JP2001505416A

JP2001505416A - 白血球の細胞増殖における芽細胞の同定

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Publication number: JP2001505416A
Application number: JP52156498A
Authority: JP
Inventors: クイレン，ナザル; アール．クリューズ，ハロルド; イー．ジャフ，ジェラルド; バーセロン，マリア; ジェイ．ルーカス，フランシス; エム．ガルシア，ナンシー
Original assignee: コールターインターナショナルコーポレイション
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2001-04-24
Also published as: WO1998020154A1; EP0948639A1; DE69733963D1; EP0948639B1; US5905031A; DE69733963T2; EP0948639A4

Abstract

(57)【要約】白血病のための治療養生法を決定するために患者サンプル中の芽細胞を検出する必要性が長い間望まれてきた。本発明は、液サンプル中の芽細胞の同定のための方法及びアッセイ試薬に関する。本法は、さらに、上記芽細胞の系統の測定を可能にする。本新規の方法は、従来技術の方法よりも短い時間での芽細胞の測定を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】白血球の細胞増殖における芽細胞の同定関連出願に対するクロス・リファレンス本願は、1995年５月18日に出願された同時係続中の特許出願逐次番号第08／44 4,051号の一部継続である。本発明の背景細胞の酵素は、細胞間の、代謝の多様性、分化、及び細胞病理学の鍵である。しかしながら、細胞の酵素は、極めて多様である。それらの働きは、宿主の防御、膜を通る分子の輸送、エネルギー生産、及びその細胞構成成分の合成である。千個程多くの酵素がいずれの所定の細胞内でも作用可能であるかもしれないが、数ダースの酵素は、いずれか１つの細胞型の作用を定めることができる。さらに、酵素レベルは、その細胞の働き又は分化の状態に依存して、10〜100の要因によって変化することができる。さらに、これらの同一の酵素は、同一の機能性の表現型をもつ静止細胞内、及び異なる働きを遂行する細胞内では、非検出性であることができる。細胞内の化学構成成分の形態学的分類は、細胞化学的染色の使用により助けられた。使用された上記方法は、酵素的な技術であり、そして一般に、酵素活性についての従来技術のアッセイの全てが、細胞化学的比色分析アッセイである。従来技術の酵素活性計測の例は以下のものである：１）α−ナフチル・アセテートを用いて計測されるアセテート・エステラーゼ活性が白血球の細胞型を同定するために他のエステラーゼ活性と共に使用されており、そして一般に、正常な単球及び巨核球内で、そして急性骨髄単球性の白血病、急性単球白血病及び急性赤白血病の芽細胞内で、高い。２）ナフトール−AS−Ｄクロロアセテートを用いて計測されるクロロアセテート・エステラーゼ活性は、一般に、正常な前骨髄球及び好中球内で、そして成熟した急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性の白血病及び急性骨髄単球性の白血病の芽細胞内で、高い。３）Ｉ−ナフチル・ブチレートを用いて計測されるブチリル・エステラーゼは、異なる細胞型を同定するために使用されており、そして一般に、正常な単球内で、及び急性骨髄単球性白血病及び急性単球性白血病の芽細胞内で、高い。ブチリル・フルオレセインは、ホスホリパーゼＡ₂、プロスタグランジン及びロイコトリエンの生産を導く生化学カスケードにおける初期酵素のための基質でもある。４）ホスファターゼ活性のアッセイは、多くの異なる細胞型を同定するためにエステラーゼ活性のアッセイと共に使用されてきた。単球、好中球及びＴ−リンパ球は比較的高い酸性ホスファターゼ活性を有し、一方、Ｂ−リンパ球は比較的低い酸性ホスファターゼ活性を有する。さらに、急性前骨髄球性白血病及び急性骨髄単球性白血病は比較的高い酸性ホスファターゼ活性をもつことが示されている。５）β−グルクロニダーゼの誘導体は、PMNの働きを阻害する異なる非ステロイド性抗−炎症薬（NSAIDS）の能力のテストにおいて多形核リンパ球(PMN)内の脱顆粒を計測するために使用されてきた。末梢血Ｔ−リンパ球は、末梢血Ｂ−リンパ球よりも高いβ−グルクロニダーゼ活性を示す。フルオレセイン・ジグルクロニドは負電荷をもつ化合物である。他の糖誘導体がＢ−グルコシダーゼのアッセイにおいて細胞膜を通過することを助けるために、リソソーム作用性の洗剤（Ｎ−ドデシルイミダゾール）が使用された。フロー・サイトメトリーによる酵素の研究は、1957年に始まり、その時、Lowr y(J．Biol．Chem.，224：1047-1067(1957))は、NADPを使用した細胞内の蛍光顕微鏡によりデヒドロゲナーゼを研究した。Rotman(J．Immunology，Vol．120，No .8，pp．1460-1464(1978)；PNAS USA，Vol．75，No.2，pp．720-724(1978)；及びPNAS，Vol．60，pp．660-667(1968))は、リボソーム内の９−ガラクトシダーゼを研究した。1969年、Hulett(Science，166：747-749(1969))は、フルオレセインをもつエステラーゼ化合物を調製した。ナフチルアミン、ナフトール及びクマリン誘導体は、Dolbeare and Smith(Clin．Chem．23/8，1485-1491(1977))により研究された。イオン化カルシウム、細胞内pH、グルタチオン及び膜電位についての機能的細胞アッセイはRabinovitch(NYAS，667：252(1990))により研究され、そしてValet(NYAS，667：233(1993))は、白血球におけるファゴサイトーシス、レスピレイトリー・バースト、活性化抗原、及びプロテアーゼ活性を記載している。酸化的バーストのための細胞基質としてのジクロロフルオレッシン・ジアセテート（２’，７’−ジクロロフルオレッシン・ジアセテート、以下、DCFH -DAという）は、Bass，et al.，J．Immunology，Vol．130，No.4，pp．1910-191 7（1983）により、最初に示唆された。それは、酸素ラジカルに敏感である。DCF H-DAの使用は、好中球細胞内のペルオキシダーゼ又はカタラーゼから生じた酸化物バーストを測定するために使用された。このコンセプトは、DCFH-DAとの反応が、バクテリアを中和するために十分な酸素ラジカルが存在するかどうかを決定するための好中球細胞の機能テストを提供するということであった。それ故、好中球機能のテストは、疾患との戦いにおけるその効力を測定するということであった。 Bass et al．は、1983年にDCFH-DAを使用した好中球における酸化的バーストを、最初にモニターした。Bass et al．は、非蛍光ジクロロフルオレッシン・ジアセテート(DCFH-DA)の、高蛍光化合物２’，７’−ジクロロフルオレッセイン( DCF)への変換が数段階において生じるということを提案した。第１に、DCFH-DA は、細胞膜を横切って輸送され、そしてエステラーゼにより脱アセチル化されて、非蛍光化合物、２’，７’−ジクロロフルオレッシン（DCFH）が形成される。この化合物は、細胞内に捉えられる。次にDCFHは、ペルオキシド（H₂O₂）の作用を通じてDCFに変換される。 DCFの蛍光の計測は、それ故、H₂O₂の生産の尺度である。 DCFHの酸化に対するペルオキシダーゼの貢献は知られていない。溶液中、DCFH の酸化は、ペルオキシダーゼにより著しく高められる。しかしながら、ミエロペルオキシダーゼの阻害剤であるアジドも、DCFHの細胞内酸化を高める。Bass et al．は、この増加が、カタラーゼ、細胞により作られたペルオキシドとの相互作用についてDCFHと競合する酵素、のアジド仲介阻害に因るということを推定した。Rothe，Oser and Valet，Naturwissenschaften，75，354-355(1988)は、DCFH- DAよりも高感度の、酸化的バースト活性のプローブとして、1988年に好中球における酸化的バースト活性のフロー・サイトメトリーのインジケーターとしてジヒドロローダミン123（DHR123）を導入した。OserとValetは、DHR 123が、刺激により作り出される比較的小さな酸化的バーストの増加、例えば、化学走性のペプチドf-Met-Leu-Pheを検出することができることを発見した；この増加は、DCFH- DAによってはほとんど計測されることができない。 DCFH-DAとDHR 123の両方が、多形核白血球の酸化的バーストの産物を計測するために使用される。酸化的バーストの間、細胞酵素、NADPHオキシダーゼとスーパーオキシド・ジスムターゼは、スーパーオキシド・アニオン（Ｏ₂ ^-）と過酸化水素（H₂O₂）を以下の反応において、生産する：ミエロペルオキシダーゼが存在するとき、それは過酸化水素を分解する： Royall and Ischiropoulos，Arch．Biochem．& Biophys.，Vol．302，No.2，3 48-355（1993）は、DCFH-DA，DCFH、及びDCFへの培養内皮細胞の細胞膜の透過性についてのいくつかの実験を行った。彼らの実験においては、RoyallとIschirop oulosは、DCFH-DAを含有する培地中で細胞をインキュベートし、そして次に、DC FH-DAを含まない培地中でそれらの細胞を洗浄した。次に、彼らは、DCFH-DA，DC FH、及びDCFの細胞内及び細胞外濃度を計測した。彼らは、１時間後に細胞からの、90％を超えるDCFHとDCFの損失があることを発見した。これは、DCFHとDCFが、内皮細胞内に捉えられていないことを示している。細胞膜を横切るプローブの拡散についての彼らの実験において、Vowells et a l.，J．Imm．Methods，178，pp．89-97(1995)は、PM Aで刺激された正常な顆粒球内で計測された蛍光シグナルが、DCFH-DAよりもDHR 123について７倍高かったことを発見した。0.017％のアジドの添加は、140％程D CFH-DAからのシグナルを、そして25％程DHR 123からのシグナルを、増加させた。Vowells et al.は、慢性肉芽腫症(CGD)、NADPHオキシダーゼ酵素複合体における欠陥により引き起こされる稀な遺伝子病をもつ患者からの顆粒球と正常な顆粒球の混合物についても研究した。Vowells et al.は、DCFH-DAではなく、DHR 123 が、正常／CGD顆粒球の混合物において0.1％程の小さな正常サブ集団を検出することができたことを発見した。白血病のための治療養生法を決定するための患者サンプル中の芽細胞を検出する必要性が長い間、望まれていた。従って、芽細胞を正確に測定するために、Wr ight染色が使用される。