JP2001511006A

JP2001511006A - 突然変異熱ショック転写因子を用いる療法

Info

Publication number: JP2001511006A
Application number: JP53338198A
Authority: JP
Inventors: ヴェルミー，リチャード，ダブリュ．
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-21
Publication date: 2001-08-07
Also published as: AU6032098A; AU736925B2; WO1998031803A1; EP1007664A1; EP1007664B1; CA2278102A1; DE69840980D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、真核細胞、組織および生物（哺乳動物、特にヒトの細胞、組織および生物等）における内在性熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）遺伝子の発現または合成を変化させる外来性突然変異ＨＳＦ（外来性ＤＮＡによりコードされるｍｕｔＨＳＦ）に関する。本明細書に記載されるように、ｍｕｔＨＳＦは、細胞において内在性ｈｓｐの発現を制御し、その結果として細胞のストレスに対する応答を変化させることが示された。本発明のｍｕｔＨＳＦは、正に作用するｍｕｔＨＳＦまたは負に作用するｍｕｔＨＳＦである。

Description

【発明の詳細な説明】突然変異熱ショック転写因子を用いる療法関連出願本願は、１９９７年１月２１日出願の米国出願暫定番号第６０/０３５，６６２号の特典を受ける１９９７年８月１９日出願の特許出願第０８/９１４，６４６号（いずれも「突然変異体熱ショック転写因子ＨＳＦを用いる療法」という名称を有する）の一部継続出願である。特許出願第０８/９１４，６４６号および特許出願第６０/０３５，６６２号の開示内容はすべて、参照により本願に取り込まれる。政府助成本発明の一部は、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（National Institutes of Health）の補助金（ＧＭ３２１１５）の助成を受けてなされたものである。米国政府は本発明において相応の権利を有する。発明の背景細胞、組織、または生物を致死量未満の熱ショックにあらかじめ曝露させると、通常は致死的である過酷な熱処理に対するその後の曝露に抵抗性を示すようになる[パーセルとリンドクイスト（Parsell，D.A．and Lindquist，S.)、Annu．R ev．Genet.，27:437-496(1993)]。この現象は熱耐性として知られている。上記前曝露はまた、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）と呼ばれる１群のタンパク質の発現促進を引き起こす。熱による前曝露があると、細胞はその後の過酷な熱処理に耐えるようになるだけでなく、虚血型障害をはじめとする熱以外のストレスにも耐えるようになる。このことは、培養細胞を用いた実験で示されているのみならず、たとえばインタクトの心臓[リチャードら(Richard，V.R．et al.)、Fund．Clin．Pharmacol.，1 0:409-415(1996)]などの器官においても示されている。発明の要約本明細書で説明するように、外来性突然変異体熱ショック転写因子(外来性ＤＮＡによってコード化されたｍｕｔＨＳＦ)は、真核細胞、組織、および生物(たとえば哺乳類、とくにヒトの細胞、組織および生物)における内在性熱ショックタンパク質(ｈｓｐ)の発現または合成を変化させる。また、本明細書で説明するように、ｍｕｔＨＳＦは、細胞における内在性ｈｓｐの発現を調節し、その結果として、該細胞のストレス応答を変化させることも示されている。本発明のｍｕｔＨＳＦは、正作用性ｍｕｔＨＳＦ（本明細書ではＨＳＦ１（+）と呼ぶこともある）または負作用性ｍｕｔＨＳＦ（本明細書ではＨＳＦ１（−）と呼ぶこともある）のいずれかである。１つの態様においては、本発明は、正作用性ｍｕｔＨＳＦまたは正作用性ｍｕｔＨＳＦをコードする発現可能型ＤＮＡを、該ｍｕｔＨＳＦがｈｓｐ合成を促進するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、細胞に導入される、細胞(たとえば単離細胞、単離組織、単離器官；または個体の細胞、組織もしくは器官) におけるｈｓｐの合成を促進する方法に関する。別の態様においては、本発明は、正作用性ＨＳＦを、該ｍｕｔＨＳＦが個体の細胞に導入されｈｓｐ合成を促進するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、該個体に投与することを含む、個体におけるｈｓｐの合成を促進する方法に関する。本明細書で使用する場合、「正作用性ｍｕｔＨＳＦ」という用語は、細胞に導入されたときに内在性ｈｓｐの合成をアップレギュレートまたは促進するｍｕｔＨＳＦをいう。また、本明細書で使用する場合、内在性ｈｓｐの「促進された発現」または「アップレギュレートされた発現」という用語は、ストレスまたは陽性ｍｕｔＨＳＦにより、内在性ｈｓｐの発現が増大した状態をいう。内在性ｈｓｐの促進、誘導、またはアップレギュレートされた発現(過剰発現)とは、ストレスまたは陽性ｍｕｔＨＳＦの非存在下で起きるものより高度にｈｓｐが発現または合成されることをいう。陽性ｍｕｔＨＳＦの作用により、内在性ｈｓｐの発現を促進または増大させ、結果的に細胞を保護状態、すなわち細胞がさらされるストレスまたはその他の好ましくない状態(たとえば毒物、ＵＶＢ曝露、この種の傷害と関連する炎症反応を含む虚血/再潅流、敗血症、急性呼吸器疾患、化学療法剤、またはその他の薬剤) から細胞全体または一部を保護する状態に置くことができる。陽性ｍｕｔＨＳＦは、細胞におけるｈｓｐ発現をアップレギュレートさせ、結果的に細胞(たとえば癌細胞)を免疫認識のターゲットとして除去する目的にも使用することができる。本発明はまた、正作用性ｍｕｔＨＳＦまたはｍｕｔＨＳＦをコードする発現可能型ＤＮＡを、該ｍｕｔＨＳＦがｈｓｐ合成を活性化させるのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、細胞に導入する、細胞に保護状態を誘導する方法に関する。別の態様においては、本発明は、細胞に保護状態を誘導する必要がある個体に対して、正作用性ｍｕｔＨＳＦが該個体の細胞に導入されてｈｓｐ合成を促進するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを該個体に（たとえば個体の細胞を化学療法、ＵＶＢ、敗血症、虚血などから保護する目的で）投与することで保護状態を作り出す、該個体の細胞に保護状態を誘導する方法に関する。具体的な態様においては、本発明は、細胞、組織または生物に、正作用性ｍｕｔＨＳＦまたは正作用性ｍｕｔＨＳＦをコードする発現可能型ＤＮＡを、該ｍｕｔＨＳＦがｈｓｐ合成を活性化させ抗炎症反応(作用)を起こさせるのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、導入することを含む、該細胞、組織または生物に抗炎症作用を誘導する方法に関する。別の態様においては、本発明は、負作用性ｍｕｔＨＳＦまたは負作用性ｍｕｔＨＳＦをコードする発現可能型ＤＮＡを、該ｍｕｔＨＳＦがストレス誘導性ｈｓｐ合成を阻害するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、細胞に導入する、細胞におけるｈｓｐ合成を阻害(完全にまたは部分的に)する方法に関する。本明細書で使用する場合、「負作用性ｍｕｔＨＳＦ」という用語は、細胞に導入されたときに内在性ｈｓｐのストレス誘導性合成をダウンレギュレートまたは阻害するｍｕｔＨＳＦをいう。また、本明細書で定義する場合、ストレス誘導性内在性ｈｓｐの阻害された、低減された、またはダウンレギュレートされた発現とは、負作用性ｍｕｔＨＳＦの非存在下で起きるものより高度にｈｓｐの発現または合成が低減された状態をいう。負作用性ｍｕｔＨＳＦの作用により、内在性ｈｓｐの発現をストレス条件または望ましくない条件中に阻害(完全にまたは部分的に)させるか低減させ、結果的に細胞を熱およびその他のストレスに対して感受性にする、すなわち細胞を感作状態に置くことができる。たとえば、負作用性ｍｕｔＨＳＦは、腫瘍細胞の細胞死を、熱および/またはその他のストレスによる細胞死にターゲット化させる目的に使用することができる。本発明の正作用性ｍｕｔＨＳＦは、最低限、熱ショックエレメント(ＨＳＥ)ＤＮＡ結合ドメイン、たとえばＨＳＦ由来の疎水性反復オリゴマー化ドメインの全体または一部などのＨＳＦオリゴマー化ドメイン(三量体化ドメイン)、核局在化シグナルおよび転写活性化ドメインを含む。好ましいタイプの負作用性ＨＳＦは、最低限、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメイン、ＨＳＦオリゴマー化ドメイン、および核局在化シグナルを含む。正作用性ｍｕｔＨＳＦとは、ＨＳＦの調節領域内にある少なくとも１つのアミノ酸残基を突然変異させたＨＳＦ（たとえば哺乳類ＨＳＦ、とくにヒトＨＳＦ１）分子をいう。負作用性ＨＳＦとは、１つ以上の活性化ドメインを突然変異させたＨＳＦ分子またはＤＮＡ結合ドメインを変化させたＨＳＦ分子をいう。具体的な態様においては、負作用性ｍｕｔＨＳＦは、ＨＳＦの２つの活性化ドメインに突然変異が存在するＨＳＦ分子である。ｍｕｔＨＳＦをコードするＤＮＡも、本発明の主題である。細胞(組織または生物)におけるｈｓｐの発現を変化(促進/アップレギュレートまたは阻害/ダウンレギュレート)させる方法において、ｍｕｔＨＳＦまたはｍｕｔＨＳＦをコードする核酸(ＤＮＡまたはＲＮＡ)を、該ｍｕｔＨＳＦが該ｈｓｐの発現を変化させるのに適した条件下で、該細胞に導入する。１つの態様においては、ｍｕｔＨＳＦをコードする核酸を含有する発現可能型ベクターを細胞に導入し、該ｍｕｔＨＳＦを核酸配列から転写および翻訳させる。該ｍｕｔＨＳＦが産生され、細胞核に入り、ＨＳＥと結合し、そこで該ｍｕｔＨＳＦは核酸配列から転写される。産生したｍｕｔＨＳＦはＨＳＥと結合し、ｍｕｔＨＳＦの結合相手となるＨＳＥを含むＤＮＡによってコード化されたｈｓｐの発現をもたらす。あるいは、ｍｕｔＨＳＦは、細胞に導入され、細胞核に入り、ＨＳＥと結合して、コード化されたｈｓｐの発現をもたらす。いずれのアプローチにおいても、ｍｕｔＨＳＦを発現する細胞を個体に導入することができる。ｍｕｔＨＳＦをコードするＤＮＡは、発現可能な型で個体に導入され、ｍｕｔＨＳＦを発現させようとする細胞に入り、細胞中でｍｕｔＨＳＦが発現されると、細胞核内で内在性ｈｓｐ発現を促進する作用を示すｍｕｔＨＳＦを、遺伝子治療法などにより、個体に投与することもできる。あるいは、適当なビークルに含ませたｍｕｔＨＳＦそのものが個体に導入され、細胞に入り、ｈｓｐ産生を促進する作用を示す。いずれの場合も、ｍｕｔＨＳＦはＨＳＥと結合し、保護状態の誘導という所望効果を得るのに十分な量でコード化ｈｓｐの発現をもたらす。たとえば１つの態様においては、ＨＳＥのＤＮＡ結合ドメインとＨＳＦオリゴマー化ドメインと核局在化シグナルと転写活性化ドメインを含有する正作用性ｍｕｔＨＳＦをコードするＤＮＡまたはこれらのエレメントを含むｍｕｔＨＳＦを、促進されたｈｓｐ発現をもたらすのに十分な量で、ｈｓｐ発現のアップレギュレート(促進)が必要である個体に導入する。１つの態様においては、細胞に存在するすべてのタイプのｈｓｐ(たとえばｈｓｐ７０、ｈｓｐ２５、ｈｓｐ６０、ｈｓｃ７０、およびｈｓｐ９０)の普遍的アップレギュレーションが起き、ストレスまたはその他の好ましくない状態に対する細胞の保護をもたらす。本明細書で説明するｍｕｔＨＳＦおよび方法は、様々な状態や疾患の治療または予防に有効である。ｈｓｐ合成のアップレギュレーションは、たとえば高体温症、酸化性ストレス、毒物曝露（たとえば窒素酸化物などの有毒代謝物）、ＵＶＢ曝露、様々な環境下で起きる虚血/再潅流、敗血症、および急性呼吸器疾患によって引き起こされる障害に対する保護が求められる用途において有益である。また、アップレギュレーションは、炎症性応答（例えば、炎症性サイトカイン、リポ多糖（ＬＰＳ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の炎症媒介物質により生じる毒性の合成）ならびに興奮性アミノ酸レセプターの活性化により生じた神経損傷または血管形成後の再狭窄等における負の結果を低減するのにも有用である。また、アップレギュレーションは、化学療法剤に耐性な非標的細胞（正常細胞）を低減させることも有用である。癌細胞におけるｈｓｐのアップレギュレーションは、該細胞を免疫認識および除去のためにターゲット化することも期待できる。１つの態様においては、本発明は、細胞に正作用性ｍｕｔＨＳＦを、該ｍｕｔＨＳＦがｈｓｐ合成を活性化させるのに十分な量で、かつそれに適した条件下で導入することにより、該細胞に保護状態を誘導する方法に関する。別の態様においては、本発明は、細胞（たとえば、または個体の細胞）に正作用性ｍｕｔＨＳＦを導入してｈｓｐ合成を促進させることを含む、虚血障害から該細胞（たとえば該個体の１つ以上の細胞）を保護する方法に関する。別の態様においては、本発明は、ｈｓｐ合成を促進するのに十分な量の正作用性ｍｕｔＨＳＦを癌細胞に投与することを含む、該細胞の免疫原性を増大する方法に関する。さらに別の態様においては、本発明は、個体の腫瘍細胞に導入されるのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、該個体に正作用性ｍｕｔＨＳＦを投与することにより該腫瘍細胞におけるｈｓｐ合成を促進させることを含む、該腫瘍細胞の免疫原性を増加させる方法に関する。あるいは、ｈｓｐ合成のダウンレギュレーションは、たとえば細胞をストレスの多い条件に感作させることでたとえば抗癌剤の力価を高めたり、アポトーシス細胞死を誘導したりするのに有用である。１つの態様においては、本発明は、細胞を、通常は物理的または化学的ストレスによって誘導されるｈｓｐ合成を完全にまたは部分的に阻害(防止または減少)させるのに十分な量の負作用性ｍｕｔＨＳＦを該細胞に付与することを含む、該細胞の該ストレスに対する感受性を増大させる方法、すなわち感作状態を誘導する方法に関する。図面の簡単な説明図１は、ヒト熱ショック転写因子(ＨＳＦ１)のアミノ酸配列(配列番号：１)である。図２は、ｈｓｐレベルが上昇すると細胞増殖が高度に阻害されることを示した相対的細胞数の経日変化のグラフである。図３Ａおよび３Ｂは、Ｓ期およびＧ２/Ｍ期におけるＨＳＦ１（+）発現細胞数がやや増大することを示した相対蛍光強度と相対細胞数の関係のグラフである。発明の詳細な説明本発明は、突然変異体熱ショック転写因子（ｍｕｔＨＳＦ）またはｍｕｔＨＳＦを発現可能な形でコードする遺伝子を細胞に導入することで、該細胞における熱ショックタンパク質(ｈｓｐ)遺伝子発現（ｈｓｐ合成）を調節または変化させることで、レシピエント細胞におけるｈｓｐ合成を調節または変化(アップレギュレートまたはダウンレギュレート)させることに関する。ストレス誘導性ｈｓｐ遺伝子の転写は、熱ショック転写因子（ＨＳＦ）の活性によって調節される。脊椎動物細胞においては、ストレス誘導性ｈｓｐ遺伝子の転写は、熱ショック転写因子１(ＨＳＦ１)の活性によって調節される。この因子は、ストレス誘導性ｈｓｐ遺伝子のすべてのプロモーター中に存在するＨＳＥ配列に結合して、ｈｓｐのｍＲＮＡの合成促進をもたらす。ｈｓｐの合成は、さらに転写後制御と翻訳制御を受けることがよく知られている。ＨＳＦは、ストレスを受けている細胞とストレスを受けていない細胞の両者に存在するが、ストレス存在時のみ、活性転写因子になる。この因子の活性化には、一連の複雑な調節事象が関与する。通常、すなわちストレスを受けていない細胞においては、ＨＳＦは単量体であり、おそらくは分子内疎水性相互作用によって安定化状態にあり、単数または複数のリプレッサータンパク質と複合体を形成している。この状態のＨＳＦは、ＤＮＡと結合することができない。ストレスを受けると、該単数または複数のリプレッサータンパク質が放出され、疎水性相互作用が破壊され、該因子はホモ三量体になり、結果的にＨＳＥＤＮＡ結合活性を獲得し、再び核に戻る。該三量体因子がｈｓｐ遺伝子の転写を刺激できるようになるためには、おそらくリン酸化によって誘導されるであろう独立的な立体構造変化がさらに必要であろう。哺乳類細胞を、ヒトＨＳＦ１をコードする遺伝子でトランスフェクトさせたところ、内在性ＨＳＦ１の量を大幅に上回る量のＨＳＦ１の合成が起きた[ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Cell Biol.，15:4319-4330(1995)]。トランスフェクト遺伝子から発現されたＨＳＦ１は三量体で、ＨＳＥＤＮＡ結合性を示し、核局在化されていた。したがって、ＨＳＦ１の過剰発現は、通常は該因子を単量体かつＤＮＡ非結合性に保っている調節制御の一部に対するバイパスとなる。ところが、過剰発現されたＨＳＦ１は、ｈｓｐ遺伝子プロモーターによって制御されるリポーター遺伝子からの転写を刺激する能力を有さなかった。本発明は、ｍｕｔＨＳＦが内在性ｈｓｐの発現を調節する結果、ストレスに対する細胞の感受性を変化させるという発見に基づくものである。