JP2001505437A - 突然変異ｏｂ受容体およびそれをコードするヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ａ）機能性第１ＣＫ−Ｆ３ドメイインの欠失、ｂ）機能性第２ＣＫ−Ｆ３ドメインの欠失、またはｃ）機能性細胞内ドメインの欠失を有する突然変異ｏｂ受容体を作成した。そのような受容体は、新規のリガンドを同定するトランス活性化アッセイのような様々なアッセイに利用できるであろう。

Description

【発明の詳細な説明】 突然変異ＯＢ受容体およびそれをコードするヌクレオチド 発明の分野 本発明は、突然変異ｏｂ受容体タンパク質、それをコードするヌクレオチドお よびその突然変異受容体タンパク質を使用したアッセイに関する。 発明の背景 最近、げっ歯動物で肥満の発症に関係のあるいくつかの遺伝子において突然変 異が同定された。特に重要なのは、体重を調節する新規なシグナルトランスダク ション経路の一成分であるペプチドホルモン（レプチン）で発見された突然変異 である（Ｚｈａｎｇら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：４２５−４３２ ； Ｃｈｅｎら， １９９６， Ｃｅｌｌ ８４：４９１−４９５）。レプチン は、最初、マウスで肥満遺伝子（ｏｂ）のポジショナルクローニングによって発 見された。２つの異なるｏｂ対立遺伝子が同定された。１つの突然変異は、端を 切り取ったタンパク質を生じるレプチンペプチドの早期終止を引き起こし、もう 一つの突然変異は、肥満（ｏｂ）遺伝子の転写活性 を変化させ、結果として循環レプチンの量を減少させる。 生物学上活性なレプチンのレベルの減少とｏｂ／ｏｂマウスにおいて観察され た顕性の肥満の表現型との間には相関性がある。組換えレプチンは、ｏｂ／ｏｂ マウスにおいては減量を誘起するが、糖尿病表現型ｄｂ／ｄｂマウスではそうで はないことが示されている（Ｃａｍｐｆｉｅｌｄら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ５４６−５４９； Ｈａｌａａｓら，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：５４３−５４６；Ｐｅｌｌｙｍｏｕｎｔｅｒら，１９９５， Ｓｃｉｅ ｎｃｅ２６９：５４０−５４３； Ｒｅｎｔｓｃｈら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１４：１３１−１３６；およびＷｅ ｉｇｌｅら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ９６：２０６５−２ ０７０）。 レプチンの合成は脂肪細胞で生じるか、食物摂取を低減させると共に代謝速度 を増大させるその能力は、視床下部によって中枢的に仲介されているように思わ れる。脳の第３脳室へ組換えレプチンを注入すると、レプチンの末梢投与と類似 した応答が誘発される。また、最近のクローニングにより、レプチンに対するヒ ト受容体、すなわちｏｂ−受容体（ＯＢ−Ｒ）は、視 床下部で転写されることが明らかになっている（Ｔａｒｔａｇｌｉａら，１９９ ５，Ｃｅｌｌ ８３：１２６３１２７１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら，１９９５，Ｎａ ｔｕｒｅ ３７７：５３０−５３２）。さらに、視床下部で優先的に発現される マウスＯＢ−Ｒのロングフォームの早期終止を生じる突然変異は、ｄｂ／ｄｂマ ウスの肥満表現型の原因となっているようである（Ｌｅｅら，１９９６，Ｎａｔ ｕｒｅ ３７９：６３２−６３５；Ｃｈｕａら，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ７１：９９４−９９６；およびＣｈｅｎら，１９９６，Ｃｅｌｌ ８４：４９１ −４９５）。 突然変異ｏｂ受容体タンパク質をクローニング・産生して、肥満症の解明とそ の予防および治療において有用でありうるリガンドの同定のためのアッセイに使 用することができれば望ましいであろう。 発明の詳細な説明 本発明は、ａ）機能性第１ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失すること、ｂ）機能性 第２ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失すること、およびｃ）機能性細胞内ドメインを 欠失すること、から成る群から選択される突然変異を有することで野生型受容体 とは異なり、「レプチン受容体」とも呼ばれる突然変異ｏｂ受容 体（「ＯＢ−Ｒ」）に関する。 「機能性のモジュールまたはドメインを欠失する」という表現は、受容体がも はや受容体分子の構造部分に関連した生物学的機能を持っていないことを意味す る。これは、モジュールまたはドメインを欠失させることによって、あるいは機 能を喪失するように、あるドメインを構築するアミノ酸を他のアミノ酸により置 換することによって、達成することかできる。 