これは、芽細胞の存在を確認し、そしてそれらの脂質タンパク質及び核酸濃度により細胞を同定するための古典的染色技術である。次に、芽細胞内のペルオキシダーゼの存在又は非存在を示すための顕微鏡スライド調製物上の比色ペルオキシダーゼ染色が使用される。細胞化学染色のパネルは、これらの悪性の細胞型を顕微鏡により同定するために使用される。次に、これらの特異的な染色技術の使用は、関連する細胞系を確立することができる。これらの技術においては、上記細胞は代謝的に活性ではない。長年にわたり、手による示差的カウントとして知られた、血液フィルム上の白血球、赤血球、及び血小板の顕微鏡検査は、血液学的異常の診断のための基礎として認められてきた。しかしながら、この手による方法は、高価、かつ、退屈であり、高い技能者を必要とし、そして比較的高い固有の誤り率という評価をもつ。この手による方法の高い可変性は、その調製技術、サンプル・サイズ、そしてオペレーターの主観性に関する。さらに、急性の白血疾患者は、骨髄細胞の生産の役割に対する効果をもち、そして血液細胞の形態学を変更することができる医薬により、しばしば、処理される。そしてこれは、これらの細胞を正確に同定することを困難にする。結果は、主観的解釈に基づく。臨床的運用は、１％未満で、芽細胞を測定することが好ましいであろう。初期の検出が最も好ましい。なぜなら、化学療法及び正常な細胞を殺す他の苛酷な処理並びに異常細胞から成る処置が、上記処置の悪影響を最小化するために投与されることができるであろうし、そしてより低い検出レベルも、医薬療法の効果をモニターすることを可能にするであろう。本発明の要約本発明は、液体サンプル中の芽細胞の同定方法であって、個体から体液サンプルを採取し、そのサンプルは代謝的に活性な細胞を含有し；上記液体サンプルを使用して、少なくとも１のテスト・サンプルを調製し、そのテスト・サンプルは代謝的に活性な細胞を含有し；調製されたテスト・サンプルのそれぞれにアッセイ試薬を添加し、蛍光生成指示薬を含有する上記アッセイ試薬は、上記アッセイ試薬が上記細胞内の酵素と反応する前に非蛍光性の第１の状態をもち、そして上記アッセイ試薬が上記細胞内の上記酵素と反応した後、450nmより大きな波長において励起されることができる蛍光性の第２の状態をもつ、その能力について選択されており、上記アッセイ試薬は、上記細胞内の上記酵素との反応前、代謝的に活性な細胞の自己−蛍光よりも小さな蛍光をもち；検出を行うことができる装置内で上記テスト・サンプル中の上記細胞についての光散乱の２つのチャンネルと蛍光を検出し；そして上記サンプル中に含有される芽細胞を同定するために、上記細胞について上記蛍光産物と上記光散乱を分析する、前記同定方法に関する。本発明は、液体サンプルが少なくとも２つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、酸化還元酵素と反応する第１のアッセイ試薬に添加され、そして第２のテスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応するアッセイ試薬に添加される、方法にも関する。本発明は、液体サンプルが少なくとも３つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、酸化還元酵素と反応する第１のアッセイ試薬に添加され、第２のテスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加され、第３のテスト・サンプルが、ホスファターゼ酵素と反応する第３のアッセイ試薬に添加され、そして第４のテスト・サンプルが、グルクロニダーゼ酵素と反応する第４のアッセイ試薬に添加される、方法にも関する。本発明は、さらに、液体サンプルが少なくとも４つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、酸化還元酵素と反応する第１のアッセイ試薬に添加され、第２のテスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加され、第３のテスト・サンプルが、ホスファターゼ酵素と反応する第３のアッセイ試薬に添加され、そして第４のテスト・サンプルが、グルクロニダーゼ酵素と反応する第４のアッセイ試薬に添加される、方法に関する。本発明は、細胞酵素活性の計測による液体サンプル中の芽細胞の同定のためのアッセイ試薬であって、３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート及び３’，６’−フルオレセイン・ジブチレートから選ばれたアッセイ化合物と、生理学的に許容されるバッファーを含み、そして代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満の純度及び４〜7.5のpH をもつ、前記アッセイ試薬にも関する。好ましくは、このアッセイ試薬は、凍結乾燥される。図面の簡単な説明目下、好ましい図面態様を示すが、本発明が図示されたまさにその手段及び配置に限定されないと理解される。図１Ａ，１Ｂ，１Ｃ、及び１Ｄは、本発明に係る４つのアッセイ・プロトコールのフロー・チャートである；図２は、Wright染色法により得られたパーセント芽細胞に比較した、本発明に係る方法を使用したフロー・サイトメトリーにより得られたパーセント芽細胞の測定値の相関を表す。図３Ａと３Ｂは、骨髄芽細胞の指標を提供するための本発明に係るアッセイ試薬の使用を示すヒストグラムを表す。図４Ａと４Ｂは、芽細胞が骨髄芽細胞ではないという指摘を提供するために本発明に係るアッセイ試薬の使用を示す、リンパ球、単球、顆粒球、及び芽細胞のヒストグラムを表す。図５Ａと５Ｂは、芽細胞がリンパ球細胞であるという指摘を提供するために本発明に係るアッセイ試薬の使用を示す、リンパ球、単球、顆粒球、及び芽細胞のヒストグラムを示す。好ましい態様の詳細な説明以下のアウトラインを、本発明の好ましい態様を説明するために使用する：Ｉ．アッセイのタイプ II．代謝的に活性な全細胞の調製 III．アッセイ化合物 IV．アッセイ化合物を含有するアッセイ試薬の調製Ｖ．アッセイ条件 VI．アッセイ・プロトコール VII．データ分析Ｉ．アッセイのタイプアッセイ試薬が、病気の存在、病気の進行、薬の効能及び細胞分化の表れを提供するために、代謝的に活性な全細胞の酵素活性を測定するための方法において使用されることができるということが発見されている。より特に、１以上の酵素の活性における変化が、白血病の如き病気の存在及び進行の表れを提供するために調べられることができる。さらに、酵素活性の計測は、特定の医薬又は処置に対する応答の指標を提供することができる。なぜなら、それらの酵素の活性は、その薬物がその病気と首尾よく戦い、それを調節し又は治療する場合、変化するであろうからである。さらに、白血病性細胞の分化が酸化還元酵素及び１以上の選ばれた酵素の存在により測定されることができることが認められている。II ．代謝的に活性な全細胞サンプルの調製上記アッセイ試薬を、代謝的に活性な全細胞アナライトと反応させる。代謝的に活性な全細胞は、組織、血液、細胞培養物又は他の細胞含有成分、例えば、骨髄吸引液又はリンパ節から、例えば生検から調製された、脊髄液、腹膜、又は組織細胞懸濁液中に含有される。好ましい態様においては、代謝的に活性な全細胞は、全血又は骨髄吸引物から得られる。好ましくは、代謝的に活性な全細胞は、細胞のタイプに分けられる。分析されるべき代謝的に活性な細胞は、知られた技術、例えば、示差的溶解（differential lysis）、示差的遠心分離、及びアフィニティー・カラムにより単離される。しかしながら、他の細胞からの、試験されるべき細胞の分離は、常に不可欠ではない。上記細胞は、場合により、不所望の細胞の溶解又は物理的分離により、いずれかの細胞外酵素を除去するために、通常、洗浄される。これを達成するためのいくつかの好ましい技術を、図１Ａ−１Ｄに要約する。分離された代謝的に活性な細胞の分析は、特定の酵素分析についての特異性を提供する。例えば、代謝的に活性な細胞が白血球血液細胞であるとき、上記方法は、上記細胞アナライトから白血球細胞を分離し、血清又は血漿酵素のいずれをも除去するために残存白血球細胞を洗浄し、上記白血球細胞をアッセイ試薬化合物と接触させ、そして上記白血球細胞からの蛍光を測定する、工程を含む（図１Ｂ参照）。上記方法の変法は、血清又は血漿酵素のいずれをも除去するために細胞アナライトを洗浄し、上記細胞アナライトとアッセイ化合物を接触させ、上記細胞アナライトから上記白血球細胞を分離し、そして上記白血球細胞からの蛍光を測定する、工程を含む（図１Ａ参照）。さらに、白血球血液細胞、有核赤血球血液細胞、及び血小板アナライトの細胞アナライトのために使用されることができる他の方法は、血清又は血漿酵素のいずれをも除去するために上記細胞アナライトを洗浄し、上記アナライトとアッセイ化合物を接触させ、そして上記アナライトからの蛍光を測定する、工程を含む（図１ｃ参照）。細胞がアッセイ時に代謝的に活性であることを確認するために、その細胞の生存度をアッセイ時にチェックすることが望ましい。いくつかのテストが、細胞の生存度を測定するために有用である。トリパン・ブルーは、細胞内に拡散する青色染料であり、そしてその細胞が生存している場合、細胞により除去される。死んだ細胞は、上記染色を除去しないであろうし、そして青色を呈するであろう。ヨウ化プロピジウムは、DNA-RNA染料であり、それは、その細胞が死んでおり、かつ、膜が傷ついている場合、その細胞に侵入し、そしてそのDNA-RNAを染色する。フルオレセイン・ジアセテート−ヨウ化プロピジウムは、生きている細胞が緑色の蛍光を発することを引き起こすであろう。なぜなら、そのフルオレセイン・ジアセテートは加水分解されるであろうし、一方、死んた細胞は、ヨウ化プロピジウムから赤色の蛍光を発するであろうからである。成熟な赤血球は、細胞分裂を経験せず、そしてそれ故、（細胞分裂の指標である）２，３−ジホスホグルコース・デヒドロゲナーゼの存在についてのテストは、生存度のために有用なテストである。本発明のアッセイは、哺乳類細胞、例えばヒト細胞内の酵素の細胞内濃度を計測するために特に有用である。しかしながら、上記アッセイは、代謝活性をもつさまざまな又は他のタイプの細胞においても有用であるはずである。III ．アッセイ化合物本発明に従えば、アッセイ試薬は、代謝的に活性な全細胞内の酵素活性を測定するために製造される。このアッセイ試薬は、上記細胞が、少なくともそのアッセイの期間にわたり代謝的に活性な状態で残存するような細胞に、適したものでなければならない。このアッセイ試薬は、細胞壁を通過することができる少なくとも１のアッセイ化合物を含む。上記アッセイ化合物は、それが細胞内に伝達されることができるために十分に小さくなくてはならない。約5,000未満の分子量をもつアッセイ化合物が、目下、好ましい。上記アッセイ化合物は代謝的に活性な全細胞内に含まれる酵素と反応する前の第１の状態、及びそれが、上記細胞内の酵素と反応した第２の状態をもつであろう。酵素との反応後、アッセイ化合物は、ほぼ可視レンジの波長、例えば、好ましくは、約450〜500ナノメーター（nm）の間の波長において、励起され（蛍光を発するようにされる）ことができる。