JP2001507379A

JP2001507379A - 微生物からのトリグリセリドの抽出

Info

Publication number: JP2001507379A
Application number: JP50641897A
Authority: JP
Inventors: リデル，ジョン・マクドナルド
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1995-07-18
Filing date: 1996-07-16
Publication date: 2001-06-05
Also published as: US6180376B1; EP0843733A1; ATE201907T1; EP0843733B1; DE69613228D1; CA2226427C; AU6467096A; DE69613228T2; ES2158323T3; DK0843733T3; WO1997004121A1; GB9514649D0; CA2226427A1

Abstract

(57)【要約】微生物を崩壊させ、それらをその細胞材料中に本来存在する水分の少なくとも７０重量％の水分の存在下でその油に対する水−非混和性溶剤と接触させ、微生物から溶剤を分離し、そして溶剤から油を回収することにより、油を含有する微生物から油が抽出される。

Description

【発明の詳細な説明】微生物からのトリグリセリドの抽出本発明は抽出法に関する。植物油は、乾燥した植物種子から加圧により抽出することができる。これによれば一般に、圧潰した植物組織中に植物油が残り、これは水−非混和性有機溶剤、たとえばヘキサンを用いて抽出することができる。微生物油を全微生物からヘキサン抽出により抽出することができる。この油をヘキサンで効果的に抽出しうるには、予め微生物材料を通常は５％（ｗ／ｗ）未満の水分にまで乾燥しなければならない。これは、一般に微生物細胞がその油以外の含有物を基準として少なくとも７０％、たとえば８０〜９５％（ｗ／ｗ）の水を含有するのでかなりのエネルギー消費を伴うというだけでなく、感受性の高い油、たとえば酸素感受性または熱感受性の油が乾燥過程で化学反応を受ける可能性のあることも本発明者らは見出した。微生物から油を抽出する別法では、水混和性溶剤、たとえばイソプロパノールを用いることができる。このような抽出法は一般に非極性溶剤を用いる方法より選択性が低く、油のほかに広範な他の細胞成分、たとえばリン脂質および細胞壁成分も抽出される可能性がある。したがって水混和性溶剤を蒸発させるとさらに精製しなければならない残渣が残る。 “油”とは、抽出温度で液体であり、かつ水にほとんど溶解しない物質を意味する。一般に微生物から回収される油はトリグリセリドである。本発明は、油を含有する微生物から油を抽出する方法であって、微生物を崩壊させ、それらを、その細胞材料中に本来存在する水分の少なくとも７０重量％の水分の存在下で、好ましくは実質的に該微生物の本来の水分すべての存在下で、その油に対する水−非混和性溶剤と接触させ、微生物から溶剤を分離し、そして溶剤から油を回収することを含む方法を包含する。本発明は、トリグリセリドを含有する微生物材料からトリグリセリドを抽出する方法であって、トリグリセリドを細胞から加圧ホモジナイゼーションにより放出させ、次いで放出されたトリグリセリドを、微生物材料と水−非混和性溶剤、たとえば好適には４〜１２個、好ましくは５〜８個の炭素原子を有するアルカン、たとえばシクロヘキサンまたは好ましくはヘキサンとの接触により抽出する方法をも包含する。本発明によれば、微生物材料を脱水する必要性が避けられ、同時に水−非混和性溶剤中への抽出の良好な選択性を保証することができる。微生物をそれが培養されていた水性培地の存在下で崩壊させることが好ましく、なぜならばこれにより本方法の前に微生物材料を培地から分離する必要性が避けられるからである。一般に微生物は培地の５〜２０容量％を構成するであろう。トリグリセリドを含有する連続量の崩壊生物を抽出するために、同一溶剤を２回以上再使用し、これにより溶剤のトリグリセリド含量を高めることができる。これはトリグリセリドを溶剤から蒸発により回収する際に経済的に有利である。このような操作は、所望により向流抽出により行うことができる。好適にはこれは、崩壊した微生物を含有する相より低い密度（dense）の溶剤を用い、それを抽出が行われる容器内へ、崩壊した微生物を含有する相より低い位置で供給することにより実施できる。容器は垂直流を制限するバフルを備えていてもよく、これらがバフル間に接触帯域を定め、容器は接触帯域内の材料を撹拌するための手段を備えている。所望により、分離したトリグリセリド含有溶剤を新鮮な溶剤と共に用いて、まだ抽出されていない微生物を抽出することができる。溶剤は遠心分離により分離することができる。溶剤は炭化水素、たとえば好適には４〜１２個、好ましくは６〜１０個の炭素原子を有するアルカンであることが好適であり、ヘキサンが好適である。