酸を含む。ＤＤＲ１ａ アイソフォームは膜近傍領域に１３９アミノ酸を含み、一方ｂアイソフォームは ａアイソフォームとは余分のエキソンによってコードされる膜近傍領域中の３７ アミノ酸のさらなる伸張の組込みで異なる。ｂアイソフォーム特異的モチーフは 、Ｓｈｃアダプタータンパク質のホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインのドッ キング部位として作用する配列ＬＬＳＮＰＡＹを含む。 図２０ＡおよびＢは、ヒトＤＤＲ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定 アミノ酸配列を示す（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９３（前出）中の図１）。Ｎ末端 付近の四角で囲った配列はジスコイジンＩ様ドメインを含み、Ｃ末端付近の四角 はチ ロシンキナーゼドメインを含む。推定のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメイン に下線を付す；ジスコイジンＩ様ドメインとチロシンキナーゼドメインとの間の プロリンおよびグリシン残基をイタリックにする。∧∧記号は、連結領域の最も プロリンおよびグリシン−リッチに下線を付す。膜近傍領域は、アミノ酸４６８ とアミノ酸６０７との間である。ＤＤＲ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ １１３１５またはＬ２０８１７においても見出すことができる。スプライシング されたＤＤＲ１アイソフォームの配列のアラインメントを図２１（Ａｌｖｅｓら ，１９９５の図１）に示す。 図２２Ａおよび２２Ｂは、ヒトＤＤＲ２（すなわち、ＴＫＴ）のヌクレオチド 配列および推定アミノ酸配列を示す。（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７４７６４） 。膜近傍領域は、アミノ酸４２２とアミノ酸５７０との間である。 本発明における使用のための受容体チロシンキナーゼタンパク質がタンパク質 のアイソフォームまたは一部であってもよいことが理解される。本発明の方法に おける使用に意図されるアイソフォームは、ジスコイジンドメイン受容体チロシ ンキナーゼタンパク質と同じ機能特性を有するアイソフォームである。 好ましい実施態様において、タンパク質の一部は、少なくとも２０個の連続す るアミノ酸を有し、好ましくは細胞外ドメインまたはＣ末端領域を含む。受容体 はオリゴマー化されてもよく、特に二量体および三量体が本発明の方法および組 成物における使用に意図される。 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質の一部は、コラーゲ ンまたは細胞内分子（Ｓｈｃのような）またはＰＤＺドメイン（すなわち、結合 ドメイン）を有するタンパク質と直接的または間接的に相互作用する分子の部分 を包含する。結合ドメインは、分子の連続的な部分（すなわち、連続するアミノ 酸の配列）であってもよく、またはコンホメーション性（すなわち、その分子が 天然状態にある場合に、本発明の複合体中で別の分子と相互作用する構造を形成 する非連続的なアミノ酸の配列の組み合わせ）であってもよい。本明細書におい て意図されるＤＤＲタンパク質の一部は、本発明の複合体中の分子の天然結合ド メインと同一であるかそれと実質的に等価である分子性物体（すなわち、ＤＤＲ またはその一部ならび にコラーゲンおよびその一部）を包含する。結合ドメイン由来のペプチドは下記 で論じる。 本発明において使用されるＤＤＲタンパク質は、ジスコイジンドメイン受容体 チロシンキナーゼタンパク質の配列と実質的な配列同一性を有するタンパク質で あってもよい。用語「実質的な同一性を有する配列」は、ジスコイジンドメイン 受容体チロシンキナーゼタンパク質の配列からのわずかなまたは重要でない配列 変動を有するアミノ酸配列を意味する。変動は、局所的変異または構造的改変に 帰し得る。適切なタンパク質は、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ タンパク質との、７５％を超える、好ましくは８５％を超える、最も好ましくは ９０％を超える同一性を有し得る。 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼまたはその一部を、本発明にお ける使用のために、標的化または選択されるリガンドの性質に基づいて選択して もよい。特定のリガンドおよび相補的なジスコイジンドメイン受容体チロシンキ ナーゼの選択によって、特異的複合体が提供され、本発明の方法において、ジス コイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ調節経路に影響を及ぼす特異的物質の 同定が可能なる。例えば、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ型コラーゲンを、本 発明の複合体および方法においてＤＤＲ１と相互作用させてもよい。ＩまたはＩ ＩＩ型コラーゲンを、本発明の複合体および方法においてＤＤＲ２と相互作用さ せてもよい。 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼまたはその一部を、そのタンパ ク質を発現することが既知の細胞から単離してもよい(例えば、ＤＤＲ１を、マ ウス胚発生の間の感覚上皮細胞、またはヒト卵巣および乳ガン試料から単離して もよい)。あるいは、タンパク質またはタンパク質の一部を、当該分野において 公知の組換えＤＮＡ法を使用して製造してもよい。例えば、ジスコイジンドメイ ン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはタンパク質の一部をコードする配列 を有する核酸分子を製造し、公知の方法で、タンパク質またはその一部の良好な 発現を確実にする適切な発現ベクター中に組込んでもよい。可能な発現ベクター は、限定するものではないが、そのベクターが使用される宿主細胞と適合性であ れば、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスを包含する。 ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはその一部を、 固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ ．８５：２１４９−２１５４）または均質溶液中での合成(Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙ ｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｅ．Ｗａｎｓｃｈ編，第１５１およびＩＩ巻，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒ ｔ)のような、タンパク質化学において周知の技術を使用する化学合成によって 製造してもよい。 本発明の方法における使用のためのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナ ーゼタンパク質またはその一部は細胞表面と会合していてもよい。細胞表面上で のジスコイジン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはその一部の発現は、常 法を使用して実施することができる。 タンパク質またはその一部の他の分子(タンパク質またはポリペプチドのよう な)との結合体を製造し、本明細書に記載の方法において使用してもよい。これ は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成してもよい 。従って、融合タンパク質を、組換え技術を介して、ジスコイジンドメイン受容 体チロシンキナーゼタンパク質またはその一部と、所望の生物学的機能を有する 選択されたタンパク質またはマーカータンパク質の配列とを融合することによっ て製造してもよい。融合タンパク質の製造に使用し得るタンパク質の例は、免疫 グロブリンおよびその一部（免疫グロブリンの定常領域のような）ならびにγイ ンターフェロン、腫瘍壊死因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、Ｉ Ｌ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、 ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１およびＧ−ＣＳＦのようなリンホカインを包含する。 本発明において用いるジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク 質、そのアイソフォームまたは一部は不溶化されていてもよい。例えば、受容体 タンパク質またはその一部、好ましくは細胞外ドメインは、適切な担体に結合さ れていてもよい。適切な担体の例は、アガロース、セルロース、デキストラン、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、リポソーム、カルボキシメチルセルロ ースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチッ クチューブ、ガ ラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、ア ミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどで ある。担体は例えば、チューブ、試験プレート、ビーズ、ディスク、スフェアな どの形状であってもよい。不溶化受容体チロシンキナーゼタンパク質を、公知の 化学的または物理的方法（例えば、臭化シアンカップリング）を使用して適切な 不溶性担体と材料とを反応させることによって製造してもよい。 本発明の方法および複合体において使用され得る適切なコラーゲンは、Ｉ、Ｉ Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンを包含する。コラーゲンを商業的供給源 から入手してもよく、または常法を使用して製造してもよい。選択されるＤＤＲ の活性化を提供するコラーゲンが、本明細書に記載の複合体および方法のために 選択される。コラーゲンの一部を本発明の方法および組成物において使用しても よい。本発明の１つの実施態様において、ジスコイジンドメイン受容体チロシン キナーゼ（好ましくはＤＤＲ２）の細胞外ドメインに結合し、この受容体を活性 化することができる、コラーゲンの炭水化物部分もしくはこの部分の一部、また はコラーゲンの三重らせんコンホメーションを有するＧ−Ｘ−Ｙ反復領域を使用 する。本発明において使用されるコラーゲンまたはその一部は不溶化されていて もよい；例えば、それは本明細書に記載の適切な担体に結合されていてもよい。 ペプチド 本発明は、ＤＤＲもしくはその一部とコラーゲンもしくはその一部、またはＤ ＤＲと細胞内分子（Ｓｈｃのような）もしくはＰＤＺドメインを有するタンパク 質に結合し、その相互作用を阻害するペプチド分子を提供する。特異的結合ドメ インに由来するペプチドは、天然に生じる結合部位のアミノ酸配列、その結合部 位のいずれかの部分、または会合分子に結合するように機能する他の分子性物体 を包含し得る。そのような結合ドメインに由来するペプチドは、天然の結合ドメ インを模倣するような方法で会合分子と直接的または間接的に相互作用する。そ のようなペプチドは、競合的インヒビター、エンハンサー、ペプチド模倣物など を包含し得る。これらのペプチドの全て、ならびにこれらのペプチドと実質的に 相同な、それに相補 的な、またはそうでなければ機能的もしくは構造的に等価な分子を、本発明の目 的のために使用してもよい。 「ペプチド模倣物」は、分子間の相互作用においてペプチドの代替物として作 用する構造物である（総説については、Ｍｏｒｇａｎら，（１９８９），Ａｎｎ ．Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３−２５２を参照のこと）。 ペプチド模倣物は、アミノ酸および／またはペプチド結合を含んでもよくまたは 含まなくてもよいが、本発明のペプチド、またはエンハンサーもしくはインヒビ ターの構造的および機能的特徴を保持する合成構造物を包含する。ペプチド模倣 物はまた、ペプトイド、オリゴペプトイド（Ｓｉｍｏｎら（１９７２）Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７）；および本発明のペ プチドに対応するアミノ酸の全ての可能な配列を表す設計された長さのペプチド を含むペプチドライブラリーを包含する。 ペプチドを常法によって合成してもよい。例えば、ペプチドを固相ペプチド合 成を使用して化学合成によって合成してもよい。この方法は、固相または溶液相 合成法のいずれかを用いる（固相合成技術については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ およびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ ＩＩＩ．（１９８４）ならびにＧ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒ ｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅ ｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編 第２巻 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ． ３−２５４を；そして古典的な溶液合成については、Ｍ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐ ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｌｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４ならびにＥ．Ｇｒｏｓｓおよび Ｊ.Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，前出，第１巻を参照のこと）。 ペプチド模倣物を、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での系統的置換、側鎖の異な る電子特性を有する基での置換およびペプチド結合のアミド結合置換物での系統 的置 換によって得られる情報に基づいて設計してもよい。局所的コンホメーション強 制を導入して、候補ペプチド模倣物の活性についてのコンホメーション的要件を 決定することもできる。模倣物は、逆ターンコンホメーションを安定化または促 進するために、および分子の安定化を補助するために、立体異性アミド結合また はＤ−アミノ酸を含んでもよい。環状アミノ酸アナログを使用して、アミノ酸残 基を特定のコンホメーション状態に強制してもよい。模倣物はまた、インヒビタ ーペプチドの２次構造の模倣物を包含し得る。これらの構造は、アミノ酸残基の 三次元配向を、タンパク質の既知の二次コンホメーションに合わせて形作ること ができる。Ｎ置換アミノ酸のオリゴマーであり、新規分子の化学的多岐ライブラ リーの生成用モチーフとして使用し得るペプチドイドを使用してもよい。 本発明のペプチドを、生物学的発現系をし使用して開発してもよい。この系の 使用により、ランダムなペプチド配列の大ライブラリーの製造およびこのライブ ラリーの特定のタンパク質へ結合するペプチド配列についてのスクリーニングが 可能になる。ライブラリーを、ランダムなペプチド配列をコードする合成ＤＮＡ を適切な発現ベクター中にクローン化することにより製造してもよい(Ｃｈｒｉ ｓｔｉａｎら１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１；Ｄｅｖｌｉｎ ら，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；Ｃｗｉｒｌａら１９９０，Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８を参照のこと) 。ライブラリーを、重複するペプチドの同時合成によって構築してもよい（米国 特許第４，７０８，８７１号を参照のこと）。 本発明のペプチドを使用して、薬物開発のためのリード化合物を同定してもよ い。本明細書に記載のペプチドの構造を、ＮＭＲおよびＸ線結晶学のような多数 の方法によって容易に決定することができる。配列は類似しているが、標的分子 においてそれらが発揮する生物学的活性が異なるペプチドの構造の比較によって 、標的の構造−活性関係についての情報を提供することができる。構造−活性関 係の検討から得られる情報を使用して、改変ペプチド、またはその他の低分子も しくはリード化合物のいずれかを設計することができ、これらを、標的分子に関 連する推定の特性について試験することができる。リード化合物の活性を、本明 細書に記載のアッセ イと類似のアッセイを使用して評価することができる。 構造−活性関係についての情報を、共結晶化研究から得てもよい。これらの研 究において、所望の活性を有するペプチドを、標的分子とともに結晶化させ、複 合体のＸ線構造を決定する。次いで、この構造を、天然状態の標的分子の構造に 対して比較することができ、そのような比較からの情報を使用して所望の活性を 有することが予想される化合物を設計してもよい。 本発明において使用し得る特定のペプチドは、Ｓｈｃに結合するＤＤＲ（例え ば、ＤＤＲ１ｂ）上の部位に由来するか、もしくはＳｈｃ ＰＴＢ結合ドメイン に由来するペプチド、インスリン受容体基質（ＩＲＳ−１）に結合するＤＤＲ上 の部位もしくはＤＤＲに結合するＩＲＳ−１上の部位、またはＰＤＺドメインを 有するタンパク質に結合するＤＤＲ（例えば、ＤＤＲ１）上の部位もしくはＰＤ Ｚドメインに由来するペプチドを包含する。１つの実施態様において、アミノ酸 ΨＸＮＰＸｐＹを含むペプチドが意図され、式中、Ψは疎水性アミノ酸（アラニ ン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリ ンおよびトリプトファンを含む）であり、Ｘはいずれかのアミノ酸であり、Ｎは Ａｓｎであり、Ｐはプロリンであり、ｐＹはホスホチロシンである。