JP2001511903A

JP2001511903A - オートフォーカス顕微鏡システム用のアナログ回路

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Publication number: JP2001511903A
Application number: JP53442598A
Authority: JP
Inventors: プライス，ジェフレイ，エイチ．; ブラボ−ザノグエラ，ミゲル
Original assignee: キュー３ディーエム，エルエルシー
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-01-14
Publication date: 2001-08-14
Also published as: BR9807671A; WO1998035256A1; USRE40674E1; DE69807512D1; CN1246929A; US5995143A; EP1021741B1; ATE223070T1; AU5909998A; CA2283088C; EP1021741A1; CA2283088A1; DE69807512T2

Abstract

(57)【要約】オートフォーカス顕微鏡システム用のアナログ回路は、顕微鏡ＣＣＤカメラのビデオ信号から直接対象の焦点度を測定する。それから回路は、対象に焦点を合わせるために顕微鏡の対物レンズの位置を調整する目的でホストコンピュータにインデックスを返す。いくつかの異なる垂直位置でインデックスを比較することによってベストフォーカスが見つけられる。焦点度を求めるために採用される基準は、ビデオ信号スペクトルのエネルギー分布から得られる。信号はハイパスフィルタ、ゲート(スキャニングノイズを除去する)、スクエアラおよびインテグレータを通る。ビデオスペクトルの高周波エネルギーは、ベストフォーカスにおいて最大となり、光学系が焦点からはずれると、分布は低周波方向へ移動する。この発明のアナログ回路によって低コスト、リアルタイムのオートフォーカスが達成され、より高価な専用のリアルタイム画像処理ハードウェアを置換できる。

Description

【発明の詳細な説明】オートフォーカス顕微鏡システム用のアナログ回路発明の分野この発明は、顕微鏡によって観察された画像の焦点が自動的に調整される、顕微鏡検査の分野に関するものである。このような顕微鏡焦点の自動調整は”オートフォーカス”と呼ばれる。この発明はオートフォーカスシステムの顕微鏡光学系に起因する伝達関数の効果の元となるアナログ回路の組み込みに関するもので、オートフォーカス機能をそこなうスキャニングノイズをなくし、照明の不安定性の影響を修正する。発明の背景機械的不安定性、ガラススライドとカバースリップの不規則性、生きている試料の運動および熱膨張の影響を克服するために、自動化された顕微鏡検査においてオートフォーカスは不可欠である。オートフォーカスはこれらの制限を克服することができ、完全に自動化された定量的な顕微鏡検査における正確で再現可能な測定を可能にする。多くの実験はオートフォーカスから恩恵を受けるだろう、そしてそれが不可欠である例は次のものを含んでいる：（ａ）フィールドの深さが制限される高分解能での大きな区域のスキャニング (例えば、スライド当たり１０，０００の顕微鏡フィールドを持つ、頸部がんのスクリーニング)。（ｂ）時間的経過の実験(例えば、時間から日まで)。（ｃ）（ａ）と（ｂ）を結合した時間的経過スキャニングの細胞数測定、ここでオート・フォーカス・スピードは一時的分解能の基本的要因になる。不安定などんなソースであっても、もし位置的変化がオートフォーカス修正よりも長い時定数を持っているならば、オートフォーカスは補償するだろう。オートフォーカスシステムは典型的に、スライド上の試料を拡大して観察するために顕微鏡スライドが取り付けられている拡大光学系と調整可能なステージを含む、自動化された顕微鏡を含んでいる。ステージに結合されたモータは、ステージの位置の水平調整を行う。拡大光学系とステージ間の垂直（Ｚ軸）調整のための手段が用意される。これらは、対物レンズのＺ軸位置を調整するための、あるいはステージのＺ軸調整による、手はずを含むことができる。カメラは、拡大光学系を経由して拡大された画像を受け取り、オートフォーカス・エレクトロニクスに拡大された画像を代表する電子信号を送る。オートフォーカス・エレクトロニクスは、焦点度を示す関数によって信号を処理し、垂直調整装置に調整（あるいはエラー）信号を送る。これに応じて、垂直調整装置は、対物レンズあるいはステージの垂直位置を調整し、拡大された画像の焦点を変更する。スライド上の試料の自動翻訳（スキャニング）のために、オートフォーカスシステムにそのほかの回路を含めることができる。いくつかの方法が、分解能、コントラスト、およびエントロピを含んで、オートフォーカスのためにテストされた。光学的分解能の測定はオートフォーカスをロバストに、また正確に行うことが最近示された。Price，J.H．and Gough D.G. ,"Comparison of Phase-Contrast and Fluorescence Digital Autofocus for Sc anning Microscopy,"，Cytometry 16，pp.283-297，1994。