本明細書で説明するように、ヒトＨＳＦ１配列(図１)における約１８０位から約３１５位のアミノ酸をカバーする調節領域の突然変異は、ストレスの非存在下でもｈｓｐ合成を活性化しうる因子(正作用性ｍｕｔＨＳＦ)の生成をもたらす。また、本明細書で説明するように、ｍｕｔＨＳＦは、ｈｓｐ９０、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ６０、およびｈｓｐ２５をコードする遺伝子などの内在性ｈｓｐ遺伝子の発現を促進しうる。さらに本明細書で説明するように、ヒトＨＳＦ１配列における約２７７位から約５２９位のアミノ酸をカバーする第２の領域（転写活性化ドメインを含む）の突然変異が、ストレスの存在下でもストレス誘導性ｈｓｐ合成を阻害しうる因子(負作用性ｍｕｔＨＳＦ)の生成をもたらす。本発明は、外来性ＤＮＡによってコードされるＨＳＦ、すなわち外来性ｍｕｔＨＳＦであって、真核細胞、組織または生物(たとえば哺乳類、とくにヒトの細胞、組織、または生物)に存在する場合に内在性ｈｓｐ遺伝子の発現または合成を変化させる外来性ｍｕｔＨＳＦに関する。本明細書で説明するように、ｍｕｔＨＳＦは、細胞における内在性ｈｓｐの発現を調節する結果、該細胞のストレス応答性を変化させることが示されている。本発明のｍｕｔＨＳＦは、正作用性ｍｕｔＨＳＦまたは負作用性ｍｕｔＨＳＦのいずれかである。１つの態様においては、本発明は、正作用性ｍｕｔＨＳＦがｈｓｐ合成を促進するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、該正作用性ｍｕｔＨＳＦを細胞、組織、または生物に導入することで、該細胞を、曝露を受けるストレスまたはその他の好ましくない状態、たとえば、ＵＶＢ曝露、この種の傷害と関連する炎症反応を含む虚血/再潅流、敗血症、神経細胞の場合は高濃度興奮性アミノ酸、ＬＰＳやＴＦＮなどの炎症ミーディエーター、窒素酸化物などの有毒代謝物、および化学療法剤から完全にまたは部分的に保護する、該細胞、組織、または生物におけるｈｓｐの合成を促進する方法に関する。別の態様においては、正作用性ｍｕｔＨＳＦを用いて、腫瘍細胞におけるｈｓｐ発現をアップレギュレートし、結果的に該腫瘍細胞を免疫認識および除去のためにターゲット化することができる。別の態様においては、本発明は、負作用性ｍｕｔＨＳＦが、ストレス時または好ましくない条件下で、ｈｓｐ合成を阻害するのに十分な量で、かつそれに適した条件下で、該負作用性ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入する、該細胞におけるｈｓｐの合成を阻害する(完全にまたは部分的に)方法に関する。負作用性ｍｕｔＨＳＦは、熱およびその他のストレスに対して細胞を感作させるべく腫瘍細胞の細胞死をターゲット化するという用途がある。本発明に使用されるｍｕｔＨＳＦは、様々な供給源から得ることができる。例えば、ｍｕｔＨＳＦは、天然原料から得てもよく、組換え技術による製造や化学的に合成もできる。ＨＳＦは当初、ＨＳＥと結合しうる因子として特徴付けられていた[ボエルミー（Voellmy，R．）、Crit．Rev．Eukaryotic Gene Expr.，4:3 57-401(1994)；ボエルミー（Voellmy，R．）、In:Stress-Inducible Cellular R esponses（フェイゲら（Feige，U．et al.）編）、Birkhauser Verlag，Basel， Switzerland，pp．121-137(1996)]。ＨＳＥは、５’ＮＧＡＡＮＮＴＴＣＮＮＧＡＡＮ（配列番号：２）を最小構造とする短い２本鎖ヌクレオチド配列であり、通常はｈｓｐ遺伝子のプロモーター中に存在する。ｈｓｐ遺伝子のプロモーターの欠失に関する研究で、これらのプロモーターからの熱誘導性転写にはＨＳＥ配列が必要であることが判明している。ストレスを受けた細胞から精製したＨＳＦ [ゴールデンベルグら（Goldenberg，J．et al．）、J．Biol．Chem.，263:19734 -19739(1988)]は、イン・ビトロでｈｓｐプロモーターからの転写を刺激しうることが示されている。ＨＳＦのｃＤＮＡは、酵母、植物、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、マウス、ニワトリおよびヒトをはじめとする多くの生物からクローン化されている[ボエルミー（Voellmy，R．）、Crit．Rev．Eukaryotic Gene Expr.，4:357-4 01(1994)]。配列比較により、幾つかの保存された特性がわかっている[ナカイとモリモト（Nakai，A．and Morimoto，R.I.）、Mol．Cell Biol.，13:1983-1997( 1993)]。すべてのＨＳＦ類は、分子のアミノ末端付近にＨＳＥＤＮＡ結合ドメインを有しているものと思われる。このＤＮＡ結合ドメインには、２つの近接する３，４タイプの疎水性反復配列が後続している。これらの疎水性反復配列はそれぞれが２つの疎水面を含む。「３，４タイプ」という用語は、両者の関係について述べたものである。この疎水性ストレッチの一部が、活性三量体因子を一体的に保持させる役目を果たしている。第３の疎水性反復配列領域が、上記第１の２つの疎水性反復配列から一定の距離を置いた位置にある。異なる生物に由来するＨＳＦ間の全体的配列類似性または同一生物に由来する異なるＨＳＦ間の全体的配列類似性（下記参照）は低いが、ＤＮＡ結合領域と疎水性領域はよく保存されている[ナカイとモリモト（Nakai，A．and Morimoto，R.I.）、Mol．Ce ll Biol.，13:1983-1997(1993)]。驚くべきことに、脊椎動物は２つ以上の異なるタイプのＨＳＦを含んでいるものと思われる。その２つのＨＳＦ遺伝子をヒト細胞からクローン化した。コード化された因子をＨＳＦ１およびＨＳＦ２と呼ぶ（ヒトＨＳＦ１のクローン化については、ラビンドランら（Rabindran，S.K．et al.）、Proc．Natl．Acad．Sci. ，USA 88:6906-6910（1991）参照）。ＨＳＦ１およびＨＳＦ２に対して特異的な抗体が作製され、これらを用いた抗体スーパーシフト実験で、熱誘導性ＨＳＥＤＮＡ結合活性がＨＳＦ１によるものであることが示されている[ベイラーら（B aler，R．et al.）、Mol．Cell Biol.，13:2486-2496(1993)]。その結果、ＨＳＦ１がｈｓｐ遺伝子のストレス活性化を引き起こす因子であると推定された。しかし、ｈｓｐ遺伝子の活性化にどれだけの量の転写因子が必要であるかを推定することができないため、上記スーパーシフト実験は結論を導くに到っていない。すなわち、上記スーパーシフト実験で見落とされているマイナーなＤＮＡ結合活性が実際にはｈｓｐ遺伝子を調節していると考えられる。本出願人の発見の以前には、ＨＳＦ１が実際に内在性（すなわち染色体中に位置する）ｈｓｐ遺伝子のストレス調節因子であること、あるいはそれが単独で、すなわち他のストレス誘導性因子の非存在下で、これらのｈｓｐ遺伝子を活性化することを明らかにする証拠は得られていなかった。ＨＳＦの構造/機能を調べるために、ヒトＨＳＦ１（ｈＨＳＦ１）ｃＤＮＡを鋳型として用いるイン・ビトロ転写反応においてＨＳＦ１のｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡを、アフリカツメガエルの第６期卵母細胞にマイクロ注入したところ、卵母細胞はｈＨＳＦ１を合成したという[ベイラーら（Baler，R．et al. ）、Mol．Cell Biol.，13:2486-2496(1993)]。ストレスを受けていない細胞における内在性ＨＳＦ１と同様に、産生されたｈＨＳＦ１（過剰発現ｈＨＳＦ１という）は一部が単量体であり、一部がｈｓｐ７０と１：１の複合体を形成しており、ＤＮＡとの結合能力を欠いていた。上記注入卵母細胞を熱処理したところ、ｈＨＳＦ１がホモ三量体化し、ＨＳＥＤＮＡ結合能力を獲得した。上記熱ショック処理によりｈＨＳＦ１に転写活性が誘導されたかどうかを決定するために、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインを、細菌リプレッサータンパク質ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインで置換した。ＬｅｘＡ−ｈＨＳＦ１キメラのｍＲＮＡを卵母細胞に注入したところ、単量体キメラ因子が合成された。該単量体キメラ因子は、熱ショック処理により三量体化へと誘導され、ＬｅｘＡコンセンサス認識配列への結合能力を獲得した。また、この熱活性化キメラ因子は、ＬｅｘＡ結合部位を補足した基本プロモーターによって制御される核注入クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）（Ｌｅｘ−ＣＡＴ）からの発現を促進することも示されている[ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Cell Biol.，14:7557-7568(199 4)；ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Cell Biol.，15:4319-4330(1995)]。上記卵母細胞マイクロ注入系におけるｈＨＳＦ１突然変異体を解析したところ、前述の複数の疎水性反復配列が機能上重要であることが判明した。因子の三量体化には、反復配列１が必要であった。熱ショックの非存在下でも該因子を単量体化非ＤＮＡ結合性型に維持するためには、反復配列２および３ならびに反復配列１のアミノ末端側配列が必須であった[ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Cell Biol.，14:7557-7568(1994)]。反復配列２を欠失させたところ、該因子が三量体化し、転写活性を示すようになったが、他の反復配列における突然変異では、因子の三量体化が起きただけで、転写活性因子の生成をもたらさなかった。上記第２の反復配列(アミノ酸２０３位から３１５位)の後続領域における突然変異は、因子の三量体化を引き起こさなかったが、疎水性反復配列における第２の突然変異によって三量体化された因子の転写コンピテンスは活性化させた。転写活性化ドメインを含むアミノ酸２７７位から５２９位の間のカルボシキ末端配列における突然変異はｈＨＳＦ１を部分的にまたは完全に不活化させた点を除き、ｈＨＳＦ１の他の配列は熱調節に関与していないものと思われた[ズオら（Zuo，J ．et al.）、Mol．Cell Biol.，14:7557-7568(1994)；ズオら（Zuo，J．et al. ）、Mol．Cell Biol.，15:4319-4330(1995)]。過剰発現されたｈＨＳＦ１は主に三量体であって、熱ショックの非存在下でもＨＳＥＤＮＡ結合性を示すことが判明したことを除いて、哺乳類細胞において、ウイルスプロモーターによって制御されるトランスフェクトされたｈＨＳＦ１遺伝子から発現されたｈＨＳＦ１に重複があることがわかった[ズオら（Zuo，J ．et al.）、Mol．Cell Biol.，15:4319-4330(1995)]。生じたｈＨＳＦ１は、より小型の熱誘導性ｈｓｐ７０遺伝子のプロモーターに結合させたＣＡＴリポーター遺伝子（ｈｓｐ７０Ｂ−ＣＡＴ）の発現を刺激する能力を欠いていた。ＬｅｘＡ−ｈＨＳＦ１キメラ因子をコードする適当な構築物を利用することで、熱ショック処理により、不活性三量体因子が、ＬｅｘＡ−ＣＡＴリポーター遺伝子からの転写を促進しうる活性因子に変換されることが示された。上記第２の疎水性反復配列またはこの反復配列(アミノ酸２０３位から３１５位)に直接的に隣接する配列内部の欠失またはアミノ酸置換により、ｈＨＳＦ１は、熱ショックの非存在下でもｈｓｐ７０Ｂ−ＣＡＴリポーター遺伝子からの転写を促進しうるようになった。たとえば、アミノ酸１８６位〜２０１位、２０３位〜２７７位または２０３位〜３１５位を欠失させると、残基１８６〜２０１の領域におけるいくつかの小型の３残基または７残基長の欠失または残基１８９、１９１[ズオら（Zuo，J ．et al.）、Mol．Cell Biol.，14:7557-7568(1994)]、２７９、２９８[ニュートンら（Newton，E.M．et al．）、Mol．Cell Biol.，16:839-846（1996） ]、２９０〜２９２、または３０７の置換と同様に、該因子が活性化される。３０３位および３０７位における同時置換は、３０７位における単一置換より有効であることが示されている。これらをはじめとする結果から、ｈＨＳＦ１の転写コンピテンスの制御に関与する調節領域は、アミノ酸約１８０位と約３１５位の間に存在することがわかる。調節領域にある少なくとも１つのアミノ酸残基の違いが野生型ＨＳＦとのアミノ酸配列の違いをもたらしているｍｕｔＨＳＦ、ならびにｈｓｐ合成または発現を調節または変化（たとえば促進）させる用途も、本発明の主題の１つである。たとえば、ｈｓｐ合成を促進する態様においては、調節領域にある１つ以上のアミノ酸残基（配列が図に示されているヒトＨＳＦのアミノ酸約１８０位から３１５位）が置換、欠失、または修飾される。さらに別の態様においては、１つ以上のアミノ酸残基を付加することにより、野生型ＨＳＦ調節領域を修飾する。他の有用なＨＳＦ突然変異体の決定は、通常の実験操作でできる。本明細書の説明に従い、同様の効果を示す他のＨＳＦ突然変異体をこの領域に作製することができる。ＨＳＦの遺伝子が複数の生物から単離されている。ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインをコードする領域および疎水性反復配列をコードする配列の３つの独立したストレッチがすべてのＨＳＦに共通している。正作用性ｍｕｔＨＳＦをコードする遺伝子は、第２および第３の疎水性反復配列を参照することで決定され、ヒトＨＳＦにおける残基約１８０位から残基約３１５位に位置する調節領域を突然変異させることによって、ＨＳＦ遺伝子から作製することができる。第３の疎水性反復配列が長すぎること、および転写活性化領域が置換容易性であることから、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインとオリゴマー化ドメイン（第１の疎水性反復配列）と核局在化シグナルと機能的活性化ドメインを組み合わせることによって、ｍｕｔＨＳＦを構築してもよい。負作用性ｍｕｔＨＳＦは、ｈｓｐ遺伝子プロモーターにおけるＨＳＥ配列への結合をめぐって内在性ＨＳＦと競合するタンパク質、または内在性ＨＳＦとヘテロマー状無機能複合体を形成しうるタンパク質である。本明細書に示すように、残基約２７７位と残基約５２９位の間の配列をサイズ決定可能な程度に欠失させると、ヒトＨＳＦ１のカルボキシ末端に位置する活性化ドメインの機能が妨害または阻害される。したがって、該ＨＳＦのトランス活性化活性が阻害されるように、該ＨＳＦのトランス活性化ドメインにあるアミノ酸配列の全部または一部を欠失させることによって、ＨＳＦから負作用性ｍｕｔＨＳＦを得ることができる。このような陰性ｍｕｔＨＳＦは、野生型ＨＳＦ１と同様に、ＨＳＥＤＮＡに結合する。過剰発現された負作用性ｍｕｔＨＳＦは、細胞中でＨＳＥエレメントに結合し、ストレスによって活性化された機能性内在性ＨＳＦの結合を防止する。負作用性突然変異体は、上記活性化領域の部位特異的突然変異誘発法によって作製することもできる。生物種が異なっても保存されているというＨＳＦの性質に基づき、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインとＨＳＦ由来のオリゴマー化ドメインと核局在化シグナルを組み合わせることによって、負作用性ｍｕｔＨＳＦを構築してもよい。負作用性ｍｕｔＨＳＦは、上記ＨＳＥＤＮＡ結合領域をＨＳＦから除去することによって作製してもよい。生じたタンパク質は、内在性ＨＳＦとオリゴマーを形成し、特異的ＤＮＡ結合に必要な３つのＨＳＥＤＮＡ結合ドメインの集合を阻害しうる。たとえば、負作用性ｍｕｔＨＳＦ（ストレスフル状態によるｈｓｐ遺伝子発現の誘導を防止または低減させうる因子）は、ＨＳＦのトランス活性化機能を除去またはブロックすることで、構成的にはＨＳＥＤＮＡ結合性を示すが相互作用相手であるプロモーターを活性化させる能力を欠いている因子を生ぜしめることによって、これを作製することができる。細胞中に通常存在するＨＳＦの量が少ないことを考慮すると、上記ｍｕｔＨＳＦが中程度の量で存在すれば、利用可能なＨＳＥ結合部位をめぐって内在性因子と競合することで、該内在性因子がｈｓｐ遺伝子と結合してそれを活性化させることが防止されるであろう。動物ＨＳＦ（脊椎動物ＨＳＦ１）のトランス活性化ドメインは、該因子のアミノ酸配列のカルボキシ末端から３分の１の位置に存在することが、マッピングによって決定された。この領域および隣接領域（ヒトＨＳＦ１および他のＨＳＦにおける対応する領域における残基２７７〜５２９）におけるほとんどすべてのサイズ決定可能な欠失は、負作用性ｍｕｔＨＳＦとして機能するであろう転写不活性であるがＤＮＡ結合性を有する因子の生成をもたらす[ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Ce ll Biol.，15:4319-4330(1995)]。