JP2001510049A

JP2001510049A - 微生物および該微生物から得られるエステラーゼ

Info

Publication number: JP2001510049A
Application number: JP2000503221A
Authority: JP
Inventors: フィリップ・アレキサンダー・キーン; ロバート・クリストファー・ブラウン; スティーブン・ジョン・クリフォード・テイラー
Original assignee: Chirotech Technology Ltd
Current assignee: Chirotech Technology Ltd
Priority date: 1997-07-15
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2001-07-31
Also published as: AU8350398A; EP1003885A1; GB9714877D0; WO1999004015A1

Abstract

(57)【要約】新規な微生物はラセミ体のＮ-ベンゾイル-２-アゼチジンカルボン酸メチルエステルから少なくとも９９％エナンチオマー過剰率で(Ｓ)-Ｎ-ベンゾイル-２-アゼチジンカルボン酸を生成する能力により特徴付けられる。酵素が該微生物から得られ、同じ又は反対のエナンチオマー選択性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、微生物および該微生物から得られる立体選択的エステラーゼに関す
る。

【０００２】（発明の背景）生物分割は、一般的に、エナンチオマー的に純粋な化合物の製造に用いられる
ことが知られている方法である。しかしながら、特定の化合物の分割における特
定の生物触媒の利用可能性を予想することはほとんど不可能である。

【０００３】アゼチジン-２-カルボン酸および類似体はある種の治療薬の製造に有用なシン
トンである。シントンが化学的に合成される場合、それはラセミ体である。常套
の合成によれば、最終薬物も又エナンチオマーの混合物となり、エナンチオマー
の一つがあまり作用的でないのではないか、望ましくない副作用を引き起こすの
ではないかという当然の懸念を引き起こす。それゆえ、ラセミ体のシントンの２
つのエナンチオマーのどちらかが単離され得、次いでその残りがそれに基づいて
構築され得る合成法に手段を講ずる必要がある。

【０００４】これを行う効果的な方法は、酸のエステルの一エナンチオマーを選択的に加水
分解するための酵素を用いて一エナンチオマーとして酸を得、他方のエナンチオ
マーをエステルとして残すことである。混合物の成分はこうして容易に分けられ
得る。

【０００５】ＷＯ-Ａ-９８０２５６８は、エナンチオマーに富むアゼチジン-２-カルボン酸
が新規かつ効果的な生物分割法によりエナンチオマー的に純粋な形で、高い収量
で得られ得ることを開示する。

【０００６】（発明の概要）本発明によれば、新規な微生物は生物触媒作用、例えばＷＯ-Ａ-９８０２５６
８に開示されている方法のために有用な酵素を生成し、。驚くべきことに、アス
ペルギルス(Aspergillus)に属するある株が特に有用であることが見出された。

【０００７】アスペルギルスタマリイ(Aspergillus tamarii)(ＣＭＣ３２４２)として識別される新規な微生物がイギリス、サリー、エガムの国際菌類学研究所にブダ
ペスト条約の規定に基づき１９９７年７月８日に寄託された。その受諾番号はＩＭＩ３７５９３０である。

【０００８】エステラーゼをコードしている遺伝子を単離し、配列を決定し(配列番号１を参照されたい)、酵素のアミノ酸配列を得た(配列番号２を参照されたい)。本発明は、上記の構造を有する化合物および、当業者に明らかであるように、同じ活
性を有するその断片に関する。新規な天然型酵素はラセミ体のＮ-ベンゾイル-２
-アゼチジンカルボン酸を転換する能力により特徴付けられ、(Ｓ)-２-アゼチジンカルボン酸を少なくとも９９％ｅｅで与える；新規な組換え型酵素は反対のエ
ナンチオマーをこれも又少なくとも９９％ｅｅで与える。これらの結果はここで
示される条件下で得られ得る。

【０００９】（発明の記述）実例として、ラセミ体のＮ-アシラゼチジン-２-カルボン酸エステルの生物転換による、エナンチオマーに富むＮ-アシラゼチジン-２-カルボン酸を得るための方法において、新規な微生物と単離酵素を用い得る。

【００１０】「エナンチオマーに富んだ」により我々は、一方が他方よりも大きな比率で、即ち少なくとも５０％ｅｅ、好ましくは少なくとも７０％ｅｅおよびより好
ましくは少なくとも９０％で存在するエナンチオマーの混合物のいずれかを意味
する。分割によりこれが達成されなければ、ｅｅ(エナンチオマー過剰率)はしば
しば結晶化により高められ得る。

【００１１】本発明による方法は、一の酸エステルエナンチオマーの対応する酸への選択的
な加水分解を含む。酸および残存エステルは容易に分離され得る。残存エステル
は(望まれない場合)回収され、ラセミ化され(例えばナトリウムメトキシドなどの塩基を用いて)、そして分割過程で再使用され得る。

【００１２】本発明における使用のための適当な基質はキラルな酸のエステルである。その
ような酸はナプロキセンなどのプロフェンを含む。

【００１３】言及され得るエステルは、アリール(例えばフェニル)又は直鎖若しくは環状ア
ルキル(特に低級アルキル)エステルを含む。言及され得る特別なエステルは、プ
ロピル、エチルおよび特にメチルエステルを含む。

【００１４】新規な微生物はラセミ体のＮ-ベンゾイルアゼチジンカルボン酸エステルの生物分割により(Ｓ)-Ｎ-ベンゾイルアゼチジン-２-カルボン酸を生成するその能力
により特徴付けられる。酵素活性は常套の方法で同定され得る。驚くべきことに
、切断型酵素は反対のエナンチオマー特異性を有し、それによりラセミ体のエス
テル基質からどちらかのエナンチオマーを過剰に産生させることが見出された。

【００１５】酵素は全細胞型で又は単離型で用いられ得る。所望により当業者によく知られ
る方法により固定され得る。

【００１６】酵素は寄託された微生物から製造され得る。これとは別に、組換え技術によっ
ても製造され得る。

【００１７】本願により与えられたＤＮＡおよびアミノ酸配列を用いて、当業者は本願によ
り開示されている遺伝子や酵素の断片又は変異体を容易に構築することが出来る
。例示された酵素の活性を保持するこれらの断片および変異体は、本発明の範囲
内にある。又、遺伝子コードの重複のために、様々な異なるＤＮＡ配列がこの中
で開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一又は類似の酵素をコードし
ているこれらの選択的ＤＮＡ配列を作ることは当業者の技術範囲内にある。これ
らのＤＮＡ配列は本発明の範囲内にある。本願で用いられている、「本質的に同
じ」配列の意味することは実質的に活性に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠
失、付加又は挿入を言う。活性を保持している断片もこの定義中に含まれる。