この実験的証拠は次の論理的定義を補強する：最高の分解能は最良の焦点に起こる。画像の焦点がずれると細部がかすんで分解能は失われる。分解能は、高周波を分離するフィルタを用いてフーリエ周波数スペクトルを解析することによって測定することができる。そうして高周波の平方の和（信号パワー）を分解能の尺度として用いることができる。スペクトルの用語でいうと、これはハイパス・フィルタまたはローパス・フィルタにすることができる。典型的なフィルタは、画像強度の第１導関数の実行である。別のフィルタはラプラシアン・フィルタで、これは画像強度の第２導関数の尺度である。ラプラシアン・フィルタはより卓越したハイパス特性を持っており、より小さいスケールで分解能を測定する。平方は関数値の間の差異を拡大する。いろいろな基準を比較するために、オートフォーカスシステムは典型的に、Ｚ軸位置の関数として焦点関数を計算する。焦点関数の値は各Ｚ軸位置において得られた画像から計算される.Princeらによると、ディジタルフィルタを用いる焦点関数のための典型的な式は、１次元ハイパス・フィルタを用いた画像ｉ_XY のたたみ込みから成り、不安定な照明の影響を軽減するために平方の和を得て、正規化を行う。このような関係は式（１）に与えられる。ｆ(z)＝ΣΣ([-１２-1]^*ｉ_XY)²/[(１/ＸＹ of pixels)(ΣΣｉ_XY)]² （１）ここでＺ＝垂直位置で、ｉ_XYは位置（Ｘ，Ｙ）における強度である。アナログ焦点回路は、Ali Kujoory，M.，Mayall，B.H．and Mendelsohn，M.L. ，"Focus-Assist Device for a Flying-Spot Microscope"．IEEE Transactions on Biomedical Engineering，20(2)，pp.126-32．1973,およびJohnson，E.T．an d Goforth，L.J.，"Metaphase Spread Detection and Focus Using Closed Circ uit Television."Journal of Histochemistry and Cytochemistry，22(7)，pp.5 36-587，1974．McKeogh，L.，Sharpe，J.，and Johnson，K.，は"A Low-Cost Au tomatic Translation and Autofocusing System for a Microscope"．Meas．Sci ．Techno.，6，pp.583-587，1995において、顕微鏡検査におけるオートフォーカスのためのアナログ回路について述べている。しかしこれらの設計は、高周波フィルタの選定においてオートフォーカスシステムの伝達関数の影響を考慮していない。これらの今までの実施において考慮されていなかった追加の重要な特徴は、ビデオ信号の水平ラインと照明不安定の修正のための正規化の間のフィルタ・エンド効果を含んでいる。さらに、低い情報内容の画像では、水平ラインの末端におけるフィルタのゆがみによって背景強度の変化が支配的になる可能性がある。発明の開示この発明の目標は、たとえば、蛍光着色した生物試料のスキャニング顕微鏡検査に使用するために低コストで、迅速、正確なオートフォーカスを実現することである。この発明は、顕微鏡、顕微鏡によって生成された拡大画像を代表するビデオ信号のソース、およびフォーカス・インデックス信号に応じて顕微鏡の焦点を合わせる自動顕微鏡焦点制御を有するオートフォーカスシステムに実行される。この発明は、この文脈で、フォーカス・インデックス信号を生ずるアナログ回路によって具体化される。回路は、ビデオ信号中のあらかじめ定められた周波数を代表する、フィルタされた信号を供給するフィルタを含んでいる。フィルタされた信号からスキャニングノイズを取り除くために、フィルタにトランジエント・リムーバが結合される。トランジエント・リムーバに結合された平方回路は、フィルタされた信号のあらかじめ定められた周波数成分の大きさを平方する。平方回路に結合されたインテグレータは、フィルタされた信号の周波数成分の大きさの平方を積分することによって、顕微鏡の焦点度を代表するフォーカス・インデックス信号を生ずる。回路はさらに、ビデオ信号に応じて平均照度信号を生ずるインテグレータを含むことが望ましい。フォーカス・インデックス信号と平均照度信号の両方は、顕微鏡の焦点位置を代表する焦点位置信号を生ずるために、オートフォーカスシステムの制御においてプロセッサによって結合される。焦点位置に顕微鏡を調整するために焦点位置信号を使用する。スキャニングの組み合わせによってビデオ信号が生成されると仮定すると、トランジエント・リムーバはまた、フォーカス・インデックス信号が生成される拡大された画像の区域を定義するために、ビデオ信号に課されたウィンドウをつくることができる。したがって、この発明の目的は、焦点度を代表するフォーカス・インデックス信号を生ずる、オートフォーカスシステムのためのアナロク回路を提供することである。さらなる目的は、焦点位置信号を生ずるためにプロセッサによってフォーカス・インデックス信号と結合されることができる平均照度信号のこのような回路による供給である。図面の簡単な説明この発明の目的、利点および特徴は、付図と関連して読む場合、以下の詳細説明から一層容易にわかるだろう。