上記アッセイ化合物は、通常、約480〜620nmの、好ましくは、500 〜600nmの、そしてより好ましくは500〜550nmの範囲内で発光するであろう。上記細胞の自己蛍光は、約500nm未満で最も優勢である。好適なアッセイ化合物は、DCFH-DA、ジヒドロローダミン123、及びニトロブルー・テトラゾリウムを含む。これら３つのアッセイ化合物は、上記酸化還元酵素と反応する。好ましくは、上記アッセイ化合物は、脱離基と指示基を含むであろう。脱離基は、上記酵素による解裂について選択される。この指示基は、脱離基に結合されるときの第１の状態、及びその脱離基が上記酵素により上記指示基から解裂されるときの第２の状態をもつ、その能力について選択される。上記指示基は、好ましくは、蛍光生成性及び化学発光性化合物から誘導される。指示基は、脱離基に結合されるとき、クエンチされなければならない。用語“クエンチされた”とは、指示基が、脱離基に結合されたときに蛍光又は化学発光をほとんどもたないということを意味する。脱離基が指示基から分離されるとき、得られた指示化合物は、蛍光をもつであろう。好適な蛍光生成性指示化合物は、キサンチン化合物を含む。好ましくは、この指示化合物は、フルオレセインである。エステラーゼ酵素のための脱離基は、好ましくは、２〜30の間の炭素原子を含むカルボン酸の合成により調製される。カルボン酸は飽和又は不飽和であることができる。カルボン酸は、好ましくは、２〜24の炭素を、そしてより好ましくは、４〜24の炭素原子を含む。上記カルボン酸のアナログを使用することもできる。カルボン酸は、天然又は合成起源であることができる。例は、酪酸、カプロン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸である。本発明のためには、好ましい脱離基は、アセテート及びクロロアセテート及びブチリレートから選ばれるであろう。エステラーゼ酵素のための好ましいアッセイ化合物は、FDA（3’，６’−フルオレセイン・ジアセテート）、FDClAc（３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート）、FDB(３’，６’−フルオレセイン・ジブチレート）から選ばれる。FDA，FDClAc、及びFDBは、ヒト組織中の多くの異なるエステラーゼのための基質である。FDA（３’，６’−フルオレセイン・ジアセテート）は、フッ化ナトリウムと併合されるとき、単球系統の細胞のための酵素活性を阻害することが発見されている。アッセイ試薬、FDA-NaF中、フッ化ナトリウムの濃度は、約300〜 1,500ミリグラム／リッター、好ましくは500〜1,000ミリグラム／リッターの範囲にあるであろう。ホスファターゼのための脱離基は、好ましくは、ホスフェート、ホスファチジン酸、リン脂質、及びリンタンパク質の合成により調製される。これらの化合物のアナログも、使用されることができる。例は、ATP，ADP，AMP、及びサイクリックAMP（c-AMP）である。本発明のために、好ましい脱離基は、ホスフェートであろう。ホスファターゼのために好ましいアッセイ化合物は、３’，６’−フルオレセイン・ジホスフェート、４’（５’）−カルボキシ・フルオレセイン・ジフェニルホスフェート、及びフルオレセイン・ジフェニルホスフェートである。好ましくは、アッセイ化合物は、３’，６’−フルオレセイン・ジホスフェート (FDP)である。FDPを使用するとき、好ましいアッセイ試薬は、酵素、酸性ホスファターゼにより加水分解されることができる３’，６’−フルオレセイン・ジホスフェート・アンモニウム塩（FDP-AS）である。糖類のための脱離基は、炭水化物、糖、糖タンパク質、及び糖脂質の合成により調製される。β−グルクロニダーゼ酵素のための好ましいアッセイ化合物は、フルオレセイン−９−Ｄ−ジグルクロニドである。フルオレセイン −９−Ｄ−ジグルクロニドは、リボソーム酵素β−グルクロニダーゼにより加水分解される。アッセイ化合物は、そのアッセイのために許容されるレベルまで精製される。上記アッセイ化合物の合成からの、副反応生成物、副産物、及び出発材料であってそのアッセイの有用性を減ずるであろうものを除去することがひじょうに重要である。生理学的に許容されない不純物は除去されなければならない。さらに、不純物から生成するバックグラウンド・ノイズは、代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満でなければならない。不純物が存在するとき、その不純物は、酵素活性に対する阻害剤であることができることが判明している。さらに、その出発材料のいずれかの中の金属不純物が、酵素を害し、上記アッセイ化合物の加水分解を防止し、そして上記酵素アッセイの正確さを妨害することができる。さらに、不純物は、細胞の天然の蛍光に付加されて、酵素により生成された蛍光の検出を妨害することができる一定レベルのバックグラウンド・ノイズを作り出すであろう、バックグラウンド蛍光を作り出すであろう。蛍光不純物は、細胞により取り込まれることができ、そして時間に対する蛍光率の計測は、上記の細胞の蛍光不純物の取り込みにのみ起因する増加する偽の蛍光率を示すであろう。これは、そのアッセイが酵素の存在又は非存在を測定するために行われる場合、特に問題である。なぜなら、この不純物は、酵素活性に偽って帰されるようである蛍光率（a rate of fluorescence）を示すであろう。上記蛍光不純物は、それらが細胞内の酵素のベースライン検出をぼんやりさせないレベルまで、除去されなければならない。このベースライン検出は、指示基の対数希釈を分析することにより確立されることができる。好ましくは、上記不純物は、その不純物の蛍光が代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満であるように、除去されなければならない。それ故、上記アッセイ試薬中の不純物は、約１×10^-6Ｍの遊離指示基により生成される蛍光未満、そしてより好ましくは、約１×10^-7Ｍの遊離指示基により生成される蛍光未満の濃度まで除去されるべきことが好ましい。これは、SLM Comp any of Chicago，Illinoisにより製造された光子計数スペクトロフルオロメーター上で10分間にわたり計測されるとき、１cm経路長のキュベット内で１×10^-7〜 10^-8Ｍ、好ましくは、５×10^-8Ｍにおいて標準としてローダミン110を使用して、100,000光子カウントに相当する量である。これは、細胞偽陽性が最高の感度環境において10分間の期間にわたり、全く検出されない場合における、フロー・サイトメーター上での使用レベルに相当する。これは、１／100,000未満、より好ましくは、１／500,000未満、最も好ましくは、1／1,000,000未満の不純物の濃度を必要とすることが分っている。不純物の存在は、化合物の保存安定性における減少を引き起こし、増加されたバックグラウンド蛍光を導く増加された自己加水分解をもたらす。化合物は、その化合物（又はその化合物を含有する試薬が４℃で30日間、好ましくは90日間、より好ましくは180日間、最も好ましくは１年間、保存されるとき、そのバックグラウンド蛍光が、それぞれ、上記時間期間にわたり、10％未満、好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満、増加するように、不純物を含んではならない。精製されたアッセイ化合物は、大気圧下で乾燥窒素上、密閉容器内で保存されることができ、又は凍結乾燥され、そして密閉バイアル内で保存されることができる。安定性を計測するための時間における出発点は、通常、そのアッセイ化合物の精製が終了した直後であるが、それは、アッセイ試薬の調製が終了した直後の如きいずれの時であることができる。IV ．アッセイ化合物を含有するアッセイ試薬の調製アッセイ試薬は、代謝活性細胞と適合性である必要がある。アッセイ試薬は、約250ミリモル〜350ミリモルの、好ましくは、275ミリモル〜320ミリモルの重量オスモル濃度をもたなければならない。さらに、アッセイ試薬のpHは、約４〜７の間、好ましくは、約5.0〜6.5の間であろう。アッセイ化合物は、７を上廻るpH で自己加水分解し、これは、凍結乾燥されたアッセイ試薬の保存安定性、再構築された安定性を減少させるであろうし、そして偽陽性を与えることによりそのアッセイに影響を及ぼす。さらに、細胞内アッセイの効果は、そのアッセイ試薬における１以上の成分の添加により実質的に改良される。改良の例は、反応時間の減少、標的酵素についての高められた選択性、競合酵素反応の減少、酵素反応のシグナルの増加、他の非標的酵素に対するアッセイされた酵素の反応性の増加、細胞内の指示基の保存時間の増加、その他の同様の有利な結果を含む。追加の成分は、他の非標的酵素を超えて標的酵素の活性を増加させるための、バッファー、補因子、モジュレーター、インヒビター、アクチベーターを含み、可溶化成分及び保持成分も、酵素アッセイの結果を改善するためのアッセイ試薬中に含まれることができる。これらの成分は、アッセイされる代謝的に活性な全細胞（whole cell）にとって生理学的に許容性である。上記バッファーの化学的性質は、細胞酵素とのアッセイ化合物の反応性にとって重要である。上記細胞に阻害効果を全く示さないバッファー成分を、使用することができる。好適なバッファー成分は、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチノレ）メチノレ−２−アミノエニタンスノレホン酸(TES)、Han ks Balanced Salt Solution（HBSS）、２−Ｎ−モルフォリノエタンスルホン酸( MES)、及びHEPESである。さらに、代謝エネルギー源、例えば、糖（グルコース）がHBSSを使用するときに、添加されることができる。好ましいバッファー成分は、酸性溶液のためのMESである。アッセイ化合物は、水性培地中で可溶性でなければならない。溶解性は、培地とアッセイ化合物の混合を通して光のパーセント透過率（又は吸収）を使用した光散乱により計測される。分光光度計上で計測されるとき、アッセイ化合物は、蒸留水又は脱イオン水に対してブランクされた340ナノメーター（25℃）において、1,000未満の、好ましくは800朱満の、そして最も好ましくは、500未満のミリ吸光単位のアッセイにおいて使用されるべき濃度においてバックグラウンド・カラーをもたなければならない。アッセイ化合物は、通常、0.5〜10mMの濃度において使用されるであろう。溶解度を測定するための有用な濃度は５mMである。好ましくは、アッセイ時間の間に、酵素と反応するであろうアッセイ化合物の２倍過剰量が、水性培地中に溶解性でなければならない。過剰のアッセイ化合物が好ましい。不十分な量のアッセイ化合物が提供される場合、その酵素反応は、上記アッセイ化合物を完全に加水分解するであろうし、そしてそのアッセイのダイナミック・レンジが限定されるであろう。得られた指示化合物は、限定された蛍光持続期間をもつであろう。しかしながら、過剰のアッセイ化合物が使用されるとき、その酵素反応はアッセイ化合物を連続的に加水分解するであろうし、そして蛍光持続期間は、酵素反応の間、継続するであろう。これは、アッセイ化合物の１以上の反応状態を感知するための、長い時間期間をもつという利点を提供する。