【００１８】本発明の遺伝子はよく知られる方法により単離され得、広く様々な宿主に導入
され得る。遺伝子の発現は直接的または間接的に酵素の細胞内合成および保持に
至る。遺伝子は微生物宿主に適当なベクターを経て導入され得る。

【００１９】遺伝子の安定した保持および発現のための条件下で、微生物宿主に遺伝子を導
入するために広く様々な方法が利用される。ＤＮＡ構築物は遺伝子の発現のため
の転写および翻訳制御シグナル、その制御調節下の遺伝子および宿主微生物中の
ＤＮＡ配列と類似のＤＮＡ配列(これにより組み込みが可能になる)、および／又
は宿主中で機能し得る複製システム(これにより組み込みや安定保持が可能になる)を含み得る。

【００２０】転写の方向、即ちコード又はセンス配列の５’から３’の方向に、構築物はある場合には転写調節部位、およびプロモーター（ここで調節部位はプロモータ
ーの５’又は３’のどちらにあってもよい）、リボゾーム結合部位、開始コドン
、開始コドンに同期するオープンリーディングフレームを有する構造遺伝子、停
止コドン、ある場合にはポリアデニル化シグナル配列、および終結部位を含み得
る。二重鎖としてのこの配列はそれ自体で微生物宿主の形質転換のために使用さ
れ得るが、たいていはマーカーを含むＤＮＡ配列と共に含まれる。

【００２１】開始部位の調節制御下に置かれるべく、遺伝子は、転写／翻訳開始部位と終結
部位の間に導入され得る。この構築物は、少なくとも一つの複製系を含み得るが
、一つ以上の複製系を含んでいてもよいプラスミドの中(プラスミド中、一つの複製系はプラスミドの発生中にクローニングのために使用され、第２の複製系は
最終宿主において機能するために必要である)に含まれ得る。加えて、上述のように一つ又はそれ以上のマーカーも存在し得る。組み込みが望まれる場合、プラ
スミドは望ましくは宿主遺伝子と相同の配列を含む。

【００２２】形質転換体は常套の方法に従って単離され得るが、たいていは、変更されてい
ない微生物や転換中の微生物が存在する時、それらに対して所望の微生物を選択
するために採られる選択技術を用いる。

【００２３】適当な宿主細胞は原核生物と真核生物を含む。一例は大腸菌である。

【００２４】以下の実施例は本発明を説明する。

【００２５】エステラーゼ含有株の同定公知のエステラーゼ活性を有するカイロテックテクノロジー株コレクション
から選択された微生物株を、ＫＨ₂ＰＯ₄(７ｇ／Ｌ)、Ｋ₂ＨＰＯ₄(２ｇ／Ｌ)、( ＮＨ₄)₂ＳＯ₄(１ｇ／Ｌ)、イースト抽出物(１０ｇ／Ｌ)、微量元素溶液(１ｍｌ／Ｌ)およびグルコース(１０ｇ／Ｌ)の水溶液から成る培地に生育させた。培地は２５０ｍｌの三角フラスコあたり２５ｍＬにて作成し、ｐＨ６.０(菌およびイ
ースト用)およびｐＨ７.０(細菌用)に合わせ、その後１２１℃で２０分間滅菌し
た。微量元素溶液は、ＣａＣｌ₂.２Ｈ₂Ｏ(３.６ｇ／Ｌ)、ＣｏＣｌ₂.６Ｈ₂Ｏ(２
.４ｇ／Ｌ)、ＣｕＣｌ₂.２Ｈ₂Ｏ(０.８５ｇ／Ｌ)、ＦｅＣｌ₃.６Ｈ₂Ｏ(５.４ｇ／Ｌ)、Ｈ₃ＢＯ₄(０.３ｇ／Ｌ)、濃ＨＣｌ(３３３ｍｌ／Ｌ)、ＭｎＣｌ₂.４Ｈ₂ Ｏ(２.０ｇ／Ｌ)、Ｎａ₂ＭｏＯ₄.２Ｈ₂Ｏ(４.８ｇ／Ｌ)、およびＺｎＯ(２.０ｇ
／Ｌ)から成る。

【００２６】各株の１００μｌ量のグリセロール貯蔵物をフラスコの中に接種し、２５℃で
、ニューブランスウィック(New Brunswick)制御環境インキュベーター振とう機(モデルＮｏ.Ｇ-２５)中で２５０ｒｐｍにて２４から７２時間生育させた。１
０ｍｌの各培養物を次いで遠心分離により回収し、ペレットを４ｍＬの５０ｍＭ
ＫＨ₂ＰＯ₄(ｐＨ７.０)内に再懸濁した。

【００２７】シンチレーションバイアル中８６０μｌの５０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄(ｐＨ７.０
)を４０μＬの５０％ｗ／ｖＮ-ベンゾイル-２-アゼチジンカルボン酸メチルエス
テル(２.０ｇＮ-ベンゾイル２-アゼチジンカルボン酸メチルエステル＋２ｍＬ
Ｈ₂Ｏ＋０.０２ｇトゥイーン８０、４℃で１０秒間１５-１８μｍの超音波をかけ、３秒間停止させる超音波処理を１０分間施した)および上述のように生育させた１００μＬの再懸濁培養物と共に混合した。反応をニューブランスウィ
ック制御環境インキュベーター振とう機(モデルＮｏ.Ｇ-２５)中で２５℃、２５
０ｒｐｍにて遂行した。

【００２８】サンプルを７日まで植え継ぎ、ＨＰＬＣにより転換に関して分析した。即ちサ
ンプルを適当に希釈し、２０μｌを５ｃｍハイパーシルＢＤＳＣ１８カラム上へ
注入した。溶離バッファーは５０％ｖ／ｖＭｅＯＨ＋１ｇ／ＬＨ₃ＰＯ₄であ
った。流速は１.５ｍＬ／分および検出は２２５ｎｍにて行い、実施時間は３分間であった。