本発明はまた、ａ）第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部または実質的に全部から なるアミノ酸残基の欠失を含んでいる受容体、ｂ）第２ＣＫ−Ｆ３モジュール中 のＣＫドメインの、Ｆ３ドメインの全部または実質的に全部による置換を含み、 Ｆ３−Ｆ３モジュールを生じている受容体、およびｃ）細胞内ドメインの全部ま たは実質的に全部の欠失を有する受容体、からなる群から選択される突然変異ｏ ｂ受容体に関する。 本発明の別の態様は、本発明の突然変異体ＯＢ−Ｒをコードする核酸に関する 。好ましくは、核酸はＤＮＡである。 本発明は、さらに突然変異体ＯＢ−Ｒ遺伝子を含んでいるベクター、このベク ターを含んでいる宿主細胞、および、突然変異体ＯＢ−Ｒ遺伝子を含むベクター を宿主細胞へ導入し、突然 変異体ＯＢ−Ｒが生産されるような適切な条件下でその宿主細胞を培養する工程 からなる突然変異体ＯＢ−Ｒタンパク質を産生する方法も包含する。このように 産生された突然変異体ＯＢ−Ｒは、従来の方法で宿主細胞から収集することがで きる。 さらに、本発明の別の態様は、突然変異体ＯＢ−Ｒを使用するアッセイである 。これらのアッセイにおいては、野生型ＯＢ−Ｒリガンドと思われる様々な分子 を突然変異体ＯＢ−Ｒと接触させ、それらの結合を検出する。特に好ましいアッ セイのタイプは、トランス活性化アッセイであり、ここでは、突然変異体ＯＢ− Ｒへのリガンドの結合により、一連の細胞内事象が開始され、検出可能であるレ ポーター遺伝子の転写および／または翻訳が生起する。本発明のアッセイを利用 して、アゴニスト、アンタゴニストおよびリガンド擬似体を同定することができ る。本発明のさらなる態様は、そのように同定されたリガンドである。 また、本発明のさらに別の態様は、遺伝子治療における本発明の突然変異受容 体の使用である。治療の必要な動物へ突然変異受容体をコードする遺伝子を移入 することができ、それは体重増加の調節に影響を及ぼすであろう。 図面の簡単な説明 図１は、欠失突然変異受容体Ｄ（４１−３２２）のアミノ酸配列（配列番号： １）である。 図２は、アミノ酸４２０−４９６が欠失され、アミノ酸５００−６３２で置換 された置換突然変異受容体のアミノ酸配列（配列番号：２）である。 図３は、図１の欠失突然変異体を使用した結合アッセイのグラフである。 図４は、図１の欠失突然変異受容体を使用したトランス活性化アッセイのグラ フである。 図５は、シグナル配列としてレプチン受容体のアミノ酸１−２２を含み、かつ レプチン受容体の残基４２０−６３２を含んでいる可溶性レプチン結合ドメイン のアミノ酸配列（配列番号：３）である。 本明細書と請求の範囲を通じて、次の定義を適用する。 「野生型」は、遺伝子またはタンパク質が、参照する基準種に見られるものと 実質的に同一であり、その遺伝子またはタンパク質に対する突然変異を持ってい ないと考えられるものであることを意味する。核酸またはアミノ酸配列に関して 「実質的 に同一」とは、参照配列と同一であるか、完全に同一でなくても、その生物学的 な活性または機能に影響しない変更を含んでいるかのいずれかを意味する。 欠失に関連して「実質的に全部」とは、その欠失か、特定のドメインまたはモ ジュールがもはやその生物学的機能を保持しないよう十分に広範囲にわたること を意味する。 ＯＢ−Ｒはサイトカイン受容体ファミリーの一つである。サイトカイン受容体 ファミリーは、比較的大きいファミリーであり、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ ）、エリトロポイエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）および顆粒球コロニー刺激因子（ ＧＣＳＦ−Ｒ）を包含している。 ＧＨ−Ｒは、現在高分解能構造か知られている２つの受容体のうちの１つであ る。ＧＨ−Ｒの細胞外領域は２つのドメイン、すなわちＣＫドメインおよびＦ３ ドメインから構成されており、そのいずれも独特の共通（コンセンサス）残基に よって特徴づけられる。これらが組み合わされたＣＫ−Ｆ３モジュールは、成長 ホルモン結合部位を形成する。 ＯＢ−ＲとＧＨ−Ｒの間の配列アライメントにより、ＯＢ−Ｒの細胞外領域は ＣＫ−Ｆ３モジュールの２つの相同ユニット を含むことが明らかになっている。第１のＣＫ−Ｆ３モジュールは、アミノ酸４ １から３２２まで伸延しており、そのＣＫドメインは、アミノ酸４１から２２２ まで伸延し、Ｆ３ドメインはアミノ酸２２３から３２６まで伸延している。第２ のＣＫ−Ｆ３モジュールは、アミノ酸４３１から６３２まで伸延しており、その ＣＫドメインは、アミノ酸４３１から５０８までであり、Ｆ３ドメインは、アミ ノ酸５０９から６３２までである。ＯＢ−Ｒにある反復するＣＫ−Ｆ３モジュー ルモチーフは、サイトカイン受容体では共通して見い出されず、このような反復 するＣＫ−Ｆ３モジュールを有するサイトカイン受容体に対するリガンド結合部 位の局在は知られていない。 本明細書では、ヒトＯＢ−Ｒに関して、特定のアミノ酸およびドメインに言及 する。しかしながら、他の種に由来するＯＢ−Ｒを同様に改変して、本明細書に 明確に記載された突然変異体と同等の突然変異体を得ることができ、本発明は、 ヒトＯＢ−Ｒの突然変異に限定されない。 本発明に従って、レプチン受容体の突然変異体を３種類構築した。第１の種類 は、機能性第１ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失している。