ここで図１は完全なオートフォーカス顕微鏡システムのブロックダイアグラムである。図２はオートフォーカス顕微鏡システムのためのアナログ回路のブロックダイアグラムである。図３ａと図３ｂは、図２のアナログ回路の動作を説明する波形のプロットである。図４Ａ，４Ｂ，４Ｃ，４Ｄから成る図４は、図２のアナログ回路を実行するためのベストモードを説明する電子回路の概要図である。図５は、図２と図４のアナログ回路を用いたオートフォーカス顕微鏡システムの使用による実験結果を説明するディジタルおよびアナログ焦点関数曲線を例示するグラフである。図６は、図１のオートフォーカス顕微鏡システムによる厚い細胞の単分子層に対する、いろいろなズームにおけるアナログ焦点関数曲線を示すグラフである。発明の実施態様今、同じ参照数字が同じ要素を示す図を参照すると、図１に対物レンズ１４，およびスライドを載せることができる顕微鏡ステージ１６を含む顕微鏡１２を含むオートフォーカスシステム１０が例示されている。ステージに置かれた顕微鏡スライドの連続する区域が既知の方法によってスキャンされることができるように、ステージ１６はＸおよびＹ方向に動かすことができる。１つのこのような区域が参照数字１８によって示されている。顕微鏡は、蛍光着色された生物試料の照明のための装置２０および位相コントラストまたはほかの送られた顕微鏡照明のための装置２２を含んでいる。区域１８の画像は、対物レンズ１４とズームレンズ２３を含む顕微鏡１２の拡大光学系によって拡大される。おのおのの拡大された画像は、組み合わされたスキャニングによって、拡大された画像を代表する、そしてスキャニングの組み合わせのために必要ないろいろな同期成分を含む、ビデオ信号を生ずるカメラ３０によって獲得される。ビデオ信号は、ほかの機能の中に画像プロセッサ３８と焦点信号プロセッサ３９を含む、プログラムされた汎用ディジタルコンピュータ３４に、信号経路３２を通って供給される。ビデオ信号はこの発明を具体化するアナログ・オートフォーカス回路３６にも供給される。アナログ。・オートフォーカス回路３６は、オートフォーカス・インデックス信号、平均照度信号、およびトリガー信号を生じ、それらは信号経路４０，４２および４４を通ってそれぞれコンピュータ３４のフォーカス・プロセッサ３９に供給される。コンピュータ３４のフォーカス・プロセッサ３９は、フォーカス・インデックス、平均照度およびトリガー信号に応じて焦点関数信号を計算する自動顕微鏡焦点制御を構成する。焦点関数信号は顕微鏡１２の多数の焦点位置のおのおのに生成される。これらはフォーカス・プロセッサ３９によって結合されて、顕微鏡１２の焦点位置を代表する焦点位置信号を生ずる。焦点位置信号は信号経路５０に供給され、対物レンズ１４の位置を調整する既知の装置を制御するために使用され、それによって顕微鏡１２の焦点を合わせる。その他の信号は、ステージ１６のＸおよびＹ位置を調整するために信号経路５２に供給される。アナログ・オートフォーカス回路３６を含まないオートフォーカスシステムは、米国特許第5,548,661号の１２列、ライン２８から１４列、ライン３６に述べられており、それはこの参照によってそっくりそのまま組み込まれる。ハードウェアおよび実験方法この発明によるアナログ操作のための位相コントラストと明るい視野照明のために、オートフォーカスシステム１０がつくられた。細胞は、Ｐｈ３の明るいフェーズ・コントラストをもつCF Fluor DL 40xC，0.85NA対物レンズによってNiko n Optiphor顕微鏡に画像を生ずる。画像はさらに,Nikon CCTV 0.9-2.25ズームレンズによって、７ＭＨｚの周波数応答をもつ、Dage VE-1000 CCD RS-170カメラに拡大された。顕微鏡ステージ１６は、蛍光画像細胞数測定のためにステッパ・モータによってコンピュータ３４の制御の下でＸ，Ｙ平面内で動かされた。顕微鏡ステージ１６の制御は、マイクロステッピング・ドライバとAT ISA-busコンパティブル・コンピュータ・ボードによった。焦点は、ピエゾエレクトリック・オブジェクティブ・ポジショナ(PIFOC)およびE-S810.10クローズド・ループ・コントローラ(Polytec PI，Costa Mesa，CA) によって対物レンズ１４の位置を変えることによって変えられた。≦１μｍの移動のために、対物レンズ１４の位置は１０ｍｓ間安定である。PIFOCの位置は、コンピュータ３４に組み込まれたKeithley Metrabyte（Taunton，MA）DAS 1600 データ・アキジッション・ボードのディジタル-アナログ(D/A)コンバータからのアウトプットによって制御された。１２ビットD/Aコンバータは、PIFOCの１００ μｍの範囲を各２４ｎｍの４，０９６ステップに分割する。 RS-170ビデオ・インプット・ボード(imaging Technology Inc.によるVSI-1５０)を使用する画像プロセッサ３８は、拡大された画像をビデオ信号の形でとらえ、４．２ＭＨｚで３ｄＢおよび８ＭＨｚで−１２ｄＢ減衰のアンチ-アリアシング・フィルタを適用した。これらの値は、この発明のアナログ回路のフィルタを設計し、それをディジタル・バージョンに応じてコンパチブルにするために参照として用いられた。アナログ回路の実行この発明は、カメラ３０のビデオ信号からの直接焦点度を測定し以前の設計の限界を解決する、アナログ・オートフォーカス回路３６を提供する。