【００２９】顕著な加水分解を与えるこれらの反応物に関して、エステルと生成物のエナン
チオマー過剰率(ｅｅ)を決定した。エステルのエナンチオマー過剰率(ｅｅ)をＧ
Ｃにより決定した。サンプルのｐＨをＮａＯＨを用いてｐＨ９.５に調整し、エチルアセテート中へ抽出し、Ｍｇ₂ＳＯ₄にて乾燥させ、２５ｍ×０.２５ｍｍキラシルＤＥＸＣＢカラム上へ注入した。分析中のオーブンの温度を１２５℃に
維持した。生成物のエナンチオマー過剰率(ｅｅ)をＨＰＬＣにより決定した。サ
ンプルのｐＨをＮａＯＨを用いてｐＨ９.５に調整し、エチルアセテート中へ４回抽出し、エステルを除去した。次いでｐＨをＨ₃ＰＯ₄を用いて１.５に調整し、産物をエチルアセテート中へ抽出し、Ｍｇ₂ＳＯ₄にて乾燥させ、２０μｌを２
５ｃｍのキラルセルＯＤカラム上へ注入した。溶離バッファーは９２：８：１
へプタン：プロパン-２-オール：トリフルオロ酢酸であった。流速は１.０ｍＬ／分であり、検出は２５４ｎｍにて行った。

【００３０】初めのスクリーニングにおいて株アスペルギルスタマリイ(ＣＭＣ３２４２)
は４８時間の生物転換の後、添加基質の３０％の転換を得た。残存エステルは９
９％ｅｅ過剰率の(Ｒ)-エナンチオマーであり、生成物は７４％のｅｅ過剰率の(
Ｓ)-エナンチオマーであることが示された。上述のように、株はＩＭＩに既に寄
託されている。

【００３１】アスペルギルスタマリイＣＭＣ３２４２の発酵胞子懸濁接種物を調製するために、アスペルギルスタマリイの培養物をＰＤ
Ａプレート(１２１℃で２０分間滅菌し、５０℃に冷却し、１４０ｍｍペトリ皿に注いだ３９ｇ／Ｌのジャガイモデキストロースアガー(オキソイドＣＭ１３９)
)上に展開し、２５℃で７日間インキュベートした。アスペルギルスタマリイの胞子を次いで滅菌(１２１℃にて２０分間滅菌した)１０％ｗ／ｖグリセロー
ル＋０.１％ｗ／ｖトゥイーン８０に再懸濁した。１ｍＬのサンプルを２ｍＬのクリオバイアルに分注し、−８０℃で保存した。

【００３２】以下の培地を発酵槽の中で使用した：ＫＨ₂ＰＯ₄(７ｇ／Ｌ)、Ｋ₂ＨＰＯ₄(２ｇ／Ｌ)、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄(１ｇ／Ｌ)、ＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ(１ｇ／Ｌ)、微量元素溶
液(１ｍＬ／Ｌ)、ポリプロピレングリコール(１ｍＬ／Ｌ)、イースト抽出物( ２０ｇ／Ｌ)およびスクロース(２０ｇ／Ｌ)。

【００３３】培地を各発酵槽当たり終体積が１.５Ｌとなるよう作成し、ｐＨを６.０に調整
した後滅菌した(６０分間１２１℃)。スクロースを５０％ｗ／ｖ溶液として別に
滅菌し、冷却後、発酵槽に加えた。発酵槽に１ｍＬの胞子懸濁物を接種した。温
度を２５℃に保持し、ｐＨを５.８から６.２の間に調整した。１０００ｒｐｍで
振動させ、空気流を１.０Ｌ／分に設定した。１００ｍＬの３４％ｗ／ｖスクロース＋１００ｍＬの３４％ｗ／ｖイースト抽出物＋１.７ｇ／Ｌ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄(１２１℃で６０分間別々に滅菌した)の栄養分を４８時間後に発酵槽に添加した。７２時間生育させた後発酵物をろ過により収集し、細胞ペーストとして- ２０℃で貯蔵した。全湿バイオマス２５０ｇを収集した。細胞の活性は４１.７Ｕ／ｇであった(ＩＵ＝１時間に産出される１ｍｇ生成物)。

【００３４】全細胞生物転換凍結させた細胞ペースト(５０ｇ)を２００ｍＬの０.１ＭＮａ₂ＨＰＯ₄／ＮａＨ₂ＰＯ₄バッファー(ｐＨ６.４)中で解凍した。モーターとすりこぎを用いて細胞を粉砕した。反応物に１００ｇのラセミ体のＮ-ベンゾイル-２-アゼチジンカルボン酸メチルエステルを添加し、体積を２００ｍＬの０.１ＭＮａ₂ＨＰＯ ₄ ／ＮａＨ₂ＰＯ₄バッファー(ｐＨ６.４)を用いて１０００ｍＬにした。反応を２
５℃で行い、ｐＨを６.４に調整した。更に５０ｇの細胞を４.５時間後に添加し
た。

【００３５】１２時間後、生物転換汁をセライトパッドを通してろ過した。残存物をジクロ
ロメタン(５００ｍＬ)を用いて洗浄し、２層のろ過物を分け、水性溶液を更なる
ジクロロメタン(４×７５０ｍＬ)を用いて抽出した。合わせたジクロロメタン溶
液を塩水(２００ｍＬ)を用いて洗浄し、乾燥させ(ＭｇＳＯ₄)、ろ過し、溶媒を真空中でエバポレートし、橙色のオイル(５６.１ｇ、５６.１％回収、５４％ｅｅ)を得た。原水溶液を酸性化し(ｐＨ２、濃ＨＣｌ)、再びジクロロメタン(３×
７５０ｍＬ)で抽出した。有機(穏やかに乳化された)溶液を各回分離し、合わせた。これらの合わせた抽出物を静置して(１時間)分離し、分液漏斗に通した。有
機相を塩水(１００ｍＬ)で洗浄し、乾燥させ(ＭｇＳＯ₄)、ろ過し、溶媒を真空中でエバポレートし、半結晶化固体(３３.７ｇ、３６％収量、９４％ｅｅ)を産出した。この半結晶化酸(３３ｇ)をエチルアセテート(７５ｍＬ)中で２０分間室
温にて攪拌し、白色固体(１８ｇ、５５％収量、＞９９％ｅｅ)を吸引ろ過により
収集した。ろ過物を乾燥状態までエバポレートし、第２群の生成物を単離した( ２ｇ、６％収量、＞９９％ｅｅ)。¹Ｈｎｍｒ(ＣＤＣｌ₃)は生成物の構造と一致した。