生物は、細胞壁溶解酵素を用いる細胞の酵素破壊法、ビーズミリング法、コロイドミリング法、放圧、衝撃ジェット、超音波、好ましくは高剪断混合および／または高圧ホモジナイゼーションによる破壊などの機械的方法によって崩壊させることができる。破壊は、細胞壁を破壊し、これにより細胞内に含有されるトリグリセリドへの溶剤の到達を高めるのに十分なものでなければならない。このためにはいかなる形態の加圧ホモジナイザーも使用できる。一般に溶剤抽出法では、抽出される材料と比べて少量の溶剤を用いる。これは溶剤相中に高濃度の目的溶質を得るという利点をもつが、微生物材料をこの方法で抽出する場合には存在する有機物が乳化剤として作用して、安定性の高い水中溶剤型エマルジョンが形成される傾向にある。このようなエマルジョンの安定性を低下させるためには、解乳化剤を添加し、これによりエマルジョンが高重力状態で好適に分離するのを可能にする必要があろう。しかし解乳化剤が分離したい生成物を汚染する可能性があり、かつ付加的経費を伴う。解乳化剤が有毒である場合には汚染は特に望ましくないであろう。本発明者らは、溶剤中水型の分散液を形成するのに十分な高濃度の溶剤の存在下で操作することにより、解乳化剤の不在下でも分散液の安定性がより低く、たとえば重力沈降または遠心の使用によってより容易に分離できることを見出した。この場合、連続量の微生物材料を溶剤で抽出することにより溶剤のトリグリセリド含量を高めることが望ましい。したがって本発明は、崩壊した微生物を連続相の溶剤と接触させる、前記方法を包含する。抽出工程に際して、溶剤相と存在する他の物質との比率は少なくとも１：１、好ましくは少なくとも１．５：１、より好ましくは少なくとも２：１とすべきであり、好適には最高１０：１、好ましくは最高１：１とすべきであるのが望ましい。実施例１Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａの１菌株をグルコースと酵母自己分解物の混合物に基づく水性培地中でバッチ培養により増殖させて、トリグリセリド油２４％ｗ／ｗを含有する細胞５４．８ｇ／ｌを含む培養物を得た。この油の脂肪酸組成は５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）１８．６％ｗ／ｗであると判定された。この細胞懸濁液を高剪断ミキサー（ウルトラ・ツラックス（ＵｌｔｒａＴｕｒｒａｘ）、ＩＫＡ）を用いて分散させ、次いで４００バールの圧力で作動している高圧ホモジナイザー（ラニー・ラボ（ＬａｎｎｉｅＬａｂ）ホモジナイザー、ＡＰＶ）に供給した。次いで得られた細胞ホモジネートをまず解乳化剤（アーモガード（Ａｒｍｏｇａｒｄ）Ｄ５３９０、アクゾ−ノーベル（Ａｋｚｏ−Ｎｏｂｅｌ）、リトルボロー）と、解乳化剤濃度２０００ｐｐｍになるように混合した。次いでこの水相を、良好な相接触が保証されるように高剪断混合（ウルトラ・ツラックス、ＩＫＡ）によりヘキサンと接触させた（周囲温度および中性ｐＨ）。水：溶剤の相比３：１を用いた。得られたエマルジョンを３０００ｇで３分間の遠心により分離した。分離したヘキサン相をシリカゲルカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、セプ−パック（Ｓｅｐ−ｐａｋ））に導通することにより発酵消泡剤残留物から精製し、蒸発させて、精製トリグリセリド油を得た。この油をガスクロマトグラフィーにより５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸含量につき分析した。水相のヘキサン接触で得た全トリグリセリド収率は、微生物細胞の最初の油含量に対して６５．７％であった。油の５，８，１１，１４ −エイコサテトラエン酸含量は２８．１％ｗ／ｗであった。比較として、発酵槽培養物の試料を採取し、濾過により細胞を回収した。採集した細胞を凍結乾燥により乾燥させ、次いでヘキサンと混合した。５ｇの乾燥細胞を２５ｍｌのヘキサンと接触させた。周囲温度で６０分間、溶剤を細胞と接触させたのち、懸濁液の濾過により溶剤抽出物を回収した。シリカゲルカラム（ウォーターズ、セプ−パック）を用いて溶剤を発酵消泡剤残留物から精製し、蒸発させて、精製トリグリセリド油を得た。全トリグリセリド収率は、微生物細胞の最初の油含量に対して５９％であった。これをガスクロマトグラフィーにより５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸につき分析して、濃度７．１％ｗ／ｗを得た。これは、ホモジナイズした全細胞培養物からの抽出と比較して乾燥細胞の抽出の間に５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸のかなりの分解が起こったことを示す。凍結乾燥細胞と比較して高圧ホモジナイズした全細胞培養物からの抽出の方が油収率が高く、回収された５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸からみた油の品質も高かった。