もう１つの負作用性ｍｕｔＨＳＦ製造アプローチは、ＨＳＦのＨＳＥＤＮＡ結合ドメインを欠失させるか、別のタンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメインで置換することである（ＬｅｘＡ−ＨＳＦ１キメラについては、既報（ズオら（Zuo，J．et al.）、1995参照）。単一のＨＳＥＤＮＡ結合ドメインは、せいぜいＨＳＥ配列と弱く結合しうるにすぎない。高親和性ＤＮＡ結合には、少なくとも２つのＨＳＥＤＮＡ結合ドメインから成る多量体結合ドメインが必要である[ハリソンら（Harrison，C.J．et al．）、Scien ce，263:224-7(1994)]。したがって、オリゴマー化と合わせてＨＳＦの他の配列も含んでいるがＨＳＥＤＮＡ結合ドメインは含まないｍｕｔＨＳＦが十分量で細胞に導入されれば、オリゴマー１個あたり１を越えない内在性ＨＳＦ(ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインを含む)分子から成る内在性因子とヘテロオリゴマーを形成するはずである。該ヘテロオリゴマーは、ＨＳＥＤＮＡとの効果的結合能力とｈｓｐ遺伝子活性化能力を欠いているであろう。ｈｓｐ合成のアップレギュレーションを行う用途を検討する場合、ｍｕｔＨＳＦは、調節領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基を突然変異(たとえば欠失、付加、置換)させたＨＳＦ（哺乳類、とくにヒトなどの脊椎動物のＨＳＦ１）分子をいう。ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインおよび３つの疎水性ドメインは保存されているため、他の脊椎動物ＨＳＦ１ならびに無脊椎動物由来のＨＳＦも、本発明の方法に用いることができる。いかなるＨＳＦにおいても、これらの領域の位置を容易に決定し、該ＨＳＦを活性化させる上で効果的な突然変異の配置に必要な座標を与えることができる。互いに遠い位置に離れた調節領域中の単一アミノ酸置換がＨＳＦ１を活性化するという知見から、この置換は調節領域の立体配置に影響を及ぼすこと、およびそのような立体配置の変化に伴いＨＳＦ１活性化が起きることが強く示唆される。調節領域における産生的立体配置変化は、調節領域内のアミノ酸置換および欠失によるだけでなく、調節領域における配列の挿入や調節領域外の配列の付加によっても、これを行うことができる。後者の操作によって活性化されたＨＳＦ１（またはＨＳＦ）分子も、本発明の範囲に含まれるものとする。さらに、ＨＳＦ１における転写活性化ドメインは、他の転写因子に由来する活性化ドメインと機能的に置換しうることが知られている[ニュートンら（Newton，E.M．et al．）、Mol．Cell Biol.，16:839-846(1996)]。最後に、因子をイン・ビトロで合成する実験において、疎水性反復配列３を除去すると、ＨＳＦ３がＤＮＡ結合性を示すようになることも示されている[ナカイとモリモト（Nakai，A．and Morimoto，R.I.）、Mol．Cell Biol.，13:1983-1997（1993）；ズオら（Zuo，J．et al.）、Mol．Cell Biol.，14:7557-68(1994)]。ｈｓｐのアップレギュレーションを必要とする用途においては、機能性ｍｕｔＨＳＦ分子は、最低限、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインとＨＳＦ由来オリゴマー化（三量体化）ドメイン（疎水性反復配列１）と核局在化ドメインとトランス活性化ドメインから成る。ｈｓｐのダウンレギュレーションを必要とする用途においては、機能性ｍｕｔＨＳＦ分子は、機能性ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインが存在しないという点以外は、正作用性ｍｕｔＨＳＦと同じエレメントを含んでいてよい。負作用性ｍｕｔＨＳＦは、最低限、ＨＳＦの適当なオリゴマー化ドメインから成る。ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインは、様々な原料から得ることができる。たとえば、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインは、ヒトＨＳＦ１などあらゆるＨＳＦから得ることができる。また、ＨＳＥＤＮＡ結合ドメインは、ストレス誘導性ｈｓｐ遺伝子（ＨＳＦ、ＨＳＦ１、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ９０）のプロモーターから得ることができる。また、オリゴマー化（三量体化）ドメインは、様々な原料から得ることもできる。例えば、オリゴマー化ドメインは、ヒトＨＳＦ１等のいかなるＨＳＦからも得ることができる。本発明のｍｕｔＨＳＦに組み込んで使用するための核局在化シグナルは、正作用性ｍｕｔＨＳＦを用いる態様においては、核局在化シグナルが核ターゲット細胞への正作用性または負作用性ＨＳＦの侵入をもたらすのに適している場合に限り、転写因子または核タンパク質などに由来するものなど適当な原料から得ることができる。核局在化シグナルは、たとえばＳＶ４０コンセンサス核局在化シグナル(ＮＬＳ)上に形成させるなどして、合成的に調製することもできる。本発明のｍｕｔＨＳＦに組み込んで使用するための転写活性化ドメインは、ウイルスタンパク質であるＶＰ１６またはその他の転写因子などの適当な原料から得ることができる。あるいは、トランス活性化ドメインが機能性を示す(すなわち単数または複数の内在性ｈｓｐ遺伝子の活性化を引き起こして、内在性ｈｓｐの発現促進をもたらすのに十分である)場合に、ランダム配列をスクリーニングに付して、機能性活性化ドメインを探索することによって得てもよいし、合成的に調製してもよい。ｍｕｔＨＳＦ分子は、転写因子機能を妨害しない限り、リンカー配列など通常はＨＳＦとは無関係の他のタンパク質配列を含んでいてもよい。ｍｕｔＨＳＦ遺伝子は、細胞への直接的注射によるか、リン酸カルシウム沈殿を含むトランスフェクト操作によるか、リポフェクションすなわちリポゾームによるか、エレクトロポーレーションによるか、粒子銃によるか、受容体介在取り込みによるかして送達されるＤＮＡまたはＲＮＡベクター（たとえばウイルス、レトロウイルス、または哺乳類のベクター）を介して、様々なアプローチによって送達させることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に導入することができる方法であれば、どのような送達方法でも利用することができる。遺伝子治療の場合、ｍｕｔＨＳＦコード化配列を、プロモーター配列を含む適当なベクターに導入して、ｍｕｔＨＳＦの発現を起こさせる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、植物、または動物ウイルスベクターであってもよいし、宿主細胞において複製または維持されうるＤＮＡであってもよい。ｍｕｔＨＳＦを含むベクターは、たとえば注入、トランスフェクション、エレクトロポーレーション、リポフェクション、または感染など適当な方法により、宿主細胞に導入される。宿主細胞は、エクス・ビボで処理した後、個体に投与してもよい。あるいは、ベクターは特定の組織にターゲット化させてもよいし、個体に全身的に投与してもよい。あるいは、ｍｕｔＨＳＦはタンパク質治療剤として送達させてもよい。この場合のｍｕｔＨＳＦを調製するためには、通常の分子生物学的手法を用いてｍｕｔＨＳＦ遺伝子を適当なベクターに挿入し、生じた構築物を産生細胞に導入する。産生細胞は、たとえば大腸菌などの細菌菌体であってよい。また、真菌、動物、または植物細胞を用いてｍｕｔＨＳＦを製造することも可能である。ベクターまたはウイルスまたはその他のビヒクルと産生細胞の適当な組み合わせを選択する手段、ならびに遺伝子を該ベクターまたはビヒクルに挿入し、該ベクターまたはビヒクルを産生細胞に導入し、ｍｕｔＨＳＦ発現を起こさせる手段は、当該分野に熟練せる者にとって自明である。このようにして製造されたｍｕｔＨＳＦは、選択された産生細胞とは無関係に、ＤＮＡ結合性三量体構造を形成する。したがって、移動度シフトアッセイなどのＨＳＥＤＮＡ結合アッセイによって最も簡便に産生状況をモニターすることができる。あるいは、産生細胞から抽出した試料を、特異的抗ＨＳＦ抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけることによって、モニタリングを行ってもよい。産生細胞と近縁の生物に由来するｍｕｔＨＳＦを発現させて免疫学的交叉反応性を観察する場合、サブユニットの分子量の差に基づき（通常はｍｕｔＨＳＦを生成させるために除去される特定の配列の長さ分だけｍｕｔＨＳＦの方が内在性ＨＳＦよりも分子量が低い）、該ｍｕｔＨＳＦを内在性ＨＳＦと区別することができる。ｍｕｔＨＳＦは、従来の生化学的方法によるか、ＨＳＥＤＮＡアフィニティークロマトグラフィー[ゴールデンベルグら（Goldenberg，C.J．et al．）、J．Biol．Chem.，263:19734-39(1988)]によるか、これらの方法を組み合わせた方法により精製することができる。細菌以外の細胞を産生細胞として用いる場合、ｍｕｔＨＳＦから分離することが困難な場合がある不定的に活性化された内在性ＨＳＦによって、調製物が汚染されることがある。分離を行うための生化学的方法を開発してもよいが、ｍｕｔＨＳＦをアミノ末端タグ付与タンパク質として産生させる方が簡便である。ポリヒスチジンタグおよびＦｌａｇタグ付与ｍｕｔＨＳＦは、ＤＮＡ結合性三量体タンパク質として産生されることが判明している。タグの付加により、タグ特異的アフィニティークロマトグラフィーによる精製が可能になる。タグは、後で除去してもよいし、除去しなくてもよい。精製ｍｕｔＨＳＦの転写活性は、アフリカツメガエル卵母細胞へのｈｓｐプロモーター主導リポーター遺伝子の共注入（核内）など様々な手段により試験することができる。転写活性は、リポーター遺伝子活性として評価することができる。精製ｍｕｔＨＳＦは、タンパク質を単数または複数の細胞、組織、または生物への導入に適した方法により、単数または複数のターゲット細胞、組織、または生物に送達することができる。例えば、ｍｕｔＨＳＦを送達用リポソーム内にパッケージングしてもよい。次いで、ｍｕｔＨＳＦを、宿主細胞への該タンパク質の導入に適した処方に組み入れてもよい。宿主細胞は、エクス・ビボで処方による処理を行うことができる。あるいは、タンパク質処方は、特定の組織に導入してもよいし、全身的に投与してもよい。以下の実施例においてさらに詳細に説明するように、本出願人は、ｍｕｔＨＳＦが内在性ｈｓｐ遺伝子を誘導することを示した(実施例２参照)。すなわち、通常のサブクローニング操作を用いて、ｍｕｔＨＳＦのｃＤＮＡをアデノウイルス５ベクターに導入した。これらの実験においては、残基２０３〜３１５をコードする領域を欠くｈＨＳＦ１遺伝子を用いた。ヒトＨｅＬａ細胞またはＭＲＣ５細胞にｍｕｔＨＳＦウイルスを感染させたところ、抗ｈＨＳＦ１ウエスタンブロットで示されるｍｕｔＨＳＦ産生が起きた。それぞれの特異的抗ｈｓｐ抗体をプローブとするウエスタンブロットにより、ｈｓｐ９０、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０（ｈｓｐ７２ともいう）、ｈｓｐ６０、およびｈｓｐ２５（ｈｓｐ２７ともいう）のかなりのアップレギュレーションが、感染後１５ないし３６時間目の様々な時点で検出された。３Ｈ−ロイシンによる感染細胞パルス標識化後に、ＳＤＳ− ＰＡＧＥおよびフルオログラフィーを行うことによっても、アップレギュレーションが起きたことが証明された。ウイルスビヒクルに単独感染させた細胞では、ｈｓｐ発現の増大は検出されなかった。同じｍｕｔＨＳＦ遺伝子をサイトメガロウイルスプロモーターに結合させたものを、市販のLipofectamine^TM試薬を用いるリポフェクションにより細胞に導入したところ、同様の結果が得られた。これらの実験においては、細胞を、ｍｕｔＨＳＦ遺伝子ならびに発現可能な形で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子で同時トランスフェクトさせた。十分にトランスフェクトされた細胞を、ＧＦＰの蛍光を基準とする蛍光活性化細胞選別法(ＦＡＣＳ)によって単離した。選別された蛍光(トランスフェクト)細胞は、選別された非蛍光細胞と比べて、ｈｓｐ７０とｈｓｐ９０のレベルが上昇していることが示された。これらの実験においては、他のｈｓｐのアッセイは行わなかった。数種類のげっ歯類細胞系を用いて同様の実験を行ったところ、ヒト細胞タイプのものとは異なるｈｓｐ過剰発現パターンが見られた。ｈｓｐ９０および程度は低いが明らかにｈｓｐ２５が過剰発現されており、ｈｓｐ７０の合成速度はわずかに上昇したに過ぎなかった。ｍｕｔＨＳＦによるｈｓｐ遺伝子発現のアップレギュレーションは、ｍｕｔＨＳＦの非存在下で起きるものよりもｈｓｐの産生を増大させ(産生促進)、産生されたｈｓｐは、ｈｓｐ発現がアップレギュレートされている細胞に保護状態をもたらす。ｍｕｔＨＳＦの作用の結果として発現されたｈｓｐは、ｈｓｐが通常持っていると思われる保護作用を提供するということが、実施例３で説明する実験によって証明される。実施例３で説明する研究で、保護された表現型の３つの側面、すなわちストレス誘導性細胞死抵抗性、ストレス誘導性細胞骨格構造破壊抵抗性、および細胞周期停止抵抗性が評価された。すなわち、上記側面のうち最初の２つについて調べるために、ＨｅＬａ−ＣＡＴ細胞（ＨｅＬａ細胞にヒトｈｓｐ７０プロモーターの制御を受けるＣＡＴ遺伝子を組み込んだもの）を、ｍｕｔＨＳＦウイルスまたは対照であるウイルスビヒクル単独に感染させた。次いで、細胞を２０分間にわたり４９℃の熱ショックに曝露した。対照温度(３７℃)にて一夜インキュベートした後、生体染色(トリパンブルー)で染まらない細胞を計数することにより、細胞生存率を求めた。未感染細胞またはウイルスビヒクル感染細胞は４０％の生存率を示した。ｍｕｔＨＳＦウイルス感染細胞は、高温による細胞死から１００％保護された。細胞をより低温に曝露しても、急速細胞死をもたらさないが、組織培養基質からの可逆的脱離を引き起こす。この脱離を、温度による細胞骨格構造崩壊の目安とした。４７℃の高温に２０分間曝露したところ、約８５％の細胞が組織培養皿から脱離した。ウイルスビヒクルで感染させておいた細胞の場合も同様であった。一方、ｍｕｔＨＳＦウイルスを感染させた細胞では２５％しか脱離しなかった。すなわち、ｍｕｔＨＳＦで誘導したｈｓｐ過剰発現は、高温細胞死および細胞骨格崩壊から細胞を保護した。ＨｅＬａ−ＣＡＴ細胞を４３℃の熱ショックに１時間曝露し、３７℃で１５時間インキュベートしたところ、大部分の細胞がＧ２/Ｍ期に蓄積したことから、該細胞はＧ２/Ｍ期に周期を停止したことが判明した。この細胞周期停止は、ヨウ化プロピジウム染色細胞のフローサイトメトリーによって調べた。ｍｕｔＨＳＦによるｈｓｐ発現(促進発現)が、高温性細胞周期停止から細胞を保護するかどうかを決定するために、細胞を、ＣＭＶプロモーター結合ｍｕｔＨＳＦ遺伝子構築物とＧＦＰ構築物で同時トランスフェクトさせるか、ＧＦＰ構築物で単独トランスフェクトさせた。本明細書の説明に従い熱処理と後保温を行った後、ＧＦＰ蛍光を基準として細胞を選別した。陽性と判定された細胞(ＧＦＰとｍｕｔＨＳＦ、または対照実験においてはＧＦＰを含む)および陰性と判定された細胞をヨウ化プロピジウム染色し、フローサイトメトリーにかけてＤＮＡ含有量を測定するか、ウエスタンブロットに用いて、ｍｕｔＨＳＦおよびｈｓｐ７０の発現を検出した。その結果、ＧＦＰのみを含む細胞は、未トランスフェクト細胞と同様にＧ２/Ｍ期に周期停止を受けることが明らかになった。一方、ＧＦＰとｍｕｔＨＳＦを含みｈｓｐ７０を発現する細胞の場合は、低率のものが周期を停止したものと思われた。すなわち、ｍｕｔＨＳＦによって誘導されたｈｓｐの発現は、高温誘導性細胞周期停止から細胞を保護するものと思われた。以上まとめると、実施例２および３に示した実験から、ｍｕｔＨＳＦをヒト細胞に導入すると、分析した主なｈｓｐ、すなわちｈｓｐ９０、ｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ６０、およびｈｓｐ２５のいずれにも対して劇的なアップレギュレーションをもたらすことが明らかになった。このアップレギュレーションは、熱による細胞死、熱誘導性細胞骨格崩壊、および熱誘導性細胞周期停止に対して抵抗性を示すようになる細胞保護(部分的または完全)をもたらす。過去２０年間に行われた数多くの試験の結果、細胞、組織、器官、または生物を熱で条件づけ処理すると、その後の過酷な高温処理による高温障害に対して抵抗性を示すようになること、すなわち該細胞、組織、器官、および生物が保護表現型を獲得することが判明している。保護表現型の獲得は、ｈｓｐの蓄積と相関する[レビューは、パーセルとリンドクイスト（Parsell，D.A．and Lindquist， S．）、Annu．Rev．Genet.，27:437-96（1993）参照]。さらに、エタノールや亜ヒ酸ナトリウムなどの薬剤による細胞の前処理も、細胞を熱による細胞死に対して抵抗性にする同様の効果がある[リー（Li，G.C.）、J．Cell Physiol.，115:1 16-122(1983)]。これらの薬剤は、ｈｓｐの蓄積を誘導することも示されている。