JP2001505191A - 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）核酸リガンド複合体 - Google Patents

血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）核酸リガンド複合体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドをＳＥＬＥＸ法により同定し、このＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を製造する方法を開示する。本発明はさらに、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体を開示する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築体、およびその製造方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体発明の分野 本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオ ロ（２’−Ｆ）ピリミジン系ＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リガン ドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これはＳｙｓ ｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏ ｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ(指数的濃縮による系統的リガンド進化) の頭字語である。本発明はさらに、ＳＥＬＥＸ法によりＶＥＧＦ核酸リガンドを 同定し、このＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化 合物と共有結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分 子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を調製する方 法を包含する。本発明はさらに、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドおよ び非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複 合体を包含する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥ ＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに 、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体（ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ） 、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性 化合物を含む複合体を含む脂質構築体を使用することにより、ＶＥＧＦ核酸リガ ンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、療法用また は診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高分 子量化合物を含む複合体と結台させることにより、ＶＥＧＦを発現している生物 学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって、 複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧＦ核酸リガンドがさらにその脂質構 築体の外側と結合している方法に関する。発明の背景 Ａ．ＳＥＬＥＸ 核酸は主に情報の役割をもつというのが長年の定説であった。指数的濃縮によ る系統的リガンド進化（ＳＥＬＥＸと呼ばれる）として知られる方法によって、 核酸はタンパク質と異なる三次元構造多様性をもつことが明らかになった。ＳＥ ＬＥＸは高い特異性でターゲット分子に結合する核酸分子をインビトロ進化させ る方法であり、下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号 、１９９０年６月１１日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化”、 現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月10日出願 、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許出 願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガンド ”、現在は米国特許第５，２７０，１６３号(国際特許出願公開第ＷＯ９１／１ ９８１３号も参照)；これらをそれそれ本明細書に援用する。これらの各特許出 願（本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ）には、目 的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製するための、基 本的には新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法によれば、核酸リガンドと 呼ばれる一群の生成物が得られる。これらのリガンドはそれそれユニークな配列 をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ 。ＳＥＬＥＸにより同定された核酸リガンドはそれぞれ、特定のターゲット化合 物または分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が実質的にいかな る化合物（モノマーであってもポリマーであっても）についてもリガンドとして 作用する(特異的結合対を形成する)のに十分な多様な二次元および三次元構造の 形成能、ならびにそれに十分な化学的多能性をそれらのモノマー内にもつという 、新しい洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分子も、ターゲットとする ことができる。 ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一 般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的に いかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ 法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合 に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に 結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を 解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド 濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目 的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和 性核酸リガンドを得る。 本発明により認識されるように、ＳＥＬＥＸ法は、核酸が化合物として広範な 形状、サイズおよび立体配置のアレイを形成することができ、生物学的系内で核 酸が示すよりはるかに広いレパートリーの結合その他の機能を示しうることを証 明する。 本発明者らは、いずれか特定のターゲットに対する核酸リガンドを同定しうる ものと類似の様式で、ＳＥＬＥＸまたはＳＥＬＥＸ様方法を利用していずれか特 定の反応を促進しうる核酸を同定できることを認識した。理論的には、核酸約１ ０13〜１０18の候補混合物内に、多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれ を促進するのに適した形状をもつ核酸が少なくとも１つ存在すると本発明者らは 仮定する。 多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。 たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願 、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動 と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択す ることが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年 ９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法 であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいは それらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法 が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月 ７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド” （現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子（非ペプチド系であ ってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬ ＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。米国特 許出 願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮 による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は米国特許第５，５６７， ５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと 低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記 載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性 などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和 性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／ またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。 ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米 国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌ クレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０， ９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化 学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載さ れている。前掲の米国特許出願第０８／１３４,０２８号には、２’−アミノ(２ ’−ＮＨ2)、２’−フルオロ(２’−Ｆ)、および／または２’−Ｏ−メチル(２ ’−ＯＭｅ)で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異 性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１ ９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジンを製造するための新規方 法：分子内求核置換”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌク レオチドが記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレ オチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。 これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日 出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在 は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９ ９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進 化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴ ヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性およ び複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。 ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原 性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包 含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５ 月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体 中において、親油性化合物、たとえばジアシルグリセロールまたはジアルキルグ リセロールと結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／７３９， １０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ） 核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において 、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン 脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したＶ ＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１号、１９９７年７ 月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合体”に記載されて いる。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体と して本明細書に援用する。 Ｂ．脂質構築体 脂質二重層小胞は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個 々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水 性部分はホスファト、グリセロホスファト、カルボキシ、スルファト、アミノ、 ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。親油性基の例は、飽和または不 飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小胞の 安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステロー ル類（たとえばコレステロール）および他の薬剤学的に許容しうる佐剤（α−ト コフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。 リポソームはこれらの二重層小胞の集合体であり、主に、脂肪酸鎖から構成さ れる２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露 されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する 極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、球状二重膜を形成する。し たがって膜のそれぞれの側は親水性表面となり、一方、膜の内部は親油性媒質を 含む。これらの膜を、内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で薄い水の 層で分離された一連の同心球状膜として配置させることができる。これらの多重 膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、小さな小胞、または単膜小胞（ＵＶ）に 変換することができる。 療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の 送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の 組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソーム は長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これに より投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に 適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。 多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な 位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき 、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎と なりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲ ティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。 これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれら の投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であると いう理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに 取込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアラン ス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。 リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内 および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違い が生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる ２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付 着させるものである。抗体はそれらの対応する抗原に対し高い特異性をもつこと が知られており、リポソームの表面に付着されたが、多くの場合、結果は成功と はいえなかった。しかし抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせ る幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、第５， ４４１，７４５号、または第５，４３５，９８９号参照。 研究者らが積極的に追求している領域の開発は、特定の細胞タイプのみでなく 、細胞の細胞質中へ、さらには核中へ薬剤を送達することである。これは、ＤＮ Ａ、ＲＮＡ、リボザイムおよびタンパク質など、生物学的薬剤の送達に特に重要 である。この領域の有望な療法の試みは、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリ ゴヌクレオチドを疾病の処置に用いるものである。しかしアンチセンス法の有効 適用に際し生じる重大な問題のひとつは、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオ チドがターゲット細胞に達する前に体液中で、細胞内および細胞外酵素、たとえ ばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解されるこ とである。静脈内投与によっても腎臓により血流から速やかにクリアランスされ 、有効な細胞内薬物濃度を生じるのには取込みが不十分である。リポソーム封入 は分解酵素からオリゴヌクレオチドを保護し、循環半減期を延長し、リポソーム が食作用されるため取込み効率を高める。こうしてオリゴヌクレオチドをインビ ボでそれらの目的ターゲットに到達させ、細胞に送達することができる。 研究者らがアンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性 高分子量化合物に付着させた数例が報告されている。しかしアンチセンスオリゴ ヌクレオチドは細胞内薬剤として有効であるにすぎない。上皮増殖因子（ＥＧＦ ）受容体をターゲティングするアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが 、ポリエチレングリコールスペーサーによりフォレートに結合させたリポソーム （フォレート−ＰＥＧ−リポソーム）に封入され、フォレート受容体仲介エンド サイトーシスにより培養ＫＢ細胞中へ送達された（Ｗａｎｇら(１９９５)９２： ３３１８−３３２２）。