本発明の特 定のペプチドの例は、ＬＬＳＮＰＡｐＹ、ＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＡおよび ＡＥＤＡＬＮＴＶ（ＤＤＲ１のアミノ酸９０６〜９１３）である。 複合体 本発明の複合体は、以下を包含する：（ａ）ＤＤＲまたはそのアイソフォーム もしくは一部、およびコラーゲンまたはその一部を含む単離された複合体；（ｂ ）ＤＤＲ（例えば、ＤＤＲ１ｂ）およびＳｈｃまたはＳｈｃのＰＴＢドメインを 含む単離された複合体；ならびに（ｃ）ＤＤＲ（例えば、ＤＤＲ１）およびＰＤ Ｚドメインを含むタンパク質もしくはＰＤＺドメインを含む単離された複合体。 複合体中のＤＤＲはオリゴマー化されていてもよく、別のタンパク質に結合され ていてもよく、そして／または不溶化されていてもよい。さらに、本発明の複合 体中のコラーゲンは不溶化されていてもよい。複合体は、相互作用する分子の結 合ドメインおよび複 合体の活性を維持するために必要な他の隣接配列のみを含んでいてもよい。複合 体の例は、ＤＤＲ１とＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲン、ＤＤＲ２ とＩおよびＩＩＩ型コラーゲン、ＤＤＲ１ｂとＳｈｃ、およびＤＤＲ１とＰＤＺ ドメインを含むタンパク質を含包含する。 本発明はまた、本発明の複合体またはペプチドに特異的な抗体を意図する。抗 体はインタクトなモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、および免疫学的 に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）₂フラグメント）、抗 体重鎖、および抗体軽鎖、遺伝子操作された単鎖Ｆ_v分子（Ｌａｄｎｅｒら，米 国特許第４，９４６，７７８号）、またはキメラ抗体（例えば、マウス抗体の結 合特異性を含むが、残りの部分がヒト起源である抗体）であってもよい。抗体（ モノクローナルおよびポリクローナル抗体、フラグメントならびにキメラを包含 する）を、当業者に公知の方法を使用して製造してもよい。 本発明の複合体に特異的な抗体を、組織において複合体を検出し、その組織分 布を決定するために使用してもよい。本発明の抗体を使用するインビトロおよび インサイチュ検出法を、増殖性障害のような症状の予後のおよび／または診断的 な評価を補助するために使用してもよい。本発明の複合体に特異的な抗体を、本 明細書に論じるように治療的に使用してもよい。 いくつかの遺伝的疾患は、本発明の複合体中の相互作用する分子の結合ドメイ ン領域において変異を含み得る。それゆえ、本発明の複合体が遺伝的障害に関連 付けられる場合、ＰＣＲを使用して、結合ドメインからＤＮＡを増幅し、ドメイ ンの１つの中に変異が含まれるかどうかを迅速にチェックすることが可能であり 得る。ドメインの隣接領域に対応するプライマーを作製し、標準的配列決定法を 用いて、変異が存在するかどうかを決定することができる。この方法は、冒され た遺伝子の事前の染色体マッピングを必要とせず、欠陥タンパク質をコードする 遺伝子全体の配列決定を不要にすることによって、時間を節約することができる 。 物質の評価および同定 本明細書に記載の方法を使用して、ＤＤＲチロシンキナーゼ媒介性シグナリン グ 経路を調節する、特に細胞外マトリックスの合成、分解またはリモデリングを調 節する物質を同定してもよい。本発明の複合体中の分子に結合するか、またはそ の分子と相互作用する他の分子に結合する新規物質が意図される。本発明の複合 体中の分子またはその分子と相互作用する他のタンパク質の相互作用を妨害また は増強する物質もまた意図される。 本発明の方法を使用して同定される物質は、限定するものではないが、可溶性 ペプチドのようなペプチド（Ｉｇ−テイル付加融合ペプチドを含む）、Ｄおよび ／またはＬ立体配置アミノ酸から作製されるランダムペプチドライブラリーおよ びコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリーのメンバー、ホスホペプチド（ラ ンダムなまたは部分的に縮重し、方向付けられたホスホペプチドライブラリーの メンバーを含む）、抗体[例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、 抗イディオタイプ、キメラ、単鎖抗体、フラグメント(例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａ ｂ）₂、およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結 合フラグメント)]、ならびに有機または無機低分子を包含する。物質は、内因性 の生理学的化合物であってもよく、または天然もしくは合成の化合物であっても よい。 本発明は、試験物質を、ＤＤＲチロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路に影 響を及ぼす、特に細胞外マトリックスの合成、分解またはリモデリングを調節す る能力について、本発明の複合体中の分子の結合のアゴニストまたはアンタゴニ スト(すなわち、エンハンサーまたはインヒビター)をアッセイすることによって 評価するための方法を意図する。この方法は、一般に、複合体中の分子および試 験物質を、複合体の形成を可能にする条件下で含有する反応混合物を調製する工 程を包含する。試験物質を最初に混合物に添加してもよく、または分子の添加に 続いて添加してもよい。試験物質を含有しないかまたはプラシーボを含有するコ ントロール反応混合物もまた調製する。複合体の形成を検出する。コントロール 反応物中では複合体が形成され、反応混合物中では複合体が形成されないことは 、試験物質が分子の相互作用を妨害することを示す。反応を、液相で実施しても よく、または分子もしくは試験物質を本明細書中に記載のように固定化してもよ い。本発明の方法を使用して同定される物質を、常法を使用して単離、クローン 化および配列決定し得る。 １つの実施態様において、ＤＤＲチロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路に 影響を及ぼす物質の同定方法が提供される。この方法は、 （ａ）コラーゲンと、少なくとも１つのジスコイジンドメイン受容体チロシン キナーゼタンパク質またはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一部と、試 験物質とを反応させる工程であって、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイ ン受容体チロシンキナーゼタンパク質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコ イジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質複合体を形成するように選択 される工程；および （ｂ）上記物質の非存在下のコントロールに対して比較して、物質の効果を決 定する工程を包含する。 特に、細胞においてＤＤＲチロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路に影響を 及ぼす物質の同定方法が提供される。この方法は、 （ａ）コラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質 複合体の形成を可能にする条件下で、コラーゲンまたはその一部と、少なくとも １つのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質またはこのタン パク質のアイソフォームもしくは一部と、試験物質とを反応させる工程であって 、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク 質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナ ーゼタンパク質複合体を形成するように選択される工程；および （ｂ）複合体、遊離物質、非複合体化コラーゲン、または上記タンパク質の活 性化についてアッセイする工程を包含する。 複合体の形成を可能にする条件は、物質およびリガンドの性質および量のよう な要因を考慮して選択し得る。 複合体、遊離物質または非複合体化リガンドを、従来の単離技術（例えば、塩 析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、分画、吸収、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、凝集、またはそれらの組み合わせ）により単離してもよい。成 分のアッセイを容易にするために、物質に対する抗体、または標識コラーゲン、 または標識物質を利用してもよい。抗体、受容体タンパク質または物質を、上記 のような検出 可能な物質を用いて標識してもよい。 タンパク質の活性化を、タンパク質のチロシンリン酸化、タンパク質のオリゴ マー化、ＰＴＢドメインのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパ ク質膜近傍ドメインへの結合を測定することによって、または細胞に対する生物 学的影響（増殖、分化または移動の阻害または刺激のような）をアッセイするこ とによってアッセイしてもよい。 本発明の方法を使用してアッセイすることができるアゴニストおよびアンタゴ ニスト（すなわち、インヒビターおよびエンハンサー）は、複合体中の相互作用 する分子上の１つ以上の結合部位（アゴニスト結合部位、競合的アンタゴニスト 結合部位、非競合的アンタゴニスト結合部位またはアロステリック部位を含む） に作用してもよいことが理解される。 本発明はまた、本発明の複合体中の分子の相互作用のアゴニストの効果を阻害 するアンタゴニストについてスクリーニングすることを可能にする。従って、本 発明を、本発明の複合体中の分子の同じ結合部位について競合する化合物につい てアッセイするために使用してもよい。 本発明はまた、本発明の複合体の分子と相互作用するタンパク質に結合し、そ れによってＤＤＲシグナリング経路に影響を及ぼす新規化合物の同定方法を意図 する。タンパク質−タンパク質相互作用を、共免疫沈降、架橋、および勾配また はクロマトグラフィーカラムを介する同時精製のような常法を使用して同定して もよい。分子と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子の同時同定をもたら す方法を使用してもよい。この方法は、標識分子を用いて発現ライブラリーをプ ローブする工程を包含する。さらに、Ｘ線結晶学的研究を、物質および分子との 相互作用を評価する手段として使用してもよい。例えば、適切な形態に結晶化さ せた場合、本発明の複合体中の精製組換え分子は、Ｘ線結晶学による分子内相互 作用の検出を受けることができる。分光学を使用して相互作用を検出してもよく 、特にＱ−ＴＯＦ機器を使用してもよい。 ツーハイブリッドシステムを使用してインビボにおいてタンパク質相互作用を 検出してもよい。一般に、２つのハイブリッドタンパク質をコードするブラスミ ドを 構築する。第１のハイブリッドタンパク質は本発明の複合体中の分子に融合され た転写アクチベータタンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、第２のハイブリ ッドタンパク質は、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラスミド中に組換えら れているｃＤＮＡによってコードされる未知のタンパク質に融合された転写アク チベータタンパク質のアクチベータドメインからなる。プラスミドは、その調節 領域が転写アクチベータの結合部位を含むリポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ 、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダー ゼ)を含む酵母(例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)株中に形質転換される。ハ イブリッドタンパク質単独ではリポーター遺伝子の転写を活性化することはでき ない。しかし、２つのハイブリッドタンパク質の相互作用は、機能的アクチベー タタンパク質を再構成し、リポーター遺伝子の発現を生じ、これはリポーター遺 伝子産物についてのアッセイによって検出される。 融合タンパク質および組換えタンパク質が上記方法において使用され得ること が理解される。本発明の複合体が組換え分子を使用してインビトロで再構成され 得、試験物質の効果が再構成された系において評価され得ることもまた理解され る。 ＤＤＲ受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路に影響を及ぼすかまた はそれを調節する物質および化合物を評価するために本発明の方法を適用するた めに適切な試薬を、適切な容器中に包装された必要な材料を提供する便利なキッ トに包装してもよい。キットは本発明の方法の実施に有用な適切な支持体を含ん でもよい。 組成物および処置 上記の本発明の方法を使用して、細胞においてジスコイジンドメイン受容体チ ロシンキナーゼシグナリング経路に影響を及ぼす物質、特に増殖、転移、または 細胞外マトリックスの合成、分解もしくはリモデリングに関与する物質を同定し 得る。そのような物質が増殖、転移、および／または細胞外マトリックスの合成 、分解もしくはリモデリングを調節するための医薬品として有用であることが理 解される。本発明の方法を使用して同定される物質が増殖および／または転移な らびに他の細胞のプロセスに影響を及ぼす能力を、動物モデルにおいて確認して もよい。例えば、 ＭＤＡＹ−Ｄ２マウスモデルを使用して、抗増殖剤または抗移転剤としての物質 の有用性を確認してもよい。 本発明は、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリング 経路が関与する症状の処置または予防方法を提供する。この方法は、それを必要 とする患者にシグナリング経路を妨害（すなわち、阻害または増強）するために 有効な量の物質を投与する工程を包含する。この物質は、（ａ）ジスコィジンド メイン受容体チロシンキナーゼもしくはその一部;(ｂ)コラーゲンもしくはその 一部;(ｂ)ＤＤＲもしくはその一部およびコラーゲンもしくはその一部を含む単 離された複合体；（ｃ）コラーゲンもしくはコラーゲンの一部、またはＳｈｃも しくはＰＤＺドメインを含むタンパク質と相互作用するＤＤＲの結合ドメイン由 来のペプチド;(ｄ)ＤＤＲもしくはその一部と相互作用するコラーゲンの結合ド メイン由来の分子;(ｅ)複合体およびペプチドに特異的な抗体；または（ｆ）： （ｉ）コラーゲンと、少なくとも１つのジスコイジンドメイン受容体チロシンキ ナーゼタンパク質またはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一部と、試験 物質とを反応させる工程であって、上記コラーゲンおよびジスコイジンドメイン 受容体チロシンキナーゼタンパク質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコイ ジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質複合体を形成するように選択さ れる工程；および （ii）上記物質の非存在下のコントロールに対して比較して、物質の効果を決 定する工程によって最初に同定される物質である。 本発明はまた、ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリ ング経路に影響を及ぼすために有効な量の、（ａ）ジスコイジンドメイン受容体 チロシンキナーゼもしくはその一部；（ｂ）コラーゲンもしくはその一部、好ま しくは炭水化物部分；（ｂ）ＤＤＲもしくはその一部およびコラーゲンもしくは その一部を含む単離された複合体；（ｃ）コラーゲンもしくはコラーゲンの一部 、またはＳｈｃもしくはＰＤＺドメインを含むタンパク質と相互作用するＤＤＲ の結合ドメイン由来のペプチド；（ｄ）ＤＤＲもしくはその一部と相互作用する コラーゲンの結合ドメイン由来の分子；（ｅ）（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の複 合体、ペプチドおよび分子に特異的な抗体；または（ｆ）本発明の方法によって 最初に同定される物 質、および医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含有する医薬組成物に 関する。本発明の１つの実施態様において、組成物は、ジスコイジンドメイン受 容体チロシンキナーゼの細胞外ドメイン、またはコラーゲンのＧ−Ｘ−Ｙ反復領 域もしくは炭水化物部分に結合する細胞外ドメインの部分、またはそのオリゴマ ーもしくは模倣物を含んでもよい。 本発明の方法および組成物を、哺乳動物における増殖または転移の変化、コラ ーゲンの構造的または機能的脱調製が関与する症状(Ｓｉｃｋｌｅｒ症候群のよ うな)の処置、コラーゲンの欠損が関与する症状（骨形成不全症のような）の処 置、細胞外マトリックスの分解またはリモデリングの調節を必要とする症状の処 置、創傷治癒の増強、および軟骨または骨形成の増強のために使用してもよい。 本発明の組成物は、対象に、インビボにおける医薬投与に適切な生物学的に適合 性の形態で投与される。「インビボにおける投与に適切な生物学的に適合性の形 態」は、タンパク質の治療的効果がいずれの毒性効果にもまさる、投与されるべ きタンパク質の形態を意味する。用語、対象は、哺乳動物を含むことが意図され る。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェ ニック種を包含する。本発明の医薬組成物の治療有効量の投与は、所望の結果を 達成するために必要な投薬量および期間で有効な量として定義される。例えば、 活性物質の治療有効量は、個体の状態、年齢、性別および体重のような要因に従 って変動し得る。投薬養生法は、最適の治療応答を提供するように調整してもよ い。例えば、いくつかの分割した用量を毎日投与してもよく、または用量を、示 される治療状況の必要性に応じて減少させてもよい。 活性化合物（例えば、タンパク質）を、注射（皮下、静脈内など）、経口投与 、吸入、経皮適用または直腸投与によるような便利な方法で投与してもよい。投 与経路に依存して、酵素、酸および化合物を不活化し得る他の天然条件の作用か ら化合物を保護するために、活性化合物を材料中にコートしてもよい。