その上、ｈｓｐ７０遺伝子を用いたトランスフェクション実験で、熱条件づけの高温細胞死保護効果の少なくとも一部は、ｈｓｐ７０の過剰発現によるものであると考えられる。実施例３に示した熱性細胞死からの保護に関する実験で、すべてのｈｓｐのｍｕｔＨＳＦアップレギュレーションによるｈｓｐのアップレギュレーションが、ｈｓｐ７０遺伝子単独のアップレギュレーションによって得られるものと同様の保護作用をもたらすことが明らかになった。ｈｓｐ２５遺伝子を用いたトランスフクション実験で、ｈｓｐ２５は、熱誘導性細胞骨格崩壊を緩和することが示されている[ラボイエら（Lavoie，J.N．et al．）、J．Biol ．Chem.，268:3420-9(1993)]。実施例３で説明する細胞の熱誘導性脱離に関する実験で、すべてのｈｓｐのアップレギュレーションが細胞骨格統合性を保護することが示された。すなわち、ｍｕｔＨＳＦが介在するすべてのｈｓｐの発現は、とくにｈｓｐ７０およびｈｓｐ２５をはじめとする個々のｈｓｐの発現によって緩和されうる障害から保護する働きを示す。ｍｕｔＨＳＦによって誘導されるすべてのｈｓｐの蓄積は、１つのｈｓｐまたは複数のｈｓｐを組み合わせたものの過剰発現が有効であることが判明している状況において、保護作用を示す。本発明においては、ｍｕｔＨＳＦを用いて、真核生物とくに哺乳類さらに具体的にはヒトの細胞におけるｈｓｐ遺伝子発現を調節して、ｈｓｐ遺伝子発現の化学調節物質(誘導剤および阻害剤)の代替とする。ｈｓｐ発現の調節は、個体から採取され、ｍｕｔＨＳＦまたはｍｕｔＨＳＦをコードするＤＮＡの導入による操作を受け、ｈｓｐ発現を促進またはダウンレギュレートする血球または骨髄細胞などの細胞中で、エクス・ビボで起こりうる。ｈｓｐ産生を調節する細胞は、その採取元である個体に導入し戻してもよいし、ｈｓｐ産生の促進が望まれる個体など他の適当なまたは適合性のある個体に導入してもよい。あるいは、ｈｓｐ産生の調節は、ｈｓｐの調節を必要とする個体に、発現可能な形のｍｕｔＨＳＦコード化外来性ＤＮＡまたはｍｕｔＨＳＦタンパク質を、該ＤＮＡまたはタンパク質がｈｓｐ産生を変化(たとえば促進または低減)させようとする細胞への侵入に十分な量で、かつそれに適した組成物として、導入するなどして、所望効果（たとえばストレスまたはその他の好ましくない状態からの保護、または特定の細胞の免疫認識ターゲット化またはストレスによる細胞死）を得るように、イン・ビボで実施することもできる。ｈｓｐ合成の調節は、ネイティブでないタンパク質の細胞内濃度と関係があり、実際、その濃度によって制御されている[アナンタンら（Ananthan，J．et al ．）、Science，232:522-524(1986)]。ｈｓｐ合成の誘導物質は、細胞タンパク質の変性を引き起こしうるため、ｈｓｐ発現を刺激するものと思われる[アナンタンら（Ananthan，J．et al．）、Science，232:522-524(1986)]。すなわち、ｈｓｐ合成は、細胞タンパク質の一部が変性される程度にまでストレスを受けている細胞に限って、化学誘導物質によって誘導される。ｈｓｐ遺伝子発現の阻害剤(たとえばＨ７、スタウロスポリン(staurosporine)、ＧＦ−Ｘ、およびカルホスチン（calphostin）などのある種のＳｅｒ/Ｔｈｒタンパク質キナーゼ阻害剤、およびケルセチン（quercetin）などのＴｙｒタンパク質キナーゼ阻害剤)も、おそらくは正常なシグナル伝達に対して強い影響を及ぼすために細胞傷害性を示す。ｍｕｔＨＳＦは、ｈｓｐ遺伝子発現の正常調節にバイパスを提供することが治療現場における唯一の効果であるという特化的機能を有するネイティブタンパク質であるため、ｍｕｔＨＳＦタンパク質として、またはｍｕｔＨＳＦコード化ＤＮＡとして投与されたｍｕｔＨＳＦによるｈｓｐ発現の調節は、ある種の医学的状況において許容できないこれらの交絡因子の影響を受けない。したがって、これらの状況においては、細胞傷害性化学誘導物質や阻害剤の投与によるのではなく、細胞にｍｕｔＨＳＦ（またはｍｕｔＨＳＦコード化ＤＮＡ）を導入することにより、ｈｓｐ合成を調節するのが好ましい。１つ以上のｈｓｐまたは１つ以上のｈｓｐコード遺伝子が細胞に導入されるｈｓｐ治療またはｈｓｐ遺伝子治療によって、上記利点の一部を得ることができる。ｈｓｐ調節がもたらす多くの好ましい作用はｈｓｐ７０によるものと考えられるが、一部の作用は他のｈｓｐによるものと思われる。たとえば、虚血および再灌流障害からＣＮＳを保護する作用の一部はｈｓｐ２５のアップレギュレーションにより得られる可能性があることに対する評価が高まりつつあり、ｈｓｐ２５は薬剤抵抗性、酸化性ストレス抵抗性、および細胞骨格保護に関与していることが示されている。すなわち、ｍｕｔＨＳＦ療法ではすべてのｈｓｐのレベルを同時に調節できるため、この療法は一般にｈｓｐ療法よりも有用性が高いはずである。正作用性ｍｕｔＨＳＦによるｈｓｐ合成のアップレギュレーションが有益である用途の具体例としては、療法のターゲットではない細胞、組織、および器官を、化学療法剤の細胞傷害副作用からシールドすることが望まれる化学療法などが挙げられる。これらの用途は、以下の知見に基づき、可能になる。すなわち、機能性ｈｓｐ２５遺伝子の導入によりヒト精巣腫瘍細胞においてｈｓｐ２５を過剰発現させたところ、熱、シスプラチン、およびアントラサイクリンであるドキソルビシンに対する細胞の抵抗性の増大をもたらしたという[リチャーズら(Richar ds，E.H．et al.)、Cancer Res.，55:2446-51(1996)]。さらに、ヒト乳癌細胞系におけるｈｓｐ２５の発現は、上記薬剤ドキソルビシンおよび熱に対する抵抗性と相関していることが判明した[オエステライヒら(Oesterreich，S．et al.)、C ancer Res.，53:4443-4448(1993)]。過少発現している乳癌細胞系をｈｓｐ２５遺伝子でトランスフェクトしたところ、ドキソルビシンに対して抵抗性を示すようになったという[マハビら(Mahvi，D.M．et al.)、Endocrine，4:269-275(1996 )]。また、ｈｓｐ７０の過剰発現は、ドキソルビシンにより誘導されるＧ２/Ｍ細胞周期停止を克服することが報告されている[カールセダーら(Karlseder，J． et al.)、BBRC，220:153-9(1996)]。精巣癌および膀胱癌細胞に対して熱的条件づけを行ったところ、ドキソルビシンに対する抵抗性は増大したが、シスプラチンに対する抵抗性は増大しなかったという[リチャーズら(Richards，E.H．et al .)、Int．J．Oncol.，8:1265-71(1996)]。さらに、熱抵抗性を有するものを選択したチャイニーズハムスター繊維芽細胞において、アドリアマイシンに対する交叉抵抗性が認められている[ワルナーとリー(Wallner，K．and L i，G.C.)、Oncol．Biol．Physiol.，12:829-33(1986)]。最後に、ＷＥＨＩ−Ｓ線維肉腫細胞においてｈｓｐ７０を過剰発現させたところ、２つの新規抗癌剤ゲムシタビン（gemcitabine）とトポテカン（topotecan）に対して抵抗性になったという[スリウツら(Sliutz，G．et al.)、Br．J．Cancer，74:172-7（1996）]。正作用性ｍｕｔＨＳＦは、細胞、組織、および器官を、高温障害、酸化性障害、有毒化学物質曝露による障害、炎症性サイトカイン曝露による障害、敗血症による障害、およびＵＶＢ光による障害から保護する目的にも使用することができる。以下の知見は、これらの用途の根拠を与えるものである。ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０遺伝子を用いたトランスフェクション実験で、ｈｓｐ９０またはｈｓｐ７０のいずれかが過剰発現されると、神経細胞を熱的細胞死から保護することが明らかになった[マイルホスら(Mailhos，C．et al.)、J．Neurochem.，63:178 7-95(1994)]。ヒトｈｓｐ７０遺伝子でトランスフェクトさせたラット細胞[リウら(Liu，R.Y．et al.)、Cancer Res.，52:3667-73(1992)]およびヒトｈｓｐ７０を過剰発現するラット細胞系[リーら（Li，L．et al．）、Exp．Cell Res.，217 :460-8；リーら（Li，G.C．et al．）、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，89:2036 -40(1992)]は、それぞれのナイーブな細胞系と比較して、転写、翻訳の熱誘導性阻害および熱的細胞死に対する抵抗性が増大していることが判明した。致死量未満の熱（ｈｓｐ合成を誘導する）または致死量未満の酸化性ストレス物質過酸化水素に対して条件づけたチャイニーズハムスター繊維芽細胞は、酸化剤ストレスに対する抵抗性を増大させたという[スピッツら(Spitz，D.R．et al. )、J．Cell Physiol.，131:364-73(1987)]。酸化ストレスを誘導するスルフヒドリル試薬であるシステアミン（cysteamine）に曝露させたチャイニーズハムスター繊維芽細胞は、耐熱性を示すようになり、ｈｓｐの発現レベルが上昇する[イッセルズら(Issels，R.D．et al.)、Cancer Res.，47:2268-74(1987)]。さらに、マウスをある用量のアンフェタミンを用いて熱処理すると、ブロモベンゼンおよびアセトアミノフェンから肝臓を保護する。ＴＮＦ感受性ＷＥＨＩ−Ｓ細胞におけるヒトｈｓｐ７０遺伝子を発現させることで、過剰なｈｓｐ７０の発現が、該細胞をＴＮＦ細胞傷害性に対して抵抗性にすることが示されている[ジャアトテラら（Jaattela，M．et al．）、EMBO J.， 11:3507-12(1992)]。別の試験では、マウス細胞培養アッセイにおいて、ｈｓｐ２５の過剰発現は、上昇するとＴＮＦアルファおよび酸化性ストレス物質から細胞を保護する上で重要な意味を持つグルタチオンレベルを上昇させることが明らかにされている[メーヘレンら(Mehlen，P．et al.)、EMBO J.，15:2695-706(199 6)]。培養ネズミ細胞を用いた第２の試験で、これらの知見が確認されている[ワングら(Wan遺伝子．et al.)、J．Immunotherap.，19:9-20(1996)]。ＴＮＦは重要な敗血症メディエーターである。ホッチキスら（Hotchkiss et a l.）は、ｈｓｐのアップレギュレーションが、動物モデルの全身において敗血症からの保護作用を示しうるかどうかを調べるために、マウスを一過性の全身高温状態に付し、この前処理がマウスをエンドトキシンのチャレンジから保護することを見出した[ホッチキスら（Hotchkiss，R．et al.）、Am．J．Physiol.，265: 1447-57(1993)]。この保護作用は、ｈｓｐの発現と相関していた。ラットの腹腔内敗血症および盲腸結紮および穿孔によって生じた敗血症性急性肺傷害のラットモデルを用いて研究したビラーら(Villar et al.)も、同様の結論に達している[ ビラーら(Villar，J．et al.)、Crit．Care Med.，22:914-21(1994)]。おもしろいことに、肺におけるｈｓｐ７２誘導物質である亜ヒ酸ナトリウムは、同じ肺敗血症モデルの死亡率低下に有効であった[リベイロら(Ribeiro，S.P．et al.)、C rit．Care Med.，22:922-9(1994)]。敗血症の特徴の１つに病的血管拡張があるが、一酸化窒素（ＮＯ）がこの過程に関与していると考えられている。スチュワートら（Stewart et al.）[スチュワートら(Stewart，T.E．et al.)、Am．J．Re spir．Crit．Care Med.，151:713-8(1995)]は、ラット肺敗血症モデルを用いて、敗血症動物は、呼気中ＮＯ濃度が大幅に上昇していることを示した。以下に説明するように、ＮＯ産生はｈｓｐとくにｈｓｐ７２によって阻害される。上皮癌細胞系Ａ４３１のＵＶＢ抵抗性は、熱条件づけ処理によって有意に増大させることができる。細胞をｈｓｐ７２のアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは熱ショック応答阻害剤であるケルセチン[ホソカワら(Hosokawa，N．et al． )、Cell Struct．Func.，15:393-401(1990)]に曝露させると、細胞がＵＶＢ障害に対して感作される[トラウティンガーら(Trautinger，F．et al.)、J．Invest ．Dermatol.，105:160-2(1995)]。ネズミ線維肉腫細胞(ＷＥＨＩ−Ｓ)におけるｈｓｐ７０の過剰発現は、ＵＶＢ光曝露を受けたときの生存率を増大させる。ｈｓｐ７２は、ＵＶ照射によって引き起こされる酸化ストレスを緩和するものと思われる。おもしろいことに、ｈｓｐ７２はＩＬ１やＩＬ６などの前炎症サイトカインの放出をダウンレギュレートする働きもある[シモンら(Simon，M.M．et al. )、J．Clin．Invest.，95:926-33(1995)]。通常、血行遮断または重度の急性または慢性血行障害によって起き、虚血事象後の再潅流時に引き起こされる酸化性障害によって悪化する虚血障害は、大きな医学的問題の１つである。この種の問題は、心不全の際に急性的に起きたり、特定の心臓状態において慢性的に起きたりする。また、とくに高齢患者の場合の外科手術に伴い起こることもある。血管形成術の際に引き起こされ、炎症反応や頻回の再狭窄をもたらす障害も関係する。卒中、外傷、およびおそらくはある種の慢性病態も脳の虚血を引き起こす。大動脈や脳の手術では、虚血性合併症も起きる。その他、大動脈、血管系、ならびに腎臓、肝臓、腸管など様々な組織も、傷害や外科手術に伴い虚血障害に対して感受性になる。以下に示す知見に基づき、正作用性ｍｕｔＨＳＦを投与すれば、虚血および再潅流事象の障害作用を緩和する上で有益である。虚血は様々な様相を呈する事象である。細胞レベルでは、酸素欠乏およびその他の組織環境の変化による直接的障害がある。この過程は、虚血をシミュレートする細胞培養モデルにおいて調べることができる。そのようなモデルにおいて、ｈｓｐとくにｈｓｐ７０は直接的虚血障害からの保護作用を示すことが明らかにされている[メストリルら(Mestril，R．et al.)、J．Clin．Invest.，93:759-67 (1994)]。ハービマイシンＡは、心筋細胞においてｈｓｐ７２を特異的に誘導して細胞保護をもたらすことが報告されている[モリスら(Morris，S.D．et al．) 、Circulation，92:1-652(1995)]。虚血のもう一つの特徴は強い炎症応答である。この場合もやはり、ｈｓｐとくにｈｓｐ７０の過剰発現は、この応答の惹起とそれによって引き起こされる障害の両者を緩和する。ｈｓｐ過剰発現による炎症応答およびその影響の緩和については、様々な組織培養モデルにおいて調べられている。熱的条件づけ処理ならびにトランスフェクト遺伝子由来ｈｓｐ７０の過剰発現は、ラット膵島細胞(ラットインスリノーマ細胞系ＲＩＮｍ５Ｆ)をＮＯ毒性から保護する[ベルマンら(Bel lmann，K．et al.)、FEBS Lett.，391:185-8(1996)]。ネイティブでないタンパク質の蓄積がｈｓｐ合成を誘導することが古くから知られている[アナンタンら（Ananthan，J．et al．）、Science，232:522-524(1986)]。プロテアソーム（p roteasome）経路が阻害されると、折りたたまれていないタンパク質が蓄積するものと予想される。実際、特異的プロテアソーム阻害剤を細胞に加えたところ、ｈｓｐ７２転写のアップレギュレーションが起きたことが観察されている[ズホウら(Zhou，M．et al.)、J．Biol．Chem.，271:24769-75(1996)]。最近、プロテアソーム阻害剤がＮＦκＢ活性化およびマクロファージにおけるＮＯシンターゼの誘導を妨害することが報告されている[グリスカバゲら(Griscavage，J.M．et al.)、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，93:3308-12(1996)]。上記２つの知見を総合すると、ｈｓｐ（とくにｈｓｐ７２の可能性が最も高い）は、ＮＯシンターゼ発現、およびその他ＮＦκＢ活性化に依存する免疫応答の様々な特徴を調節する転写因子ＮＦκＢの活性化をブロックすることが示唆される。フェインステインら(Feinstein et al.)は、熱ショックまたはｈｓｐ７０遺伝子のトランスフェクションが脳のグリア細胞におけるＮＯシンターゼ発現を阻害することをより直接的に示した。ｈｓｐ７０が、ＬＰＳの核転位を阻害することにより、該因子または前炎症サイトカインによるＮＦκＢの活性化を阻害することの証拠が得られている[フェインステインら(Feinstein，D.L．et al.)、J．Biol．Chem .，271:17724-32(1996)]。ＴＮＦ感受性ＷＥＨＩ−Ｓ細胞においてヒトｈｓｐ７０遺伝子を発現させることにより、過剰なｈｓｐ７０の発現が、細胞をＴＮＦ細胞傷害性に対して抵抗性にすることが示されている[ジャアトテラら(Jaattela， M．et al.)、EMBO J.，11:3507-12(1992)]。この抵抗性は、ｈｓｐ７０のレベルが上昇すると、ホスホリパーゼＡ２の活性化が妨害されるという知見[ジャアトテラら(Jaattela，M．et al.)、J．