実施例２Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａａｌｐｉｎａの１菌株をグルコースと酵母自己分解物の混合物に基づく水性培地中でバッチ培養により増殖させて、トリグリセリド油５１．０％ｗ／ｗを含有する細胞４６．０ｇ／ｌを含む培養物を得た。この油の脂肪酸組成は５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）２５．１％ｗ／ｗであると判定された。この細胞懸濁液を高剪断ミキサー（ウルトラ・ツラックス）を用いて分散させ、次いで４００バールの圧力で作動している高圧ホモジナイザー（ラニー）に供給した。次いでこの水相を、良好な相接触が保証されるように高剪断混合（ウルトラ・ツラックス）により、種々の量のヘキサンと接触させた（周囲温度および中性ｐＨ）。水：溶剤の相比１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、および１：３を用いた。得られた混合相を目盛り付き試験管中において３０００ｇで３分間の遠心により分離し、最初の溶剤相の回収を測定した。水：溶剤の相比１：２を用いて調製した試料の場合、溶剤相を回収し、水：溶剤の相比１：２を得るのに十分なヘキサン溶剤で水相を再構成した。最初の抽出の場合と同様に、良好な相接触を保証するために高剪断ミキサーを用いた。プールしたヘキサン相を蒸発させ、全トリグリセリド含量および５，８，１１，１４ −エイコサテトラエン酸につき分析した。全トリグリセリド収率は７６％であり、油の５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸含量は２９.２％ｗ／ｗであった。実施例３Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍの１菌株をグルコース、酵母抽出物、ペプトンおよび２０ｇ／ｌのＮａ₂ＳＯ₄の混合物に基づく水性培地中でバッチ培養により増殖させて、トリグリセリド油３０％ｗ／ｗを含有する細胞１５ｇ／ｌを含む培養物を得た。この油の脂肪酸組成は７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）１０％ｗ／ｗであると判定された。この細胞懸濁液を５００バールの圧力で作動している高圧ホモジナイザー（ニロ−ソアビ・パンダ・ラボラトリー（Ｎｉｒｏ−ＳｏａｖｉＰａｎｄａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）ホモジナイザー）に２回導通した。次いでこの水相を良好な相接触が保証されるように高剪断混合（ウルトラ・ツラックス、ＩＫＡ）により、水相の容量の３倍のヘキサンと接触させた（周囲温度および中性ｐＨ）。得られた混合相を重力下で分離させ、溶剤相を回収し、保存した。水相を再びヘキサン（水相の容量の３倍に等しい容量）と接触させ、ヘキサン抽出液を重力沈降により分離させた。プールしたヘキサン相を蒸発させ、全トリグリセリド含量および４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）につき分析した。全トリグリセリド収率は９１％であり、油の４，７，１０，１３，１６，１９ −ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量は８．７％ｗ／ｗであった。油の過酸化物価（ＰＶ）は活性酸素５ミリ当量／ｋｇ未満であると測定された。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年６月２０日（１９９７．６．２０）【補正内容】請求の範囲１．油を含有する微生物から油を抽出する方法であって、機械的手段によって、あるいは細胞壁溶解酵素の添加により微生物の細胞壁を破壊することによって微生物を崩壊させ、それらをその細胞材料中に本来存在する水分の少なくとも７０重量％の水分の存在下でその油に対する水−非混和性溶剤と接触させ、微生物から溶剤を分離し、そして溶剤から油を回収することを含む方法。２．微生物が、実質的にそれらの水分すべての存在下でその油に対する水−非混和性溶剤と接触させられる、請求項１記載の方法。３．油がトリグリセリドである、請求項１または２記載の方法。４．油が酸素感受佳または熱感受性である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。５．微生物を水性培地の存在下で崩壊させ、これにより油を含有する培地を調製し、この培地を溶剤と接触させる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。６．崩壊した生物を溶剤と反復接触させ、これによりそれから連続量の油を抽出する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。７．崩壊した微生物から抽出したトリグリセリドを含有する溶剤を用いて、まだ抽出されていない崩壊した微生物を抽出する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．