図２のブロック・ダイアグラムおよび図４の回路図は、この新しい回路の機能要素を説明する。デフォーカスの程度を求めるために採用された基準は、空間周波数の関数として拡大された画像に含まれる相対エネルギーであった。デフォーカスの下では、拡大された画像の隣の要素は、かすんで見えるかあるいは平均化されて、高い方の空間周波数の損失を生ずる。エネルギーは単調に変化して焦点で最大になるので、これらの周波数において焦点位置の関数として相対エネルギーを測定することによって、最適な焦点位置を決定するための基準が確立された。これらの仮定は、焦点の基準のために高周波が使用される場合にのみ、位相コントラストに対して適用できる。定周波数に関係するこれらの条件の下で、単調性はしばしば破られる。Priceらの前掲報文。アナログ回路３６は、画像のエネルギーの尺度として、ビデオ信号の平方値の積分で焦点関数を実現する。ビデオ信号は、焦点に最も大きく依存する高周波を強調するために、平方する前にフィルタされる。式（２）は、アナログ回路３６とコンピュータ３４によって遂行される処理を表している。回路の構成要素に関して、フィルタ５２は、ビデオ画像信号から周波数の範囲を選び、平方と積分を行った後に、アナログ回路３６は、平均照度値（Ｉ_XY）(平均照度信号の大きさ)とともにフォーカス・インデックス信号の大きさとしてコンピュータ３４に戻される、フォーカス・インデックス値∬(ｄＩ_XY/ｄχ)²ｄχｄｙを生ずる。 A/D変換後、コンピュータ３４は、焦点信号プロセッサ３９を使用して、平均照度値を平方し、次いで割算を行い、焦点関数Ｆ(ｚ)を生ずる：Ｆ(ｚ)＝∬(ｄＩ_XY/ｄχ)²ｄχｄｙ/(∬Ｉ_XYｄχｄｙ)² （２）焦点関数の形は、焦点基準、顕微鏡とカメラの伝達関数、および画像化された対象によって決定される。有用な焦点関数の特性は次の通りである：１）単一モード性、１つのみ最大；２）正確度、最大は焦点位置に生ずる；３）再現性、焦点関数曲線のシャープさ；４）実行、焦点値の迅速な計算。Priceらの前掲報文、およびGroen，F.C.A.，Young，I.T.，Ligthart，G.，"a Comparison of Different Focus Functions for Use in Autofocus Algorithms,"Cytometry 6 ，pp81-91，1985。アナログ回線は、もしそれらが最初の３つの特性についてディジタル回路の性能に匹敵することができるなら、実施上ディジタル回路にまさる実質的な利点を持っている。これは、従来のビデオ周波数で動作するアナログの構成要素が相対的に至る所で入手できて安価だからである。アナログ回路３６は、ビデオ信号から直接焦点を測定する。カメラ３０のアウトプットは、従来通りのスキャンされビデオ・フォーマットであって、２つの組み合わされたフィールドから成っている。アナログ部分はさらにフォーカス・インデックス部と平均照度部に分けることができる。次の３つの信号がアナログ回路３６によってコンピュータ３４に供給される；フォーカス・インデックス信号、平均照度信号およびトリガーパルス。今、図２と図４を参照すると、区域１８の拡大された画像を代表するビデオ信号は、ビデオ信号から水平と垂直のパルスを消去する従来のシンク・ストリッパー５０に供給される。シンク・ストリッパー５０のアウトプットは、伝達関数Ｈ(ω)を有するバンドパス・フィルタ５２のインプットに送られる。フィルタは、上に述べた理由のためにビデオ信号の高周波成分を通過させる周波数応答を持っている。フィルタ５２は、画像信号中のあらかじめ定められた高周波を代表する、フィルタされた信号を生ずる。フィルタされた信号は、トランジエント・リムーバル・エレメント５６のインプットに結合されている、フィルタ５２のアウトプットに供給される。トランジエント・リムーバル・エレメント５６は、ビデオ信号から抽出された同期信号によってゲートされる。好ましい具体化では、ゲーティングは、画像信号のスキャンラインのおのおのの最初と終わりに発生したスキャニングノイズを消去する。実際には、トランジエント・リムーバル・エレメント５６はまた、ビデオ信号中の各スキャンラインに対して、スキャンラインのそれぞれの末端がウィンドゥの末端を超えて伸びることによって、スキャンラインよりも短いウィンドゥを可能にする、ウィンドゥ・ジェネレータとみなすことができる。垂直シンク・パルスの供給は、トランジエント・リムーバル・エレメント５６が、２つの組み合わされたフィールドのおのおのの上を動くことができる２次元ウィンドゥを生成し、典型的なスキャンされたフォーマットのビデオのフレームを形成することを可能にする。トランジエント・リムーバル・エレメント５６は、平方回路５８のインプットに結合されているアウトプットに、スキャニングノイズを除去された、フィルタされた信号を供給する。平方回路は、フィルタされた信号中のあらかじめ定められた周波数成分の大きさを平方し、平方された大きさをインテグレータ６０のインプットに結合されているアウトプットに供給する。インテグレータ６０は、フィルタされた信号の周波数成分の平方された大きさを積分し、サンプルおよびホールド回路６２に供給される、アナログ形式のフォーカス・インデックス信号を生ずる。