Immunol.，151:4286-94(1993)]によって説明することができる。別の試験では、マウス細胞培養アッセイにおいて、ｈｓｐ２５の過剰発現が、ＴＮＦアルファおよび酸化性ストレス物質からの保護に重要な意味を持つグルタチオンレベルを上昇させることが明らかにされている[メーヘレンら(Mehlen，P．et al.)、EMBO J.，15:2695-706(1996)]。虚血脳では、グルタミン酸塩の放出と再吸収不能も起きて、これが神経細胞障害につながる。グルタミン酸塩は非ＮＭＤＡ受容体を刺激し、膜の脱分極ならびにナトリウムとカルシウムの透過性を引き起こす。その結果、ＮＯシンターゼ発現が増大し、ＮＯ濃度が有毒水準にまで上昇する。グリリら(Grilli et al.)は、最近、アスピリンとサリチル酸ナトリウムがグルタミン酸塩誘導性細胞死から神経細胞を保護することを報告している[グリリら(Grilli，M．et al.)、1996]。サリチル酸塩は通常、ＨＳＦのＤＮＡ結合能力を誘導するだけであるが[ジュリビチら(Jurivich， D.A．et al.)、J．Biol．Chem.，270:24489-95(1995)]、ＨＳＦリン酸化を増大させる薬剤とサリチル酸塩を組み合わせると、該因子を完全に活性化させてｈｓｐ遺伝子発現を刺激することができる[クシアとボエルミー(Xia，W．and Voellm y，R.)、J．Biol．Chem.，272:4094-4102(1997)]。したがって、サリチル酸塩をグルタミン酸塩による受容体活性化と組み合わせると、ＨＳＦを活性化させ、ｈｓｐの蓄積が引き起こされると考えるのが妥当である。この解釈は、サリチル酸塩はＮＦκＢ活性化を防止するというグリリら(Grilli et a l.)の報告知見、およびＮＦκＢ活性化はｈｓｐ７０によってブロックされるという以前の知見と一致する。したがって、ｈｓｐの過剰発現は、虚血脳におけるグルタミン酸塩毒性を緩和する可能性もある。炎症過程に有意に寄与していることが知られているさらに別の虚血の特徴は、虚血事象に続く組織および器官の再潅流時に引き起こされる障害である。再潅流は、活性酸素種の蓄積を引き起こす。すなわち、酸化性ストレスを誘導する。末梢血リンパ球を過酸化水素またはキサンチンオキシダーゼとヒポキサンチンに曝露させて、フリーラジカルを生成させると、ヘムオキシゲナーゼＩを含む一連のｈｓｐが誘導されること、および細胞をその後の活性酸素種によるチャレンジに耐えるようにすることが報告されている。熱ショック前処理は、同様の保護作用を示した[マリニら(Marini，M．et al.)、Int．J．Radiat．Biol.，70:337-350(1996)]。ｈｓｐは組織および器官における虚血障害からの保護能力を有することが、熱的条件づけ実験[リチャードら(Richard，V．et al.)、Fund．Clin．Pharmacol．，10:409-15(1996)においてレビューされている]ならびにトランスジェニック動物を用いた試験によって証明されている。ｈｓｐ７０を過剰発現するトランスジェニックマウスの心臓を虚血事象に付した。虚血事象後３０分間にわたり再潅流を行った後、心臓の虚血外傷回復度を判定した。収縮力およびクレアチンキナーゼ放出量の測定値を基準に判定したところ、トランスジェニックマウスの心臓は、非トランスジェニック動物の心臓と比べて、有意な回復改善を示していた[プルミエルら(Plumier，J.C．et al.)、J．Clin．Invest.，95:1854-60(1995)]。これらの結果は、やはりｈｓｐ７０トランスジーン発現マウスを用いた第２の同様の試験によって確認されている[マーべルら(Marber，M.S．et al.)、J．Clin ．Invest.，95:1446-56(1995)]。化学誘導剤による合目的的ｈｓｐ誘導も、移植に用いた器官を虚血障害および再灌流障害から保護することが判明している[ペルドリゼット(Perdrizet，G.A.)、New Horiz.，3:312-20(1995)]。すなわち、本発明は、正作用性ＨＳＦが個体に導入されてｈｓｐ合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体におけるｈｓｐの合成を促進する方法に関する。別の態様においては、本発明は、正作用性ｍｕｔＨＳＦが、保護状態（たとえば個体の細胞を化学療法、ＵＶＢ、敗血症、虚血から保護する）を必要としている個体の細胞に投与され、ｈｓｐ合成を促進することで、保護状態を作り出すのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体の細胞に保護状態を誘導する方法に関する。正作用性ｍｕｔＨＳＦは、癌の免疫療法にも適用することができる。ｈｓｐは非常に高度に保存されているタンパク質であり、広範囲の病原体および自己免疫疾患における優勢抗原であることが知られている[ヤング（Young，R.A．）、Ann u．Rev．Immunol.，8:401-420(1990)]。ｈｓｐ９０は、古くからネズミ肉腫の腫瘍拒絶抗原であるとされている[ウルリッチら（Ullrich，S.J．et al.）、Proc ．Natl．Acad．Sci.，USA，83:3121(1986)]。ストレス誘導性ｈｓｐ７０は、Ｈ- ｒａｓ発癌遺伝子形質転換ラット線維肉腫系の細胞表面発現腫瘍関連抗原であることが示されている。ペアレント細胞ではなく腫瘍細胞に対するＣＤ４-ＣＤ８- Ｔ細胞の細胞傷害性は、抗ｈｓｐ７０抗体によって中和することができたという [タムラら（Tamura，Y．et al．）、J．Immunol.，151:5516-24(1993)]。同じ研究者らは、後から発表した論文中で、上記細胞傷害性反応は、ｈｓｐ７０とペプチドの複合体に対して引き起こされるらしいと報告している[タカシマら（Takas hima et al.）、J．Immunol.，157:3391-5(1996)]。ヒト肉腫を用いた試験でも、形質転換細胞の細胞表面には誘導性ｈｓｐ７０分子が存在するが、正常細胞には存在しないことが示されている[ムルソフら（Multhoff，G．et al．）、Blood ，86:1374-82(1995)]。ヒト・ガンマデルタＴ細胞は、ｈｓｐ７０ファミリーの１メンバーであるｇｒｐ７５と関連して、ヒトリンパ芽球様細胞系上の特定の（腫瘍）抗原を認識するが、古典的ＭＨＣ分子とは関連しない。これらの観察から、ｈｓｐ７０タンパク質は、Ｔ細胞認識および抗原提示において重要な役目を果たしていることが示唆される[キムら（Kim，H.J．et al.)、J．Imm unol.，154:1614-23(1995)]。これらの知見を総合すると、ｈｓｐは、哺乳類腫瘍細胞の表面上で発現させることができ、細胞溶解性の免疫反応のターゲットとして利用できることが明確に示される。腫瘍細胞においてｈｓｐのアップレギュレーションを正確に行うと、その免疫原性が増大し、ｈｓｐのアップレギュレーションに基づく癌治療アプローチの根拠が得られることを示すために、いくつかの試験が行われている。ムルソフら（ Multhoff et al．）は、熱ショックと抗ｈｓｐ７０抗体ブロックを組み合わせてｈｓｐ７２の発現をアップレギュレートすることで、ある種の細胞系の表面におけるｈｓｐ７０発現とＩＬ２刺激ＣＤ３ナチュラルキラー細胞への感受性増大の相関を見出すことに成功した。この試験をはじめとしてｈｓｐ７０の表面発現を認めたという試験では、ただ１つの表面エレメントの抗ｈｓｐ７０抗体認識だけが示されたということが注目される。このエレメントは、全長ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７０断片、またはｈｓｐ７０配列に由来するペプチドである可能性がある。メノレットら[メノレットら（Menoret，A．et al.）、J．Immunol.，155:740-747( 1995)]は、ラット大腸癌モデルを用いて、同一腫瘍から複数細胞クローンを単離し、免疫適格性同系動物におけるクローンの腫瘍原性が、誘導ｈｓｐ７０を発現する能力と相関することを見出した。致死量未満の熱ショック処理を反復することにより、高度腫瘍原性クローンから１つの変異体が得られたが、このものは、ｈｓｐ７０合成能力が増大し腫瘍原性が低下していた。逆に、部分的免疫抑制状態にあるラットにおけるイン・ビボ成長によって退行クローンから得られた１つの変異体は、腫瘍原性を獲得し、誘導ｈｓｐ７０合成能力を失っていた。この試験において、ｈｓｐ７０は細胞表面上には検出されなかった。血液リンパ球の新鮮単離自己腫瘍細胞死滅能力があることが患者の予後の良さと強く関連しているため、自己腫瘍細胞死が癌患者における重要な予後因子となっている。ウエイら（Wei et al.）は、新鮮単離腫瘍細胞を短時間の熱ショック処理に付すと、自己血リンパ球による細胞溶解に対する感受性が増大することを見出している[ウエイら（Wei，Y．et al.）、Cancer Res.，56:1104-10(1996)]。ウエスタンブロット分析で、処理した腫瘍細胞の内部および表面において、ｈｓｐ７０の発現が増大することが明らかになった。血液リンパ球の細胞傷害性は、ターゲット腫瘍細胞を抗ｈｓｐ７０抗体で処理することによって阻害された。これらの知見から、腫瘍細胞におけるｈｓｐ(ｈｓｐ７０)のアップレギュレーションは免疫原性を増大させるため、免疫破壊に対する感受性も増大することが明白である。このようなアップレギュレーションは、タンパク質または遺伝子治療剤として腫瘍ターゲットに導入した正作用性ｍｕｔＨＳＦを介して行うことができる。すなわち、本発明は、正作用性ｍｕｔＨＳＦを個体の腫瘍細胞に導入するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することで該腫瘍細胞におけるｈｓｐ合成を促進することを含む、該腫瘍細胞の免疫原性を増加させる方法に関する。ｈｓｐ遺伝子治療を用いた実験癌に対する免疫化とその退行が行われており、癌の治療におけるｍｕｔＨＳＦ遺伝子治療アプローチを利用する根拠となっている。マイコバクテリアｈｓｐ６０遺伝子が、レトロウイルス転移法により、腫瘍原性マクロファージ系Ｊ７７４の細胞に導入された。ｈｓｐ６０発現Ｊ７７４細胞の腹腔内注射を受けたマウスは腫瘍を発生せず、その後のＪ７７４細胞によるチャレンジでも腫瘍は生じなかった[ルカクスら（Lukacs，K.V．et al．）、J． Exp．Med.，178:343-8(1993)]。さらに、上記と同じｈｓｐ６０遺伝子を含むリポソーム処方を腹腔内投与したところ、既存の腫瘍の退行をもたらしたという[ ルカクスら（Lukacs，K.V．et al．）、Gene Therapy，April，1997]。マウス・メラノーマ腫瘍モデルと、異なるマイコバクテリアｈｓｐ６０遺伝子の場合も同様の知見が得られている[シュウエイクホッファー（Schweighoffer，T．）、E ur．J．Immunol.，26:2559-64(1996)]。負作用性ｍｕｔＨＳＦは、誘導性ｈｓｐ合成をブロックすることが有益である癌治療などの状況において利用することができる。前述したように、ｈｓｐは、ある種の化学療法剤から保護する作用を示す。ｈｓｐの過剰細胞が保護的役目を果たすとすれば、ある種の薬剤によりｈｓｐ合成を誘導することで、その効果が低減されるものと予想される。この誘導を防止すれば、薬剤に対する細胞の感受性を高め、より効果的な治療および/または少ない薬剤用量での治療が可能になる。負作用性ｍｕｔＨＳＦによるｈｓｐ合成の防止は、熱的細胞死に対しても細胞を感作する。この感作により、高温癌療法の成功率が高くなるはずである。この原理の妥当性を示す証拠がスリウツら（Sliutz，et al.）の試験で得られているが[スリウツら（Sliutz，G．et al．）、Br．J．Cancer，74:172-7(1996)]、該試験では、ｈｓｐ７０は２種類の化学療法剤およびＨＳＦ活性阻害剤ケルセチン[ホソカワら（Hosokawa，N．et al．）、Cell Struct．Funct.，15:393-401(1 990)]に対して細胞を抵抗性にし、ｈｓｐ７０過剰発現の効果を無効にした。別の癌治療アプローチにおいては、ｈｓｐ７０発現を調節することにより、腫瘍細胞をアポトーシスへと誘導することができる[ウエイら（Wei，Y.-Q．et al ．）、Cancer Immunol．Immunotherap.，40:73-8(1995)]。本発明においては、ｍｕｔＨＳＦタンパク質またはｍｕｔＨＳＦをコードする遺伝子を、ターゲット細胞におけるｈｓｐ合成の十分な調節を引き起こすのに十分な量で、ターゲット細胞に導入する。タンパク質またはＤＮＡの投与量は、選択した送達ビヒクル、およびｍｕｔＨＳＦが全身的に導入されるのか特定の組織に導入されるのかによって決まる。さらに、特定の用途においては、すべてのターゲット細胞がｍｕｔＨＳＦタンパク質またはｍｕｔＨＳＦＤＮＡの投与を受けることが望ましく、たとえばｈｓｐを過剰発現する癌細胞に対する免疫応答を誘発するために計画されたプロトコルの場合など上記以外の用途においては、癌細胞の一部だけがｍｕｔＨＳＦの投与を受けるのが適当である。一般に、投与量は、選択した送達ビヒクルの既知特性に基づいて求めることができる場合が多い。他の場合、動物モデル試験を行うことで、ヒトにおける有効用量の推定に用いるのに適した用量範囲を決めることができる。動物における用量範囲は、対象症状の軽減効果に基づいて決めてもよい。あるいは、生検を行ってもよいし、ｈｓｐ発現を有意に変化させる用量として有効用量を定めてもよい。ｈｓｐ発現の変化は、免疫組織化学的方法、様々なｈｓｐに対する市販抗体を用いる組織抽出物のウエスタンブロット、ｈｓｐのｍＲＮＡを検出するハイブリダイゼーション法などの適当な方法によって検出することができる。特定用途のための正しい投与法ならびに投与回数は、最終的に臨床試験現場で決定される。本発明を下記実施例により説明するが、これに限定されるものではない。実施例方法細胞培養、プラスミド、トランスフェクション、ウイルスベクターおよびFACS ヒトHeLa細胞、ヒトhsp70Bプロモーターによって駆動されるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子コピーを含有するHeLa-CAT細胞（Baler，R．ら，J．Cell.．Biol.，117：1151-1159(1992)）、または293細胞は、10％ウシ胎仔血清（FBS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、加湿５％CO₂下に、３７℃で培養した。ヒトHepG2細胞は、10％FBSと１mMピルビン酸ナトリウムを添加したアールの塩類に基づくMEMで培養した。発現プラスミドは、ヒトHSF1（HSF1（wt））、LexA₈₇−ヒトHSF1₇₉（LexA-HSF 1(wt)）、ヒトHSF1d202-316（HSF1（＋））、LexA₈₇−ヒトHSF1₇₉d202-316(LexA -HSF1(+))、ヒトHSF1d453-523（HSF1（−））および細菌β−ガラクトシダーゼのcDNA遺伝子を既に記述されているように挿入することにより、pcDNA1またはpcDNA3（Invitrogen社，カリフォルニア州カールズバッド）から誘導した（Zo u，J．ら，Mol．Cell．Biol.，15：4319-4330(1995)；Zou，J．ら，Mol．Cell． Biol.，14：7557-7568(1994)）。多重（multiple）LexA結合部位が加えられた最小プロモーターの制御下にCAT遺伝子を含むリポータープラスミドLexA-CATの構築も既に報告されている（Zou，J．ら，Mol．Cell．Biol.，15：4319-4330(1995 )）。エンハンスト緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescence protein ）のコード配列を含有するプラスミドEGFP-C1（ここではEGFPという）は、Clont ech Laboratories社（カリフォルニア州パロアルト）から入手した。細胞（＞70 ％コンフルエント培養）は、Lipofectamine^TM（Gibco BRL，Life Technologies 社，ニューヨーク州グランドアイランド）により、その製造者が提案する手順でトランスフェクトした。組換えアデノウイルスベクターは、HSF1d202-316（Zou，J．ら，Mol．Cell．B iol.，15：4319-4330(1995)；Zou，J．ら，Mol．Cell．Biol.，14：7557-7568(1 994)）を含むまたは含まないプラスミドAC CMV pLpA SR（＋）と感染性プラスミドJM17を、GrahamとPrevecのプロトコル（Methods in Molecular Biology，Vol ．7:Gene Transfer and Expression Protocols（Murray，E.J.編，The Humana P ress社，ニュージャージー州クリフトン，1991）の109〜127頁、Graham，F．I. およびPrevec，L.著「Manipulation of adenovirus vectors（訳：アデノウイルスベクターの操作）」）に従って、ヒト293細胞に同時トランスフェクトすることによって作製した。ウイルスプラークを単離、拡大し、ウイルスDNAを制限酵素消化によって分析した。