この種類の１つの実施形 態は、（アミノ酸４１から ３２２まで伸延している）第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部または実質的に全部 を欠失した欠失突然変異体である。 本発明のある好ましい実施形態では、第１ＣＫ−Ｆ３モジュール全体を欠失し た。特に、この特別な突然変異体をＤ（４１−３２２）と称する。驚いたことに 、Ｄ（４１−３２２）は、組換え体レプチンに野生型受容体と同じ親和性で結合 し（ＩＣ５０＝０．５ｎＭ）、本発明の（以下により詳しく記述する）トランス 活性化アッセイにおいて、ルシフェラーゼ合成の誘導において機能的に活性であ る（ＥＣ５０＝０．２ｎＭ）。（ＯＢ−Ｒと同じ種類のサイトカイン受容体であ る）ＧＣＳＦ受容体のＮ−末端ドメインの点突然変異および欠失は活性に否定的 に影響することか示されているので、この発見は予期せぬものであった（Ｆｕｋ ｕｎａｇａら，１９９１ ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８５５−２８６５を参照）。 対照的に、このドメインに欠失を生じたＯＢ−Ｒ突然変異体は、活性を保持して いた。 本発明の突然変異体の解析によって、レプチン受容体の細胞外領域の３分の１ は、結合または活性化に必要でないことが示された。レプチン結合部位は残基４ ２０−６３２内に位置する。 化合物スクリーニングにＤ（４１−３２２）欠失突然変異体を 使用することは、野生型より有利であり得る。それは、小さな分子化合物は、野 生型受容体中の両方のＣＫ−Ｆ３モジュールに結合しえ、それ故合成化合物にお ける構造−活性関係を確立するプロセスでのデータ解釈が複雑になるかもしれな いからである。 本発明による突然変異体の２番目の種類は、機能性第２ＣＫ−Ｆ３ドメインを 欠失する。この種類の１つの実施形態は、置換突然変異体と呼ばれる。ある置換 突然変異体では、第２ＣＫ−Ｆ３モジュール中の（アミノ酸４２０から４９６ま で伸延している）ＣＫドメインの全部または実質的に全部を除去し、第２ＣＫ− Ｆ３モジュール中の（アミノ酸５００から６３２まで伸延している）Ｆ３ドメイ ンの全部または実質的に全部からなるアミノ酸で置換する。これにより、第２Ｃ Ｋ−Ｆ３モジュールの代わりに新しいモジュールＦ３−Ｆ３が生じる。 好ましい実施形態では、CKドメイン全体を第２モジュール中のＦ３ドメイン全 体で置換する。この突然変異体を（４２０−４９６）ＴＯ（５００−６３２）と 称する。この突然変異体は、放射能標識したレプチン結合のレベルが０．２ｎＭ では検出可能でなく、また、１００ｎＭまでのレプチンを用いたトラ ンス活性化アッセイにおいてルシフェラーゼ合成の誘導ができない。この突然変 異体は、野生型ＯＢ−Ｒの優性な負の突然変異体として挙動する。この突然変異 体を野生型ＯＢ−Ｒと共に同時発現させた時、レプチン結合または活性化は検出 不可能であった。このことは、サブユニット間のホモ２量体化相互作用の可能性 を示唆している。対照的に、欠失（４１−３２２突然変異体）の同時発現では、 野生型活性か保持された。 本発明による突然変異体の３番目の種類は、機能性細胞内ドメインを欠失する 。これらの突然変異体のある群は、細胞内残基（８６７−１１６５）の全部また は実質的に全部を欠失している。このクラスの突然変異体の好ましい実施形態は 、細胞内領域全体の欠失を有する。この突然変異体Ｄ（８６７−１１６５）は、 野生型受容体と同じレプチン結合親和性を示すが、１００ｎＭまでのレプチンを 用いたトランス活性化アッセイにおいてルシフェラーゼ合成の誘導はできない。 この突然変異体も、ＯＢ−Ｒの優性な負の突然変異体として挙動する。 さらに、本発明は、分泌シグナル配列（残基１−２２）とＯＢ−Ｒの残基４２ ０−６３２からなる可溶性の分泌形態のレプチン結合ドメインにも関する（図４ ）。このレプチン結合ドメ インは、ＣＯＳまたは他の細胞によって産生させ、次いで精製することが可能で ある。そのような精製した可溶性の結合ドメインをＯＢ−Ｒリガンドのスクリー ニングに使用すると、細胞に基づくアッセイと比較して、スクリーニングアッセ イの特異性を実質的に増すことができる。 本発明の別の態様は、上記の突然変異ＯＢ−Ｒ受容体を使用するトランス活性 化アッセイである。膜結合受容体を用いるトランス活性化アッセイについては、 先行技術で記述されている。一般に、リガンドが膜結合受容体に結合すると、一 連の細胞内事象が開始され、最終的に応答要素として知られているＤＮＡ配列の 一部分に対する分子の結合が生じる。次に、これが、その応答要素と関係した遺 伝子の転写を始める。トランス活性化アッセイにおいては、（ルシフェラーゼま たはＣＡＴのような）レポーター遺伝子を含んでいるレポーター構築物を応答要 素の転写制御下に置き、宿主細胞へ導入する。さらに、この宿主細胞は、（内因 的か組換え体発現を介してのいずれかで）目的とする受容体を発現する。リガン ドが受容体に結合すると、様々な細胞内シグナルが生成され、最終的に、レポー ター遺伝子が転写および／または翻訳される。転写および／または翻訳は、 様々な方法によって検出・測定することができ、定量することもできる。 １９９６年４月２２日に提出された同時係属中の米国仮特許出願第６０／０１ ６０５１号、および１９９６年１１月１５日に提出された （代理人事件番 号１９６８６ＰＶ２）は、共に引用によりここに援用するが、様々な天然のＯＢ −Ｒに対するトランス活性化アッセイを記述している。本発明のアッセイでは、 同じ一般的なトランス活性化アッセイプロトコルにおいて本発明の突然変異体Ｏ Ｂ−Ｒを使用して、受容体リガンド（アゴニストおよび／またはアンタゴニスト ）をスクリ−ニングし、そして、一般に受容体構造および機能を研究することが 可能である。 本発明のさらなる態様は、ａ）機能性第ＩＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失する受 容体から成る群から選択された突然変異体ＯＢ−Ｒを発現する細胞を試料と接触 させ、ｂ）レポーター遺伝子の転写または翻訳が生じるか否かを決定することか らなる、ＯＢ−Ｒリガンドが試料中に存在するか否かを決定する方法である。 本発明の別の態様は、ａ）第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部 または実質的に全部からなるアミノ酸残基の欠失を含んでいる受容体がらなる群 から選択されるＯＢ−Ｒ突然変異体を発現し、かつレポーター遺伝子と機能的に 結合したレプチン応答要素を含んでいるレポーター遺伝子構築物を含む細胞と試 料とを接触させ、そして、ｂ）レポーター遺伝子の転写または翻訳か生じるか否 かを決定する工程からなる、ＯＢ−Ｒリガンドが試料中に存在するか否かを決定 する方法である。 このアッセイの好ましい実施形態では、突然変異受容体を発現する細胞は内因 性のＯＢ−Ｒを発現しないか、あるいは単に少量の内因性受容体を発現するのみ である。従って、レポーター遺伝子の転写および／または翻訳の量は、突然変異 受容体の結合と活性化に直接相関するであろう。 レポーター遺伝子構築物は、レプチン応答要素を含むプロモーター領域および レポーター遺伝子を含んでいる。 本発明で使用できるレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来ガンマインターフェ ロン活性化配列である。ＩＲＦ−１由来の活性化配列については、先行技術に記 載されている（Ｐｉｎｅら，１９９４ ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１５８−１６７） 。 選択したプロモーターと１つ以上のレプチン応答要素を含ん でいるプロモーター領域を構築する。プロモーター領域はハイブリッドプロモー ター領域であってもよい。すなわち、天然には共に存在することのないプロモー ターと１つ以上の応答要素を含んでいてもよいし、あるいは、１つ以上の関連し た応答要素と共に天然に存在するプロモーター領域であってもよい。好ましい実 施形態では、プロモーターは、単純性疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモータ ーのような充分に特徴づけられたプロモーターであるが、選択された宿主細胞で 機能することが知られている他のプロモーターを使用してもよい。さらに、レプ チン応答要素の活性に影響を及ぼすかもしれない転写制御配列が存在しないよう に、プロモーターが最小のプロモーターであることも好ましい。 レプチン応答要素は、好ましくは、プロモーターの近位に位置する。レプチン 応答要素の機能を干渉しないという条件で、レプチン応答要素とプロモーターと の間に介在配列が存在してもよい。 本発明によれば、適切なレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来ガンマインター フェロン活性化配列５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧ−３’（ 配列番号４）である。好ましい 実施形態では、プロモーター領域は複数のＩＲＦ−１由来ガンマインターフェロ ン活性化配列を含み、さらに好ましくは、少なくとも３つのそのような配列を含 む。複数のレプチン応答要素が存在する場合、タンデムに連結するのが好ましい 。しかしながら、レプチン応答要素の機能に影響しないという条件で、介在配列 が存在してもよい。 また、ＩＲＦ−１由来ガンマインターフェロン活性化配列の代わりに、または それに加えて、当技術分野で知られている他のサイトカイン活性化配列を使用し てもよい。これらの中には、ＳＴＡＴ結合配列がある。 レプチン−ＯＢ−Ｒ結合の結果として生じる転写を検出するためには、少なく とも１つのレプチン応答要素を含んでいるプロモーター領域にレポーター遺伝子 を機能的に結合することが好ましい。レポーター遺伝子は容易に検出されるペプ チドをコードするいかなる遺伝子でもよく、あるいはその他の方法で転写または 翻訳が容易に検出できる遺伝子でもよく、一般に、宿主細胞に天然には存在しな いか宿主細胞によってほんの少量しか生産されないタンパク質をコードしている 。よく知られているレポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、（バク テリア又はホタルのいずれかの）ルシフェラーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼ 、アルカリフォスファターゼ等のような他の酵素に基づいた検出システムかある 。