本発明の 医薬組成物は、経口、局所、吸入または大脳内投与用であってもよい。好ましく は、本発明の医薬組成物は、例えば大脳内投与によって、直接的に、末梢または 中枢神経系に投与される。 本発明の医薬組成物を、対象に、適切な担体または希釈剤中で、酵素インヒビ ターと同時投与して、または細孔性もしくは固体ビーズもしくはリポソームのよ うな適切な担体中で投与することができる。本明細書において使用する用語「医 薬上許容される担体」は、生理食塩水および緩衝水溶液のような希釈剤を含むこ とが意図される。リポソームは水中油中水エマルジョンならびに従来のリポソー ムを包含する（Ｓｔｒｅｊａｎら，（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７：２７）。活性化合物を非経口または腹腔内投与してもよい。分散物もまた 、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物ならびに油中で 製造することができる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの調製物に微 生物の増殖を防止するための保存料を含めてもよい。 注射使用に適切な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）もしくは分散物 および滅菌注射溶液または分散物の用事調製用の滅菌粉末を包含する。全ての場 合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注射可能性が存在 する程度に流動性でなければならない。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安 定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して 保護されなければならない。医薬上許容される担体は、例えば、水、エタノール 、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコールおよび液体ポリ エチレングリコールなど）、ならびにその適切な混合物を含む溶媒または分散媒 であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用に よって、分散物の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活 性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止を、種々の抗菌 剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコ ルビン酸、チメロサールなど）によって達成することができる。多くの場合にお いて、組成物中に等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（マンニトールのような ）、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含めることが好ましい。注射用組成物の 吸収の延長を、吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウム およびゼラチン)を組成物中に含めることによって達成することができる。 滅菌注射用溶液を、必要とされる量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要に応 じ て上記で列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに取り込ませ、続いて濾過 滅菌することによって製造することができる。一般に、分散物は、活性化合物を 、滅菌ビヒクル（これは、基礎分散媒および上記で列挙した必要とされる他の成 分を含有する）中に取り込ませることによって製造される。滅菌注射用溶液の調 製用の滅菌粉末の場合は、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり 、これは、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分（例えば、抗体）およ びいずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる。 上記のように活性化合物が適切に保護される場合、組成物を、例えば、不活性 な希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与してもよい。本明細書中で 使用する場合、「医薬上許容される担体」は、いずれかのおよび全ての溶媒、分 散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包 含する。そのような媒質および薬剤の医薬上活性な物質のための使用は、当該分 野において周知である。いずれかの従来の媒質または薬剤が活性化合物と非適合 性である場合を除いて、その治療組成物における使用が意図される。 本発明の医薬組成物が、精製および単離されたジスコイジンドメイン受容体チ ロシンキナーゼタンパク質、またはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一 部、本発明のペプチド、本発明の複合体に対する抗体、または本発明の方法を使 用して同定された物質をコードする核酸分子で形質転換され、その結果タンパク 質、タンパク質のアイソフォームもしくは一部、好ましくは細胞外ドメイン、ま たは物質をインビボで発現する細胞またはウイルス、好ましくはレトロウイルス ベクターを含んでもよいこともまた意図される。本発明における使用に適切なウ イルスベクターは、当該分野において周知であり、組換えワクシニアウイルスベ クター（米国特許第４，６０３，１１２号および同第４，７６９，３３０号）、 組換えポックスウイルスベクター（ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８９／０１９７３）、 ならびに好ましくはレトロウイルスベクター（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｅ ｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｗｉｔｈ Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｅｃｏｔｒ ｏｐｉｃ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅｓ」，ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９０／０２８０６ ；「Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎ ｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」，ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８９／０７１５０；およ び「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｔ ｒｏｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔａｔｅｓ」，ＰＣＴ公開公報ＷＯ ８７ ／０３４５１）を包含する。細胞またはウイルスを含有する組成物を対象に直接 的に導入してもよい。ＤＤＲまたはこのタンパク質のアイソフォームもしくは一 部、本発明のペプチド、本発明の複合体に対する抗体、または本発明の方法を使 用して同定された物質をコードする核酸分子を、物理的技術（マイクロインジェ クションおよびエレクトロポレーションのような）または化学的方法（核酸の共 沈およびリポソーム中への取り込みのような）を使用して対象に導入してもよい 。核酸を、エアロゾルの形態でまたは洗浄によって送達してもよい。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限 定するものではない。 実施例実施例１ 本発明者らは、活性化されたＤＤＲ１（ＭＣＫ１０）のｂアイソフォーム（ａ アイソフォームではなく）が、インビボにおいてＳｈｃと会合し、インビトロに おいてＳｈｃ ＰＴＢドメインに結合ずることを示した。この相互作用は、ｂア イソフォームの膜近傍インサートにおいて特異的に見出されるＬＬＳＮＰＡＹモ チーフを含むホスホペプチドによってブロックされる。これらの結果は、オルタ ナティブスプライシングが、ＤＤＲ１がＳｈｃと相互作用する能力を、ＰＴＢ結 合部位の存在または非存在を制御することによって、直接的に調節することを示 唆する。 実験手順 材料および細胞株 − 機能的ＳｈｃドメインのグルタチオンＳトランスフェラ ーゼ(ＧＳＴ)融合タンパク質としてのクローニングおよび発現は以前に記載した (１３)。簡潔に記載すると、ＰＴＢドメイン融合構築物は、ヒトｐ５２ Ｓｈｃ のアミノ酸１〜２２５を含み、ＳＨ２構築物はアミノ酸３６６〜４７３にわたる 。ＤＤ Ｒ１（ＭＣＫ１０としても知られる）発現ベクターは以前に記載した（１）。ホ スホペプチドＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓモデル４３１Ａ機器を使用して合成した。Ｓｈｃに対する抗体を、Ｇ ＳＴ−Ｓｈｃ ＳＨ２融合タンパク質に対して惹起した。他の抗体を、Ｓａｎｔ ａ Ｃｒｕｚ，Ｉｎｃ．から購入した（モノクローナル抗ホスホチロシン抗体４ Ｇ１０、およびＭＣＫ１０のアミノ酸８９４〜９１３に対するポリクローナルウ サギ血清）。ヒト胚腎臓線維芽細胞２９３をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７ ３）、推奨される条件下で培養した。 一過性発現 − 半集密の２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿によって、ＤＤ Ｒ１のａまたはｂアイソフォームを含むサイトメガロウイルウスに基づく発現ベ クターでトランスフェクトした（１）。１６時間後、細胞をさらに２４時間無血 清培地に移した。溶解前に、細胞を１ｍＭオルトバナジン酸（ｐＨ１０．０）で ９０分間刺激した。リン酸化タンパク質をインビボにおいて標識するために、細 胞を０．５ｍＣｉ ｍｌ^-1[³²Ｐ]無機リン酸（ＮＥＮ）とともに４時間増殖させ た。 免疫沈降、ウエスタンブロッティングおよびキナーゼアッセイ − トランスフ ェクトした２９３細胞を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０)、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ４０、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍ Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド、１ｍＭ オルトバナジン酸および１０ μｇｍｌ^-1アプロチニンを含有するＮＰ４０緩衝液中で溶解した。細胞溶解物を １０分間４℃で１３０００ｒｐｍで遠心分離し、上清のアリコートをＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥに供するか、または特異的抗体を用いる３時間４℃での回転輪上での免疫 沈降によってさらに分析した。免疫複合体を３回ＮＰ４０緩衝液で洗浄し、ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｉｅ ｌｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏ ｎ Ｘ−１００、０．２５％ ゼラチン中１：５００希釈した抗体を用いて一晩 イムノブロットした。ウエスタンブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二 次ヤギ抗プロテインＡ抗体(Ｂｉｏ ｒａｄ)および増強化学発光(Ａｍｅｒｓｈａｍ)を使用して発色させた。再プロ ーブ用に、膜を７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、０ ．１％β−メルカプトエタノール中で５５℃で３０分間剥離した。インビトロキ ナーゼアッセイ用に、免疫沈降物を４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１０μＭオルトバナジン酸、５μＭ ｄ ＡＴＰ中で２回洗浄し、２０μＣｉ[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰとともに３０℃で２０分 間インキュベートした。キナーゼ反応の生成物をｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜（ＮＥＮ ）に移したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによってモニターし た。 ホスホペプチドマッピング − タンパク質を膜から切出し、Ｎ−ｐ−トシル− Ｌ−リジン−クロロメチル−ケトン処理したトリプシン（Ｓｉｇｍａ）で１６時 間消化し、過ギ酸を用いて１時間酸化し、段階的に脱塩し、凍結乾燥によって濃 縮した。等ｃｐｍの放射能標識したペプチドを二次元で、第一次元において薄層 セルロース（ＴＬＣ）プレート（１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）上での、ＨＴＬＥ ７０００装置（Ｃ．Ｂ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｄｅｌ Ｍａｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い る、ｐＨ １．９緩衝液（２．５％ ギ酸、７．８％酸性酸(acidic acid)）中 での電気泳動を使用し、第二次元において上昇クロマトグラフィー(3７．５％ ｎ−ブタノール、２５％ピリジン、７．５％ 酸性酸、３０％水）を使用して分 離した。ＴＬＣプレートを乾燥させ、Ｘ線フィルムに−７０℃で増感スクリーン を使用して曝露した。 表面プラズモン共鳴 − 実験をＢＩＡｃｏｒｅ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を 用いて実施した。ポリオーマウイルスミドルＴ抗原（ｍＴ）中のＮＰＸＹ配列に 対応するホスホペプチド（ＬＳＬＬＳＮＰＴｐＹＳＶＭＲＳＫ）をバイオセンサ ーチップの表面に吸収させた。可溶性ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメイン融合タン パク質のｍＴペプチドへの結合を、ＤＤＲ１ｂのＴｙｒ ５１３またはＮＧＦＲ のＴｙｒ４９０の周囲の配列に基づく競合可溶性ホスホペプチド（ＨＩＩＥＮＰ ＱｐＹＦＳＤ）（２１）の存在下または非存在下で測定した。結果および考察 ＤＤＲ１ ＲＴＫがＳｈｃタンパク質と相互作用するかどうかを決定するため に、ヒト胚腎臓線維芽細胞２９３をＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂアイソフォーム をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトした。受容体キナーゼ活性 化および自己リン酸化を、細胞を１ｍＭ オルトバナジン酸で９０分間溶解前に 処理することによって達成した。オルトバナジン酸処理は、ＤＤＲ１のチロシン リン酸化をインビボで刺激することが以前に示されている（１）。Ｓｈｃタンパ ク質をこれらの細胞の溶解物から免疫沈降させ、免疫沈降物を抗ホスホチロシン 抗体を用いてイムノブロットした。約１２５ｋＤａのチロシンリン酸化タンパク 質が、ＤＤＲ１ｂでトランスフェクトした細胞からＳｈｃとともに共沈された（ 図１Ａ）。ブロットの抗ＤＤＲ１抗体を用いる再プローブによって、１２５ｋＤ ａ Ｓｈｃ会合タンパク質はＤＤＲ１ｂであることが示された（図１Ｂ）。ＤＤ Ｒ１ａ自体はＤＤＲ１ｂに匹敵する程度にチロシンリン酸化されるという事実に かかわらず、２９３細胞においてＤＤＲ１ａとＳｈｃとの間の会合は見られなか った（図１Ｄ）。 ＳｈｃのＤＤＲ１ｂとの相互作用をより詳細に検討するために、ＳｈｃのＰＴ ＢおよびＳＨ２ドメインをＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。これらのＧ ＳＴ融合体を固定化し、２９３細胞（ＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂアイソフォー ムを用いてトランスフェクトし、オルトバナジン酸とともにインキュベートして 、受容体チロシンリン酸化を誘導しておいた）の溶解物とともにインキュベート した。オルトバナジン酸処理した細胞由来のＤＤＲ１のｂアイソフォームは、イ ンビトロにおいてＳｈｃ ＰＴＢドメインと特異的に会合したが、一方、未刺激 細胞由来のｂアイソフォームの結合は観察されなかった（図１Ｅ）。対照的に、 Ｓｈｃ ＰＴＢドメインは、オルトバナジン酸刺激した細胞由来のＤＤＲ１ａに 結合しなかった。Ｓｈｃ ＳＨ２ドメインのチロシンリン酸化ＤＤＲ１ａまたは ＤＤＲ１ｂへの結合は検出されなかった。これらの結果は、Ｓｈｃ ＰＴＢドメ インが、ＤＤＲ１ｂに特異的であり、ＤＤＲ１ａには存在しない自己リン酸化部 位を認識することを示唆し、これは、ＤＤＲ１ｂの膜近傍インサート中のＬＬＳ ＮＰＡＹモチーフの存在と一致する。従って、オルタナティブスプライシングは 見かけ上、ＤＤＲ１中のＳｈｃ ＰＴＢ結合部位の存在または非存在を調節し、 それによってインビボにおいてＤＤ Ｒ１がこの下流標的と相互作用する能力を制御している。 上記に示す結果は、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインが、ＤＤＲ１ｂ膜近傍インサート 中のモチーフＬＬＳＮＰＡＹ中に位置するリン酸化Ｔｙｒ ５１３に結合する可 能性を提起する。Ｔｙｒ ５１３のリン酸化がＰＴＢ結合部位を形成し得るかど うかを試験するために、ＤＤＲ１ｂの残基５０５〜５１８に対応する配列ＡＬＬ ＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡを有する１４マーホスホペプチドを合成した。