ヒト細胞（HeLa-CATまたはHepG2）培養（＞70％コンフルエント）は５〜10PFU/細胞の感染多重度（MOI）で感染させた。蛍光活性化細胞選別を行うために、EGFP発現コンストラクトをトランスフェクトまたは同時トランスフェクトした培養の細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中の0.04％EDTAによる処理で組織培養皿から取りだし、PBSに再懸濁した。次に細胞懸濁液をFACStar Plus（Becton-Dickinson社，カリフォルニア州サンノゼ）装置にかけた。励起波長は488nmとし、検出波長はヨウ化プロピジウムについては6 50nm（ロングパス）、EGFP蛍光の検出については520nm（狭帯域）とした。細胞周期分布の分析については、細胞を70％エタノールで少なくとも18時間固定し、 50μg/mlヨウ化プロピジウム（Molecular Probes社，オレゴン州ユージーン）で染色した。細胞生存／死滅およ剥離アッセイと擬似虚血熱処理の後、培養を37℃で終夜インキュベートした。トリパンブルー排除を細胞生存の規準として使用した場合は、細胞（非付着細胞と付着細胞）を収集し、トリパンブルーを排除する細胞を血球計でカウントした。いくつかの実験では、 Sigma社（ミズーリ州セントルイス）のLDHアッセイキットを使って、細胞死滅を乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイで見積もった。基底からの剥離を定量するために、培養物をあらかじめ温めておいたDMEMで３回洗浄し、培養皿上に残った細胞の数を血球計で決定した。表３に示す実験では、細胞をリン酸緩衝食塩水中の２％ホルムアルデヒドと0.2％グルタルアルデヒドで固定し、X-Gal試薬（Invitrogen社，カリフォルニア州カールズバッド）で染色した。虚血状態は、既に記述されているようにシミュレートした（Mestril，R．ら，J．Clin．Inves t.，93：759-767(1994)）。簡単に述べると、グルコースまたは血清を含まないわずかに低張性のHBSS（1.3mM CaCl₂、5mM KCl、0.3mM KH₂PO₄、0.5mM MgCl₂、0 .4mM MgSO₄、69mM NaCl、4mM NaHCO₃、0.3mM Na₂HPO₄）に細胞を入れ、37℃で４〜６時間低酸素状態にした。対照細胞は同じ期間、正常酸素条件下に放置した。低酸素は気密ジャーを使ってそこから酸素をアルゴン置換で除去することによって達成した。10分間のガス交換後に、酸素濃度は＜0.2％だった。低酸素はBBL M icrobiology Systems社（メリーランド州コッキーズヴィル）の酸素消費GasPak システムを使って維持した。翻訳回復実験典型的な実験では、60mm培養皿中の並行HeLa-CAT培養（＞70％コンフルエント）にEGFPコンストラクト0.75μgとHSF1（＋）またはHSF1（−）コンストラクト2 .25μgおよびLipofectamine^TM1.5μlをトランスフェクトした。トランスフェクションの約36時間後にその培養物を熱ショックにさらす前に、細胞を再播種した（約70％コンフルエントにするため）。いくつかの実験ではHSF1（＋）をトランスフェクションではなくアデノウイルスベクターによる感染で導入したことに留意されたい。培養物を42℃／１時間の熱ショックにさらした後、37℃に戻した。その後のより過酷な熱ショックの前、その熱ショック中、およびその熱ショック後の様々な時点で、タンパク質合成の速度を³H−ロイシンによる細胞のパルス標識によって決定した。標識するために、培養物をあらかじめ温めておいたPBSで２回洗浄し、1mlのラベリング培地（２％FBSと65μCiの³H−ロイシン（179Ci/mm ol）を含む無ロイシンDMEM）を加えた。培養物を3TCで30分間インキュベートし、PBSで２回洗浄し、細胞をこすり落とし、収集し、バッファーＣ（20mM Hepes 、0.42M NaCl、1.5mM MgCl₂、0.2mM EDTA、0.5mMジチオスレイトール、0.5mM PM SF、25％グリセロール）中で溶解した。溶解物の一部をブラッドフォード法（Br adford，M.A.，Analytical Biochemistry，72:248-254(1976)）によるタンパク質量の決定に使用し、一部を10％トリクロロ酢酸による沈殿に使ってタンパク質への放射性標識の取りこみ量を測定した。タンパク質合成の相対速度はcpm/μg タンパク質として計算した。またいくつかの実験では、一部をSDS-PAGEとフルオログラフィーで比較した。ウェスタンブロット細胞を培養皿からこすり落とし、バッファーＣ中で溶解した。等量の細胞タンパク質と染色済み分子量マーカーを含むアリコートを8.5％SDS-PAGEゲルにのせた。電気泳動後にタンパク質をImmobilon-Pトランスファーメンブレン（Millip ore社，マサチューセッツ州ベッドフォード）に転写し、２％脱脂粉乳を含むTBS （25mM Tris-HCl，pH8.0，0.136M NaCl，2.7mM KCl）と共にインキュベートすることによってメンブレンをブロックした。メンブレンの適当な切片を抗HSF1ポリクローナル抗体（Baler，R．ら，Mol．Cell．Biol.，13：2486-2496(1993)）、抗Hsp抗体（すべてStressGen Biotechnologies社（ブリティッシュコロンビア州ヴィクトリア）から入手）、または抗アクチン抗体(Amersham社，イリノイ州アーリントンハイツ）と共にインキュベートした。TBSで３回洗浄した後、メンブレンを再ブロックし、二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギIgG（Amersham社））と共にインキュベートした。TBSで数回洗浄した後、ECLウェスタンブロットディテクションキット（Amersham社）を使ってメンブレンを発色させた。他のアッセイ CATアッセイは、Gorman，C.M．ら，Mol．Cell．Biol.，2:1044-1051（1982）のクロマトグラフィーアッセイを使って行った。DNA複製は標準的な³H−チミジン取りこみアッセイによって評価した。標準化は、ウェスタンブロットアッセイを含むほとんどの実験で、タンパク質含量に基づいて行った。タンパク質量の決定はすべてブラッドフォード法を使って行った。選別した細胞に関わる数種の実験では、細胞数に基づいて標準化を行った。全ての実験を少なくとも２回反復し、ほとんどの場合、各データ点を３〜５つの並行試料から導いた。実施例１ HSF（−）はストレス誘導性のHsp発現と寛容状態の樹立を防止する過去に特徴づけられた２つのHSF1欠失を正および負に作用する可能性のある因子として選択した。トランスフェクトされた遺伝子から発現されるHSF1d202-316 （ここではmutHSFまたはHSF1（＋）ともいう）は構成的に三量体かつDNA結合性であり、hsp70Bプロモーターによって駆動されるリポーター遺伝子をストレスの不在下でトランス活性化する能力を持つ（Zou，J．ら，Mol．Cell．Biol.，15:4 319-4330(1995)）。HSF1d453-523（以下HSF1（−）という）もDNA結合性であるが、これは機能的な転写活性化ドメインを持たない（Zou，J．ら，Mol．Cell．B iol.，15：4319-4330(1995)）。突然変異型因子の遺伝子は、アデノウイルスベクターによる感染（５〜10のMOI）か、Lipofectamine^TMトランスフェクションによって細胞に導入した。いくつかの実験では、トランスフェクション混合物が、強い蛍光を発する緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードする遺伝子をも含み、ほとんどの細胞をトランスフェクトすることが重要だと考えられる場合は、蛍光活性化細胞選別法（FACS）で単離したEGFP蛍光細胞を使用した。 HSF1（−）が負に作用する因子として機能しうるかどうかを明らかにするため、hsp70B−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子のコピーが組み込まれているHeLa-CAT細胞にHSF1（−）とEFGP発現コンストラクトを同時トランスフェクトした。１日後、細胞を41℃／１時間の熱ショックにかけ、37℃で終夜インキュベートした。HSF1（−）を含むまたは含まない細胞のFACS 単離集団に対するCATアッセイは、HSF1（−）が熱誘導性のリポーター発現を著しく抑制することを示した。またこの因子は、抗Hsp72ウェスタンブロットによって証明されるように、熱誘導性のHsp蓄積も著しく減少させた。熱プレコンディショニングによって誘導されるHsp濃度の上昇が、熱誘導性翻訳停止からの回復率の増加として測定される寛容性の発生に必要かどうかを決定するため、EGFP 発現コンストラクトとHSF1（−）発現コンストラクトを同時トランスフェクトした培養物またはEGFP発現コンストラクトのみをトランスフェクトした培養物（対照培養）を穏やかに熱プレコンディショニングし（41℃／１時間）、３時間後に 44℃／30分の（過酷な）熱ショックにかけた。次に、回復を見込んで培養を37℃ で様々な期間インキュベートした。細胞を³H−ロイシンでパルス標識することによって、タンパク質合成の速度を評価した。２回の独立した実験で得た結果を表１に示す。表１熱プレコンディショニングした細胞の熱ショック後の翻訳の回復第一の実験では、タンパク質合成の速度が熱ショック中に10％未満に低下し、プレコンディショニングしたコントロール細胞では熱ショックの１時間後に約33％まで回復した。HSF1（−）コンストラクトをトランスフェクトしておいた培養物では、同じ回復期間後にタンパク質合成速度がわずか18％だった。第二の実験では、翻訳速度はHSF1（−）を欠く細胞では63％まで回復したが、HSF1（−）を発現する細胞では44％までしか回復しなかった。プレコンディショニングを行わなかった場合は、１時間の回復期間後の翻訳速度が５％未満だった。これらの結果から、HSF1（−）発現細胞では対照細胞と比較して翻訳停止からの回復がかなり減少することが明らかになった。このタイプの実験（と次の実験）には多数の細胞が必要なので、うまくトランスフェクトされた細胞のFACS単離は省略した。HS F1（−）コンストラクトを受け入れていない細胞の寄与を、HSF1（−）コンストラクトをトランスフェクトした培養で決定されたタンパク質合成速度から取り除くために、トランスフェクション効率をサイトメトリーで決定したところ、約53 ％であることがわかった。非トランスフェクト細胞の寄与を差し引くと、熱ショックの１時間後におけるHSF1（−）発現細胞に関する補正されたタンパク質合成速度は、２つの実験に関してそれぞれ約５％と24％であることが明らかになった。ストレス事象によって誘導されるHsp蓄積が同じ事象中に保護性を持つかどうかを知るために、EGFP/HSF1（−）トランスフェクト培養とEGFPトランスフェクト培養（対照）に熱ショック（42℃／１時間）をかけ、翻訳停止からの回復を熱ショックの２時間後に比較した。表２熱ショック後の翻訳の回復 EGFPトランスフェクト細胞の回復はEGFP/HSF1（−）同時トランスフェクト細胞よりも有意に良好だった。非トランスフェクト細胞の存在について補正を施した後、HSF1（−）含有細胞でのタンパク質合成速度は非熱処理細胞の速度の27％でしかないことがわかったのに対し、対照細胞での速度は２時間の回復期間の終了時点で約63％に修復された。HSF1（−）の発現がストレス誘導性の細胞死滅に及ぼす影響をも評価するため、培養物にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をトランスフェクトするか、β−ガラクトシダーゼ遺伝子とHSF1（−）コンストラクトを同時トランスフェクトした。表３熱ショック（48℃／１０分）後の細胞生存率トランスフェクト培養物を過酷な熱ショック（48℃／10分；細胞生残率約75％）にかけるか、無処置のまま放置し、翌日、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞をカウントした。無処置の一重および二重トランスフェクト培養物は、よく似た数のβ −ガラクトシダーゼ発現細胞を含有した。熱ショックを施した培養物では、HSF1 （−）の存在により、細胞死滅が約60％（p＜0.05）増加した。したがって、ストレス事象の結果として起こるHsp濃度の上昇は、有意な即時保護作用を持つ。実施例２ HSF突然変異体による内因性hsp遺伝子の発現の活性化または促進の評価サイトメガロウイルスプロモーター（Zou，J．ら，Mol．Cell．Biol．15:4319 -30（1995））の制御下にヒトHSF1 cDNA遺伝子（Baler，R．ら，Mol．Cell．Bio l．13:2486-96（1993））を含有するコンストラクトをトランスフェクトしたヒトHeLa-CAT細胞（Baler，R．ら，J．Cell Physiol．117：1151-9（1992））とHe La細胞で、529残基長のヒトHSF1ポリペプチドが発現され、蓄積されることは、過去の実験によって示されている。トランスフェクトされた遺伝子から合成されるHSF1は主として三量体であり、HSE DNA結合性であり、核局在性である（Zuo ら，1995）。しかしストレスの不在下では、この因子は、HeLa-CAT細胞中に存在するヒトhsp70Bプロモーター駆動性のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）リポーター遺伝子を活性化できない。外来性の三量体型HSF1が熱ショックによって活性化されうるかどうかを調べるため、HSF1の最アミノ末端に位置するHSE DNA結合ドメインを細菌リプレッサーLexAのDNA結合ドメインで置き換えた（標準的な組換えDNA法を使ってHSF1の最初の78残基を87残基長のLexA 断片で置換）。HSF1そのものと同様に、得られたLexA-HSF1キメラは、ストレスの不在下では、DNA結合性ではあるが転写的に不活性な三量体として蓄積されることがわかった。LexA結合部位を含有するプロモーターによって制御されるリポーター遺伝子の発現をこの因子が刺激できることからわかるように、熱ショックはこのキメラ因子を活性化できた。残基186と315の間の領域における欠失と一定の置換により、HSF1はストレスの不在下でHeLa-CAT細胞中のhsp70Bリポーター遺伝子を活性化できるようになることがわかった。このようなHSF1欠失突然変異体が内在性hsp遺伝子の発現をも活性化または促進できるかどうかを決定するため、10％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中、加湿５％CO₂雰囲気下に37℃で生育したHeLa-CAT細胞に、H SF1d202-316（HSF（＋），残基203〜315を欠く。以下、この欠失因子を総称して mutHSFという）cDNAと細菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現可能な形で含むコンストラクトを同時トランスフェクトするか、β−ガラクトシダーゼコンストラクトだけをトランスフェクトした。元のヒトHSF1 cDNA遺伝子は、ヒトcDNAライブラリーを標準的な技術を使って配列既知のオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることによって得られたものだった（Baler，R．ら，Mol．Cell．B iol．13:2486-96（1993））。そのcDNAをベクターpGEM3Zf（＋）のHindIII制限部位とEcoRI制限部位の間に再クローニングした。mutHSF cDNA遺伝子の調製には、残基202と316にあるBamHI制限部位とSmaI制限部位の存在を利用した。SmaI部位にある配列へのインフレーム融合を可能にするため、正しい長さのオリゴヌクレオチドリンカーをBamHI部位に付加した（Zuo，J．ら，Mol．Cell．Bi ol．14:7557-68（1994））。mutHSF遺伝子をサイトメガロウイルスプロモーターの制御下に置くため、その遺伝子をpGEM3ZfからHindIIIとEcoRIで切り出し、ベクターpcDNA1（Invitrogen社）のポリリンカー領域中の同じ部位間に挿入した。 DNAは標準的方法で調製した。トランスフェクションはLipofectamine^TM溶液（Gi bco/BRL）をその製造者の提案するプロトコルに従って使用することにより、リポフェクション法で達成した。トランスフェクションの１日後または２日後に、細胞を80μCi/mlの³H−ロイシン（New England Nuclear社；比活性5.18tBq/mmol ）と共に、ロイシンを欠くDMEM中で２時間インキュベートした。次に細胞を培地で洗浄し、収集し、３パック細胞容積の20mM Hepes(pH7.9)、0.42M NaCl、1.5mM MgCl₂、0.2mM EDTA、0.5mMジチオスレイトール、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリドおよび25％グリセロール中で溶解した。その溶解物を４℃、12,000 ×ｇで５分間の遠心分離によって清澄化し、³H−ロイシン標識タンパク質の量を清澄化した溶解液（抽出物）の一部で、TCA沈殿により決定した。