さらに、可溶化成分は、代謝的に活性な細胞内へのアッセイ化合物の伝達を助けるために、アッセイ化合物と共に、利用されることができる。この可溶化成分は、その細胞に悪影響を及ぼさずに、上記アッセイ化合物として細胞脂質２重層を通過せしめるために有効な量で存在する。可溶化成分は注意して選択されなければならない。なぜなら、悪い可溶化成分は溶解又は細胞死を引き起こすことができるからである。アッセイ化合物が、1,000より大きな、800より大きな、又は500ミリ吸光単位より大きな（アッセイにおいて使用されるべき濃度において）バックグラウンド・カラーをもつとき、溶解性成分は、そのバックグラウンド・カラーを、1,000 未満、800未満、又は500未満のミリ吸光単位まで低下させるために使用されることができる。しかしながら、その可溶化成分の濃度は限定される。高濃度の可溶化成分が使用される場合、代謝的に活性な細胞が溶解されるであろう。低濃度の可溶化成分が使用される場合、アッセイ化合物の十分な溶解度が達成されないであろう。可溶化成分の有効量は経験的に決定されることができるが、典型的には、そのアッセイ化合物の10.0重量％未満である。好適な可溶化成分は、非イオン界面活性剤、ポリエチレン・グリコール、ジメチル・スルホキシド（DMSO）、及びマンニトールを含む。商業的に入手可能な可溶化製品は、ICI Americas，Inc.から入手可能なBRIJ 35(ポリオキシエチレン・ラウリル・エーテル)及びTWEEN 20（プロピレン・オキシド及びプロピレン・グリコールからの疎水性塩基によるエチレン・オキシド）、並びにBASF Wyandotte から入手可能なPLURONIC 25 R8（プロピレン・オキシド及びプロピレン・グリコールからの疎水性塩基によるエチレン・オキシド）、及びRohm and Haas Companyから入手可能なTRITON×100(オクチルフェノキシ・ポリエトキシ・エタノール)を含む。好ましい可溶化成分はDMSOである。アッセイ化合物がその中に溶解されるところの培地は、細胞が、そのアッセイの少なくとも経過時間にわたりその培地中で代謝的に活性で残存することができるように、その細胞と適合性でなければならない。培地は好ましくは無菌であり、そして細胞の生理学に悪影響を及ぼさないエンドトキシン及び化学物質を含まない。アッセイ化合物は、好ましくは、それが使用されるところの濃度において、培地中で完全に溶解性である。アッセイ化合物は、好ましくは、飽和又は懸濁レベルまでの又は濁り(turbidity)が生じる前までの濃度内で使用される。培地は、その中にアッセイ化合物及び他の添加物が溶解されるところの生理学的食塩水又は緩衝化された溶液（ホスフェート緩衝化生理食塩水）であることができる。この培地は、好ましくは、代謝的に活性な細胞とアッセイ化合物のアッセイ混合物のpHが、酵素加水分解のために適当な点で維持されるように、バッファー剤を含むべきである。保存目的のためには、化合物と培地の混合物は、凍結され又は凍結乾燥されるべきであるが、好ましくは、凍結乾燥されるであろう。凍結乾燥は、その溶媒の昇華が真空の適用の間に生じる条件下で、生じるはずである。“融解戻り(melt back)”といわれる、液体が、気相に行く前に団体上に形成する温度におけるサンプルへの真空の適用は、その化合物の分解を引き起こすことができる。適当な温度が化合物のそれぞれのために決定されるべきであり、そして好ましい温度は、主に水性である溶液のためには、通常、−５℃〜−35℃である。凍結乾燥の熱サイクルの間、熱が、追加の水分を追い出すために昇華後に、適用されることができる。製品温度は、加えられた熱を決して超えてはならず、そして製品は、15〜72時間にわたり室温まで戻されなければならない。真空は、乾燥窒素を入れることにより大気条件に戻されなければならない。製品は、大気圧及び大気温度で栓をされる。凍結乾燥された化合物は、４℃〜８℃で保存され、そしてエンドトキシン不含脱イオン水を使用して再構築されることができる。基質の非特異的加水分解である、自己加水分解は、標的酵素から得られない細胞蛍光を作り出す。基質化合物の安定性は、自己加水分解の防止における重要な要因であることが証明されている。アッセイ化合物及び／又はアッセイ試薬は、自己蛍光又は化学発光が、酵素による解裂の前にそのアッセイ化合物の分解により全く作られないように、十分に安定性でなければならない。好ましくは、上記アッセイ化合物又はアッセイ試薬が20℃で30日間、好ましくは90日間、より好ましくは、180日間、そして最も好ましくは、１年間、保存されるとき、そのアッセイ試薬は、100,000以下の光子カウントを示す。光子は、先に記載されたようなローダミン110標準に対して、脱イオン水中、アッセイ化合物の２ミリモル溶液及び１cmの経路長を使用することにより計測されることができる。蛍光不純物は、アッセイの間に生成される蛍光の10％未満の原因でなければならない。許容されるアッセイ試薬は、以下の３つの特徴をもたなければならない；（１）細胞により非特異的に吸収される、低レベルの生来の遊離の蛍光が存在しなければならない。従って、低レベルの蛍光不純物が存在しなければならない。これらの不純物の許容され、かつ、好ましいレベルは既に記載された。（２）試薬は、それが調製された後すぐに、それが使用される必要がないように時間にわたり安定性でなければならない。特定の不純物及び特定の添加物は、試薬の蛍光を増加させる自己加水分解率を高めることができる。許容され、かつ、好ましい安定性については既に討議した。（３）試薬は、酵素と試薬の間の反応の結果として生成された蛍光が容易に計測されることができるように、計測される酵素との十分に高い反応率をももたなければらない。１の側面においては、反応率は、アッセイ試薬と細胞内の標的酵素の反応の結果として生成された蛍光が、そのアッセイにおいて生成された他の非特異的蛍光よりも、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも10倍、より好ましくは、少なくとも50倍、そして最も好ましくは少なくとも100倍大きい程、十分に高くなければならない。Ｖ．アッセイ条件培地中に含まれた分析されるべき細胞の濃度は、使用される装置のスピードを考慮に入れて、所定の時間期間内に所望数の細胞の読みを提供するために十分に高くなければならない。最近のフロー・サイトメトリー技術のためには、約3,00 0,000細胞／ミリリッターの濃度が、約１〜２分間で約10,000〜15,000細胞の計測値を得るために適当である。アッセイ化合物は、一般に、アッセイ時間内に酵素量により完全に加水分解されることができる量の過剰の濃度において使用される。あまりに高いアッセイ化合物の濃度は、酵素活性に悪影響を及ぼすことができる。細胞の最適化におけるアッセイ化合物の濃度は、Ｋ_m（既知の速度定数）及びＶ_MAX（最大速度）の計算を使用して決定される。アッセイ化合物は、好ましくは、アッセイ期間の経過時間内に酵素により完全に加水分解されることができる量の約２〜約100倍のＶ_MAX、及び最も好ましくは約２〜約10倍の量において存在する。アッセイは、速度測定として、又は終点測定として行われることができる。速度測定が好ましい。なぜなら、それらは、一般に、自己蛍光によりあまり影響されないからである。従って、速度測定アッセイはより感度がよく、かつ、正確である。速度測定においては、アッセイ化合物−細胞アナライト混合物の蛍光は、その細胞アナライトがそのアッセイ化合物と接触した直後に測定されることができる。シグナルを検知し、そしてバックグラウンド・ノイズからそれを区別する能力が、データ収集の最初の出発点を決定し、そして最後のデータ点は、好ましくは、その反応速度の勾配が変化する、典型的には２％を上廻って変化する点で、測定される。ほとんどの細胞反応は、厳密には、０次速度式に従わない。ほとんどの細胞酵素は、アッセイ化合物に細胞が晒される時間と、バックグラウンド・ノイズよりも大きいシグナルを検出する能力との間の遅れを示す。０次速度式に従わない細胞酵素反応は、１次、偽１次、又は初期速度計測として、未だ有用な計測である。反応（混合反応）における多数の酵素は、モニターされる時間経過の間の勾配変化により示される。終点測定においては、酵素加水分解反応は、事前に決められた時間長にわたり、通常、Ｖ_MAXで進行される。反応時間は、ミカエリスーメンテンの方法論を使用して、その反応が０次又は１次速度式であるかどうかに基づいて計算されることができる。あるいは、反応時間は、偽１次反応について異なった所要時間により調整されることもできる。多くの要因が、アッセイの信頼性を減じ、そして偽陽性を生じ、又は酵素活性の誤指示をもたらすであろうということが認められている。これらは、（ｉ）細胞アナライトとアッセイ化合物の間の延長された反応；（ii）脱離基を解裂させる、他の非標的酵素；（iii）アッセイ化合物の自己加水分解；（iv）存在し、かつ、検出されない阻害剤又は刺激物質；（ｖ）もはや代謝的に活性でなく、又は死んでいる細胞；（vi）細胞の混合集団；（vii）サンプリング前の患者の輸血；陰性細胞による非特異的な染料の取り込み；及び（ix）バック・グラウンド蛍光、を含む。偽陰性、又は酵素活性の欠如の偽の指示の創出は、（ｉ）細胞アナライトとアッセイ化合物の間の不十分な反応、（ii）細胞活性における減少を導く浸透圧下の培地；（iii）もはや代謝的に活性でない細胞；（iv）バースト細胞；及び標的酵素に対する阻害剤の存在、により引き起こされることができる。反応条件が、脱離基についてその他の方法で競合するかもしれない他の非アッセイ酵素に対して、アッセイされた酵素の活性を最大化するように調整される場合、アッセイがかなり改善されるであろうということが、さらに認められている。より特に、標的酵素は、多酵素反応カスケードにおけるような、他の酵素に逐次的にカップルされる酵素の直鎖カスケード反応に関係することもできる。反応条件は、経路の効率を最大化するように、又は競合経路の効率を減少させるように、調節されることができる。このような条件は、好ましくは、少なくとも１のpH、アッセイ化合物の形態の選択、温度、浸透圧、イオン強度、及び反応時間を含む。酵素が最も効率的であるところのpHは、一般に、約４〜7.5の間であろう。好ましくは、アッセイ化合物のpHは、pH4.5〜7.0、そして最も好ましくは、4.7〜6 .7であろう。アッセイ混合物のpHは、適当なバッファー中に細胞アナライトとアッセイ化合物を溶解させることにより制御される。酵素源を用いず同一のデータ収集窓を使用する反応ランは、基質の自己加水分解を測定し、そしてそれ故、陰性細胞が、染料を非特異的に吸収して偽陽性をもたらす、潜在能力を決定するであろう。アッセイの時間は、典型的には、30分未満、好ましくは、20分未満、通常、５秒〜20分の間、そして最も好ましくは、約10秒〜約５分の間である。いくつかの酵素系、例えば、エステラーゼは、細胞内に在る酵素の濃度に因り、より短い時間期間においてアッセイ化合物と反応することができる。反応時間は、指示化合物の細胞排除の効果が回避されるであろうように、制限されなければならない。アッセイが行われるところの温度は、細胞にとって生理学的に許容され得るものでなければならない。