JP2001507688A - ヌクレオシド類似体の化学合成とそのポリヌクレオチドへの導入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規ヌクレオシド、ヌクレオシドの化学合成およびヌクレオシドのポリヌクレオチド中への取り込みの方法が開示される。また、２’−Ｏ−アミノ、Ｌ−ヌクレオチドおよび他のもの等の１つまたはそれ以上の修飾を有するポリヌクレオチド、例えばアンチセンス、ＴＦＯおよび核酸触媒も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシド類似体の化学合成とそのポリヌクレオチドへの導入 発明の背景 本発明は新規なヌクレオシド類似体、これら類似体の化学合成及びそのポリヌ クレオチドへの導入に関する。 以下は、ヌクレオシド、及びオリゴヌクレオチドの化学修飾に関する簡略な記 載である。本概要は完璧を期すものではなく、以下に述べる本発明の理解のため だけのものである。本概要は、以下に記載される研究のすべてが特許請求される 本発明の先行技術であることを容認するものではない。 塩基及び糖のヌクレオシド修飾は、天然に存在する多種多様なＲＮＡで発見さ れてきた（例、ｔＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ；Ｈａｌｌ、１９７１「核酸の修 飾されたヌクレオシド」コロンビアユニバーシティプレス、ニューヨーク；Ｌｉ ｍｂａｃｈ等、１９９４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８ ３に概説されている）。核酸におけるこれらヌクレオシド修飾の生物学的意義、 構造及び熱力学的な性質、及びヌクレアーゼ抵抗性を理解しようとして、何人か の研究者が、種々の塩及び糖を修飾してヌクレオシド、ヌクレオチド及びホスホ ルアミダイトを化学合成し、それらをオリゴヌクレオチドに導入してきた。 ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎ、１９９０，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０ ，５４３は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを安定化させるためのヌクレオ シド修飾の用途を概説している。 Ｕｓｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８７及びＷＯ９５／１３ ３７８は、酵素的核酸分子のヌクレアーゼ安定性を高めるための糖、塩基及び骨 格部分の修飾の用途を記載している。 Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０７０６５は、酵素的核 酸分子のヌクレアーゼ安定性を高めるための糖、塩基及び骨格部分の修飾の用途 を記載している。 Ｇｒａｓｂｙ等、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｄｉａｎ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、 １０６，１００３は、「ＲＮＡの構造及び機能に関する研究における合成オリゴ リボヌクレオチド類似体の応用例」を概説している。 ＥａｔｏｎとＰｉｅｋｅｎ、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． 、６４，８３７は、ＲＮＡ分子のヌクレアーゼ安定性を高める糖、塩基及び骨格 部分の修飾を概説している。 ＨｉｌｄｂｒａｎｄとＬｅｕｍａｎｎ、１９９６，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉ ｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３５，１９６８は、２−アミノピリジンヌクレオシド 誘導体の合成方法を記載している。 Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ、１９８１，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１，１〜２８は、アル コール（ＲＯＨ）をアミノオキシアルコール（ＲＯＮＨ₂）へ変換する方法を記 載した。 Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ（同上）によって記載された方法は、糖及び二糖類の変換 に応用されている（Ｇｒｏｃｈｏｗｓｋｉ等、１９７６，５０，Ｃ１５；Ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｓ １９７６，６８２；Ｊ．Ｂｕｌｌ．Ｐｏｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，３５，２２５；Ｔｒｏｎｃｈｅｔ等、１ ９８２，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，６５，１４０４；Ｃａｒｂｏｈｙｄ ｒ．Ｒｅｓ．，１９９０，２０４）。 Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ（同上）によって記載された方法はまた、３’−Ｏ−ＮＨ₂ ヌクレオシド及び５’−Ｏ−ＮＨ₂ヌクレオシドの合成に応用されている（Ｎｉ ｅｌｓｅｎ、１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．，２４ ，１６７；Ｂｕｒｇｅｓｓ等、１９９４，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃ ｏｍｍｕｎ．，９１５；Ｋｏｎｄｏ等、１９８５，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓ ｙｍｐ．Ｓｅｒ．，１６，９３；Ｖａｓｓｅｕｒ等、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ ｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，４００６；Ｔｒｏｎｃｈｅｔ等、１９９４，１３，２ ０７１；Ｐｅｒｂｏｓｔ等、１９９５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６０，５１５ ０）。 上記参考文献に開示された情報が今回特許請求される発明と異なっているのは 、それらが本発明に特許請求されるようなメトキシヌクレオシドの合成方法を開 示及び／又は考察していないからである。 発明の概要 本発明は構造式Ｉを有する新規ヌクレオシド類似体に関する： ここで、Ｒ１は独立的にＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ₃（Ｒ₃はアルキル、アルケニル、ア ルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール 及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、Ｃ−Ｒ₃（Ｒ₃は アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式ア リール、複素環式アリール、アミド及びエステルからなる群より独立的に選択さ れる成分である）、ハロ、ＮＨＲ₄（Ｒ₄はアルキル（Ｃ１−２２）、アシル（Ｃ １−２２）、置換された又は置換されてないアリール）、又はＯＣＨ₂ＳＣＨ₃（ メチルチオメチル）であり；Ｘは２−フルオロピリジン−３−イル、ピリジン− ２−オン−３−イル、ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−３ −イル、２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン−５−イル、２− アミノピリジン−５−イル及びピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）− オン−５−イルからなる群より独立的に選択されるヌクレオチド塩基であり；Ｙ は独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的にＤＭＴ又はリン含有基である。 １つの好ましい実施形態では、本発明は構造式ＩＩを有する新規ヌクレオシド 類似体を特徴とする： ここで、Ｒ１は独立的にＨ、ＯＨ、Ｏ−Ｒ₃（Ｒ₃はアルキル、アルケニル、ア ルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール 、アミド及びエステルからなる群より独立的に選択される成分である）、Ｃ−Ｒ₃ （Ｒ₃はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭 素環式アリール、複素環式アリール、アミド及びエステルからなる群より独立的 に選択される成分である）、ハロ、ＮＨＲ₄（Ｒ₄はアルキル（Ｃ１−２２）、ア シル（Ｃ１−２２）、置換された又は置換されてないアリール）、又はＯＣＨ₂ ＳＣＨ₃（メチルチオメチル）であり；Ｘは２−フルオロピリジン−３−イル、 ２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン−５−イル及び２−アミノ ピリジン−５−イルからなる群より独立的に選択されるヌクレオチド塩基であり ；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的にＤＭＴ又はリン含有基である 。 本発明はさらに核酸の糖部分を含むヌクレオシド又はヌクレオチドに関するも のであって、上記糖の２’位は２’−Ｏ−ＮＨＲ１なる式を有し、ここでＲ１は 独立的にＨ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステリル基、 リポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコチン酸残 基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基、アルキ ル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール 、複素環式アリール、アミド又はエステルである。本発明はまた核酸の糖部分を 含むヌクレオシド又はヌクレオチドに関するものであって、上記糖の２’位は２ ’−Ｏ−Ｎ＝Ｒ３なる式を有し、ここでＲ３は独立的にピリドキサール残基、ピ リ ドキサール−５−リン酸残基、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナ ール残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、 炭素環式アルキルアリール又は複素環式アルキルアリールである。 本発明は構造式ＩＩＩを有する新規ヌクレオシド類似体を特徴とする： ここで、Ｒ１は独立的にＨ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、 コレステリル基、リポ酸残基、レチノイン酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残 基、ニコチン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラ ン酸残基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、 炭素環式アリール、複素環式アリール、アミド又はエステルであり；Ｘは独立的 にヌクレオチド塩基又はその類似体又は水素であり；Ｙは独立的にリン含有基で あり；Ｒ２は独立的に保護基又はリン含有基である。 １つの好ましい実施形態では、本発明は構造式ＩＶを有する新規ヌクレオシド 類似体を特徴とする： ここで、Ｒ３は独立的に独立的にピリドキサール残基、ピリドキサール−５− リン酸残基、１３−シス−レチナール残基、９−シスーレチナール残基、アルキ ル、アルケニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール又 は複素環式アルキルアリールであり；Ｘは独立的にヌクレオチド塩基又はその類 似体又は水素であり；Ｙは独立的にリン含有基であり；Ｒ２は独立的に保護基又 はリン含有基である。 ある好ましい実施形態では、本発明は少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドを含 む核酸触媒を特徴とし、このＬ−ヌクレオチドは構造式Ｖを有する： ここで、Ｘは、修飾されてもされなくてもよい核酸塩基又は水素であり；Ｙは リン含有基であり；Ｒ１はＨ、ＯＨ又は他の２’修飾体であり；Ｒ２は保護基又 はリン含有基である。 「保護基」とはポリヌクレオチド合成の後に除去し得る及び／又は固相ポリヌ クレオチド合成で化学反応しない（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）基のことである。 「リン含有基」は、ジチオエート、ホスホルアミダイト及び／又はオリゴヌク レオチドの部分のような形態でリンを含み得る。 ある好ましい実施形態では、本発明は化学式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体 の合成方法を特徴とする。 「アルキル」基とは、直鎖、分岐鎖及び環式アルキル基を含む、飽和の脂肪族 炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は１〜１２の炭素を有する。より 好ましくは、それは炭素数１〜７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキ ルである。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。置換され る場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシ、シアノ、アルコキシ、ＮＯ₂又は Ｎ（ＣＨ₃）₂、アミノ又はＳＨである。 「アルケニル」基という用語は、直鎖、分岐鎖及び環式の基を含めて少なくと も１つの炭素−炭素二重結合を含んでいる不飽和の炭化水素基を指す。好ましく は、アルケニル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、それは炭素数１ 〜７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルケニルである。アルケニル基は 置換されていても置換されていなくてもよい。置換される場合、置換基は、好ま しくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂ 、アミノ又はＳＨである。 「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖及び環式の基を含めて少なくとも １つの炭素−炭素三重結合を含んでいる不飽和の炭化水素基を指す。好ましくは 、アルキニル基は１〜１２の炭素を有する。より好ましくは、それは炭素数１〜 ７の、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルケニルである。アルキニル基は置 換されていても置換されていなくてもよい。置換される場合、置換基は、好まし くは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂又はＮ（ＣＨ₃）₂ 、アミノ又はＳＨである。 「アリール」基とは、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する芳香族 の基を指し、炭素環式アリール、複素環式アリール及び二アリール基を含み、そ のいずれもが場合により置換されていてもよい。アリール基に付く好ましい置換 基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、シアノ、アルコキシ、 アルキル、アルケニル、アルキニル及びアミノ基である。 「アルキルアリール」基とは、（上記に記載された）アルキル基と（上記に記 載された）アリール基が共有結合したものを指す。 「炭素環式アリール」基とは、芳香環の環原子がすべて炭素原子である基のこ とである。この炭素原子は場合により置換されている。 「複素環式アリール」基とは、芳香環の環原子として１〜３のへテロ原子を有 する基のことであり、環原子の残りは炭素原子である。適切なへテロ原子には、 酸素、イオウ、窒素があり、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、ピロロ 、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリルといったものを含み、いずれも場合に よっては置換される。 「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒを指し、ここでＲはアルキル、アリー ル、アルキルアリール又は水素のいずれかである。 「エステル」とは、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’を指し、ここでＲ’はアルキル、ア リール、アルキルアリール又は水素のいずれかである。 別の好ましい実施形態では、本発明は構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体 、２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ−メチルヌクレオシド又はそれらの組み合わせ をポリヌクレオチドヘ導入することを特徴とする。上記の新規ヌクレオシド類似 体は酵素的にポリヌクレオチドヘ導入され得る。例えば、バクテリオファージの Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを利用することにより、上記の新規ヌクレオシド類似体 は１つ又はそれ以上の位置でＲＮＡへ導入され得る（Ｍｉｌｌｉｇａｎ等、１９ ８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８０，５１）。別法では，新規ヌ クレオシド類似体は固相合成を利用してポリヌクレオチドヘ導入され得る（Ｂｒ ｏｗｎとＢｒｏｗｎ、１９９１，「オリゴヌクレオチドと類似体：実践アプロー チ」１頁，Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，オックスフォードユニバーシティプレス， ニューヨーク；Ｗｉｎｃｏｔｔ等，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．，２３，２６７７；Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９９ ６，「生物有機化学：核酸」３６頁，Ｓ．Ｍ．Ｈｅｃｈｔ編，オックスフォード ユニバーシティプレス，ニューヨーク）。 構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド及び／又は２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ− メチルヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドへの選択的導入のための基礎単位と して、ヌクレオチド、ヌクレオチド−３−リン酸及び／又はホスホルアミダイト の化学合成に利用し得る。上記のオリゴヌクレオチドは，アンチセンス分子，２ −５Ａアンチセンスキメラ、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ） として、又は酵素的核酸分子として利用し得る。オリゴヌクレオチドはまた、Ｒ ＮＡ又はＤＮＡの合成及び／又は配列決定のプローブ又はプライマーとして利用 し得る。 構造式Ｉ〜Ｖの新規ヌクレオシド類似体又はそれらの組み合わせは、独立的に 又は組み合わせて、抗ウィルス、抗癌又は抗腫瘍剤として利用し得る。上記の化 合物は、独立的に又は他の抗ウィルス、抗癌又は抗腫瘍剤と組み合わせて利用し 得る。 「アンチセンス」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ＰＮ Ａ（蛋白質核酸；Ｅｇｈｏｌｍ等、１９９３ Ｎａｔｕｒｅ ３６５，５６６） 反応によって標的ＲＮＡと結合し、標的ＲＮＡの活性を変える、非酵素的核酸分 子を意味する（概要はＳｔｅｉｎとＣｈｅｎｇ、１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ６１，１００４を参照のこと）。 「２−５Ａアンチセンスキメラ」とは，５’位がリン酸化された２’−５’結 合性アデニレート残基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。上記 キメラは配列特異的なやり方で標的ＲＮＡと結合して細胞性２−５Ａ依存性リボ ヌクレアーゼを活性化し、次いで、標的ＲＮＡを切断する（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ等 、１９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，１３００ ）。 「トリプレックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）」とは、配列特異的なや り方で二本鎖ＤＮＡと結合し三重鎖ヘリックスを形成し得るオリゴヌクレオチド を意味する。このような三重ヘリックス構造の形成が標的遺伝子の転写を阻害す ることが示されている（Ｖａｌｅｎｔｉｎ等、１９９２ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，５０４）。 本発明は１つ又はそれ以上のＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒に関する 。このような置換は、単独で又は他のＤ−及びＬ−化学的置換とともに、その触 媒活性を全く阻害することなく、核酸をヌクレアーゼによる分解から護るもので ある。ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性は、これら核酸の細胞内半減期を増加さ せ、核酸触媒の全体的な有効性を改善する。こういった修飾はまた細胞による核 酸触媒の効率的な取り込みとこれら核酸の細胞内における移送及び局在化を容易 にし、インビトロ及びインビボにおける核酸触媒の効力を全体的に改善する役に 立つのに利用され得る。 ここに用いられる「化学的置換」という用語は、核酸の触媒活性を全く阻害す ることなくそれをヌクレアーゼによる分解から保護する、塩基、糖及び／又はリ ン酸の修飾を指す。 １つの好ましい実施形態では、本発明は、構造式ＶのＬ−ヌクレオチドだけか ら成りＤ−ヌクレオチド残基をもたない核酸触媒（Ｌ−核酸触媒）を特徴とする 。