JP2002520051A - 抗ウイルス剤としての核酸分子の使用 - Google Patents

抗ウイルス剤としての核酸分子の使用

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カオ，チェン・シー
ジーゲル，ロバート・ダヴリュー
ベロン，ローレント
ベイジェルマン，レオニド
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リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド
アドバンスト・リサーチ・アンド・テクノロジー・インスティテュート・インコーポレーテッド
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Abstract

(57)【要約】 ウイルスポリメラーゼに特異的に結合し，前記ウイルスポリメラーゼの活性を阻害しうる直線状一本鎖核酸分子。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 ウイルスは，感染の成功に必要な基本的プロセスの多くを感染した宿主に依存
する偏性寄生体である。ウイルスは宿主細胞の酵素的および合成的機能に依存す
るため，細胞プロセスに影響を与えずにウイルス感染を治療することは非常に困
難である。インフルエンザ，ＡＩＤＳ，および肝炎等のいくつかのウイルス疾患
が世界的に広まるならば，有効なウイルス特異的薬剤の設計は，ますます重要に
なってくる。
【０００２】 例えば，潜在的抗ウイルス剤をスクリーニングして，その薬剤が優先的にウイ
ルス過程を阻害しうるか否かを判定する。１つのそのような薬剤はアジドビルで
あり，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のリバーストランスクリプターゼは，宿
主細胞のポリメラーゼより容易にこれを利用する。しかし，アジドビルおよび他
のウイルス阻害剤は，一般に，徹底的かつ高価な薬剤スクリーニングプログラム
により発見された。
【０００３】 他の抗ウイルス治療，例えばインターフェロンは，細胞において顕著かつ広範
な変化を引き起こし，したがって，熱，吐気および他の苦痛などの多くの副作用
を導く。
【０００４】 ウイルスの病原性の基本となる過程であるウイルス核酸（ＲＮＡ／ＤＮＡ）の
複製には，蛋白質による核酸の特性の特異的認識が必要である。ＲＮＡ依存性Ｒ
ＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）は，ウイルスおよび細胞蛋白質から構成される複
合体であり，感染したＲＮＡテンプレートからウイルスＲＮＡの合成を指令する
。多くのウイルスＲｄＲｐ蛋白質が配列決定され，分析されている。しかし，Ｒ
ＮＡ合成を記述する総合的なメカニズムはない。したがって，ＲｄＲｐの一般的
知識は他のＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼより遙かに少ない。
【０００５】 核酸に基づく技術を用いてウイルス蛋白質の機能を阻害するためのいくつかの
方法が開発されている。多くのこのような方法は，Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，１
９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．６４，７６３−９７（その全体を
本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。例えば，アンチセン
ス分子およびリボザイムを用いて，ｍＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害することに
成功している。あるいは，蛋白質に直接結合し，このことによりその機能を低下
させるかまたは排除しうるオリゴヌクレオチドが見いだされている。
【０００６】 蛋白質に結合するオリゴヌクレオチドを発見する1つの方法は，インビトロ選
択として知られる方法を用いるものである。ＲＮＡ分子のランダムプールから，
アフィニティー選択サイクルにより，特定の蛋白質に結合しうる配列が同定され
る。例えば，Ｔｕｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，６９８８−６９９２は，ＨＩＶのリバーストラン
スクリプターゼに結合してｃＤＮＡ合成を阻害しうるリガンドを同定するための
選択方法の使用を記載する。他の核酸リガンド（アプタマー）もまた，高い親和
性で蛋白質に結合することが記載されている。しかし，これらのＲＮＡアプタマ
ーのすべては，複雑な二次および三次構造で高度に構造化されている。
【０００７】 すなわち，ウイルス複製を特異的に阻害する薬剤に対する継続的な要求がある
。
【０００８】発明の概要 本発明は，ウイルスポリメラーゼの特異的阻害剤として有用な核酸分子を提供
する。特に，本発明は，少なくとも４つのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを
提供し，ここで，オリゴヌクレオチドは，ウイルス開始ヌクレオチドを含むウイ
ルス核酸配列を含む。好ましくは，オリゴ−ヌクレオチドはウイルスプロモータ
ーおよび開始配列を含む。
【０００９】 好ましい態様においては，本発明は，ウイルスポリメラーゼに結合し，このこ
とによりポリメラーゼ活性を阻害することができる直鎖状一本鎖核酸分子を特徴
とし，その結果ウイルス複製が阻害される。これらの核酸分子は，好ましくは開
始配列，または例えば，ウイルスＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始に
必要な他の配列を含んでいてもよい。核酸分子は，好ましくは開始ヌクレオチド
およびウイルス配列中の開始ヌクレオチドの３’側の少なくとも最初の，より好
ましくは最初の２つのヌクレオチドを含む。
【００１０】 "核酸分子"とは，少なくとも１つのヌクレオチドから構成される高分子を意味
する。本発明の核酸分子は，ＤＮＡ，ＲＮＡまたはそれらの混合物でありうる。
好ましくは，核酸分子はＤＮＡからなる。より好ましくは，本発明の核酸分子は
，塩基，糖またはリン酸基に修飾を有するヌクレオチドを含む。また，本発明の
核酸分子は，好ましくは少なくとも約４から少なくとも約５０，より好ましくは
少なくとも約４０，さらに好ましくは少なくとも約２０から少なくとも約３５，
特に好ましくは４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，または１４
の連続するヌクレオチドを含み，核酸分子は好ましくはそれが由来する野生型ウ
イルス配列との同一性を有する。核酸分子はまた，任意に５'または３'末端にキ
ャップ構造を含んでいてもよい。
【００１１】 本明細書において用いる場合，"ヌクレオチド"とは，当該技術分野において認
識されているように，天然の塩基（標準的），および当該技術分野においてよく
知られる修飾塩基を含む。そのような塩基は，一般に糖部分の１’位に位置する
。ヌクレオチドは一般に，塩基，糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは，糖
，リン酸および／または塩基部分において修飾されていてもされていなくてもよ
い（また，ヌクレオチド類似体，修飾ヌクレオチド，非天然ヌクレオチド，非標
準ヌクレオチド等として，互換的に称される，例えば，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｍ
ｃＳｗｉｇｇｅｎ，（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ
９２／０７０６５；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９３／１５１８７
；Ｕｓｍａｎ＆Ｐｅｙｍａｎ（上掲）（すべて本明細書の一部としてここに引用
する）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例が
あり，最近その概要がまとめられている（Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ １９９
４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３）。核酸中に導入し
うる塩基修飾の非限定的な例としては，イノシン，プリン，ピリジン−４−オン
，ピリジン−２−オン，フェニル，シュードウラシル，２，４，６−トリメトキ
シベンゼン，３−メチルウラシル，ジヒドロウリジン，ナフチル，アミノフェニ
ル，５−アルキルシチジン（例えば，５−メチルシチジン），５−アルキルウリ
ジン（例えば，リボチミジン），５−ハロウリジン（例えば，５−ブロモウリジ
ン）または６−アザピリミジンまたは６−アルキルピリミジン（例えば６−メチ
ルウリジン），プロピンおよびその他のもの（Ｂｕｒｇｉｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０，Ｕｓｍａｎ＆Ｐｅｙｍ
ａｎ（上掲））が挙げられる。この観点において，"修飾塩基"とは，１’位に存
在する，アデニン，グアニン，シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基
，またはその同等物を意味する。そのような塩基は，酵素的核酸分子の触媒コア
中でおよび／または核酸分子の基質結合領域中で用いることができる。
【００１２】 "非修飾ヌクレオチド"とは，β−Ｄ−リボ−フラノースの１'炭素に結合した
，アデニン，シトシン，グアニン，チミン，ウラシルのいずれかの塩基を有する
ヌクレオチドを意味する。
【００１３】 "修飾ヌクレオチド"とは，非修飾ヌクレオチド塩基，糖および／またはリン酸
の化学構造中に修飾を含むヌクレオチドを意味する。
【００１４】 "キャップ構造"とは，オリゴヌクレオチドの末端に組み込まれた化学修飾を意
味する。これらの末端修飾は，核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し，
輸送および／または細胞中における局在化を助けることができる。
【００１５】 本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチド"とは，２またはそれ以上
のヌクレオチドを含む分子を意味する。
【００１６】 別の好ましい態様においては，本発明の核酸分子（１つまたは複数）を用いて
，またはこれを他の薬剤と組み合わせてまたは一緒に用いて，以下に記載される
疾患または状態を治療することができ，これらは抗ウイルス組成物を製造するの
に有用である。本発明の抗ウイルス組成物は，ウイルスポリメラーゼを生成する
のに宿主の細胞機構を使用することができるウイルスの感染または複製を阻害す
る方法において特に有用である。そのようなウイルスの非限定的例は，（＋）一
本鎖ＲＮＡウイルス，例えば細菌，植物および動物ウイルスを含むアルファウイ
ルス・スーパーファミリーである。本発明の核酸分子により阻害することができ
るウイルスの他の例としては，Ｃ型肝炎ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，Ａ型肝炎
ウイルス，ＨＩＶが挙げられるが，これらに限定されない。
【００１７】 また，少なくとも１つの本発明の核酸分子を用いる，ウイルス感染を阻害また
は治療する方法も提供される。該方法は，有効量の少なくとも１つの本発明の核
酸分子を，ウイルス感染を有するかまたは有すると疑われる細胞に投与すること
を含み，ここで，核酸分子はウイルスのための開始ヌクレオチドを含む。
【００１８】 "有効量"とは，細胞，組織または生物全体におけるウイルス負荷（ｌｏａｄ）
の減少を誘導するのに必要な核酸分子の最小量を意味する。
【００１９】 別の好ましい態様においては，核酸分子は，２'−Ｏ−アルキル（例えば２’
−Ｏ−アリル；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲））；２'−Ｏ−アルキル
チオアルキル（例えば２'−Ｏ−メチルチオメチル；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １６
，９５５−９５８）；Ｌ−ヌクレオチド（Ｔａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９７
０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４９９；Ａｓｈｌｅｙ，１９９２，Ｊ．Ａｍ
．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，９７３１；Ｋｌｕｂｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４，１１１２）；２’−Ｃ−アルキ
ル（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７０，２５７０２）；１−５−アンヒドロヘキシトール；２，６−ジアミノプ
リン（Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３，１３
８２４−１３８３５）；２'−（Ｎ−アラニル）アミノ−２'−デオキシヌクレオ
チド；２'−（Ｎ−ベータ−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'−（リシル
）アミノ；２'−Ｏ−アミノ（Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３９，１１３１）；２'−デオキシ−２'−
（Ｎ−ヒスチジル）アミノ；５−メチル（Ｓｔｒｏｂｅｌ，（上掲））；２'−
（Ｎ−ｂ−カルボキシアミジン−ベータ−アラニル）アミノ；２'−デオキシ−
２'−（Ｎ−ベータ−アラニル）（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ｅｔ ａｌ
．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５，２７２１−
２７２４）；キシロフラノシル（Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１
，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，７４，７４８；Ｓｅｅｌａ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，７７，８８３
；Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｅｍ．Ａｃ
ｔａ，７９，１４５１）を含む群より選択される修飾を含む。
【００２０】 さらに別の好ましい態様においては，５'キャップ構造は，反転無塩基残基，
４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌ
クレオチド，４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；１，５−アンヒ
ドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；
修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシル
ヌクレオチド；非環状３'，４'−セコヌクレオチド；非環状３，４−ジヒドロキ
シブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，３
'−３'−反転ヌクレオチド部分；３'−３'−反転無塩基部分；３'−２'−反転ヌ
クレオチド部分；３'−２'−反転無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェ
ート；３'−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホス
フェート；３'−ホスフェート；３'−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエー
ト；または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分（詳細は，Ｂｅｉｇｅｌ
ｍａｎ ｅｔ ａｌ．．国際公開ＷＯ９７／２６２７０（本明細書の一部として
ここに引用する）を参照）を含む群より選択される。
【００２１】 さらに別の好ましい態様においては，３'キャップ構造は，４'，５'−メチレ
ンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４'
−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５'−アミノ−アルキルホスフェ
ート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプロピルホス
フェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェ
ート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌク
レオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド
；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３'
，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５
−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５'−５'−反転ヌクレオチド部分；５'
−５'−反転無塩基部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチオエート
；１，４−ブタンジオールホスフェート；５'−アミノ；架橋および／または非
架橋５'−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジ
チオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５'−メルカプト部分
（詳細は，Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ ｌｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ ４９，１９２５（本明細書の一部としてここに引用する）を参照）を含
む群より選択される。
【００２２】 さらに別の好ましい態様においては，本発明の核酸分子を別の成分とコンジュ
ゲートする。そのような成分としては，無塩基ヌクレオチド，ポリエーテル，ポ
リアミン，ポリアミド，ペプチド，炭水化物，脂質，またはポリ炭化水素化合物
が挙げられるが，これらに限定されない。当業者は，これらの分子を，核酸分子
を含む１またはそれ以上の任意のヌクレオチドに，糖，塩基またはリン酸基のい
くつかの位置において連結しうることを認識するであろう。
【００２３】 本発明の別の観点においては，ウイルスポリメラーゼに結合する核酸分子は，
ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換
えベクターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。リ
ボザイム発現ウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデ
ノウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが，これ
らに限定されない。好ましくは，リボザイムを発現しうる組換えベクターは，上
述のように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過渡的発
現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは，必
要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されたら，核酸分子は
，ウイルスポリメラーゼに特異的に結合することができる。核酸分子を発現する
ベクターの輸送は，例えば静脈内または筋肉内投与により全身的に，または患者
から外植された標的細胞に投与した後，患者に再導入することにより，または所
望の標的細胞中への導入を可能とする他の任意の手段により，行うことができる
（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６
，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。本発明の別の観点においては，ウイルスＲ
ＮＡポリメラーゼに結合し，ウイルス複製を阻害する核酸分子は，ＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，またはウイルスベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。"患
者"とは，外植した細胞のドナーまたはレシピエントである生物，または細胞そ
れ自体を意味する。"患者"とはまた，酵素的核酸分子を投与することができる生
物を表す。好ましくは，患者は哺乳動物または哺乳動物細胞である。より好まし
くは，患者はヒトまたはヒト細胞である。
【００２４】 "ベクター"とは，所望の核酸を輸送するために用いられる任意の核酸系および
／またはウイルス系技術を意味する。
【００２５】 本発明は，ウイルス核酸合成の開始のための核酸配列のみを必要とするため，
他の既知の抗ウイルス剤よりも優れているであろう。すなわち，配列は容易に調
製することができ，分子生物学技術による複雑な操作を必要とせず，最小限のス
クリーニング計画のみが必要である。さらに，オリゴヌクレオチドを修飾して，
より低い濃度におけるその効力を増加させることができる。例えば，ヌクレオチ
ド類似体を含むように修飾するか，ＲＮＡについては環化して，インビボでより
安定であるようにして，血清中における分解に対する耐性を増加させることがで
きる。核酸分子の化学はまた，前記核酸分子の結合親和性が増加するように変更
することができる。これは，核酸分子の有効量を減少させるのに有効であろう。
さらに，すべてのウイルスが核酸合成の開始に必要な最小限の１つの配列を有す
るのであれば，すべてのウイルスについて少なくとも１つの治療を設計すること
ができる。さらに，これらの阻害剤を用いて，ＲＮＡ合成の開始と密接に関連し
ているかもしれないウイルス複製の他の段階，例えば，翻訳，蛋白質および核酸
の修飾を混乱させることもできる。
【００２６】 本発明の他の特徴および利点は，以下の好ましい態様の説明および特許請求の
範囲から明らかであろう。
【００２７】好ましい態様の説明 まず，図面を簡単に説明する。
【００２８】 図１は，ＢＭＶ ＲｄＲｐがＲＮＡまたはＤＮＡプロスクリプトからＲＮＡ合
成を正確に開始する能力を示す。（上）ウイルス（＋）鎖ＲＮＡ３の位置１２２
２−１２５２に相補的なプロスクリプト−２０／１３は，１３−ｎｔ生成物の合
成を指令するＷＴ ＢＭＶサブゲノムプロモーターを含み，ＷＴ対照として働く
。開始ヌクレオチドは矢印で示され，ＲｄＲｐ生成物の配列は上に示される。試
験した種々の構築物の概略図の一覧が示され，右側は，ＷＴ対照からの量と比較
したＲＮＡ合成の量を示す，対応するオートラジオグラフィー中のレーン番号で
ある。ＲＮＡ配列は太字の大文字で示され，ＤＮＡ配列は小文字で示される。Ｒ
ＮＡおよびＤＮＡ構築物の両方におけるヌクレオチド置換は各配列の下に示され
る。Δ−１ｇプロスクリプトは開始部位に対して位置−１の３'末端グアニル酸
を欠失している。（下）ＢＭＶ ＲｄＲｐ反応生成物のオートラジオグラフ。２
５ｎＭのプロスクリプト−２０／１３ＷＴからのＲＮＡ合成の量は，レーン１お
よび１０に示される。Ｔ７から生成した，ＲｄＲｐ生成物の予測される配列を含
むマーカーを用いて，実際に開始された１３−および１４−ｎｔ ＢＭＶ Ｒｄ
Ｒｐ生成物のサイズを決定した。１４−ｎｔ生成物はＲｄＲｐによる１−ｎｔの
非テンプレート付加によるものである。２５ｎＭのすべてのデオキシリボースプ
ロスクリプト，ｄ（−２０／１３）を用いる反応は，レーン２−９に示される。
プロスクリプトｄ（−２０／１３）からのＲＮＡ合成および正確な開始は，それ
ぞれレーン３−５およびレーン６−９のゲルの上に示した処理により確認した。
最後から２番目の開始部位を有する１２５ｎＭのＲＮＡまたはＤＮＡテンプレー
トからのＲｄＲｐ生成物の量はレーン１１−２１に示される。レーン１２−１４
および１９−２１の上に示した処理は，それぞれｒ（−ｌ／１３）およびｄ（−
ｌ／１３）からの開始の要求性を示す。レーン１６−１８の上に示した処理は，
ｄ（−ｌ／１３）からのＲＮＡ合成を確認する。レーン０はテンプレートを加え
ない対照反応の生成物を示し，Ｓｔｄレーンは，追加の処理をしていない生成物
を表す。
【００２９】 図２は，ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を促進するリボース部分を示す。（上）−
２０／１３ＷＴプロスクリプトの配列が示され，開始部位は矢印で示される。リ
ボースおよびデオキシリボース残基の両方を含むハイブリッドプロスクリプトの
配列は，下に示される。ＲＮＡ配列は，太字の大文字で表され，ＤＮＡ配列は小
文字で表される。開始部位に対して位置−１１に２'−ＯＨの置換を含むプロス
クリプトを構築して，この官能基がどのようにしてＢＭＶ ＲｄＲｐと相互作用
するかを判定した。右側には，下のオートラジオグラフ中で各プロスクリプトか
ら生成したＲｄＲｐ生成物を表すレーン番号が示される。（下）ハイブリッドプ
ロスクリプトからのＢＭＶ反応生成物のオートラジオグラフィー。２５ｎＭの各
プロスクリプトからのＲＮＡ合成の量がレーン１−１１に示され，各ハイブリッ
ドプロスクリプトの−２０／１３ＷＴプロスクリプトに対するパーセント活性が
ゲルの下に示されている。生成物のサイズは横に示される。レーン０はテンプレ
ートを加えない対照反応の生成物を表す。示される値は，少なくとも５回の独立
した実験の平均を表す。
【００３０】 図３は，ＲｄＲｐとの安定な相互作用におけるリボース２'−ＯＨの役割を示
す。（上）開始シチジル酸（矢印）からの１５−ｎｔ生成物の合成を指令する−
２０／１５ＷＴプロスクリプトの配列を示す。このＲＮＡ構築物の下に示される
ものは，全てＷＴサブゲノムプロモーター配列を含む種々の競合剤の配列である
。−２０／−１プロスクリプトは，開始部位に対して位置−２０から−１にＷＴ
サブゲノムプロモーターを含み，負の対照として働く。２５ｎＭの−２０／１５
プロスクリプトからの合成を５０％減少させるのに必要な競合剤の濃度（Ｉ50）
が右に示される。（下）ＲＮＡおよびＤＮＡサブゲノムプロモーターについての
Ｉ50値の決定。−２０／１５ＲＮＡプロスクリプトから生成した１５−ｎｔ生成
物の量を測定し，各競合剤の濃度の関数としてプロットした。競合剤の種類はグ
ラフの右に示される。データポイントは，３回の独立した実験の平均であり，標
準偏差が示される。
【００３１】 図４は，最小ＤＮＡプロスクリプトがインビトロでウイルスＲＮＡ合成を阻害
しうることを示す。（上）１５−ｎｔ生成物の合成を指令する−２０／１５ＷＴ
プロスクリプトの配列を示す。矢印は開始部位を示す。下に挙げられるのは連続
的な５'切断型を有する種々のＤＮＡ阻害剤の配列である。ＷＴ開始配列を含有
する各オリゴヌクレオチドは，ＢＭＶ ＲｄＲｐを指令してそれぞれ１３−，８
−，または６−ｎｔの生成物を合成することができる。ｄ（−１／１３）Ｒｅｖ
プロスクリプトは負の対照として働く。名前およびＩ50値は横に示される。（下
）ＤＮＡ阻害剤のＩ50値の決定。−２０／１５ＲＮＡプロスクリプトから生成さ
れた１５−ｎｔ生成物の量を，増加する量のＤＮＡテンプレートの存在下で測定
した。Ｉ50値は，２５ｎＭの−２０／１５プロスクリプトからの１５−ｎｔ生成
物を５０％減少させるのに必要な阻害剤の濃度として定量化した。阻害剤の種類
はグラフの右に示される。データポイントは，３回の独立した実験の平均であり
，偏差が示される。
【００３２】 図５は，ＲＮＡ合成の開始に必要なサブゲノムプロモーター中の機能的成分を
示す。（Ａ）ＢＭＶ ＲｄＲｐとの相互作用に必要な推定官能基。示される配列
は，１３−ｎｔ生成物の合成を指令し，ＷＴ対照として働く，ＷＴ ＢＭＶサブ
ゲノムプロモーターを含むプロスクリプト−２０／１３である。サブゲノム開始
部位は矢印で示され，ＲｄＲｐ生成物の配列は上に示される。先の変異研究（Ｓ
ｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．９４，１１２３８−１１２４３）によりＲｄＲｐと相互作用すると推定される
塩基部分は，ＲＮＡ合成に必須の４つのヌクレオチドの下に示される。（Ｂ）位
置−１７および−１１のグアニル酸残基の認識。アスタリスクを付したバンドは
，投入したテンプレートのターミナルトランスフェラーゼによる標識を表す。（
Ｃ）位置−１４のアデニル酸および位置−１３のシチジル酸の認識。各位置にお
ける特定の塩基，および位置−１７および−１１のグアニル酸の場合にはヌクレ
オシドの構造が示され，矢印は，種々の塩基類似体の挿入により媒介される官能
基の明確な変化を示す。括弧内の数字は，示される塩基類似体を含むプロスクリ
プトからのＲｄＲｐ反応生成物を含むオートラジオグラフにおけるレーンを示す
。レーンＷＴは，−２０／１３プロスクリプトにより指令される生成物を表し，
レーン０はテンプレートを加えない対照反応の生成物を表す。反応生成物は，変
性ＰＡＧＥにより分離し，オートラジオグラフィーにより可視化した。そのサイ
ズは横に示されている。支配的なＲｄＲｐ生成物は，ＲＮＡ生成物の３'末端に
おける１残基の非テンプレート付加による１４−ヌクレオチドであった（Ｓｉｅ
ｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。正確な開始は，記載されている酵素的操作
（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲））により確認し，Ｔ７により生成した
サイズマーカーと比較した。ゲルの下に記載される値は，各塩基類似体を含むプ
ロモーターからの活性をＷＴプロモーター配列からの活性と比較したパーセンテ
ージである。
【００３３】 図６は，ＲｄＲｐとの安定な相互作用に必要なテンプレート要求性を示す。（
Ａ）テンプレートの５’切断型を含むプロスクリプトの概略図。開始部位は矢印
で示される。＋１ｃ／ｇ変異を含むプロスクリプト（丸印）はＲＮＡ合成を指令
することができない。各構築物の名前およびＩ50値は横に示される。（Ｂ）Ｉ50 値の決定。１５−ｎｔ生成物の合成を指令する−２０／１５プロスクリプトから
の活性の量は，増加する量（１０倍モル過剰，２５０ｎＭまで）の競合テンプレ
ートの存在下で測定した。Ｉ50値は，２５ｎＭの−２０／１５プロスクリプトか
らの１５−ｎｔ生成物を５０％減少させるのに必要な競合剤の濃度として決定し
た。種々のプロスクリプト競合剤の種類はグラフの右側に示される。データポイ
ントは少なくとも３回の独立した実験の平均であり，標準偏差は誤差棒で示され
る。
【００３４】 図７は，サブゲノム開始部位の認識を示す。ＷＴ−２０／１３プロスクリプト
の配列を開始部位とともに示す。位置−１，＋１，および＋２に取り込まれた塩
基類似体の構造が挙げられており，種々のプロスクリプトの名前が左に示される
。塩基類似体を含むプロスクリプトからのＲｄＲｐ反応生成物を含むレーンは右
に示される。レーン０はテンプレートを加えない対照反応の生成物を表す。反応
生成物は，変性ＰＡＧＥにより分離し，オートラジオグラフィーにより可視化し
た。そのサイズが横に示される。ゲルの下に挙げられる値は，各塩基類似体を含
むプロモーターからの活性をＷＴプロモーター配列からの活性と比較したパーセ
ンテージである。
【００３５】 図８は，ＲＮＡ合成を開始するのに必要な，ＢＭＶ ＲｄＲｐとサブゲノムプ
ロモーター要素との間の相互作用のモデルを示す。必須ヌクレオチドはボックス
で囲まれており，ＲｄＲｐ中のアミノ残基残基と水素結合を形成するのに必要で
あると推定される重要な特性は上に示される。位置−１１の２'−ヒドロキシル
もまた，ＲＮＡ合成に寄与する。開始ヌクレオチドの認識は，ＲｄＲｐにより結
合されたｒＧＴＰプライマーにより行われるであろう。長円は，ＲｄＲｐ複合体
の低解像度の構造を示す。
【００３６】 図９は，ウイルス複製を阻害する核酸分子の概略図を示す。
【００３７】 図１０は，選択されたオリゴヌクレオチドのＩ50値である。
【００３８】 図１１は，ＤＮＡ阻害剤のＩ50値のグラフである。反応混合物は，２０ｍＭグ
ルタミン酸ナトリウム（ｐＨ８．２），４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１２．５ｍＭ Ｄ
ＴＴ，０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＭｎＣｌ
２，２００μＭ ＡＴＰおよびＵＴＰ，５００μＭ ＧＴＰ，および２５０ｎＭ
［α−３２Ｐ］ＣＴＰを含む４０μｌ容量中に，２５ｎＭの−２０／１５ＷＴテ
ンプレートＲＮＡを１０μｌＢＭＶ ＲｄＲｐとともに含む。ＤＮＡ阻害剤（１
０，５０，１００，２００および５００倍モル過剰で存在）を含有する反応から
のＲｄＲｐ生成物を定量し，その相対的活性を存在する阻害剤の量に対してプロ
ットした。Ｉ50値は，合成を対照反応の５０％に減少させるのに必要な阻害剤の
量を計算することにより決定した。
【００３９】核酸分子の合成 １００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は，自動化方法を用いては困難
であり，そのような分子の治療的コストは非常に高くなる。本発明においては，
小さい核酸モチーフ（例えば，アンチセンスオリゴヌクレオチド，ハンマーヘッ
ドまたはヘアピンリボザイム）が外的輸送に用いられる。これらの分子は構造が
簡単であるため，核酸がＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の
分子は化学的に合成した。オリゴデオキシリボヌクレオチドは，Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
２１１，３−１９（本明細書の一部としてここに引用する）により記載される
標準的プロトコルを用いて合成した。
【００４０】 ある種の酵素的核酸分子等の通常のＲＮＡについて用いられる合成の方法は，
Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９
，７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５４３３およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１
９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４に記
載される方法にしたがい，慣用の核酸保護基およびカップリング基，例えば，５
'末端にジメトキシトリチル，および３'−末端にホスホルアミダイトを用いた。
非限定的例においては，３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．合成機で，改変した２．５μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて，アルキ
ルシリル保護ヌクレオチドについては５分間のカップリング工程を，２'−Ｏ−
メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行い，小スケ
ールの合成を行った。表７は，合成サイクルにおいて用いた試薬の量および接触
時間の概要を示す。各カップリングサイクルにおいて，ポリマー結合５'−ヒド
ロキシルに対して６．５倍過剰（１６３μＬの０．１Ｍ＝１６．３μｍｏｌ）の
ホスホルアミダイトおよび２４倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（２３８μＬの
０．２５Ｍ＝５９．５μｍｏｌ）を用いた。３９４ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は，トリチル画分
の比色定量により決定して，９７．５−９９％であった。３９４ Ａｐｐｌｉｅ
ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器用の他のオリゴヌクレオチド合成試
薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中２％ＴＣＡ（ＡＢ
Ｉ）；キャッピングは，ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およ
びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２，６−ルチジン（ＡＢＩ）；酸化溶液は，
１６．９ｍＭ Ｉ2，４９ｍＭピリジン，ＴＨＦ中９％水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
）であった。Ｂ＆Ｊ合成等級アセトニトリルは，試薬瓶から直接用いた。Ｓ−エ
チルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は，Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体か
ら作成した。
【００４１】 ＲＮＡの脱保護は以下のように実施した。ポリマー結合オリゴリボヌクレオチ
ド（トリチルオフ）を合成カラムから４ｍＬガラスねじ蓋バイアルに移し，メチ
ルアミン（ＭＡ）の溶液中に６５℃で１０分間懸濁した。−２０℃に冷却した後
，上清をポリマー支持体から除去した。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣ
Ｎ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し，ボルテックスし，次に上清を最初の上清
に加えた。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して，白色粉末を
得た。
【００４２】 塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ・ＨＦ／ＮＭＰ溶液（２５０
μL溶液，１．５ｍＬ Ｎ−メチルピロリジノン，７５０μL ＴＥＡおよび１．
０ｍＬ ＴＥＡ・３ＨＦから１．４Ｍ ＨＦ濃度を得る）に再懸濁し，６５℃に