このホ スホペプチドがＳｈｃ ＰＴＢドメインに結合する能力を、競合アッセイを使用 して分析した。このアッセイにおいて、ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢ融合タンパク質 が、トランスフェクトした２９３細胞の溶解物由来のチロシンリン酸化ＤＤＲ１ ｂに結合する能力を、漸増量のＴｙｒ ５１３ホスホペプチドの存在下で測定し た。１００ｎＭのホスホペプチドは、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインのＤＤＲ１ｂへの 結合を阻害し、完全な阻害は２μＭのホスホペプチド濃度において達成された（ 図２Ａ）。これらの結果は、Ｔｙｒ ５１３のリン酸化がＳｈｃ ＰＴＢドメイ ンの強力な結合部位を作り出すことを示唆する。この相互作用をより正確に定量 するために、表面プラズモン共鳴技術を使用した。この技術において、可溶性Ｄ ＤＲ１ｂホスホペプチドを用いて、ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢ融合タンパク質の、 バイオセンサーチップ上に固定化したポリオーマウイルスミドルＴ抗原ホスホペ プチドへの結合を阻害した（２１）。図２Ｂに示すように、約８００ｎＭの濃度 のＤＤＲ１ｂホスホペプチド（Ｔｙｒ ５１３周辺の配列を含む）は、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインのミドルＴ抗原ホスホペプチドへの結合を５０％阻害した（ＩＣ₅₀ ）。これらの知見は、ＮＧＦ受容体のＮＰＸＹモチーフ周辺のホスホペプチド を比較実験において使用した場合に見出された約１００ｎＭのＩＣ₅₀値とは対照 的であるが（図２Ｂ）、ミドルＴ抗原ホスホペプチド自体のＩＣ₅₀には類似して いる（２１）。 Ｓｈｃ ＰＴＢドメインとリン酸化ペプチドとの間の相互作用を分析する実験 データは、チロシンリン酸化部位のＮ末端側の特定の残基の重要性を強調した。 −３位のＡｓｎを欠くホスホペプチドはＳｈｃ ＰＴＢドメインの結合において 無効であったが、一方、−２位のＰｒｏは結合に重要ではあるが必須ではないよ うである（２１−２５）。親和性の実質的な減少は、−５位の疎水性残基の極性 アミノ酸への変 更に際しても観察され、このことは、コアＮＰＸＹ配列の上流の大きな疎水性残 基がＳｈｃ ＰＴＢドメインの認識に寄与することを示す（１３、１８）。ＮＧ Ｆ受容体由来のホスホペプチドに結合したＳｈｃ ＰＴＢドメインの構造解析に よって、−５残基を受け入れる疎水性ポケットが同定されており、これは、この 位置における疎水性残基の優先性を説明する（２６）。ＤＤＲ１ｂのＴｙｒ５１ ３に先行する配列は、−５、−６および−７位における３つ組のロイシンならび に−８位におけるアラニンを示し、これは、この部位がＳｈｃ ＰＴＢドメイン に高親和性で結合するという知見と一致する。この配列は、Ｓｈｃ ＰＴＢ結合 についてのコンセンサスのみならず、インスリン受容体基質１（ＩＲＳ−１）の ＰＴＢドメインとの相互作用についてのコンセンサス（−６〜−８位において疎 水性残基を必要とする）とも一致する（２７、２８）。ＩＲＳ−１は、ＤＤＲ１ ｂと会合し得る。興味深いことに、３つのロイシンは、ＤＤＲ１ｂ中のＮＰＸＹ モチーフのＣ末端側＋２〜＋４位においても見出される。この高度に対称的な配 列の重要性は不明である。おそらく、プロリンにおけるｂターンによって開始さ れる拡張ループの形成が、３つ組ロイシンの２つのブロックによって賦与される のであろう。 ＤＤＲ１ｂアイソフォームに特有の膜近傍インサートの配列は、２つの可能な チロシンリン酸化部位、Ｔｙｒ ５１３および５２０を含む。上記で詳述した実 験は、Ｔｙｒ ５１３のリン酸化がＳｈｃ ＰＴＢドメイン用の強力な結合部位 を形成し得ることを示す。異なるＤＤＲ１アイソフォームのリン酸化の程度をモ ニターするために、２９３細胞をＤＤＲ１のａまたはｂアイソフォームをコード する発現ベクターを用いてトランスフェクトし、このトランスフェクトした細胞 を[³²Ｐ]オルトリン酸を用いて代謝標識した。オルトバナジン酸で９０分間刺激 した後、ＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂアイソフォームを細胞溶解物から免疫沈降 させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製し、トリプシン消化に供した。得られたト リプシン消化ホスホペプチドを二次元で分離した。いずれの受容体形態の二次元 ホスホペプチドマップも、幾分複雑なスポットのパターンを示し、このことは、 複数の部位におけるリン酸化を示す（図３ＡおよびＢ）。両方のマップの重ね合 わせによって、ＤＤＲ１ａ由来の全てのホスホペプチドはＤＤＲ１ｂ由来のペプ チドと共移動するが、一方、ＤＤ Ｒ１ｂのトリプシン消化ホスホペプチドマップに存在するスポットｃ、ｅ、ｉお よび１はＤＤＲ１ａの消化物に存在しないことが示された（図３Ａ、ＢおよびＣ ）。これらのＤＤＲ１ｂ特異的ホスホペプチドの中で、スポット１は最も濃く、 このことは、これが受容体の細胞質領域中の主要なリン酸化部位に由来すること を示唆する。この結果は、ＤＤＲ１ｂのオルタナティブスプライシングされたイ ンサートが、ＤＤＲ１ａ中には見出されない新たな自己リン酸化部位を提供する という可能性と一致する。ｂアイソフォームに特異的な複数のホスホペプチドの 存在は、膜近傍インサート内の複数の部位のリン酸化によって、または単一のリ ン酸化部位を含むいくつかの異なるペプチドの生成によって説明され得る。 これらの結果を追求するために、抗ＤＤＲ１免疫沈降物をインビトロキナーゼ 反応に供して、受容体自己リン酸化を誘導した。インビトロリン酸化したＤＤＲ １ａおよびＤＤＲ１ｂ（図３ＤおよびＥ）または両方のアイソフォームの混合物 （図３Ｆ）のトリプシン消化ホスホペプチドマップは、ａアイソフォーム由来の 全てのホスホペプチドがｂアイソフォームの消化物中にも存在することを示した が、より長いアイソフォームがさらなるホスホペプチドを含むことも示した。ｂ アイソフォームに特異的なホスホペプチドのうちの２つ(主要スポット１および より弱いスポットｅ)は、³²Ｐ標識オルトバナジン酸処理細胞から単離したｂア イソフォームに特有のホスホペプチドに対応した（図３ＢおよびＥ）。インビト ロキナーゼ反応はまた、インビボ標識タンパク質の消化物中には見られなかった １つのＤＤＲ１ｂ特異的ペプチドのリン酸化を生じ（スポットｐ）、一方、ペプ チドｃおよびｉのリン酸化は、インビボ条件下のみで生じた。これらのデータは 、ＤＤＲ１ｂが、インビトロ自己キナーゼ反応およびオルトバナジン酸処理後の ＤＤＲ１ｂ発現細胞の両方においてリン酸化される、少なくとも１つの、ＤＤＲ １ａと比較して新たな自己リン酸化部位を含むことを示唆する。これらの結果は 、ＤＤＲ１ｂの膜近傍インサートが、ＤＤＲ１のその標的との相互作用を、特異 的にＳｈｃ ＰＴＢドメインに対するドッキング部位を提供することによって改 変するという示唆と一致する。実施例２ これまでに、ＤＤＲ１またはＤＤＲ２へのリガンドの結合も、ＤＤＲの固有の チロシンキナーゼ活性を誘導するペプチドまたはタンパク質も報告されていない 。コラーゲンファミリーの特定のメンバーがＤＤＲ１およびＤＤＲ２に対するリ ガンドとして同定された。コラーゲンは、細胞外ドメインと直接的に相互作用す ることが見出され、コラーゲンは時間および濃度依存性様式でＤＤＲのチロシン リン酸化を誘発した。 最初に、Ｍａｔｒｉｇｅｌと呼ばれる細胞外マトリックスタンパク質の市販の 調製物が、ＤＤＲ１のチロシンリン酸化を誘導することが見出された。Ｍａｔｒ ｉｇｅｌの種々の成分を試験して、ＩＶ型コラーゲンがリガンド活性を有するこ とが同定された。次いで、種々の器官および種（ヒト、ラット、マウス、ウシ） 由来のほぼ全ての市販のコラーゲンの型をリガンドアッセイにおいて試験した。 Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンは、等しく良好なＤＤＲ１に対するリガ ンドであった。ＩおよびＩＩＩ型コラーゲンは高度に強力なＤＤＲ２に対するリ ガンドであり、ＩＩおよびＶ型コラーゲンは中程度であり、ＩＶ型は活性を示さ ない。Ｉ型コラーゲンをＤＤＲ１またはＤＤＲ２ ｃＤＮＡを用いてトランスフ ェクトしたヒト胚腎臓線維芽細胞２９３の組織培養培地に添加すると、リガンド 活性が、１ｍｌの培地当り約２５０ｎｇのコラーゲンの最小濃度で検出された。 最大のチロシンリン酸化は、１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンでの刺激後９０分 に見られた。以前に、Ｔ−４７Ｄ（ヒト乳ガン細胞株）およびＡ４３１（ヒト類 表皮ガン細胞株）が、ＤＤＲ１の内因性発現を示すことが見出された。Ｉ型コラ ーゲンでの刺激後、ＤＤＲ１タンパク質を免疫沈降によって抽出した。この免疫 沈降物において、ＤＤＲ１チロシンリン酸化の有意な増加が、コラーゲン刺激後 に、ウエスタンブロットまたはインビトロキナーゼアッセイ技術を使用して検出 された。リガンド活性は、Ｉ型コラーゲンのコラゲナーゼでの前処理後に消滅し たが、ペプシンでの処理後は消滅しなかった。過ヨウ素酸を酸化剤として使用し てＩ型コラーゲンの炭水化物部分を除去した後、ＤＤＲ２に対するリガンド活性 は劇的に低下した。これらのデータは、コラーゲンのグリコシル化がＤＤＲ活性 化に必須であることを示唆する。図４、５および６ならびに１２Ｃは、実験結果 を示す。 コラーゲンは高度に翻訳後修飾されている（例えば、ヒドロキシル化、グリコ シル化およびジスルフィド結合）。これらの修飾はリガンド活性に重要または必 須であり得る。 発ガンおよび転移の進行において、腫瘍成長の最初の段階はなお幾分不可解で ある。特に転移において、何が原発腫瘍からの細胞の剥離を誘導するか、何の因 子が腫瘍を取り囲む基底膜および結合組織の障害を破壊するために細胞にとって 必要であるか、および何の因子が転移部位における再付着に関与しているかは不 明である。腫瘍の侵入および転移性成長を開始するためには、健常な基底膜が破 損されなければならない。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のファ ミリーはこの過程に関与することが知られている。ＤＤＲの活性化は、ＭＭＰの 機能と相関し得る。ＤＤＲ１は腫瘍細胞の表面で発現され、ＤＤＲ２は周囲の間 質組織において発現され、両者はコラーゲンに結合できるので、これらの受容体 は腫瘍の成長および転移に関与し得る。 多面的な異なるヒト疾患がコラーゲンの構造的改変または機能的脱調節に関連 していることが知られている。多くの遺伝性結合組織障害の遺伝的基礎は未解明 である。ＤＤＲ１およびＤＤＲ２遺伝子のリガンド結合ドメイン、キナーゼドメ インまたはいずれかの他の位置における変異は、これらの種類の障害を引き起こ し得る。結合組織障害の患者由来のＤＮＡ試料を、サザンブロットおよびＰＣＲ 技術を使用して分析して、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２遺伝子における遺伝子変異を 同定することができる。ＤＤＲ１のヒト遺伝子座は６ｐ２１．３であり、ＤＤＲ ２のヒト遺伝子座は１ｑ２１−ｑ２３である。データベース検索によって、これ らの遺伝子座付近にマッピングされ、骨、皮膚または軟骨欠陥を示すいくつかの 疾患が示された。ＤＤＲ１遺伝子座付近の第一候補はＳｉｃｋｌｅｒ症候群であ る。コラーゲンの偏在性発現のために、他の遺伝性でない疾患も同様にＤＤＲ１ およびＤＤＲ２の機能不全に潜在的に関連し得る。実施例３ 以下は、コラーゲンファミリーのメンバーがＤＤＲのリガンドであることを示 す、 実施例２において論じた実験の詳細である。 実験手順 試薬、細胞株およびプラスミド ＭａｔｒｉｇｅｌをＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手した。全ての型のコラーゲン および他の試薬をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒト胚 腎臓線維芽細胞２９３、ヒト乳ガン細胞Ｔ−４７Ｄおよびヒト線維肉腫細胞ＨＴ １０８０をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎから入手し、推奨させる条件下で培養した。細菌グルタチオンＳトラン スフェラーゼ融合タンパク質としてのＳｈｃ ＰＴＢドメインの発現は以前に発 表された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒら，１９９６）。ＤＤＲ発現ベクターは以 前に記載された（１）。ＤＤＲ１（アミノ酸２９〜１８６）およびＤＤＲ２（ア ミノ酸２８〜３６７）の細胞外ドメインの部分をｐＥＴ３０ａベクター（Ｎｏｖ ａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にＨｉｓタグとインフレームでクローン化 し、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＴ７プロモーター下で発現させた。タンパク質をＮｉアフ ィニティークロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、これを抗体を 惹起するために使用した。ペプチドＡＬＬＬＳＮＰＡＹＲＬＬＬＡＴＹＡＲＣを 、ＤＤＲ１のｂアイソフォームに対する抗体を惹起するために使用した（アミノ 酸５０５〜５２３）。ＤＤＲ１（アミノ酸８９４〜９１３）およびインスリン受 容体（アミノ酸１３６５〜１３８２）に対する抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｉ ｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。モノクローナル抗ホスホ チロシン抗体４Ｇ１０をＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ ．（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から入手した。 コラーゲンの精製 成体マウスを屠殺し、コラーゲンを含有する鍵を、その尾から、滅菌鉗子を使 用して切除した。腱を５００ｍＭ酢酸中、振盪機上で４℃で一晩インキュベート した。 不溶性物質を遠心分離によって除去した。可溶性物質を１０ｍＭ酢酸に対して透 析した。コラーゲンの純度および完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。 ＩＶ型コラーゲンを、２Ｍ塩酸グアニジウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７． ５)、２ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液を用いてＭａｔｒｉｇｅｌから抽出した( Ｋｌｅｉｎｍａｎら，１９８２)。可溶性物質を５００ｍＭ酢酸に対して透析し た。あるいは、Ｍａｔｒｉｇｅｌを５００ｍＭ 酢酸、１％ペプシンを用いて抽 出し、可溶性コラーゲンを５００ｍＭ酢酸に対して透析した(Ｔｉｍｐｌら，１ ９７９)。 ２９３細胞における一過性発現およびウエスタンブロット分析 半集密の２９３細胞をリン酸カルシウム沈殿によってサイトメガロウイルウス に基づく発現ベクターを用いてトランスフェクトした。１６時間後、細胞をさら に２４時間、無血清培地に移した。細胞を１０μｇ／ｍｌのコラーゲンで９０分 間刺激し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７． ５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭフェニルメチ ルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ Ｎａ−オルトバナジン酸、１０ μｇ／ｍｌアプロチニンを用いて溶解した。細胞溶解物を１０分間４℃で１３， ０００ｒｐｍで遠心分離し、上清のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供するか、 または特異的抗体を用いる３時間４℃での回転輪上での免疫沈降によってさらに 分析した。免疫複合体を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ、１０％グリセロールで３回洗浄し、ＳＤＳ− ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃ ｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ ５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ゼラチン中１：５００希釈 した抗体を用いて一晩イムノブロットした。ウエスタンブロットを西洋ワサビペ ルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｂｉｏｒａｄ）および増強化学発光（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）を使用して発色させた。再プローブ用に、膜を７０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐ Ｈ６．８）、２％ ＳＤＳ、０．１％β−メルカプトエタノール中で５５℃で３ ０分間剥離した。インビトロキナー ゼアッセイ用に、免疫沈降物を４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１０μＭオルトバナジン酸、５μＭ ｄＡＴ Ｐ中で２回洗浄し、５μＣｉ[γ−³²Ｐ]ＡＴＰとともに３０℃で２０分間インキ ュベートした。キナーゼ反応の生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグ ラフィーによりモニターした。 結合分析 １００μｇのマウスＩ型コラーゲンを、１ｍＣｉのＮａ[¹²⁵Ｉ]（ＮＥＮ）お よび１つのｉｏｄｏ−ｂｅａｄ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＮ−クロロ−ベンゼ ンスルホンアミド法によりヨウ素化した。