同等量の放射標識タンパク質を含むように標準化したアリコートを使って、β−ガラクトシダーゼ活性を標準的な比色アッセイ（ONPG加水分解法）で測定するか、それらアリコートを10％SDS-ポリアクリルアミドゲルにのせた。電気泳動後、ゲルを10％サリチル酸ナトリウムで処理し、適当な期間、−70℃でＸ線フィルムに露出した。 β−ガラクトシダーゼ活性のアッセイ結果は細胞がうまくトランスフェクトされていることを示したにもかかわらず、この実験では主要hspに特有なサブユニット分子量を持つタンパク質の合成が促進しているという証拠を得ることができなかった。哺乳類細胞のトランスフェクション効率は概して低いので、うまくトランスフェクトされたごく一部の細胞におけるhsp発現の促進が観察しくくなったのだと仮定して、分析に先立ってトランスフェクト細胞の選択を試みた。この実験では市販の「pHook」システムを使用した（Chesnut，J.D．ら，J．Immunol．Methods，193：17-27(1996)）。Hookコンストラクトは膜結合型抗体をコードし、抗原を装填した磁気ビーズへの結合によってその抗体を発現する細胞を濃縮できるようにする。前回と同様にサイトメガロウイルスプロモーター連結mutHSF遺伝子とHookコンストラクトを細胞に同時トランスフェクトするか、Hookコンストラクトのみをトランスフェクトし、トランスフェクションの１日後および２日後に収集し、抗原含有磁気ビーズと共にインキュベートし、結合した細胞を未結合の細胞から磁石を使って分離した。抽出物を前回と同様に結合細胞から調製し、hsp90、hsc73、hsp72、hsp60およびhsp27に特異的な抗体（Stres sGen Biotechnologies社）を使ってウェスタンブロットによって分析した。mutH SFによる内在性hsp遺伝子の活性化を示す証拠は何も得られなかった。これはおそらくこの分離法の選択性が不充分なためだろう。トランスフェクション効率の低さに伴う明らかな問題を完全に回避するため、トランスフェクション法の代わりに感染法を使用した。mutHSF cDNA（HSF1（＋））を、プラスミドベクターAC CMV pLpA SR（＋）中のアデノウイルス配列に隣接するサイトメガロウイルスプロモーターの後方に挿入した。アデノウイルスE1 A領域遺伝子を発現するヒト293細胞に、挿入された外来遺伝子を持たないプラスミドベクターまたはmutHSFを含有するプラスミドベクターと、アデノウイルス配列の大部分を含有するプラスミドJM17とを同時トランスフェクトした。これら２種類のプラスミド上の配列の組換えにより、EIA領域を欠く（複製欠損性）がサイトメガロウイルスプロモーター（対照ウイルス）またはmutHSF遺伝子に連結されたサイトメガロウイルスプロモーター（mutHSFウイルス）を含有し、欠損ウイルス粒子にパッケージングされる、アデノウイルスゲノムが生成した（これらアデノウイルス媒体の作成に使用した方法論の説明についてはGrahamおよびPrevec ，1991を参照されたい）。ウイルスプラークを単離、拡大し、ウイルスゲノムを制限酵素消化によって分析した。ウイルスによる感染は、約５の感染多重度（ MOI）で行った。HeLa-CAT細胞の50％コンフルエント培養を3グループ準備した。第一群をmutHSFウイルス（Ade-HSF1（＋））に、第二群を対照ウイルス（Ade）に感染させ、第三群にはウイルスを添加しなかった。次に、これら３群の培養をそれぞれ15時間、24時間および36時間インキュベートした後、収集した。抽出物を前回と同様に調製した。感染細胞でのmutHSF発現を評価するために、ヒトHSF1 に対する特異抗体（Baler，R．ら，Mol．Cell．Biol．13:2486-96（1993））を使って細胞抽出物のウェスタンブロット分析を行い、その特異抗体を化学ルミネセンスにより検出した（Zuo，J．ら，Mol．Cell．Biol．15:4319-30（1995））。結果は、感染の15時間後にかろうじて検出できるmutHSFの発現を示し、感染の 24時間後と36時間後には多量のmutHSFを示した。非感染細胞または対照ウイルス感染細胞から得た抽出物には、バックグラウンドレベルしか存在しなかった。 mutHSFが転写的に活性であるかどうかを調べるために、HeLa-CAT細胞中に存在するhsp70B-CATリポーター遺伝子の発現速度を、Gormanら（Gorman，C.M．ら，M ol．Cell．Biol．2：1044-51(1982)）が記述したように行われるCAT活性アッセイで見積もった。この実験では、並行培養をmutHSFと対照ウイルスに感染させた。対照培養は実験期間中37℃でインキュベートするか、43℃／30分の熱ショックにかけた。3TCで終夜インキュベートした後、細胞を収集し、抽出物を調製し、C AT活性について分析した。結果は、mutSHFがhsp70B-CAT遺伝子を、中等度に過酷な熱ショックによって活性化される内在性HSF1と同等かそれ以上に活性化することを示した。 mutHSFが内在性hspの発現を促進／活性化できたかどうかを決定するために、非感染細胞とmutHSFまたは対照ウイルスに感染させた後、15時間、24時間および 36時間インキュベートした細胞から得た抽出物（上記参照）を抗hspウェスタンブロットで分析した。mutHSFはhsp70ファミリーの主要誘導性要素hsp72の発現量とhsp27（hsp25としても知られている）の発現量を激増させた。hsp73（hs c70としても知られている）やhsp60などの通例誘導性の低いhspの合成さえ促進された。hsp90濃度もmutHSFウイルス感染細胞で明らかに上昇していた。使用したhsp90抗体が誘導型hsp90と構成型hsp90の両方を検出して、誘導型のさらに劇的な誘導が覆い隠していたかもしれない。対照ウイルス感染細胞から得た抽出物は非感染細胞より多量のhspを含まなかった。異なるレーンのタンパク質負荷量が等しいことを確認するために、ブロットを抗アクチン抗体でもプローブした。これらの観察結果は、mutHSFが単独で主要hspの細胞内濃度を上昇させうることを強く示唆している。これらの発見を裏付けると共に、mutHSFの発現が非hspの発現を促進するかどうかを調べるために、同様の実験を行った。この実験では、新たに合成されたタンパク質を放射標識するため、細胞を収集する直前に細胞を³H−ロイシンに２時間ばく露した。細胞抽出物をSDS-PAGEとフルオログラフィーにかけた（手順については上を参照されたい）。mutHSFウイルス感染細胞は、hsp90、hsp70メンバー、hsp60およびhsp25に相当する分子量90、72、60および25kDaのポリペプチドの合成の促進を示したが、対照ウイルス感染細胞はそうでなかった。既知hspの範囲にないサブユニット分子量を持つタンパク質の合成の増加は観察されなかった。上述の発見を一般化するため、HeLa細胞と同じ条件で生育したmutHSFウイルスおよび対照ウイルス感染ヒトMRC5細胞ならびに非感染ヒトMRC5細胞中の新たに合成されたポリペプチドを、先の実験と同様に分析した。HeLa細胞の場合とよく似た誘導タンパク質発現パターンがMRC5細胞に検出された。 hsp遺伝子は変性したタンパク質によって活性化されることが既に示されており、非未変性タンパク質の蓄積がhsp遺伝子の活性化における必須の中間段階かもしれないと述べられている（Ananthan，J．ら，Science 232:522-4（1986））。したがって、mutHSFが内在性HSF1を活性化できる非未変性タンパク質であるという可能性がある。しかし、この可能性は次の観察結果からみて事実上排除できる。第一に、非未変性タンパク質によるHSF1とhsp遺伝子の効果的な活性化には、完全に変性したタンパク質が大量に必要であり（Ananthanら，1986と本出願人の観察結果）、選ばれたタンパク質だけが変性後に活性化を誘発できる。第二に、次の規準によれば、mutHSFは完全に未変性のタンパク質である：このタンパク質はHSE DNA結合アッセイで（活性化された）野生型HSF1と同等に活性であり、三量体化と定量的核再局在が可能である（Zuo，J．ら，Mol．Cell．Biol．15:43 19-30（1995））。さらにまた、上述したように、HSF1中のHSE DNA結合ドメインをLexA DNA結合ドメインで置き換えると、LexA結合部位を含有するプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子の熱制御的活性化を行いうるキメラ因子（LexA -HSF1）が得られる。この実験では、LexA-CATリポーター遺伝子コンストラクトと発現可能な形のLexA-HSF1遺伝子を含有するコンストラクトをHeLa細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの１日後に熱処理を施し、トランスフェクションの２日後に細胞を収集し、CAT活性についてアッセイした。熱処理したLexA-HSF1同時トランスフェクト細胞は高レベルのCAT活性を持ったが、無処理のLexA-HSF1同時トランスフェクト細胞はそうではなかった。リポーター遺伝子コンストラクトのみをトランスフェクトされた細胞は、熱処理してもしなくても、検出できないレベルのCAT活性しか示さなかった。残基203-315の欠失（mu tHSFに存在するもの）をLexA-HSF1に導入すると、LexA-CATリポーター遺伝子を構成的に活性化できる因子（LexA-mutHSF）が生成した。したがって、この欠失は機能の獲得をもたらす。この実験は、この欠失を保持するキメラ因子が完全に活性な転写因子であることを明確に示した。先に行われたHSF1の構造機能解析により、残基203のアミノ末端側と残基277のカルボキシ末端側にある領域でのほとんどの欠失が非三量体型、非DNA結合性、非核因子もしくは転写不活性因子をもたらすことがしめされているので（Zuoら，1995）、転写因子として機能するには、LexA-mutHSFが、そしてさらにはmutHSFが、事実上完全に未変性のコンフォメーションを持たなければならない。残基203-315の欠失がHSF1を、hs p活性化を誘発しうるほどに非未変性なタンパク質にできるという可能性を直接取り扱うため、HeLa-CAT細胞のhsp70B-CATリポーター遺伝子を活性化するという LexA-mutHSFの能力を試験した。この実験では、トランスフェクトされた遺伝子から発現したmutHSFがhsp70B-CAT遺伝子を強く活性化したが、LexA-HSF1またはL exA-mutHSFを発現させる細胞では、検出可能なリポーター活性ははっきりしなかった。同じ抽出物の抗HSF1ウェスタンブロットは、LexA-HSF1とLexA-mutHSFが内在性HSF1と比較して（とりわけうまくトランスフェクトされた細胞が全体の約10 ％でしかなったことを考慮すると）かなり過剰発現されていることを示した。この特別な実験では、LexA-mutHSFがmutHSFより高いレベルで発現された。これらの観察結果は、mutHSFが内在性hsp遺伝子を（内在性HSF1の活性化を誘発することによってではなく）直接的に活性化する、高度に活性な転写因子であることを証明している。実施例３ hsp発現がmutHSFによって誘導されている細胞における保護表現型の獲得の評価 mutHSFによってhspを発現させるように誘導された細胞が保護表現型を獲得するかどうかを決定するため、熱誘導性の死滅、細胞骨格構造の完全性の指標としての基底からの剥離、およびG2/M期における熱誘導性の細胞周期停止に対する感受性について、細胞をアッセイした。 mutHSFによって誘導されたhspの熱誘導性細胞死滅に対する保護効果を見積もるために、HeLa-CAT培養の各群をmutHSF（Ade-HSF1（＋））または対照ウイルス（Ade）に感染させるか、未感染のままにしておいた。感染の１日後にそれらの培養物を49℃／20分の熱ショックにさらした後、37℃に戻し、さらに15時間インキュベートした。細胞の生存率はトリパンブルー排除細胞を血球計で評価することによって見積もった。表４熱ショック（４９℃／２０分）後の細胞生存率結果は、この熱ショック法が細胞の60％以上を死滅させること示した。対照ウイルス感染細胞は同じ割合で死滅したが、mutHSFウイルス感染細胞は本質的に100 ％保護された。このように、mutHSFによって媒介される正常なhspセットの過剰発現は、熱誘導性の細胞死滅に対して有効な保護を与える。わずかな死滅しかもたらさない熱処理であっても、細胞を細胞培養表面から一時的に剥離させる。ストレス誘導性のこの剥離を、正常な細胞骨格構成の破壊の尺度として追跡した。感染培養物と非感染培養物を47℃／20分の熱ショックにさらした。剥がれた細胞を取り除くために熱処理の直後に培養物を洗浄し、培養皿上に残った細胞を37℃でさらに15時間インキュベートしてからカウントした。表５熱ショック（４７℃／２０分）後の基底への細胞接着熱処理は細胞の約85％を表面から引き離した。mutHSFウイルス感染細胞はほとんど保護されたが、対照ウイルス感染細胞は保護されず、mutHSFによって媒介されるhspの過剰発現がストレス誘導性の細胞骨格構造の破壊を防止することが示唆された。 mutHSF誘導性のhsp合成が熱誘導性のG2/M細胞周期停止を防止できるかどうかを決定するための実験も行った。熱ショックに続く翻訳停止からの回復について調べるため、Ade-HSF1（＋）またはAdeに感染させた細胞を44℃／30分の熱ショックにさらした後、37℃で回復させた。表６熱ショック（４４℃／３０分）後の翻訳の回復タンパク質合成は熱ショック中に正常速度の約10％まで低下したが、１時間の回復期間後には、HSF1（＋）発現細胞でショック前のレベルに戻り、対照細胞では戻らなかった。このように、HSＦ（＋）によって媒介されるHspの蓄積量の増加は、細胞を過酷な熱ストレスから効果的に保護した。アデノウイルスベクター（ mutHSFウイルスと対照ウイルスの両方）を使った研究を行っているときに、それらのウイルスが感染細胞の増殖速度を低下させることが観察された。結果の解釈をあいまいにしないために、感染法ではなくトランスフェクション法を使って細胞周期停止を取り扱う実験を行うことにした。うまくトランスフェクトされた細胞を非トランスフェクト細胞から分離する際に見られた以前の問題点を克服するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)をトランスフェクションのマーカーとする実験を開始した。サイトメガロウイルスプロモーターによって駆動される遺伝子（ EGFP-C1 DNA）からGFPを発現させる細胞は、操作されていない細胞から申し分なく分離することができた。培養物にmutHSF遺伝子とEGFP-C1 DNAを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、細胞を0.04％EDTA/リン酸緩衝食塩水（PBS）で培養皿から取りだし、PBSに懸濁した。蛍光活性化細胞選別と DNA含量の分析は、他の文献（Parks，D.R．ら，The Handbook of Experimental Immunology,第４版，Vol．29，1〜29頁，1986）に記述されているような構成のF ACStar Plus装置（Becton-Dickinson社，カリフォルニア州サンホゼ）で行った。励起波長は488nm、検出波長はヨウ化プロピジウムについては650nm（ロングパス）、GFPによる蛍光については520nm（狭帯域）とした。選別された細胞から得た抽出物をウェスタンブロットで分析した。mutHSFはGFPについて陽性として分類された細胞には検出されたが、陰性として分類された細胞には検出されなかった。表２を参照されたい。GFP陽性細胞は、hsp72とhsp90のレベルがGFP陰性細胞より高かった。hsp72誘導のレベルはかなり高く、GFP陽性細胞は、収集と分析の１日前に熱ショックを与えた非感染細胞と同等のhsp72濃度を持っていた。細胞周期停止に対する影響を調べるために、HeLa-CAT培養物にmutHSF遺伝子とEGFP-C 1 DNAを同時トランスフェクトするか、モックトランスフェクト（EGFPコンストラクトのみをトランスフェクト）し、１日後に熱処理を施し、37℃でさらに１日インキュベートした後、FACSのために収集した。あるタイプの実験では、HSF1（＋）発現細胞と非発現細胞をFACSによって単離して再播種し（第１日）、その増殖を第２日から第４日まで追跡した（図２）。結果は、上昇したHsp濃度が細胞増殖を厳しく抑制することを示した。同様の結果は、細胞を選別せず、トランスフェクト細胞の数を総細胞数とEGFPを発現する細胞の割合のサイトメトリーによる評価から決定したもう一つのタイプの実験でも得られた。後者の実験では、細胞が第１日と第２日の間に増殖したこと、すなわち増殖が早くも第２日に停止したことも明らかになった。GFP蛍光に基づきFACSで分画した後、 GFP陽性プールとGFP陰性プールの細胞を70％エタノールで18時間固定し、50μg/ mlヨウ化プロピジウム（Molecular Probes社）で染色した後、DNA含有量を決定するためにフローサイトメトリーで再分析した。この分析により、mutHSF含有およびhsp過剰発現細胞に相当するGFP陽性プールでは、G2/M期にある細胞の比率が、GFP陰性プールよりもはるかに低いことが明らかになった。