その温度は、生存度を保持し、そして酵素活性を保証するために十分に高くなければならないが、脱離基、酵素、又は混合物の他の成分に関係する、分解又は他の有害反応を引き起こす程高いものであってはならない。特定の酵素、又は特定の経路内の酵素は、特定の温度においてより反応性である。この温度は、好ましくは、約30℃〜約40℃、より好ましくは、約35℃〜約38 ℃、そして最も好ましくは約36℃〜約38℃の間で維持される。アッセイ混合物の浸透圧は、約250ミリモル〜350ミリモル、好ましくは、約27 5ミリモル〜320ミリモルの生理学的範囲にあるようにコントロールされる。浸透圧は、代謝的に活性な全細胞の生存度を維持するように選ばれなければならない。浸透圧における変化は、あまりに低いとき、細胞の溶解、重度の縮み又はshri veling（鈍鋸歯状形成）をもたらし、そしてあまりに高いとき、細胞の膨張又はバースト(stomatolysing)をもたらすであろう。蛍光の読みは、反応が生じた後、又は特定の時間期間の後に行われる。典型的には、反応は、約０℃まで細胞を冷却する、氷と水の中に反応容器を沈めることにより停止される。蛍光測定による１以上の反応状態の感知が、酵素による指示基の解裂を確認する。蛍光測定は、蛍光測定を行うことができるImage Analysis Syste m（IAS）又はFlow Cytometer（FC）又はこのような他の装置上で、行われることができる。IASは、当業者に知られた、蛍光を計測する顕微鏡ベースのシステムである。IASの代表例は、Universal Imaging Corporation，West Chester，Penn sylvaniaによるMetamorph^TMである。フロー・サイトメーターの構造及び操作も、文献中によく書かれている。伝統的なFCの代替物は、slit-scan FC及びstoppe d-flow FCを含む。実施例中に記載される実験を行うために使用される装置のタイプは、フロー・サイトメーター（例えば、Coulter Corporation of Miami，Fl oridaにより製造されたCoulter Proーターは、細胞全体を横切って蛍光を計測する。細胞の一部だけの中の蛍光を計測するフロー・サイトメータ一法、例えば、スリット・スキャン・フロー・サイトメトリーは、本発明においてかなりの有用性をもつ。なぜなら、酵素が位置するところの細胞の領域上に計測が集中するとき、バックグラウンド蛍光がかなり減少されるからである。蛍光測定は、アッセイにより生成されるひじょうに低い蛍光レベルを計測する能力をもつ分光蛍光光度計により行われることもできる。分光蛍光光度計は、使用される特定の指示薬の励起及び発光波長に同調される。好ましい化合物、ローダミン110とフルオレセインは、それぞれ、約495〜498nm（励起）と520〜525nm の励起波長及び発光波長をもつ。SLM company，Milton Roy（Chicago，Illinois ）の子会社により製造されたModel 8000C光子計数分光蛍光光度計が使用された。フロー・サイトメーターは、単一波長の蛍光計測に加えて追加の計測を行うことができる。フロー・サイトメーターは、２以上の別個の波長において蛍光を計測するように装備されることができる。このような読みは、１以上のアッセイ化合物を使用するとき、又は細胞の表現型を決定するために、細胞表面マーカー、例えば、モノクローナル抗体を使用するために、本発明に従ってアッセイを行うために有用である。VI ．アッセイ・プロトコールそれにより、酵素が、本発明の方法に従って調製された試薬を使用してアッセイされることができるところの好ましいサンプル調製が、開発された。これらのサンプル調製の例は、修飾されることができ、そして目下、好ましいそれらの手順を開示するために本明細書中に、含まれる。サンプル調製は、それぞれ、図１Ａ，１Ｂ，１Ｃ、及び１Ｄ中に示す実施例１，２，３、及び４により表される４つの異なる方法に分けられることができる。サンプル調製の選定は、ユーザー及びアナライトに依存する。これら４つの方法は以下のものである：実施例１後溶解による赤血球汚染をもつ白血球又は組織細胞の検査（EDTA、ヘパリン又はACD中の）全血又は溶解組織又は体液（滑液）又は細胞培養基から成るサンプルを、得て、そして生存度を減少させないようなやり方で保存する。サンプルを、血漿、培地、体液、死骸、及び細胞外酵素を除去するために十分に洗浄する。洗浄培地は、生理学的にバランスされた緩衝化塩溶液から成る。洗浄した細胞を、37℃でインキュベートする。50mLのサンプルと25mLの基質培地を一緒に混合し、そして所定の時間期間にわたり37℃でインキュベートに供する。インキュベーション期間の終わりに、不所望の細胞を溶解試薬で溶解し、すなわち、赤血球を除去する。適した溶解系は、Q-Prep^TM、酸溶解（ギ酸／クエンチ）、Erythrolyse^TM、（酸溶解／洗剤／クエンチ）又は低張塩化アンモニウムである。次にサンプルは、蛍光について計測される。参照した溶解系は、Coulter Corpor ation，Miami，Floridaから商業的に入手可能である。実施例２前溶解による赤血球汚染をもつ白血球又は組織細胞の検査（EDTA、ヘパリン又はACD中の）全血又は溶解組織又は体液（滑液）又は細胞培養基から成るサンプルを得て、そして生存度を低下させないようなやり方で保存する。不所望の細胞、すなわち、赤血球を溶解試薬で溶解させる。適した溶解系は、酸溶解（ギ酸／クエンチ）、IVCS溶解（第４アンモニウム塩／クエンチ）又は低張塩化アンモニウムである。サンプルを、血漿、培地、体液、死骸、及び細胞外酵素を除去するために十分に洗浄する。洗浄培地は、生理学的にバランスされた緩衝化塩溶液から成る。洗浄された細胞を37℃でインキュベートする。50 mLのサンプルと25mLの基質培地を一緒に混合し、そして所定の時間期間にわたり 37℃でインキュベートに供する。インキュベーション期間の終わりに、サンプルを蛍光について計測する。実施例３血小板、赤血球、白血球、溶解組織、体液、及び細胞培養基の検査（EDTA、ヘパリン又はACD中の）全血又は溶解組織又は体液（滑液）又は細胞培養基から成るサンプルを得て、そして生存度を低下させないようなやり方で保存する。このサンプルを、血漿、培地、体液、死骸、及び細胞外酵素を除去するために十分に洗浄する。この洗浄培地は、生理学的にバランスされた緩衝化塩溶液から成る。洗浄された細胞を37℃でインキュベートする。50mLのサンプルと25 mLの基質培地を一緒に混合し、そして所定の時間期間にわたり37℃ でインキュベーションに供する。インキュベーション期間の終わりに、蛍光について計測する。実施例４細胞集団を単離するための機械的手段を使用した血小板、赤血球、白血球、溶解組織、体液、及び細胞培養基の検査（EDTA、ヘパリン又はACD中の）全血又は溶解組織又は体液（滑液）又は細胞培養基から成るサンプルを得て、そして生存度を低下させないようなやり方で保存する。特定の細胞集団を単離するための機械的分離、すなわち、ficoll、示差的遠心分離、分別沈殿を行う。サンプルを、血漿、培地、体液、死骸、及び細胞外酵素を除去するために十分に洗浄する。洗浄培地は、生理学的にバランスされた緩衝化塩溶液から成る。洗浄された細胞を、37℃でインキュベートする。50mL のサンプルと25mLの基質培地を一緒に混合し、そして所定の時間期間にわたり37 ℃でインキュベートに供する。インキュベーション期間の終わりに、サンプルを蛍光について計測する。蛍光を検出するために使用される装置は、フロー・サイトメーター又は蛍光顕微鏡である。フロー・サイトメーターのための４つの異なる装置配置、Ａ，Ｂ，Ｃ、及びＤがある。この４つの配置のいずれも、上記のサンプル調製物の中のいずれか１と共に使用されることができるどの配置を選ぶかの選択は、ユーザーと得ようとする情報に依存する。４つの配置は以下のものである：配置Ａ：配置Ａは、サイズ、粒度、及び単一色により細胞を分析する。第１の配置においては、フロー・サイトメーターは、サイズ及び粒度により細胞を分離する。次に、酵素活性が試薬化合物を使用してアッセイされる。２つのサンプルが異なる時刻において進行に供され、そして反応が停止される。好ましい合計集団カウントは500〜50 0,000細胞である。光散乱又は血液学的パラメーターの使用は、サイズ及び粒度の分離を提供する。所望の集団の強度ビットマップ及び単一の計測点又は多点計測による蛍光活性の測定を、使用することができる。酵素活性を提示する多−モデル集団の、カウント、パーセンテージ、及び蛍光強度を測定する。配置Ｂ：配置Ｂは、サイズ、粒度、及び２色により細胞を分析する。第２の配置においては、フロー・サイトメーターは、サイズ及び粒度により細胞を分離する。細胞の形態を、モノクローナル抗体マーカーを用いた蛍光アッセイにより測定する。次にアッセイ化合物の加水分解率を測定する。好ましい合計集団カウントは、50 0〜500,000細胞である。光散乱又は血液学的パラメーターの使用は、サイズ及び粒度分離を提供する。所望の集団の強度ビットマップ及び単一計測又は多点計測による蛍光活性の測定を、使用することができる。酵素活性を提示する多−モデル集団の、カウント、パーセンテージ、及び蛍光強度を測定する。分析は、１の色において酵素活性を計測し、そして他の色において表面−マーカー抗体細胞形態を計測する、２−色分析である。配置Ｃ：配置Ｃは、サイズ、粒度、２色、及びバックゲート（backgate）蛍光により細胞を分析する。配置３は、Daque法の修正法である。Daque，R.E.,“Flow Cytome tric Analysis of Lymphomas and Acute Leukemias”，Annals of the New York Academy of Scienlces，Clinical Flow Cytometry，677，pp．309-325（March 20，1993）。細胞のサイズと粒度は、光散乱を使用した、そして／又は表曲マーカー、例えば、モノクローナル抗体を用いた、フロー・サイトメーターにより分離される。一連の細胞集団が、疾患細胞と正常細胞を同定するためのヒストグラムの再編成をもって、測定される。次に酵素の活性がアッセイされる。好ましい合計集団カウントは500〜500,000細胞である。光散乱又は血液学的パラメーターの使用は、サイズ及び粒度分離を提供する。所望の集団の強度ビットマップ並びに単一計測点又は多点計測による蛍光活性の測定を使用することができる。酵素活性を提示する多−モデル集団のカウント、パーセンテーゼ及び蛍光強度を測定する。分析は、１色において酵素活性を計測し、そして他色において表面マーカー抗体の細胞形態学を計測する２色分析である。死んだ細胞のカウント及びパーセントを測定するためのサイズ及び粒度についてのバックゲート蛍光データ。配置Ｄ：配置Ｄは、時間にわたる細胞集団の活性を分析する。好ましい合計集団カウントは500〜500,000である。光散乱又は血液学的パラメーターの使用は、サイズ及び粒度分離を提供する。所望の集団の強度ビットマップ並びに単一計測点又は多 −点計測による蛍光活性の測定を使用することができる。酵素活性を提示する多 −モデル集団のカウント、パーセンテージ、及び蛍光強度を測定する。