１．５時間加熱した。得られた完全に脱保護したオリゴマーを，５０ｍＭ ＴＥ
ＡＢ（９ｍＬ）で急冷し，次にアニオン交換脱塩に供した。
【００４３】 脱保護オリゴマーのアニオン交換脱塩のためには，５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０
ｍＬ）であらかじめ洗浄したＱｉａｇｅｎ５００（登録商標）アニオン交換カー
トリッジ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．）にＴＥＡＢ溶液を負荷した。負荷したカー
トリッジを５０ｍＭ ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）で洗浄した後，２Ｍ ＴＥＡＢ（１
０ｍＬ）でＲＮＡを溶出し，乾燥して白色粉末とした。
【００４４】 ＲＮＡは，ヌクレアーゼ耐性基，例えば，２'−アミノ，２'−Ｃ−アリル，２
'−フルオロ，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾で修飾して安
定性を増強することができる（総説として，Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇ
ｒｅｎ，１９９２ ＴＩＢＳ １７，３４；Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
４ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇ
ｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６，１４０９０を
参照）。
【００４５】 ＲＮＡは，一般的方法を用いてゲル電気泳動により精製するか，または高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，国際
公開ＷＯ９５／２３２２５を参照：これらのすべてを本明細書の一部としてここ
に引用する）により精製し，水に再懸濁した。
【００４６】 この研究に有用な化学的に合成されたＲＮＡの配列は図１−５に示される。当
業者は，これらの配列はさらに多くのそのような配列の例にすぎず，ヌクレオチ
ドの化学組成を変更してもよいことを認識するであろう。例えば，安定性を高め
るために，５'または３'末端に"キャップ"構造を付加してもよい。
【００４７】核酸分子の投与 核酸分子の輸送の方法は，Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎ
ｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，２，１３９；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔ
ｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５に記載されており，
これらの両方とも本明細書の一部としてここに引用する。Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９４／０２５９５はさらに，酵素的ＲＮＡ分子を輸送
するための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルを利用して，事実上い
かなる核酸分子をも輸送することができる。核酸分子は当業者に知られる種々の
方法によって細胞に投与することができ，これにはリポソームへの封入，イオン
トホレシス，または他のベヒクル，例えば，ヒドロゲル，シクロデキストリン，
生分解性ナノカプセル，および生体接着性小球体への組み込みが含まれるが，こ
れらに限定されない。ある適応症に対しては，核酸分子をエクスビボで，上記ビ
ヒクルを用いてまたは用いずに，細胞または組織に直接輸送することができる。
あるいは，核酸／ビヒクルの組み合わせを，直接注入により，またはカテーテル
，注入ポンプもしくはステントを用いることにより局所的に輸送する。他の輸送
経路には，静脈内，筋肉内，皮下または関節注射，エアロゾル吸入，経口（錠剤
またはピル形態），局所，全身，眼，腹腔内および／またはくも膜下腔内輸送が
含まれるが，これらに限定されない。核酸の輸送および投与のより詳細な説明は
Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）およびＤｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．
，ＰＣＴ ＷＯ９３／２３５６９に提供されており，これらを本明細書の一部と
してここに引用する。
【００４８】 本発明の分子は医薬として用いることができる。医薬は患者の疾病状態を予防
し，発症を阻害し，またはそれを治療する（症状をある程度，好ましくは全ての
症状を緩和する）。
【００４９】 本発明の負に荷電したポリヌクレオチド（例えば，ＲＮＡ，ＤＮＡまたは蛋白
質）は，医薬組成物を形成するために安定化剤，緩衝剤等を用いて，または用い
ることなく，任意の標準的手段により患者に投与および導入することができる。
リポソーム輸送メカニズムを用いることが望ましい場合，リポソームの形成のた
めの標準的プロトコルに従うことができる。本発明の組成物はまた，経口投与用
の錠剤，カプセルまたはエリキシル；直腸投与用の座剤；無菌溶液；注射投与用
の懸濁液等として，処方して用いることもできる。
【００５０】 本発明はまた，記載される化合物の薬学的に許容しうる処方を含む。これらの
処方には，上述の化合物の塩，例えば，酸付加塩（例えば，塩酸，シュウ酸，酢
酸およびベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【００５１】 医薬組成物または処方は，細胞または患者への投与（例えば全身投与），好ま
しくはヒトへの投与に適当な形態の組成物または処方を表す。適当な形態は，部
分的には，使用する投与経路（例えば経口，経皮，または注射）に依存する。そ
のような形態は，組成物または処方が標的細胞（すなわち，負に荷電したポリマ
ーが輸送されることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例
えば，血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は
当該技術分野において知られており，例えば，毒性，および組成物または処方が
その効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【００５２】 "全身投与"とは，インビボでの全身吸収，または血流中における薬剤の蓄積の
後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には，静
脈内，皮下，腹腔内，吸入，経口，肺内および筋肉内が含まれるが，これらに限
定されない。これらの投与経路のそれぞれは，所望の負に荷電したポリマー（例
えば核酸）をアクセス可能な疾病組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は，
分子量またはサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリ
ポソームまたは他の薬剤担体を使用することにより，薬剤を，例えば，あるタイ
プの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることができる。
薬剤と細胞（例えば白血球およびマクロファージ）の表面との会合を容易にする
ことができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は，マクロファージお
よび白血球による異常な細胞（例えば癌細胞）の免疫認識の特異性を利用するこ
とにより，薬剤の標的細胞への輸送を促進するであろう。
【００５３】 本発明はまた，ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾，または長期
間循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む，表面修飾リポソームを含
む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は，標的組織における薬剤の蓄積を
増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は，単核食細胞システム（ＭＰ
ＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗性であり，したがって
，封入された薬剤の血流循環時間を長くし，組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉ
ｃ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉ
ｓｈｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，
４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは，おそらくは脈管新生標
的組織における溢出および捕獲のため，腫瘍中に選択的に蓄積することが示され
ている（Ｌａｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５，２６７，１２
７５−１２７６；Ｏｋｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは，特に，
ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べ
て，ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態学および薬力学を増強する（Ｌｉｕ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；
Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，国
際公開ＷＯ９６／１０３９２；これらをすべて本明細書の一部としてここに引用
する）。長期間循環リポソームはまた，代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織（例えば肝
臓および脾臓）における蓄積を回避する能力に基づいて，カチオン性リポソーム
と比較して，ヌクレアーゼ分解から薬剤をより高い程度で保護するであろう。こ
れらの参考文献はすべて本明細書の一部としてここに引用する。
【００５４】 本発明はまた，薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容しうる担体また
は希釈剤中に含む，保存または投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用
いるための許容しうる担体または希釈剤は，医薬の技術分野においてよく知られ
ており，例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａ
ｒｏ編 １９８５）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている
。例えば，保存剤，安定剤，染料，および風味剤を用いることができる（同上，
１４４９）。これらには，安息香酸ナトリウム，ソルビン酸，およびｐ−ヒドロ
キシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに，抗酸化剤および懸濁剤を用いても
よい（同上）。
【００５５】 薬学的に有効な用量とは，疾病状態の予防，発症の阻害または治療（症状をあ
る程度緩和し，好ましくはすべての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学
的に有効な用量は，疾病の種類，用いる組成物，投与の経路，治療する哺乳動物
の種類，考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性，同時投与される薬剤，および
医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に，負に
荷電したポリマーの効力に依存して，０．１ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇ体重
／日の活性成分を投与する。
【００５６】核酸分子のベクターに基づく輸送 本発明の別の観点においては，標的分子を切断する核酸分子は，ＤＮＡまたは
ＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される（例えばＣｏｕｔｕ
ｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。組換えベク
ターは，好ましくはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。核酸分子
を発現するウイルスベクターは，アデノ関連ウイルス，レトロウイルス，アデノ
ウイルス，またはアルファウイルスに基づいて構築することができるが，これら
に限定されない。好ましくは，核酸分子を発現しうる組換えベクターは，上述の
ように輸送され，標的細胞中に残留する。あるいは，リボザイムの過渡的発現を
与えるウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは，必要に
応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば，核酸分子は標的
のウイルスポリメラーゼに結合する。核酸分子を発現するベクターの輸送は，全
身的（例えば，静脈内または筋肉内投与により），患者から外植された標的細胞
に投与した後，患者に再導入することにより，または所望の標的細胞中への導入
を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる（総説については，Ｃ
ｏｕｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【００５７】 本発明の１つの観点においては，本発明の核酸分子の少なくとも１つをコード
する核酸配列を含む発現ベクターが開示される。本発明の核酸分子をコードする
核酸配列は，その核酸分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結され
ている。
【００５８】 本発明の別の観点においては，発現ベクターは，転写開始領域（例えば真核生
物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核
生物ｐｏｌ Ｉ，ＩＩまたはＩＩＩの終止領域）；ｃ）本発明の核酸触媒の少な
くとも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現およ
び／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可
能なように連結されている。ベクターは，任意に，本発明の核酸分子をコードす
る遺伝子の５'側または３’側に動作可能なように連結された，蛋白質のための
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；および／またはイントロン（介在配
列）を含んでいてもよい。
【００５９】 核酸分子配列の転写は，真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ Ｉ），ＲＮ
ＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ），またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏ
ｌ ＩＩＩ）のプロモーターにより推進される。ｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ Ｉ
ＩＩプロモーターからの転写産物は，すべての細胞において高いレベルで発現さ
れるであろう。所定の細胞タイプ中における所定のｐｏｌ ＩＩプロモーターの
レベルは，近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー，サイレンサー等）の
性質に依存するであろう。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発
現される限り，原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅ
ｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎ
ｇ １９９３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２
；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，
２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。本発明の核酸分子は，ポリメラーゼを発
現する細胞においてのみ発現され，したがって，毒性を低下させることができる
ため，この戦略は好ましいであろう。
【００６０】 転写ユニット，例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ），転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およ
びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは，細胞中に
おいて高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばリボザイム）を生成するのに有用であ
る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓ
ｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，
１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂ
ｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許５，１６２４，８０３；Ｇｏｏｄ ｅｔ ａｌ
．，１９９７，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ ｅｔ
ａｌ．，国際公開ＷＯ９６１１８７３６；（これらのすべての刊行物を本明細書
の一部としてここに引用する））。上述のＲＮＡ転写ユニットは，哺乳動物細胞
中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとして
は，プラスミドＤＮＡベクター，ウイルスＤＮＡベクター（例えばアデノウイル
スまたはアデノ関連ウイルスベクター），またはウイルスＲＮＡベクター（例え
ばレトロウイルスまたはアルファウイルスベクター）が挙げられるが，これらに
限定されない（総説については，Ｃｏｕｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍ
ｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【００６１】 本発明のさらに別の観点は，本発明の核酸分子の少なくとも１つをコードする
核酸配列を，その核酸分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴と
する。１つの態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終
止領域；ｃ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺
伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始
領域および前記終止領域に動作可能なように連結されている。別の好ましい態様
においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オー
プンリーディングフレーム；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺
伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末端に
動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／
または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーディングフレ
ームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。さらに別の態様に
おいては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イント
ロン；ｄ）前記核酸分子の少なくとも１つをコードする遺伝子を含み；前記遺伝
子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領
域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている。別
の態様においては，発現ベクターは，ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ
）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；ｅ）前記核酸分子の少なく
とも１つをコードする遺伝子を含み，前記遺伝子は，前記オープンリーディング
フレームの３'−末端に動作可能なように連結されており，前記遺伝子は，前記
核酸分子の発現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イ
ントロン，前記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能な
ように連結されている。
【００６２】実施例 ブロムモザイクウイルス ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）は，（＋）鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ合成
の段階を明らかにするための有用なモデルである。ＢＭＶはＲＮＡ１，２，およ
び３と称される３つのゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡ４を有する。これら
のＲＮＡは４つの蛋白質：ヘリカーゼ様ｌａ（１０９ｋＤＡ），ポリメラーゼ様
２ａ（９６ｋＤａ），移動蛋白質３ａ（３４ｋＤａ），およびカプシド蛋白質（
２０ｋＤａ）をコードする。各ＢＭＶ ＲＮＡは，高度に保存された３'領域を
含み，これはｔＲＮＡ様構造に折り畳まれ，（−）鎖ＲＮＡの合成を指令するの
に必要である。（−）鎖ＲＮＡは，テンプレートとして働き，ゲノム（＋）鎖お
よびサブゲノムＲＮＡ合成のためのシス作用配列を提供する。
【００６３】 ＢＭＶ ＲＮＡ複製酵素は，小胞体に局在する複合体である。これは，ＢＭＶ
がコードする１ａおよび２ａ蛋白質およびまだ同定されていない宿主蛋白質を含
む。膜に会合したレプリカーゼは，非イオン性界面活性剤で可溶化することがで
き，これは依然として，外的に加えられたゲノムＲＮＡまたは（−）鎖ＢＭＶ
ＲＮＡ３からそれぞれ（−）鎖ＲＮＡまたはサブゲノム（＋）鎖ＲＮＡの合成を
指令する能力を維持している。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）と
称される，界面活性剤可溶化ＢＭＶレプリカーゼは，保存ｔＲＮＡ様配列を含む
１６０ヌクレオチド以下の（＋）鎖ＲＮＡを用いて，インビトロでＢＭＶ特異的
ＲＮＡ合成を指令することができる。
【００６４】 ＢＭＶは，正鎖ＲＮＡウイルスであり，正センスＲＮＡウイルスのアルファウ
イルス様スーパーファミリーにおいて，植物ウイルスのブロモウイルス群の代表
的なメンバーである。モノシストロニックであるＲＮＡ１およびＲＮＡ２は，そ
れぞれ蛋白質１ａ（推定メチルトランスフェラーゼおよびヘリカーゼドメインを
含有する）および２ａ（ポリメラーゼ様ドメインを含む）をコードする。細胞蛋
白質，例えばｅＩＦ３とともに，ｌａおよび２ａはテンプレート特異的ＢＭＶ
ＲｄＲｐを構成する。ジシストロニックであるＲＮＡ３は，３ａ移動蛋白質およ
びコート蛋白質をコードする。これらの蛋白質の翻訳は，サブゲノムＲＮＡ４（
０．８８ｋｂ）により指令される。サブゲノムＲＮＡ４の合成は，ＲＮＡ３の（
−）鎖コピーからの内部開始による。
【００６５】 ＢＭＶ ＲｄＲｐ複合体は，植物の膜内に一体化されるが，高濃度の塩および
非イオン性界面活性剤，例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００で可溶化することができ
る。ＢＭＶ ＲｄＲｐは高度に濃縮され，投入されたプラス鎖ＲＮＡテンプレー
トからマイナス鎖ＲＮＡを配列特異的様式で特異的に合成することができる。さ
らに，ＢＭＶ ＲｄＲｐはまた，ＲＮＡ３のマイナス鎖の内部に存在するグアニ
ル酸残基から開始して，サブゲノムのプラス鎖ＲＮＡ４を合成することができる
。マイナス鎖ＲＮＡの合成は，プラス鎖ＢＭＶ ＲＮＡの保存３'末端から開始
される。この保存領域は，ｔＲＮＡ様構造に折り畳まれることができる。ｔＲＮ
Ａにおける場合と同様に，末端の３残基は５'−ＣＣＡ−３'である。マイナス鎖
の合成の開始は，最後から２番目のシトシン残基から開始すると報告されており
，新たに合成されるＲＮＡの最初のヌクレオチドはグアニル酸になる。
【００６６】 ウイルスＲｄＲｐは，ＢＭＶプロモーター配列を含む外から加えられたテンプ
レートを用いることができるため，ＢＭＶ ＲＮＡ合成は生化学的研究により分
析することができる。投入された（＋）鎖テンプレートからの（−）鎖ＲＮＡの
合成の正確な開始はすでに示されている。（−）鎖ＲＮＡ合成におけるいくつか
の段階は明確にされており，これには，開始，プライマー誘導性ＲＮＡ合成，全
長ＲＮＡの１０倍モル過剰で蓄積される８ｎｔまでの早期（ａｂｏｒｔｉｖｅ）
開始生成物の合成（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６），およびＲｄＲｐの開始
から伸長への遷移（Ｓｕｎ＆Ｋａｏ，１９９７ａ，１９９７ｂ）が含まれる。こ
れに対し，サブゲノムＲＮＡ合成のメカニズムは注意深く研究されてこなかった
。（−）鎖ＲＮＡ３の短い領域を用いて，サブゲノムプロモーターのこれまでの
特徴決定をさらに詳細に調べ，ＲｄＲｐがいかにしてプロモーターを認識するか
を決定した（Ａｄｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９７）。以下に記載されるように，サブゲノム（＋）鎖ＲＮＡ合成（
開始および終止を含む）のメカニズムを識別し，（−）鎖合成と比較した。
【００６７】ポリメラーゼ活性の保存 いくつかの異なるポリメラーゼの構造は保存されているように見えるため，，
核酸合成のメカニズムもまた保存されていると示唆されていた。最もよく特徴づ
けられているポリメラーゼは，転写を担うＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｄ
ｄＲｐ）である。ＤＮＡ依存性ＲＮＡ合成は，多くの生化学的に別個の工程，す
なわち，ＤｄＲｐのプロモーターへの結合，転写的に活性なオープン複合体の形
成，最初のホスホジエステル結合の合成，早期ＲＮＡ合成，プロモータークリア
ランス，逐次伸長および終止に分けられている。これらの工程の進行には，ポリ
メラーゼとテンプレートとの間の相互作用の親和性の増加が伴い，ポリメラーゼ
のテンプレートへの関与（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）は，最初の移動工程の間また
はその直後に生ずる。関与したポリメラーゼは，伸長に必要な追加のヌクレオチ
ドが反応系中にない場合であっても，テンプレートと安定に会合したままである
と考えられている。
【００６８】 ウイルスＲＮＡ複製は，ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）により
媒介される。正センスＲＮＡウイルスについては，ゲノム（＋）鎖ＲＮＡが（−
）鎖ＲＮＡの合成のテンプレートとして働き，次に，ゲノム（＋）鎖ＲＮＡの，
そして多くのウイルスでは（＋）鎖サブゲノムＲＮＡの，追加のコピーの合成の
ためのテンプレートとして働く。
【００６９】 ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成の詳細の解明は，ＲＮＡ修復および組換えの研究の
基礎を提供し，ＤｄＲｐによるＲＮＡ合成の比較を可能とするであろう。ＢＭＶ
ＲｄＲｐによるインビトロＲＮＡ合成のこれまでの特徴決定からの結果は，い
くつかの段階を明らかにした。これには，（１）ＢＭＶ（＋）鎖テンプレートの
３'末端の最後から２番目のシチジル酸におけるＲＮＡ合成の開始（Ｍｉｌｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）；，３１Ｓ，６８
−７０；Ｋａｏ＆Ｓｕｎ，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｘ，６８２６−６８３
０），（２）早期オリゴリボヌクレオチド合成（Ｓｕｎ ｅｔ ａ１．，１９９
６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２９６，１−１２），および（３）逐次（ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｖｅ）ＲＮＡ合成（Ｓｕｎ＆Ｋａｏ．１９９７．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｉ，６
３−７３）が含まれる。ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成の工程は，早期開始生成物の
放出および８−１０ｎｔの裸のＲＮＡの合成後の伸長の進行を含む，ＤｄＲｐに
よる転写において認められるものを反映するように見える。このことは，すべて
のポリメラーゼの触媒的サブユニットが共通の構造的および機能的モチーフを有
しているため，おそらくは驚くべきことではない。
【００７０】 ＤｄＲｐおよびＲｄＲｐによるＲＮＡ合成における全体的類似性にもかかわら
ず，いくつかの相違に言及しなければならない。第１に，ＲｄＲｐは通常，Ｄｄ
Ｒｐにおけるように専らＤＮＡ分子中のプロモーターからＲＮＡ合成を開始する
のではなく，ＲＮＡテンプレートの末端から開始する（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７，５３７−５４６；Ｉｓｈｉｈ
ａｍａ ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，１９８８；Ｋａｏ ａｎｄ Ｓｕｎ，１９９６
，，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｘ，６８２６−６８３０）。第２に，ＲｄＲｐは，早期
開始段階の間，テンプレートから解離しているようである（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｋ
ａｏ，１９９７）。これに対し，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはより安定的にスーパ
ーコイルＤＮＡに結合したままである。ただし，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＤＮ
Ａとの相互作用の安定性は，テンプレートの構造に強く依存する（Ｄｉａｚ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５，１０８３７−１０８
４３）。第３に，ＤｄＲｐ三成分（ｔｅｒｎａｒｙ）複合体の安定性は，ＲＮＡ
−ＤＮＡ相互作用によってではなく，主としてＲＮＡ−蛋白質およびＤＮＡ−蛋
白質相互作用により維持される（Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９１，３７８４−３７８８）。
ＲｄＲｐに関しては，あるウイルスについては，（−）鎖ＲＮＡ合成の中間体は
発生期ＲＮＡおよびテンプレートＲＮＡから構成される二本鎖ハイブリッドであ
ることが可能である（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９６８；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６；Ｂｉｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２；ｄｅＧｒａａｆｆ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９５）。これが正しければ，デュープレックスはＲｄＲｐ三成
分複合体の安定性に寄与するかもしれない。
【００７１】 以下は，本発明の核酸分子の有用性を示す非限定的例である。当業者は，ある
実験条件，例えば温度，反応時間，培地条件，トランスフェクション試薬および
ＲＮＡアッセイは，限定を意味するものではなく，プロトコルを有意に変更する
ことなく容易に改変しうることを認識するであろう。
【００７２】実施例１：ＲｄＲｐの認識要素の同定および分析 正確なサブゲノム開始： ＢＭＶのサブゲノムコアプロモーター中に含まれる認識要素を決定するために
，３３ヌクレオチドのプロスクリプト（−２０／１３）を構築した。これは，（
−）鎖ＲＮＡ３中のサブゲノム開始部位の２０ヌクレオチド３’側のＷＴプロモ
ーター配列を含む。塩基類似体を含むプロスクリプトの化学合成は，ＡＢＩ ３
９４自動化ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で，Ｗｉｎ
ｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，８
，１４２１にしたがい，慣用的なホスホルアミダイト伸長サイクルを用いて行っ
た。水性メチルアミンおよびトリエチルアミン三フッ化水素酸で処理して，存在
する場合には環外のアミノおよび２'−ＯＨ保護基を切断した後，プロスクリプ
トを精製してアニオン交換ＨＰＬＣで分析した。
【００７３】 このプロスクリプトは，１３−ｎｔ生成物の合成を指令する。この最初の１１
ｎｔはＢＭＶ配列であり，その後にＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより２つのグアニ
ル酸を付加して，ＲｄＲｐ生成物を［α−３２Ｐ］ＣＴＰで標識できるようにし
た。プロスクリプト−２０／１３中のＢＭＶ配列は，ウイルス（＋）鎖ＲＮＡ３
の位置１，２２２−１，２５２に相補的であり，ＷＴ対照として働く。
【００７４】 プロモーター配列中に種々の変異を作成した。最初に，３ヌクレオチドの群ご
との変換体（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ）を合成して，プロモーター全体をスキ
ャンし，ＲＮＡ合成にどの領域が必要であるかを決定した。位置−１７から−９
は，プロモーターのこの領域中の変異によりＢＭＶ ＲｄＲｐがサブゲノムＲＮ
Ａの合成を開始する能力がＷＴの活性の約２％に低下したため，必須ヌクレオチ
ドを含むと同定された。ヌクレオチド位置−５から−３における変異はより低い
影響を有し，ＷＴの活性の１６％を保持していた。コアプロモーター中の他のす
べての位置をカバーする３ヌクレオチド変換体は，それぞれ合成を５０％低下さ
せたのみであった。すべてのテンプレートからの支配的なＲｄＲｐ生成物は，１
ヌクレオチドの非テンプレート付加による１４ｎｔであった。これは，すべての
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびポリオウイルスＲｄＲｐに共通する現象
である。
【００７５】 予測に反して，サブゲノム合成は，開始部位の−２から＋１のヌクレオチドの
置換によっては比較的影響を受けなかった。従来の研究は，サブゲノムＲＮＡ４
については，開始シチジル酸の同一性は維持されなければならないことを示して
いる。−２＋１プロスクリプト中の３ヌクレオチド変換体は，位置−１にシチジ
ル酸を配置しており，ＢＭＶ ＲｄＲｐは，非テンプレートグアニル酸（＋１位
置におけるテンプレートシチジル酸の代わりに）を利用することにより，または
＋１位置を完全にバイパスすることにより，ＷＴプロスクリプトと同じサイズの
生成物を指令するＲＮＡ合成の開始のために，このヌクレオチドを用いることが
できると考えられる。開始位置を動かすことができるか否かを試験するために，
２つの追加のプロスクリプトを作成した。プロスクリプト＋１Ｃ／Ｇは，開始シ
チジル酸がグアニル酸で特異的に置き換えられているが，他のすべての位置はＷ
Ｔ配列のままである。プロスクリプト−１／＋１Ｇは，グアニル酸を開始部位中
に挿入し，ＷＴの＋１シチジル酸を＋２位置に移動させる。このプロスクリプト
は，＋１位置に挿入されたグアニル酸がＢＭＶ ＲｄＲｐにより認識されれば，
１４ｎｔ生成物（非テンプレートを加えて１５ｎｔ）をコードする。しかし，開
始部位が現在＋２位置を占めるシチジル酸にシフトすることができれば，１３−
ｎｔ生成物（非テンプレートを加えて１４ｎｔ）が観察されるはずである。Ｒｄ
Ｒｐ生成物の正確な開始は，開始にのみ必要なＧＴＰを控えることにより，また
はグアニル酸の後を特異的に切断するＲＮａｓｅＴ１で処理することにより確認
することができる。すなわち，正しく開始されたＲｄＲｐ生成物は，ＲＮａｓｅ
Ｔｌ消化の後に１ｎｔ短くなるであろう。
【００７６】 プロスクリプト−２＋１，−１／＋１ＧおよびＷＴ−２０／１３からのＲｄＲ
ｐ生成物はすべて，ＧＴＰを欠失した反応およびＲＮａｓｅＴｌ処理により判定
して，ＧＴＰで始まっており，Ｔ７サイズマーカーと同じサイズ（１３および１
４ｎｔ）であった。しかし，＋１Ｇ／Ｇプロスクリプトからは生成物が合成され
なかった。すなわち，シチジル酸残基は，開始ヌクレオチドとして必要であり，
先の知見が確認された。ＢＭＶ ＲｄＲｐは，元の開始部位の３'または５'側に
隣接するいずれかの１つのヌクレオチドのシチジル酸を認識することができるよ
うである。すべての反応は正確な開始を示し，ＲｄＲｐサブゲノムコアプロモー
ターの相互作用の特性決定にこの系を使用することが有効であることが確認され