より特定すると、このＬ−核酸触媒は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はリボー及びデオ キ シリボヌクレオチドの組み合わせである。別に、又はさらに、Ｌ−核酸触媒は、 触媒活性を全く阻害されることなく、塩基、糖及び／又はリン酸骨格を単独に又 は組み合わせて修飾されている。 別の好ましい実施形態では、本発明は少なくとも２つの構造式ＶのＬ−ヌクレ オチド置換を含む核酸触媒を特徴とし、ここで上記置換は同じであっても異なっ ていてもよい。 また別の好ましい実施形態では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を 有する核酸触媒を特徴とし、ここで上記核酸は、別の核酸分子、好ましくは１本 鎖の核酸、より好ましくはＲＮＡを切断し得る。 ある好ましい実施形態では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有す る核酸触媒を特徴とし、ここでこの触媒は、ハンマーヘッド又はヘアピンリボザ イム・モチーフの形状である。 別の態様では、本発明は構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を 特徴とし、ここで上記核酸は、別々の核酸分子をライゲートさせる。 本発明はまた構造式ＶのＬ−ヌクレオチド置換を有する核酸分子触媒を特徴と し、ここで上記核酸分子は、アミド又はペプチド結合を切断又は形成する。 「ヌクレオチド」という用語は、当技術分野で認知されているように、天然の 塩基及び当技術分野でよく知られている修飾された塩基を含むように用いられて いる。このような塩基は一般に糖成分の１’位に位置している。ヌクレオチドは 一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは修飾されていなくてもよ く、又は糖、リン酸及び／又は塩基成分で修飾されていてもよい（例えば、Ｕｓ ｍａｎとＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、同上；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際ＰＣＴ公開番号 ＷＯ９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ等、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１５１８ ７を参照。これらはすべてここに援用する）。当技術分野では修飾された核酸塩 基の幾つかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈ等、１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３、により最近要約された。酵素的核酸へその触媒 活性に著しく影響することなく導入し得る塩基修飾の非制限的な例の幾つかは、 イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュ ードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒ ドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例、５−メ チルシチジン）、５−アルキルウリジン（例、リボチミジン）、５−ハロウリジ ン（例、５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミ ジン（例、６−メチルウリジン）その他がある（Ｂｕｒｇｉｎ等、１９９６，Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０）。本発明の観点における「修飾さ れた塩基」とは、１’位にあるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外 のヌクレオチド塩基又はそれらの同等物を意味する；このような塩基は酵素の触 媒中心内部及び／又は基質結合領域において利用され得る。 酵素的核酸分子へ、その触媒作用に著しく影響することもそのヌクレアーゼ安 定性及び効力を著しく高めることもなく導入し得る糖修飾を記載した当技術分野 の例が幾つかある。酵素的核酸分子の糖修飾は当技術分野で詳細に記述されてい る（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒ ａｕｌｔ等、Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４４，５６５〜５６８；Ｐｉｅｋｅｎ 等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５３，３１４〜３１７；ＵｓｍａｎとＣｅｄ ｅｒｇｒｅｎ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７ ，３３４〜３３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開ＰＣＴ番号ＷＯ９３／１５１８７； Ｓｐｒｏａｔ、米国特許番号５，３３４，７１１及びＢｅｉｇｅｌｍａｎ等、１ ９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２）。上記の出版物は修飾 の導入位置などを記載しており、ここに援用する。このような教示に照らして、 同様の修飾がここに記載するように利用し得る。 好ましい実施形態では、本発明は、非ヌクレオチド置換を有する核酸触媒を特 徴とする。非ヌクレオチド置換は、例えば構造式ＶにおけるＬ−ヌクレオチド置 換及び／又は非ヌクレオチド置換とは別に、標準的な非ヌクレオチド残基として 対掌のエナンチオマー形においてなされる。ここで用いられる「非ヌクレオチド 」という用語は、脱塩基性（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリ アミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質又はポリ炭化水素化合物のいず れかを含む。特定の例は、ＳｅｅｌａとＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８：６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１９８７，１５：３１１３；ＣｌｏａｄとＳｃｈｅｐａｒｔｚ、Ｊ．Ａｍ ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：５１０９；Ｍａ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１：２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１９９０，１８：６３５３；ＭｃＣｕｒｄｙ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９１，１０：２８７；Ｊｓｃｈｋｅ等、Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９３，３４：３０１；Ｏｎｏ等、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，３０：９９１４；Ａｒｎｏｌｄ等、国際公開番 号ＷＯ８９／０２４３９；Ｕｓｍａｎ等、国際公開番号ＷＯ９５／０６７３１； Ｄｕｄｙｃｚ等、国際公開番号ＷＯ９５／１１９１０及びＦｅｒｅｎｔｚとＶｅ ｒｄｉｎｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，１１３：４０００に記載 されたものを含み，これらはすべてここに援用する。従って、好ましい実施形態 では、本発明は、１つ又はそれ以上の非ヌクレオチド成分を有し、ＲＮＡ又はＤ ＮＡ分子を切断する酵素活性を有する酵素的核酸分子を特徴とする。「非ヌクレ オチド」なる用語は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド単位のかわりに核酸鎖に 導入することができ、糖及び／又はリン酸置換を含み、残った塩基がその酵素活 性を示すことを可能にする、基又は化合物を意味する。この基又は化合物は、ア デノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンのような通常認知されてい るヌクレオチド塩基を含まないという点で脱塩基性である。ここに用いられる「 脱塩基性」又は「脱塩基性ヌクレオチド」なる用語には、塩基を欠く糖成分又は １’位に塩基のかわりに他の化学基を有する糖成分が包含される。 好ましい実施形態では、酵素的核酸は、非ヌクレオチド成分と結合した１つ又 はそれ以上のＲＮＡストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅ）を含み、これがこの分子の 酵素活性をもたらす。必要とされるＲＮＡ成分は本技術分野で知られており、例 えばＵｓｍａｎ、同上、が参考になる。ＲＮＡとは少なくとも１つのリボヌクレ オチド残基を含む分子を意味する。 本明細書で用いられているように、非ヌクレオチド含有酵素的核酸という用語 は、リボザイムの一部分、例えば、限定されないが、二本鎖ステム部分、一本鎖 の「触媒中心」配列、一本鎖のループ又は一本鎖の認識配列に置き換わる、少な くとも１つの非ヌクレオチド成分を含む核酸分子を意味する。上記の分子は、ヌ クレオチド塩基配列特異的なやり方で別個のＲＮＡ又はＤＮＡ分子を切断（好ま しくは、繰り返し切断）することができる。このような分子はまた、所望ならば 、分子内で切断するように作用し得る。このような酵素的分子はほとんどすべて のＲＮＡ転写産物を標的とすることができる。 「Ｌ−ヌクレオチド」とは、天然に存在するＤ−エナンチオマーに対して反対 の回転分散スペクトルを有するヌクレオチドを意味する（Ｒｏｓａｎｏｆｆ，同 上）。ここに用いるエナンチオマーとは、Ｊａｃｑｕｅｓ等、１９９１，「エナ ンチオマー、ラセミ体及び分割」３頁〜、クリーガーパブリッシング社、フロリ ダ、アメリカ、によって定義される、お互いの鏡像体を示すものである。 Ｊａｃｑｕｅｓ等、１９９１，「エナンチオマー、ラセミ体及び分割」３頁〜 、クリーガーパブリッシング社、フロリダ、アメリカは、キラリティ、ラセミ体 及びエナンチオマーを定義している。３〜４頁によると、 「キラリティは有機化学者及び、実際は、ともかくも構造に関心のある全て の化学者によく知られている概念である。それには実に多くの含意があり、物 質の物理的性質に影響するものから生物学的メカニズムに関連するものに及ん でいる。こういった含意は“純粋”化学の境界を遠く越えている・・・ ある物体とその鏡像との非同一性の原因となる幾何学的性質がキラリティと 呼ばれる。キラルな物体は、お互いが鏡像である２つのエナンチオモルフィッ ク な（ｅｎａｎｔｉｏｍｏｒｐｈｉｃ）形態で存在する場合がある。このよう な形態は逆対称要素、即ち、対称の中心、平面及び変則軸を欠いている。これ ら逆対称要素の１つまたはそれ以上を有する物体はその鏡像に重ね合わせるこ とができる、即ちそれらはアキラルである。あらゆる物体は上記カテゴリーの １つに属する；手、ヘリックス階段及びカタツムリの殻がいずれもキラルであ る− 方、立方体と球はアキラルである。 ・・・上記の定義はすべて分子レベルでも正しい、つまりアキラルな分子と キラルな分子が存在する。後者は２つのエナンチオメリック（ｅｎａｎｔｉｏ ｍｅｒｉｃ）な形態として存在する（エナンチオモルフィックという形容詞は より一般的には肉眼的な物体に適用される）。エナンチオマーという用語は、 単一の分子、ホモキラル分子の集合体、又は１つのエナンチオマーを過剰に含 み、その組成がそのエナンチオメリック純度ｐ又はｐと同等であるエナンチオ メリック過剰度 ｐｐによって定義されるヘテロキラルな集合体を指すために用 いられる。 分子キラリティの最も昔から知られている例示は光学活性又は回転力という 、 光の偏光面の回転によって示される性質である。ある定まった化合物の２つの エナンチオマーは、絶対値が等しいが符号又は意味が反対である回転力を有す る。一方がポジティブ又は右旋性であれば、他方はネガティブ又は左旋性であ る。符号の絶対的な指定は、それが波長、温度及び溶媒依存性である以上、恣 意的であるが、相対的な指定はいつでも正しい。つまり、あるエナンチオマー は、ある波長で（＋）、別の波長で（−）になり得るが、この対となるエナン チオマーは必ずその対応する波長で反対の符号をとるのである。我々は、一対 のエナンチオマーを指定するために、可能な限り（＋）及び（−）の符号を使 うつもりだが、簡便のためにｄ及びｌ又はＤ及びＬを時々使用するだろう。 ・・・キラルな物質の絶対配置がわかるのは、エナンチオメリックな構造を ある定まった符号の光学活性サンプルに当てはめらたときである・・・Ｃａｈ ｎ、Ｉｎｇｏｌｄ及びＰｒｅｌｏｇの規則によって適用法が決められているア ルファベットの符号使用（右ｒｅｃｔｕｓのＲと左ｓｉｎｉｓｔｅｒのＳ）に よって絶対配置は指定される。しかしながら、ＲｏｓａｎｏｆｆのＤ及びＬ表 記は依然として炭水化物に使用されている。これを光学活性の符号と混同しな いよう注意すべきである。」（強調の追加） Ｔａｚａｗａ等、１９７０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４９９は、Ｌ−ア デノシン残基のついたジヌクレオチドの合成を記載した。彼等はまたＬ−アデノ シンダイマーが、脾臓及び蛇毒由来のホスホジエステラーゼ酵素による切断に対 して「完全に」又は「極めて」抵抗性であることを報告した。 Ａｓｈｌｅｙ、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４，９７３１ によると、Ｌ−リボヌクレオチド｛(Ｌ)−ＲＮＡ｝だけからなるＲＮＡ分子は、 相補的な（Ｄ）−ＲＮＡと安定的に相互作用し得るが、相補的な（Ｄ）−ＤＮＡ とは不十分に相互作用する。彼はまたこの論文で、（Ｌ）−ＲＮＡが「精製リボ ヌクレアーゼＡとＬ細胞の全細胞抽出物の両方に対して抵抗性である」と述べて いる。 Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４，１ １１２；Ｎｏｌｔｅ等、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４，１ １１６はＤ−アデノシン及びＬ−アルギニンのリガンドと結合し得るＬ−オリゴ ヌクレオチドアプタマーを選別する方法を記載している。 ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒとＫｉｍ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３４８７９は 、「天然の左右性を持たない（天然に又は野生型として存在するキラリティを持 たない）で、他のキラルな高分子のリガンドとなる高分子（ペプチド、オリゴヌ クレオチド、糖及び、ＲＮＡ−蛋白質複合体、蛋白質−脂質複合体のような高分 子の複合体）」を同定する方法を記載している。上記及び本明細書の他の所で引 用した出版物は、Ｌ−ヌクレオチド置換とその同類を含む、糖、塩基及び／又は リン酸修飾物を触媒作用を阻害することなくリボザイムへ導入するときの位置を 決定するための一般的な方法及び戦略を記載していて、ここに援用される。この ような教示に照らして、ここに記載するような同様の修飾を利用して、本発明の 核酸触媒を修飾する。 「核酸触媒」なる句は、他の別個の核酸分子を、ヌクレオチド塩基配列特異的 なやり方で繰り返し切断する能力（エンドヌクレアーゼ活性）を含めて多種多様 な反応を触媒し得る核酸分子を意味する。エンドヌクレアーゼ活性を有するこの ような分子は、基質結合領域において、ある特定の遺伝子標的に対する相補性を 有する場合があり、また、その標的のＲＮＡ又はＤＮＡを特異的に切断する酵素 活性を有する。つまり、エンドヌクレアーゼ活性を有する核酸分子は分子内又は 分子間でＲＮＡ又はＤＮＡを切断し、それによって標的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子を 不活化することができる。この相補性は、酵素的ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡ又はＤ ＮＡと十分ハイブリダイゼーションして切断が起こることを可能にするように機 能する。１００％の相補性が好ましいが、５０〜７５％程度の低い相補性も本発 明では有用であろう。この核酸は塩基、糖及び／又はリン酸基で修飾されてよい 。酵素的核酸という用語は、リボザイム、触媒的ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、触媒的 ＤＮＡ、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ 、 エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、リードザイム、オリゴザイム又はＤＮＡ酵素 のような句と交換可能的に使用される。こういった用語はすべて酵素的活性を有 する核酸分子を記載するものである。 ここで用いられる「核酸分子」は、ヌクレオチドを含む分子を意味する。この 核酸は修飾された又は未修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチド又はその様々な 混合物及び組み合わせより構成され得る。 「相補性」とは、塩基対相互作用の伝統的なワトソン−クリックタイプ又は他 の非伝統的なタイプ（例えば、フーグスティーン［Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ］タイプ ）のいずれかによって他のＲＮＡ配列と水素結合を形成し得る核酸を意味する。 本発明の好ましい態様では、酵素的核酸分子はハンマーヘッド又はヘアピン・ モチーフの形で形成されるが、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、グループＩイン トロン、（ＲＮＡガイド配列と結合した）ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ又はニューロス ポラ属ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成されてもよい。上記ハンマーヘッド・モチ ーフの例は、Ｒｏｓｓｉ等、１９９２，Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３に、ヘアピン・モチーフに ついてはＨａｍｐｅｌ等、ＥＰ０３６０２５７、ＨａｍｐｅｌとＴｒｉｔｚ、１ ９８９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９及びＨａｍｐｅｌ等、１９ ９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，２９９にあり、デルタ肝炎 ウィルス・モチーフの例はＰｅｒｒｏｔｔａとＢｅｅｎ、１９９２ Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６；ＲＮａｓｅＰ・モチーフについてはＧｕｅｒｒｉ ｅｒ−Ｔａｋａｄａ等、１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９及びＦｏｒｓｔｅｒ とＡｌｔｍａｎ、１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，７８３に、ニューロスポ ラ属ＶＳ ＲＮＡリボザイム・モチーフはＣｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅとＣ ｏｌｌｉｎｓ、１９９０ Ｃｅｌｌ ６１，６８５〜６９６；Ｓａｖｉｌｌｅと Ｃｏｌｌｉｎｓ、１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８８２６〜８８３０；ＧｕｏとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９５ ＥＭＢＯ Ｊ ．１４，３６８）によって記載され、グループＩイントロンについてはＣｅｃｈ 等、米国特許４，９８７，０７１に記載されている。上記の特定のモチーフは本 発明を制限するものではなく、本発明のエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素的 核酸 分子において重要なことは、それが標的遺伝子ＲＮＡ領域の１つ又はそれ以上と 相補的である特定の基質結合部位を有するということ、及びそれが上記基質結合 部位の内部又は周囲に、その分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を 有することであることを当業者は認識するであろう。 本発明は所望される標的ＲＮＡのような標的に対して高い特異性を示す一群の 酵素的切断薬剤を製造する方法を提供する。酵素的核酸分子は、単一の酵素的核 酸によって疾患又は病態への特定の治療が可能になるように、好ましくは標的の 高度に保存された領域を標的とする。このような酵素的核酸分子は、要求される ように、特定の細胞へ外から輸送され得る。好ましいハンマーヘッド・モチーフ では、分子サイズが小さい（６０未満のヌクレオチド、好ましくは３０〜４０の ヌクレオチド長）ために、治療コストを他のリボザイム・モチーフに比較して減 らすことが可能になる。 治療用リボザイムは、標的ｍＲＮＡの翻訳が望まれない蛋白質のレベルを減少 させるに十分なほど長く阻害されるまで細胞内で安定でなければならない。この 時間は疾患の状態に依存して時間から日単位まで変化する。効果的な細胞内治療 薬として機能するために、リボザイムはヌクレアーゼ抵抗性でなければならない のは明らかである。ＲＮＡの化学合成における諸改善（ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９ ９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３、２６７７；ここに援用す る）によって、リボザイムを修飾してそのヌクレアーゼ安定性を高めるための能 力が広がってきた。この研究の大部分はハンマーヘッド・リボザイム（Ｕｓｍａ ｎとＭｃＳｗｉｇｇｅｎ、１９９５ 同上に概説されている）を用いてなされ、 他の触媒的核酸モチーフヘ容易に拡張され得る。 「酵素的部分」とはＲＮＡ基質の切断に必須であるリボザイムの部分を意味す る。 「基質結合アーム」とは、その基質の一部分と相補的である（即ち、塩基対合 することができる）リボザイムの部分を意味する。一般に、このような相補性は １００％であるが、所望ならばそれより少なくてよい。例えば、１４のうち１０ ほどの塩基が塩基対合してもよい。このようなアームは一般に以下に論じるよう に図１に示される。