向流抽出法により実施される、請求項７記載の方法。９．溶剤が崩壊した微生物を含有する相より低い密度であり、それを抽出が行われる容器内へ、崩壊した微生物を含有する相より低い位置で供給する、請求項８記載の方法。１０．溶剤が崩壊した微生物を含有する相より高い密度であり、それを抽出が行われる容器内へ、崩壊した微生物を含有する相より高い位置で供給する、請求項８記載の方法。１１．容器が、垂直流を制限してそれらの間に接触帯域を定めるバフル、および接触帯域内の材料を撹拌するための手段を備えている、請求項９または１０記載の方法。１２．溶剤を遠心により分離することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。１３．崩壊した微生物を連続相の溶剤と接触させる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。１４．抽出に際して、溶剤相と存在する他の物質との比率が少なくとも１：１、好ましくは１．５：１、より好ましくは少なくとも２：１であり、好適には最高１０：１、好ましくは５：１である、請求項１２記載の方法。１５．細胞を加圧ホモジナイゼーションにより崩壊させる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。１６．溶剤が炭化水素である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。１７．炭化水素がヘキサンである、請求項１５記載の方法。１８．微生物が、Mortierella alpinaまたはThraustrochytriumである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｐ 7/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．油を含有する微生物から油を抽出する方法であって、微生物を崩壊させ、それらをその細胞材料中に本来存在する水分の少なくとも７０重量％の水分の存在下でその油に対する水−非混和性溶剤と接触させ、微生物から溶剤を分離し、そして溶剤から油を回収することを含む方法。２．油を含有する微生物から油を抽出する方法であって、微生物を崩壊させ、それらを実質的にそれらの水分すべての存在下でその油に対する水−非混和性溶剤と接触させ、微生物から溶剤を分離し、そして溶剤から油を回収することを含む方法。３．油がトリグリセリドである、請求項１または２記載の方法。４．油が酸素感受性または熱感受性である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。５．微生物を水性培地の存在下で崩壊させ、これにより油を含有する培地を調製し、この培地を溶剤と接触させる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。６．崩壊した生物を溶剤と反復接触させ、これによりそれから連続量の油を抽出する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。７．崩壊した微生物から抽出したトリグリセリドを含有する溶剤を用いて、まだ抽出されていない崩壊した微生物を抽出する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。８．向流抽出法により実施される、請求項７記載の方法。９．溶剤が崩壊した微生物を含有する相より低い密度であり、それを抽出が行われる容器内へ、崩壊した微生物を含有する相より低い位置で供給する、請求項８記載の方法。１０．溶剤が崩壊した微生物を含有する相より高い密度であり、それを抽出が行われる容器内へ、崩壊した微生物を含有する相より高い位置で供給する、請求項８記載の方法。１１．容器が、垂直流を制限してそれらの間に接触帯域を定めるバフル、および接触帯域内の材料を撹拌するための手段を備えている、請求項９または１０記載の方法。１２．溶剤を遠心により分離することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。１３．崩壊した微生物を連続相の溶剤と接触させる、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。１４．抽出に際して、溶剤相と存在する他の物質との比率が少なくとも１：１、好ましくは１．５：１、より好ましくは少なくとも２：１であり、好適には最高１０：１、好ましくは５：１である、請求項１２記載の方法。１５．細胞を加圧ホモジナイゼーションにより崩壊させる、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。１６．溶剤が炭化水素である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。１７．炭化水素がヘキサンである、請求項１５記載の方法。