さらに、アルキレンジオールがオリゴヌクレオチドに結 合された（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，２４５，０２２号）。さらに、アンチ センスオリゴヌクレオチドに共有結合させた親油性化合物が文献に示されている （欧州特許第４６２ １４５Ｂ１号）。 リポソームへの生物学的薬剤の装填は、脂質配合物への含有または予め形成し たリポソームへの装填により達成できる。オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガン ドをリポソームの外面に受動的にアンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）させるこ とが記載されている（Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃ ｈｅｍ．８：１１１：１１８）。 Ｃ．ＶＥＧＦ 既存の内皮からの新たな血管の増殖（血管形成）は、健康な成人では正および 負の調節因子の対抗する作用によって厳密に制御されている。増殖性網膜症、慢 性関節リウマチ、乾癬および癌を含めた特定の病的状態では正の調節因子が支配 し、血管形成が疾病の進行の一因となる（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕ ｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２７−３１に概説）。癌の場合、血管形成が腫瘍 の増殖および転移の律速段階となるという考え（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９７１）Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２−１１８６）が、現在かなりの 実験的証拠により支持されている（Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎら（１９９３）Ｃａ ｎｃｅｒ ７１：１３６８−１３８３；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ（１９９ ４）Ｃｅｌｌ ７９：１８５−１８８；Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９０）Ｊ．Ｎａｔ ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６に概説）。 腫瘍組織の血管量は、胸部癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎ ｅｒら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４０１−４０９）、脳腫 瘍（Ｌｉら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：８２−８６）、および黒色腫（ Ｆｏｓｓら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９００−２９０３）に おける強い負の予後指標である。 現在までに多数の血管形成性増殖因子が報告されており、それらのうち血管内 皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が生理学的および病的血管形成の正の調節因子として重 要な役割を果たしていると思われる（Ｂｒｏｗｎら（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修） に概説、ビルクハウゼル、バーゼル、印刷中；Ｔｈｏｍａｓ（１９９６）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０３−６０６に概説）。ＶＥＧＦは、内皮細胞を 選択的に刺激して増殖、移動させ、マトリックス分解酵素を産生する、分泌型ジ スルフィド結合ホモ二量体である（Ｃｏｎｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１３２３−１３２７；Ｆｅｒｒａｒａおよ び Ｈｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ｕｎ．１６１：８５１−８５８；Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚｅｔら（１９８９ ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３１１−７３１５；Ｐｅ ｐｐｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ ｎ．１８１：９０２−９０６；Ｕｎｅｍｏｒｉら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．１５３：５５７−５６２）。これらはすべて新たな血管の形成に 必要なプロセスである。ＶＥＧＦは既知の唯一の内皮細胞特異性マイトジェンで あるほか、それが高分子に対する一過性の血管透過性増大を誘発する効力をもつ 点で、血管形成性増殖因子のうちで独特である（したがってその最初の別名は、 血管透過性因子、ＶＰＦである）（Ｄｖｏｒａｋら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６：５６２９−５６３２）。血管透過性増大とその結果起きる血管外空間での 血漿タンパク質沈着が、内皮細胞の移動のための一時マトリックスを提供するこ とによって新たな血管形成を助成する（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。実際、透過性過剰は腫瘍に伴う ものを含めて新生血管の特徴である（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐ ａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。さらに、組織低酸素により誘発さ れる代償性血管形成がＶＥＧＦにより仲介されることは、現在分かっている（Ｌ ｅｖｙら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４６−２７５３；Ｓｈｗｅ ｉｋｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５）。 ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子のオータナティブスプライシングの結果、４形態 （ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６ ）で生じる（Ｈｏｕｃｋら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０ ６−１８１４；Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６ ：１１９４７−１１９５４）。小さい方の２形態は拡散可能であるが、大きい方 の２形態はそれらがヘパリンに対し高い親和性をもつため主に細胞膜に局在した ままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘ パリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、受容体に対する親和 性 がより低く（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：５５１９−５５２３）かつマイトジェン効力も低い（Ｋｅｙら（１９９ ６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８−７７９５）ように思われる。 ＶＥＧＦの生物学的作用は、その発現が内皮由来の細胞に著しく限定された２種 類のチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ）により仲 介される（ｄｅＶｒｉｅｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９ ９１；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：８３５−８４６；Ｔｅ ｒｍａｎら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：５１９−５２４）。高親和性結 合にはこれら両方の機能性受容体の発現が必要であるが、内皮細胞における走化 性およびマイトジェン性のシグナル発生は、主にＫＤＲ受容体により起きると思 われる（Ｐａｒｋら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６ −２５６５４；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１ ３５−１４７；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発生にＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体が 重要であることは、ＶＥＧＦ遺伝子の１つの対立遺伝子を欠如するマウス（Ｇａ ｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒ ｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２）またはＦｌｔ −１の両方の対立遺伝子を欠如するもの（Ｆｏｎｇら（１９９５）３７６：６６ −７０）またはＦｌｋ−１遺伝子を欠如するもの（Ｓｈａｌａｂｙら（１９９５ ）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６２−６６）において最近証明された。それぞれの場 合、明らかに異常な血管形成がみられ、その結果、胚が死に至る。 ＶＥＧＦは、実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌され る（Ｂｒｏｗｎら（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎ ｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修）、ビルクハウゼル、バーゼ ル、ｐｐ．２３３−２６９）。ＶＥＧＦおよびその受容体が腫瘍の増殖の一因で あることの直接的な証拠が、ＶＥＧＦに対する中和抗体により（Ｋｉｍら（１９ ９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４）、優性ネガティブＶＥＧＦ受容 体ｆｌｋ−１の発現により（Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．