つまり、上記アームは、リボザイムの内部に、相補的な塩基 対合反応を介してリボザイムと標的ＲＮＡを一緒にするように意図された配列を 含む；例えば、標準的なハンマーヘッド・リボザイムのステムＩ及びＩＩＩの内 部にあるリボザイム配列が基質結合ドメインを構成する（図１参照）。 好ましい実施形態では、酵素的核酸分子は直接的に、陽イオン性脂質と複合さ せるか又はリポソーム内にパッケージされて、又は別の方法で、平滑筋細胞へ輸 送される。このＲＮＡ又はＲＮＡ複合体は、生体高分子へ導入するか又はしない 状態で、カテーテル、注入ポンプ又はステントの使用を介して、関連する組織へ 局所的に投与され得る。ここに記載される方法を用いれば、標的核酸を切断する 他の酵素的核酸分子を上記に記載したように誘導して利用し得る。本発明の核酸 触媒の特定の例が以下の表及び図に提示されている。 Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、同上、は酵素的ＲＮＡ分子を輸送する一般的な方法を記 載している。リボザイムは、限定されないが、リポソーム被包、イオン導入法、 又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル及び生体癒着性ミ クロスフェアのような他の担体への導入を含む、当業者に知られた種々の方法に より細胞へ投与してよい。ある適応症に対しては、リボザイムは、上記の担体と ともに又は担体なしで、細胞又は組織へエクスビボで直接輸送してもよい。別の 方法では、ＲＮＡ／担体結合物は、直接注射するか又はカテーテル、注入ポンプ 又はステントの使用を介して、局所的に投与され得る。他の輸送経路には、限定 されないが、血管内、筋肉内、皮下又は関節注射、エアゾール吸入、経口（錠剤 又は丸剤）、局所性、全身性、眼内、腹腔内及び／又は鞘内輸送がある。リボザ イムの輸送及び投与に関するより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、同上、及 びＤｒａｐｅｒ等、同上、に提供され、ここに援用されている。 「本質的に〜からなる」とは、活性リボザイムが実施例にあるのと同等な酵素 の中心又は核、及び、標的部位での切断を起こすように標的核酸分子を結合し得 る結合アームを含むことを意味する。この切断に干渉しない他の配列も存在して よい。 従って、ある態様では、本発明は遺伝子発現及び／又は細胞増殖を阻害するリ ボザイムを特徴とする。上記の化学的又は酵素的に合成された核酸分子は、特定 の標的核酸分子の接近可能領域と結合する基質結合ドメインを含む。この核酸分 子はまた標的の切断を触媒するドメインを含む。結合すると、この酵素的核酸分 子は標的分子を切断し、例えば、翻訳及び蛋白質蓄積を妨害する。標的遺伝子が 発現されないと、例えば細胞増殖が阻害される。 「患者」とは、外植された細胞又は細胞それ自身のドナー又はレシピエントで ある生物体を意味する。「患者」はまた酵素的核酸分子が投与され得る生物体を 指す。好ましくは、患者は哺乳類又は哺乳類細胞である。より好ましくは、患者 はヒト又はヒト細胞である。 本発明の新規ヌクレオシド類似体及び／又は上記類似体を含むポリヌクレオチ ドは、直接的に細胞へ加えられるか、陽イオン性脂質と複合させるか又はリポソ ーム内にパッケージされて、又は別の方法で、標的細胞へ輸送される。このヌク レオシド、核酸又は核酸複合体は、生体高分子へ導入するか又はしない状態で、 注射、注入ポンプ又はステントを介して、エクスビボで又はインビボで、関連す る組織へ局所的に投与され得る。 「酵素的部分」とはＲＮＡ基質の切断に必須であるリボザイムの部分を意味す る。 「基質結合アーム」とは、その基質の一部分と相補的である（即ち、塩基対合 することができる）リボザイムの部分を意味する。一般に、このような相補性は １００％であるが、所望ならばそれより少なくてよい。例えば、１４のうち１０ ほどの塩基が塩基対合してもよい。このようなアームは一般に以下に論じるよう に図１−３に示される。つまり、上記アームは、リボザイムの内部に、相補的な 塩基対合反応を介してリボザイムと標的ＲＮＡを一緒にするように意図された配 列を含む；例えば、標準的なハンマーヘッド・リボザイムのステムＩ及びＩＩＩ の内部にあるリボザイム配列が基質結合ドメインを構成する（図１参照）。 ここに用いる「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、２つ又は それ以上のヌクレオチドを含む分子を意味する。 「未修飾のヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボフラノースの１’炭素に結合し たアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル塩基のうち１つを意味する。 「修飾されたヌクレオシド」とは、未修飾のヌクレオチド塩基、糖及び／又は リン酸の化学構造に１つの修飾を含むヌクレオチド塩基を意味する。 様々なタイプの生物学的に関心のある高分子又はレポーター基とオリゴヌクレ オチドとのコンジュゲートは実験手段として有用である。このようなとのコンジ ュゲートの化学合成のために当技術分野で知られている方法の大部分は、適当な スペーサーを使ってオリゴヌクレオチドの３’−及び／又は５’−末端へ関心対 象である分子を合成後に付加する方法か、糖、塩基及び／又は骨格部分が修飾さ れたモノマーのヌクレオシドユニットを化学合成の間にオリゴヌクレオチドヘ導 入する方法のいずれかに基づいている。しかしながら、上記の方法には、低収率 性及び冗長な合成スキームのような不都合な点が幾つかある。こういった問題を 回避するためには、オリゴヌクレオチド及び付加すべき分子のいずれにも独自の 官能基を用いることが必要である。上記官能基は、温和な条件下、好ましくは水 性溶液において、定量的に反応することが可能であるものでなければならない。 ここにおける主要な着想は、関心対象となる分子をコンジュゲートするときの連 結基（ｔｅｔｈｅｒ）としても用いられる独自の官能基を持ったヌクレオシドの 単量体ユニット（ホスホルアミダイト）を設計することである。 オキシム（アルデヒド又はケトンとヒドロキシルアミンの相互作用）又はオキ サミド（カルボン酸とヒドロキシルアミンの相互作用）の形成は、上記の要求を 満たす、第一選択とすべき有機反応であろう（Ｓａｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｋａ ｒｏ，Ｗ「有機官能基の製造法」第ＩＩＩ巻、Ｗａｓｓｅｒｍａｎ Ｈ．Ｈ．編 、アカデミックプレス社、１９８９，３７８〜５２３頁）。 好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、直接的に又は適切なスペーサ ーの利用を介して、この単量体ユニットに結合した１つ又はそれ以上のヒドロキ シルアミノ官能基を有する。オリゴヌクレオチドにはアルデヒド基もヒドロキシ ルアミノ基もないので、ポリマーの鋳型としてオリゴ（Ｏｌｉｇｏ）を用いて、 オキシムの形成が選択的に生ずる。このアプローチを利用すれば、関心対象とな るほとんどすべての分子（ペプチド、ポリアミン、補酵素、オリゴ糖、脂質、等 ）を、関心対象となる分子のアルデヒド基又はカルボン酸基を使ってオリゴヌク レオチドへ直接付加することが容易になるだろう。 計画１．合成後のオキシム結合形成 計画２．オリゴヌクレオチドの化学的なライゲーション オキシム結合形成の利点： ・オキシム化反応が水中で進行すること ・定量的な収率 ・広範囲のｐＨ（５〜８）における加水分解安定性 ・オキシムの両親媒性によって弱酸又は弱塩基として作用し得ること ・オキシムが金属イオンと複合する強い傾向を示すこと 別の好ましい実施形態では、リボザイムのようなオリゴヌクレオチド中にある アミノオキシの「連結基」は、カルボン酸基を有する様々な化合物（例、アミノ 酸、ペプチド、「キャップ」構造、等）と反応して以下に示すようなオキサミド を形成する。 計画３．合成後のオキサミド結合形成 好ましい実施形態では、本発明は、ａ）３’及び５’保護アラビノヌクレオシ ドを、無水トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸塩化 物等のようなスルホン化試薬と、３’及び５’保護２’−アラビノスルホニルヌ クレオシドの形成に適した条件下で接触させること；ｂ）上記２’−アラビノス ルホニルヌクレオシドのスルホニル基を、１，８−ジアザビシクロ（５．４．０ ）ウンデカ−７−エンのような強有機塩基の存在下、３’及び５’保護２’−Ｏ − Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドの形成に適した条件下で、Ｎ−ヒドロキシフタ ルイミドに置換すること；ｃ）上記Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドを、フッ化 テトラブチルアンモニウム、三フッ化水素トリエチルアミン等のようなフッ素含 有試薬によって、２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオチドの形成に適した条 件下で、脱保護化すること；ｄ）上記２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシ ドを、アルキルアミン（例えば、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン等 ）、ヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン及びＮ−アルキルヒドラジン（例えば 、Ｎ−メチルヒドラジン等）からなる群より選択される試薬と、上記２’−Ｏ− アミノヌクレオシドの形成に適した条件下で接触させること、の各工程を含む、 ２’−Ｏ−アミノアデノシン、２’−Ｏ−アミノグアノシン、２’−Ｏ−アミノ シチジン、２’−Ｏ−アミノウリジン等のような２’−Ｏ−アミノヌクレオシド の合成方法を特徴とする。 本発明の他の特徴及び利点は以下の好ましい実施形態の記載及び請求の範囲か ら明らかであろう。好ましい実施形態の記載 図について先ず簡略に記載する。図： 図１は、当技術分野で知られているハンマーヘッド・リボザイムドメインの概 略図である。ステムＩＩは２塩基対以上の長さであり得る。各Ｎは、ここで用い られているように、独立して任意の塩基又は非ヌクレオチドである。 図２ａは、当技術分野で知られているハンマーヘッド・リボザイムドメインの 概略図であり；図２ｂは、Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２ ７，５９６〜６００）によって基質と酵素部分に分割されたハンマーヘッド・リ ボザイムの概略図であり；図２ｃは、ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ（１９ ８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５〜５９１）によって２つの部分に分割され たハンマーヘッドを示す同様の図であり；図２ｄは、ＪｅｆｆｅｒｉｅｓとＳｙ ｍｏｎｓ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７，１３７１〜１３ ７１）によって２つの部分に分割されたハンマーヘッドを示す同様の図である。 図３は、ヘアピン・リボザイムの一般構造の概略図である。ヘリックス２（Ｈ ２）は少なくとも４つの塩基対（即ち、ｎは１、２、３又は４である）で与えら れ、ヘリックス５は、場合によっては、２又はそれ以上の塩基（好ましくは３〜 ２０の塩基、即ち、ｍは１〜２０又はそれ以上である）で与られる。ヘリックス ２とヘリックス５は、１つ又はそれ以上の塩基（即ち、ｒは１塩基以上である） によって、共有結合してもよい。ヘリックス１、４又は５は、２又はそれ以上の 塩基対（例えば、４〜２０塩基対）によって延長されてリボザイムの構造を安定 化させることができ、好ましくは蛋白質結合部位である。それぞれの例で、各Ｎ 及びＮ’は独立的に通常の又は修飾された塩基であり、各ダッシュは塩基対合相 互作用が可能な部分を示す。上記のヌクレオチドは糖、塩基又はリン酸部分で修 飾されてよい。ヘリックス部分での完全な塩基対合は、必要とされないが、好ま しい。ヘリックス１及び４は、塩基対合が幾つか維持されている限りは、いかな る大きさでもよい（即ち、Ｏ及びｐは各々独立的に０から任意の数、例えば２０ 、である）。必須な塩基はこの構造の特定の塩基として示されているが、当業者 は、１つ又はそれ以上の塩基を化学的に修飾（脱塩基、塩基、糖及び／又はリン 酸修飾）し得るか、又は著しい効果をもたらすことなく別の塩基に置換し得るこ とを認めるであろう。ヘリックス４は、２つの分離した分子から、つまり結合ル ープを使わずに、形成され得る。結合ループは、存在するとき、塩基、糖又はリ ン酸が修飾された又はされていないリボヌクレオチドであってよい。「ｑ」は２ 塩基以上である。結合ループはまた非ヌクレオチドのリンカー分子で置換し得る 。Ｈは、塩基Ａ、Ｕ又はＣを指す。Ｙはピリミジン塩基を指す。「−−−−−」 は化学結合を指す。 図４は、当技術分野で知られているデルタ肝炎ウィルス・リボザイムドメイン の一般構造図である。各Ｎは、独立して任意の塩基又はここで用いられているよ うな非ヌクレオチドである。 図５は、自己切断的ＶＳ ＲＮＡ・リボザイムドメインの一般構造図である。 図６は、本発明の幾つかの新規ヌクレオシド類似体の概略図である。１は、３ −（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン；２は、５−（β−Ｄ−リ ボフラノシル）−ピリジン−２−オン；３は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル） −２−ブロモピリジン；４は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピ リジン；５は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン；６は 、３−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジンである。 図７は、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の２） 及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジン（図６の３及び図７ の１１）モノマーの合成計画である。 図８は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の１及 び図８Ｂの１３）及び３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン （図６の５及び図８Ｂの１２）モノマー合成の２つの合成計画である。 図９は、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ リル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミ ダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オン の合成計画である。 図１０は、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチル シリル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルア ミダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−２−オ ンの合成計画である。 図１１は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ リル−Ｏ⁴−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン３’−（２−シアノ エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成計画である。 図１２は、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ リル−Ｏ⁴−ジフェニルカルバモイル−３−デアザシチジン３’−（２−シアノ エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）の合成計画である。 図１３は、２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −β−Ｄ−リボフラノシルインドールの合成計画である。 図１４は、２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト） −β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールの合成計画である。 図１５は、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフ ェニルエチル）−オン及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（ ４−ニトロフェニルエチル）−オンーホスホルアミダイトの合成計画である。 図１６は、２’−Ｏ−アミノピリミジンヌクレオシド及びホスホルアミダイト の合成計画である。 図１７は、２’−Ｏ−アミノアデノシンヌクレオシド及びホスホルアミダイト の合成計画である。 図１８は、２’−Ｏ−アミノグアノシンヌクレオシド及びホスホルアミダイト の合成計画である。 図１９は、２’−Ｏ−アミノ基で様々な位置で置換されたハンマーヘッド・リ ボザイムの概略図である（Ａ）。（Ｂ）は、９Ａのリボザイムによって触媒され るＲＮＡ切断反応の速度を示す。 図２０は、Ｄ−ヌクレオチド及びＬ−ヌクレオチドの一般構造を示す。 図２１は、Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成計画（計画１）を 示す。 図２２は、５’−Ｏ−シリル保護基を用いたＬ−リボヌクレオシドのホスホル アミダイト合成計画（計画２）を示す。 図２３Ａ）は、Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−ピリミジンホスホルアミ ダイトの合成計画、Ｂ）は、Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−プリンホスホ ルアミダイトの合成計画を示す。 図２４は、Ｌ−ヌクレオチドで置換されたハンマーヘッド・リボザイムの概略 図である。 図２５は、Ｌ−ヌクレオチドで置換されたハンマーヘッド・リボザイムによっ て触媒されるＲＮＡ切断反応のグラフ図である。ポリヌクレオチドの合成 例えばエンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸は、ヌクレオチド塩基配列特 異的なやり方で他のＲＮＡ分子を繰り返し切断することができる。このような酵 素的ＲＮＡ分子はほとんどすべてのＲＮＡ転写産物を標的とすることができ、イ ンビトロで効率的な切断が達成される（Ｚａｕｇ等、３２４，Ｎａｔｕｒｅ ４ ２９，１９８６；Ｋｉｍ等、８４ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ８７８８，１９８７；ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、３３４ Ｎａ ｔｕｒｅ ５８５，１９８８；Ｃｅｃｈ、２６０ ＪＡＭＡ ３０３０，１９８ ８；及びＪｅｆｆｅｒｉｅｓ等、１７，Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ １３７１，１９８９）。それらの基質特異性のために、トランス−切断 リボザイムはヒト疾患の治療薬剤として有望である（ＵｓｍａｎとＭｃＳｗｉｇ ｇｅｎ、１９９５ Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０，２８５〜２９４ ；ＣｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎとＭａｒｒ、１９９５ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ．３８，２０２３〜２０３７）。リボザイムは細胞性ＲＮＡの環境内部で特定の ＲＮＡ標的を切断するように設計され得る。このような切断が起こるとｍＲＮＡ は非機能的になり、そのＲＮＡから蛋白質が発現されなくなる。このようにして 、ある疾患状態に関連した蛋白質の合成が選択的に阻害され得る。 天然に存在する酵素的ＲＮＡについて７つの基本的な種類が今日知られている 。各々は生理的条件下でトランスにＲＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を 触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。表１はこれらリボザイム の特性の幾つかを要約する。一般に、酵素的核酸は先ず標的ＲＮＡに結合するこ とにより作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断する分子の酵素的部分 のごく近傍に位置している酵素的核酸の標的結合部分を介して起こる。従って、 酵素的核酸は、先ず標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的な塩基対合を介してそれ に結合し、正確な部位に結合すると、標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用 する。このような標的ＲＮＡの戦略的な切断によって、コードされる蛋白質の合 成を指令するその能力が破壊される。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的に結合して 切断した後、そのＲＮＡから離れて別の標的を探し、新しい標的に対して繰り返 し結合して切断し得る。 リボザイムの酵素的な性質が他の技術よりも有利なのは、治療効果をもたらす のに必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンス・オリゴヌクレオチドのそれよ り低いからである。この利点は、酵素的に作用するリボザイムの能力を反映して いる。つまり、単一のリボザイム分子が多くの標的ＲＮＡ分子を切断することが できるのである。さらに、リボザイムはきわめて特異的な阻害剤であり、その阻 害特異性は、結合の塩基対合メカニズムだけでなく、この分子がそれに結合する ＲＮＡの発現を阻害するメカニズムにも依存している。つまり、この阻害はＲＮ Ａ標的の切断によるものであり、その特異性は、非標的ＲＮＡの切断速度に対す る標的ＲＮＡの切断速度の比率として定義される。この切断メカニズムは塩基対 合に関係する要因以外の要因にも依存している。