サンプルおよびホールド回路６２は、インテグレータ６０によって生成された積分された信号の電圧の大きさをホールドするためにゲートされる。積分された信号（フォーカス・インデックス信号）の電圧の大きさは、顕微鏡１２の焦点度を代表する。フォーカス・インデックス信号は、コンピュータ３４への信号経路４０に供給される。したがって要素５２，５６，５８，６０，６２は、アナログ回路３６のアナログ部分へのフォーカス・インデックス部を形成する。アナログ回路３６の平均照度部は、シンク・ストリッパー５０によってシンク信号をストリップされたビデオ信号を積分する、インテグレータ６８によって形成される。例えば、ビデオのラインに関してのインテグレータ６８によるビデオ信号の積分は、ライン上の平均照度を代表する。インテグレータ６８の大きさはサンプルおよびホールド回路７０によってサンプル、ホールドされ、そのアウトプットは信号経路４２に供給される平均照度信号を形成する。アナログ回路３６のディジタル部分は、垂直と水平のシンク部分のようなスキャニングノイズのすべてを含む、画像信号をそのまま受け取る制御タイミング回路６６から成る。制御タイミング回路６６は、インテグレータ６０と６８の動作をそれぞれサンプルおよびホールド回路６２と７０に連続的に同期させる、リセットおよびホールド信号を生ずる。さらに、制御タイミング回路６６は、信号ライン４６にトリガー信号を生ずる。制御タイミング回路６６はさらに、トランジエント・リムーバル・エレメント５６によって実現されるウィンドゥを形成するために必要なシンク信号を生ずる。ディジタルセクション図２と図４を参照すると、水平および垂直パルスを抽出するシンク・セパレータ８０(LM1881，National Semiconductor．Arlington，TX)によって、制御タイミング回路６６においてビデオ信号の同期パルスが検出される。このタイミング情報は、焦点関数が実行される画像の区域を代表するウィンドゥをつくるために用いられる。最低でも、ウィンドゥは水平ラインの末端にフィルタ５２によって生じた不連続性の除去を可能にする。アナログ回路３６のこの部分は、処理のためにビデオ・フィールドの任意の長方形の部分を選ぶためのマスク・ジェネレータとして使用することができる；２つのモノステープル・マルチバイブレータの時定数を変更することによって、垂直にまた水平にどんなウィンドゥサイズも定義することができる。ウィンドゥの第１の部分は、フリップフロップ８２ａと８２ｂによって確立される；第２の部分はフリップフロップ８３ａと８３ｂによって確立される。この種のアナログ・マスキングは、ビデオ・ディメンジョン・アナライザに使用された。Yin，F.C.P.，Tompkins，W.R．Pe terson，K.L．およびIntaglietta M,"A Video-Dimension Analyzer,"IEEE Trans actions on Biomedical Engineering，19(5)，pp.376-81，1972。ウィンドゥ情報は、トランジエント・リムーバル・エレメント５６のゲート増幅器８４によって使用される。各ウィンドゥまたはビデオフィールドの後に、トリガーパルスが生成される。制御タイミング回路６６はまた、各フィールドの対応するアナログ値のA/D変換のためにコンピュータ３４をゲートする、連続する６０Ｈｚトリガー信号を発生する。アナログセクションフィルタ５２は、高速と安定性のために高いスルーレートと内部単位ゲイン周波数補償を有する広い帯域幅のモノリシック増幅器90-96で実現される。このような高周波、高速の増幅器は、低周波の装置よりも振動しやすい傾向がある。しかし、この不安定性は、増幅器のインプットとアウトプットの浮遊容量を減らすことによって消去された。安定性の向上のために供給電源のバイパシングも用いられ、フィルタにおける避けがたい浮遊容量を補償するためにフィードバック抵抗に並列に小キャパシタが追加された。図３ａは、水平ビデオライン１００と、選ばれてそれに続いてアナログ処理されたアウトプットのプロットを示している。シンク・ストリッパー５０は、波形１０２について複合ビデオ信号のシンク部分を除去する。参照レベルはグラウンドであって、シンクチップはマイナスであるので、アウトプットはシンクを除去され、ブランキング・レベルをグラウンドに置くだろう。ビデオ信号のインプットがその同期化パルスをストリップされた後、信号はフォーカス・インデックス・セクションのフィルタ５２と照度インテグレータ６８の両方にフィードされる。フィルタの操作増幅器9c-96(LT1220，Linear Technology Corporation，Milpi tas，CA)のおのおのは、４つの操作増幅器が第４等級のロウパス・セクション５２ａと第４等級のハイパス・セクション５２ｂに配置された、２極アクティブ・バターワース(Butterworth)・フィルタ・コンフィグレーションで使用される。顕微鏡１２の光学系の伝達関数を代表する、ディジタルフィルタの応答に合わせるために、２から４ＭＨｚの周波数応答が選ばれた。信号の減衰を補償するために２．５６のバンドパス・ゲインが使用された。広い帯域幅と要素の単位補償によって、それ以上の注文設計なしで良好な性能が得られた。部品の正しい選択によって、カットオフ周波数は増幅器の帯域幅に独立であり、ロウパス・セクション５２ａとハイパス・セクション５２ｂのそれぞれのＲ−Ｃネットワークによってのみ決定される。