特に好ましい実施形態では、ルシフェラーゼがレポーター遺伝子である。代わ りとなる実施形態では、翻訳産物よりも、むしろレポーター遺伝子ＤＮＡから転 写されたｍＲＮＡを測定してもよい。このレポーター遺伝子構築物は、ａ）プロ モーターおよび少なくとも１つのレプチン応答要素を含んでいるプロモーター領 域、およびｂ）（プロモーター領域と機能的に結合した）レポーター遺伝子から なり、適当なベクター中に入れ、宿主細胞をトランスフェクションするのに好ま しく用いられる。ベクターは、選択した宿主細胞中で機能可能なプラスミド、コ スミドおよびウイルスベクターを始めとする任意の公知のベクターでよい。 宿主細胞は、都合よく培養される任意の細胞または細胞系でよい。一般に、好 ましい宿主細胞は真核生物であり、好ましくは哺乳動物であり、特に好ましい実 施形態では、（ＧＴ１−７、ＮＬＴまたはＧｎ１１のような）マウス視床下部細 胞、哺乳動 物の神経芽細胞腫細胞系、ヒト脳ニューロン（ＳＫ−ＮＭＣまたはＳＫ−Ｎ−Ｂ Ｅ２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）またはＬ（ＡＴＣＣ Ｃ ＣＬ １）のようなマウス繊維芽細胞細胞系、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨ Ｏ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴ ＣＣ ＣＲＬ １５７３）、またはＣＤＳ細胞である。 本発明の別の態様は、ｉ）推定されるリガンドを、ａ）機能性第１ＣＫ−Ｆ３ モジュールを欠失すること、ｂ）機能性ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失すること、 ｃ）機能性細胞内ドメインを欠失すること、から成る群から選択された突然変異 を有することによって野生型受容体と異なる突然変異体ＯＢ−Ｒと接触させるこ と、そして、ｉｉ）結合が生じるか否かを決定することからなる、推定されるＯ Ｂ−Ｒリガンドが試料の中に存在するか否かを決定するためのアッセイである。 結合の決定は、放射能標識リガンドの使用を始めとする任意の従来法によって 行うことができる。ある好ましいアッセイは、推定されるリガンドが存在してい る状態と欠如している状態で生じる放射能標識レプチンの結合量を比較する。推 定されるリガンドの結合量は、標識されたレプチン結合の阻害に関係があ る。 本発明の別の態様は、本発明のアッセイで使用することが可能であるような、 宿主細胞をトランスフェクションするのに適した１絹のベクターである。そのベ クターの組は、突然変異体ＯＢ−Ｒ構築物を含んでいる第１ベクターを含む。Ｏ Ｂ−Ｒ構築物は、受容体の所望の突然変異形態をコードする核酸を含んでおり、 天然のプロモーターまたは任意の他の所望の異種プロモーターの制御下にあって もよい。また、場合により、エンハンサーおよび膜上での受容体の発現を補助す る配列のような他の発現制御要素を含んでいてもよい。 また、このベクターの組は、前に記述されたレポーター遺伝子構築物を含む第 ２のベタターも含んでいる。 本発明の好ましいアッセイでは、レプチン受容体リガンドであると思われる化 合物をアッセイすることができる。この実施形態では、突然変異体ＯＢ−Ｒを発 現する細胞を前に記述したレポーター遺伝子構築物でトランスフェクションする 。推定されるＯＢ−Ｒリガンドをトランスフェクションした細胞と接触させ、レ ポーター遺伝子の転写または翻訳産物の存在を検出する。これは、同様にトラン スフェクションした細胞をレプチン と接触させて行なったコントロールアッセイで測定された転写または翻訳の量と 比較することができる。本発明のアッセイのさらなる利点は、用量依存性である ということである。すなわち、より多くのレプチンリガンド−ＯＢ−Ｒ結合が生 じるにつれて、レポーター遺伝子の転写および／または翻訳が増加するので、Ｏ Ｂ−Ｒ結合活性の定量が可能である。 さらに、カウンタースクリーンをこのアッセイの一部として使用してもよい。 カウンタースクリーンでは、同じ細胞型の別の細胞を、前に記述したレポーター 遺伝子構築物でトランスフェクションするが、ＯＢ−Ｒ遺伝子構築物ではトラン スフェクションしない。推定されるＯＢ−Ｒリガンドをトランスフェクションし た細胞と接触させ、レポーター遺伝子の転写か翻訳の存在を検出する。レプチン 受容体の存在においてのみレポーター遺伝子構築物を活性化するそれらの推定Ｏ Ｂ−Ｒリガンドは、特異的なレプチンアゴニストであることになる。 この実施形態のアッセイを利用して、レプチンのアゴニストおよびアンタゴニ ストを同定することができる。レプチンアゴニストは、レプチン擬似体のように ＯＢ−Ｒに結合する化合物であり、少なくともレプチンのそれとほぼ同等であり 、レプチ ンよりも多大であり得る細胞応答を生じる。そのような化合物は、レプチンの不 足が肥満症、糖尿病または不妊症を引き起こす状況において有用であろう。 さらにアッセイのこの実施形態を使用して、レプチンアンタゴニストを同定す ることもできる。レプチンアンタゴニストは、ＯＢ−Ｒに結合可能な化合物であ るが、天然のレプチンより小さい応答を生じる。