従って、リボザイム作用の特異 性は同一のＲＮＡ部位に結合するアンチセンス・オリゴヌクレオチドのそれより も高い。 本発明の好ましい態様の１つでは、酵素的核酸分子はハンマーヘッド又はヘア ピン・モチーフの形で形成されるが、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、グループ Ｉイントロン、グループＩＩイントロン又は（ＲＮＡガイド配列と結合した）Ｒ ＮａｓｅＰ ＲＮＡ、又はニューロスポラ属ＶＳ ＲＮＡのモチーフで形成され てもよい（図４、５）。上記ハンマーヘッド・モチーフの例は、Ｄｒｅｙｆｕｓ 、同上、Ｒｏｓｓｉ等、１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕ ｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８，１８３に、ヘアピン・モチーフについ てはＨａｍｐｅｌ等、ＥＰ０３６０２５７、ＨａｍｐｅｌとＴｒｉｔｚ、１９８ ９Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８，４９２９、Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ等、１９８ ９，Ｇｅｎｅ，８２，５３、ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃｈ、１９８９，Ｇ ｅｎｅ，８２，４３及びＨａｍｐｅｌ等、１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓ Ｒｅｓ．１８，２９９にあり、デルタ肝炎ウィルス・モチーフの例はＰｅｒ ｒｏｔｔａとＢｅｅｎ、１９９２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１，１６；Ｒ ＮａｓｅＰ・モチーフについてはＧｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ等、１９８３ Ｃｅｌｌ ３５，８４９；ＦｏｒｓｔｅｒとＡｌｔｍａｎ、１９９０，Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２４９，７８３；ＬｉとＡｌｔｍａｎ、１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４，８３５に、ニューロスポラ属ＶＳ ＲＮＡリボザイ ム・モチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９０ Ｃｅ１１ ６１，６８５〜６９６；ＳａｖｉｌｌｅとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９ １ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，８８２６〜８８３ ０；ＣｏｌｌｉｎｓとＯｌｉｖｅ、１９９３ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２ ，２７９５〜２７９９；ＧｕｏとＣｏｌｌｉｎｓ、１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．１ ４，３６３）によって記載され、グループＩＩイントロンは、Ｇｒｉｆｆｉｎ等 、１９ ９５，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，７６１；ＭｉｃｈｅｌｓとＰｙｌｅ、１９９５ ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４，２９６５；Ｐｙｌｅ等、国際ＰＣＴ公開番 号ＷＯ９６／２２６９８に、グループＩイントロンは、Ｃｅｃｈ等、米国特許４ ，９８７，０７１に記載されている。上記の特定のモチーフは本発明を制限する ものではなく、本発明の酵素的核酸分子において重要なことは、それが標的遺伝 子ＲＮＡ領域の１つ又はそれ以上と相補的である特定の基質結合部位を有すると いうこと、及びそれが上記基質結合部位の内部又は周囲に、その分子にＲＮＡ切 断活性を与えるヌクレオチド配列を有することであることを当業者は認識するで あろう。 １００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は自動化された方法では困難であ り、このような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明では、小さな核酸モ チーフ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ハンマーヘッド又はヘアピ ン・リボザイム）が外からの輸送に利用される。上記分子の単純な構造は、ｍＲ ＮＡ構造の標的領域へこの核酸が侵入する能力を増加させる。 １００ヌクレオチド長より大きい核酸の合成は自動化された方法では困難であ り、このような分子の治療コストはひどく高くなる。本発明では、小さな酵素的 核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド又はヘアピン構造の）が外からの輸送に 利用される。上記分子の単純な構造は、ｍＲＮＡ構造の標的領域へこの酵素的核 酸が侵入する能力を増加させる。 リボザイムのようなＲＮＡ分子は化学的に合成される。利用される合成方法は 、Ｕｓｍａｎ等、１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５ ；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１ ８，５４３３；及びＷｉｎｃｏｔｔ等、１９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７〜２６８４に記載されるような通常のＲＮＡ合成法に 準じ、５’−末端のジメトキシトリチル及び３’−末端のホスホルアミダイトの ような、通常の核酸保護基及び結合基を利用する。２．５μｍｏｌスケールに変 更されたプロトコールに基づいて、アプライドバイオシステム社の３９４型シン セサイザーを用いて，５分間のアルキルシリル保護ヌクレオシド・カップリング 工程及び２．５分間の２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド・カップリング工程で、 小規模合 成を実施した。表２は、この合成サイクルで用いた試薬の量及び接触時間を要約 する。ポリマー結合性５’−ヒドロキシルに対して、６．５倍過剰（０．１Ｍを １６３μＬ；１６．３μｍｏｌ）のホスホルアミダイト及び２４倍過剰のＳ−エ チルテトラゾール（０．２５Ｍを２３８μＬ；５９．５μｍｏｌ）が各カップリ ングサイクルで使われた。トリチル分画の比色定量によって決定される、アプラ イドバイオシステム社の３９４型シンセサイザーの平均カップリング収率は９７ ．５〜９９％であった。アプライドバイオシステム社の３９４型シンセサイザー 用の他のオリゴヌクレオチド合成試薬に関しては、脱トリメチル化溶液は塩化メ チレン中２％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり、キャッピングはＴＨＦ中１６％Ｎ−メチ ルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジ ン（ＡＢＩ）で実施され、酸化溶液は１６．９ｍＭヨウ素、４９ｍＭピリジン、 ＴＨＦ中９％水（ミリポア）であった。Ｂ＆Ｊの合成グレードアセトニトリルは 試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０． ２５Ｍ）は、アメリカンインターナショナルケミカル社より得た固体より調製し た。 ＲＮＡの脱保護化は以下のように実施した。トリチル基がとれてポリマーに結 合したオリゴリボヌクレオチドを合成カラムから４ｍＬのガラス製ネジ蓋バイア ルへ移し、メチルアミン（ＭＡ）溶液に６５℃、１０分間懸濁した。−２０℃ま で冷やした後、上澄液をポリマー支持体から除去した。支持体をＥｔＯＨ：Ｍｅ ＣＮ：Ｈ₂Ｏ（３：１：１）溶液１ｍＬで３回洗浄し、渦状に撹拌してその上澄 液を最初の上澄液に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む、この合わせた上澄 液を白色粉末になるまで乾燥した。 塩基が脱保護化されたオリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶 液（Ｎ−メチルピロリジオン１．５ｍＬ、ＴＥＡ７５０μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦ１ ｍＬの溶液を２５０μＬ，ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し、６５℃で１．５時間 加熱した。完全に保護基がとれたオリゴマーを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（９ｍＬ）で 冷却した後、陰イオン交換によって脱塩化した。 脱保護化オリゴマーの陰イオン交換による脱塩化には、５０ｍＭ ＴＥＡＢ（ １０ｍＬ）で前洗浄したキアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）５００（商標）陰イオン交 換カートリツジ（キアジェン社）にこのＴＥＡＢ溶液をのせた。このカートリッ ジ を５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後、２Ｍ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ） でＲＮＡを溶出し、その後、白色粉末になるまで乾燥した。 Ｇ₅をＵに、Ａ₁₄をＵに（（Ｈｅｒｔｅｌ，Ｋ．Ｊ．等、１９９２，Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，３２５２）からの番号付けによる）置換す ることによって不活性なハンマーヘッド・リボザイムを合成した。 段階的カップリングの平均収率は９８％より高かった（ｗｉｎｃｏｔｔ等、１ ９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３，２６７７〜２６８４） 。 ヘアピン・リボザイムは１部分として合成するか、又は２部分として合成し、 アニールし活性リボザイムを再構成する（ＣｈｏｗｒｉｒａとＢｕｒｋｅ、１９ ９２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０，２８３５〜２８４０）。 ＲＮＡは一般的な方法を用いたゲル電気泳動によって精製されるか又は高圧液 体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、国際ＰＣＴ公開番 号ＷＯ９５／２３２２５、このすべてをここに援用する）によって精製した後、 水に再懸濁する。 リボザイムの有用性を高めるために、リボザイム構造に様々な修飾がなされ得 る。このような修飾は、貯蔵寿命、インビトロの半減期、安定性及びこのような リボザイムの標的部位への導入しやすさ、例えば細胞膜への浸透を高め、標的細 胞を認識しそれに結合する能力をもたらす。リボザイム活性の最適化 リボザイム活性はＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等、同上に記載されたようなやり方で 最適化され得る。詳細は繰り返さないが、これはリボザイム結合アーム（ステム Ｉ及びＩＩＩ，図２ｃを参照）の長さを変更すること、又は血清リボヌクレアー ゼによる分解を防ぐ修飾を施したリボザイムを化学的に合成することを含む（例 えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ等、国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕ ｌｔ等、１９９０ Ｎａｔｕｒｅ ３４４,５６５；Ｐｉｅｋｅｎ等、１９９１ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３，３１４；ＵｓｍａｎとＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９ ２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ 等、国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；Ｒｏｓｓｉ等、国際公開番号ＷＯ９１ ／０３１６２；Ｓｐｒｏａｔ、米国特許番号５，３３４，７１１を参照のこと。 これ らは、酵素的ＲＮＡ分子の糖成分に対してなし得る種々の化学修飾について記載 している）。細胞内での効力を高め、ステムＩＩの塩基を除去してＲＮＡ合成時 間を短縮し化学的要求性を減少させるための修飾が望ましい（上記出版物はすべ てここに援用する）。ポリヌクレオチドの投与 Ｓｕｌｌｉｖａｎ等、ＰＣＴＷＯ９４／０２５９５、は酵素的ＲＮＡ分子を輸送 する一般的な方法を記載している。リボザイムは、限定されないが、リポソーム 被包、イオン導入法、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプ セル及び生体癒着性ミクロスフェアのような他の担体への導入を含む、当業者に 知られた種々の方法により細胞へ投与してよい。ある適応症に対しては、リボザ イムは、上記の担体とともに又は担体なしで、細胞又は組織へエクスビボで直接 輸送してもよい。別の方法では、ＲＮＡ／担体の組み合わせは、直接注射するか 又はカテーテル、注入ポンプ又はステントの使用を介して、局所的に投与され得 る。他の輸送経路には、限定されないが、血管内、筋肉内、皮下又は関節注射、 エアゾール吸入、経口（錠剤又は丸剤）、局所性、全身性、眼内、腹腔内及び／ 又は鞘内輸送がある。リボザイムの輸送及び投与に関するより詳細な記載は、Ｓ ｕｌｌｉｖａｎ等、同上、及びＤｒａｐｅｒ等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９に あり、ここに援用されている。実施例 以下に示すのは、本発明の構造式Ｉ〜Ｖのある化合物及びこれら化合物の１つ 又はそれ以上を含むポリヌクレオチドの合成及び活性を示す実施例である。当業 者は、以下の実施例に記載された温度、ｐＨ、イオン条件、反応時間及び溶媒条 件のようなある種の反応条件が限定的なものではなく、合成に著しく影響せずに 容易に変更し得ることを認めるだろう。実施例１：塩基修飾されたヌクレオチドを含むリボザイムの合成 用いた合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７， １０９， ７８４５〜７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．１９９０，１８，５４３３〜５４４１及びｗｉｎｃｏｔｔ等、１ ９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７〜２６８４に記 載 されるような通常のＲＮＡ合成法に準じ、５’−末端のジメトキシトリチル及び ３’−末端のホスホルアミダイトのような、通常の核酸保護基及び結合基を利用 する（化合物４，９，１３，１７，２２，２３）。段階カップリングの平均収率 は９８％より高かった。これら塩基修飾されたヌクレオチドは、ハンマーヘッド ・リボザイムだけでなく、ヘアピン、ＶＳリボザイム、デルタ肝炎ウィルス又は グループＩ又はグループＩＩイントロンに導入され得る。それゆえ、それらは任 意の核酸構造における置換モチーフとして広く使用される。実施例２：５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（２）の合成 図７を参考にして、ピリジン−２−オンＣヌクレオシド２（図６）は、２−（ ベンジルオキシ）−５−ヨードピリジン（３）及びＤ−リボノ−１，４−ラクト ン４から５段階で、また、別の方法では、２，５−ジブロモピリジン（７）及び Ｄ−リボノ−１，４−ラクトン４から７段階で製造された。中間体１’−Ｏ−酢 酸誘導体９は、ヘミアセタール８の脱酸素化を成功させるのにきわめて重要であ った。 Ｏ²カルボニルを欠くピリミジンヌクレオシド類似体２の合成をここに記載す る。新規な水素結合様式を有する上記のピリミジンヌクレオシド類似体は、本質 的な分子内水素結合相互作用を同定するための貴重なツールとして役立ち得る。 １の２’−デオキシ類似体（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｐ． Ｂ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９１，３２，３２９７〜３３００ ；Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｐ．Ｂ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ．１９９３，５８，２２３２〜２２４３）及び１は、α及びβアノマーの混合物 として記述される（Ｂｅｌｍａｓ等、１９８９ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ８，３０７）。リボ誘導体２は知られていないので、 ここに記載する。 ２（図７）を合成する試みにおいて、出願人は２−（ベンジルオキシ）−５− ヨードピリジン（３）（ＮａＨ／ＢｎＯＨ／ＤＭＦのような還元試薬を用いて２ −ブロモ−５−ヨードピリジン（Ｈａｍａ等、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊ ｐｎ．１９８８，６１，１６８３〜１６８６）から合成される）を、約−７８度 の温度を用いるような適切な条件下で、リチウムジアザプロピルアミン（ＬＤＡ ） のような試薬を用いる金属化反応によって５−リチオ誘導体へ変換した。この中 間体（５−リチオ誘導体）で５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２，３−Ｏ −イソプロピリデン−Ｄ−リボラクトン（４）のような、保護化されたＤ−リボ ノラクトンを縮合させると、α及びβラクトール５の混合物を１：８の比率で得 た（収率４７％）。ヘミアセタール５、８及び９の接頭辞αが、基準Ｃ原子（２ ではＣ４’；即ち，ピリジル成分はβ位にある）での配置に関するグリコシドＯ Ｈ基の位置を指すことに留意すべきである。アノメリック配置の指定は、¹Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるイソプロピリデンメチル基のΔδ値に基づいていた。 以前の研究（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９６，３７，２３６５〜２３６８；Ｄｏｎｄｏｎｉ，Ａ．；Ｓｃｈｅｒｒｍ ａｎｎ，Ｍ．Ｃ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，６４０４〜６４１２ ）から、１’−脱酸素化へのアプローチとしては、還元的１’−脱アセトキシル 化のほうが１’−ＯＨを直接還元よりもずっと効率的であることが知られている 。残念ながら、Ａｃ₂Ｏ／ＤＭＡＰ／ＴＥＡのアセトニトリル溶液で５をアセチ ル化しても成功しなかった。¹Ｈ ＮＭＲによると、主要生成物がアセチル基を 含まなかったからである。 室温のような温度で、アセトニトリル中トリエチルシラン（Ｅｔ₃ＳｉＨ）／ ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏのような還元剤で５を還元したところ、２１％の収率で、Ｃ−ヌ クレオシド６のα／β（１：１）混合物を生じた。６β及び６αは、溶出用にジ クロロメタン中メタノールの５−１０％勾配を用いるフラッシュカラムクロマト グラフィーによって、容易に分離できた。 ６βは、ＴＢＡＦのような試薬を用いて脱ブロック化し、５’−シリルエーテ ル保護基を外し、酸でイソプロピリデン基を切断し、高収率で１２を得た。１２ の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃）₂ＣＯ＋Ｄ₂Ｏデータ：δ８．１９（ｄ，Ｊ_6,4＝２．４ ，１Ｈ，Ｈ６），７．７９（ｄｄ，Ｊ_4,3＝８．４，Ｊ_4,6＝２．４，１Ｈ，Ｈ４ ），６．８０（ｄ，Ｊ_3,4＝８．４，１Ｈ，Ｈ３），５．３７（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ Ｐｈ），４．６４（ｄ，Ｊ_1',2'＝７．２，１Ｈ，Ｈ１’），４．１２（ｄｄ， Ｊ_3',2'＝５．４，Ｊ_3',4'＝３．４，１Ｈ，Ｈ３’），３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ ４’），３．８８(ｄｄ，Ｊ_2'1'＝７．２，Ｊ_2'3'＝５．４，１Ｈ，Ｈ２’）， ３．７ ４（ｄｄ，Ｊ_5'4'=３．６，Ｊ_5'5"＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５’），３．６９（ｄ ｄ，Ｊ_5"4'＝４．２，Ｊ_5"5'＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５”）。 遊離Ｃヌクレオシド２を高収率でもたらす、トリメチルシリルヨウ化物（ＴＭ ＳＩ）のジクロロメタン溶液を用いた１２のベンジルエーテル基の切断反応のよ うな、様々なアプローチを用いてベンジル基を除去することによって、化合物２ を得た。 ＰａｒｈａｍとＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４ ２，２５７〜２６０）は、ごく低温（−１００℃）下で２，５−ジブロモピリジ ン（７）とｎ−ブチルリチウムとの間に起こる予想外の高度に選択的なハロゲン −リチウム交換反応について記載しており、ここでは５−ブロモ置換体だけが交 換される。 出願人は７及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン４から出発する別のアプローチ（ 計画１）によって、２を合成した。ＴＨＦ中で約−１００℃で７を金属化し、リ チウム化されたピリジンを保護化されたＤ−リボノ−１，４−ラクトン４で−１ ００℃において縮合させると、２つの副生成物（それぞれ、収率６％、１７％） とともに、予期したヘミアセタール８（収率４４％、α／β１：１２）が得られ た。 ８の製造方法：２，５−ジブロモピリジン７（１．７５ｇ，７．４ｍｍｏ１） をアルゴン存在下乾燥ＴＨＦ（４６ｍＬ）に溶解し、溶液を−１００℃まで冷や した。ヘキサン中１．６Ｍのｎ−ＢｕＬｉ（５．０９ｍＬ，８．１４ｍｍｏｌ） を５分間かけて滴下した後、溶液を−１００℃で３０分間撹拌した。乾燥ＴＨＦ 中のＤ−リボノ−１，４−ラクトン４（３ｇ，７ｍｍｏｌ）の溶液（１０ｍＬ） を５分間かけて滴下した後、混合物を４０分かけて室温にまで温めた。室温でさ らに２０分間撹拌した後、塩化アンモニウム飽和水溶液で冷却した。