た。またこれらの実験により，１４−ｎｔ生成物を生成する非テンプレートヌク
レオチドの付加が（＋）鎖生成物のの３'末端で生じることが確認された。
【００７７】サブゲノムＲＮＡ合成の開始に重要なヌクレオチド： ３ヌクレオチド変換体からのデータは，位置−１７から−９がＲＮＡ合成に重
要なヌクレオチドを含むことを示した。重要な残基を同定するために，この領域
中の各位置およびサブゲノムコアプロモーターの位置−５から−３に１ヌクレオ
チドの変換を含むプロスクリプトを構築した。位置−１７，−１４，−１３，−
１１，−１０，および−５は，変換がＢＭＶ ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を顕著
に減少させたため，合成のために重要であった。最も重要な位置である−１７，
−１４，−１３，および−１１はすべてＷＴプロスクリプトの３％より低い活性
を有していた。位置−１０および−５における変化は影響がより低く，ＷＴ合成
の３１％から１８％を保持していた。負の対照として，位置＋１において変換を
含むプロスクリプト＋１Ｃ／Ｇからは合成が観察されなかった。
【００７８】 最も重要な位置である−１７，−１４，−１３，および−１１にすべての可能
なヌクレオチド置換を含むプロスクリプトをアッセイして，これらの４つの位置
の配列特異性を試験した。位置−１７におけるＷＴのグアニル酸のウリジル酸へ
の変更（−１７Ｇ／Ｕ）は，ＷＴ活性の１３％のＲＮＡ合成を支持した。−１７
の他のヌクレオチドによる置換（−１７Ｇ／Ｃおよび−１７Ｇ／Ａ）は，ＲＮＡ
合成を指令することができなかった。位置−１４または−１３においては，ＷＴ
配列以外のヌクレオチドは適当な活性を維持せず，このことから，−１４のアデ
ニル酸および−１３のシチジル酸の重要性が示された。位置−１１のＷＴグアニ
ル酸をウリジル酸またはアデニル酸に置換すると（−１１Ｇ／Ｕまたは−１１Ｇ
／Ａ）約８％の活性が維持されたが，元の−１１Ｇ／ＣプロスクリプトはＷＴプ
ロスクリプトの１％の活性しか有していなかった。上述の４つの位置の特異的要
求性をさらに示すため，位置−１０のＷＴグアニル酸をウリジル酸またはアデニ
ル酸で置換したところ，有害な影響はなかった。実際，これらの変異体−１０Ｇ
／Ｕおよび−１０Ｇ／Ａは，両方とも，ＷＴプロスクリプトよりわずかに優れた
プロモーターであり，−２０／１３の生成物の１４０％を生成した。これらの結
果は，ＢＭＶサブゲノムコアプロモーターの位置−１７，−１４，５−１３，お
よび１１におけるヌクレオチド特異性を示す。
【００７９】接触部位における１ヌクレオチド塩基の変更を用いる野生型プロスクリプトの競
合： ヌクレオチド特異性のこの概念を試験するために，競合実験を行って，プロス
クリプト−２０／１３，−１７Ｇ／Ｃ，および−１７Ｇ／Ｕが，１５ｎｔ生成物
の合成を指令するＷＴプロモーター配列を有する第２のプロスクリプト（−２０
／１５と称される）からの合成に影響を及ぼすか否かを判定した。競合テンプレ
ートの濃度を−２０／１５プロスクリプトの０．１−から１０倍モル過剰まで変
化させた。競合は，１５−ｎｔ生成物の量の減少および同時に１３−ｎｔ生成物
の増加により可視化した。予測されたように，プロスクリプト−２０／１３は，
ＷＴサブゲノムプロモーターをも含むため，有効に合成に競合した。−２０／１
３が等モル量で存在したとき，−２０／１５からの合成は５０％減少した。これ
に対し，プロスクリプト−１７Ｇ／Ｃは，有効な競合剤ではなく，等モル比で存
在したとき−２０／１５からの合成を１５％のみ減少させた。−１７Ｇ／Ｕプロ
スクリプトは，−２０／１５からの合成を−２０／１３で観察されたものより低
いレベル（３５％）で阻害した。この阻害のレベルは，この変異テンプレートか
らの合成が減少したが完全にはなくならなかったという結果と一致する。この実
験からの結果は，位置−１７，およびおそらくは変異導入により同定された他の
鍵となるヌクレオチドが，ＢＭＶ ＲｄＲｐにより接触されるという概念と一致
する。
【００８０】 アルファウイルスサブゲノムプロモーター：ＢＭＶサブゲノムプロモーターと
植物および動物の両方に感染するアルファウイルス様スーパーファミリーの他の
メンバーのサブゲノムプロモーターの比較から，ＢＭＶ ＲｄＲｐによる合成に
重要な４つのヌクレオチドが著しく保存されていることが明らかになった。さら
に，これらのプロモーターはすべて，開始ヌクレオチドとしてピリミジンを含み
（動物ウイルスにおいてはウリジル酸，および植物ウイルスにおいてはシチジル
酸またはウリジル酸のいずれか），＋２位置に高度に保存されたアデニル酸を含
む。この類似性は，アルファウイルス様スーパーファミリーのメンバーからのＲ
ｄＲｐが保存されたメカニズムでサブゲノムプロモーターを認識することを意味
する（例えば表１−３を参照）。
【００８１】 テンプレート認識の様式が保存されている可能性を試験するために，ＳＦＶか
らのサブゲノムプロモーターを含むプロスクリプトを構築し，これがＢＭＶ Ｒ
ｄＲｐにより認識される能力について試験した。ＢＭＶプロスクリプトから生成
した１３−ｎｔ生成物からＲＮＡ生成物を可視的に区別できるようにするため，
ＳＦＶプロスクリプトは１１−ｎｔ生成物の合成を指令するよう設計した。この
最初の９ｎｔはＷＴＳＦＶ配列であり，その後に，［α−３２Ｐ］ＣＴＰにより
ＲｄＲｐ生成物を標識できるようにするためにＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより２
つのグアニル酸を付加した。ＳＦＶプロスクリプトは，ＢＭＶ ＲｄＲｐがこの
テンプレートからのサブゲノム合成の開始ヌクレオチドとしてのみ用いられるＡ
ＴＰに依存する生成物を合成するよう指令する。合成の量は等モル量のＷＴ−２
０／１３からの合成のわずか０．２５％であったが，バックグラウンドより有意
に高かった。この結果は，植物感染ウイルスからのＲｄＲｐと動物感染ウイルス
からのサブゲノムプロモーターを含むＲＮＡテンプレートとの間に異種相互作用
があることを示す。
【００８２】実施例２：サブゲノムＲＮＡ合成のための配列要求性 ＲｄＲｐ活性アッセイ： ＢＭＶ ＲｄＲｐは，本質的にＳｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）に記載され
るように，感染した大麦から調製した。早期開始の研究において用いられたＲｄ
Ｒｐ調製物は，追加のＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ゲル濾過カラムを通して
，ＮＴＰおよび他の低分子量夾雑物を除去した。標準的ＲｄＲｐ活性アッセイは
，２０ｍＭグルタミン酸ナトリウム（ｐＨ８．２），４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１２
ｍＭジチオスレイトール，０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ
ＭｎＣｌ２，２００μＭ ＡＴＰ，５００μＭ ＧＴＰ，２００μＭ ＵＴＰ
，２４２ｎＭ［α−３２Ｐ］ＣＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，１０ｍＣｉ／ｍＬ
，Ａｍｅｒｓｈａｍ），等モル（一般に１．０ｐｍｏｌ）のテンプレートＲＮＡ
，および５−１０μｌＲｄＲｐを含む４３μＬの反応系から構成された。反応系
は，特に記載しない限り，３０℃で９０分間インキュベートした。反応生成物は
，標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）にしたが
って，フェノール／クロロホルム（１：１，ｖ／ｖ）で抽出し，３倍容量のエタ
ノールおよび１０μｇグリコゲンで沈殿させた。
【００８３】ＲｄＲｐ生成物の分析： ＲｄＲｐ反応からの生成物を１Ｘ変性負荷緩衝液（４５％（ｖ／ｖ）脱イオン
化ホルムアミド，１．５％（ｖ／ｖ）グリセロール，０．０４％（ｗ／ｖ）ブロ
モフェノールブルーおよび０．０４％（ｗ／ｖ）キシレンシアノール）に懸濁し
，９０℃で３分間加熱することにより変性し，次に変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分析した。生成物は，２０％または２４％アクリルアミド（１９
：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）−７Ｍ尿素ゲル（１４ｘ１４ｘ０
．０５ｃｍ）で，公表されている方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９
８９）にしたがって分析した。場合により，５％アクリルアミドスタッキングゲ
ル（２ｘ１４ｘ０．０５ｃｍ）を用いた。１９８ｎｔまたはそれより長い生成物
の合成を指令するテンプレートを含む反応からの生成物を，２．５ユニットのＳ
１ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３０℃で１０分間消化した。変性負荷緩衝
液をＳ１処理生成物に加えた後，５％アクリルアミドゲルで変性ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析し，一方，非変性負荷緩衝液（５％（ｖ／ｖ）グリ
セロール，０．０４％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー，０．０４％（ｗ／ｖ
キシレンシアノール）をＳ１処理生成物に加えた後，１％アガロースゲルで非変
性電気泳動により分析した。すべてのゲルは，−８０℃でフィルムを感光させ，
新たに合成されたＲＮＡに取り込まれた標識の量をホスファーイメージャー（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により決定した。
【００８４】ＲｄＲｐのテンプレートの合成： ＰＣＲを用いて，サブゲノムプロモーターを包含する（−）鎖ＢＭＶ ＲＮＡ
３または（−）鎖プロモーターを包含する（＋）鎖ＢＭＶ ＲＮＡ３もしくはＲ
ＮＡＩのいずれかのｃＤＮＡコピーを合成した。一方はＴ７プロモーターを含む
合成オリゴヌクレオチドの対を，それぞれＢＨＶ ＲＮＡ３（ｐＢ３ＴＰ８）ま
たはＲＮＡ１（ｐＢｌＴＰ３）のｃＤＮＡクローンを用いるＰＣＲ反応において
用いた（Ｊａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。３０サイクルのＰＣＲを用い
てＴａｑポリメラーゼで増幅し，各サイクルは，各３０秒の９４℃での変性，最
低のオリゴヌクレオチドＴｍより５℃低い温度でのアニーリングおよび７２℃で
の伸長から構成された。ＰＣＲ生成物は，上述したように精製し（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９），インビトロ転写のテンプレートとして用いた
。Ｔ７ ＤｄＲｐをすべての転写反応に用いた（Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ，Ｅｐ
ｉｃｅｎｔｒｅ）（表４）。Ｂ３−１９８テンプレートの合成は先に記載されて
いる（Ｓｕｎ＆Ｋａｏ，１９９７ａ）。８−および１３−ｎｔの分子量マーカー
は，Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）のプロトコルにより，オリゴ
ヌクレオチドＴ７（＋）およびＴ７（−）８ｍｅｒまたはＴ７（−）１３ｍｅｒ
を用いて合成した（表４）。全長（−）鎖および（＋）鎖ＲＮＡ３の転写産物は
，ＲＮＡ３のｃＤＮＡを含むプラスミドから合成した。５'末端における２５０
ｎｔの伸長を有する（−）鎖ＲＮＡ３および５'末端における１５０ｎｔの伸長
を有する（＋）鎖ＲＮＡ３の転写産物は，それぞれＴ７プロモーターの２５０ま
たは１５０ｎｔ下流に位置したＲＮＡ３のｃＤＮＡを含むプラスミドから合成し
た。
【００８５】 転写産物は，ＲｄＲｐアッセイの前に，Ｑｉａｇｅｎ ｔｉｐ−２０カラムで
，製造元のプロトコルを用いてアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した
。すべてのＲｄＲｐテンプレートは，５'末端に，ｃＤＮＡテンプレート上での
Ｔ７ポリメラーゼ転写の開始の間に取り込まれた２つの非ウイルス性グアニル酸
を含む。ＲｄＲｐテンプレーの濃度は，トルイジンブルー染色の後，変性ＰＡＧ
Ｅにより，および／または先に記載されたように（Ａｄｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．
，１９９７）分光高度計を用いて，決定した。
【００８６】開始シチジル酸のフランキング変異： 開始シチジル酸のグアニル酸への変換が，プロスクリプトがＲＮＡ合成を指令
する能力をなくすことが先に示されている（Ａｄｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９
９７；Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。しかし，ＢＭＶ ＲｄＲｐは
，ウリジル酸を第１のテンプレートヌクレオチドとして用いて，効率的に合成を
開始することができない（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。近傍ヌク
レオチドの役割を調べるため，＋２位置にすべての可能なヌクレオチド置換を含
むプロスクリプトをアッセイして，この位置についての要求性を決定した。＋２
アデニル酸のグアニル酸への変異は，プロスクリプトがＲＮＡ合成を指令する能
力をなくしたが，シチジル酸またはウリジル酸への変更は，それぞれ野生型レベ
ルの３７％または６６％のＲＮＡ合成を指令した。すなわち，＋２に要求される
塩基成分については推定することができないが，サブゲノムＲＮＡ合成には＋２
位置のアデニル酸が好ましい。次に，ＢＭＶサブゲノムＲＮＡ合成についての＋
３および＋４位置のヌクレオチド要求性を評価した。＋３ウリジル酸のシチジル
酸またはグアニル酸への変異は，テンプレートがＲＮＡ合成を指令する能力を，
それぞれ野生型レベルの６４％または５８％に減少させた。＋４アデニル酸のシ
チジル酸への変異は，ＲＮＡ合成を指令する能力に悪影響を与えなかった。＋４
アデニル酸のグアニル酸への変異は，テンプレートがＲＮＡ合成を指令する能力
を野生型レベルの５７％に減少させた。すなわち，ＲＮＡ合成に及ぼすテンプレ
ート配列の影響は，開始ヌクレオチドからの距離が増加するにつれて減少するよ
うである。
【００８７】 −１位置におけるヌクレオチド変更の影響もまた測定した。−１グアニル酸の
アデニル酸への変異は，活性を野生型プロスクリプトの８２％に減少させたのに
対し，ウリジル酸への変更は，影響を与えなかった。このことは，−１ヌクレオ
チドの種類はサブゲノムＲＮＡ合成の効率に影響を与えないことを示唆する。非
常に興味深いことに，−１変異を含むプロスクリプトにおいて，真正の開始部位
からの量の５％未満ではあったが，別の開始部位からのＲｄＲｐ生成物の合成が
観察された。プロスクリプト−１Ｇ／Ｕからの新規な１５ｎｔ ＲｄＲｐ生成物
は，見かけ上，テンプレートウリジル酸を用いて−１位置で開始された。プロス
クリプト−１Ｇ／Ａからの新規な１６ｎｔ ＲｄＲｐ生成物は，見かけ上−２シ
チジル酸で開始された。プロスクリプト−１Ｇ／Ａにおいては，−２および−１
ｎｔはシチジル酸−アデニル酸であり，この配列はまた＋１および＋２位置にも
見いだされる。これらの結果は，ＲｄＲｐによる開始部位の認識にはある程度の
柔軟性があることを示す。
【００８８】（−）鎖合成における＋２ｎｔのゆるやかな要求性： （−）鎖合成のプロモーター中の＋２ｎｔが同様の優先性を有するか否かを調
べるために，２つのテンプレートを用いた（Ｂ１−２４２＋２Ｃ／ＡおよびＢ１
−２４２＋２Ｃ／Ｕ）。各テンプレートは，＋２シチジル酸のアデニル酸または
ウリジル酸への変更を含む２４２ｎｔ（−）鎖ＲＮＡ１生成物の合成を指令した
。Ｂ１−２４２＋２Ｃ／ＡまたはＢ１−２４２＋２Ｃ／Ｕからの合成を，同じモ
ル濃度で同じ反応系中に存在する，１９８ｎｔ（−）鎖ＲＮＡ３生成物の合成を
指令する第２のテンプレート（Ｂ３−１９８）からの合成と比較した。＋２シチ
ジル酸のウリジル酸への変更は，合成を３１％に減少させた（先にＳｕｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９６により観察されたものと類似）が，アデニル酸への変更は合
成を野生型Ｂｌ−２４２およびＢ３−１９８の１５７％に増加させた。この結果
は，（−）鎖合成に関して＋２ｎｔの種類はサブゲノム合成についての場合ほど
重要ではないことを示唆する。
【００８９】サブゲノムＲＮＡ合成についての高ＵＴＰ濃度の要求性： （−）鎖ＲＮＡ合成の間に高いＧＴＰ濃度の要求性があることが先に観察され
ている（Ｋａｏ＆Ｓｕｎ，１９９６）。＋２アデニル酸についての優先性（上述
）および放射性標識として通常の［α−３２Ｐ］ＣＴＰではなく［α−３２Ｐ］
ＵＴＰを用いたときのインビトロでのサブゲノムＲＮＡの非効率的な合成は，サ
ブゲノムＲＮＡ合成の間に取り込まれる２番目のヌクレオチド（ＵＴＰ）もまた
特異的要求性を有するかもしれないことを示唆した。この可能性を調べるために
，サブゲノムおよび（−）鎖ＲＮＡ合成におけるＵＴＰ要求性を，ｕｐ／４５（
２０７ｎｔサブゲノムＲＮＡの合成を指令する）およびＢ３−１９８を用いて比
較した。いずれのＲＮＡも，５０μＭ ＵＴＰを含む反応系中に別々に存在した
とき，ＢＭＶ ＲｄＲｐにより用いられた。さらに，５０μＭ ＵＴＰを含む反
応系中の２つのＲＮＡの等モル混合物から，いずれかのＲＮＡを単独で含む反応
と非常に類似する量の生成物が得られ（図２，レーン４），このことは，ＢＭＶ
ＲｄＲｐによるプロモーター使用がほぼ等しいことを示す。ＵＴＰ濃度を１．
６μＭに減少させると，いずれのテンプレートからの合成も減少したが，その量
は異なっていた。３回の独立した実験において，サブゲノムＲＮＡ合成は，再現
性をもって，（−）鎖合成より４−１０倍減少していた。示される実験において
は，（−）鎖合成は５０μＭ ＵＴＰで観察されたレベルの１３％に減少したが
，サブゲノム合成は検出できないレベルまで減少した。これらの結果は，サブゲ
ノムＲＮＡ合成のためのテンプレートにおける＋２アデニル酸の優先性のさらな
る証拠を提供し，サブゲノムＲＮＡにおけるホスホジエステル結合の合成には高
濃度のＧＴＰおよびＵＴＰの両方が必要であることを示唆する。
【００９０】サブゲノムおよび（−）鎖ゲノムＲＮＡ合成の間の異なるプライマー使用： サブゲノムおよび（−）鎖合成における＋２ｎｔの役割の相違を調べるために
，これらの２つのタイプのＲＮＡ合成における開始ヌクレオチドの使用を比較し
た。サブゲノムおよび（−）鎖ＲＮＡ合成の両方にＧＴＰが用いられるため，両
方のタイプの合成に及ぼすＧＴＰ濃度の影響を分析した。サブゲノムおよび（−
）鎖ＲＮＡ合成においては相違は認められず，各々，２５μＭで最初に検出され
，２００μＭ ＧＴＰまで連続して増加した。次に，モノヌクレオチドまたはジ
ヌクレオチドプライマーが開始ヌクレオチドとしてＧＴＰを置き換える能力を調
べた。プライマーが高濃度のＧＴＰの必要性を軽減することが先に示されている
（Ｋａｏ＆Ｓｕｎ，１９９６）。プライマーＧｐＵは，サブゲノムＲＮＡ合成の
開始配列に相補的であり，ＧｐＧは（−）鎖ＲＮＡ合成の開始配列に相補的であ
る。ＧＤＰは，サブゲノムおよび（−）鎖ＲＮＡ合成の両方のプライマーとして
働くと予測される。
【００９１】 対照反応には，サブゲノム（ｕｐ／４５）およびゲノム（−）鎖（Ｂ３−１９