分析は、１色において酵素活性を計測し、そして他色において表面マーカー抗体の細胞形態を計測する２色分析である。VII ．データ分析前方及び側方散乱の光散乱を使用したヒストグラムにおける芽細胞位置の検査は、芽細胞の大部分がリンパ球及び単球細胞と共に位置しているが、主にリンパ球と共に位置することを示す。正常なリンパ球の酵素レベルは、芽細胞と比較したとき相違し、本発明により芽細胞から正常なリンパ性細胞を分離するための機会を提供する。さらに、酵素のパネルが芽細胞の系統を決定するために使用されることができるということが認められている。芽細胞は、リンパ球、単球又は顆粒球起源であることができる。例えば、顆粒球及び単球起源をもつものは、細胞内で、NADPHオキシダーゼ及びミエロペルオキシダーゼから生じた、多量の酸化還元酵素活性をもつ。それ故、この酸化還元酵素活性を同定するためにアッセイ試薬に細胞サンプルを晒し、そしてそのリンパ球領域をビット・マッピングすることは、正常なリンパ球と、顆粒状又は単球系統の芽細胞が存在するとき、二峰性である蛍光ヒストグラムをもたらす。さらに、エステラーゼ酵素活性を計測するために使用されるアッセイ試薬に細胞サンプルを晒すことは、単芽球又は骨髄芽球の測定を可能にする蛍光ヒストグラムをもたらす。より特に、エステラーゼ活性を計測するために使用される上記２アッセイ試薬の結果が、異なる強度をもつ蛍光平均チャンネル・レンジをもつ蛍光ヒストグラムをもたらすとき、それは、単芽球細胞の存在を示す。しかしながら、エステラーゼ活性を計測するために使用される上記２アッセイ試薬の結果が、等しい蛍光平均チャンネル・レンジをもつ蛍光平均チャンネル・レンジをもつ蛍光ヒストグラムをもたらすとき、それは、骨髄芽球細胞の存在を示す。データの少なくとも３つのパターンは明らかであることができる；全ての細胞がそのヒストグラムにおいて低い強度の蛍光をもつか、全ての細胞がそのヒストグラムにおいて高い強度の蛍光をもつか、又は二峰性分布がその蛍光ヒストグラムにおいて存在するであろうか、である。二峰性ヒストグラムにおいては、パーセント芽細胞は、芽細胞が存在するところの選ばれた領域内で蛍光をカウントし、そしてFS及びSSヒストグラムからの白血球ビットマップ領域内の白血球の合計カウントで割って、100をかけることにより、測定されることができる。アッセイ化合物を用いたフロー・サイトメトリーにより得られたパーセント芽細胞の測定は、Wright染色法により得られたパーセント芽細胞に相関する。これは、Wright's染色対本発明の方法間の相関を示す図２により示される。同様に、光散乱特性とアッセイ試薬、３’，６’−フルオレセイン・ジブチレート(FDB)、３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート（FDClAc）、フルオレセイン−９−Ｄ−ジグルクロニド、３’，６’−フルオレセイン・ジアセテート(FDA)、３’，６’−フルオレセイン・ジアセテート・フッ化ナトリウム(FDA-NaF)、及び３’，６’−フルオレセイン・ジホスフェート・アンモニウム塩（FDP-AS）が、パネル内でのさらに分化した悪性細胞との比較により、蛍光酵素活性により芽細胞を区別するために使用されることができる。計測された蛍光強度は、（ピーク又は積分モードにおける）蛍光平均チャンネルからMESF(当量の溶解性の蛍光色素の分子、Flow Cytometry Standards Corp. ，San Juan，Puerto Rico)に、又は細胞当りの加水分解の国際単位に変換されることができる。以下の詳細な実施例は、本発明を説明することを意図され、その範囲を限定するものではない。実施例５単芽球細胞の測定Ａ．必要な材料１）１×Hanksバランス塩溶液(HBSS)(妨害物質番号：１を参照のこと)、pH7.40 −7.55、重炭酸ナトリウムなし２）ホスフェート緩衝化生理食塩水^*（PBS）、pH7.00−7.55、発熱物質なし３）ピペット４）ピペット先端５）ガラス管（12×75mmホウケイ酸塩）６）37℃水浴７）クラッシュ・アイス８）Q-Prep及び試薬（Coulter Corporation）９）無発熱物質水 11）遠心分離機 12）エステラーゼ酵素活性を同定するために使用されるアッセイ試薬ａ．DCFH-DA（３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート）ｂ．FDA（３’，６’−フルオレセイン・ジアセテート）ｃ．FDA-NaF（３’，６’−フルオレセイン・ジアセテート・フッ化ナトリウム）ｄ．FDClAc（３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート）ｅ．FDB（３’，６’−フルオレセイン・ジブチレート）Ｂ．手順１）装置のセット・アップ：Flow-Check^TM Fluorospheres(Coulter Corporati on)を使用したEPICS XLフロー・サイトメトリー・システム（又は等価物）の流体完全性(fluidic integrity)を確認する。一貫性のある結果のために、高電圧を、蛍光球標準を使用して毎日、設定されなければならない。例えば：洗浄された全血サンプルの分析は、蛍光ヒストグラムの標的平均チャンネル−22.7±0.30 にFlow-Set^TM Fluorospheres(Coulter Corporation)を入れるためにLFL １高電圧を設定する。同一の標的平均チャンネル要求をもつアッセイ試薬を分析するために、上記の高電圧を使用する。FDClAc及びFDBのために、標的平均チャンネル6 .0±0.1にFlow-Set蛍光球を入れるために高電圧を使用する。日毎に、同一標的チャンネル内に標準蛍光球を入れるために必要な高電圧を再確立する。Flow-Set蛍光球の新たなロットに変えるとき、新たな平均標的値を確立するために、現在のロットを新たなロットと比較する。２）サンプル調製：HBSSとPBSのpHを毎日チェックする。バッファーを7.40〜7 .55のpHに調整する。HBSS又はPBS(10：１)のいずれかの中でサンプルを洗浄する。10分間、200gでサンプルを回転させる。この洗浄手順を２回繰り返す。全血サンプルのための第２及び第３の洗浄物を、５分間、500±200ｇで回転させることができる。３）細胞ペレットを、HBSS又はPBS中に、3.0±0.5×10⁶細胞／mLの濃度に、緩やかに再懸濁させる。ボルテックスしてはいけない。４）適当なアッセイ試薬名を用いて、12×75mmガラス試験管にラベルを付ける。サンプル当り１つのブランク管にラベルを付ける。50μＬの洗浄サンプルを上記ラベルされた管のそれぞれに添加する。５）手順：５〜10分間37℃水浴中に上記管を入れる。一旦、サンプルを暖めれば、分析を進行させなければならない。調製された管を、工程７において定義するアッセイ試薬と共に30分以内のインキュベーションにより、分析しなければならない。６）使用直前に、凍結乾燥形態にある場合、アッセイ試薬を再構築する。７）アッセイ試薬の添加の前水浴中、事前に暖めたサンプル管を放置することにより37℃の反応温度を維持する。25μＬのHBSS又はPBSを上記ブランク管に添加する。25μＬのアッセイ試薬を上記の適当なラベルされた管に添加する。・注：アッセイ試薬は、各管について正確なインキュベーション時間を維持するために約15秒の間隔で水浴内で上記管に添加されなければならない。・各添加の後に、手で速やかに混合する。上記管を水浴に戻し、そして各アッセイ試薬について等しい時間期間について37℃でDCFH-DA，FDA、及びFDA-NaFをインキュベートする。上記アッセイ試薬についての時間期間は、2〜10分間、好ましくは、４〜６分間であることができる。本実施例においては、各アッセイ試薬を５分間インキュベートした。FDClAcとFDBアッセイ試薬については、各アッセイ試薬について等しい時間期間について37℃でインキュベートする。上記アッセイ試薬についての時間期間は、15秒〜２分間、好ましくは、30〜90秒間であることができる。本実施例においては、各アッセイ試薬を60秒間インキュベートした。・そのインキュベーション時間の終了時に各管を取り出し、そして最小３分間時間にわたりクラッシュ・アイス上に置く。これらの管を、工程８と工程９に進む準備ができるまで氷上に留めなければならない。これらの管を、20分間まで氷上に保つことができる。・各管について、上記クラッシュ・アイスから工程８と工程９に直ちに進行させる。（一貫性を確保するために、各管を、37℃と氷インキュベーション工程の両方におけるアッセイ試薬添加と同じ時間間陥において取り出さなければならない。）８）洗浄された全血サンプルのために、Q-Prep Workstation装置(Coulter Cor poration)上で上記管を処理する。全血サンプルの調製のためのQ-Prep手順及びガイドラインに従う。全血以外のサンプルのために、1mLの冷HBSS又はPBS中に細胞を懸濁させる。 10）分析のために、分散パターン〔前方分散（Forward Scatter(FS)）対側方分散(Side Scatter(SS))〕を確立させ、そして着目の集団上にゲート（gate）する。その散乱パターンが、分析されるサンプルに代表的なものであることを確認する。例えば、正常な全血調製物のための典型的な３つの集団の散乱パターンを受容することを期待する。上記の３つの部分の差異を明らかにするために、しきい値、前方散乱の増加、及び側方散乱の高電圧を調整する。工程１において確立した高電圧を使用することにより着目の集団の平均蛍光強度を測定する。上記ブランクを、陽性蛍光がそのブランクよりも、平均チャンネルにおいてより高く現われることを保証するようにガイドラインとしてのみ使用する。Ｃ．結果本実施例においては、単芽球細胞は、リンパ球ビットマップ内に共に存在し、そしてDCFH-DAアッセイ試薬を用いたリンパ球よりも高い蛍光平均チャンネル・レンジを示す。FDAとFDA-NaFアッセイ試薬の結果を互いに比較するとき、減少された平均チャンネル・レンジがFDA-NaFエステラーゼ・アッセイにおいて示される。FDClAc及びFDBエステラーゼ・アッセイは、酵素活性に比例する蛍光平均チャンネル・レンジを示す。サンプルが単芽球をもつとき、FDBアッセイは、その細胞サンプル中のリンパ球細胞の蛍光平均チャンネル・レンジよりも大きな蛍光平均チャンネル・レンジをもつであろう。 FDClAcアッセイは、細胞サンプル中のリンパ球細胞以下又はそれに等しいであろう蛍光平均チャンネル・レンジをもつであろう。 Wright's染色の使用及び400カウントの差異は、芽細胞の存在を示している。Ｄ．妨害物質１）蒸留水中に在る発熱物質は、免疫系に属する細胞を活性化し、酵素活性を変化させることができる。常に、無発熱物質の水、バッファー、及び材料を使用する。２）試薬は、特異的酵素により加水分解されるように配合する。しかしながら、細胞は、酵素基質の加水分解について競合することができる他の酵素を含む。阻害剤を、特異性をさらに強化するために添加することができる。赤血球溶解物と血小板は、WBC集団の酵素活性に影響を及ぼすことができる。３）全血サンプルを、ヘパリン、EDTA又はACD中に採取することができ、そして採取から６時間以内に処理しなければならない。