【００３６】 (Ｓ)-Ｎ-ベンゾイルアゼチジン-２-カルボン酸(５.９０ｇ、２８.７８ｍｍｏｌ)を水酸化ナトリウム水溶液(６.９２ｇ、０.１７３モル、９２ｍＬ水中)に室温にて攪拌しながら溶解した。反応物を７５℃まで２２時間加熱し、次いで室温
まで冷却させた。反応混合物をｐＨ２に(濃ＨＣｌにて)調整し、エチルアセテー
ト(３×１００ｍｌ)を用いて抽出した。水溶液を次いで乾燥状態までエバポレー
トし、白色固体(１３ｇ)を得た。これを無水エタノール(１５０ｍＬ)中５０℃に
て１時間スラリーにし、室温まで(〜１時間)冷却させた。吸引ろ過により塩を除
去し、エタノール溶液を乾燥状態までエバポレートし、白色固体(１.８５ｇ、４
７％収量)を得た。

【００３７】分離物を水(１００ｍｌ)中に再溶解し、アンバーライト(Amberlite)ＩＲＡ-６
７イオン交換樹脂(５ｇ)を用いて３０分間攪拌することにより中和した(ｐＨ７.
１まで)。樹脂を吸引ろ過により除去し、ろ過物を乾燥状態までエバポレートし、わずかにオフホワイトの固体(１.３８ｇ、収量)を得た。オフホワイトの固体を還流ＭｅＯＨ(１０ｍＬ)を用いて５分間懸濁し、室温まで冷却し、精製生成物
を吸引ろ過により収集した(９０５ｍｇ、３１％収量、９８％ｅｅ)。¹Ｈｎｍｒ(
Ｄ₂Ｏ)は生成物の構造と一致した。

【００３８】全ＲＮＡの調製１２５ｍｌのアスペルギルスタマリイＣＭＣ３２４２培養物を３０℃にて４
８時間インキュベートした。細胞をろ過(ホワットマン２.７μｍＧＦ／Ｄグラ
スミクロファイバー)により収集した。回収した細胞(１２ｇ湿重量)をＲＮａｓｅフリーの乳棒、乳鉢へ液体Ｎ₂と共に投入し、ホモジナイズした。ホモジナイズを２８ｍｌの抽出バッファーを加えながら３回繰り返した。懸濁液をＲＮａｓ
ｅ-フリーの遠心チューブに移し、細胞片を遠心分離 (５０００ｇ、３０分、１５℃)により回収した。懸濁物をきれいなＲＮａｓｅフリーのチューブに移し、そこで上清を１６ゲージの注射針に少なくとも１０回通すことによりＤＮＡを破
砕した。６.５ｍｌの分離溶液を１３ｍｌの超遠心分離チューブ中のセシウムトリフルオロアセテート６.０ｍｌの上に層を成した。

【００３９】チューブを次いで「スィング-アウト」超遠心分離ローターの中に設置し、遠心分離(１２５０００ｇ、１５時間、２０℃)によりＲＮＡを分離するための勾配
を形成させた。勾配をＲＮＡペレットのところまで吸引し、次いで１００μｌの
ＴＥバッファーに再懸濁した。ＲＮＡを次いで６５℃まで１０分間加熱し、遠心
分離(１６０００ｇ、１０分間、２０℃)により清澄化し、上清を１００μｌのＴ
Ｅと混合し、加熱と清澄化を繰り返した。上清のＲＮＡ濃度をエチジウムブロマ
イドを用いて蛍光により標準と比較して決定した。全ＲＮＡ調製物をサンプルの
体積の１／１０の３Ｍのナトリウムアセテートおよびサンプルの体積の２.５倍の１００％(ｖ／ｖ)エタノールにより沈殿させ、沈殿物を−２０℃にて必要時ま
で保存した。

【００４０】ｍＲＮＡの精製全ＲＮＡ沈殿物を遠心分離により(２１０００ｇ、３０分、４℃)回収し、ペレ
ットをＲＮａｓｅフリーの７０％(ｖ／ｖ)エタノールを用いて洗浄した(２１０００ｇ、１０分間、４℃)。ＲＮＡのペレットを乾燥させ、３００μｌのＴＥバッファーに再懸濁した。再懸濁された全ＲＮＡ調製物から、ファルマシアバイ
オテッククイックプレップ(Pharmacia Biotech Quick Prep) ｍＲＮＡ精製キ
ット＃２７-９２５４Ｂを用いて精製した。２つのオリゴ(ｄＴ)セルロースカラムを平衡化し、１５０μｌのＲＮＡ調製物を３.８５ｍｌの溶離バッファーと混合し、各カラムに加えた。ｍＲＮＡを遠心分離(３５０ｇ、２分、２０℃)により
結合させ、残存汚染物を３×３ｍｌ高塩バッファーウォッシュ(３５０ｇ、２分、２０℃)により除去した。続いて２回３ｍｌの低塩バッファー(３５０ｇ、２分
、２０℃)を用いて洗浄した。結合させたｍＲＮＡを２×２５０μｌの溶離バッファー(あらかじめ６５℃に温めた)を添加することにより溶離し、遠心分離した
(３５０ｇ、２分、２０℃)。溶離ｍＲＮＡを次いで１０μｌのグリコーゲン、ア
ンプル体積の１／１０の酢酸カリウム溶液および１ｍｌの１００％(ｖ／ｖ)エタ
ノールを添加することにより沈殿させ、サンプルを-２０℃で２時間静置し、沈殿を完成させた。沈殿物を遠心分離により(２１０００ｇ、３０分、２０℃)回収
した。ｍＲＮＡペレットを７０％(ｖ／ｖ)エタノールを用いて洗浄し(２１０００ｇ、２分、２０℃)、乾燥させた。ｍＲＮＡペレットを次いで２５μｌのＤＥＰＣＨ₂Ｏに再懸濁し、次のｃＤＮＡ合成のために用意した。