明らかに、これらのネットワークは、手動で調整できる要素を含んでもよい。波形１０４はフィルタのアウトプットを示す。ウィンドゥされ、フィルタされた信号は、波形１０６と１０８に示されているように、オフセット、増幅、平方がされる。フィルタされ、平方された信号は、それからインテグレータ６０によって１つのビデオフィールドについて積分される。インテグレータ６０は、各フィールドの終わりにキャパシタ１１０をりセットし、フォーカスインデックス計算のためにフィルタされた信号を積分し、ダイオード１１４で、フィルタ５２から意味のあるアウトプットがない間は、中間の焦点をホールドするために、制御関数をリセット、積分、ホールドすることを含んでいる。ホールド制御を欠く今までのアナログ・オートフォーカス回路の設計は、画像特徴の間でフォーカス・インデックス・アウトプットの衰退を示した。これは、図３ａの波形１０９によって明らかに説明される。ここでは、平方された波形１０８の部分に"dead space"のマークがついており、インテグレータ６０によって発生された積分信号の大きさは衰退していない。従来のインテグレータの代わりにダイオード１１４をもつインテグレータ６０を使用することによって、フォーカス・インデックスが各ビデオフィールドに対する真の数学的積分により理想的に合うことが保証される。インテグレータ６８のアウトプットは、キャパシタ１１６とダイオード１１８によって同様に制御される。平均照度セクションは、シンク・ストリップされたビデオ信号を受けて、１つのフィールドについてこの信号を積分することによって平均照度を測定する． A/Dボードのために最終アナログ値を維持するためにサンプルおよびホールド回路が使用される。この積分からの最終アウトプット、およびフォーカス・インデックスは、次にコンピュータ３４のアナログーディジタル・ボードによって変換される。新しい変換をスタートするために、各フィールドの終わりにトリガー信号がコンピュータに送られる。フォーカス・インデックス、平均照度およびトリガーは、それらのそれぞれの立場で、通常はそれぞれ、コンピュータ３４または信号経路４０，４２と４６に結合される。アナログ回路３６のウィンドゥイングが図３ｂに示されており、図２と図４の参照によって理解することができる。スキャンラインの大きさのために、水平ラインのブランキングに応じて、ビデオのどのラインに対してもフリップフロップ８２ａ-８２ｂによって水平ウィンドゥパルス１２０がつくられる。垂直のブランキングに応じて、フリップフロップ８３ａ-８３ｂによって垂直ウィンドゥパルス１２４が生成される。トランジスタラジオ-ダイオード回路１２６は、ＡＮＤゲートとしてパルス１２０と１２４に応答し、両方のパルスが高い場合に、フィルタ５２からのフィルタされた信号を平方回路５８に伝達する。明らかに、ウィンドゥの寸法を選択的に調整するために、制御タイミング回路６６のフリップフロップとともにカウンティングまたはタイミングを用いることができる。フォーカシング・ソフトウェア、オートフォーカス・アルゴリズムフォーカス・プロセッサ３９において、アナログ回路３６によって供給されたトリガー信号に基づいて、フォーカス・インデックスおよび平均照度信号のアナログ値を得るためにインタラプト・サービス・ルーチン（ＩＳＲ）が実行された。このルーチンはまた、焦点位置、オートフォーカス回路からのアナログ値の獲得、および正規化された焦点度の計算、を制御した。プログラムはＣとアセンブラ言語で書かれた。ＣルーチンはMetaware High C（Santa Cruz，CA）でコンパイルされた。インタラプト・サービス・ルーチンのためにPhar Lap(Cambridge， MA)アセンブラが使用された。各フィールドの終わりにトリガーパルスはＩＳＲをスタートさせ、ＩＳＲは、ベストの焦点を計算して設定するために、フォーカス・インデックスと平均照度信号のアナログ値をＣルーチンにアクセスできるアレイに転送する。ベストの焦点を決定するために、コンピュータ３４は、対物レンズ１４のＺ軸位置が多数の焦点位置（Ｚ_i）によって順番に処理される、フォーカス・シーケンスを実行する。各焦点位置で、フォーカス・インデックスと平均照度信号の大きさが取られて、式（２）により焦点関数値(Ｆ(Ｚ_i))が計算される。焦点関数値は、コンピュータ３４によって図１の１３０に記憶される。各フォーカス・シーケンスの後、多数の位置についてコンピュータ３４によって記憶されたフォーカス・インデックスを用いて、ベストの焦点を求めるために加重平均が使用される。細胞成分の不連続な垂直分布によって、多数の極大値を含む異常な形の焦点曲線が生ずる可能性がある。これらの理由で、加重平均が使用される。ここで、Ｗａは加重平均位置、ｚは垂直（Ｚ軸）位置、Ｆ_zは１つのｚ位置で得られた画像から計算された焦点関数（式(２)）の結果、ｎは加重の幕である。幕はピーク値を強調し平均は試料の３Ｄの性質の影響を減少させる。実験結果顕微鏡画像コントラストは、試料の固有の特性ではない。むしろそれは（１）照明光波と試料構造の相互作用と（２）顕微鏡のＭＴＦとコントラスト発生モード、の結果である。ポイント（１）は試料構造と照明光波の条件の両方によって決まり、ポイント（２）は照明の条件と試料を離れる光波がどのように処理されるのか、の両方によってきまる。Inoue，S.,"Video Microscopy"，Plenum Press ．