混合液をエ ーテルで抽出し、有機層をブラインで洗浄し、乾燥後、シロップ状になるまで蒸 発させる。ヘキサン中酢酸エチルの３−１５％勾配を用いるフラッシュカラムク ロマトグラフィーを用いると、最初に８（１．８ｇ，４４％）が溶出され、より 遅い生成物（０．２３ｇ，６％）がこれに続いて溶出した。最後に、最も遅い生 成物（０．７ｇ，１７％）が溶出した。 上記３つの生成物はいずれもヘミアセタール構造と一致する¹Ｈ ＮＭＲシグ ナルを示した。この結果は、７のリチウム化における選択性を示しているが、他 の生成物が形成されたことは、競合的なハロゲン−リチウム交換反応も起こるこ とを示唆している。５の還元と同じ手順を用いて８を脱酸素化すると、５の場合 と同じように、α／βヌクレオシドの１：１混合物が低収率で得られた。一方、 ８のアセチル化は定量的な収率で進行し、９を得た(βアノマーだけが得られた ）。０℃から室温でＥｔ₃ＳｉＨ／ＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて９を還 元すると、８２％の収率で進行したが、再び選択性はなかった（１０α／１０β １：１）。アノマーの指定は、メチル基のΔδ以外に、α−アノマーに比較した β−アノマーについてよく知られている１’−Ｈシグナルの上方シフトに基づい てなされた（Ｔａｍ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７９，４４，４８５４〜４ ８６２；Ｓｏｋｏｌｏｖａ等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８１，９３， １９〜３４）。１０βは、２工程で１１へ脱保護化された（１Ｍ ＴＢＡＦ、次 いで８０％酢酸で還流）。誘導体１１は、メトキシド及びベンジレートによる２ −ブロモ置換基の置換に対してきわめて抵抗性であった。１２を高収率で得たの は、ＫＨ／ＢｎＯＨ／ＤＭＦ、１４０度で処理した場合だけであり、１２は、２ −（ベンジルオキシ）−５−ヨードピリジン３から合成した化合物とあらゆる点 で同一であった。この比較から、２，５−ジブロモピリジン７から得られる主要 生成物が５−ピリジル位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）８であることが紛 れもなく証明された。５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンの合成：６αをＴＢＡ Ｆで処置して５’−シリルエーテル保護基を外した後、イソプロピリデン基を酸 で切断し、次いでトリメチルシリルヨウ化物（ＴＭＳＩ）のジクロロメタン溶液 を用いてベンジルエーテル基を切断し、５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−ピリ ジン−２−オンを高収率で得る。 ５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンの合成：１０αをＴＢ ＡＦで処置して５’−シリルエーテル保護基を外した後、イソプロピリデン基を 酸で切断し、５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンを高収率で 得る。 ５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンの合成 ：２−ブロモ誘 導体１１（５８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を鋼鉄性のオートクレーブの中に入れ、オ ートクレーブをアルゴンの連続流で洗浄した。ヨウ化銅（Ｉ）（７２０ｍｇ，２ 当量）を加え、オートクレーブをデュアー瓶（ＣＯ₂−イソプロパノール）で冷 却した。アンモニアがオートクレーブ中で濃縮される（約１５ｍＬ）間、この容 器のアルゴン洗浄を継続した。次いでオートクレーブを速やかに閉じ、混合物を 室温まで温め、１１５℃に熱した油浴槽に置き、２４時間撹拌した。次いでオー トクレーブを前のように冷却し、開き、室温まで温め、アンモニアを蒸発させた 。次に、暗色の混合物をメタノールに溶かし、濾過後、シロップ状のものになる まで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、メタノール／三塩化 メタン）にかけて、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジン（図 ６の４）を得た（２３５ｍｇ、収率５２％）。 ５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンの合成：５−（α−Ｄ −リボフラノシル）−２−ブロモピリジン（５８０ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を鋼鉄性 のオートクレーブの中に入れ、オートクレーブをアルゴンの連続流で洗浄した。 ヨウ化銅（Ｉ）（７２０ｍｇ，２当量）を加え、オートクレーブをデュアー瓶（ ＣＯ₂−イソプロパノール）で冷却した。アンモニアがオートクレーブ中で濃縮 される（約１５ｍＬ）間、この容器のアルゴン洗浄を継続した。次いでオートク レーブを速やかに閉じ、混合物を室温まで温め、１１５℃に熱した油浴槽に置き 、２４時間撹拌した。次いでオートクレーブを前のように冷却し、開き、室温ま で温め、アンモニアを蒸発させた。次に、暗色の混合物をメタノールに溶かし、 濾過後、シロップ状のものになるまで蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（ シリカゲル、メタノール／三塩化メタン）にかけて、５−（α−Ｄ−リボフラノ シル）−２−アミノピリジン を得た。 ここに報告した２つのアプローチはα／βアノマーを１：１の比率で生成した が、それらは、オリゴヌクレオチド基礎単位の合成のためにより大量のＣ−ヌク レオシド２を製造する有用な方法である。２も１１も、他のＣ−ヌクレオシドと 同じように、薬剤的に有用な生物活性を示す可能性がある。実施例３：３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン（１）及び ３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（５）の合成 図８を参考にして、３を室温で還元することによってピリジン−２−オン−Ｃ −ヌクレオシド１３（図６の１）を合成し、次いで環化反応によって、化合物５ 及び８を得た。脱ブロック化の後に水素添加分解及び脱ベンジル化を行えば、化 合物１３を得る。 ピリジン−２−オン−Ｃ−ヌクレオシド１３（図６の１）は、２−フルオロ− ３−リチオピリジン（１）及びＤ−リボノ−１，４−ラクトン２から７工程で製 造された。β−リボフラノシド１２（図６の５）及び１３への成功するアプロー チは、ヘミアセタール３のフラノース環の還元的開化とそれに続く分子内Ｍｉｔ ｓｕｎｏｂｕ環化反応にあった。 Ｏ⁴カルボニルを欠くピリミジンヌクレオシド類似体１２及び１３の合成はこ こに記載され、本質的な分子内水素結合反応の同定に利用され得る。 アメリック混合物としての１３の合成は、２，４：３，５−ジ−Ｏ−ベンジリ デンーアルデヒド−Ｄ−リボース及び３−リチオ−２−フルオロピリジン（Ｂｅ ｌｍａｎｓ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８ ９，８，３０７〜３１５）から記載される。しかし、この方法は非効率的であり 、要となる出発物質の製造中にリボースジチオアセタールが関与するために、大 量製造に向いていなかった。さらに、鎖状の前駆体の酸触媒環化中にフッ素原子 が加溶媒分解的に置換してしまうため、この経路では、２−フルオロピリジン誘 導体１２は単離できなかった。 図８Ａを参考にして、出願人は、５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−２， ３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボラクトン（２）のような保護化されたＤ− リボノラクトンを用いて、３−リチオ−２−フルオロピリジンと縮合（−７８℃ 、その後室温、１８時間、ＴＨＦ）すると、ラクトール３の１：５α／β混合物 を収率６３％で得た（計画１）。ヘミアセタール３の接頭辞αが、基準Ｃ原子（ ２ではＣ４’；即ち、ピリジル成分はβ位にある）での配置に関するグリコシド ＯＨ基の位置を指すことに留意すべきである。アノメリック配置の指定は、¹Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるイソプロピリデンメチル基のΔδ値に基づいていた 。種々の溶媒に溶かしたＢＦ₃・Ｅｔ₂Ｏ又はＴＭＳＯＴｆの存在下、トリエチル シ ラン（Ｅｔ₃ＳｉＨ）を用いて３を脱水素化しようとしたが、ヌクレオシド５の 収率は低かった。さらに、所望されるβ−ヌクレオシドは混合物においていつで もマイナーなアノマーであった。アノマーの指定は、イソプロピリデンメチル基 のΔδ以外に、α−アノマーに比較したβ−アノマーについてよく知られている １’−Ｈシグナルの上方シフトに基づいてなされた。 １’−ヒドロキシル基のより効率的及び／又は選択的な還元が中間体１’−Ｏ Ａｃ誘導体を介して達成されることが実証された（即ち、４；Ｇｕｄｍｕｎｄｓ ｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，２３６５；Ｄ ｏｎｄｏｎｉ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９４，５９，６４０４〜６４１２ ）。出願人は、Ａｃ₂Ｏ／ＴＥＡ／ＤＭＡＰアセトニトリル溶液を用いれば３が 定量的な収率でアセチル化され、４を生じる（１種のアノマーだけが生成した、 その配置を決定するための試みはなされなかった）ことを見出した。Ｅｔ₃Ｓｉ Ｈ／ＴＭＳＯＴｆジクロロメタン溶液で０℃〜室温において４を還元的に脱アセ チル化すると、効率的に進行し、高収率の５（α／β１０：１）が得られた；溶 媒がＥｔ₃ＳｉＨの場合、α／β比は５：１であった。上記の結果は驚くべきも のであった、なぜなら、同様の反応条件では、ピラジン（Ｌｉｕ等、Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，５３２５〜５３２８）及びイミダゾ ［１，２−ａ］ピリジンラクトール（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ等、Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９６，３７，２３６５〜２３６８）の還元において は決まってβ選択的であると報告されていたからである。 十分量のβ−Ｃ−ヌクレオシドを得るために、出願人はさらにいくつかの異な る経路を研究した：３のメシル化は、適度な収率で１’−Ｏ−メシル誘導体をも たらした（計画２）。６をＬＡＨで処置しても、２−ピリジンＣ−ヌクレオシド について報告されているようには、このスルホン酸塩を還元しなかった。より反 応性に富むＬｉＥｔ₃ＢＨも失敗した。より反応性に富む１’−Ｏ−Ｔｆ誘導体 の製造が失敗したのはトリチル化の条件下でフラノース環が開いたためであった ということは注目に値する。 Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ等（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８８，５３，３４７３ 〜３４７９）は、６−ピリジンラクトール誘導体のヘミアセタール環を水素添加 分解によって開化するとアロ（ａｌｌｏ）及びアルトロ（ａｌｔｒｏ）の異性体 が発生すると報告した。３とＮａＢＨ₄の反応は定量的な収率で進行し、約１： １のアロ／アルトロ混合物７を与えた。これらエピマーは分離しなかったが、通 常のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ条件［ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）／ Ｐｈ₃Ｐ／ＴＨＦ、還流］で処理し、５（α／β比１：２）及び３−（２，３− Ｏ−イソプロピリデン−５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニルシリル−α−Ｌ−リキソ −フラノシル）−２−フルオロピリジン（８）を得た。後者は４’−オキシホス ホニウム中間体の競合的形成より生じたものである。Ｙｏｋｏｙａｍａ等（Ｃｈ ｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９４，２６５〜２６８）は、このような中間体が形成され るのは１’−ＯＨと２−ピリミジル塩基の水素受容部分とが水素結合するためで あろうと考察した。７のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ環化が室温で行われると、より多く のリキソ誘導体８が、還流温度の場合よりも多く得られるということは注目に値 する。このことは、１’−ＯＨとそのごく近傍にあるフッ素との間に水素結合が 存在し、それが反応温度の上昇によって壊されることを示している。最近、同様 のＭｉｔｓｕｎｏｂｕ環化を重要な工程として用いるイミダゾールＣ−ヌクレオ シドの効率的な合成法が報告された（Ｈａｒｕｓａｗａ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ ｍ．１９９６，６１，４４０５〜４４１１）。５及び８の混合物をクロマトグラ フィーで分離するのは困難だったので、まずＴＢＡＦで５’−脱シリル化し、次 いでフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画した。典型的 な手順では、７（７ｇ，１３ｍｍｏｌ）及びＰｈ₃Ｐ（５．２５ｇ，２０ｍｍｏ ｌ）をＴＨＦに溶解し、その混合物を加熱して還流させた。ＤＥＡＤ（３．１５ ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を還流混合物に加え、１時間加熱を続けた。真空下で溶媒 を除去し、酢酸エチルの９−１１％勾配ヘキサン溶液を用いたフラッシュカラム クロマトグラフィーによって残渣を精製する。溶媒を除去すると、５及び８の混 合物５．６ｇ、８３％が得られた（図８Ｂ参照）。上記の混合物をＴＨＦ（７５ ｍＬ）に溶かし、ＴＢＡＦの１ＭＴＨＦ溶液（２２ｍＬ，２当量）で１時間処理 した。次いでこれを真空で濃縮し、シリカゲルのカラムにかけ、溶出用に酢酸エ チルの１５−７０％勾配ヘキサン溶液を用いて、クロマトグラフィー処理した。 最初にα−アノマー１０（０．５６ｇ，１９％）が溶出され、次いでβ−アノマ ー９（１．６ｇ，５４％）が溶出した。最後にリキソ誘導体１１（０．５６ｇ， １９％）が溶出した。β−アノマー９が７から２段階で４５％の収率で得られた のに対し、α−アノマー１０及びリキソ誘導体１１はいずれも１６％の収率で得 られた。９は、８０％酢酸で煮沸することで遊離の２−フルオロヌクレオシド１ ２（融点１３４〜１３５℃、ＴＨＦより）へ変換され、次いでＢｎＯＫで２−（ ベンジルオキシ）誘導体へ変換した（１２の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）データ： δ８．１９（ｍ，１Ｈ，Ｈ６），８．１１（ｍ，１Ｈ，Ｈ４），７．３２（ｍ， １Ｈ，Ｈ５），４．９８（ｄ，Ｊ_1',2'＝５．６，１Ｈ，Ｈ１’），４．０５− ３．９６（ｍ，３Ｈ，Ｈ２’，Ｈ３’，Ｈ４’），３．８４（ｄｄ，Ｊ_5'4'＝３ ．０，Ｊ_5'5"＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５’），３．７３（ｄｄ，Ｊ_5"4'＝４．６， Ｊ_5"5'＝１２．０，１Ｈ，Ｈ５”）。ベンジル基の触媒的水素添加分解（Ｈ₂， Ｐｄ−Ｃ）は、Ｃ１’−Ｏ４’結合も同時に切断した。トリメチルシリルヨウ化 物（ＴＭＳＩ）を用いた脱ベンジル化はうまく実行され、シロップ状の３−（β −Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（１３）を８３％の収率で得た［ ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_max３０２ｎｍ］。α−アノマー１０は９と同じようなやり 方で脱保護化して１４を得た（融点１３４〜１３５℃、ＴＨＦより；１４の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）データ：δ８．１２−８．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ６，Ｈ４ ），７．３１（ｍ，１Ｈ，Ｈ５），５．２６（ｄ，Ｊ_1',2'＝２．８，１Ｈ，Ｈ １’），４．３５−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’，Ｈ３’），４．０４（ｍ，１ Ｈ，Ｈ４’），３．８８（ｄｄ，Ｊ_5'4'＝２．６，Ｊ_5'5"＝１１．８，１Ｈ，Ｈ ５’），３．６８（ｄｄ，Ｊ_5"4'＝４．６，Ｊ_5"5'＝１１．８，１Ｈ，Ｈ５”） ）。１４のフッ素をベンジレートで置換したところ、定量的な収率で無水誘導体 １５を得た［融点１９５〜１９６℃，ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_max２８６ｎｍ；１５ の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃）₂ＣＯデータ：δ８．１０（ｄｄ，Ｊ_6,5＝５．２，Ｊ_{6, 4} ＝１．６，１Ｈ，Ｈ６），７．８０（ｄｄ，Ｊ_4,5＝７．３，Ｊ_4,6＝１．６， １Ｈ，Ｈ４），６．９５（ｄｄ，Ｊ_5,6＝５．２，Ｊ_5,4＝７．３，１Ｈ，Ｈ５） ，５．５９（ｄ，Ｊ_1',2'＝６．０，１Ｈ，Ｈ１’），５．３６（ｄ，Ｊ_OH,3'＝ ７．２，１Ｈ，３’ＯＨ），５．０２（ｄｄ，Ｊ_2',1'＝６．０，Ｊ_2',3'＝５． ２，１Ｈ，Ｈ２’），４．６４（ｔ，Ｊ_3',OH,＝５．４，１Ｈ，ＯＨ５’），３ ．９７（ｍ， １Ｈ，Ｈ３’），３．６２（ｄｑ，Ｊ_5',4'＝２．２，Ｊ_5',5"＝１２．２，１Ｈ ，Ｈ５’），３．３９（ｍ，１Ｈ，Ｈ５”），３．２２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’）］ 。この予想外の環化は、近傍の２’ヒドロキシル基によってフッ素原子の分子内 求核性置換が起きたためと解釈される。１１の構造は、Ｈ４’とＨ３’（６％Ｎ ＯＥ）及びＨ４’とＨ４（５％ＮＯＥ）との間に相互強化が観察されたＮＯＥ試 験によって確認された。 出願人は、オリゴヌクレオチド合成の基礎単位の製造用出発物質としてのＣ− ヌクレオシド１２及び１３のβ−アノマーを大量合成するのに有用な方法を記載 した。上記類似体はまた潜在的な抗ウィルス剤及び／又は抗癌剤としても興味が ある。実施例４：１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ リル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミ ダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オン （７）の合成 図９を参照し、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラ ノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オン（３）をＮｉｅｄｂａｌｌａ 等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７４，３９，３６６８〜３６７１に準じて合成 した。１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オ ン（５）は、誘導体３の標準的なＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ脱保護化によって、ほと んど定量的な収率で、製造された。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ −リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリミジン−４−オン（６）は、ピリジ ン溶液中で５を標準的に脱メトキシトリチル化する（室温、一晩中）ことによっ て製造し、収率８３％であった。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ− ｔ−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドロピリ ミジン−４−オンは、標準的なシリル化法（Ｈａｋｉｍｅｌａｈｉ等、Ｃａｎ． Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９８２，６０，１１０６〜１１１３）によって製造した。１− （５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｏ− ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト−β−Ｄ −リボフラノシル）−１，４−ジヒドロ−ピリミジン−４−オン（７）は、標準 的なホスフィチル化法(Ｔｕｓｃｈｌ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３ ，３２，１１６５８〜１１６６８)によるホスフィチル化によって製造した。実施例５：１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシ リル−３−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミ ダイト−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，４−ジヒドローピリミジン−２−オン （６）の合成 図１０を参照し、化合物６は、Ｍｕｒｒａｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９ ５，３１１，４８７〜４９４に記載された方法によって製造した。実施例６：５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリ ル−Ｏ⁴−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウリジン３’−（２−シアノエ チル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）（５）の合成 図１１を参照し、化合物（５）は、Ｏ⁴−ジフェニルカルバモイル−３−デア ザウリジン（２）のジメトキシトリチル化以外は、米国特許番号５，１３４，０ ６６に記載された方法によって製造した。