標識したコラーゲンをＳｅｐｈａｄｅ ｘ Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーにより回収し、これは５ ×１０⁶ｃｐｍ／μｇの比活性を有することが見出された。ＤＤＲ受容体への結 合を、２９３細胞を２４ウェルプレート上でＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂ用発現プラ スミドまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフェクトすることによっ て測定した。細胞を１％ＢＳＡおよび１０ｍＭグルコースを補充した氷冷ＰＢＳ で洗浄し、氷上で漸増濃度の放射能標識したコラーゲンとともに２時間インキュ ベートした。細胞を結合緩衝液で３回洗浄し、１００μｌの２００ｍＭ ＮａＯ Ｈ、１％ ＳＤＳを用いて溶解した。溶解物を２００ｍＭ ＨＣｌで中和し、ガ ンマシンチレーター(ＬＫＢ １２８２)中で計数した。各々の値は３回の測定の 平均である。 コラーゲンの脱グリコシル化 脱グリコシル化のために、マウスＩ型コラーゲンを用事調製した１０ｍＭ ｍ −過ヨウ素酸ナトリウムとともに２０分間室温で暗所でインキュベートした。過 剰の過ヨウ素酸を、２０ｍＭ 亜硫酸水素ナトリウムを添加することによって除 去した。コラーゲンを１０ｍＭ 酢酸に対して一晩透析した。 ＭＭＰ−１発現についてのアッセイ ＤＤＲ２の全長ｃＤＮＡを、ＨＴ １０８０細胞中で、レトロウイルス発現構 築 物（ｐＬＸＳＮ）を使用して安定に発現させた。ネオマイシン耐性コロニーをＤ ＤＲ２発現について試験した。親およびＤＤＲ２過剰発現細胞を無血清培地中で 培養し、１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンで種々の期間刺激した。馴化培地を２ ０倍濃縮し、ＭＭＰ−１の存在について、モノクローナル抗体４１−ＩＥ５（Ｏ ｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。 表面プラズモン共鳴 実験をＢＩＡｃｏｒｅ機器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて実施した。ポリオ ーマウイルスミドルＴ抗原中のＮＰＸＹ配列に対応するホスホペプチド(ＬＳＬ ＬＳＮＰＴｐＹＳＶＭＲＳＫ)をバイオセンサーチップの表面に吸収させた。可 溶性ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメイン融合タンパク質のミドルＴペプチドへの結 合を、ＤＤＲ１ｂのチロシン５１３（ＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡ）または ＮＧＦ受容体のチロシン４９０（ＨＩＩＥＮＰＱｐＹＦＳＤ）の周囲の配列に基 づく競合可溶性ホスホペプチドの存在下または非存在下で測定した。 ＣＤ分光分析 マウスＩ型コラーゲンのＣＤスペクトルをＡＶＩＶ ６０ＤＳ分光偏光計を用 いて記録した。温度を１℃／分の速度で上昇させながら、融解曲線を２２１ｎｍ においてモニターした。結果： ＤＤＲ１に対するリガンド活性はＭａｔｒｉｇｅｌ中に見出される ＤＤＲ１のリガンドの可能な供給源を同定するために、インビボスクリーニン グ系を確立した。ヒト胚腎臓線維芽細胞２９３を、ＤＤＲ１ｂをコードする発現 プラスミドを用いて一過性にトランスフェクトした。次いで、増殖停止細胞を種 々の因子で刺激し、受容体活性化にっいて全細胞溶解物の抗ホスホチロシンウエ スタンブロッティングによってモニターした。ＤＤＲ１ｂのチロシンリン酸化を 強力に誘導 する活性が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ( ＥＨＳ)マウス肉腫由来の基底膜タンパク質の市販調製物)中に見出された。ＤＤ Ｒ１ｂ自己リン酸化の増大は、細胞に添加したＭａｔｒｉｇｅｌの濃度に依存し た(図７Ａ)。最大の刺激は、組織培養培地１ｍｌ当り２５０μｌのＭａｔｒｉｇ ｅｌについて観察され、約２倍の受容体自己リン酸化の増大が、培養培地１ｍｌ 当り１０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌについて見られた。 Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞外マトリックスタンパク質の精製および特徴付け用 の供給源として繰り返し使用されている。それゆえ、単離されたマトリックスタ ンパク質であるフィブロネクチン、ラミニン、ＳＰＡＲＣ、パールカンおよびコ ラーゲンを、ＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化を刺激する能力について試験した。こ れらの中で、フィブロネクチンおよびラミニン（図７Ｃ、レーンＣおよびｄ）も 、ＳＰＡＲＣおよびパールカン(データは示さず)もＤＤＲ１ｂ自己リン酸化を誘 導できなかった。ＩＶ型コラーゲンを試験するために、このマトリックスタンパ ク質をＫｌｅｉｎｍａｎら（１９８２）の塩酸グアニジウム抽出プロトコルに従 ってＭａｔｒｉｇｅｌから単離し、インビボＤＤＲ１ｂ自己リン酸化アッセイに おいて用いた。この精製可溶性コラーゲンの調製物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌよりも 大きなＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の増大を誘導した（図７Ｃ、レーンｂおよび ｅ）。同様の結果が、酢酸での抽出およびペプシン消化に基づく代替法を使用し てＭａｔｒｉｇｅｌから精製したコラーゲンを使用して得られた(Ｔｉｍｐｌｅ ら，１９７９;図７Ｃ、レーンｆ)。さらに、市販のＩＶ型コラーゲン（ＥＨＳ腫 瘍またはヒト胎盤由来のいずれか）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌから精製したコラーゲ ンと同様の程度にＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化を誘導した（図７Ｃ、レーンｇお よびｈ）。 コラーゲンは両方のＤＤＲチロシンキナーゼ受容体のチロシンリン酸化を誘導す る正常組織からコラーゲンを得るために、Ｉ型コラーゲンを含有する鍵を成体マ ウスの尾から機械的に単離し、コラーゲンを５００ｍＭ酢酸での抽出によって可 溶化した。このコラーゲン調製物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌから単離したＩＶ型コラ ーゲンと同じＤＤＲ１チロシンリン酸化の実質的な活性化を示した（図８Ａ）。 このアッ セイにおいて、組織培養培地１ｍｌ当り１０μｇのコラーゲンの濃度を使用して 、精製コラーゲンは、ＤＤＲ１のａおよびｂ両方のアイソフォームに対して同様 のレベルのチロシンリン酸化を誘導した（図８Ａ）。可溶性精製マウス尾コラー ゲンを、ＲＴＫのジスコイジンドメインサブクラスの第２のメンバーであるＤＤ Ｒ２に対するｃＤＮＡを用いてトランスフェクトした２９３細胞を刺激するため にも使用した。コラーゲンは、ＤＤＲ１について観察されたものと同様のＤＤＲ ２のチロシンリン酸化の増大を誘導した（図８Ａ）。対照的に、インスリン受容 体またはＥＧＦ受容体用の発現ベクターを用いてトランスフェクトした２９３細 胞は、コラーゲンでの処理後に、受容体チロシンリン酸化の増大を示さなかった (図８、データは示さず)。 コラーゲンによるＤＤＲ１およびＤＤＲ２活性化の速度 受容体チロシンキナーゼは、通常、活性化中のリガンドによる刺激に際して迅 速に自己リン酸化される。例えば、ＥＧＦまたはインスリンの受容体の自己リン 酸化の増大は、数秒のうちに起こる。最大の活性化は、一般に刺激後数分間で達 成され、次いで、受容体は一般に種々の機構（受容体インターナリゼーションお よびタンパク質分解を包含する）を介してダウンレギュレートされる。しかし、 この規則の例外が存在する；例えば、Ｅｐｈファミリー受容体のそれらの細胞表 面リガンドによる活性化は、より延長された事象であり、最大の受容体リン酸化 に少なくとも１時間が必要とされる（Ｇａｌｅら，１９９６；Ｈｏｌｌａｎｄら ，１９９７）。コラーゲンによるＤＤＲ１およびＤＤＲ２活性化の速度を、トラ ンスフェクトした２９３細胞を使用して検討したところ、１０μｇ／ｍｌ（約３ ０ｎＭ）のマウスＩ型コラーゲンでの刺激の２分後には、自己リン酸化の有意な 増大は見出されなかった(図９ＡおよびＢ)。受容体活性化は幾分遅延され、刺激 後９０分〜２時間でピークになった。ＤＤＲ１およびＤＤＲ２両方のチロシンリ ン酸化は、可溶性コラーゲンの添加後１８時間まで持続した（図９ＡおよびＢ） 。ＤＤＲ１ａおよびＤＤＲ１ｂアイソフォームは、同一の活性化速度を示した。 内因性ＤＤＲチロシンキナーゼを発現する細胞に対するコラーゲンの効果を検 討ずるために、乳ガン細胞株Ｔ−４７Ｄを用いた。以前の結果によって、ＤＤＲ １が ヒトガン腫細胞株、特に乳ガン細胞株ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５および Ｔ−４７Ｄにおいて高度に発現されることが示されていた（１）（Ｐｅｒｅｚら ，１９９６）。図９Ｃに示すように、ＤＤＲ１ｂは、Ｔ−４７Ｄ細胞のコラーゲ ンとのインキュベーション後に、チロシンにおいて誘導的にリン酸化された。Ｔ −４７Ｄ細胞における内因性ＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の経時変化は２９３細 胞におけるよりもさらに緩慢であり、最大の活性化は１８時間の刺激後にのみ達 成された。 コラーゲンのＤＤＲ１ｂ自己キナーゼ活性に対する効果を分析するために、受 容体を、種々の期間の刺激後に、過剰発現する２９３またはＴ−４７Ｄ細胞から 免疫沈降させた。免疫沈降物をインビトロキナーゼ反応に供し、[³²Ｐ]リン酸の 受容体中への取り込みをオートラジオグラフィーによってモニターした。各々の 場合において、インビトロにおける受容体キナーゼ活性の程度は、インビボにお けるチロシンリン酸化の状態を反映した（図９ＥおよびＦ）。２９３細胞中で過 剰発現されたＤＤＲ１ｂは２時間の刺激後に最大のインビトロ自己キナーゼ活性 に達したが、Ｔ−４７Ｄ由来の内因性ＤＤＲ１ｂはコラーゲンとの一晩のインキ ュベーション後に最高活性を示した。 種々の型のコラーゲンによるディファレンシャルな活性化 ＤＤＲ１およびＤＤＲ２の活性化における異なる型のコラーゲンの役割をさら に検討するために、ヒト胎盤から精製されたＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶ型コラー ゲンおよびウシ気管軟骨由来のＩＩ型コラーゲンを入手した。受容体チロシンリ ン酸化を誘導する能力を試験するために、ＤＤＲ１またはＤＤＲ２を過剰発現す る２９３細胞を用いた。１０μｇ／ｍｌのコラーゲンでの９０分間の刺激後、Ｄ ＤＲ１は、試験した全ての型のコラーゲンについてチロシンリン酸化の増大を示 した（図１０Ａ）。対照的に、ＤＤＲ２はＩおよびＩＩＩ型コラーゲンによって のみ高度に活性化され、一方、ＩＩおよびＶ型コラーゲンは中程度の活性を示し た（図１０Ｃ）。驚くべきことに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＤＤＲ１に対するリガ ンド活性として最初に同定されたＩＶ型コラーゲンは、ＤＤＲ２チロシンリン酸 化を刺激することができなかった。種々の型のコラーゲンもまた、Ｔ−４７Ｄ細 胞中に存在する内因性Ｄ ＤＲ１ｂのチロシンリン酸化を刺激する能力について試験した。この目的のため に、ＤＤＲ１ｂを、刺激したＴ−４７Ｄ細胞の溶解物から免疫沈降させ、抗ホス ホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。図１０Ｅ に示すように、ＩおよびＶ型コラーゲンは、ＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の実質 的な増大を生じた。ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型コラーゲンにより誘導される活性 化のレベルはより低かったが、未刺激細胞に比較するとなお検出可能であった。 上記で示したように、ＤＤＲ１チロシンリン酸化は、細胞を１ｍＭオルトバナジ ン酸（チロシンホスファターゼのインヒビター）で処理することによっても活性 化することができた。さらに、熱変性コラーゲンを含有するゼラチンを、ＤＤＲ １ｂチロシンリン酸化を誘導する能力について試験した。１０μｇ／ｍｌの濃度 において、ゼラチンはＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の増大を誘導しなかった。こ のことは、コラーゲンの天然構造が細胞に基づくアッセイにおけるＤＤＲ１受容 体活性化に必須であることを示す（図１０Ｅ）。 ＤＤＲ１およびＤＤＲ２のチロシンリン酸化は固定化コラーゲンによって活性化 され得る 上記の実験は可溶性コラーゲンを用いたが、インビボにおいて遭遇するコラー ゲンは、一般に、細胞外マトリックスの一部として固定化されている。可溶化コ ラーゲンの原線維への自己組み立ては、溶媒の中和または蒸発によってインビト ロにおいて誘導することができる自発的過程である。この目的のために、組織培 養ディッデュをＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンでコートした。次いで、 ＤＤＲ１ｂまたはＤＤＲ２を過剰発現するトランスフェクトした２９３細胞をト リプシン／ＥＤＴＡで処理することなくＰＢＳ中に再懸濁し、コラーゲンコート したディッシュに９０分間添加した。受容体リン酸化の分析によって、ＤＤＲ１ ｂはプレートからの細胞の剥離に際して部分的にチロシンリン酸化されるが；し かし、受容体チロシンリン酸化は、Ｉ、ＩＩＩおよびＶ型コラーゲン上にプレー ティングした後にさらに増大することが示された（図１０Ｇ）。対照的に、ＤＤ Ｒ２過剰発現細胞の剥離後には最初の受容体リン酸化は見られなかった；ＤＤＲ ２チロシンリン酸化は細胞 をＩおよびＩＩＩ型コラーゲン上に、そしてより低い程度に、Ｖ型コラーゲン上 にプレーティングすることによって誘導された（図１０Ｈ）。可溶性ＩＶ型コラ ーゲンについても観察されたように、固定化ＩＶ型コラーゲンはこのアッセイに おいては不活性であった（図１０Ｃ）。 ＤＤＲ活性化のリガンド活性はペプシン耐性であるがコラゲナーゼ感受性である 上記のデータは、コラーゲンがＤＤＲ１およびＤＤＲ２のチロシンリン酸化を 刺激し得ることを示唆する。コラーゲンが実際にこれらの受容体の活性化を担う 分子であるかどうかを検討するために、コラーゲンファミリーのメンバーの特有 の構造的特性を利用した。コラーゲンの一次アミノ酸配列は、長さが変動するＧ ｌｙ−Ｘ−Ｙ反復の伸張を含む。第３の位置ごとのグリシン残基によって、３つ の同一のまたは高度に類似するポリペプチド鎖は互いに巻き付き、左手らせんを 形成することができる。残基ＸまたはＹはそれぞれ頻繁にプロリンまたは４−ヒ ドロキシプロリンであり、これは鎖の可撓性の制限および鎖間水素結合の形成に よって、三重らせんのさらなる安定化を可能にする。この特定の構造は、コラー ゲンを、例えば、ペプシン（コラーゲンの三重らせんにおいて見出されない大き な疎水性残基（フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、トリプトファン）の 後で切断する）によるプロテアーゼ切断に対して耐性にする。対照的に、Ｃｌｏ ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍから単離されたコラゲナーゼは、 Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ反復の第２または第３のグリシン残基ごとにその前で特異的に切 断する。 マウス尾またはヒト胎盤から単離したＩ型コラーゲンを、ペプシンまたはコラ ゲナーゼとともに３０分間３７℃でプレインキュベートした。プロテアーゼ処理 後、１つのアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマーシーブルーでの染色によ って分析し、第２のアリコートを使用してＤＤＲ２過剰発現２９３細胞を刺激し 、次いで、これをＤＤＲ２チロシンリン酸化について分析した。図１１Ａに示す ように、マウスおよびヒトＩ型コラゲナーゼは、コラゲナーゼによって有効に消 化されたが、ペプシンのタンパク質分解活性には耐性であた。対照的に、ウシ血 清アルブミンはコラゲナーゼによっては消化されなかったが、ペプシン処理によ り消化された。刺激 細胞の分析により、コラーゲンがＤＤＲ２チロシンリン酸化を誘導する能力はコ ラゲナーゼ処理によって消滅させられるが、ペプシン処理コラーゲンは刺激活性 を保持することが示された（図１１Ｂ）。この結果は、コラーゲン調製物がＤＤ Ｒ２を活性化する能力が、コラーゲンの完全性に依存することを示す。刺激活性 が特異的タンパク質分解酵素であるコラゲナーゼには感受性であるが、より一般 的なプロテアーゼであるペプシンには耐性であるという知見は、ＤＤＲチロシン リン酸化の誘導がコラーゲンに非共有結合している異なるタンパク質ではなくコ ラーゲン自体に起因するという観察を支持する。 コラーゲンの熱変性はＤＤＲチロシンリン酸化の刺激活性を阻害する 上記で略述したように、コラーゲンの三重らせん構造は水素結合によって安定 化されている。それゆえ、より高い温度において、コラーゲンのポリペプチド鎖 は融解し、最終的にランダムコイルに変性する。ＤＤＲ受容体に対するリガンド 活性がコラーゲンに固有であるという可能性を追求するために、マウスＩ型コラ ーゲンを熱変性に供し、２２１ｎｍの波長における円二色性スペクトルを記録し た。吸収は４０℃において急激に低下し（図１１Ｄ、四角）、熱処理はコラーゲ ンの不可逆的変性を生じた（図１１Ｄ、菱形）。熱融解転移中点（thermal melt ing transition midpoint）は４１℃であると算出された。コラーゲン調製物が ＤＤＲ２チロシンリン酸化を刺激する能力に対する熱変性の効果を試験するため に、Ｉ型コラーゲンのアリコートを２７℃と４５℃との間の種々の温度で３０分 間インキュベートし、次いで、これらの試料を２９３細胞において過剰発現され ているＤＤＲ２とともにインキュベートした。図１１Ｅに示すように、コラーゲ ン調製物のリガンド活性は、３９℃での熱処理後に顕著に低下し、４２℃より上 の温度でほぼ完全に消滅した。