抗血液凝固剤の選択を、酵素アッセイにおいて考慮しなければならない。例えば、EDTAキレート金属イオン、例えば、亜鉛、カルシウム及びマグネシウムは、いくつかの酵素のタンパク質分解活性に影響を及ぼすことができる。単核分離及び組織分離技術は、活性な細胞酵素を活性化して、得られる結果を変化させる。固形組織調製物中の酵素消化の使用を回避する。５）生きている細胞調製物は、細胞酵素活性の最も正確な尺度を提供する。生きていない細胞集団が分析されることができるが、生きている細胞とは、異なる活性レベルを提供することができる。生きている細胞と生きていない細胞の混合集団は推奨されない、なぜなら、それらは最終結果を歪曲するであろうからである。実施例６骨髄芽球細胞の測定実施例５の材料及び手順を繰り返す。しかしながら、これらの結果は異なる。本実施例においては、骨髄芽球細胞は、リンパ球ビットマップ内に、共に存在し (co-localize)、そしてDCFH-DAアッセイ試薬を用いたリンパ球よりも高い蛍光平均チャンネル・レンジを示す。FDA及びFDA-NaFアッセイ試薬を互いに比較するとき、同一又はほぼ同じの蛍光平均チャンネル・レンジが示される。FDClAcと FDBエステラーゼ・アッセイは、酵素活性に比例する蛍光平均チャンネル・レンジを示す。サンプルが骨髄芽球をもつ場合、FDBアッセイは、その細胞サンプル中のリンパ球細胞の蛍光平均チャンネル・レンジ未満又はそれに等しい蛍光平均チャンネル・レンジをもつであろう。FDClAcアッセイは、細胞サンプル中のリンパ細胞よりも大きいであろう蛍光平均チャンネル・レンジをもつであろう。図３Ａは、リンパ球と芽細胞のFS，SS領域であるビットマップ１を含む。図３Ｂは、DCFH-DAアッセイ試薬を用いた二峰性蛍光分布を示すビットマップ１の蛍光ヒストグラムである。Wright's染色の使用及び400カウントの差異は、17％の芽細胞の存在を示す。本発明及び約5,000リンパ球の計数を使用することにより、21.6％の芽細胞が存在していたことが測定された。図２は、本発明の方法を使用したパーセント骨髄芽細胞の同定と、パーセント芽細胞のWright's染色の測定との相関を表す。実施例７Ｌリンパ芽球細胞の測定実施例５の材料を繰り返す。但し、本実施例において使用したアッセイ試薬は、DCFH-DA，FDB，FDP-AS、及びフルオレセイン−９−Ｄ−ジグルクロニドを含む。実施例５の手順を繰り返す。但し、FDP-ASとフルオレセイン−９−Ｄ−ジグルクロニドを使用するとき、標的平均チャンネル22.7±0.30にFlow-Set蛍光球を入れるために高電圧を使用しなければならず、そして工程７において、インキュベーション時間は、各アッセイ試薬について等しい時間期間でなければならない。上記アッセイ試薬のための時間期間は、5〜15分間、好ましくは、8〜12分間であることができる。本実施例においては、各アッセイ試薬は10分間インキュベートされた。本実施例においては、リンパ芽球細胞は、リンパ球ビットマップ内に共に存在し、そしてDCFH-DAアッセイ試薬を用いてリンパ球の蛍光平均チャンネル・レンジにほぼ等しい蛍光平均チャンネル・レンジを示す。FDBとフルオレセイン−９−Ｄ−ジグルクロニド・アッセイは、リンパ球に比較されるとき、芽細胞が、その細胞サンプル中のリンパ球細胞の蛍光平均チャンネル・レンジ未満である蛍光平均チャンネル・レンジをもつ、二峰性分布を示す。FDP-ASエステラーゼ・アッセイは、酵素活性に比例する蛍光平均チャンネル・レンジを示す。サンプルがリンパ芽球をもち、そしてFDP-ASアッセイがその細胞サンプル中のリンパ球細胞の蛍光平均チャンネル・レンジ未満の蛍光平均チャンネル・レンジをもつ場合、それは、非Ｔ−細胞である。図４Ａは、リンパ球と芽細胞のFS，SS領域であるビットマップ１を含む。図４Ｂは、DCFH-DAアッセイ試薬を用いた一峰性の蛍光分布を示すビットマップ１の蛍光ヒストグラムである。一峰性の蛍光ヒストグラムは、芽細胞が骨髄芽球ではないことを示す。図５Ａは、リンパ球及び芽細胞のFS，SS領域であるビットマップ１を含む。図５Ｂは、FDBアッセイ化合物を用いた二峰性蛍光分布を示すビットマップ１の蛍光ヒストグラムである。二峰性蛍光ヒストグラムは、芽細胞がリンパ球芽細胞であることを示す。リンパ芽球細胞の同定を、蛍光顕微鏡により確認した。Wright's染色の使用及び400カウントの差異（400 count differential）は、34％の芽細胞の存在を示す。本発明及び約5,000リンパ球を使用することにより、38％の芽細胞が存在したことが認められた。本発明の結果は、それらの酵素活性に基づく細胞タイプの分離能力を証明する。本明細書中に言及する特許及び刊行物の全てを、それらの全体として引用によりここに取り込む。本発明を好ましい態様を参照しながら記載してきた。しかしながら、本発明はそれに限定されるべきではなく、そして本発明の範囲は、以上の明細書よりも、むしろ以下の請求の範囲を参照して決定されるべきであることを理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月２７日（１９９８．５．２７）【補正内容】請求の範囲１．体液サンプル中の芽細胞の同定方法であって：ａ）少なくとも１のテスト・サンプルから体液サンプルを採取し、このテスト・サンプルは代謝的に活性な細胞を含有し、ｂ）アッセイ試薬と、上記の代謝的に活性な細胞を含有する上記テスト・サンプルとを混合して、テスト細胞混合物を形成し、このアッセイ試薬は、上記アッセイ試薬が上記細胞内の酵素と反応する前、非蛍光の第１状態を、そして上記アッセイ試薬が上記細胞内の上記酵素と反応した後、450nmを超える波長において励起されることができる蛍光性の第２の状態をもつその能力について選択される蛍光生成性の指示基を含有し、上記アッセイ試薬は、上記細胞内の上記酵素との反応前、代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満の蛍光をもち、ｃ）光が散乱されることを引き起こし、そして上記テスト細胞混合物が蛍光性の第２の状態をもつことを引き起こす450nmを超える波長をもつ光のビームにより上記テスト細胞混合物を照射し、かつ、励起させ、ｄ）上記テスト細胞混合物中の細胞の蛍光及び光散乱を検出し、そしてｅ）上記細胞の上記蛍光と上記光散乱を相関させて、上記テスト細胞混合物中に含有される芽細胞を同定する、ことを含む、前記方法。２．前記アッセイ試薬が酸化還元酵素と反応する、請求項１に記載の方法。３．前記アッセイ試薬が、ジクロロフルオレッシン・ジアセテート(DCFH-DA) 、ジヒドロローダミン123（DHR 123）、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項２に記載の方法。４．前記第１のアッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項３に記載の方法。５．前記液サンプルが少なくとも２つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが酸化還元酵素と反応する第１のアッセイ試薬に添加され、そして第２のテスト・サンプルがエステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加される、請求項１に記載の方法。６．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項５に記載の方法。７．前記第１のアッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項６に記載の方法。８．前記第２のアッセイ試薬が、フルオレセイン・ジブチレート(FDB)から選ばれた、請求項５に記載の方法。９．酸化還元酵素活性についての前記テスト・サンプル中の前記細胞についての蛍光の検出が、一峰性の蛍光平均チャンネルをもつヒストグラムをもたらし、そしてエステラーゼ酵素活性についての前記テスト・サンプル中の細胞についての蛍光の検出が、二峰性の蛍光平均チャンネルをもつヒストグラムをもたらす、請求項５に記載の方法。 10．前記芽細胞がリンパ芽球細胞である、請求項９に記載の方法。 11．前記液サンプルが少なくとも３つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、ペルオキシダーゼ酵素と反応する第１アッセイ試薬に添加され、第２のテスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加され、そして第３のテスト・サンプルが、第３のアッセイ試薬に添加され、この第３のアッセイ試薬は単球系統の細胞の酵素活性を阻害する阻害剤を含有し、そしてこの第３のアッセイ試薬は上記エステラーゼ酵素と反応する、請求項１に記載の方法。 12．前記第１アッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれる、請求項11に記載の方法。 13．前記第１アッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項12に記載の方法。 14．前記第２及び第３アッセイ試薬がフルオレセイン・ジアセテート(FDA)である、請求項12に記載の方法。 15．前記第３のアッセイ試薬中に含有される前記阻害剤がフッ化ナトリウムである、請求項14に記載の方法。 16．前記芽細胞の同定が単芽細胞である、請求項14に記載の方法。 17．前記芽細胞の同定が骨髄芽球細胞である、請求項14に記載の方法。 18．前記液サンプルが、少なくとも４つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、酸化還元酵素と反応する第１アッセイ試薬に添加され、第２テスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２アッセイ試薬に添加され、第３のテスト・サンプルが、ホスファターゼ酵素と反応する第３のアッセイ試薬に添加され、そして第４のテスト・サンプルが、グルクロニダーゼ酵素と反応する第４のアッセイ試薬に添加される、請求項１に記載の方法。 19．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項18に記載の方法。 20．前記アッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項19に記載の方法。 21．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれ、そして前記第２のアッセイ試薬が、FDA、フルオレセイン・ジアセテート−フッ化ナトリウム(FDA-NaF)、フルオレセイン・ジクロロアセテート（FDClAc）及びFDBから選ばれた、請求項18に記載の方法。 22．前記光散乱が、前方角光散乱及び側方散乱を含む、請求項５，11又は18に記載の方法。 23．前記の蛍光の検出が、前記試薬を前記テスト・サンプルに添加した後20分未満以内に生じる、請求項５，11又は18に記載の方法。 24．前記体液からの赤血球を溶解させることをさらに含む、請求項５，11又は 18に記載の方法。 