【００４１】ｃＤＮＡの合成調製ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換はストラタジーン(Stratagene）ザップ-ｃ
ＤＮＡ合成キット＃２００４００を用いて遂行した。第１鎖の合成をｍＲＮＡの
ポリＡ末端にポリｄ(Ｔ)-リンカープライマーを結合させることにより開始し、第１鎖のｃＤＮＡをＭＭＬＶ-ＲＴ(逆転写酵素)により逆転写させた。ｃＤＮＡの合成を測定するために放射線標識した³⁵Ｐ-ｄＡＴＰの取り込みを用いた。第１鎖合成の完成時に、ｍＲＮＡにニックを入れ、第２鎖の合成のためのプライマ
ーを作成し、ＤＮＡポリメラーゼにより終了した。オートラジオグラフにより２
.１Ｋｂのコントロールに隣接するサイズの二重鎖ｃＤＮＡの十分量が産生されたことを確認した。ｃＤＮＡ断片の調製は「平滑末端化」、リン酸化、ＥｃｏＲ
Ｉリンカーの結合および最終的にはＸｈｏＩの切断により終えられ、発現のため
の正確な方向づけを与える非対称断片を形成した。

【００４２】ｃＤＮＡのサイズの分別所望のｃＤＮＡ断片が約８３ｋＤａの遺伝子産物(エステラーゼ)をコードする
と仮定すると、１.８-２.４ｋｂのｃＤＮＡ断片がクローニングやスクリーニングのために好ましい。それゆえ、ｃＤＮＡの各々のサイズのプールを作るために
、構造の異なるｃＤＮＡ群をセファロースＣＩ-２Ｂろ過カラムを通して断片化した。ｃＤＮＡおよび組み込まれなかった³²Ｐ-ｄＡＴＰの溶離をガイガーカウンターにより測定した。基質はより小さい断片を保持するので、ｃＤＮＡ断片は
最大のものから最小のものへと溶離された。フェノール：クロロホルムを用いて
４つの溶離断片プールを抽出し(２１０００ｇ、１０分、２０℃)、エタノールで
沈殿させた。沈殿したｃＤＮＡを遠心分離により回収し(２１０００ｇ、３０分、４℃)、ペレットを乾燥させ、２.５μｌのＨ₂Ｏに再懸濁した。

【００４３】Ｎ-末端アミノ酸配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー天然型アスペルギルスタマリイＣＭＣ３２４２エステラーゼの精製から、あ
るＮ末端アミノ酸配列(配列番号３)がＫＰＰＱＴＫＫであることが決定された。
この配列から、５つの変性オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号４-８)を合成した。他の３つの変性オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号９-１１)を別のＮ末端配列、ＤＱＡＱＷＦＫ(配列番号１２)に基づいて合成した。

【００４４】ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ) 合成ポリＡ₍₂₀₎オリゴヌクレオチドプライマーと上記プライマーの各々を用い
て、ＰＣＲをアスペルギルスタマリイＣＭＣ３２４２から調製したｃＤＮＡに
基づいて遂行した。いろいろな温度およびＭｇ²⁺濃度を用いて、いろいろなＰＣ
Ｒ断片が得られた。１.５および２.５ｋｂの間の断片を単離し、精製し、ｐＣＲ
２.１(インビトロゲンリミテッド)およびｐＣＲ-スクリプト(ストラタジーン)
中にクローン化した。更に、ＰＣＲ断片を平滑末端化し、ｐＵＣ１９に結合させ
た。結合反応物を大腸菌株ＩＮＶαＦ’、ＸＬ１-ブルーＭＲＦ’およびＤＨ５ αに各々形質転換させた。

【００４５】形質転換した細胞を次いでアンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)、１ｍＭＩＰＴ
ＧおよびＸｇａｌ(５０μｇ／ｍｌ)を含有するトリプトンダイズブロースアガ
ー(オキソイドリミテッド.＃ＣＭ１２９)上に広げた。Ｎ-ベンジルオキシカル
ボニル-２-アゼチジンカルボン酸で被覆される形質転換実施物は、ガラス(ボロシリカ)ペトリ皿中のトリプトンダイズブロースアガー添加補充物上に広げた。

【００４６】大腸菌エステラーゼ発現形質転換体のスクリーニング形質転換された大腸菌のコロニーへ、メチルＮ-ベンジルオキシカルボニル-( Ｓ)-フェニルアラニン、メチルＮ-ベンジスオキシカルボニル-２-アゼチジンカルボキシレート又はメチル(Ｓ)-ベンジルオキシカルボニル-２-アゼチジンカルボキシレートを以下の各方法により被覆した。

【００４７】オキソイドバクトアガーを２００ｍＭＫＨ₂／Ｋ₂ＨＰＯ₄(ｐＨ６.４)中溶
解しながら(〜６０℃)１％(ｗ／ｖ)に調製し、トゥイーン８０(〜０.５ｍｇ／ｍ
ｌ)とメチルＮ-ベンジルオキシカルボニル-(Ｓ)-フェニルアラニン(２ｍｇ／ｍｌ)を添加した。激しく揺り動かして乳濁液を生成した。一度冷却し(４８℃)、エステル懸濁液を大腸菌の形質転換コロニーの上に注いだ。プレートを室温にて
２４-２８時間放置し、クリアランスの範囲を観察した。

【００４８】この方法をメチルＮ-ベンジルオキシカルボニル-２-アゼチジンカルボキシレート(８ｍｇ／ｍｌ)およびメチル(Ｓ)-Ｎ-ベンジルオキシカルボニル-２-アゼチ
ジンカルボキシレート(８ｍｇ／ｍｌ)と共に１００ｍＭＫＨ₂／Ｋ₂ＨＰＯ₄(ｐ
Ｈ６.４)を用いる範囲でのみ変更して行った。