これらのデータは、ＤＤＲ２キナーゼ活性を刺激 するコラーゲン調製物の活性が、コラーゲンの三量体構造がコイルドコイルの融 解により変性されるのと同じ温度範囲にわたって低下することを示す。それゆえ 、コラーゲンの三重らせん立体構造は、このアッセイにおけるＤＤＲ受容体の完 全な活性化に必須である。 ＤＤＲとコラーゲンとの間の相互作用は直接的である コラーゲンがＤＤＲチロシンリン酸化を刺激する能力は、コラーゲンと受容体 の細胞外ドメインとの直接的会合によるか、または、例えば細胞表面分子の集合 に対する、コラーゲンの間接的効果を表している可能性がある。コラーゲンがＤ ＤＲ受容体と直接的かつ特異的に会合し得るかどうかを調査するために、アガロ ースビーズに共有結合したコラーゲンを、インビトロ混合実験において用いた。 ＤＤＲ１、ＤＤＲ２またはインスリン受容体を過剰発現している２９３細胞由来 の細胞溶解物の等量を、コラーゲン−アガロースとともに、可溶性Ｉ型コラーゲ ンの非存在下または存在下でインキュベートした。図１２Ａに示すように、コラ ーゲン−アガロースはＤＤＲ１およびＤＤＲ２には結合したが、インスリン受容 体には結合しなかった。固定化コラーゲンのＤＤＲ１またはＤＤＲ２とのこの相 互作用は、過剰の可溶性コラーゲンによって競合された。 コラーゲンがＤＤＲ受容体と直接的に相互作用するという見解と一致して、コ ラーゲンがＤＤＲチロシンリン酸化を誘導する能力は、受容体キナーゼ活性を破 壊するＤＤＲ受容体ｃＤＮＡにおけるリジンからアラニンへの点変異によって消 滅させられることが示されたが、細胞のシクロヘキシミドでの処理によっては阻 害されなかった（データは示さず）。これらの結果は、コラーゲンが直接的にＤ ＤＲ自己リン酸化を誘導し、異なるＤＤＲリガンドの誘導を介して作用するので はないことを示唆する。 ＤＤＲ１およびＤＤＲ２の発現はコラーゲンの細胞表面結合部位を増加させる ＤＤＲチロシンキナーゼの発現がコラーゲンの細胞表面受容体の量を増加させ るかどうかを検討するために、マウスＩ型コラーゲンをヨウ素化し、種々の濃度 で、ＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂまたはコントロールプラスミドを用いてトランスフ ェクトしておいた２９３細胞とともにインキュベートした。図１２Ｂに示すよう に、コラーゲンは、コントロール細胞よりもＤＤＲ１をトランスフェクトした細 胞に約３倍多く結合した。¹²⁵ＩコラーゲンのＤＤＲ１への結合はほぼ完全に１ ００倍過剰のコールドリガンドで競合された（データは示さず）。 ＤＤＲ２とコラーゲンとの間の相互作用はコラーゲンの炭水化物部分に感受性で ある 複数の研究によって、コラーゲンは、最初の合成の後に、ＮおよびＯ結合炭水 化物を介して高度にグリコシル化されることが示されている（総説については、 Ｋｉ かのリジンはヒドロキシリジンに酸化され、その後ガラクトースおよびグルコー スに結合される。マウス尾コラーゲンの単糖組成を、発蛍光団補助炭水化物電気 泳動（fluorophore-assited carbohydrate electrophoresis）技術（Ｈｉｇｇｉ ｎｓおよびＦｒｉｅｄｍａｎ，１９９５）を使用して分析し、このコラーゲン調 製物が多量のグルコースおよびガラクトース、少量のフコースおよびマンノース を含有するが、シアル酸、Ｎ−アセチル−グルコサミンまたはＮ−アセチル−ガ ラクトサミンを含有しないことが見出された（データは示さず）。それゆえ、コ ラーゲンをｍ−過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、複合糖質を部分的に除去した 。Ｉ型コラーゲンの過ヨウ素酸処理は、ポリペプチド骨格の加水分解を誘導せず 、コラーゲンの三重らせんを変性させもしなかった（データは示さず）。対照的 に、コラーゲンが２９３過剰生産細胞においてＤＤＲ２を刺激する能力は、脱グ リコシル化後に有意に低下された（図６Ｃ）。それゆえ、コラーゲンのＮまたは Ｏ結合糖質画分（またはその両方）がＤＤＲ２活性化に重要であり得る。しばし ばＤＤＲ受容体活性化を生じない市販のコラーゲン調製物に遭遇した。これは、 天然コンホメーションの損失またはグリコシル化のような修飾の不全によって説 明され得る。 コラーゲン刺激後にＳｈｃ ＰＴＢドメインはＤＤＲ１ｂに結合する コラーゲンはＤＤＲ１チロシンリン酸化を誘導するので、そのような受容体自 己リン酸化が、ＳＨ２またはＰＴＢドメインのようなホスホチロシン認識モジュ ールの結合部位を作り出す可能性がある。これに関して、ＤＤＲ１ｂの膜近傍イ ンサートがモチーフＬＳＮＰＡＹ（チロシン５１３を含む）を含み、これがＳｈ ｃ ＰＴＢドメインのコンヤンサス結合モチーフに対応することは興味深い。Ｓ ｈｃ ＰＴ Ｂドメインは、高親和性で、配列ΨＸＮＰＸｐＹ（式中、Ψは疎水性残基である ）を有するホスホチロシン含有ペプチドに結合する（２３）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｒら，１９９６）。Ｓｈｃが自己リン酸化ＤＤＲ１ｂと相互作用する可能 性を試験した。実際、ＤＤＲ１ｂは、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインを含むＧＳＴ融合 タンパク質に、コラーゲン刺激後に結合した（図１３Ａ）。Ｓｈｃ ＰＴＢドメ インは、ＤＤＲ１ｂにおいて見出されるＸＮＰＸＹモチーフを欠くＤＤＲ１のａ アイソフォームにもＤＤＲ２にも結合しなかった。このことは、ＤＤＲ１のコラ ーゲン刺激が、受容体自己リン酸化およびその結果としてのモジュール下流シグ ナリング分子のドッキング部位の形成を誘導することを示す。 ＤＤＲ１ｂとＳｈｃとの間の相互作用をより正確に定量するために、表面プラ ズモン共鳴技術を使用した。この表面プラズモン共鳴技術において、ＤＤＲ１ｂ の膜近傍領域(残基５０３〜５１８)由来の可溶性ホスホペプチドを、ＧＳＴ−Ｓ ｈｃＰＴＢ融合タンパク質の、バイオセンサーチップ上に固定化したポリオーマ ウイルスミドルＴ抗原ホスホペプチドへの結合を阻害するために用いた。図１３ Ｂに示すように、約８００ｎＭの濃度のＤＤＲ１ｂホスホペプチド（チロシン５ １３周辺の配列を含む）は、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインのミドルＴ抗原ホスホペプ チドへの結合を５０％阻害した（ＩＣ₅₀）。これらの知見は、ＮＧＦ受容体のＮ ＰＸＹモチーフ周辺のホスホペプチドを比較実験において使用した場合に見出さ れた７０ｎＭのＩＣ₅₀値とは対照的であるが（図１３Ｂ）、ミドルＴ抗原ホスホ ペプチド自体のＩＣ₅₀には類似している。 ＤＤＲ２の活性化はマトリックスメタロプロテイナーゼ−１の発現を誘導する 細胞外マトリックスの分解およびリモデリングは、大部分、マトリックスメタ ロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の活性によって制御されている。ＤＤＲシグナリン グがＭＭＰの発現に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ＤＤＲ２を、ヒト 線維肉腫細胞株ＨＴ １０８０（ＤＤＲ受容体の検出可能な発現を示さない）に おいて安定に発現させた。親およびＤＤＲ２過剰発現ＨＴ １０８０細胞を、種 々の期間、１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンで刺激した。細胞によって分泌され るマトリック スメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）の量を、馴化培地のウエスタンブロ ット分析によって測定した。図１４に示すように、ＭＭＰ−１の発現は、４日間 のコラーゲンでの刺激後に、ＤＤＲ２を過剰発現するＨＴ １０８０細胞におい てアップレギュレートされた。対照的に、ＭＭＰ−１は、親ＨＴ １０８０にお いてはコラーゲンに応答して誘導されなかった。ＭＭＰ−１発現は、親細胞およ びＤＤＲ２過剰発現細胞の両方において、ＭＭＰ発現のアクチベータであるホル ボール１２−ミリステート１３アセテート（ＴＰＡ）での処理後に誘導された。 これらのデータは、ＤＤＲ受容体活性化が、コラーゲン溶解活性の分泌を生じ、 これが最終的に細胞外マトリックスの分解を導くことを示唆する。 考察 ジスコイジンドメイン受容体のコラーゲン活性化 受容体チロシンキナーゼのＤＤＲサブファミリーのリガンドについての検索に よって、予想外に、脊椎動物において最も豊富なタンパク質の１つであるコラー ゲンが両方のＤＤＲ受容体に結合し、これを活性化できることが判明した。分析 によって、過剰発現されたＤＤＲ１の活性化は試験した５つ全てのコラーゲンに よって誘導されるが、ＤＤＲ２はＩおよびＩＩＩ型コラーゲンによって、そして より低い程度にＩＩおよびＶ型コラーゲンによってのみ活性化されることが示さ れた。ヒト乳ガン細胞株において、内因性ＤＤＲ１はＩおよびＶ型コラーゲンに よって強力に、そしてより低い程度にＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型によって誘導さ れる。それゆえ、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２のコラーゲン分子との相互作用には、 いくらかの特異性が存在する。 Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＸＩ型コラーゲンは、１０００アミノ酸より長く 広がる中断されないＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復を有し、完全な三重らせん構造を形成す る。個々のらせんは重合し、それによって高い引張り強度を有する線維を生成す る。対照的に、ＩＶ型コラーゲンは、約２０個の短い三重らせんの中断によって 特徴付けられる。これは、より高い可撓性を提供し、網状構造の形成を可能にす る（ＰｒｏｃｋｏｐおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ，１９９５）。ＩＶ型コラーゲン は、種々の 組織および器官を取り囲む基底膜の主成分である。 ３種の証拠によって、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２の結合エピトープがＧｌｙ−Ｘ −Ｙ反復領域中に存在し、三重らせんコンホメーションが受容体活性化および自 己リン酸化に必須であるという結論が支持される。第１に、コラーゲンをＮおよ びＣ末端の非らせん領域においてのみ切断するプロテアーゼであるペプシンでの コラーゲンの処理は、リガンド活性に影響を及ぼさなかった。対照的に、コラー ゲンをＧｌｙ−Ｘ−Ｙ反復領域において特異的に消化する細菌コラゲナーゼは受 容体活性化を消滅させた。第２に、コラーゲン調製物がＤＤＲ受容体を活性化す る能力は熱変性に感受性であった。コラーゲンの三重らせんは主に非共有結合に よって維持されており、これによって熱変性に感受性になっている。種々の型の コラーゲンは、三重らせん折りたたみが不可逆的に破壊される温度である３７℃ と４２℃との間の範囲で変性される（Ｎｉｙｉｂｉｚｉら，１９８４）。コラー ゲン調製物のＤＤＲ刺激活性は、コラーゲンの熱融解転移中点において顕著に低 下され、ゼラチンは、インビトロ結合活性も、インビボにおいてチロシンリン酸 化を誘導する能力も有しない。第３に、変性コラーゲンはＤＤＲ受容体を活性化 することができないが、７Ｍ尿素中で変性され、その後生理学的溶媒中への透析 によって再生されたＩ型コラーゲンは、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２のチロシンリン 酸化を誘導する能力を回復した(データは示さず)。コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂお よびＣ、デコリンならびにヘパリンのようないくつかのコラーゲン会合分子を試 験したが、ＤＤＲ活性に対する効果は見出されなかった。上記で論じた結果は、 コラーゲン自体、または非常に強固に結合した分子が、ＤＤＲ受容体の刺激リガ ンドとして作用することを示す。 ジスコイジンモチーフを有するタンパク質の生物学的機能 ＤＤＲ１およびＤＤＲ２のジスコイジンドメインは、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉ ｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのジスコイジンタンパク質に対する高い相同性(約 ７５％)を有する。変形菌類において、ジスコイジンはスラッグ（slug）および 子実体の形成の間に発現および分泌され、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンおよび ガラクトースに結合することによってレクチンとして機能する（Ｒｏｓｅｎら， １９７３）。 ジスコイジン−１欠損Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍにおいて、細胞は基層に付着 しその上を移動する能力を失い、秩序正しい細胞凝集を欠損する（Ｓｐｒｌｎｇ ｅｒら，１９８４）。コラーゲンによるＤＤＲ受容体の活性化は、明らかにコラ ーゲンの三重らせんペプチド骨格を必要とするが、これにはＮまたはＯ結合炭水 化物部分もまた関与し得る。なぜなら、コラーゲンの過ヨウ素酸での処理は、部 分的な脱グリコシル化およびリガンド活性の顕著な低下の両方を生じたからであ る。炭水化物に結合する能力が哺乳動物ＤＤＲのジスコイジンドメインにおいて 保存されていれば、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２がコラーゲンに結合している単糖ま たはオリゴ糖を認識する可能性がある。さらなる特異性および高親和性は、グリ コシル化部位の付近のペプチド骨格の三重らせんコンホメーションによって提供 され得、これはまた、結合したＤＤＲチロシンキナーゼのオリゴマー化およびそ の結果としてのリン酸基転移を可能にし得る。しかし、ＤＤＲ２とは対照的に、 過ヨウ素酸処理は、ＤＤＲ１を活性化するコラーゲンの能力に影響を及ぼさなか った（データは示さず）。 シグナリング分子としてのコラーゲン ＤＤＲ受容体がコラーゲンほど豊富なタンパク質に結合するという観察は、マ トリックス成分に対する細胞表面シグナリング受容体に根本的な、すなわちいか にして細胞質シグナリングが調節されるかという難問を提起する。コラーゲンに よるＤＤＲキナーゼの活性化は、従来の増殖因子受容体に比較して非常に遅延し た経時変化に従い、これはＤＤＲ受容体が、急性シグナリング応答を媒介するの ではなく細胞外マトリックスに対する細胞の関係をモニターするという可能性に 一致する。しかし、マウス胚または成体脳から単離されたＤＤＲ１受容体はほと んどホスホチロシンを含まないので（Ｐｅｒｅｚら，１９９６）、ＤＤＲ１活性 化を制御する調節機構が存在するに違いない。ＤＤＲ１ ＲＮＡ発現は基底膜近 傍の肺、腎臓および結腸の外上皮層において検出されているが（１）、ＤＤＲ受 容体の細胞表面の特異的小領域への局在化が調節されている可能性がある。さら に、ＤＤＲ１のシグナリング活性は、潜在的に、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインの膜近 傍結合部位の含有または排除によって制御されている可能性がある。これに関し て、ＤＤＲ１が、その下流 標的のドッキング部位がオルタナティブスプライシングによって直接的に制御さ れているＲＴＫの最初の例であることは興味深い。 Ｓｈｃは見かけ上α１β１インテグリン複合体に補充され、このインテグリン のエンゲージメント（engagement）に際して細胞の生存および増殖における役割 を果たし得る（Ｗａｒｙら，１９９６）。Ｓｈｃ ＰＴＢドメインはＤＤＲ１ｂ アイソフォーム中のリン酸化チロシン５１３に結合されるので、刺激されたＤＤ Ｒ１および活性化されたインテグリン受容体が同じシグナリング経路に集中して いる可能性がある。しかし、ＭＡＰキナーゼ経路の誘導は示されておらず、この ことはＳｈｃがＤＤＲ１シグナリングにおける別の機能を果たしていることを示 唆する。これに関して、Ｓｈｃ ＳＨ２ドメインが、膜貫通細胞−細胞接着受容 体であるカドヘリンのリン酸化テイルに結合することは興味深く（Ｘｕら，１９ ９７）、このことは、Ｓｈｃが異なる接着分子をそのＰＴＢおよびＳＨ２ドメイ ンを介して架橋する可能性を提起する。Ｓｈｃはまた、ＭＡＰキナーゼ経路以外 の細胞質シグナリング経路に連結されているかもしれない。 胚形成において、異なる型のコラーゲンの適切な発現は、骨および軟骨の適正 な形成を誘導する（ＭｕｎｄｌｏｓおよびＯｌｓｅｎ，１９９７）。コラーゲン の異常発現または一次コラーゲン配列中の点変異のいずれかによって引き起こさ れる多数のヒト遺伝病は、骨格奇形または遺伝性骨粗髭症を生じる（Ｐｒｏｃｋ ｏｐおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ，１９９５）。胚形成におけるＤＤＲ受容体の初 期の発現は、ＤＤＲ受容体が軟骨および骨形成のパターン形成(patterning)にお ける役割を果たし得ることを示す。 コラーゲンとの相互作用は、細胞の形状および移動(例えば、発生の間の上皮 シートの移動および連結)の制御にも潜在的に重要である。最近の研究によって 、種々のヒト原発腫瘍におけるＤＤＲ１およびＤＤＲ２の顕著に高いレベルが示 されている（１）。特に、乳房、卵巣および肺上皮細胞起源の迅速に成長する腫 瘍は、ＤＤＲ１の上昇した発現を有する。これらの腫瘍は、腫瘍細胞転移を導く 隣接する組織および器官中への侵入性成長によって特徴付けられる。マトリック ス障害の破壊および腫瘍からの細胞の移動を誘導するために必要な最初の刺激は 大部分未知である （Ａｌｖｅｓら，１９９５ｂ）。コラーゲンおよびエラスチンを特異的に分解す る酵素であるマトリックスメタロプロテイナーゼの上昇した発現が種々の固形腫 瘍において見出されており、それゆえ、このクラスの酵素は腫瘍の成長および転 移に関連付けられている（Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，１９９６） 。例えば、上昇したレベルのＭＭＰ−１は、結腸直腸ガンの低い予後に関連する ことが見出された（Ｍｕｒｒａｙら，１９９６）。ＤＤＲ１およびＤＤＲ２はコ ラーゲンによって誘導されるので、そして活性化ＤＤＲ２はＭＭＰ−１発現を促 進するので、これら２つの受容体は、腫瘍細胞の活性化およびその後のメタロプ ロテイナーゼによるマトリックスの分解における役割を有し得る。