そのような化合物は食欲不振と 悪液質の治療において有用だろう。 本発明の突然変異レプチン受容体は、さらにウエイトコントロールのための遺 伝子治療においても有用である。例えば、（第１ＣＫ３モジュールの全部または 実質的に全部の欠失を含んでいる）前記した第１の種類の受容体突然変異体を、 ＯＢ−Ｒ受容体の量が不十分なために肥満症にかかっている動物、または野生型 受容体ほど効率的に機能しないＯＢ−Ｒ受容体を持っている動物に移入すること が可能である。本発明の優性な負の突然変異体は、重量の増加の必要な動物の遺 伝子治療に有用である。すなわち、食欲不振または、多すぎるＯＢ−Ｒを持って いることによる徴候が現れ、あるいは、それらが野生型の効率よりも上回って機 能している状態に苦しむものに有用である。 以下に非限定的な実施例を示し、本発明をさらに例証する。 実施例１ 受容体突然変異体の構築 Ｄ（４１−３２２）と指称するヒトＯＢ−Ｒの欠失突然変異体を以下のように 構築した。野生型ヒトレプチン受容体をコードする完全長ｃＤＮＡを、プラスミ ドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）サンディエゴ、カリフォルニア）に挿 入した。プラスミドを残基３８で制限酵素ＳｐｈＩにより、残基３２４で制限酵 素ＳｃａＩによって開裂し、残基３９−３２３をコードする核酸をゲル精製によ って除去した。２つのオリゴヌタレオチド（５’−ＣＣＡＣＣＡＡＧＴ（配列番 号：５）および５’−ＡＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧ（配列番号：６））をアニー リングしてアダプターを作成し、残基３９、４０および３２３を再生するために 、ＳｐｈＩおよびＳｃａＩで切断したヒトＯＢ−Ｒ ｃＤＮＡにそのアダプター を連結した。 置換突然変異体（４２０−４９６）ＴＯ（５００−６３２）を以下のように構 築した。テンプレートとしてのヒトレプチン受容休ｃＤＮＡと、２つのオリゴヌ クレオチドプライマー（５’ＧＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣ ＡＡ ＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣ（配列番号：７）および５’ＧＧＡＡＡＡＴＧＣＡ ＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＣ（配列番号：８））を用 いて残基５００−６３２をコードする領域を増幅するＰＣＲ産物を生成した。こ のＰＣＲ断片を制限酵素ＢｓｍＩで開裂した。並行する実験において、野生型ヒ トＯＢ−Ｒをコードする完全長のｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。このプラスミドを、残基４１９および４９９で ＢｓｍＩによって開裂し、続いて、残基５００−６３２をコードするＰＣＲ断片 と連結した。 以下のようにして欠失突然変異体Ｄ（８６７−１１６５）を構築した。テンプ レートとしてのヒトＯＢ−Ｒ ｃＤＮＡと２つのオリゴヌクレオチド（５’ＴＴ ＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣ（配列番号：９）および５’ＧＡ ＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧ （配列番号：１０））を用いて、残基５００−８６６をコードするＰＣＲ断片を 生成した。このＰＣＲ断片を、制限酵素ＥｃｏＮＩおよびＸｂａＩで開裂した。 並行して、ヒトレプチン受容体ｃＤＮＡ挿入断片を有するプラスミドｐｃＤＮＡ ３ を、残基６４０でＥｏＮＩによって、停止コドンより下流でＸｂａＩによって開 裂した。残基６４０−１１６５をコードするＤＮＡをゲル精製によって除去し、 ｐｃＤＮＡ３プラスミド中の残存する受容体ＤＮＡを、残基６４０−８６６をコ ードするＰＣＲ断片と連結した。 実施例２ 細胞培養 サル腎臓細胞系であるＣＯＳ細胞を、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ ）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、ＭＤ）、１０％子ウシ血清、スト レプトマイシン５０μｇ／ｍｌおよびペニシリン５０Ｕ／ｍｌ（成長培地）中に 、９５％空気、ＣＯ₂５％の雰囲気下に、３７℃で維持した。細胞を約４×１０⁴ ／ｃｍ²で接種し、コンフルェントの前に継代した。 実施例３ ＣＯＳ細胞のトランスフェクション トランスフェクションの１８時間前、３５ｍｍの組織培養ペトリ皿当たり３． ５×１０⁵細胞で細胞を塗布した。結合アッセイのために、ＯＢ−Ｒ突然変異体 をコードするプラスミド（５００ｎｇ）をトランスフェクションした。 ルシフェラーゼアッセイのためには、リポソーム媒介トランスフェクションを 使用して、（下に記述の）プラスミドＡＨ３２、ＯＢ−Ｒ突然変異体およびｐＣ Ｈ１１０（各々３００ｎｇ）を細胞へ導入した。プラスミドｐＣＨ１１０はＰｒ ｏｍｅｇａ（マディソン、ウイスコンシン）から得た。