【００４９】組換えエステラーゼの単離ＰＣＲ形質転換物のオーバーレイは、ラセミ体のＮ-ベンジルオキシカルボニル-２-アゼチジンカルボキシレートにより被覆された際に所望のクリアランスゾ
ーンを与える１４７形質転換体を同定した。これら１４７の単離物の中で、(Ｓ)
-Ｎ-ベンジルオキシカルボニル-２-アゼチジンカルボキシレートを用いたオーバ
ーレイに関して１０クローンが明確なクリアリングを生ずることが出来た。プラ
スミドＤＮＡをこれらの１０個の推定エステラーゼクローンから調製した。アガ
ロースゲル電気泳動は、１０クローンがサイズと切断面に関して同じインサート
を持つことを示した。３.０ｋｂのバンドはｐＣＲ-スクリプトクローニングベ
クター(２.９ｋｂ)と１００ｂｐのクローン化ＰＣＲ断片を含んでいた；９００ｂｐおよび２×３５０ｂｐの明確なバンドはＰＣＲインサートのＸｈｏＩ断片で
あった。

【００５０】推定エステラーゼのＤＮＡ配列の分析推定エステラーゼクローンのＤＮＡ配列の分析により１.５ｋｂのインサート(
配列番号１)があることが示された。最長の推定オープンリーディングフレームは１２８３ｂｐにまでおよび、４２７アミノ酸残基のペプチド(配列番号２；約４３ｋＤａ)を翻訳する。Ｎ末端由来の配列の変換物のいずれかに相同の配列は全く同定されなかった。実際のところは、クローン化断片内の配列換えと共に、
クローニングベクターの多くのクローニング部位内の欠失が起こった。先端が切
除されていることに加えて、推定の組換えエステラーゼが野生型のアスペルギル
スエステラーゼと反対の選択性を有することが示された。

【００５１】ポリリンカー(〜６０ｂｐ)の欠失およびＮ−末端コード配列のいずれもが欠失
したことについて考え得る説明は、挿入部位付近のＤＮＡの相同性により引起こ
されるステムループの形成によりもたらされる組換えであろう。大腸菌宿主ＤＮ
Ａのミスマッチ修復機構は、プラスミドがうまく複製出来るようにステムループ
を開裂し、それによりＰＣＲインサートの５’部位およびｐＣＲ-スクリプトポリリンカー部位を削除し得る。