New York，1986。これらの実験では、オートフォーカスのための画像技術として位相コントラスト顕微鏡検査が使用された。位相コントラストでは、透明な細胞によってもたらされる位相変化が強度の変化に変換される。Bom，M．and Wolf，E."Princi ples of Optics"，Pergamon Press，1989。これは、画像にオートフォーカスを実行するのに有用であるコントラストを作り出す。位相コントラストはまた、光ハイパス・フィルタを実行する。Inoue，S.,"Video Microscopy"，Plenum Press ，New York，1986。実験的に、位相コントラストはまた、焦点関数曲線にサイド・ピークを表す傾向が強いことが示された。Price，J.H.らの前掲報文。したがって、単一モード性を保証するために高周波を注意深く選ぶことが重要である。図５に、いろいろなＺ軸位置における細胞単分子層の位相コントラスト実験のプロットが示されている。アナログとディジタルのバージョンによって類似の焦点関数曲線が得られ、関数のピーク幅とシャープさは本来単一モードである。曲線はメインロープの外側に減衰したサイドピークを示している。この挙動はユニット・ズームにおけるアンダーサンプリングによって激化される。倍率を増すとその結果Nyquistサンプリングになり、この挙動は消去される。フィルタの低いカットオフは、単調な挙動を仮定することが出来ないミッド・レンジの周波数をとらえる。サイドピークへ向かう傾向は、フォーカス・インデックス・システムの伝達関数の周波数応答の増大とともに減少するが、それはフィルタ、ＣＣＤカメラ、および光学的伝達関数を含んでいる。図６は、厚い細胞単分子層を使用した、アナログ・フォーカス・インデックスのプロットを示している。試料の３Ｄ構造は、ベストの焦点の差異をつくりだし、焦点関数を広げる原因となる。試料の深さの増大はまた、サイドピークを増すように思われる。このように、焦点曲線の形は、試料とシステム伝達関数の両方によってきまる。特別の実験条件に対するサンプリング周期は、１０μｍの間隔のマイクロメータ・スライドの画像を使用して校正された。Ｉｘのズームで（４０ｘの対象を使用）周期は３０３ｎｍだった。分解能はRayleigh基準、ｄ＝1.22 λ/(ＮＡ_obj＋ＮＡ_cond)によって与えられる。５００ｎｍの照明、０．５２ＮＡ_cond と０．８５ＮＡ_objで、４４５ｎｍの分解能が得られる。そうして必要なNyq uistサンプリングは、２２２．５ｎｍである。したがって、Nyquistサンプリングのために(３０３/２２２．５)＝１．３６ｘの倍率が必要である。いろいろの実用上の理由で、実際には、さらにオーバーサンプルしなければならない。Inoue,S.の前掲の報文。この注意深く設計されたアナログ回路の主な利点は、性能を犠牲にしないで低コストであることである。リアルタイム・オートフォーカスのためのディジタル処理は、より高価な大きさの等級になる可能性のあるパイプライン・アーキテクチャをもつリアルタイム画像プロセッサの使用を必要とする。さらに、ディジタルフィルタの複雑さが増大すると、係数の付加が必要になり、それはさらにコストを増加させるか、あるいはスピードを減少させる可能性がある。他方、ディジタル・オートフォーカスは、リプログラミングを簡単な仕事にし、リアルタイムの操作に対して、導関数フィルタ（例えば、｛１，−１｝と｛−１，２，−１｝のハイパス・フィルタおよび｛１，０，−１｝のバンドパス・フィルタ）の不連続な近似として簡単な１次元フィルタのためにディジタル画像処理資源を使用することができる。しかし、ディジタル画像処理のコストを仮定すると、この重要な資源をほかの仕事のために解放する、同じ性能の安価なアナログ回路によるディジタル実行の置換が、最も重要な検討すべき事項になるかも知れない。一般にアナログ回路についての１つの欠点（少なくともそれらのディジタル等価物に関する）は、ダイナミック・レンジが限定されることである。ディジタル・ダイナミック・レンジは、ピクセルとグレイレベルの積の平方根に比例する。アナログ処理はA/Dコンバータのビットの数に限定される。もちろん、アナログ・ダイナミック・レンジが限定されることは、自動ゲイン制御回路の追加によって克服できるだろう。他方、アナログの実行は、任意の高いカットオフ周波数（カメラの限界まで）を可能にするが、ディジタル・バージョンではこの上限は画像プロセッサによって設定される。これは、オートフォーカスの再現性を改善するために一層シャープなフィルタ関数曲線を生成するために、フィルタ５２の焦点カットオフ周波数を顕微鏡の光学伝達関数に合わせることを簡単にする。ＣＣＤカメラは７６８ピクセル/ラインが可能で、画像プロセッサ３８は５１２ピクセル/ラインしかディジタル化しない、と仮定しよう。アナログ回路３６によって、各ビデオカメラとフィルタ関数のマッチングおよび光学伝達関数の結合を簡単にするために、フィルタ５２に対してプラグイン・ヘッダを使用することができる。アナログ回路のフィルタ５２は、画像プロセッサ３８の分解能よりもずっと容易にかつ安価に変更することができる。