１つのモデル は、ＤＤＲ受容体を、腫瘍細胞の表面上の、細胞外マトリックスの主成分として のコラーゲンのセンサーとする。リガンド結合および受容体活性化の後、ＤＤＲ シグナルはＭＭＰ−１の発現および分泌を誘導し、これは次いで腫瘍を取り囲む コラーゲン分子を分解し、腫瘍細胞の移動および転移を可能にする。ケラチノサ イトのような正常細胞において、ＭＭＰ−１発現は、Ｉ型コラーゲン刺激後に高 度に上昇され、このことは、ＤＤＲ受容体活性が創傷治癒に関与する可能性を提 起する(Ｓｕｄｂｅｃｋら，１９９４；１９９７)。 変形菌類は、２つの異なる細胞型（胞子および柄細胞）を発達する多細胞構造 に誘導的に凝集し得る単細胞アメーバの形態で存在するので、後生動物の分化の 単純なモデルである。最近の証拠によって、ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍのＳｔ ａｔタンパク質のチロシンリン酸化が関与するＳＨ２ドメインシグナリング経路 が、モルフォゲンＤＩＦに応答してこれら２つの細胞型の分化の媒介において重 要な役割を果たしていることが示されている（Ｋａｗａｔａら，19９７）。ここ で、データは、最初は変形菌類のレクチンであるジスコイジンにおいて同定され 、分化中の細胞の凝集に重要であることが知られている細胞外ドメインが、脊椎 動物においてコラーゲンにより活性化されるチロシンキナーゼシグナリングに関 連し、正常哺乳動物細胞の秩序正しい移動および腫瘍細胞の無秩序の移動におい て潜在的に重要であることを確立する。 実施例４ Ｋ６１８Ａ変異を有するＤＤＲ１ａはもはやコラーゲンによって活性化されない 図１５Ａおよび１５Ｂに示す実験は、ＤＤＲ１ａのチロシンリン酸化が、明ら かに、インタクトな触媒ドメインに依存することを示す。コラーゲンによるＤＤ Ｒ１ａの活性化は、触媒ドメイン中の不活化（ドミナントネガティブ）変異によ って消滅させられる。他のキナーゼは、コラーゲンに応答してのＤＤＲ１ａのイ ンビボチロシンリン酸化に関与していないようである。 α１またはβ１インテグリンに対するブロッキング抗体はＤＤＲ１の活性化を阻 害しない α１β１およびα２β１型のインテグリンは、コラーゲンの受容体であること が長く知られていた。それゆえ、これらのインテグリンがＤＤＲ１ｂの活性化に 何らかの形で関与しているかどうかを決定するために試験を実施した。ＤＤＲ１ のｂアイソフォームを内因性に発現する乳ガン細胞株Ｔ−４７Ｄを使用した。イ ンテグリンの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体はコラーゲンへの結合 、およびそれゆえインテグリンのシグナリングをブロックすることができる。Ｔ −４７Ｄ細胞をα２インテグリンに対する抗体Ａ２−ＩＩＥ１０およびβ１イン テグリンに対する抗体ＤＥ９（両方ともＵｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙから）で、１０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンの非存在下または存在下で一 晩処理した。ＤＤＲ１ｂまたはＳｈｃを細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホ チロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。図１６に示 す実験は、インテグリンの活性化がＤＤＲ１ｂの活性化に必要ではないことを示 す。インテグリン受容体がブロックされたＴ−４７Ｄ細胞におけるコラーゲンで の刺激後のＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の程度は、未処理細胞と同じである。 ＤＤＲ１ｂのＳｈｃへの結合もまたインテグリンのシグナリングのブロッキング 後に変化されない ＤＤＲ１はインテグリンβ１欠損細胞においてコラーゲンによって活性化され る。 インテグリンβ１ノックアウトマウス由来の細胞株ＧＤ２５（Ｒ．Ｆａｓｓｌｅ ｒ博士，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるＤＤＲ１ｂのシグ ナリングを試験した。これらの細胞中には、機能的な、コラーゲンに対するイン テグリン受容体は存在しない。ＤＤＲ１ｂをコードするｃＤＮＡを、ＧＤ２５細 胞に、レトロウイルス移入プロトコルを使用してトランスフェクトした。ＤＤＲ １ｂ過剰発現細胞および親細胞を、Ｉ型コラーゲンで一晩刺激した。ＤＤＲ１ｂ を細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロ ッティングによって分析した(図１７Ａ)。ブロットを、ＤＤＲ１に対する抗体を 用いて再プローブした（図１７Ｂ）。遺伝子改変した細胞株を使用して、図１７ Ａおよび１７Ｂに示す実験は、ＤＤＲ１ｂが２つのインテグリン型コラーゲン受 容体の非存在下でシグナリングできることを示す。 インテグリンβ１欠損細胞におけるＤＤＲ１ｂの緩慢な活性化 ＤＤＲ１ｂ過剰発現ＧＤ２５細胞の生成は図１７Ａおよび１７Ｂに記載する。 この細胞をＩ型コラーゲンで種々の期間刺激した。免疫沈降されたＤＤＲ１ｂを 抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロットによって分析した。図１８に 示す結果は、インテグリンβ１欠損細胞におけるＤＤＲ１ｂ活性化が正常細胞に おけるように緩慢であることを示し、このことは、ＤＤＲ１ｂの延長された活性 化がインテグリンの作用によらないことを示す。 ＤＤＲ１およびＤＤＲ２受容体の活性化はＥＧＦ媒介性ＭＡＰＫ活性化に影響を 及ぼさない ＤＤＲ２を過剰発現するＴ−４７ＤまたはＨＴ １０８０細胞を、ＰＤＧＦま たはＥＧＦで５分間、Ｉ型コラーゲンで一晩、およびＥＧＦ／コラーゲンまたは ＰＤＧＦ／コラーゲンの組み合わせで刺激した。細胞溶解物のアリコートをＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し、ＭＡＰＫに対する抗体を用いてプローブした（図１ ９Ａ（Ｔ−４７Ｄ）および図１９Ｂ（ＨＴ １０８０−ＤＤＲ２））。活性化さ れたＭＡＰＫは、活性化されていないＭＡＰＫよりもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でより 遅い移動を示 す。ＭＡＰＫはＥＧＦまたはＥＧＦ／コラーゲン処理によって活性化されたが、 ＰＤＧＦ、コラーゲンまたはＰＤＧＦ／コラーゲン処理では活性化されなかった 。Ｔ４７Ｄ細胞由来の残りの溶解物を使用して、ＤＤＲ１ｂを免疫沈降させた。 抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングは、ＤＤＲ１ｂがコラ ーゲンによって活性化され、ＥＧＦまたはＰＤＧＦによっては活性化されなこと を示す（図１９Ｃ）。コラーゲンのＥＧＦとの組み合わせは、ＭＡＰＫの活性化 またはＤＤＲ１ｂのチロシンリン酸化の程度を低下させない。図１９Ａ〜１９Ｃ に示す実験は、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２の活性化がＭＡＰＫ経路の活性化を生じ ないことを示す。さらに、ＥＧＦによるＭＡＰＫの活性化は、ＤＤＲ受容体の同 時活性化によって影響されない。 本発明を、現時点で好ましいと考えられる実施例に関して説明したが、本発明 は、開示する実施例によって限定されるものではないことを理解するべきである 。反対に、本発明は、添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改 変および等価な変更を包含することが意図される。 全ての刊行物、特許および特許出願を、各々の刊行物、特許および特許出願が 、特定して個々に、その全体を本明細書に出典明示で援用することが示されると 同程度に、その全体を本明細書に出典明示で援用する。 図面の詳細な説明 図１Ａ〜１Ｅ。ＭＣＫ１０ｂ(ＤＤＲ１ｂ)はＳｈｃと共免疫沈降され、Ｓｈｃ ＰＴＢドメインと会合する。図１Ａ〜１Ｃ、ヒト胚肝臓線維芽細胞２９３を、 ＭＣＫ１０ａまたはＭＣＫ１０ｂをコードする発現プラスミドを用いてトランス フェクトした。１ｍＭオルトバナジン酸で９０分間刺激した後、Ｓｈｃを細胞溶 解物から免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、イムノブロットをホスホチロシ ンに対する抗体を用いてプローブした（図１Ａ）。次いで、ブロットを剥離し、 ＭＣＫ１０に対する抗体で（図１Ｂ）、その後Ｓｈｃに対する抗体で（図１Ｃ） 再プローブした。ＭＣＫ１０ｂおよびＳｈｃの３つのアイソフォーム、ｐ６６、 ｐ５２およびｐ４６の移動を示す。図１Ｄ、図１Ａにおいて使用した全細胞溶解 物のアリコートを抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによ って分析した。ＭＣＫ１０ａおよびＭＣＫ１０ｂの前駆体（ｐｒｅｃ.）および ｂサブユニット（ｂ−ｓｕｂ.）の移動を示す。図１Ｅ、Ｓｈｃ ＳＨ２ドメイ ンまたはＳｈｃ ＰＴＢドメインを含むＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンア ガロースに結合させ、ＭＣＫ１０ａまたはＭＣＫ１０ｂでトランスフェクトし、 オルトバナジン酸で刺激しておいた２９３細胞由来の溶解物とともにインキュベ ートした。結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセル ロースに移し、ＭＣＫ１０に対する抗体を用いてプローブした。分子量標準品を 右に示す。 図２Ａおよび２Ｂ。ＭＣＫ１０ｂ（ＤＤＲ１ｂ）膜近傍インサート中のＴｙｒ ５１３のリン酸化はＳｈｃ ＰＴＢ結合部位を形成する。図２Ａ、グルタチオ ンビーズに結合したＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメイン融合タンパク質を、ＭＣＫ １０ｂ過剰発現２９３細胞由来の溶解物とともに、漸増濃度の競合ペプチドＡＬ ＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡ（ＭＣＫ１０ｂのチロシン５１３周辺の配列に対応 する）の非存在下または存在下でインキュベートした。結合したタンパク質をＭ ＣＫ１０に対する抗体を用いるイムノブロッティングによって検出した。図２Ｂ 、精製ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメインのミドルＴ抗原ホスホペプチドへの結合 の、漸増量の、それぞれ、ＭＣＫ１０ｂホスホペプチド（ＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹ ＲＬＬＬＡ、白丸）またはＮＧＦ受容体ホスホペプチド（ＨＩＩＥＮＰＱｐＹＦ ＳＤ、黒丸）の存在下で の表面プラズモン共鳴による分析。チップ表面に結合したＳｈｃ ＰＴＢドメイ ンの百分率を、競合ペプチドの濃度に対してプロットする。 図３Ａ〜３Ｆ。ＭＣＫ１０ｂ（ＤＤＲ１ｂ）はＭＣＫ１０ａ（ＤＤＲ１ａ）に は存在しない主要な自己リン酸化部位を含む。図３Ａおよび３Ｂ、２９３細胞を ＭＣＫ１０のａまたはｂアイソフォームをコードするプラスミドを用いてトラン スフェクトし、[３２Ｐ]オルトリン酸を用いてインビボ標識した。１ｍＭオルト バナジン酸で９０分間刺激した後、ＭＣＫ１０を免疫沈降させ、トリプシンで消 化した。ａアイソフォーム（図３Ａ）およびｂアイソフォーム（図３Ｂ）の二次 元トリプシンホスホペプチドマップを示す。図３Ｄ〜３Ｆ，ＭＣＫ１０ａまたは ＭＣＫ１０ｂをトランスフェクトした細胞から免疫沈降させ、インビトロキナー ゼアッセイに供した。ａアイソフォーム（図３Ｄ）およびｂアイソフォーム（図 ３Ｅ）の標識タンパク質を、トリプシンマッピングによって分析した。等ｃｐｍ のＭＣＫ１０ａおよびＭＣＫ１０ｂホスホペプチドを合し、図３Ｆにおいて分析 した。オリジンをｘで示す。図３Ｃ、図３Ｂおよび図３Ｆにおけるホスホペプチ ドの図解。 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ − ２９３細胞におけるＤＤＲ１ａ、ＤＤＲ１ｂ、 ＤＤＲ２およびｔｒｋＡの一過性発現。ブロット 全細胞溶解物：αＰＹ。最終 濃度１０μｇ／ｍｌでコラーゲンを使用。 図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ − 全細胞溶解物のα−ｐＹブロット：Ｉ型コラー ゲン[Ｃ−７６６１ ＣＢＰ:Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ ｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ]およびＩＶ型コラーゲン[Ｃ−０５４３]での濃度依存的 刺激。 図６ − ヒト乳ガン細胞Ｔ４７ＤにおけるＤＤＲ１ｂのチロシンリン酸化。 ＤＤＲ１ｂのオルタナティブエキソン特異的抗体での免疫沈降、ブロット ＰＹ 。刺激 Ｉ型コラーゲン[Ｃ−７６６１]、ＩＶ型コラーゲン[Ｃ−０５４３]３０ 分間および１ｍＭオルトバナジン酸９０分間。 図７Ａ〜Ｄ。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＤＤＲ１に対するリガンド活性としてのＩ Ｖ型コラーゲンの同定。ヒト腎臓線維芽細胞２９３をＤＤＲ１ｂ発原プラスミド を用いてトランスフェクトした。Ｍａｔｒｉｇｅｌを組織培養培地に表示する濃 度で９０分間添加した。（図７Ａ）細胞を溶解し、１０μｇの全細胞タンパク質 をＳＤＳ −ＰＡＧＥおよび抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティウングに よって分析した。（図７Ｂ）ブロットを剥離し、ＤＤＲ１に対して惹起された抗 体で再プローブした。(図７Ｃ)ＤＤＲ１ｂ過剰発現２９３細胞を以下の試薬で処 理した；４００μＭ酢酸（ａ）、５０μｌ／ｍｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ｂ）、１ ０μｇ／ｍｌ ＩＶ型ラミニン（ｃ）、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン（ｄ） 、塩酸グアニジウムでの抽出によって（ｅ）または酢酸およびペプシンでの抽出 によって（ｆ）Ｍａｔｒｉｇｅｌから部分精製したＩＶ型コラーゲン、１０μｇ ／ｍｌマウスＩＶ型コラーゲン、Ｓｉｇｍａ Ｃ−０５４３（ｇ）、１０μｇ／ ｍｌヒトエＶ型コラーゲン、Ｓｉｇｍａ Ｃ−５５３３（ｈ）。等量の全細胞溶 解物を抗ホスホチロシンまたは（図７Ｄ）抗ＤＤＲ１抗体を用いてプローブした 。 図８Ａおよび８Ｂ。マウスＩ型コラーゲンはＤＤＲ１およびＤＤＲ２を特異的 に活性化する。２９３細胞をヒトインスリン受容体（Ｉｎｓ−Ｒ）、ＤＤＲ１ａ 、ＤＤＲ１ｂまたはＤＤＲ２をコードするプラスミドを用いてトランスフェクト した。細胞を１０μｇ／ｍｌマウスＩ型コラーゲン、１００ｎＭインスリンで刺 激するかまたは未刺激のままにした。（図８Ａ）細胞溶解物のアリコートをＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥおよび抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロットによって 分析した。(図８Ｂ)ブロットをＤＤＲ１、ＤＤＲ２およびインスリン受容体に対 する抗体の混合物で再プローブした。 図９Ａ〜９Ｆ。コラーゲンに応答してのＤＤＲの遅延した活性化。ＤＤＲ１ｂ およびＤＤＲ２を２９３細胞にトランスフェクトし、１０ｇ／ｍｌのマウスＩ型 コラーゲンで異なる期間刺激した。（図９Ａおよび図９Ｂ）全細胞溶解物を抗ホ スホチロシン抗体を用いてプローブした。最大の活性化はＤＤＲ１ｂ（図９Ａ） およびＤＤＲ２（図９Ｂ）の刺激後９０分で見られる。（図９Ｃ）ヒト乳ガンＴ −４７Ｄ細胞を１０ｃｍディッシュで集密まで培養し、０．５％血清中で一晩枯 渇させた。細胞をＩ型コラーゲンで種々の期間刺激し、溶解した。ＤＤＲ１ｂを 溶解物から免疫沈降物させ、抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッテ ィングによって分析した。ＤＤＲ１ｂの最大のリン酸化は１８時間の刺激後見ら れる。１１５ｋＤａの見かけの分子量を有する未同定のチロシンリン酸化タンパ ク質が免疫沈降物 中に同時精製されている。（図９Ｄ）ＤＤＲ１のＣ末端に特異的な抗体でのブロ ットの再プローブは、１１５ｋＤａタンパク質との反応性を示さなかった。コラ ーゲンでの延長した刺激はＴ−４７Ｄ細胞におけるＤＤＲ１ｂのプロセシングを 増加させ、これはさらなる６２ｋＤａバンドによって示される。（図９Ｅおよび ９Ｆ）ＤＤＲ１ｂを過剰発現２９３細胞（Ｅ）およびＴ−４７Ｄ細胞（図９Ｆ） から免疫沈降させ、インビトロキナーゼ反応に供した。[³²Ｐ]リン酸の取り込み を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くオートラジオグラフィーによりモニターする。 図１０Ａ〜１０Ｈ。種々の型のコラーゲンによるＤＤＲ１およびＤＤＲ２のデ ィファレンシャルな活性化。２９３細胞をＤＤＲ１ｂおよびＤＤＲ２を用いてト ランスフェクトし、１０μｇ／ｍｌヒトＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはｖ型コラーゲン およびウシＩＩ型コラーゲンで刺激した。（図１０Ａ〜１０Ｄ）全細胞溶解物を 抗ホスホチロシン抗体を用いてプローブし（図１０Ａ：ＤＤＲ１ｂおよび図１０ Ｃ：ＤＤＲ２）、ＤＤＲ１（図１０Ｂ）またはＤＤＲ２（図１０Ｄ）に対する受 容体特異的抗体で再プローブした。ＤＤＲ１ｂを、９０分間Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、 ＩＶ、Ｖ型コラーゲンまたはゼラチンで刺激するか、または１ｍＭオルトバナジ ン酸で処理しておいたＴ−４７Ｄ細胞から免疫沈降させた。（図１０Ｅ）免疫沈 降物を抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析し 、（図１０Ｆ）ＤＤＲ１特異的抗体で再プローブした。