特に、１００μｌのＯｐ ｔｉｍｅｍ^TM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ケーサーズバーグ、メリーランド）にプラ スミドまたはプラスミドの組合せを加えた。１０μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ ｎｅ^TM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド）を別の１００ μｌ容量のＯｐｔｉｍｅｍ^TMに添加した。２つの溶液を混合し、３０分間室偏で 培養し、Ｏｐｔｉｍｅｍ^TMで全容量を１０００μｌに調整した。リン酸緩衝食塩 液で２回細胞を洗浄した。ＤＮＡーリポソーム複合体を細胞に適用した。細胞を ６時間培養し、そのとき細胞に成長培地１ｍｌを添加した。１６時間後に、トラ ンスフェクション混合物を除去し、新しい成長培地２ｍｌを添加した。 レプチンによってトランス活性化した発現ベクターＡＨ３２を以下のように構 築した。標準的な分子生物学技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用いて、ＩＲＦ−１遺伝子（Ｓｉｍｓら、１９９３ ＭｏｌＣｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：６９０−７０２および Ｐｉｎｅら，１９ ９４ ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１５８−１６７、この２つは参照によりここに組み 込まれる）からのスタット結合要素（ＳＢＥ）を含む２つの相補性オリゴヌクレ オチドを合成し、キナーゼを作用させ、アニールした。使用したオリゴヌクレオ チドの配列は、５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣ ＣＧＡＡＴＧＡＣＧ−３’および ５’−ＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧ ＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴ−３’である。２本鎖のオ リゴヌクレオチドをｐＴＫＬｕｃのＳｍａ Ｉ部位にクローン化した。プラスミ ドｐＴＫＬｕｃは、ｐＺＬｕｃ （Ｓｃｈａｄｌｏｗら，１９９２ Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ Ｃｅｌｌ ３：９４１−９５１）中にあるホタルルシフェラーゼ遺伝子 の上流に、単純庖疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＭｃＫｎｉｇｈｔら，１ ９８２ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１７：３１６−３２４）の−３５〜＋１０までのプ ロモーター配列を含んでいる。連結したＤＮＡは、ＤＨ５ａコンピテント 細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド）を用いて、大周 菌のトランスフェクションに使用した。形質転換したコロニーから得られたＤＮ Ａを制限消化解析によってアッセイし、シーケンシングキット（ＵＳ Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌ，クリーヴランド，オハイオ）を用いた挿入断片を介してのシー ケンシングにより、各々の形質転換株中に発見されたＳＢＥオリゴヌクレオチド の配向とコピー数を確認した。クローンＡＨ３２は、同じ方向に挿入されたＳＢ Ｅの３つのコピーを含んでいることが分かり、ヒト繊維芽細胞細胞系（ＷＩ−３ ８ ＶＡ１３サフライン２ＲＡ；ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ ７５．１）とともにさら なる研究に使用した。ＡＨ３２でトランスフェクションした細胞は、ＩＦＮ−α またはＩＦＮ−γで処理した６時間後に、ルシフェラーゼ活性において６−１０ 倍の増加を示した。 実施例４ ルシフェラーゼアッセイ トランスフェクションの約２４時間後、様々な量の組換え体ヒトレブチンを細 胞に加えた。その後、２４時間細胞を培養した。細胞培養培地を除去し、２ｍｌ の氷冷したカルシウムとマグネシウムを含まないリン燐緩衝食塩液で細胞をすば やく洗浄 した。その後、メーカーのプロトコールに従って、１５０μｌのプロメガレポー ター溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マデイソン、ウイスコンシン）でアッセイのた めに細胞の調製を行った。その後、２０μｌの細胞溶解物を、１００μｌのプロ メガルシフェラーゼアッセイ試薬で反応を開始した後にサイクルモードを用いて 、ダイナテックＭＬ ３０００照度計（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、シャンティリー、Ｖ Ａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性をアッセイした。β−ガラクトシダーゼア ッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウイスコンシン）を用いて、５０μｌの 各細胞溶解物中のβ−ガラタトシダーゼ活性を決定した。