８）合成のために２００μＭ ＧＴＰおよびテンプレートの等モル混合物を加え
，ほぼ等モル量のサブゲノムおよび（−）鎖生成物が合成された。ＧＴＰを４μ
Ｍに減少させたとき，サブゲノムおよび（−）鎖生成物の両方の合成は，２００
μＭ ＧＴＰで観察されたものの１．５％に減少した。ＧｐＧを最終濃度２５０
−１２５０μＭで反応に加えると，（−）鎖合成は基底レベルの７−１０倍促進
されたが，サブゲノムＲＮＡ合成は変化しなかった。ＧｐＵを同じ濃度で反応に
加えると，サブゲノム合成は基底レベルの約３倍促進されたが，（−）鎖合成は
変化しなかった。（−）鎖ＲＮＡ合成と比較してサブゲノムの促進が低いことは
，先の知見と一致する（Ｋａｏ＆Ｓｕｎ，１９９６）。サブゲノム生成物は，Ｇ
ｐＵでプライミングしたとき，再現性よくより低い位置に移動した。これはおそ
らく，ジヌクレオチドでプライミングした生成物に５'リン酸が欠失しているた
めであろう。ＧＤＰを２５０−１２５０μＭで反応に加えると，サブゲノムＲＮ
Ａの合成は１．２−３．４倍促進され，（−）鎖の合成は９．４−１９倍促進さ
れた。ＡＤＰを２５０−１０００μＭで加えたところ，（−）鎖合成は１０００
μＭレベルで１．７倍促進されたが，サブゲノム合成についてはいずれのレベル
でも検出可能な増加が観察されなかった。これらの結果は，モノヌクレオチドお
よびジヌクレオチドプライマーが，限定されたＧＴＰの条件下で，サブゲノムＲ
ＮＡ合成よりも（−）鎖ゲノムＲＮＡ合成を促進することを示す。さらに，これ
らの結果から，サブゲノムおよび（−）鎖ＲＮＡ合成の開始は異なる要求性を有
するという知見が確認される。
【００９２】サブゲノムＲＮＡ合成の間の早期開始： （−）鎖合成の開始の間の早期生成物の合成が先に観察されている（Ｓｕｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｕｎ＆Ｋａｏ，１９９７ｂ）。（−）鎖合成はゲノ
ムＲＮＡの３'末端の近くで開始するため，内部プロモーターからの開始の間に
早期開始が生ずるか否かを決定することは興味深い。したがって，サブゲノムＲ
ＮＡ合成反応の生成物を，高解像度ポリアクリルアミドゲルを用いて，オリゴヌ
クレオチド（早期開始生成物である可能性がある）の存在について分析した。こ
れらの実験においては，予測される生成物の位置＋１４の前にはシチジル酸がな
く，ＵＴＰでは十分な標識が得られなかった（上述）ため，［α−３２Ｐ］ＡＴ
Ｐを標識として用いた。［α−３２Ｐ］ＡＴＰを用いた場合より［α−３２Ｐ］
ＣＴＰを用いた場合に，全長生成物のより高い合成が一貫して観察された。これ
はおそらく，ＲｄＲｐの成分であるＢＭＶ１（ヘリカーゼ様蛋白質）によるＡＴ
Ｐの加水分解によるものであろう。いくつかのサイズのオリゴヌクレオチドがプ
ロスクリプト１２／２６（８ｎｔポリウリジル酸トラクトを含み，２６ｎｔのサ
ブゲノム生成物の合成を指令する）からの合成の間に観察され，また（−）鎖Ｒ
ＮＡ３からの全長サブゲノムＲＮＡの合成の間にも観察された。オリゴヌクレオ
チドは，Ｔ７ＤｄＲｐ生成ＲＮＡと比較して，６，７，および９ｎｔのサイズで
あり，配列は，５'ＧＵＡＵＵＡ３'，５'ＧＵＡＵＵＡＡ３'および５'ＧＵＡＵ
ＵＡＡＵＡ３'であった。ＲｄＲｐにより生成された６，７および９ｎｔのオリ
ゴヌクレオチドは，ホスファーイメージャー定量により判定して，全長２６ｎｔ
生成物に対してそれぞれ１２，７および３倍モル過剰，全長サブゲノムＲＮＡに
対してそれぞれ２０，８および７倍モル過剰であった。他のサイズのオリゴヌク
レオチドも存在したが，より再現性が低いことが観察された。
【００９３】 ＲｄＲｐ調製物中にはある程度の内因性ＢＭＶ ＲＮＡが存在し，添加された
テンプレートが存在しない場合にはこれが高分子量生成物の合成を指令するが，
（−）鎖ＲＮＡ３テンプレートを加えないかぎり，オリゴヌクレオチドは合成さ
れなかった。オリゴヌクレオチド生成物は，以下の一連の証拠に基づいて，正確
に開始されていると判定された。開始ヌクレオチドであるＧＴＰを反応系から除
いたとき，オリゴヌクレオチドおよび全長生成物の両方の標識は有意に減少する
か除去された。正しく開始されたＲＮＡは位置＋１４までシチジル酸を含まない
。すなわち，早期生成物はシチジル酸を欠失しているはずである。ＣＴＰを反応
系から除いたとき，オリゴヌクレオチド合成は影響を受けなかったが，全長生成
物は合成されなかったことが見いだされた（ただし，いくつかのより大きい分子
量の生成物である１４および１７ｎｔが見られた。これはおそらく夾雑ＣＴＰに
よるものであろう。）。全長生成物およびいくつかの可能性のある休止（ｐａｕ
ｓｅ）生成物は，［α−３２Ｐ］ＣＴＰで標識されたが，オリゴヌクレオチドは
標識されなかった。最後に，＋１シチジル酸からグアニル酸への変換を含むプロ
スクリプト（３７／２６）は，オリゴヌクレオチドおよび全長生成物のいずれの
合成も指令しなかった。
【００９４】 ［α−３２Ｐ］ＡＴＰを標識として用いた場合，１２ｔ２６テンプレートから
は，全長２６ｍｅｒおよび未成熟で終止した２４ｍｅｒの両方とも観察された。
これはおそらく，［α−３２Ｐ］ＡＴＰの形のＡＴＰが限定されていた（２４２
ｎＭ）ためであろう。この知見から，限定されたＡＴＰがオリゴヌクレオチドの
生成の原因であると考えられる。この可能性を調べるために，順に高くなる濃度
の非標識ＡＴＰをＲｄＲｐ反応に加えた。オリゴヌクレオチドおよび伸長生成物
の合成は，増加する量の非標識ＡＴＰの添加に同様に応答した。９ｎｔ ＲＮＡ
および伸長生成物は，ＡＴＰ濃度を３０μＭに増加させたときに検出可能であり
，このことは，オリゴヌクレオチドの合成はＢＭＶ ＲｄＲｐの本来の特性であ
り，単に限定された基質のためではないことを示す。
【００９５】 （−）鎖ＲＮＡ合成の伸長段階にはマグネシウムが必要であるのに対し，開始
にはマンガンで十分である（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。サブゲノムプ
ロモーターからのオリゴヌクレオチドおよび全長生成物の合成に及ぼすマンガン
の影響を調べた。１−２ｍＭでは，ＭｎＣｌ２は全長生成物の合成を８−２８％
，９ｎｔ ＲＮＡの合成を９５−１２７％増加させた。ＭｎＣｌ２を２ｍＭより
多く加えると，オリゴヌクレオチドおよび伸長生成物の両方の合成が減少したが
，伸長生成物はより低いＭｎＣｌ２濃度ではより感受性が高かった。また，Ｍｎ
Ｃｌ２の添加により，新規オリゴヌクレオチド生成物が出現した。これらの結果
は，（−）鎖ＲＮＡ合成の開始についての先の知見（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１
９９６）に対応する。
【００９６】 サブゲノムＲＮＡ合成の間に生成したオリゴヌクレオチドがＲｄＲｐにより放
出され，このため早期生成物となるか否かを決定するために，以下の実験を行っ
た。ＣＴＰを欠失した反応は，ＲｄＲｐをテンプレートＲＮＡ上で休止させるは
ずである。Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＣＬ−６Ｂスピンカラムを通すことによりこれら
の休止複合体を分画した。１６個の連続する画分を回収し，２組に分割した。一
方はＲＮＡ生成物について分析し，他方はＲｄＲｐ活性についてアッセイした。
画分２および３において伸長されたＲＮＡおよびＲｄＲｐ活性が認められたのに
対し，６，７および９ｎｔオリゴヌクレオチドは画分８から１３において見いだ
された。これらの結果は，伸長されたＲＮＡはＲｄＲｐとともに三成分複合体と
して残り，オリゴヌクレオチドはＲｄＲｐ複合体から放出され，したがって，早
期開始の生成物であることを示す。
【００９７】実施例３：競合核酸分子を用いるＲＮＡ合成の阻害 開始配列に対応する短いＲＮＡがＲＮＡ合成を阻害しうるか否かを判定するた
めに，インビトロアッセイを使用した（表４）。テスターテンプレートおよび増
加する濃度の競合ＲＮＡを用いて反応を行った。次に，その結果を，増加する濃
度の阻害剤の存在下におけるテスターテンプレートの活性のパーセンテージとし
てプロットした。このプロットから，合成を５０％減少させる阻害剤の濃度が得
られる（Ｉ50）。
【００９８】 野生型プロモーターおよび開始配列を含む３３ｎｔの競合ＲＮＡ（ｗｔ−１３
）は，テスターテンプレート（ｗｔ−１５）からの合成を減少させた。ｗｔ−１
５合成を５０％減少させるのに必要なｗｔ−１３ＲＮＡの濃度（Ｉ50）は２０ｎ
Ｍであった。テスターテンプレートからのＲＮＡ合成の有効な阻害に必要な長さ
を決定するため，プロモーターおよび追加の３ヌクレオチドを含有する２３ｎｔ
のＲＮＡを利用した。このＲＮＡは，８０ｎＭのＩ50を有していた。開始ヌクレ
オチドを含まない対照ＲＮＡ（−２０／−１）は，２５０ｎＭよりはるかに高い
Ｉ50を有していた。さらに，２５０ｎＭで存在した場合においても，このテンプ
レートでは有意な阻害は観察されなかった。これらの結果は，比較的低い濃度の
短いＲＮＡが，ウイルスＲｄＲｐによるＲＮＡ合成の強力な阻害剤であることを
示唆する。開始ヌクレオチドを含むがプロモーター配列を欠失している８ｎｔの
競合ＤＮＡ分子もまた，テスターテンプレートからの合成に競合した。この８ｎ
ｔ ＤＮＡは２．５マイクロモルのＩ50を有する（図１０および１１）。この結
果はまた，一本鎖ＤＮＡを用いてウイルス複製を阻害しうることを示す。これは
，ヒト血清中におけるＤＮＡ分子の安定性が本質的に増加すれば，医薬品にとっ
て興味深い知見である。
【００９９】実施例４：ＤＮＡテンプレートを用いるＲＮＡのＲｄＲｐ媒介性合成 ＲｄＲｐが，ＤＮＡ版のサブゲノムプロモーターを認識し，これからＲＮＡ合
成を正確に開始させる能力を試験した。ＷＴ対照として，１３−ｎｔ生成物の合
成を指令するＷＴプロモーター配列を含む３３−ｎｔプロスクリプト（−２０／
１３と称される）を構築した。この最初の１１−ｎｔはＢＭＶ配列であり，その
後に，ＲｄＲｐ生成物の［α−３２Ｐ］ＣＴＰでの標識を可能とする２つのグア
ニル酸が含まれる（１２）。標準的なアッセイは，２０ｍＭグルタミン酸ナトリ
ウム（ｐＨ８．２），４ｍＭ ＭｇＣｌ２，１２．５ｍＭジチオスレイトール，
０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＭｎＣｌ２，２００μＭ
ＡＴＰおよびＵＴＰ，５００μＭ ＧＴＰ，および２５０ｎＭ［α−３２Ｐ］
ＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む４０μｌの反応系中，２５ｎＭのプロスクリ
プトＲＮＡ（特に記載しない限り）および１０μｌのＲｄＲｐから構成された。
反応系を３０℃で９０分間インキュベートし，フェノール／クロロホルム抽出に
より停止し，５μｇのグリコゲンおよび０．４Ｍ酢酸アンモニウムの存在下でエ
タノール沈殿した。生成物は，２０％変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル
での電気泳動により分離した。ゲルをプラスチックで覆い，−８０℃でフィルム
を感光させた。生成物のバンドはホスファーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量した。
【０１００】 Ｔ７ＤｄＲｐにより生成したサイズマーカーにより判定して，支配的なＲｄＲ
ｐ生成物は，多くのポリメラーゼに共通する現象である１残基の非テンプレート
付加による１４−ｎｔであった（図１，レーン１および１０）。
【０１０１】 ｄ（−２０／１３）と称される全ＤＮＡプロスクリプトは，各位置にデオキシ
リボースが挿入されているが，ＷＴサブゲノムプロモーターおよびテンプレート
配列を含む。この構築物は，ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を指令することができた
（図１，レーン２−８）。しかし，この場合は，支配的な生成物は，ＲＮＡテン
プレートを用いた場合に見られた１４−ｎｔではなく１３−ｎｔであった。この
変化は，非テンプレートヌクレオチドを効率的に付加するためにテンプレート中
の２'−ＯＨを必要とすることを反映しているのであろう。生成物の合成は，Ｄ
ＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤，例えばアクチノマイシンＤおよびリフ
ァンピシリンに耐性であった。ｄ（−２０／１３）プロスクリプトをＤＮａｓｅ
Ｉで前処理すると，生成物は合成されなかった。しかし，生成物は，ＤＮａｓｅ
Ｉに耐性であるが，ＲＮａｓｅＡには完全に感受性であった（図１，レーン３−
５）。正確な開始は，多くの方法により確認した：生成物のサイズを−２０／１
３ＷＴプロスクリプトからのものと比較（図１，レーン１対２），ＲＮａｓｅＴ
ｌ消化（これは開始グアニル酸の後を切断する）により，消化されないものより
１−ｎｔ短い標識生成物が得られること（図１，レーン６対７），正確な合成を
開始するためにのみ必要なＧＴＰの絶対的要求性（図１，レーン８），および変
異開始部位を有するプロスクリプトからの合成がないこと（図１，レーン９）。
ＲＮＡ合成の量は，ＷＴ ＲＮＡプロスクリプトからのものの約６％であったが
，これらの結果は，ＢＭＶ ＲｄＲｐがこのＤＮＡ構築物と生産的に相互作用す
ることができたことを確定的に示す。
【０１０２】末端開始部位の認識： ＲｄＲｐがＤＮＡテンプレートから末端開始部位を認識する能力を調べた（図
１）。開始部位に対して位置−１から＋１３のヌクレオチドを保持した構築物を
ＲＮＡおよびＤＮＡの両方について合成した（それぞれｒ（−ｌ／１３）および
ｄ（−ｌ／１３））。−２０から−２の位置からサブゲノムプロモーターを除去
することにより，開始部位を最後から２番目の位置に配置し，ウイルステンプレ
ートの３'末端からの開始のために好ましい位置を模倣した（Ｍｉｌｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５ Ｎａｔｕｒｅ ３１３，６８）。両方の形の−１／１３
プロスクリプトは，ほぼ等しいレベルでＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を指令するこ
とができた（−２０／１３ＷＴプロスクリプトからの合成の量に対してそれぞれ
６％および８％）。サブゲノムプロモーターを含有するプロスクリプトについて
観察されたように，支配的な生成物は，ＲＮＡテンプレートｒ（−ｌ／１３）に
ついては１４−ｎｔであり，ＤＮＡテンプレートｄ（−ｌ／１３）については１
３−ｎｔであった。
【０１０３】 これらのテンプレートからの開始のための要求性を試験するために，開始部位
中の変異を作成した。＋１シチジル酸の変異または−１グアニル酸の除去により
，ｒ（−ｌ／１３）およびｄ（−ｌ／１３）テンプレートの両方においてＲＮＡ
が合成されなかった（図１，それぞれレーン１２および１４；１９および２１）
。このことは，全長ゲノム合成における場合と同様に，開始は最後から２番目の
位置のシチジル酸から生じなければならないことを示す。しかし，ＲｄＲｐは，
これらのテンプレート中の＋２アデニル酸のシチジル酸への変化を許容する能力
において異なっていた。＋２ａ／ｃ変異により，ｒ（−１／１３）テンプレート
においてＲＮＡ合成を指令する能力がなくなった（図１，レーン１３）。一方，
ＲＮＡ合成は，ｄ（−ｌ／１３）テンプレート中のこの変異によっては影響を受
けなかった（図１，レーン２０）。このことは，ＲｄＲｐによる認識の様式の相
違を示す。ｄ（−ｌ／１３）テンプレートからのＲＮＡ合成を上述のように確認
した。ＤＮａｓｅＩによる処理は，ＤＮＡテンプレートを分解し，ＲＮＡ合成が
なくなるが，一方，生成物はＤＮａｓｅＩに耐性であったがＲＮａｓｅＡにより
分解された（図１，レーン１６−１８）。健康なトマト葉からのＲｄＲｐもまた
，ＤＮＡテンプレートの末端からＲＮＡ合成を開始することが観察されているが
，この開始は配列特異的様式では起こらず，開始のための要求性は完全には特徴
付けされていない（Ｓｃｈｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ２６８，１１８５８）。
【０１０４】開始要求性： 開始部位中の変異を生成して，これらのテンプレートからの開始の要求性を決
定した。＋１シチジル酸の変異または−１グアニル酸の除去により，ｒ（−ｌ／
１３）およびｄ（−ｌ／１３）テンプレートの両方においてＲＮＡが合成されな
かった（図１，それぞれレーン１２および１４；１９および２１）。このことは
，全長ゲノム合成の場合と同様に，開始は終わりから２番目の位置のシチジル酸
から生じなければならないことを示す。しかし，ＲｄＲｐは，これらのテンプレ
ート中の＋２アデニル酸からシチジル酸への変化に対する許容性が異なっていた
。＋２ａ／ｃ変異により，ｒ（−ｌ／１３）テンプレートにおいてＲＮＡ合成を
指令する能力がなくなった（図１，レーン１３）。一方，ＲＮＡ合成は，ｄ（−
ｌ／１３）テンプレート中のこの変異によっては影響されなかった（図１，レー
ン２０）。このことは，ＲｄＲｐによる認識の様式の相違を示す。ｄ（−ｌ／１
３）テンプレートからのＲＮＡ合成は，上述のように確認した。ＤＮａｓｅＩに
より処理すると，ＤＮＡテンプレートが分解され，ＲＮＡは合成されず，一方，
生成物はＤＮａｓｅＩに耐性であるがＲＮａｓｅＡにより分解された（図１，レ
ーン１６−１８）。健康なトマト葉からのＲｄＲｐもまた，ＤＮＡテンプレート
の末端からＲＮＡ合成を開始することが観察されているが，この開始は配列特異
的様式では起こらず，開始のための要求性は完全には特徴付けされていない（Ｓ
ｃｈｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。
【０１０５】ハイブリッドテンプレート： リボースおよびデオキシリボース残基の両方を含むハイブリッドプロスクリプ
トを生成して，ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を促進する残基の位置を決定した（図
２）。サブゲノムプロモーター中および＋１および＋２位置にのみリボースを含
むハイブリッドＨ１は，ｄ（−２０／１３）プロスクリプト（６％）と比較して
，多くの量のＲＮＡ合成を指令した（２０％）。しかし，合成はなお，−２０／
１３ＷＴプロスクリプトから得られるものより低かった（図２，レーン１対２）
。このことは，プロスクリプトのテンプレート部分におけるリボース残基の優先
性を示す。ハイブリッドＨ４中のテンプレートの位置＋２から＋１３において，
デオキシウリジンを塩基のＣ５位置にメチル基を含むデオキシチミジンで置換す
ると，Ｈ１プロスクリプトと比較してＲＮＡ合成をほとんど変化させなかった（
図２，レーン５）。
【０１０６】 Ｈ１からのものと匹敵するＲＮＡ合成は，サブゲノムプロモーター中に増加す
る量のデオキシリボースを含むハイブリッドから観察された。ハイブリッドＨ２
はデオキシリボース置換の領域が延長されており，位置＋１および＋２のリボー
スはＲＮＡ合成には重要でないことが確認された（図２，レーン２対３）。−１
７，−１４，−１３，−１１，＋１，および＋２を除く各位置にデオキシリボー
スを含むＨ３は，Ｈ１プロスクリプトからのものと類似する量のＲＮＡ合成を指
令した（図２，レーン２対４）。ハイブリッドＨ２およびＨ３からの結果は，サ
ブゲノムプロモーター中のリボース残基は位置−１７，−１４，−１３，−１１
またはそれらのサブセットにおいてのみ必要であることを示した。以前に（１１
），本出願人は，それ以外はＲＮＡであるプロスクリプトの位置−１７にデオキ
シグアノシンを配置してもＲＮＡ合成には影響を与えないが，位置−１１のデオ