上記の特許に開示された方法は所望の ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｏ⁴−ジフェニルカルバモイル−３−デアザウ リジン（３）を１０％の収率でしか与えなかった。それ故、２をジメトキシトリ チル化する以下の方法が開発された。 化合物２（１．９５ｇ，４．４５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６０ｍＬ ）に対し、シム−コリジン（ｓｙｍｍ−ｃｏｌｌｉｄｉｎｅ）（１．５３ｍＬ， １１．６ｍｍｏｌ）を加えた後、硝酸銀（０．９９ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を加え た。室温で１０分間撹拌した後、塩化ジメトキシトリチルを加え、この反応混合 物をさらに１時間撹拌した。その後、メタノール（１５ｍＬ）で冷却し、蒸発乾 固した。残渣をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブ ラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒は真空除去した。 油状の残渣を、酢酸エチルの（３０−５０％）勾配ヘキサン溶液を溶離液として 用いたシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、誘導体３を ３ｇ（８８．８％）得た。実施例７：２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル− ３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）− β −Ｄ−リボフラノシルインドールの合成 図１３を参照し、Ｓｚａｒｅｋ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７５，６４８〜 ６４９の方法により、インドール及び２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β− Ｄ−リボフラノース（１）から、１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β −Ｄ−リボフラノシル）インドール（２）を合成した。５−Ｏ−ジメトキシトリ チル−β−Ｄ−リボフラノシルインドール（３）は、標準的な脱保護化（ＮａＯ Ｍｅ／ＭｅＯＨ）の後にトリチル化（ＤＭＴＣｌ／Ｐｙ）によって、中間体２か ら製造した。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル −β−Ｄ−リボフラノシルインドール（４）は、標準的なシリル化によって中間 体３より製造した（収率３２％）。２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ −ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル ホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルインドール（５）は、３’−Ｏ −ホスフィチル化によって中間体４より製造した（収率８５％）。実施例８：２−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル− ３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）− β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾールの合成 図１４を参照し、Ｋａｚｉｍｉｅｒｃｚｕｋ等、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．１ ９８０，３５ｃ，３０〜３５の方法により、ベンズイミダゾール及び１−Ｏ−ア セチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノース（１）か ら１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノシル）ベンズ イミダゾール（２）を合成した。５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボ フラノシルベンズイミダゾール（３）は、標準的な脱保護化（ＮａＯＭｅ／Ｍｅ ＯＨ）の後にトリチル化（ＤＭＴＣｌ／Ｐｙ）によって、中間体２から製造した 。２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β− Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（４）は、標準的なシリル化によって中 間体３より製造した（収率３２％）。２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５ ’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプ ロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（５ ）は、３’−Ｏ−ホスフィチル化によって中間体４より製造した（収率８５％） 。実施例９：３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェ ニルエチル）−オン及び５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４ −ニトロフェニルエチル）−オンーホスホルアミダイトの合成 図１５を参照し、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図 ６の１）をＴＢＤＭＳｉ−Ｃｌ／ＤＭＦ、ＮＰＥＯＨ／Ｐｈ₃Ｐ／ＤＥＡＤ／Ｔ ＨＦ及びＴＦＡ，ＣＨＣｌ₃で処理すると、３−（β−Ｄ−リボフラノシル）− ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン（７）を得る。５−（β− Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オン（図６の２）をＴＢＤＭＳｉ−Ｃｌ ／ＤＭＦ、ＮＰＥＯＨ／Ｐｈ₃Ｐ／ＤＥＡＤ／ＴＨＦ及びＴＦＡ、ＣＨＣｌ₃で処 理すると、５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４−ニトロフェ ニルエチル）−オン（８）を得る。 化合物７及び８は、上記の標準プロトコールを用いて、いずれも容易にホスホ ルアミダイトヘ変換される。 本発明の新規類似体のホスホルアミダイトは以前に記載された合成、脱保護、 精製及び検査方法（ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，同上）を用いてポリヌクレオ チドヘ導入される。実施例１０：４−ベンジルアミノ−１Ｈ−ピリジン−２−オン又はＮ⁴−ベンジ ル−３−デアザシトシン（図１２） 表題の化合物は、Ｈｕｎｇ，Ｎ．Ｃ．；Ｂｉｓａｇｎｉ，Ｅ．Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ，１９８４，７６５に記載された方法で、４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピリジン −２−オン（１）より製造した。 ４−ベンジルアミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リ ボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２−オン（３）又はＮ⁴−ベンジル−２’， ３’，５’−トリ−Ｏ−ベンゾイル−３−デアザシチジン： ヘキサメチルジシラ ザン（５０ｍＬ）とトリメチルクロロシラン（５ｍＬ）の混合液に２（２．８ｇ ，１４．０ｍｍｏｌ）を懸濁し、３時間還流した。得られた２のトリメチルシリ ル誘導体の澄明溶液を蒸発乾固させた。乾燥アセトニトリル（４０ｍＬ）にこの 澄明な油液を溶かし、これに１−Ｏ−アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾ イル−Ｄ−リボフラノース（７．０６ｇ，１４．７ｍｍｏｌ）を加えた後、反応 混 合液を０℃に冷却した。上記の撹拌された溶液にトリメチルシリルトリフルオロ メタンスルホネート（３．２５ｍＬ，１６．８ｍｍｏｌ）を滴下して加えた後、 反応混合物を室温まで温め、一晩放置した。その後、反応混合物を、飽和炭酸水 素ナトリウム溶液で洗浄したジクロロメタンで希釈した。未反応物２の沈殿物は 濾過によって分離した。次いで層を分離して有機層をブラインで洗浄した後、蒸 発させた。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、 化合物３を５．５ｇ（６０％）得た。 ４−アミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リボフラノ シル）−１Ｈ−ピリジン−２−オン（４）又は２’，３’，５’−トリ−Ｏ−ベ ンゾイル−３−デアザシチジン： 化合物４は、室温、エタノールにおいて３を触 媒的水素添加分解（Ｐｄ／Ｃ）して製造した。 ４−アセチルアミノ−１−（２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−リ ボフラノシル）−ＩＨ−ピリジン−２−オン（５） ：化合物５は、誘導体４を無 水酢酸ピリジン溶液において標準的にアセチル化することによって製造した。 ４−アセチルアミノ−１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−１Ｈ−ピリジン−２ −オン（６） ：表記の化合物は、−１０℃、ピリジン−エタノール混液において 、誘導体５の糖成分を２Ｍ水酸化ナトリウム溶液で選択的に脱保護化することに よって製造される。 ４−アセチルアミノ−１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−リボフラ ノシル）−１Ｈ−ピリジン−２−オン（７） ：化合物７は上記記載の標準プロト コールを用いて製造される。実施例１１：２’−Ｏ−アミノピリミジンヌクレオシド（図１６の８）の合成 ２’−デオキシヌクレオシドの５’−Ｏ−ＮＨ₂又は３’−Ｏ−ＮＨ₂誘導体を Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ変換によって製造する合成法は、当技術分野でよく知られて いる。しかしながら、この方法を２’−Ｏ−ＮＨ₂−リボヌクレオシドの製造に 適用したところ、所望の化合物はごく低い収率（１０％未満）でしか得られなか った。出願人は、２’−Ｏ−ＮＨ₂−リボヌクレオシド及びそのホスホルアミダ イトを合成する新規の高度に効率的な方法を開発した。 ３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ−イル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ピリミジン（２） 図１６を参照し、１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウラシル（２．４４ｇ， １０ｍｍｏｌ）のような１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ピリミジンを無水ピ リジンで２度共蒸発して乾燥させ、無水ピリジンに再溶解した。上記の溶液を冷 却（０℃）し、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルシロキ サン（３．５２ｍＬ，１１．０ｍｍｏｌ）の無水ジクロロエタン溶液１０ｍＬを 撹拌しながら滴下した。反応液をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で冷却した後蒸発乾固し た。残渣を塩化メチレンに溶かし、飽和ＮａＨＣＯ₃及びブラインで洗浄した。 有機層を蒸発乾固しトルエンとともに共蒸発させ、ごく微量のピリジンを除去し 、化合物２を４．８ｇ（９８％）得た。これは、さらに精製せずに使用した。 ２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサ ン−１，３−ジ−イル）−ウリジン（４） 氷冷した３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジ− イル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−ウラシル（４ｇ，８．２ｍｍｏｌ） のジクロロメタン溶液に、無水スルホン化トリフルオロメタン（１．６６ｍＬ， ９．８６ｍｍｏｌ）を加えた後、反応混合液を−５℃で３０分間撹拌した。次い でジクロロメタンで希釈し、冷１％酢酸水溶液、次いで飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸 発乾固した。得られた誘導体３を無水アセトニトリル（７０ｍＬ）に溶かした後 、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（１．７４ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）を加えた。激 しく撹拌しながら、ＤＢＵ（１．６ｍＬ，１０．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリ ル溶液（５ｍＬ）を滴下して加えた。３０分後、暗橙色の反応混合物をジクロロ メタン（２５０ｍＬ）で希釈した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で抽出（３ ｘ２５０ｍＬ）した。得られた無色の有機層をブラインで洗浄した後蒸発乾固し 、３．６ｇ（７０％）の化合物４を得た。 ２’−Ｏ−フタルイミド−ウリジン（５） ２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサ ン−１，３−ジ−イル）−ウリジン（３ｇ，４．７５ｍｍｏｌ）のジクロロメタ ン溶液に、トリエチルアミン（１．３２ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）及び三フッ化水 素トリエチルアミン（１．５５ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）を同時に加えた。１時間 後、溶媒を真空除去し、残った残渣をジクロロメタンに溶かした後、３５℃で蒸 発させた。この手順を３回繰り返した（出発物質の完全な変換が薄層クロマトグ ラフィーで示されるまで）。残渣をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナト リウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した 後、蒸発乾固して１．５６ｇ（８５％）の化合物５を得た。 ２’−Ｏ−アミノウリジン（８）は、メチルアミン４０％水溶液で加水分解し 、次いでエタノールから結晶化して得た。 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミド−ウリジン（６） 化合物５（１．５ｇ，４ｍｍｏｌ）を無水ピリジンを用いて数回蒸発乾固させ た後、乾燥ピリジンに再溶解した後、塩化ジメトキシトリチル（１．２当量）を 加えた後、反応混合液を無水条件下で一晩放置した。次いでメタノール（１５ｍ Ｌ）で冷却し、蒸発させ、クロロホルムに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶 液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発させた 。残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、酢酸エチ ル−ヘキサン混液（２：３）で溶出させ、対応する５’−Ｏ−ジメトキシトリチ ル誘導体６を１．９３ｇ（７０％）得た。 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミドウリジン−３’−（ ２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイト（７） Ｔｕｓｃｈｌ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３，３２，１１６５８〜 １１６６８）による６の標準的ホスフィチル化によって、ホスホルアミダイト７ を７０％の収率で得た。 ホスフィチル化の一般方法：乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かした保護 化ヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）の撹拌された氷冷溶液に、アルゴンブランケット 下、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５当量）及び２−シアノエチル Ｎ’Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１．２当量）をジクロロメ タン（３ｍＬ）に前もって溶かした溶液をシリンジで滴下した。同時に、別のシ リンジで、Ｎ−メチルイミダゾール（１当量）を加え、室温で２時間撹拌を続け た。その後、反応混合液を再び氷冷し、１５ｍＬの乾燥メタノールで冷却した。 ５分間の撹拌後、混合液を真空濃縮（４０℃未満）し、シリカゲルのフラッシュ カラムクロマトグラフィーで精製し、１％トリエチルアミンを含む酢酸エチル− ヘキサン混液で溶出させ、対応する白色泡状のホスホルアミダイトを得た。 ホスホルアミダイトは、以前に記載された合成、脱保護、精製及び検査方法（ Ｗｉｎｃｏｔｔ等、１９９５，同上）を用いて、リボザイム及び基質のような核 酸分子へ導入された。段階的カップリングの平均収率は約９８％であった。実施例１２：２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル ジシロキサン−１，３−ジ−イル）−Ｎ⁶−ｔ−ブチルベンゾイルアデノシン（ 図１７の５）及び２’−Ｏ−アミノアデノシンヌクレオシド（図１７の９）の合 成 図１７を参照し、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１２ｍｍｏｌ） を、アラ−ウリジン誘導体で記載したように、１，３−ジクロロ−１，１，３， ３−テトライソプロピルシロキサン（４．２ｍＬ，１３．２ｍｍｏｌ）でシリル 化した。生成物の無水ジクロロメタン冷溶液（−１０℃）をトリフルオロメタン スルホクロライド（１．５３ｍＬ，１４．４ｍｍｏｌ）で２０分間処理した。得 られた溶液を無水ジクロロメタンで希釈し、１％の冷酢酸水溶液（０℃）、次い で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリ ウムで乾燥し、蒸発乾固して誘導体２を得た。残渣を無水アセトニトリルに溶か し、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（２．５４ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。 得られた反応混合液に、激しく撹拌しながら、ＤＢＵの無水アセトニトリル溶液 （２．３３ｍＬ，１５．６ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、暗橙〜褐色の反応混 合液をウリジン誘導体で記載したようにして処理した。得られた２’−Ｏ−フタ ルイミド誘導体４を無水ピリジンに溶かし、４−ｔ−塩化ブチルベンゾイルを加 えた後、反応混合液を室温で一晩放置した。次いでメタノール（１５ｍＬ）で冷 却し、溶媒を真空除去し、残渣をトルエンに溶かした後、蒸発乾固した。得られ た油をジクロロメタンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及びブラインで 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、蒸発乾固させた。残渣をシリカのフラッ シュカラムクロマトグラフィーで精製し、酢酸エチル−ヘキサン混液（１：２） で溶出させ、完全に保護化されたシンソン（ｓｙｎｔｈｏｎ）５を３．５ｇ（ア ラ（ａｒａ）−Ａについて３５％）得た。２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ⁶−ｔ−ブチルベンゾイルアデノシン（６） マルキェビチ（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚ）基脱保護化を、対応するウリジン誘導 体と同様に実施した。収率８６％。 ２’−Ｏ−アミノアデノシン（９）は、メチルアミン４０％水溶液で加水分解 し、次いでエタノールから結晶化して得た。 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ⁶−ｔ−ブチル ベンゾイルアデノシン（７） ２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ⁶−ｔ−ブチルベンゾイルアデノシンの標準的な ジメトキシトリチル化によって化合物７を収率７５％で得た。 ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−フタルイミド−Ｎ⁶−ｔ−ブチル ベンゾイルアデノシン−３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピル）ホ スホルアミダイト（８） Ｔｕｓｃｈｌ等、同上、による標準的なホスフィチル化によってホスホルアミ ダイト８を収率７０％で得た。実施例１３：２’−Ｏ−フタルイミド−３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピル ジシロキサン−１，３−ジ−イル）−Ｎ⁶−ｔ−ブチルベンゾイルグアノシン（ 図１８の１１）及び２’−Ｏ−アミノグアノシンヌクレオシド（図１８の８）の 合成 図18を参照し、ここに援用するＨａｎｓｓｋｅ等、１９８４，Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ 40，１２５に記載された方法を利用して、化合物１から出発して化合 物４が合成される。次いで化合物８及び９は、図７に記載された工程を利用して 化合物４から合成され得る。実施例１４：２’−Ｏ−アミノ修飾で置換されたリボザイムによって触媒される ＲＮＡ切断反応 インビトロのＲＮＡ切断アッセイ： 基質ＲＮＡは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳ バイオケミカルズ）を用いて５’末端を標識する。切断反応はリボザイム「過剰 」条件で実施する。