各試料に対して得られ た相対的な光量をβ−ガラクトシダーゼ活性で割って結果を規，準化した。結果 を図４に示す。 実施例５ 結合アッセイ トランスフェクションの約３６時間後、結合緩衝液（０．５％ＢＳＡ−２５ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ−０．５％ＮａＮ₃を補ったハンクス平衡塩類溶液）で培養皿を 洗浄した。¹²⁵Ｉ−レプチン（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ）を結合緩 衝液で０．２ｎＭまで希釈し、０．５ｍｌを各ウェルに添加した。 未標識のレプチンを、１０ｐＭから１０ｎＭまでの範囲の最終濃度で添加した。 その細胞を３時間、室温で培養し、その後、その細胞を結合緩衝液で４回洗浄し 、０．１％ＳＤＳで溶解した。細胞溶解物をガンマ計数器で数えた。結果を図３ に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｑ 1/66 1/68 Ｚ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 ホワン，ルイ−ルイ・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 フアン・デル・プローグ，レオナルドス アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）機能性第１ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失すること、ｂ）機能性第２ＣＫ −Ｆ３モジュールを欠失すること、およびｃ）機能性細胞内ドメインを欠失する こと、からなる群から選択される突然変異を有することによって、野生型受容体 とは異なる突然変異ｏｂ受容体（「ＯＢ−Ｒ」）。 ２．ａ）第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部または実質的に全部からなるアミノ酸 残基の欠失を含む受容体、ｂ）第２ＣＫ−Ｆ３モジュール中のＣＫドメインがＦ ３ドメインの全部または実質的に全部により置換され、Ｆ３−Ｆ３モジュールを 生じている受容体、およびｃ）細胞内ドメインの全部または実質的に全部の欠失 を含む受容体、からなる群から選択される請求項１に記載の受容体。 ３．第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部からなるアミノ酸残基の欠失を含む請求項 ２に記載の受容体。 ４．アミノ酸４１−３２２が欠失している請求項３に記載の受容体。 ５．第２ＣＫドメインの全部がＦ３ドメインによって置換され ている請求項２に記載の受容体。 ６．アミノ酸４２０−４９６がアミノ酸５００−６３２で置換されている請求項 ５に記載の受容体。 ７．細胞内ドメインの欠失を含んでいる請求項６に記載の受容体。 ８．アミノ酸８６７〜１１６５が欠失された請求項７に記載の受容体。 ９．請求項１のＯＢ−Ｒを発現する細胞と試料とを接触させ、結合が生じるか否 かを決定することからなる、試料中にＯＢ−Ｒリガンドが存在するか否かを決定 する方法。 １０．ａ）機能性第１ＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失した受容体からなる群から選 択される突然変異体ＯＢ−Ｒを発現し、また、レポーター遺伝子に機能的に連結 したレプチン応答要素を含むレポーター遺伝子構築体をも含む細胞と試料とを接 触させ、ｂ）レポーター遺伝子の転写あるいは翻訳が生じるか否かを決定する、 ことからなるＯＢ−Ｒリガンドが試料中に存在するか否かを決定する方法。 １１．細胞が、ｉ）第１ＣＫ−Ｆ３モジュールの全部または実質的に全部からな るアミノ酸残基の欠失を含んでいる受容体、 ｉｉ）第２ＣＫ−Ｆ３モジュール中のＣＫドメインがＦ３ドメインの全部または 実質的に全部により置換され、Ｆ３−Ｆ３モジュールとなっている受容体、ｉｉ ｉ）細胞内ドメインの全部または実質的に全部の欠失を含む受容体、からなる群 から選択されるＯＢ−Ｒ突然変異体を発現する請求項１０に記載の方法。 １２．レプチン応答要素かＩＲＦ−１由来ガンマインターフェロン活性化配列で ある請求項１１に記載の方法。 １３．ルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳を測定する請求項１２に記載の方 法。 １４．請求項１の受容体をコードする核酸。 １５．請求項１４の核酸を含むベクター。 １６．請求項１の受容体を含む宿主細胞。 １７．さらに、レポーター遺伝子に機能的に連結したレプチン応答要素を含むレ ポーター遺伝子構築物を含む請求項１６に記載の宿主細胞。 １８．ａ）ｉ）機能性第ＩＣＫ−Ｆ３モジュールを欠失した受容体およびｉｉ） 機能性細胞内ドメインを欠失した受容体、からなる群から選択される突然変異体 ＯＢ−Ｒを発現する細胞と試料とを接触させ、ｂ）生じる結合量を決定すること からなる、 ＯＢ−Ｒリガンドが試料中に存在するか否かを決定する方法。 １９．さらに、細胞と標識したレプチンとを接触させ、推定されるリガンドの結 合量を決定するステップを含む請求項１８に記載の方法。