キシグアノシンは，−２０／１３ＷＴ対照に対して半分以上合成を減少させたこ
とを見いだしている（図２，ぞれぞれレーン６および７）。これらの結果から，
位置−１１のリボースがＲＮＡ合成に重要であるものとして同定された。
【０１０７】糖の化学的修飾： ＲｄＲｐは，位置−１１のリボースの２'−ＯＨを，水素結合ドナーまたは水
素結合アクセプターのいずれかとして，またはＣ２'部分により影響を受けるリ
ボースの配向により，認識することができた。位置−１１の２'−ＯＨの役割を
決定するために，本出願人は，種々のＣ２'置換（１４）を有するＷＴ配列のＤ
ＮＡプロスクリプトｄ（−２０／１３）を合成した。位置−１１の糖に２'−Ｏ
Ｈ（リボース），２'−ＯＣＨ３および２'−Ｆを含有するものを選択した。これ
は，これらの置換がＣ３'エンドコンフォメーションを形成しうるはずであるか
らである（１６）。また，より低い頻度でＣ３'エンドコンフォメーションを形
成する２'−ＮＨ２も試験した。可能性のある水素結合アクセプターとしては，
２'−ＯＨ，２'−ＮＨ２，２'−ＯＣＨ３および２'−Ｆが挙げられるが，２'−
ＯＨおよび２'−ＮＨ２はまた，水素ドナーとしても作用することができる。こ
れらの置換を含むプロスクリプトからのＲＮＡ合成の量を判定した（図２，レー
ン８−１１）。位置−１１のＣ２'置換体はいずれも，全ＤＮＡプロスクリプト
ｄ（−２０／１３）よりＲＮＡ合成を２−３倍強く指令することができ，−１１
Ｇ残基の２'−位置の重要性が確認された。驚くべきことに，これらの置換は，
ＲＮＡ合成を指令する能力が互いに類似していた（１０％から１６％の範囲）。
２’−ＮＨ２（図２，レーン９）を含むプロスクリプトからのＲＮＡ合成のレベ
ルは，−１１Ｇ残基における支配的なＣ３’エンド配向はＲｄＲｐとの正しい相
互作用には重要ではないかもしれないことを示す。２'−Ｈは水素を受容できな
い唯一の置換であるため，−１１リボースの重要性の説明として可能性のあるも
のは，これがＲｄＲｐをこの位置に正しく配置するのに必要な水素結合アクセプ
ター部位を提供しているということである。あるいは，２'−ＯＨの存在が，立
体的妨害により，ある未知の有害な構造が生ずることを防止しているのかもしれ
ない。
【０１０８】競合アッセイ： テンプレート競合アッセイを用いて，機能的結果から予測されるようにサブゲ
ノムプロモーター中へのデオキシリボースの挿入がＲｄＲｐにより直接結合され
る能力に対して悪影響を及ぼすか否かを評価した（図３）。１５−ｎｔ生成物の
生成を指令するＷＴプロモーター（プロスクリプト−２０／１５）からの合成の
量を，種々の競合テンプレートの存在または非存在下で測定した。−２０／１５
プロスクリプトからの活性を５０％減少させるのに必要な競合剤の濃度をＩ50値
と名付けた。ＲｄＲｐとより強く相互作用しうる競合剤は，−２０／１５からの
合成をより多く減少させ，より低いＩ50値を与えるであろう。
【０１０９】 プロスクリプト−２０／１３ＷＴ（リボース残基のみから構成される）は，−
２０／１５プロスクリプトと同じモル比で存在したとき，１５−ｎｔの合成のレ
ベルを半分に減少させ，Ｉ50は２５ｎＭであった（図３）。ｄ（−２０／１３）
がＲｄＲｐにより結合される能力は，穏やかに影響を受けたのみであり，Ｉ50値
は９０ｎＭであった（図３）。ｄ（−２０／１３）が−２０／１３ＷＴプロスク
リプトからのものと比較して，ＲＮＡ合成を指令する能力が１５倍以上減少して
いたのであれば，このＩ50値の３−４倍の減少は，驚くべきことである。３０ｎ
ＭのＩ50の値により示されるように，それ以外はすべてデオキシリボースである
プロスクリプトの−１１グアニル酸のＣ２'位置に−ＯＨまたは−ＯＣＨ３基が
存在することは，ＲｄＲｐにより結合される能力を実質的に保持していた（図３
）。２'−ＯＣＨ３置換について２'−ＯＨによるものと同じレベルの結合が観察
されたという事実は，この増加が水素結合接触の回復によるものであることを示
唆する。負の対照として，位置−２０から−１にＷＴ配列を含むリボースプロス
クリプトは，試験した競合剤の範囲では（１０倍モル過剰）１５−ｎｔの合成を
有効に阻害することができなかった。
【０１１０】 図１に示される構築物を用いて得られた結果は，最小長さのＤＮＡ構築物をウ
イルス合成の潜在的阻害剤として用いることができることを示唆した。位置−１
から始まるＷＴ開始配列を含み，その５'末端では増加する切断型を有するＤＮ
Ａ阻害剤を，テンプレート競合アッセイにおいて試験した。予測されたように，
すべての構築物が，１３−，８−，または６−ｎｔのＲＮＡ生成物を指令するこ
とが見いだされた。また，これらの構築物はすべて，−２０／１５プロスクリプ
トからのＲＮＡ合成を，５'配列の長さに依存する様式で有効に減少させた（図
４）。負の対照として，ＷＴ開始配列を含まないｄ（−ｌ／１３）Ｒｅｖプロス
クリプトは，試験した阻害剤の範囲では（５００倍モル過剰）合成を阻害するこ
とができなかった。比較的安定なＤＮＡ阻害剤によるインビトロでのウイルスＲ
ＮＡ合成の配列特異的減少により，ウイルス治療の合理的な設計が可能となるは
ずである。
【０１１１】 本出願人は，ＲｄＲｐがＤＮＡテンプレート上の内部または末端のいずれかの
開始部位を認識し，ここから正確なＲＮＡ合成を開始する能力を有することを示
してきた。さらに，化学的に合成されたプロスクリプトからの機能性データおよ
び結合データは，位置−１１の２'−ＯＨが，ＲＮＡ合成の開始の間に，ＲｄＲ
ｐとの直接のまたは水分子を介する水素結合に関与することを示唆する。しかし
，プロスクリプトのテンプレート部分（位置＋３から＋１３）中のリボヌクレオ
チドは，おそらくは，ポリメラーゼが開始段階の後に移動する際のコンフォメー
ション変化を安定化させることにより，ＷＴレベルのＲＮＡ合成を指令するのに
必要なのであろう（１７）。テンプレートリボースに対するこの優先性は，最後
から２番目のヌクレオチドから合成を開始する最小プロスクリプトにおいては観
察されない。これはおそらく，ＲｄＲｐがそのコンフォメーションを調節するこ
とができるか，および／またはコアプロモーターの存在下で活性であるためであ
る。特定のＲＮＡを認識する他の蛋白質もまた，リボースに対して限定された接
触要求性を有する傾向にある。例としては，ＭＳ２コート蛋白質およびＥ．ｃｏ
ｉｌアラニン−ｔＲＮＡシンターゼが挙げられる（１８）。現代のＲｄＲｐ（ま
たはその保存された痕跡）が原始的ＲＮＡレプリカーゼを最もよく反映している
ため，これらの結果は，ＲＮＡからＤＮＡテンプレートへの遷移の間に結合エネ
ルギーの顕著な減少が生じなかったことを立証する。このエネルギー的不利を取
り除くことにより，先祖ＲｄＲｐが，新たなＤＮＡワールドで必要なＤＮＡゲノ
ムを転写しおそらくは複製するよう進化することがより容易になったであろう。
【０１１２】実施例５：化学的に修飾された塩基のテンプレート中への挿入の影響 プロスクリプトの合成： ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて，ＲＮＡ ｐＢ３ＴＰ８（９）のｃ
ＤＮＡクローンからのサブゲノムプロモーターを含有する，（−）鎖ＢＭＶ Ｒ
ＮＡ３のｃＤＮＡコピーを生成した。一方はＴ７プロモーターを含むプライマー
の対により，先に記載されたように（５）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ
ｓｃｒｉｂｅ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いてプロスクリプトＲＮＡを生成する
ことができる。イノシンを取り込む転写反応は，開始を生じさせる２ｍＭのプラ
イマーＧｐＧ，および反応においてＧＴＰの代わりにＩＴＰを用いて実施した。
ＲＮＡは，Ｑｉａｇｅｎカラム（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）で，製造元のプ
ロトコルを用いて精製し，Ｔ７転写反応系から残留するＮＴＰおよび蛋白質を除
去した。ＲＮＡは，変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により視
覚的に検査し，ＵＶ吸収により定量した。
【０１１３】 プリンリボシド（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
２６７，１６３−１７１），２−アミノプリンリボシド（Ｋｏｎｆｏｒｔｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１，４３３−４４１），およびピ
リミジン−２−オンリボシド（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．３１１，４８７−４９４））の１'−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ−３'−Ｏ
−ホスホルアミダイトの合成は，先に記載されたように実施した。７−デアザ−
２'−デオキシグアノシンの３'−Ｏ−ホスホルアミダイトは，Ｇｌｅｎ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入した。これらの塩基類似体を含
むプロスクリプトの化学合成は，ＡＢＩ ３９４自動化ＤＮＡ合成機で（ＡＢＩ
，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ），Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（上掲）
にしたがい，慣用的なホスホルアミダイト伸長サイクルを用いて行った。次にエ
タノール性水酸化アンモニウムおよびトリエチルアミン三フッ化水素酸で処理し
て環外アミノおよび１'−ＯＨ保護基を切断した後，プロスクリプトをアニオン
交換ＨＰＬＣにより精製し，分析した（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９
５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。化学
的に合成された各プロスクリプトの質量スペクトル分析は，Ｖｏｙａｇｅｒ−Ｄ
Ｅ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光高度計を用いて行い（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ），すべて予測された質量の０．
１％以内であった（表５）。
【０１１４】ＲｄＲｐ活性のアッセイおよび生成物の分析： ＢＭＶ ＲｄＲｐは，先に記載されたように（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２６，１−１２），感染した大麦から調製した。標準
的アッセイは，２０ｍＭグルタミン酸ナトリウム（ｐＨ８．２），４ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２，１２．５ｍＭジチオスレイトール，０．５％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００，２ｍＭ ＭｎＣｌ２，２００μＭ ＡＴＰおよびＵＴＰ，５００μＭ
ＧＴＰ，および２５０ｎＭ［α−３２Ｐ］ＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む
４０μｌの反応系中の，２５ｎＭのテンプレートＲＮＡ（特に記載しない限り）
および１０μｌのＲｄＲｐから構成された。反応系は，３０℃で９０分間インキ
ュベートし，フェノール／クロロホルム抽出により停止し，次に５μｇのグリコ
ゲンおよび０．４Ｍ酢酸アンモニウムの存在下でエタノール沈殿した。生成物は
，２０％変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲルで電気泳動により分離した。
ゲルをプラスチックで覆い，−８０℃でフィルムを感光させた。生成物のバンド
は，ホスファーメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて
定量し，値をＷＴテンプレート（−２０／１３）から生成した生成物の量と比較
して，変異テンプレートの相対的活性のパーセントを求めた。示されるすべての
値は，少なくとも３回の独立した実験の平均を表し，標準偏差が示される。ＷＴ
−２０／１３は，ウイルス（＋）鎖ＲＮＡ３の位置１２２２−１２５２に相補的
な配列を含む。
【０１１５】 テンプレート競合アッセイは上述した反応条件下で実施したが，ただし，１５
−ｎｔ生成物の合成を指令する２５ｎＭのプロスクリプト−２０／１５を，増加
する濃度の種々の競合剤とともにインキュベートした。これらの反応において用
いたＲｄＲｐの量は，先に記載されたように限定的であった（Ｓｉｅｇｅｌ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４
，１１２３８−１１２４３）。−２０／１５プロスクリプトから生成した生成物
を上述のように定量化し，競合剤の濃度に対してプロットして，Ｉ50値と称され
る，１５−ｎｔ生成物を５０％減少させるのに必要な競合剤の濃度を決定した。
【０１１６】 サブゲノム開始部位（＋１）に対して位置−１７，−１４，−１３，および−
１１に位置するヌクレオチドは，ＲＮＡ合成に必要であり，この効果を媒介する
機能性成分に関して推定を行った（図５Ａ）（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，（
上掲））。４つの重要な位置のそれぞれに塩基類似体を含有するＲＮＡを作成し
て，これらの官能基の重要性を決定した（図５）。ＷＴ対照として，（−）鎖Ｒ
ＮＡ３におけるサブゲノム開始部位の２０−ｎｔ３'側にＷＴプロモーター配列
を含む３３−ｎｔのプロスクリプト（−２０／１３と称される）を構築した。こ
のプロスクリプトは，１３−ｎｔ生成物の合成を指令する。この最初の１１−ｎ
ｔはＢＭＶ配列であり，その後にＲｄＲｐ生成物を［α−３２Ｐ］ＣＴＰで標識
することを可能とする２つのグアニル酸を含む（図５Ｂおよび図５Ｃ，レーンＷ
Ｔ）。
【０１１７】 本出願人は，最初に位置−１７のグアニル酸の認識を実験した（図５Ｂ）。Ｃ
６ケト（およびおそらくはＮ１）基は，ＢＭＶ ＲｄＲｐと相互作用すると推定
された。Ｃ６ケト基を除去してＮ１部分と二重結合を形成する塩基類似体２−ア
ミノプリンを含むプロスクリプトＲＮＡは，ＲＮＡ合成をバックグラウンドレベ
ルまで減少させた（図５Ｂ，レーン１）。変異分析は，Ｃ２アミンおよびＮ７イ
ミンについての役割を示唆しなかった（Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲）
）。ＲｄＲｐとの相互作用におけるＣ２アミンのより限定された役割は，２−ア
ミノプリン置換の厳格さにより推測することができ，これは，Ｃ６ケトおよびお
そらくはＮ１基が決定的成分であることを示す。負の対照として，−１７リボー
スのデオキシリボースへの変更は，ＲｄＲｐ認識に影響を与えなかった（図５Ｂ
，レーン２）。最後に，炭素による置換ならびにリボースからデオキシリボース
への変更によるＮ７イミンの直接的実験は，プロスクリプトがＲｄＲｐによるＲ
ＮＡ合成を指令する能力に影響を与えなかった（図５Ｂ，レーン３）。
【０１１８】 位置−１１のグアニル酸は，Ｃ６ケト（Ｎ１アミンとともに）およびＮ７イミ
ンの両方により媒介される歯状突起様式で認識されると推定されていた。この位
置に２−アミノプリン塩基類似体（Ｋｏｎｆｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，（上掲）
）を組み込むと，ＲＮＡ合成を指令する能力は顕著に４０％に減少した（図５Ｂ
，レーン４）。しかし，ＲＮＡ合成はバックグラウンドレベルまでは下がらず，
Ｎ７イミンもまた重要であるという推定と一致した。Ｎ７デアザ塩基類似体はデ
オキシリボース形でのみ入手可能であった。したがって，位置−１１にデオキシ
グアノシンを有する対照ＲＮＡを最初に試験した。位置−１１のデオキシリボー
スはＲＮＡ合成を野生型の４６％に減少させた（図５Ｂ，レーン５）。このこと
は，ＲＮＡ主鎖がサブゲノムプロモーター認識のある局面を媒介することを意味
する。Ｎ７イミンおよび２'−ＯＨを両方除去すると，合成はさらに野生型の２
５％まで減少し，このことは，推定されるＮ７イミンの認識を示す（図５Ｂ，レ
ーン６）。この場合も，この塩基類似体はＣ６ケト基を保持しているため，ＲＮ
Ａ合成はなくならなかった。
【０１１９】 位置−１４のアデニル酸のＲｄＲｐ認識についての候補は，環外Ｃ６アミン基
である。この基の重要性を試験するために，この位置のアデニル酸をプリンリボ
シド類似体（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（上掲））で置き換えた。この変更を有す
るＲＮＡは，野生型の６０％の合成を保持しており，このことは，アデニル酸の
何か別の特性がＲｄＲｐによる認識に重要であることを示唆する（図５Ｃ，レー
ン１）。これに対し，−１３シチジル酸は，環外Ｃ４アミン基によりＲｄＲｐと
相互作用すると推定されていた。この官能基を特異的に除去した塩基類似体ピリ
ミジン−２−オン（１２）を含むプロスクリプトは，ＲＮＡ合成のレベルを７％
に減少させた（図５Ｃ，レーン２）。
【０１２０】ＲｄＲｐはサブゲノムプロモーター中で接触する： テンプレート競合アッセイを用いて，種々のプロモーター変異が，ＲＮＡがＢ
ＭＶ ＲｄＲｐと相互作用する能力に影響を与えるか否かを試験した（表６）。
１５−ｎｔ生成物の生成を指令するＷＴプロモーター（プロスクリプト−２０／
１５）からの合成の量を，種々の競合テンプレートの存在または非存在下で測定
した。競合剤として用いた変異プロスクリプトが，ＲｄＲｐにより認識されるそ
の能力を失えば，反応系にそれが存在することは，ＷＴ−２０／１５プロスクリ
プトからの合成の量に悪影響を与えないはずである。
【０１２１】 正の対照として，ＷＴプロスクリプト−２０／１３（１３−ｎｔ生成物を生成
する）を，−２０／１５からの１５−ｎｔ生成物の合成を阻害する能力について
試験した。このプロスクリプトがプロスクリプト−２０／１５と同じモル量で存
在したとき，１５−ｎｔ合成のレベルは半分に減少した。合成を指令する能力を
なくす，位置−１４，−１３，および−１１における変異は，モル過剰で存在し
た場合においても，ＢＭＶ ＲｄＲｐが生産的にＷＴプロモーターと相互作用す
ることを阻害しなかった（表６）。これは，位置−１７における変異を用いて得
られた結果と同じであった（Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲））。これに
対し，開始シチジル酸のグアニル酸への変更（ＲＮＡ合成を指令するその能力を
なくす）は，５倍モル過剰で存在したとき，プロスクリプト−２０／１５からの
合成を４０％以上減少させた（表６）。すなわち，コアプロモーターおよび開始
ヌクレオチドにおける変異ですら，ＲＮＡ合成を指令する能力をすべて劇的に減
少させた。これらの結果は，サブゲノムコアプロモーターおよび開始部位中のヌ
クレオチドが異なる様式で認識されることを示唆する。
【０１２２】ＲｄＲｐがサブゲノムプロモーターと相互作用するのに必要な最小テンプレート
： ＲｄＲｐとの安定な相互作用に必要なテンプレートの長さを明らかにするため
に，テンプレート切断型を含むプロスクリプトを構築し，それらがプロスクリプ
ト−２０／１５からの１５−ｎｔ生成物の合成を阻害する能力について試験した