25．前記細胞が、リンパ球細胞と単球細胞を含む、請求項５，11又は18に記載の方法。 26．前記体液が、リンパ節、骨髄、及び血液から調製された細胞懸濁液から選ばれた、請求項５，11又は18に記載の方法。 27．各アッセイ試薬が、約４〜7.5のpHをもつ、請求項５，11又は18に記載の方法。 28．細胞酵素活性の計測による液サンプル中の芽細胞の同定のためのアッセイ試薬であって：ａ）３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート及び３’，６’−フルオレセイン・ジブチレートから選ばれたアッセイ化合物；及びｂ）生理学的バッファー、を含み、ここで、上記アッセイ試薬が、細胞内の酵素と反応する前、代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満の蛍光、及び４〜7.5のpHをもつ、前記アッセイ試薬。 29．前記バッファーが、２−Ｎ−モルフォリノエタンスルホン酸(MES)、Ｎ− トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、４− （２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸(HEPES)、及びH anksバランス塩溶液（HBSS）から選ばれた、請求項28に記載のアッセイ試薬。 30．前記バッファーがMESである、請求項29に記載のアッセイ試薬。 31．前記アッセイ試薬が凍結乾燥された、請求項28に記載のアッセイ試薬。 32．前記アッセイ試薬が1,000ミリ吸光単位未満の溶解度をもつ、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。 33．前記アッセイ化合物が、３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテートである、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。 34．前記アッセイ化合物が３’，６’−フルオレセイン・ジブチレートである、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クリューズ，ハロルドアール. アメリカ合衆国，フロリダ 33024，ペンブロークパインズ，ノースウエストイレブンスストリート 8960 (72)発明者ジャフ，ジェラルドイー. アメリカ合衆国，フロリダ 33024，ペンブロークパインズ，ノースウエストナインティーンスストリート 8621 (72)発明者バーセロン，マリアアメリカ合衆国，フロリダ 33324，フォートローダーデイル，エバーグリーンプレイス＃204 9421 (72)発明者ルーカス，フランシスジェイ. アメリカ合衆国，フロリダ 33431，ボカレイトン，ベゼルブールバード 2143 (72)発明者ガルシア，ナンシーエム. アメリカ合衆国，フロリダ 33174，マイアミ，サウスウエストフォースストリート 11348

Claims

【特許請求の範囲】１．液サンプル中の芽細胞の同定方法であって：ａ）個体から体液サンプルを採取し、このサンプルは代謝的に活性な細胞を含有し、ｂ）上記液サンプルを調製して、少なくとも１のテスト・サンプルを形成し、このテスト・サンプルは代謝的に活性な細胞を含有し、ｃ）調製されたテスト・サンプルのそれぞれにアッセイ試薬を添加して、テスト細胞混合物を形成し、このアッセイ試薬は、、上記アッセイ試薬が上記細胞内の酵素と反応する前、非蛍光の第１状態を、そして上記アッセイ試薬が上記細胞内の上記酵素と反応した後、450nmを超える波長において励起されることができる蛍光性の第２の状態をもつその能力について選択される蛍光生成性の指示基を含有し、上記アッセイ試薬は、上記細胞内の上記酵素との反応前、代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満の蛍光をもち、ｄ）光が散乱されることを引き起こす光のビームにより上記テスト細胞混合物を照射し、そして上記テスト細胞混合物が蛍光性の第２の状態をもつことを引き起こす450nmを超える蛍光波長により上記テスト細胞混合物を励起させ、ｅ）上記テスト細胞混合物中の細胞の蛍光及び光散乱を検出し、そしてｆ）上記細胞の上記蛍光と上記光散乱を相関させて、上記テスト細胞混合物中に含有される芽細胞を同定する、ことを含む、前記方法。２．前記アッセイ試薬が酸化還元酵素と反応する、請求項１に記載の方法。３．前記アッセイ試薬が、ジクロロフルオレッシン・ジアセテート(DCFH-DA )、ジヒドロローダミン123（DHR 123）、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項２に記載の方法。４．前記第１のアッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項３に記載の方法。５．前記液サンプルが少なくとも２つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが酸化還元酵素と反応する第１のアッセイ試薬に添加され、そして第２のテスト・サンプルがエステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加される、請求項１に記載の方法。６．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項５に記載の方法。７．前記第１のアッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項６に記載の方法。８．前記第２のアッセイ試薬が、フルオレセイン・ジブチレート(FDB)から選ばれた、請求項５に記載の方法。９．酸化還元酵素活性についての前記テスト・サンプル中の前記細胞についての蛍光の検出が、一峰性の蛍光平均チャンネルをもつヒストグラムをもたらし、そしてエステラーゼ酵素活性についての前記テスト・サンプル中の細胞についての蛍光の検出が、二峰性の蛍光平均チャンネルをもつヒストグラムをもたらす、請求項５に記載の方法。 10．前記芽細胞がリンパ芽球細胞である、請求項９に記載の方法。 11．前記液サンプルが少なくとも３つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、ペルオキシダーゼ酵素と反応する第１アッセイ試薬に添加され、第２のテスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２のアッセイ試薬に添加され、そして第３のテスト・サンプルが、第３のアッセイ試薬に添加され、この第３のアッセイ試薬は単球系統の細胞の酵素活性を阻害する阻害剤を含有し、そしてこの第３のアッセイ試薬は上記エステラーゼ酵素と反応する、請求項１に記載の方法。 12．前記第１アッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれる、請求項11に記載の方法。 13．前記第１アッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項12に記載の方法。 14．前記第２及び第３アッセイ試薬がフルオレセイン・ジアセテート(FDA)である、請求項12に記載の方法。 15．前記第３のアッセイ試薬中に含有される前記阻害剤がフッ化ナトリウムである、請求項14に記載の方法。 16．前記芽細胞の同定が単芽細胞である、請求項14に記載の方法。 17．前記芽細胞の同定が骨髄芽球細胞である、請求項14に記載の方法。 18．前記液サンプルが、少なくとも４つのテスト・サンプルを調製するために使用され、第１のテスト・サンプルが、酸化還元酵素と反応する第１アッセイ試薬に添加され、第２テスト・サンプルが、エステラーゼ酵素と反応する第２アッセイ試薬に添加され、第３のテスト・サンプルが、ホスファターゼ酵素と反応する第３のアッセイ試薬に添加され、そして第４のテスト・サンプルが、グルクロニダーゼ酵素と反応する第４のアッセイ試薬に添加される、請求項１に記載の方法。 19．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれた、請求項18に記載の方法。 20．前記アッセイ試薬がDCFH-DAである、請求項19に記載の方法。 21．前記第１のアッセイ試薬が、DCFH-DA，DHR 123、及びニトロブルー・テトラゾリウムから選ばれ、そして前記第２のアッセイ試薬が、FDA、フルオレセイン・ジアセテート−フッ化ナトリウム（FDA-NaF)、フルオレセイン・ジクロロアセテート（FDClAc）及びFDBから選ばれた、請求項18に記載の方法。 22．前記光散乱が、前方角光散乱及び側方散乱を含む、請求項５，11又は18に記載の方法。 23．前記の蛍光の検出が、前記試薬を前記テスト・サンプルに添加した後20分未満以内に生じる、請求項５，11又は18に記載の方法。 24．前記体液からの赤血球を溶解させることをさらに含む、請求項５，11又は 18に記載の方法。 25．前記細胞が、リンパ球細胞と単球細胞を含む、請求項５，11又は18に記載の方法。 26．前記体液が、リンパ節、骨髄、及び血液から調製された細胞懸濁液から選ばれた、請求項５，11又は18に記載の方法。 27．各アッセイ試薬が、約４〜7.5のpHをもつ、請求項５，11又は18に記載の方法。 28．細胞酵素活性の計測による液サンプル中の芽細胞の同定のためのアッセイ試薬であって：ａ）３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテート及び３’，６’−フルオレセイン・ジブチレートから選ばれたアッセイ化合物；及びｂ）生理学的バッファー、を含み、ここで、上記アッセイ試薬が、細胞内の酵素と反応する前、代謝的に活性な細胞の自己蛍光未満の蛍光、及び４〜7.5のpHをもつ、前記アッセイ試薬。 29．前記バッファーが、２−Ｎ−モルフォリノエタンスルホン酸(MES)、Ｎ− トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸(TES)、４− （２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン−スルホン酸(HEPES)、及びH anksバランス塩溶液（HBSS）から選ばれた、請求項28に記載のアッセイ試薬。 30．前記バッファーがMESである、請求項29に記載のアッセイ試薬。 31．前記アッセイ試薬が凍結乾燥された、請求項28に記載のアッセイ試薬。 32．前記アッセイ試薬が1,000ミリ吸光単位未満の溶解度をもつ、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。 33．前記アッセイ化合物が、３’，６’−フルオレセイン・ジクロロアセテートである、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。 34．前記アッセイ化合物が３’，６’−フルオレセイン・ジブチレートである、請求項31に記載の凍結乾燥されたアッセイ試薬。