【００５２】配列表 (１)一般的な情報： (ｉ)出願人： (Ａ)名称：カイロテックテクノロジーリミテッド (Ｂ)ストリート：ケンブリッジサイエンスパーク、ミル
トンロード (Ｃ)シティー：ケンブリッジ (Ｄ)ステート：Ｎ／Ａ (Ｅ)国：イギリス (Ｆ)郵便番号(ＺＩＰ)：シービー４４ダブリュイー (ｉｉ)発明の名称：微生物および該微生物から得られるエステラ
ーゼ (ｉｉｉ)配列の数：１２ (ｉｖ)コンピューターの読み取り： (Ａ)媒体の種類：フロッピーディスク (Ｂ)コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル (Ｃ)オペレーティングシステム：ＰＣ-ＤＯＳ／ＭＳ-ＤＯ
Ｓ (Ｄ)ソフトウエア：パテンチンリリース＃１.０、バージョン＃１.３０(ＥＰＯ) (ｖ)現在の出願の情報：出願番号：ＷＯは未知である。 (２)配列番号１の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：１５３２塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：ＤＮＡ(genomic) (ｉｉｉ)ハイポセティカル：ＮＯ (ｉｖ)アンチセンス：ＮＯ (ｖｉ)オリジナルソース： (Ａ)微生物：アスペルギルスタマリイ(Aspergillus tamar ii ) (ｉｘ)特徴： (Ａ)名前／キー：ＣＤＳ (Ｂ)場所：１..１２８１ (ｘｉ)配列番号１： ATG ACC ATG ATT ACG CCA AGC TCA GCC ATG GGA ATG TCG TCT ACA TTT 48
Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ser Ala Met Gly Met Ser Ser Thr Phe 1 5 10 15 GAA TTT GAG CGT GTC ATT ACC AAG GCG GTC GAG GAC CGC GTC ATT CCT 96
Glu Phe Glu Arg Val Ile Thr Lys Ala Val Glu Asp Arg Val Ile Pro 20 25 30 GGC GTC GTG CTG CTG GCC GAA AAC TCA TCG GGC TCG TAT CAC TAT GAA 144
Gly Val Val Leu Leu Ala Glu Asn Ser Ser Gly Ser Tyr His Tyr Glu 35 40 45 AAG GTA CTC GGC TAC AGC TCC ATC GAG GCG GGC AAC GAG AAA AAG CTC 192
Lys Val Leu Gly Tyr Ser Ser Ile Glu Ala Gly Asn Glu Lys Lys Leu 50 55 60 GAG CGC GAC AGC GTG TTC ACG TTC ATG TCC ATG ACC AAG TTC ATA ACA 240
Glu Arg Asp Ser Val Phe Thr Phe Met Ser Met Thr Lys Phe Ile Thr 65 70 75 80 GCC ATT GTG GCC ATG CAG GCC GTC GAG CGT GGT CTC TGG GAC CTC GAT 288
Ala Ile Val Ala Met Gln Ala Val Glu Arg Gly Leu Trp Asp Leu Asp 85 90 95 GCC GAT GTC GCG CCT CTG CTG CCC GAA CTG GCG GCC CTG CCT GTC CTC 336
Ala Asp Val Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Ala Ala Leu Pro Val Leu 100 105 110 AAG GGT TTC TCA GAC GAT GGC GTG CCC GAG CTG GTG CCG CGC GAG TCG 384
Lys Gly Phe Ser Asp Asp Gly Val Pro Glu Leu Val Pro Arg Glu Ser 115 120 125 GCC ATT ACG CTG CGC CAG CTG TTG TCG CAC ACG TCG GGC GCA GCC TAC 432
Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu Leu Ser His Thr Ser Gly Ala Ala Tyr 130 135 140 GAC TTC TTG TCG CCC GAT CTG ATC AAC TAC CAC GCG TGG GTA CGC AAG 480
Asp Phe Leu Ser Pro Asp Leu Ile Asn Tyr His Ala Trp Val Arg Lys 145 150 155 160 CAG CCT CCA TCG GCC GGT CTT GAG CAG CCA CCG GCA ATG ACT GTG GCA 528
Gln Pro Pro Ser Ala Gly Leu Glu Gln Pro Pro Ala Met Thr Val Ala 165 170 175 CCT CCG TCT GTT GAG GAG CGG TTC CGG TTT CCG CTC GTA TTC CAG CCT 576
Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg Phe Arg Phe Pro Leu Val Phe Gln Pro 180 185 190 GGC CAA GGC TGG CAG TAC GGC TCG AGC CTG GAC TGG GTC GGC CGT CTT 624
Gly Gln Gly Trp Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Trp Val Gly Arg Leu 195 200 205 GTT GAA GCG CCT GGA CGC CAA GAC ACA GGG GCA AGA CTG AAG AAG GAA 672
Val Glu Ala Pro Gly Arg Gln Asp Thr Gly Ala Arg Leu Lys Lys Glu 210 215 220 GCA GGC ACC AAG CTG CCG TCG GTG CCT CTG GAA GAG ATT GTG ATC CGT 720
Ala Gly Thr Lys Leu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile Val Ile Arg 225 230 235 240 GAT GTG CTC ACA CCC CTG GGG CTG CCT GCT GGC GCC TTG ACG TTC TCG 768
Asp Val Leu Thr Pro Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Leu Thr Phe Ser 245 250 255 CCG GAG CGC TAT CCC GAC GTG TTC GCA CGA ATG TGG CCA TCG CTG CCC 816
Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Val Phe Ala Arg Met Trp Pro Ser Leu Pro 260 265 270 GTG CGT GTC GGC AAC AAC GGT GCA CTG GAT GGC GGA CCA GTT GTG CAT 864
Val Arg Val Gly Asn Asn Gly Ala Leu Asp Gly Gly Pro Val Val His 275 280 285 GGT CCG TCC GTG TAC AAA AAG GCA CCT GCT GCT CTG GGC GGA CAG GGC 912
Gly Pro Ser Val Tyr Lys Lys Ala Pro Ala Ala Leu Gly Gly Gln Gly 290 295 300 ATG TAC GGC GAC ATG CCA TCG TTT TTC AAG GTG GCA CTC TCT ATT TTC 960
Met Tyr Gly Asp Met Pro Ser Phe Phe Lys Val Ala Leu Ser Ile Phe 305 310 315 320 CGC GAC GAC GGC AAG CTG CTG AAG CCC GAG TCA ACG AAG CTA TTC TTT 1008
Arg Asp Asp Gly Lys Leu Leu Lys Pro Glu Ser Thr Lys Leu Phe Phe 325 330 335 GAG CCG CAG CTG GCG TCC AAG GCC GCA CAC GCG GGC ATT ATG CAT GGC 1056
Glu Pro Gln Leu Ala Ser Lys Ala Ala His Ala Gly Ile Met His Gly 340 345 350 ACC GAG AAC TCT GGA TGG ATT ACT GGC GAT GTG CCC GAC ACC AAG GAG 1104
Thr Glu Asn Ser Gly Trp Ile Thr Gly Asp Val Pro Asp Thr Lys Glu 355 360 365 TAC TGC TGG AGT GTT GCT GGC CTT TTG GTG ACG GGC GAC TCG CAC CCA 1152
Tyr Cys Trp Ser Val Ala Gly Leu Leu Val Thr Gly Asp Ser His Pro 370 375 380 TTC CGG AAG AGG GGT GCT GTT CTG TGG GCC GGC GCG TTC AAC CTG ACA 1200
Phe Arg Lys Arg Gly Ala Val Leu Trp Ala Gly Ala Phe Asn Leu Thr 385 390 395 400 TGG ATC ATA GAC AAG GAG GCC GAT GTG TGC GCC GTG TTT GGA TCC AAC 1248
Trp Ile Ile Asp Lys Glu Ala Asp Val Cys Ala Val Phe Gly Ser Asn 405 410 415 TAC CAG CCG CCA GGC GAC CAG CAG GCA AGG CGC TGATGCGGCA GTGGGAGGAG 1301
Tyr Gln Pro Pro Gly Asp Gln Gln Ala Arg Arg 420 425 TTTGTCTACT CGCAAGCCAA GACGGCGAAG CTGTAGGCGG GAGGTATATG TCACAGTTTT 1361 GTCAAGTCTC AAGTTTGGAT AATATATTAA AAATGTAAAT TGCAGTAAAT TTCAAAAAAA 1421 AAAAAAAAAA ACTCGAGGGG GGGGGATCCG TCGGAAATAC AGGAACGCAC GCTGGATGGC 1481 CCTTCGCTGG GATGGTGAAA CCATGAAAAA TGGTAGCTTC AGTGGATTAA G 1532 ２)配列番号２の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：４２７アミノ酸 (Ｂ)種類：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：タンパク質 (ｘｉ)配列番号２： Met Thr Met Ile Thr Pro Ser Ser Ala Met Gly Met Ser Ser Thr Phe 1 5 10 15 Glu Phe Glu Arg Val Ile Thr Lys Ala Val Glu Asp Arg Val Ile Pro 20 25 30 Gly Val Val Leu Leu Ala Glu Asn Ser Ser Gly Ser Tyr His Tyr Glu 35 40 45 Lys Val Leu Gly Tyr Ser Ser Ile Glu Ala Gly Asn Glu Lys Lys Leu 50 55 60 Glu Arg Asp Ser Val Phe Thr Phe Met Ser Met Thr Lys Phe Ile Thr 65 70 75 80 Ala Ile Val Ala Met Gln Ala Val Glu Arg Gly Leu Trp Asp Leu Asp 85 90 95 Ala Asp Val Ala Pro Leu Leu Pro Glu Leu Ala Ala Leu Pro Val Leu 100 105 110 Lys Gly Phe Ser Asp Asp Gly Val Pro Glu Leu Val Pro Arg Glu Ser 115 120 125 Ala Ile Thr Leu Arg Gln Leu Leu Ser His Thr Ser Gly Ala Ala Tyr 130 135 140 Asp Phe Leu Ser Pro Asp Leu Ile Asn Tyr His Ala Trp Val Arg Lys 145 150 155 160 Gln Pro Pro Ser Ala Gly Leu Glu Gln Pro Pro Ala Met Thr Val Ala 165 170 175 Pro Pro Ser Val Glu Glu Arg Phe Arg Phe Pro Leu Val Phe Gln Pro 180 185 190 Gly Gln Gly Trp Gln Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Trp Val Gly Arg Leu 195 200 205 Val Glu Ala Pro Gly Arg Gln Asp Thr Gly Ala Arg Leu Lys Lys Glu 210 215 220 Ala Gly Thr Lys Leu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile Val Ile Arg 225 230 235 240 Asp Val Leu Thr Pro Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Leu Thr Phe Ser 245 250 255 Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Val Phe Ala Arg Met Trp Pro Ser Leu Pro 260 265 270 Val Arg Val Gly Asn Asn Gly Ala Leu Asp Gly Gly Pro Val Val His 275 280 285 Gly Pro Ser Val Tyr Lys Lys Ala Pro Ala Ala Leu Gly Gly Gln Gly 290 295 300 Met Tyr Gly Asp Met Pro Ser Phe Phe Lys Val Ala Leu Ser Ile Phe 305 310 315 320 Arg Asp Asp Gly Lys Leu Leu Lys Pro Glu Ser Thr Lys Leu Phe Phe 325 330 335 Glu Pro Gln Leu Ala Ser Lys Ala Ala His Ala Gly Ile Met His Gly 340 345 350 Thr Glu Asn Ser Gly Trp Ile Thr Gly Asp Val Pro Asp Thr Lys Glu 355 360 365 Tyr Cys Trp Ser Val Ala Gly Leu Leu Val Thr Gly Asp Ser His Pro 370 375 380 Phe Arg Lys Arg Gly Ala Val Leu Trp Ala Gly Ala Phe Asn Leu Thr 385 390 395 400 Trp Ile Ile Asp Lys Glu Ala Asp Val Cys Ala Val Phe Gly Ser Asn 405 410 415 Tyr Gln Pro Pro Gly Asp Gln Gln Ala Arg Arg 420 425 ２)配列番号３の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：７アミノ酸 (Ｂ)種類：アミノ酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：ペプチド (ｖ)断片の種類：Ｎ末端 (ｘｉ)配列番号３： Lys Pro Pro Gln Thr Lys Lys 1 5 ２)配列番号４の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２１塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｘｉ)配列番号４： AARCCNCCNC ARACNAARAA R 21 ２)配列番号５の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２３塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｘｉ)配列番号５： AAAARCCNCC NCARACNAAR AAR 23 ２)配列番号６の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２４塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｘｉ)配列番号６： AAAAARCCNC CNCARACNAA RAAR 24 ２)配列番号７の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２１塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｉｘ)特徴： (Ａ)名称／キー：misc difference (Ｂ)場所：置換(１..２１、「ｎ」) (Ｃ)他の情報：／標準名＝「イノシトール」 (ｘｉ)配列番号７： AANCCNCCNC ANACNAANAA N 21 ２)配列番号８の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：１９塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｘｉ)配列番号８： ACCNCCNCAR ACNAARAAR 19 ２)配列番号９の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２０塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide” (ｘｉ)配列番号９： GAYCARGCNC ARTTYAARCC 20 ２)配列番号１０の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２１塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide”
(ｘｉ)配列番号１０： AGAYCARGCN CARTTYAARC C 21 ２)配列番号１１の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：２２塩基対 (Ｂ)種類：核酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：他の核酸 (Ａ)ディスクリプション：／desc=“Oligonucleotide”
(ｘｉ)配列番号１１： AAGAYCARGC NCARTTYAAR CC 22 ２)配列番号１２の情報： (ｉ)配列の種類： (Ａ)長さ：７アミノ酸 (Ｂ)種類：アミノ酸 (Ｃ)鎖の数：一本鎖 (Ｄ)トポロジー：直鎖 (ｉｉ)分子の種類：ペプチド (ｖ)断片の種類：Ｎ−末端 (ｘｉ)配列番号１２： Asp Gln Ala Gln Trp Phe Lys 1 5