mutHSFの発現をウェスタンブロットで検証した。図２に示す実験で、最終時点（第４日）の細胞を DNA含量について分析したところ、Ｓ期およびG2/M期にあるHSF1（＋）発現細胞の数がいくらか増加していることがわかった（図３Ａ−３Ｂ）。サイトメトリー分析は、平均細胞サイズにはっきりした変化がないことを示した。したがって、 Hsp濃度の増加は、細胞を細胞周期の特定の位置に停止させることなく細胞周期の進行速度を急激に遅らせる。進行の抑制はG1期とＳ期の間ではいくらか軽いように思われ、その結果、時間が経つにつれて、Ｓ期とG2/M期にある細胞の多少の蓄積が起こっている。DNA複製を³H−チミジン取りこみによって評価したところ（第２日）、HSF1（＋）発現細胞では対照細胞と比較して４〜５倍減少していることがわかった。表９ HSF1（＋）発現細胞におけるタンパク質およびＤＮＡの合成速度細胞を³H−ロイシンでパルス標識した後、標識されたタンパク質のTCA沈殿を行う（表９；第４日からのデータを示す）か、SDS-PAGEとフルオログラフィーで分析することにより、タンパク質合成を調べた。Hsp濃度の上昇は、タンパク質合成速度に影響を及ぼさず、また合成された非Hspタンパク質の相対量を大きく変化させることもないことがわかった。Hsp濃度が上昇している細胞の転写（RNAポリメラーゼII）能の推定値を得るために、細胞をAde-HSF1（＋）またはAdeに感染させ、１日後にEGFPコンストラクトをトランスフェクトした。表１０ HSF1（＋）発現細胞におけるRNAポリメラーゼII転写 Hsp濃度が増大している細胞は、絶対レベルは対照細胞と比較していくらか減少（約45％減少）したものの、かなりのEFGPを発現させうることが、サイトメトリーによる定量化で示された。要約すると、Hsp濃度の上昇によって生じる理想的な寛容状態は、厳しく抑制された細胞周期進行とDNA複製、ならびに正常な翻訳とかなりの転写活性を特徴とする。この非増殖的代謝状態は数日間維持されうる。したがって、mutHSFによって媒介されるhspの過剰発現は、細胞を熱誘導性の細胞周期停止から保護する。この保護作用は、上述のようにEGFP-C1 DNAのみをトランスフェクトして調べた細胞には見られなかった。 HSF1（＋）発現細胞は、肝毒性を持つことが知られている化学療法剤シクロホスファミドの毒性や模擬虚血などの医学関連ストレスからも部分的に保護された。ヒト肝細胞由来HspG2細胞をシクロホスファミド（20mM）にばく露（24時間）するとかなりの死亡（38％）が起こったが、これはHSF1の存在によって55％減少した。表７シクロホスファミドへの曝露に由来する死亡率乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）漏出アッセイで死滅率を評価したところ、HSF1（＋）の発現は、熱プレコンディショニングに関して報告された25％の減少に十分匹敵する43％の減少をもたらした（Salminen，W.F．ら，Toxicol．Appl．Pharma col.，141：117-123(1996)）。HSF1（＋）は模擬虚血にさらされたHepG2細胞の死亡率も50％以上低下させた（熱プレコンディショニングには40％の効果があった）。表８模擬虚血に由来する死亡率このように、HSF1（＋）によって、すなわちHSF1活性の規制解除によって媒介されるHsp濃度の上昇は一般に細胞保護的である。均等物当業者であれば、単なる日常的な実験方法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲の範疇に含まれることを意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月１日（１９９９．３．１）【補正内容】請求の範囲１．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、内在性熱ショックタンパク質合成の促進方法。２．正作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメイン、核局在化シグナルおよび転写活性化ドメインを含有する請求項１記載の方法。３．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約１８０残基〜約３１５残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１記載の方法。４．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項１記載の方法。５．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、内在性熱ショックタンパク質の合成を活性化するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞における保護状態の誘導方法。６．正作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメイン、核局在化シグナルおよび転写活性化ドメインを含有する請求項５記載の方法。７．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約１８０残基〜約３１５残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項５記載の方法。８．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項５記載の方法。９．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、内在性熱ショックタンパク質の合成を阻害するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞における感作状態の誘導方法。１０．負作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック因子オリゴマー化ドメインおよび核局在化シグナルを含有する請求項９記載の方法。１１．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約２７７残基〜約５２９残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項９記載の方法。１２．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項９記載の方法。１３．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、ストレスにより誘導された内在性熱ショックタンパク質の合成を阻害するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞におけるストレスにより誘導された内在性熱ショックタンパク質合成の阻害方法。１４．負作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメインおよび核局在化シグナルを含有する請求項１３記載の方法。１５．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショック転写因子のトランスアクティベーション活性が阻害されるように、アミノ酸配列の約２７７アミノ酸〜約５２９アミノ酸の全部または一部の欠失により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１３記載の方法。１６．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメインの除去または置換により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１３記載の方法。１７．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項１３記載の方法。１８．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体における内在性熱ショックタンパク質合成の促進方法。１９．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより保護状態を作る、保護状態を必要とする個体の細胞における保護状態の誘導方法。２０．個体の細胞が、化学療法、ＵＶＢ、敗血症、高体温、炎症応答、酸化ストレス、炎症性サイトカインまたは虚血により生じた障害に対して保護される請求項１９記載の方法。２１．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体における内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。２２．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて内在性熱ショックタンパク質の合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより保護状態を作る、保護状態を必要とする個体の細胞における保護状態を誘導するための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。２３．個体の細胞が、化学療法、ＵＶＢ、敗血症、高体温、炎症応答、酸化ストレス、炎症性サイトカインまたは虚血により生じた障害に対して保護される請求項２２記載の使用。２４．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の腫瘍細胞に導入されるのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより腫瘍細胞における内在性熱ショックタンパク質の合成を促進する、個体における腫瘍細胞の免疫原性の増加方法。２５．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の腫瘍細胞に導入されるのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより腫瘍細胞における内在性熱ショックタンパク質の合成を促進する、個体における腫瘍細胞の免疫原性を増加させるための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショックタンパク質合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、熱ショックタンパク質合成の促進方法。２．正作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメイン、核局在化シグナルおよび転写活性化ドメインを含有する請求項１記載の方法。３．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約１８０残基〜約３１５残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１記載の方法。４．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項１記載の方法。５．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショックタンパク質合成を活性化するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞における保護状態の誘導方法。６．正作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメイン、核局在化シグナルおよび転写活性化ドメインを含有する請求項５記載の方法。７．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約１８０残基〜約３１５残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項５記載の方法。８．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項５記載の方法。９．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショックタンパク質合成を阻害するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞における感作状態の誘導方法。１０．負作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック因子オリゴマー化ドメインおよび核局在化シグナルを含有する請求項９記載の方法。１１．ｍｕｔＨＳＦが、ヒトＨＳＦ１の約２７７残基〜約５２９残基に相当する領域での突然変異により熱ショック転写因子から派生したものである請求項９記載の方法。１２．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項９記載の方法。１３．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、ストレス誘導性熱ショックタンパク質合成を阻害するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを細胞に導入することを含む、細胞におけるストレス誘導性熱ショックタンパク質合成の阻害方法。１４．負作用性ｍｕｔＨＳＦが熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメイン、熱ショック転写因子オリゴマー化ドメインおよび核局在化シグナルを含有する請求項１３記載の方法。１５．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショック転写因子のトランスアクティベーション活性が阻害されるように、アミノ酸配列の約２７７アミノ酸〜約５２９アミノ酸の全部または一部の欠失により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１３記載の方法。１６．負作用性ｍｕｔＨＳＦが、熱ショックエレメントＤＮＡ結合ドメインの除去または置換により熱ショック転写因子から派生したものである請求項１３記載の方法。１７．該細胞がｍｕｔＨＳＦをコードする核酸配列を含有する発現可能型ベクターで形質導入され、ｍｕｔＨＳＦが該核酸配列から発現される請求項１３記載の方法。１８．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて熱ショックタンパク質合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体における熱ショックタンパク質合成の促進方法。１９．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて熱ショックタンパク質合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより保護状態を作る、保護状態を必要とする個体の細胞における保護状態の誘導方法。２０．個体の細胞が、化学療法、ＵＶＢ、敗血症、高体温、炎症応答、酸化ストレス、炎症性サイトカインまたは虚血により生じた障害に対して保護される請求項１９記載の方法。２１．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて熱ショックタンパク質合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含む、個体における熱ショックタンパク質合成を促進するための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。２２．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の細胞に導入されて熱ショックタンパク質合成を促進するのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより保護状態を作る、保護状態を必要とする個体の細胞における保護状態を誘導するための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。２３．個体の細胞が、化学療法、ＵＶＢ、敗血症、高体温、炎症応答、酸化ストレス、炎症性サイトカインまたは虚血により生じた障害に対して保護される請求項２２記載の使用。２４．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の腫瘍細胞に導入されるのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより腫瘍細胞における熱ショックタンパク質合成を促進する、個体における腫瘍細胞の免疫原性の増加方法。２５．正作用性ｍｕｔＨＳＦが、個体の腫瘍細胞に導入されるのに十分な量で、かつ、それに適した条件下で、該ｍｕｔＨＳＦを個体に投与することを含み、それにより腫瘍細胞における熱ショックタンパク質合成を促進する、個体における腫瘍細胞の免疫原性を増加させるための正作用性ｍｕｔＨＳＦの使用。