。−２０／１５の活性を５０％減少させるのに必要な競合プロスクリプトの濃度
をＩ50値と名付けた。テンプレート競合アッセイのこの改良により，種々のプロ
スクリプトがＲｄＲｐと相互作用する能力を比較することが可能となった。より
優れた競合剤（ＲｄＲｐとより強く相互作用し，したがって，プロスクリプト−
２０／１５からの合成を減少させることができる）は，より低いＩ50値を有する
であろう。これらの切断型プロスクリプトはすべてＷＴプロモーター配列を含む
が，そのテンプレートの長さは，１３−から５−，３−，２−，１−，および０
−ｎｔまで様々であった（図６Ａ）。ＲＮＡ合成の影響を結合から分離するため
に，これらの切断型プロスクリプトはすべて変異開始部位（＋ｌｃ／ｇ）を含ん
でいた。プロスクリプト−２０／１３＋ｌｃ／ｇと−２０／１３ＷＴのＩ50値の
比較は，１５−ｎｔ生成物の合成を阻害する能力が５倍相違することを明らかに
した（図６Ｂ）。これは，表６に見られる結果と一致する。
【０１２３】 競合ＲＮＡの１３−から３−ｎｔのテンプレート部分の長さを短くすると，Ｒ
ｄＲｐと相互作用するその能力に有害な影響はなかった（Ｉ50値は９５−１２５
ｎＭの範囲，図６Ｂ）。しかし，２−ｎｔの長さのテンプレートは，試験した濃
度範囲では（１０倍モル過剰まで）プロスクリプト−２０／１５からの１５−ｎ
ｔの合成を５０％減少させることができなかった（図６Ｂ）。予測されたように
，この欠陥はまた，テンプレート中に１−または０−ｎｔを有するプロスクリプ
トにおいても認められた。（図６Ｂ）。これらの結果は，ＲｄＲｐとの安定な相
互作用に必要なプロスクリプト最小の長さは３ヌクレオチドであることを示す。
この要求性は，位置＋２および＋３のヌクレオチドの種類には依存しない。これ
は，これらの位置に種々のヌクレオチドを含むプロスクリプトが類似するＩ50値
を有していたためである。
【０１２４】サブゲノム開始部位のまわりのヌクレオチドの認識： 本出願人は，次に，ＲｄＲｐがどのようにして正しい開始部位を認識するかを
決定しようとした。位置−１，＋１および＋２に塩基類似体を含有するプロスク
リプトを構築した。−１グアニル酸の２−アミノプリンへの変更および＋２アデ
ニル酸の環外基を有しないプリンへの変更により，いずれも，ＲＮＡ合成がわず
かに４０−４５％減少したプロスクリプトが得られた（図７，レーン２および４
）。逆に，＋１シチジル酸から環外Ｃ４アミン基を除去すると，ＲＮＡ合成は検
出できないレベルまで減少した（図７，レーン３）。これらの結果は，ヌクレオ
チドのこの同じ領域中の変異分析からの知見と一致する（１５）。ＢＭＶ Ｒｄ
Ｒｐによる＋１ヌクレオチドの認識は以下に議論される。
【０１２５】用途 本発明の核酸分子は，ＲＮＡ転写を阻害することによりウイルス複製を防止す
るために用いることができる。これは，ウイルスがＲＮＡ合成に宿主細胞のメカ
ニズムではなくそれ自身の特定のウイルスポリメラーゼを用いる場合，特に有効
である。非限定的例においては，ブロムモザイクウイルスはＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼを用いてウイルスＲＮＡを生成する。ポリメラーゼはウイルスに特
異的であるため，宿主細胞の正常な細胞メカニズムに影響を与えることなくこれ
を阻害することができる。このことは，副作用が生ずる可能性を減少させ，ウイ
ルス特異的治療を可能とする。ウイルスがＲＮＡを転写するのにウイルスポリメ
ラーゼを用いるのであれば，この技術を用いて他のＲＮＡウイルスを阻害するこ
とができるであろう。核酸分子を用いる阻害の概念は図９に示される。図９Ａは
ＲＮＡ転写の正常な開始を示し，図９Ｂおよび９Ｃは，核酸分子阻害剤の影響を
示す。
【０１２６】インビトロ用途： 本発明の核酸分子はまた，診断用途，すなわち分子をウイルスポリメラーゼの
検出に用いるのに有用である。ウイルス負荷の１つの基準は関連する細胞タイプ
または患者において発現しているウイルスポリメラーゼの量である。核酸分子と
患者から得たウイルスポリメラーゼとの結合により蛍光または着色シグナルが放
出される診断キットを設計することができる。このシグナルを検出し，定量して
，患者中のウイルス負荷のレベルを決定することができる。しかし，ウイルスポ
リメラーゼの発現，および標的細胞ならびに患者に対する推定状のリスクを見抜
くためには，その結果を定量することが絶対的に必要なわけではない。リスクを
確立するためには，ウイルスポリメラーゼの発現の判定で十分であろう。同等の
特異的活性のプローブを用いれば，蛋白質レベルの定性的比較が適当であり，初
期の診断コストを低くするであろう。これらの核酸分子についての他のインビト
ロ用途としては，ウイルスポリメラーゼのメカニズムの研究における研究試薬と
しての用途が含まれ，これはより優れた薬剤の設計につながるであろう。
【０１２７】 他の態様は，以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
【表２】
【０１３０】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は，ＢＭＶ ＲｄＲｐがＲＮＡまたはＤＮＡプロスクリプト
からＲＮＡ合成を正確に開始する能力を示す。
【図２】 図２は，ＲｄＲｐによるＲＮＡ合成を促進するリボース部分を示
す。
【図３】 図３は，ＲｄＲｐとの安定な相互作用におけるリボース２'−Ｏ
Ｈの役割を示す。
【図４】 図４は，最小ＤＮＡプロスクリプトがインビトロでウイルスＲＮ
Ａ合成を阻害しうることを示す。
【図５】 図５は，ＲＮＡ合成の開始に必要なサブゲノムプロモーター中の
機能的成分を示す。
【図６】 図６は，ＲｄＲｐとの安定な相互作用に必要なテンプレート要求
性を示す。
【図７】 図７は，サブゲノム開始部位の認識を示す。ＷＴ−２０／１３プ
ロスクリプトの配列を開始部位とともに示す。
【図８】 図８は，ＲＮＡ合成を開始するのに必要な，ＢＭＶ ＲｄＲｐと
サブゲノムプロモーター要素との間の相互作用のモデルを示す。
【図９】 図９は，ウイルス複製を阻害する核酸分子の概略図を示す。
【図１０】 図１０は，選択されたオリゴヌクレオチドのＩ50値である。
【図１１】 図１１は，ＤＮＡ阻害剤のＩ50値のグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 カオ，チェン・シー アメリカ合衆国インディアナ州47401，ブ ルーミントン，サウスダウンズ，1516イ ー・サウス (72)発明者 ジーゲル，ロバート・ダヴリュー アメリカ合衆国ニューメキシコ州87025， ジェームズ・スプリングス，ヒドゥン・バ レイ528 (72)発明者 ベロン，ローレント アメリカ合衆国コロラド州80301，ボウル ダー，グレンウッド・ドライブ2946 (72)発明者 ベイジェルマン，レオニド アメリカ合衆国コロラド州80303，ロング モント，コルト・ドライブ5530 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA05 DA02 EA02 EA04 FA02 FA07 GA11 HA17 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA02 CA44 4C084 AA13 NA14 ZB332 ZC202 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 ZC20

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルスポリメラーゼに特異的に結合し，前記ウイルスポリ
    メラーゼの活性を阻害しうる，直鎖状一本鎖核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記核酸分子が少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド
    を含む，請求項１記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記核酸分子が少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む，
    請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記核酸分子が少なくとも４つのヌクレオチドを含む，請求
    項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記核酸分子が５−１００ヌクレオチドを含む，請求項１記
    載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記核酸分子が５−５０ヌクレオチドを含む，請求項１記載
    の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記核酸分子が５−２５ヌクレオチドを含む，請求項１記載
    の核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記ウイルスポリメラーゼがＲＮＡポリメラーゼである，請
    求項１記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 核酸分子中の各ヌクレオチドが，２'−Ｏ−メチル，２'−Ｏ
    −アリル，２'−Ｏ−メチルチオメチル，Ｌ−ヌクレオチド；２'−Ｃ−アリル；
    １−５−アンヒドロヘキシトール；２，６−ジアミノプリン；２'−フルオロ；
    ２'−デオキシ−２'−アミノ；２'−（Ｎ−アラニル）アミノ；２'−（Ｎ−フェ
    ニルアラニル）アミノ；２'−デオキシ−２'−（Ｎ−β−アラニル）アミノ；２
    '−デオキシ−２'−（リシル）アミノ；２'−Ｏ−アミノ；２'−デオキシ−２'
    −（Ｎ−ヒスチジル）アミノ；６−メチルウリジン；５−メチルシチジン；２'
    −（Ｎ−β−カルボキシアミジン−β−アラニル）アミノ−２'−デオキシ−ヌ
    クレオチド；およびキシロフラノシルからなる群より選択されるヌクレオチド修
    飾を独立して含む，請求項１記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 前記ＲＮＡポリメラーゼがＢＭＶ，ＨＣＶ，またはＨＢＶ
    に由来するものである，請求項８記載のＲＮＡポリメラーゼ。
  11. 【請求項１１】 ウイルスの複製を阻害する方法であって，請求項１記載の
    核酸分子を，前記核酸分子がウイルスポリメラーゼに結合するのに適した条件下
    でウイルスポリメラーゼ分子と接触させ，このことによりウイルス複製を阻害す
    る工程を含む方法。
  12. 【請求項１２】 前記核酸分子が複数のリボヌクレオチド，デオキシリボヌ
    クレオチド，またはリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む，
    請求項１記載の核酸分子。
  13. 【請求項１３】 前記核酸分子が，複数のヌクレオチド修飾を含む，請求項
    １記載の核酸分子。
  14. 【請求項１４】 前記核酸分子が，５'キャップ構造，３'キャップ構造また
    は５'および３'キャップ構造を含む，請求項１記載の核酸分子。
  15. 【請求項１５】 前記３'キャップ構造が，それが存在する場合には，反転
    無塩基残基；４'，５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフ
    ラノシル）ヌクレオチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；１
    ，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌ
    クレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペン
    トフラノシルヌクレオチド；非環状３'，４'−セコヌクレオチド；非環状３，４
    −ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌク
    レオチド，３'−３'−反転ヌクレオチド部分；３'−３'−反転無塩基部分；３'
    −２'−反転ヌクレオチド部分；３'−２'−反転無塩基部分；１，４−ブタンジ
    オールホスフェート；３'−ホスホルアミデート；ヘキシルホスフェート；アミ
    ノヘキシルホスフェート；３'−ホスフェート；３'−ホスホロチオエート；ホス
    ホロジチオエート；およびメチルホスホネート部分からなる群より選択されるキ
    ャップ構造である，請求項１４記載の核酸分子。
  16. 【請求項１６】 前記５'キャップ構造が，それが存在する場合には，４'，
    ５'−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレ
    オチド；４'−チオヌクレオチド，炭素環式ヌクレオチド；５'−アミノ−アルキ
    ルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート，３−アミノプ
    ロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシ
    ルホスフェート；ヒドロキシ−プロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキ
    シトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基
    ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド
    ；非環状３'，４'−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチ
    ド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド，５'−５'−反転ヌクレオチド
    部分；５'−５'−反転無塩基部分；５'−ホスホルアミデート；５'−ホスホロチ
    オエート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５'−アミノ；架橋および／
    または非架橋５'−ホスホルアミデート，ホスホロチオエートおよび／またはホ
    スホロジチオエート，架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５'−メルカ
    プト部分からなる群より選択されるキャップ構造である，請求項１４記載の核酸
    分子。
  17. 【請求項１７】 前記核酸分子が，３'キャップ構造として３'−３'結合反
    転無塩基部分を含む，請求項１４記載の核酸分子。
  18. 【請求項１８】 前記ウイルスポリメラーゼが植物ウイルスポリメラーゼで
    ある，請求項１記載の核酸分子。
  19. 【請求項１９】 前記ウイルスポリメラーゼが動物ウイルスポリメラーゼで
    ある，請求項１記載の核酸分子。
  20. 【請求項２０】 前記ウイルスポリメラーゼが細菌ウイルスポリメラーゼで
    ある，請求項１記載の核酸分子。
  21. 【請求項２１】 請求項１記載の少なくとも１つの核酸分子を，その核酸分
    子の発現を可能とする様式でコードする核酸配列を含む発現ベクター。
  22. 【請求項２２】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み，ここで，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能
    とする様式で，前記開始領域および前記終止領域に動作可能なように連結されて
    いる，請求項２１記載の発現ベクター。
  23. 【請求項２３】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）オープンリーディングフレーム； ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み，ここで，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末
    端に動作可能なように連結されており，かつ，前記遺伝子は，前記核酸分子の発
    現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記オープンリーデ
    ィングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結されている，請求項
    ２１記載の発現ベクター。
  24. 【請求項２４】 前記発現ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み，ここで，前記遺伝子は，前記核酸分子の発現および／または輸送を可能
    とする様式で，前記開始領域，前記イントロンおよび前記終止領域に動作可能な
    ように連結されている，請求項２１記載の発現ベクター。
  25. 【請求項２５】 前記ベクターが， ａ）転写開始領域； ｂ）転写終止領域； ｃ）イントロン； ｄ）オープンリーディングフレーム； ｅ）少なくとも１つの前記核酸分子をコードする遺伝子 を含み，ここで，前記遺伝子は，前記オープンリーディングフレームの３'−末
    端に動作可能なように連結されており，かつ，前記遺伝子は，前記核酸分子の発
    現および／または輸送を可能とする様式で，前記開始領域，前記イントロン，前
    記オープンリーディングフレームおよび前記終止領域に動作可能なように連結さ
    れている，請求項２１記載の発現ベクター。
  26. 【請求項２６】 請求項１記載の核酸分子を含む細胞。
  27. 【請求項２７】 前記細胞が植物細胞である，請求項２６記載の細胞。
  28. 【請求項２８】 前記細胞が動物細胞である，請求項２６記載の細胞。
  29. 【請求項２９】 前記細胞が細菌細胞である，請求項２６記載の細胞。
  30. 【請求項３０】 前記細胞が哺乳動物細胞である，請求項２６記載の細胞。
  31. 【請求項３１】 前記哺乳動物細胞がヒト細胞である，請求項３０記載の哺
    乳動物細胞。
  32. 【請求項３２】 請求項１記載の核酸分子を含む医薬組成物。
  33. 【請求項３３】 前記核酸分子が化学的に合成されたものである，請求項１
    記載の核酸分子。
  34. 【請求項３４】 前記核酸分子が酵素的に合成されたものである，請求項１
    記載の核酸分子。
  35. 【請求項３５】 前記核酸分子が精製された形態である，請求項１記載の核
    酸分子。
  36. 【請求項３６】 核酸分子が，開始ヌクレオチドを含有するウイルス核酸配
    列を含む，請求項１記載の核酸分子。
  37. 【請求項３７】 前記核酸分子が少なくとも４つのヌクレオチドを含む，請
    求項３６記載の核酸分子。
  38. 【請求項３８】 前記ウイルスポリメラーゼが，（＋）一本鎖ＲＮＡウイル
    スによりコードされる，請求項１記載の核酸分子。
  39. 【請求項３９】 前記ウイルスポリメラーゼが，（−）一本鎖ＲＮＡウイル
    スによりコードされる，請求項１記載の核酸分子。
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