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｐ 17/10 (Ｃ１２Ｎ 1/19 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:66） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:66） 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ロバート・クリストファー・ブラウンイギリス、シービー４・４ダブリューイー、ケンブリッジ、ミルトン・ロード、ケンブリッジ・サイエンス・パーク、カイロテック・テクノロジー・リミテッド (72)発明者スティーブン・ジョン・クリフォード・テイラーイギリス、シービー４・４ダブリューイー、ケンブリッジ、ミルトン・ロード、ケンブリッジ・サイエンス・パーク、カイロテック・テクノロジー・リミテッドＦターム(参考） 4B024 AA03 BA11 CA01 DA06 HA01 4B050 CC03 DD03 LL05 4B064 AE48 CA02 CA05 CA19 CB03 CC24 4B065 AA26X AA60Y AB01 AC14 BD33 CA17 CA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＩＭＩ３７５９３０として入手される微生物の特徴を有する
微生物。
【請求項２】ラセミ体のＮ-ベンゾイル-２-アゼチジンカルボン酸メチルエステルから少なくとも９９％のエナンチオマー過剰率で(Ｓ)-Ｎ-ベンゾイル- ２-アゼチジンカルボン酸を生成する能力により特徴付けられる微生物。
【請求項３】エステラーゼ活性を有する、請求項１記載の微生物から得ら
れ得る酵素又は、同じ若しくは反対のエナンチオマー選択性を有するその断片。
【請求項４】Ｎ-ベンゾイルアゼチジン-２-カルボン酸メチルエステルのエナンチオマーを加水分解することができる、配列番号２に示されるアミノ酸配
列を含む酵素又はその断片。
【請求項５】固定型の、請求項３又は請求項４に記載の酵素。
【請求項６】請求項４記載の酵素をコードしている単離ヌクレオチド。
【請求項７】配列番号１に示される配列の全部又は一部を有する、請求項
６記載のヌクレオチド。
【請求項８】請求項４記載の酵素を発現するよう形質転換された微生物。
【請求項９】請求項１、２および８のいずれかに記載の微生物を培養する
ことを含む、請求項３記載の酵素を製造するための方法。