上記の詳細説明は、いろいろな具体化に適用されるとして、この発明の基礎的な新しい特徴を示し、説明し、指摘したが、技術に熟達した人が、請求される発明の精神と適用範囲から逸脱することなく、説明された装置の形式と詳細のいろいろな省略と代用と変更を行うことができる、ということが理解されるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．顕微鏡、顕微鏡によって生ずる拡大された画像を代表する画像信号の発生源、およびフォーカス・インデックス信号に応じて顕微鏡の焦点を合わせる自動顕微鏡焦点制御、を有するオートフォーカス・システムにおいて、フォーカス・インデックス信号を生ずるための回路、これは次のものから成る：画像信号中のあらかじめ定められた周波数を代表する、フィルタされた信号を供給するためのフィルタ；フィルタされた信号からスキャニングノイズを除去するためにフィルタに結合されたトランジエント・リムーバ；フィルタされた信号の周波数成分の大きさを平方するためにトランジエント・リムーバに結合された平方回路；およびフィルタされた信号の周波数成分の平方された大きさを積分することによって顕微鏡の焦点を代表するフォーカス・インデックス信号を生ずるために平方回路に結合されたインデックス・インテグレータ。２．さらに画像信号に応じて平均照度信号を生ずるための照度インテグレータを含む請求項１記載の回路。３．焦点制御は、フォーカス・インデックスおよび平均照度信号に応じて顕微鏡の焦点関数を代表する焦点位置信号を生ずるためのプロセッサを含む請求項１記載の回路。４．さらにフォーカス・インデックス信号が衰退するのを防止するためにインデックス・インテグレータのアウトプットに結合されたダイオードを含む請求項１記載の回路。５．さらに次のものを含む請求項３記載の回路：フォーカス・インデックス信号が衰退するのを防止するためにインデックス・インテグレータのアウトプットに結合された第１ダイオード；および平均照度信号が衰退するのを防止するために照度インテグレータのアウトプットに結合された第２ダイオード。６．トランジエント・リムーバはフィルタ信号に一次元ウィンドゥを適用する請求項１記載の回路。７．トランジエント・リムーバはフィルタ信号に二次元ウィンドゥを適用する請求項１記載の回路。８．画像信号はビデオ信号である請求項１記載の回路。９．スキャニングノイズはビデオ信号のスキャンラインの末端を含む請求項８記載の回路、１０．フィルタは実質上顕微鏡の光学的伝達特性に等しい伝達特性を有する請求項１記載の回路。１１．拡大された画像を代表するビデオ信号に応じて顕微鏡の焦点を制御するためのオートフォーカスシステム、これは次のものから成る：拡大された画像の焦点度を示すフォーカス・インデックス信号および拡大された画像の平均照度の大きさを示す平均照度信号を生ずることによってビデオ信号に応答するアナログ・オートフォーカス回路：およびフォーカス・インデックス信号および平均照度信号に応じて焦点位置信号を生ずるためにアナログ・オートフォーカス回路に結合されたコンピュータ顕微鏡の焦点位置を示す焦点位置信号。１２．フォーカス・インデックス信号は拡大された画像の分解能を示す請求項１１記載のオートフォーカス制御システム。１３．フォーカス・インデックス信号はビデオ信号のあらかじめ定められた周波数に含まれるエネルギーを示す請求項１１記載のオートフォーカス制御システム。１４．アナログ・オートフォーカス回路はビデオ信号のバンドパス・フィルトレーションによってフォーカス・インデックス信号を生ずる請求項１３記載のオートフォーカス制御システム。１５．アナログ・オートフォーカスシステムはフォーカス・インデックス信号を生ずる際にビデオ信号からすキャニングノイズを除去する請求項１４記載のオートフォーカス制御システム。１６．アナログ・オートフォーカス回路は次のものから成る請求項１１記載のビデオ信号中のあらかじめ定められた周波数を代表するフィルタされた信号を供給するためのフィルタ；フィルタされた信号からスキャニングノイズを除去するためにフィルタに結合されたトランジエント・リムーバ；フィルタされた信号の周波数成分の平方された大きさを積分することによってフォーカス・インデックス信号を生ずるために平方回路に結合されたインデックス・インテグレータ。１７．さらに画像信号に応じて平均照度信号を生ずるための照度インテグレータを含む請求項１６記載のオートフォーカス制御システム。１８．焦点制御は、フォーカス・インデックス信号と平均照度信号に応じて顕微鏡の焦点関数を代表する焦点位置信号を生ずるためのプロセッサを含む請求項１７記載のオートフォーカス制御システム。１９．さらにフォーカス・インデックス信号が衰退するのを防止するためにインデックス・インテグレータのアウトプットに結合されたダイオードを含む請求項１６記載のオートフォーカス制御システム。２０．さらに次のものを含む請求項１６記載のオートフォーカス制御システム。フォーカス・インデックス信号が衰退するのを防止するためにインデックス・インテグレータのアウトプットに結合された第１ダイオード；および平均照度信号が衰退するのを防止するために照度インテグレータのアウトプットに結合された第２ダイオード。２１．コンピュータは、各焦点位置で得られたフォーカス・インデックス信号値と平均照度信号値を結合することによって多数の顕微鏡焦点位置のおのおのに対する焦点関数値を生じ、また多数の焦点関数値を結合することによって顕微鏡の焦点位置を代表する焦点位置信号を生ずる請求項１１記載のオートフォーカス制御システム。