（図１０Ｇおよび図１０ Ｈ）ＤＤＲ１ｂまたはＤＤＲ２を用いてトランスフェクトしておいた２９３細胞 をＰＢＳを用いて繰り返しのピペッティングによってプレートから洗い出し、ヒ トＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶ型コラーゲンでコートしておいたディッシュに添加 した。３７℃で９０分間インキュベートした後、細胞を溶解した。全細胞溶解物 を抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した( 図１０Ｇ:ＤＤＲ１ｂおよび図１０Ｈ:ＤＤＲ２)。 図１１Ａ〜１１Ｅ。ＤＤＲリガンド活性はコラゲナーゼ処理または熱変性によ って破壊される。マウスもしくはヒト組織から単離したＩ型コラーゲンまたはＢ ＳＡを、コラゲナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由 来、１μｇのコラーゲン当り２０ｎｇ）またはペプシン（ブタ粘膜由来、１μｇ のコラー ゲン当り２ｎｇ）で処理した。（図１１Ａ）等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析 し、クマーシー染色によって可視化するか（＋Ｃ：コラゲナーゼとのインキュベ ーション；＋Ｐ：ペプシンとのインキュベーション；α１（Ｉ）およびα２（Ｉ ）：単量体コラーゲン鎖；βおよびγ：共有結合したオリゴマーコラーゲン）ま たはＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞を刺激するために使用した。（図１１Ｂ ）細胞溶解物のアリコートを抗ホスホチロシン抗体を用いてブロットし、（図１ １Ｃ）ＤＤＲ２特異的抗体で再プローブした。（図１１Ｄ）マウスＩ型コラーゲ ン(１０ｍＭ酢酸中５００ｎｇ／ｍｌ)を分光旋光度計中で融解させ、円二色性の 変化を記録した(四角)。熱変性後、スペクトルを再度測定した（菱形）。熱転移 中点（Ｔｍ）を示す。（図１１Ｅ）マウスＩ型コラーゲンのアリコートを２４℃ と４５℃との間の種々の温度で３０分間インキュベートし、これを使用してＤＤ Ｒ２を過剰発現する２９３細胞を刺激した。全細胞溶解物を抗ホスホチロシン抗 体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。 図１２Ａ〜１２Ｃ。コラーゲンのＤＤＲ１およびＤＤＲ２への結合は直接的で あり、ＤＤＲ２の活性化はコラーゲンの脱グリコシル化の後に低下する。（図１ ２Ａ）アガロースビーズに共有結合したコラーゲンを、インスリン受容体、ＤＤ Ｒ１ｂまたはＤＤＲ２を過剰発現する２９３細胞の溶解物とともに、５０ｇ／ｍ ｌの可溶性Ｉ型コラーゲンの非存在下または存在下でインキュベートした。結合 した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにインスリン受容体、ＤＤＲ１およびＤＤＲ ２に対する抗体の混合物を用いるウエスタンブロッティングによって分析した（ 図１２Ａ）。下方のＤＤＲ２のグリコシル化アイソフォームはコラーゲンビーズ に対して最も強い親和性を示した。（図１２Ｂ）ＤＤＲ１ａ（四角）、ＤＤＲ１ ｂ（菱形）またはコントロールプラスミド（丸）でトランスフェクトした２９３ 細胞を種々の濃度のヨウ素化Ｉ型コラーゲンとともにインキュベートし、結合し たリガンドの量をβ計数によって測定した。（図１２Ｃ）Ｉ型コラーゲンをｍ− 過ヨウ素酸ナトリウムで脱グリコシル化し、これを使用してＤＤＲ２を過剰発現 する２９３細胞を刺激した。 全細胞溶解物を抗ホスホチロシン抗体を用いてブロットした。 図１３Ａおよび１３Ｂ。アダプタータンパク質ＳｈｃはＤＤＲ１ｂに結合する 。 （図１３Ａ）ＳｈｃのＰＴＢドメインをＥ．ｃｏｌｉ中でＧＳＴ融合タンパク質 として発現させ、ＤＤＲ１ａまたはＤＤＲ１ｂを過剰発現する２９３細胞由来の 溶解物とともにインキュベートした。結合したタンパク質をＤＤＲ１のＣ末端に 対する抗体を用いて検出した。（図１３Ｂ）競合量の、それぞれ、ＤＤＲ１ｂホ スホペプチド（ＡＬＬＬＳＮＰＡｐＹＲＬＬＬＡ、白丸）またはＮＧＦ受容体ホ スホペプチド（ＨＩＩＥＮＰＱｐＹＦＳＤ、黒丸）の存在下での表面プラズモン 共鳴による、精製ＧＳＴ−Ｓｈｃ ＰＴＢドメインの、ミドルＴ抗原ホスホペプ チドへの結合の分析。チップ表面に結合したＳｈｃ ＰＴＢドメインの百分率を 、競合ペプチドの濃度に対してプロットする。 図１４。ＤＤＲ２の活性化はＭＭＰ−１の発現を誘導する。親およびＤＤＲ２ 過剰発現ＨＴ １０８０細胞を、表示する期間Ｉ型コラーゲンまたはＴＰＡで刺 激した。馴化培地を濃縮し、ＭＭＰ−１に対する抗体を用いるウエスタンブロッ ティングによって分析した。 図１５Ａおよび１５Ｂ：Ｋ６１８Ａ変異を有するＤＤＲ１ａはもはやコラーゲ ンによって活性化されない。配列アラインメントによって、ＤＤＲ１ａタンパク 質中のリジン６１８が、チロシンキナーゼドメインの触媒機能におそらく必須で あることが示された。それゆえ、点変異を、ＤＤＲ１ａをコードするｃＤＮＡに 導入し、リジン６１８をアラニンに変更した。変異ｃＤＮＡを野生型ＤＤＲ１ａ ｃＤＮＡとともに２９３胚腎臓線維芽細胞中で一過性に発現させた。細胞を１ ０μｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンで９０分間刺激するか、または未刺激のままにし た。全細胞溶解物の等アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、抗ホスホ チロシン抗体を用いてプローブした(図１５Ａ)。ブロットをＤＤＲ１に対する抗 体を用いて再プローブした（図１５Ｂ）。この実験は、ＤＤＲ１ａのチロシンリ ン酸化が明らかにインタクトな触媒ドメインに依存することを示す。コラーゲン によるＤＤＲ１ａの活性化は触媒ドメイン中の不活化（ドミナントネガティブ） 変異によって消滅させられる。他のキナーゼはコラーゲンに応答してのＤＤＲ１ ａのインビボチロシンリン酸化に関与していないようである。 図１６：α１またはβ１インテグリンに対するブロッキング抗体はＤＤＲ１の 活 性化を阻害しない。α１β１およびα２β１型のインテグリンは、コラーゲンの 受容体であることが長く知られていた。それゆえ、インテグリンのＤＤＲ１ｂの 活性化における関与を検討した。ＤＤＲ１のｂアイソフォームを内因性に発現す る乳ガン細胞株Ｔ−４７Ｄを使用した。インテグリンの細胞外ドメインに対する モノクローナル抗体は、コラーゲンへの結合、およびそれゆえインテグリンのシ グナリングをブロックすることができる。Ｔ−４７Ｄ細胞をα２インテグリンに 対する抗体Ａ２−ＩＩＥ１０およびβ１インテグリンに対する抗体ＤＥ９（両方 ともｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）で、１０μｇ／ｍｌの Ｉ型コラーゲンの非存在下または存在下で一晩処理した。ＤＤＲ１ｂまたはＳｈ ｃを細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブ ロッティングによって分析した。この実験は、インテグリンの活性化がＤＤＲ１ ｂの活性化に必要ではないことを示す。インテグリン受容体がブロックされたＴ −４７Ｄ細胞におけるコラーゲンでの刺激後のＤＤＲ１ｂチロシンリン酸化の程 度は、未処理細胞と同じである。ＤＤＲ１ｂのＳｈｃへの結合はまた、インテグ リンのシグナリングをブロックした後に変化されない。 図１７Ａおよび１７Ｂ：ＤＤＲ１はインテグリンβ１欠損細胞においてコラー ゲンによって活性化される。インテグリンβ１ノックアウトマウス由来の細胞株 ＧＤ２５におけるＤＤＲ１ｂのシグナリングを試験した。これらの細胞中には、 機能的なコラーゲンに対するインテグリン受容体は存在しない。ＤＤＲ１ｂをコ ードするｃＤＮＡをＧＤ２５細胞にレトロウイルス移入プロトコルを使用してト ランスフェクトした。ＤＤＲ１ｂ過剰発現細胞および親細胞を、Ｉ型コラーゲン で一晩刺激した。ＤＤＲ１ｂを細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン 抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した（図１７Ａ）。ブロッ トを、ＤＤＲ１に対する抗体を用いて再プローブした（図１７Ｂ）。遺伝子改変 した細胞株を使用して、この実験は、ＤＤＲ１ｂが２つのインテグリン型コラー ゲン受容体の非存在下でシグナリングできることを示す。 図１８：インテグリンβ１欠損細胞におけるＤＤＲ１ｂの緩慢な活性化。ＤＤ Ｒ１ｂ過剰発現ＧＤ２５細胞の生成は図１７に記載する。この細胞をＩ型コラー ゲン で種々の期間刺激した。免疫沈降されたＤＤＲ１ｂを抗ホスホチロシン抗体を用 いるウエスタンブロットにおいて分析した。この結果は、インテグリンβ１欠損 細胞におけるＤＤＲ１ｂ活性化が正常細胞におけるように緩慢であることを示し 、このことは、ＤＤＲ１ｂの延長された活性化がインテグリンの作用によらない ことを示す。 図１９Ａ〜図１９Ｃ：ＤＤＲ１およびＤＤＲ２受容体の活性化はＥＧＦ媒介性 ＭＡＰＫ活性化に影響を及ぼさない。ＤＤＲ２を過剰発現するＴ−４７Ｄまたは ＨＴ １０８０細胞を、ＰＤＧＦまたはＥＧＦで５分間、Ｉ型コラーゲンで一晩 、およびＥＧＦ／コラーゲンまたはＰＤＧＦ／コラーゲンの組み合わせで刺激し た。細胞溶解物のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＭＡＰＫに対す る抗体でプローブした（図１９Ａ（Ｔ−４７Ｄ）および図１９Ｂ（ＨＴ １０８ ０−ＤＤＲ２））。活性化されたＭＡＰＫは、活性化されていないＭＡＰＫより もＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でより遅い移動を示す。ＭＡＰＫはＥＧＦまたはＥＧＦ／ コラーゲン処理によって活性化されたが、ＰＤＧＦ、コラーゲンまたはＰＤＧＦ ／コラーゲン処理では活性化されなかった。Ｔ−４７Ｄ細胞由来の残りの溶解物 を使用してＤＤＲ１ｂを免疫沈降させた。抗ホスホチロシン抗体を用いるウエス タンブロッティングは、ＤＤＲ１ｂがコラーゲンによって活性化され、ＥＧＦま たはＰＤＧＦによっては活性化されなことを示す（図１９Ｃ）。コラーゲンのＥ ＧＦとの組み合わせは、ＭＡＰＫ活性化またはＤＤＲ１ｂのチロシンリン酸化の 程度を低下させない。この実験は、ＤＤＲ１およびＤＤＲ２の活性化がＭＡＰＫ 経路の活性化を生じないことを示す。さらに、ＥＧＦによるＭＡＰＫの活性化は 、ＤＤＲ受容体の同時活性化によって影響されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ １１１ 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/78 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 9/12 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ０７Ｋ 14/78 Ａ６１Ｋ 37/52 Ｃ１２Ｎ 9/12 37/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼもしくはその一部、 およびコラーゲンもしくはその一部；（ｂ）ジスコイジンドメイン受容体チロシ ンキナーゼもしくはその一部、およびＳｈｃもしくはＳｈｃのＰＴＢ結合ドメイ ン；または（ｃ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼもしくはその一 部、およびＰＤＺドメインを含むタンパク質もしくはＰＤＺドメインを含む単離 された複合体。 ２．ジスコイジンドメイン受容体１またはその一部、およびＩ、ＩＩ、ＩＩＩ 、ＩＶもしくはＶ型コラーゲンまたはその一部を含む請求項１記載の単離された 複合体。 ３．ジスコイジンドメイン受容体２またはその一部、およびＩ型もしくはＩＩ Ｉ型コラーゲンまたはその一部を含む請求項１記載の単離された複合体。 ４．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼまたはその一部がオリゴマ ーである請求項１記載の単離された複合体。 ５．ジスコイジンドメイン受容体１ｂおよびＳｈｃまたはＳｈｃのＰＴＢ結合 ドメインを含む請求項１記載の単離された複合体。 ６．コラーゲンと相互作用するか、またはＳｈｃもしくはＰＤＺドメインを含 むタンパク質と相互作用するジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼの結 合ドメインに由来するペプチド。 ７．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼと相互作用するコラーゲン の結合ドメインに由来する分子。 ８．請求項２記載の複合体に特異的な抗体。 ９．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質または該タンパ ク質のアイソフォームもしくは一部を、コラーゲンもしくはコラーゲンの一部と 反応させるか、または細胞を、請求項１記載の複合体、請求項６記載のペプチド 、請求項７記載の分子または請求項８記載の抗体と反応させ、それによって該細 胞におけるシグナリング経路を調節する工程を包含することを特徴とする、細胞 におけるジ スコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路の調節方法 。 １０．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質がジスコイジ ンドメイン受容体１またはその一部であり、コラーゲンがＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉ ＶもしくはＶ型コラーゲンまたはその一部である請求項９記載の方法。 １１．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質がジスコイジ ンドメイン受容体２またはその一部であり、コラーゲンがＩ型もしくはＩＩＩ型 コラーゲンまたはその一部である請求項９記載の方法。 １２．（ａ）コラーゲンと、少なくとも１つのジスコイジンドメイン受容体チ ロシンキナーゼタンパク質または該タンパク質のアイソフォームもしくは一部と 、試験物質とを反応させる工程であって、該コラーゲンおよびジスコイジンドメ イン受容体チロシンキナーゼタンパク質が、それらが結合してコラーゲン−ジス コイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質複合体を形成するように選 択される工程；および （ｂ）該物質の非存在下のコントロールに対して比較して、物質の効果を決定す る工程、 を包含することを特徴とする、化合物を、ＤＤＲ媒介性シグナリング経路を調節 する能力について評価する方法。 １３．（ａ）コラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタン パク質複合体の形成を可能にする条件下で、コラーゲンまたはその一部と、少な くとも１つのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質または該 タンパク質のアイソフォームもしくは一部と、試験物質とを反応させる工程であ って、該コラーゲンおよびジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパ ク質が、それらが結合してコラーゲン−ジスコイジンドメイン受容体チロシンキ ナーゼタンパク質複合体を形成するように選択される工程；および（ｂ）複合体 、遊離物質、非複合体化コラーゲン、または該タンパク質の活性化についてアッ セイする工程を包含することを特徴とする、細胞においてＤＤＲ受容体チロシン キナーゼ媒介性シグナリング経路に影響を及ぼす物質の同定方法。 １４．タンパク質の活性化が、該タンパク質のチロシンリン酸化、該タンパク 質 のオリゴマー化、ＰＴＢドメインのジスコイジンドメイン受容体チロシンキナー ゼタンパク質膜近傍ドメインへの結合を測定することによって、または細胞に対 する生物学的影響についてアッセイすることによってアッセイされる請求項１３ 記載の方法。 １５．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質がジスコイジ ンドメイン受容体１またはその一部であり、コラーゲンがＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｉ ＶもしくはＶ型コラーゲンまたはその一部である請求項１３記載の方法。 １６．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼタンパク質がジスコイジ ンドメイン受容体２またはその一部であり、コラーゲンがＩ型もしくはＩＩＩ型 コラーゲンまたはその一部である請求項１３記載の方法。 １７．試験物質が、コラーゲンの炭水化物部分もしくはその模倣物、またはコ ラーゲンに結合するＤＤＲのドメイン由来のペプチドである請求項１３記載の方 法。 １８．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼ媒介性シグナリング経路 が関与する症状の処置または予防方法であって、該方法が、それを必要とする患 者にシグナリング経路を妨害するために有効である量の物質を投与する工程を包 含し、該物質が（ａ）ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼもしくはそ の一部；（ｂ）コラーゲンもしくはその一部；（ｃ）最初に請求項１３記載の方 法によって同定された物質；（ｃ）請求抗１記載の単離された複合体；（ｄ）請 求項６記載のペプチド；（ｅ）請求項７記載の分子、または（ｆ）請求項８記載 の抗体であることを特徴とする方法。 １９．（ａ）単離および精製されたジスコイジンドメイン受容体チロシンキナ ーゼもしくはその一部；（ｂ）コラーゲンもしくはその一部；（ｃ）最初に請求 項１３記載の方法によって同定された物質；（ｃ）請求項１記載の単離された複 合体；（ｄ）請求項６記載のペプチド；（ｅ）請求項７記載の分子、または（ｆ ）請求項８記載の抗体を含む組成物。 ２０．ジスコイジンドメイン受容体チロシンキナーゼの細胞外ドメイン、また はコラーゲンの炭水化物部分もしくはその模倣物に結合する細胞外ドメインの部 分を含む請求項１９記載の組成物。 ２１．ジスコイジンドメイン受容体２またはそのオリゴマーを投与する工程を 包含することを特徴とする細胞においてＭＭＰ−１発現をアップレギュレートす る方法。