ごく微量（１ｎＭ以下）の５’末端標識基質及び４０ｎＭ非 標識リボザイムを変性し、２分間で９０℃まで加熱し、氷上１０〜１５分間急冷 す ることにより別々に再生する。リボザイム及び基質を、３７℃で１０分間、５０ ｍＭトリス塩酸及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液で別々に保温する。 リボザイムと基質溶液を混合し、３７℃で保温することにより反応を開始する。 一定の時間間隔で５μＬの部分標本を取り、反応は等量の２Ｘホルムアミド停止 液と混合して抑止する。各標本は、２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離す る。結果を定量化し、標的ＲＮＡの切断比率を時間に対してプロットする。 図１９Ａを参照し、４、７、９又は１５．１位に２’−Ｏ−アミノ置換基がつ いたハンマーヘッド・リボザイムは上記記載のように合成された。上記リボザイ ムの標的ＲＮＡ切断能力をアッセイした。図１９Ｂに示されるように、図１９Ａ に示されたすべてのリボザイムは標的ＲＮＡの切断を触媒することができた。実施例１５：Ｌ−ヌクレオチド置換を含む酵素的核酸の合成 合成方法は、Ｕｓｍａｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８７，１０９ ，７８４５〜７８５４；Ｓｃａｒｉｎｇｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．１９９０，１８，５４３３〜５４４１；及びＷｉｎｃｏｔｔ等、１９９５ ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７（これら参考文献はす べてこのまま援用する）に記載されるような通常のＲＮＡ合成法に準じ、５’− ＯＨのジメトキシトリチル及び３’−ＯＨのホスホルアミダイトのような、通常 の核酸保護基及び結合基を利用する。Ｌ−ヌクレオシドのホスホルアミダイトは 、ハンマーヘッド・リボザイムだけでなく、ヘアピン、デルタ肝炎ウィルス、Ｖ Ｓ ＲＮＡ，ＲＮａｓｅＰリボザイム、グループＩ、グループＩＩイントロン又 は他の触媒的核酸に導入され得る。それ故、それらは核酸構造において広く使用 される。実施例１６：Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成（計画１） 図２１を参照し、（Ｖｉｓｓｅｒ等、Ｒｅｃｌ．Ｔｒａｖ．Ｐａｙｓ−Ｂａｓ １９８６，１０５，５２８〜５３７）に記載されたやりかたで、Ｌ−リボース を塩酸／メタノールの作用によって１−Ｏ−メチル−α，β−Ｌ−リボフラノシ ドへ変換した。この中間体をさらにＢｚ／Ｐｙによってベンゾイル化し、得られ た１−Ｏ−メチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−Ｌ−リボフラノシドを アセトリシス法（Ａｃ₂Ｏ／ＡｃＯＨ／Ｈ₂ＳＯ₄）にかけた。目標である１−Ｏ −アセチル−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−リボフラノシドは、 Ｌ− リボースから約３０％の収率で単離され、Ｖｏｒｂｒｉｇｇｅｎ法（Ｖｏｒｂｒ ｉｇｇｅｎ等、１９８１，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１１４，１２３４）による収率５ ０〜７５％のＬ−リボヌクレオシド合成の出発物質として役立てた。 完全に保護されたリボヌクレオシドのリボース部分はＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ処 理（Ｕｒｄ）及びＮａＯＨ／ジオキサン（Ｃｂｚ，Ａｂｚ，Ｇｉｂｕ）によって 、脱保護化された。次いで、標準トリチル化、シリル化、２’および３’−Ｏ− ＴＢＤＭＳｉ異性体の分割、及びホスフィチル化法によって、目標のホスホルア ミダイトを得た。 上記ホスホルアミダイトは、以前に記載されたＲＮＡ合成及び脱保護化の一般 的な方法（ｗｉｎｃｏｔｔ等、同上、そのままここに援用する）を用いてハンマ ーヘッド・リボザイムに導入した。２．５μｍｏｌスケールに変更されたプロト コールに基づいて、３９４型（ＡＢＩ）シンセサイザーを用いて、５分間の２’ −Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ保護化ヌクレオチド・カップリング工程及び２．５分間の２ ’−Ｏ−メチルヌクレオチド・カップリング工程で、合成を実施した。ポリマー 結合性５’−ヒドロキシルに対して、６．５倍過剰の０．１Ｍホスホルアミダイ ト溶液及び２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾールが各カップリングサイクルで使 われた。 すべての分析的ＨＰＬＣ分析は、報告されているように（ｗｉｎｃｏｔｔ等、 同上）、５０℃で、ヒューレットパッカードの１０９０ＨＰＬＣ、Ｄｉｏｎｅｘ のＮｕｃｌｅｏＰａｃ（商標）ＰＡ−１００カラム，４ｘ２５０ｍｍにて実施し た。 ＣＧＥ分析は、ヒューレットパッカードの^3DＣＥで、Ｊ＆ＷのμＰＡＧＥ^TM− ５（５％Ｔ，５％Ｃ）ポリアクリルアミドゲル充填カラム、７５μｍＩ．Ｄ．ｘ ７５ｃｍ、有効長５０ｃｍ、１００ｍＭトリスホウ酸塩、７Ｍ尿素、ｐＨ８．３ 及びＪ＆ＷのμＰＡＧＥ^TM緩衝液（１００ｍＭトリスホウ酸塩、７Ｍ尿素、ｐＨ ８．３）を用いて実施した。サンプルは、３〜１０秒間に−１３ｋＶで電気力学 的に注入され、−１３ｋＶで運転した後、２６０ｎｍで検出された。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、パーセプティブ・バイオシステムズ（ ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ ） 分光計によって決定された。実施例１７：Ｌ−リボヌクレオシドのホスホルアミダイト合成（計画２） 上記の標準的な計画１は広く利用されている（Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、同上、及 びＡｓｈｌｅｙ、同上）が、ある種の欠点がある；ａ）Ｌ−リボースが高価で、 Ｌ−リボヌクレオシド合成に必要な重要な中間体、１−Ｏ−アセチル−２，３， ５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｌ−リボフラノシドの収率が低いこと（約３０ ％）；ｂ）塩基保護に影響せずにリボース保護基を選択的に除去することが困難 であること、及びトリチル化反応に用いられる中間体の単離が冗長になることの ために、Ｎ−保護化５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体への変換があまり効率的ではないこ と（典型的な収率は４０〜５０％である）。 上記の問題は合成の第一工程で５−Ｏ−基に直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保 護を導入することによって克服され得る。これには２つの目的がある：１）Ｌ− リボースの、グリコシル化の前駆体として役立つ５−Ｏ−ｔ−ブチルジフェニル シリル−１，２，３−Ｏ−ベンゾイルリボフラノースへの効率的な変換が達成さ れること（計画１の３０％に対して６０％）；２）アシル型リボースに対する５ ’−Ｏ−ＴＢＤＰＳｉ基の直交性及び完全にブロックされたＬ−リボヌクレオシ ドの塩基保護によって、この基の選択的な除去と５’−ＯＨ中間体の効率的な単 離、及び次の効率的な５’−トリチル化が可能になること。５’−Ｏ−ＤＭＴ中 間体からの２’，３’−保護基の除去及び目標の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ−保護化 Ｌ−リボヌクレオシドの単離がずっと効率的になるのは、５’−Ｏ−ＤＭＴ基の 親油性によるものである。実施例１８：Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシーウリジン及びピリミジンホス ホルアミダイトの合成 図２３Ａを参照し、Ｌ−アラビノースを、Ｈｏｌｙ、Ｃｏｌｌ．Ｃｚｅｃｈ． Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７２，４０７２〜４０８７の方法により、２−ア ミノ−β−Ｌ−アラビノフラノ［１’，２’：４，５］オキサゾリン（１）を介 して２，２’−アンヒドロ−Ｌ−ウリジン（２）へ変換した。アジドリチウムを 用いた２，２’アンヒドロ環の開化及び次の２’−アミノ−ウリジン４への還元 は（Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７１，３６，２５０〜 ２５４；Ｈｏｂｂｓ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７９，４２，７１４〜７１ ９）に記載されたやり方で実施した。ヌクレオシド（４）の目標ホスホルアミダ イト（６）への変換は、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９５，４４３４〜４４４２に準じて達成した。 重要中間体４はまた、Ｄｉｖａｋａｒ等、１９８２，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ，１１７１による標準的な成分置換反応によって、２’−デオ キシ−２’−アジド−シチジンへ変換され、ベンゾイル基でＮ４を保護し、トリ チル化した後、ウリジンの場合と同じように、２’−Ｎ３官能基を２’−アミノ へ還元した。さらに上記中間体は、ウリジンに対するフタロイル保護基導入及び ホスフィチル化と同じ方法を用いて、ホスホルアミダイトへ変換した。実施例１９：Ｌ−２’−アミノ−２’−デオキシ−プリンホスホルアミダイトの 合成 図２３Ｂを参照し、Ａ及びＧのＬ−リボヌクレオシドが、上記の合成計画１及 び２に示されたようにＬ−リボースより得られた。それらは暫定的な保護法を用 いてＮ−保護化され（Ｔｉ等、ＪＡＣＳ １９８２、１０４，１３１６〜１９） 、その後マルキェビチ保護基で３’及び５’位を保護した。得られた中間体１を ＣｒＯ₃／ｐｙによって酸化し、得られた２−ケト化合物を２’−キシロ誘導体 ２へ還元した。Ｒｏｂｉｎｓ等（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅｓ １９９２，１１，８２１〜８３４）の方法により、トリチル化及びＬ ｉＮ３による求核置換を施し、２’−Ｎ３−誘導体３を得た。３のアジド基をＰ ｈ₃Ｐ／ＮＨ₄ＯＨで還元した後、脱シリル化した。得られた２’−アミノヌクレ オシド４は約６０％の収率で単離された。中間体４からホスホルアミダイト６へ の変換は、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、同上、による関連ピリミジン誘導体と同様の 方法で実施した。実施例２０：Ｌ−ヌクレオチドで置換されたリボザイムの触媒活性 ハンマーヘッド・リボザイムをいくつかの部位においてＬ−ヌクレオチドで置 換した（図２４）。リボザイム触媒活性に対するＬ−ヌクレオチド置換の相対的 な効果は、「材料と方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、 同上、に記載された標準アッセイ条件のもとで検討された。インビトロのＲＮＡ切断アッセイ： 基質ＲＮＡは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＵＳ バイオケミカルズ）を用いて５’末端を標識する。切断反応はリボザイム「過剰 」条件で実施する。ごく微量（１ｎＭ以下）の５’末端標識基質及び４０ｎＭ非 標識リボザイムを変性し、２分間で９０℃まで加熱して別々に再生し、氷上１０ 〜１５分間急冷する。リボザイム及び基質を、３７℃で１０分間、５０ｍＭトリ ス塩酸及び１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む緩衝液で別々に保温する。リボザイ ムと基質溶液を混合し、３７℃で保温することにより反応を開始する。一定の時 間間隔で５μＬの部分標本を取り、反応は等量の２Ｘホルムアミド停止液と混合 して抑止する。各標本は、２０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離する。結果 を定量化し、標的ＲＮＡの切断比率を時間に対してプロットする。 図２５を参照すると、１つ又はそれ以上の部位でＬ−ヌクレオチド置換したハ ンマーヘッド・リボザイムはいずれも標的ＲＮＡを切断する触媒活性を有してい た。 上記及び本仕様に記載されたリボザイム、標的配列、リボザイムモチーフ及び Ｌ−ヌクレオチド置換位置の配列は非限定的な例であることを意味し、当業者は 、他の核酸触媒モチーフ、標的配列及びＬ−ヌクレオチド置換(塩基、糖及びリ ン酸修飾)が標準的な技術を用いて容易に生成され、本発明の範囲内にあること を認知するだろう。実施例２１：Ｌ−核酸触媒のインビトロ選択 インビトロ選択（発展）戦略（Ｏｒｇｅｌ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｂ２０５，４３５）は、ホスホジエステル結合及びアミド結合 の切断及び結合のような、種々の反応を触媒することができる核酸触媒を含むＬ −ヌクレオチドを発展させるために利用され得る。記載され概説されてきたイン ビトロ選択を実行するための多くの異なるアプローチ（Ｊｏｉｃｅ、１９８９， Ｇｅｎｅ，８２，８３〜８７；Ｂｅａｕｄｒｙ等、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，６３５〜６４１；Ｊｏｙｃｅ、１９９２，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍ ｅｒｉｃａｎ ２６７，９０〜９７；Ｂｒｅａｋｅｒ等、１９９４，ＴＩＢＴＥ ＣＨ １２，２６８；Ｂａｒｔｅｌ等、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１ ４ １１〜１４１８；Ｓｚｏｓｔａｋ、１９９３，ＴＩＢＳ １７，８９〜９３；Ｋ ｕｍａｒ等、１９９５，ＦＡＳＥＢＪ．，９，１１８３；Ｂｒｅａｋｅｒ、１９ ９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７，４４２；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ 等、１９９６，同上；Ｎｏｌｔｅ等、１９９６，同上；Ｋｌｕｂｍａｎｎ等、１ ９９６，同上；Ｂｒｅａｋｅｒ、１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，印刷中）のう ち任意の１つ及び他の関連アプローチは、核酸触媒を含むＬ−ヌクレオチドを発 展及び／又は選択するために利用され得るものであり、本発明の範囲内にある。 上記の例は非限定的であることを意味し、当業者は、本発明に記載したのと同 様な戦略が他のヌクレオシド類似体の合成に容易に適用でき、本発明の範囲内に あることを認知するだろう。応用例 構造式Ｉ〜Ｖの化合物、２’−Ｏ−メチル又は３’−Ｏ−メチルヌクレオシド を用いて、オリゴヌクレオチドフラグメントの細胞輸送、ヌクレアーゼ抵抗、細 胞移行及び局在化、化学的結合といった目的のために、種々のリガンドをオリゴ ヌクレオチドに付けることができる。構造式Ｉ〜Ｖの化合物の１つまたはそれ以 上をリボザイムに導入するとその効能が増す場合がある。構造式Ｉ〜Ｖの化合物 はまた潜在的な抗ウィルス薬として利用され得る。リボザイム工学 上記に示された技術及び当技術分野で知られている技術（Ｚａｕｇ等、１９８ ６，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９；Ｒｕｆｆｎｅｒ等、１９９０，Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．，２９，１０６９５；Ｂｅａｕｄｒｙ等、１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２９，６５３４；ＭｃＣａｌｌ等、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５７１０；Ｌｏｎｇ等、１９９４，同上；Ｈｅｎｄｒｙ 等、１９９４，ＢＢＡ １２１９，４０５：Ｂｅｎｓｅｌｅｒ等、１９９３，Ｊ ＡＣＳ，１１５，８４８３；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ ｄｓ Ｒｅｓ．，２４，４４０１；Ｍｉｃｈｅｌｓ等、１９９５，Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，３４，２９６５；Ｂｅｅｎ等、１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，１１ ８４３；Ｇｕｏ等、１９９５，ＥＭＢＯ．Ｊ．，１４，３６８；Ｐａｎ等、１９ ９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３３，９５６１；Ｃｅｃｈ、１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｏ ｐ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ．，２，６０５；Ｓｕｇｉｙａｍａ等、１９９６，ＦＥ ＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９２，２１５；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ等、１９９４，Ｂｉｏ ｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４，１７１５；すべてここにそのまま援用する） を用いて、別個の標的ＲＮＡ又はＤＮＡをトランスで切断し得るように、配列、 化学及び構造の異なる核酸触媒を工学処理することができる。診断薬的な使用 本発明のリボザイムは病的な細胞内部の遺伝的浮動及び突然変異を検査する又 は細胞内の特定ＲＮＡの存在を検出するための診断ツールとして利用することが できる。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との緊密な関連性によって、分子の 任意の領域にある、標的ＲＮＡの塩基対合及び三次元構造を変える突然変異が検 出できる。本発明に記載した多くのリボザイムを使用することによって、インビ トロばかりでなく細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能にとって重要なヌ クレオチド変化を位置付けられる可能性がある。リボザイムを用いた標的ＲＮＡ の切断は遺伝子発現を阻害し、特定の遺伝子産物の疾患進展における役割を（本 質的に）明確化するのに役立つかもしれない。このようにすれば、他の遺伝的標 的物が疾患の重要な仲介物として明確化されるかもしれない。このような実験は 、複合的な治療法（例、種々の遺伝子を標的にした複数のリボザイム、既知の低 分子阻害剤と組み合わせたリボザイム又はリボザイム及び／又は他の化学的又は 生物学的分子を複合させた間欠的な治療）の可能性を供することによって、疾患 進展に対するより良い治療につながるだろう。本発明のリボザイムの他のインビ トロ使用は当技術分野でよく知られていて、関連する病態の原因となるｍＲＮＡ の存在を検出することを含む。このようなＲＮＡは、標準的な方法を用いてリボ ザイムで処置した後の切断産物の存在を決定することによって、検出される。 ある特定の例では、標的ＲＮＡの野生型又は突然変異型のいずれかのみを切断 し得るリボザイムがアッセイに使われる。第一のリボザイムがサンプルに存在す る野生型ＲＮＡを同定するのに用いられると、第二のリボザイムはサンプルの突 然変異型ＲＮＡを同定するのに用いられる。反応対照（コントロール）として野 生型ＲＮＡ及び突然変異型ＲＮＡの合成基質を２つのリボザイムによって切断し 、反応におけるリボザイムの相対的な効率性と「非標的」ＲＮＡ種を切断しない こ とを実証する。合成基質由来の切断産物はまたサンプル集団における野生型及び 突然変異型ＲＮＡの分析のサイズマーカーとして役立つ。従って、各分析は、２ つのリボザイム、２つの基質及び１つの未知サンプルを必要とし、これらを６つ の反応に組み合わせる。切断産物の存在は、各ＲＮＡの全長又は切断フラグメン トが１レーンのポリアクリルアミドゲルで分析される、ＲＮａｓｅ保護アッセイ を用いて決定される。突然変異ＲＮＡの発現、及び標的細胞における所望の表現 型変化が起こる推定リスクを洞察するためには、必ずしも結果を定量化する必要 はない。この表現型の発生に意義がある蛋白質産物のｍＲＮＡが発現していれば 、リスクを立証するに十分である。比較可能な非活性を有するプローブを両方の 転写産物に用いれば、ＲＮＡレベルの定性的な比較に十分であり、初診のコスト を減らすことになろう。野生型に対する突然変異型の比率が高いことは、ＲＮＡ レベルを定性的又は定量的に比較しても、よりリスクが高いことに関連するので ある。 表１ 天然に存在するリボザイムの特徴 グループＩイントロン ・サイズ：約１５０〜１０００余りのヌクレオチド。 ・標的配列中の切断部位の５’側に隣接してＵを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：グアノシンの３’−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５ ’グアノシンを有する切断産物を生成する。 ・活性構造のフォルディング及び維持を助けるために、ある場合には、蛋白質の 補因子がさらに必要とされる［１］。 ・このクラスには３００以上の種類が知られている。テトラヒメナ・サーモフィ ラのｒＲＮＡ、真菌ミトコンドリア、葉緑体、ファージＴ４、らん藻類、その 他において、介在配列として見出されている。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較、突然変異原性及び生化学的研究によっ てほぼ確立されている［２，３］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが立証されている［４ ，５，６，７］。 ・リボザイムのフォルディング及び基質ドッキングに関する研究が進行中［８， ９，１０］。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている［１１，１２］。 ・このリボザイムは、結合部位が小さい（４〜６ヌクレオチド）ために標的ＲＮ Ａ切断に対して非特異的になる場合があるが、テトラヒメナのグループＩイン トロンは、「欠損」β−ガラクトシダーゼのメッセージに新しいβ−ガラクシ ダーゼ配列を結合することによってこのメッセージを修復するのに利用されて いる［１３］。 ＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（Ｍ１ＲＮＡ） ・サイズ：約２９０〜４００のヌクレオチド。 ・偏在するリボ核蛋白質酵素のＲＮＡ部分。 ・ｔＲＮＡ前駆体を切断し、成熟ｔＲＮＡを形成する［１４］。 ・反応メカニズム：恐らくはＭ²⁺−ＯＨによって攻撃し、３’−ＯＨ及び５’ リン酸を有する切断産物を生成する。 ・ＲＮａｓｅＰは原核生物及び真核生物全体に見出されている。このＲＮＡサブ ユニットは、細菌、酵母、げっ歯類及び霊長類から配列決定されている。 ・内因性ＲＮａｓｅＰを治療応用に活用することは、外部ガイド配列（ＥＧＳ） と標的ＲＮＡのハイブリダイゼーションによって可能である［１５，１６］。 ・リン酸と２’ＯＨとの接触の重要性が最近判明した［１７，１８］。 グループＩＩイントロン ・サイズ：１０００余りのヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［１９，２０］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：内部アデノシンの２’−ＯＨが３’−ＯＨ、及び３’−５’ 及び２’−５’分岐点（ｂｒａｎｃｈ ｐｏｉｎｔ）を含む「ラリアット（ｌ ａｒｉａｔ）」ＲＮＡを有する切断産物を生成する。 ・ＲＮＡの切断及び結合だけでなくＤＮＡ切断との関わりが実証された［２１， ２２］唯一の天然リボザイム。 ・主要な構造上の特徴は、系統発生比較によってほぼ確立されている［２３］。 ・２’ＯＨ接触の重要性が判明しはじめている［２４］。 ・力学的フレームワークは検討中である［２５］。 ニューロスポラ属ＶＳ ＲＮＡ ・サイズ：約１４４ヌクレオチド。 ・ヘアピン標的ＲＮＡのトランス切断であることが最近実証された［２６］。 ・配列要求性は完全には決定されていない。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨが切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’，３’ −サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する。 ・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていない。 ・このクラスは１種しか知られていない。ニューロスポラ属ＶＳ ＲＮＡに見出 されている。 ハンマーヘッド・リボザイム（本文を参照のこと） ・サイズ：約１３〜４０ヌクレオチド。 ・切断部位の５’に隣接した標的配列ＵＨを必要とする。 ・切断部位の両側で可変数のヌクレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスには１４種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する植物病 原体（ウィルソイド：ｖｉｒｕｓｏｉｄｓ）に見出されている。 ・２つの結晶構造を含め、本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている。 ・（インビトロ選択による工学的処理に対し）ごくわずかなライゲーション活性 が実証された。 ・２つ又はそれ以上のリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立さ れている。 ・重要な残基の化学修飾検討は十分確立されている。 ヘアピン・リボザイム ・サイズ：約５０ヌクレオチド。 ・切断部位の３’に隣接した標的配列ＧＵＣを必要とする。 ・切断部位の５’側で４〜６のヌクレオチドと、切断部位の３’側で可変数のヌ クレオチドと結合する。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスには３種が知られている。ＲＮＡを感染体として利用する３種の植 物病原体（タバコ・リングスポット・ウィルス，アラビス・モザイク・ウィル ス及びチコリー黄色斑ウィルスのサテライトＲＮＡ）に見出されている。 ・本質的な構造上の特徴がほぼ明確にされている［２７，２８，２９，３０］。 ・（切断活性に加えて）ライゲーション活性があるためにこのリボザイムはイン ビトロ選択による工学処理が可能である［３１］。 ・１つのリボザイムに対して完全な力学的フレームワークが確立されている［３ ２］。 ・重要な残基の化学修飾検討が着手された［３３，３４］。 デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム ・サイズ：約６０ヌクレオチド。 ・標的ＲＮＡのトランス切断であることが実証されている［３５］。 ・結合部位及び構造上の要求性は完全には決定されていないが、切断部位の５’ 側の配列は要求されない。折りたたまれたリボザイムはシュードノット構造を 含む［３６］。 ・反応メカニズム：２’−ＯＨによって切れやすい結合の５’側を攻撃し、２’ ，３’−サイクリックリン酸及び５’−ＯＨ末端を有する切断産物を生成する 。 ・このクラスは２種しか知られていない。ヒトＨＤＶに見出されている。 ・環状のＨＤＶは活性があり、ヌクレアーゼ安定性が増加している［３７］。 表２ ２．５μｍｏｌＲＮＡ合成サイクル ＊待ち時間には輸送間の接触時間を含めない。 他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/7076 Ａ６１Ｋ 31/7076 31/708 31/708 31/7115 31/7115 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 35/00 Ｃ０７Ｈ 19/048 Ｃ０７Ｈ 19/048 19/052 19/052 19/10 19/10 19/167 19/167 21/02 21/02 Ｃ０７Ｋ 14/08 Ｃ０７Ｋ 14/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/22 9/22 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０４２，４６４ (32)優先日 平成９年３月31日(1997．3．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｍ Ｘ (72)発明者 マチュリック−アダミック，ジェイセンカ アメリカ合衆国コロラド州80303，ボール ダー，サウス・フォーティセカンド・スト リート 760

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 核酸糖部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記糖の２ ’位は、式：２’−Ｏ−ＮＨＲ₁ ［式中、Ｒ₁は、Ｈ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステ リル基、リポ酸残基、レチノール酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコ チン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基 、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式 アリール、複素環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択される ］ を有することを特徴とするヌクレオシドまたはヌクレオチド。 ２． 核酸糖部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記糖の２ ’位は、式：２’−Ｏ−Ｎ＝Ｒ₃ ［式中、Ｒ₃は、ピリドキサール残基、ピリドキサール−５−ホスフェート残基 、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケ ニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール、および複素 環式アルキルアリールからなる群より選択される］ を有することを特徴とするヌクレオシドまたはヌクレオチド。 ３． 式ＩＩＩ： ［式中、Ｒ₁は、Ｈ、アミノアシル基、ペプチジル基、ビオチニル基、コレステ リル基、リポ酸残基、レチノール酸残基、葉酸残基、アスコルビン酸残基、ニコ チン酸残基、６−アミノペニシラン酸残基、７−アミノセファロスポラン酸残基 、 アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式ア リール、複素環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択され； Ｘは、独立して、ヌクレオチド塩基またはその類似体または水素であり； Ｙは、独立して、リン含有基であり；および Ｒ₂は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する、請求項１記載の化合物。 ４． 式ＩＶ： ［式中、Ｒ₃は、ピリドキサール残基、ピリドキサール−５−ホスフェート残基 、１３−シス−レチナール残基、９−シス−レチナール残基、アルキル、アルケ ニル、アルキニル、アルキルアリール、炭素環式アルキルアリール、および複素 環式アルキルアリールからなる群より選択され； Ｘは、独立して、ヌクレオチド塩基またはその類似体または水素であり； Ｙは、独立して、リン含有基であり；および Ｒ₂は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する、請求項２記載の化合物。 ５． 核酸塩基部分を含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、前記塩基 は、２−フルオロピリジン−３−イル、ピリジン−２−オン−３−イル；ピリジ ン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−３−イル、２−ブロモピリジン −５−イル、２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン−５−イル、 ２−アミノピリジン−５−イル、およびピリジン−２−（４−ニトロフェニルエ チル）−オン−５−イルからなる群より選択されることを特徴とするヌクレオシ ドまたはヌクレオチド。 ６． 式Ｉ： ［式中、 Ｒ₁は、独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｏ−Ｒ₃（式中、Ｒ₃は、独立して、アルキル、ア ルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素 環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択される部分である）； Ｃ−Ｒ₃（式中、Ｒ₃は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリー ル、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミドおよびエ ステルからなる群より選択される部分である）；ハロ；ＮＨＲ₄（Ｒ₄＝アルキル （Ｃ１−２２）、アシル（Ｃ１−２２）、置換されたまたは置換されていないア リール）；またはＯＣＨ₂ＳＣＨ₃（メチルチオメチル）であり； Ｘは、独立して、２−フルオロピリジン−３−イル、ピリジン−２−オン−３− イル；ピリジン−２−（４−ニトロフェニルエチル）−オン−３−イル、２−ブ ロモピリジン−５−イル、２−ブロモピリジン−５−イル、ピリジン−２−オン −５−イル、２−アミノピリジン−５−イル、およびピリジン−２−（４−ニト ロフェニルエチル）−オン−５−イルからなる群より選択されるヌクレオチド塩 基であり； Ｙは、独立して、リン含有基であり；および Ｒ₂は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する、請求項５記載の化合物。 ７． 式ＩＩ：［式中、 Ｒ₁は、独立して、Ｈ；ＯＨ；Ｏ−Ｒ₃（式中、Ｒ₃は、独立して、アルキル、ア ルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素 環式アリール、アミドおよびエステルからなる群より選択される部分である）； Ｃ−Ｒ₃（式中、Ｒ₃は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリー ル、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環式アリール、アミドおよびエ ステルからなる群より選択される化合物である）；ハロ；ＮＨＲ₄（Ｒ₄＝アルキ ル（Ｃ１−２２）、アシル（Ｃ１−２２）、置換されたまたは置換されていない アリール）；またはＯＣＨ₂ＳＣＨ₃（メチルチオメチル）であり； Ｘは、独立して、２−フルオロピリジン−３−イル、２−ブロモピリジン−５− イル、ピリジン−２−オン−５−イル、および２−アミノピリジン−５−イルか らなる群より選択されるヌクレオチド塩基であり； Ｙは、独立して、リン含有基であり；および Ｒ₂は、独立して、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する、請求項１記載の化合物。 ８． 前記化合物がヌクレオチドである、請求項１、２または５に記載の化合物 。 ９． 前記化合物がヌクレオチド三リン酸である、請求項１、２または５に記載 の化合物。 １０． １つまたはそれ以上の位置において請求項１、２または５に記載の化合 物を含むポリヌクレオチド。 １１． 前記ポリヌクレオチドが酵素的核酸である、請求項１０記載のポリヌク レオチド。 １２． 前記核酸がハンマーヘッドコンフィギュレーションのものである、請求 項１１記載の酵素的核酸。 １３． 前記核酸がヘアピンコンフィギュレーションのものである、請求項１１ 記載の酵素的核酸。 １４． 前記核酸が、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、ＶＳ ＲＮ Ａ、グループＩＩイントロンまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡコンフィギュレーショ ンのものである、請求項１１記載の酵素的核酸。 １５． 前記化合物が３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン である、請求項６記載の化合物。 １６． 前記化合物が３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンで ある、請求項６記載の化合物。 １７． 前記化合物が３−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４− ニトロフェニルエチル）−オンである、請求項６記載の化合物。 １８． 前記化合物が３−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−フルオロピリジン である、請求項６記載の化合物。 １９． 前記化合物が５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンで ある、請求項６記載の化合物。 ２０． 前記化合物が５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−ブロモピリジンで ある、請求項７記載の化合物。 ２１． 前記化合物が５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンで ある、請求項６記載の化合物。 ２２． 前記化合物が５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−オンで ある、請求項７記載の化合物。 ２３． 前記化合物が５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンで ある、請求項６記載の化合物。 ２４． 前記化合物が５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−ピリジン−２−（４− ニトロフェニルエチル）−オンである、請求項６記載の化合物。 ２５． 前記化合物が５−（α−Ｄ−リボフラノシル）−２−アミノピリジンで ある、請求項７記載の化合物。 ２６． 前記化合物が２’−Ｏ−アミノアデノシンである、請求項１記載の化合 物。 ２７． 前記化合物が２’−Ｏ−アミノグアノシンである、請求項１記載の化合 物。 ２８． 前記化合物が２’−Ｏ−アミノシチジンである、請求項１記載の化合物 。 ２９． 前記化合物が２’−Ｏ−アミノウリジンである、請求項１記載の化合物 。 ３０． 請求項１−７のいずれかに記載の化合物を含む哺乳動物細胞。 ３１． 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３０記載の哺乳動物細胞。 ３２． 請求項１０記載の化合物を含む哺乳動物細胞。 ３３． 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３２記載の哺乳動物細胞。 ３４． 請求項１０記載のポリヌクレオチドを製造する方法。 ３５． 請求項１０記載のポリヌクレオチドを用いて遺伝子発現を調節する方法 。 ３６． 請求項１−７のいずれかに記載の化合物を含む医薬組成物。 ３７． 請求項１０記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。 ３８． 前記化合物が抗ウイルス剤として用いられる、請求項１、２または５に 記載の化合物。 ３９． ２’−Ｏ−アミノヌクレオシドを合成する方法であって、 ３’および５’−保護アラビノヌクレオシドを、３’−および５’−保護２’− アラビノスルホニルヌクレオシドの形成に適した条件下でスルホニル化試薬と接 触させ； 有機強塩基の存在下で、３’−および５’−保護２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボ ヌクレオシドの形成に適した条件下で、前記２’−アラビノスルホニルヌクレオ シドからスルホニル基をＮ−ヒドロキシ−フタルイミドで置き換え； ２’−Ｏ−Ｎ−フタロイルリボヌクレオシドの形成に適した条件下で、フッ素含 有試薬を用いて前記フタロイルリボヌクレオシドを脱保護し；そして 前記２’−Ｏ−アミノヌクレオシドの形成に適した条件下で、前記２’−Ｏ−Ｎ −フタロイルリボヌクレオシドを、アルキルアミン、ヒドラジン；Ｎ−フェニル ヒドラジンおよびＮ−アルキルヒドラジンからなる群より選択される試薬と接触 させる、 の各工程を含む方法。 ４０． 前記スルホニル化試薬が無水トリフルオロメタンスルホン酸である、請 求項３９記載の方法。 ４１． 前記スルホニル化試薬が塩化トリフルオロメタンスルホン酸である、請 求項３９記載の方法。 ４２． 前記有機強塩基が、１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ− ７−エンである、請求項３９記載の方法。 ４３． 前記フッ素含有試薬が、フッ化テトラブチルアンモニウムおよび三フッ 化水素トリエチルアミンからなる群より選択される、請求項３９記載の方法。 ４４． 前記アルキルアミンが水性メチルアミンである、請求項３９記載の方法 。 ４５． 前記Ｎ−アルキルヒドラジンがＮ−メチルヒドラジンである、請求項３ ９記載の方法。 ４６． 少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒。 ４７． 前記Ｌ−ヌクレオチドが式Ｖ： ［式中、Ｘは、修飾されていても修飾されていなくてもよい核酸塩基またはＨで あり；Ｙはリン含有基であり；Ｒ₁は、Ｈ、ＯＨまたは他の２’一修飾であり； およびＲ₂は、ブロッキング基またはリン含有基である］ を有する、請求項４６記載の核酸触媒。 ４８． 前記核酸触媒がエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項４６記載の核 酸触媒。 ４９． 前記核酸触媒がペプチド結合を切断しうる、請求項４６記載の核酸触媒 。 ５０． 前記核酸触媒が別個の核酸分子を切断する、請求項４７記載の核酸触媒 。 ５１． 前記核酸触媒が別個の核酸分子をライゲートする、請求項４６記載の核 酸触媒。 ５２． 前記別個の核酸分子がリボ核酸分子である、請求項５０記載の核酸触媒 。 ５３． 前記核酸触媒がＬ−核酸触媒である、請求項４６記載の核酸触媒。 ５４． 前記触媒がハンマーヘッドリボザイムモチーフのものである、請求項４ ．８記載の核酸触媒。 ５５． 前記触媒がヘアピンリボザイムモチーフのものである、請求項４８記載 の核酸触媒。 ５６． 前記触媒が、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン、グループＩ Ｉイントロン、ＶＳ ＲＮＡまたはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡモチーフのものである 、請求項４８記載の核酸触媒。 ５７． 前記触媒が、同一であっても異なっていてもよい少なくとも２つの前記 Ｌ−ヌクレオチド置換を含む、請求項４６記載の核酸触媒。 ５８． 前記触媒が少なくとも１つのＤ−ヌクレオチド残基を含む、請求項４６ 記載の核酸触媒。 ５９． 前記触媒が前記別個の核酸分子に相補的な１２−１００塩基を含む、請 求項５０記載の核酸触媒。 ６０． 前記触媒が前記別個の核酸分子に相補的な１４−２４塩基を含む、請求 項５０記載の核酸触媒。 ６１． 前記Ｒ₁がＯＨである、請求項４７記載の核酸触媒。 ６２． 前記Ｒ₁がアミノである、請求項４７記載の核酸触媒。 ６３． 前記Ｒ₁がアルコキシである、請求項４７記載の核酸触媒。 ６４． 前記Ｘが、アデニン、グアニン、ウラシルおよびシトシンからなる群よ り選択される、請求項４７記載の核酸触媒。 ６５． 請求項４６記載の核酸触媒を含む哺乳動物細胞。 ６６． 前記細胞がヒト細胞である、請求項６５記載の細胞。 ６７． 請求項４６記載の核酸触媒を含む医薬組成物。 ６８． 哺乳動物細胞に少なくとも１つの請求項４６記載の核酸触媒を投与する ことにより、前記細胞において遺伝子の発現を調節する方法。 ６９． 別個の核酸分子を切断する方法であって、請求項４６記載の核酸触媒を 、前記別個の核酸分子の切断に適した条件下で前記別個の核酸分子と接触させる ことを含む方法。 ７０． 前記切断が、二価カチオンの存在下で実施される、請求項６９記載の方 法。 ７１． 前記二価カチオンがＭｇ²⁺である、請求項７０記載の方法 ７２． 前記核酸が化学的に合成される、請求項４６記載の核酸分子。 ７３． 前記Ｌ−ヌクレオチド置換が前記ハンマーヘッドリボザイムモチーフの ４位または７位にある、請求項５４記載のハンマーヘッドリボザイムモチーフ。 ７４． 前記Ｌ−ヌクレオチド置換が前記ハンマーヘッドリボザイムモチーフの ４位および７位にある、請求項５４記載のハンマーヘッドリボザイムモチーフ。 ７５． 前記Ｌ−ヌクレオチド置換が前記ハンマーヘッドリボザイムモチーフの ３’末端にある、請求項５４記載のハンマーヘッドリボザイムモチーフ。