５６：１６１５−１６２０；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒ ｅ ３６７：５７６−５７９）、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻 害薬により（Ｓｔｒａｗｎら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３５４ ０−３５４５）、またはＶＥＧＦ ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現に より（Ｓａｌｅｈら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３９３−４０１ ）、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻止できるという証明に より得られた。重要なのは、腫瘍の転移発生率もＶＥＧＦアンタゴニストによっ て著しく低下することが認められた点である（Ｃｌａｆｆｅｙら（１９９６）Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１７２−１８１）。 ＶＥＧＦ阻害薬は抗癌薬としての使用のほか、過度の血管形成を特徴とする多 様な増殖性疾患にも有用であり、これには乾癬、眼障害、膠原病および慢性関節 リウマチが含まれる。大部分のタイプの腫瘍はＶＥＧＦを産生することが知られ ているが、機能性ＶＥＧＦ受容体を発現することは最近まで示されていなかった 。カポジ肉腫（ＫＳ）細胞は多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥ ＧＦ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用すること が示された。カポジ肉腫は一般に、慣用される代謝拮抗性薬物を用いて治療され る。しかしＫＳ患者に化学療法を採用することの主な欠点は、これに伴って免疫 抑制が誘導されることであり、これは免疫系が既に低下している患者には重大な 結果をもたらす。代替療法の必要性は、ＫＳ病変が出現し始めているが他の点で は患者はかなり健康であると感じている疾病初期に特に大きい。これに関し、ダ ウノルビシンなどの化学療法薬をリポソームに封入するのは、抗腫瘍効力を維持 しつつ化学療法の副作用を最小限にする有望な方法であることが、最近証明され た。内皮由来の活性化した細胞、たとえば本明細書に記載する核酸リガンドＶＥ ＧＦアンタゴニストに選択的にターゲティングする低毒性薬物は、ＫＳの処置に きわめて有益であろう。 ＶＥＧＦ核酸リガンドに関する他の領域の臨床用途の可能性は、過度の血管形 成を特徴とする眼障害である。そのような障害の例は、黄斑変性および糖尿病性 網膜症である。黄斑変性の場合、黄斑（最高視力に関係する網膜部分）下の進行 性脈絡膜血管形成が視覚を妨害する。糖尿病性網膜症の場合、網膜における血管 形成が視覚を妨害する。黄斑変性および糖尿病性網膜症における血管増殖を開始 する最初の刺激は現在分かっていないが、ＶＥＧＦは重要な血管形成誘発因子で あると思われる（Ｌｏｐｅｚ，Ｐ．Ｆ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔ ｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，８５５−８６８；Ｋｌｉ ｆｆｅｎ，Ｍ．ら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８１，１５４ −１６２；Ｋｖａｎｔａ，Ａ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍ ｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，１９２９−１９３４；Ｐａｑｕｅ ｓ．ら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２３：１２ ５−１３０）。したがってＶＥＧＦの阻害薬は黄斑変性において血管形成を減少 させるのに有用となりうる。発明の概要 本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオ ロ（２’−Ｆ）−修飾ピリミジンＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リ ガンドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これは指 数的濃縮による系統的リガンド進化の頭字語である。本明細書に記載するリガン ドは、３０または４０の隣接位置でランダム化された当初約１０14ＲＮＡ分子の プールから選択された。本明細書には図２〜６に示す進化したリガンドが含まれ る。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物ま たは親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核 酸混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）候補となる混合物の貨子をＶＥＧＦに対 する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへ の結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得 ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガ ンドである）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高 分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または 親油性化合物からなる複合体を含む。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築体を包含 する。本発明はさらに、複合体を含む脂質構築体の製造方法であって、複合体が ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物からなる方法に関する。 他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ 核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与することに 関する。本発明はさらに、この複合体をさらに脂質構築体と結合させることによ り、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。 本発明の目的は、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性 化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体、およ びそれを製造する方法を提供することである。本発明の他の目的は、複合体を含 む脂質構築体を提供することである。本発明の他の目的は、改良された薬物動態 学的特性を備えた、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性 化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを提供することであ る。 ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物を含む複合体を目的と する本発明の態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコ ール、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい 。より好ましくは、ＰＥＧは約１０〜８０Ｋの分子量をもつ。最も好ましくは、 ＰＥＧは約２０〜４５Ｋの分子量をもつ。ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化 合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、親油性化合物はグリセロ リン脂質であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、脂質構築体は 好ましくは脂質二重層小胞、最も好ましくはリポソームである。好ましい態様に おいて、ＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）に共有結合した非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）はターゲティング能に作用すること ができる。 さらにＶＥＧＦ核酸リガンドは、複合体の一部ではない脂質構築体と共有結合 または非共有結合による相互作用により結合することができる。 さらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体または非免疫原性高分子量化 合物もしくは親油性化合物／ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を含む脂質構築体を目 的とする本発明の態様であって、脂質構築体が内部コンパートメントを定める膜 を備えたタイプのもの（たとえば脂質二重層小胞）である場合、脂質構築体と会 合したＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体は脂質構築体の膜と結合するか、また はコンパートメント内に封入されていてもよい。ＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構 築体の膜と結合した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドは膜の内側に面した部分 または外側に面した部分と結合し、これによりＶＥＧＦ核酸リガンドが小胞の内 側または外側へ突出していてもよい。特定の態様では、予め形成した脂質構築体 の外側にＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を受動的に装填することができる。核酸リ ガンドが脂質構築体から突出した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲテ ィング能に作用することができる。 脂質構築体のＶＥＧＦ核酸リガンドがターゲティング能に作用する場合、脂質 構築体はさらに療法用または診断用薬剤と結合していてもよい。１態様において 、療法用または診断用薬剤は脂質構築体の外側に結合している。他の態様におい ては、療法用または診断用薬剤は脂質構築体に封入されているか、または脂質構 築体の内側に結合している。さらに他の態様において、療法用または診断用薬剤 は複合体と結合している。１態様において、療法用薬剤は薬物である。他の態様 において、療法用または診断用薬剤は１またはそれ以上の他の核酸リガンドであ る。本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンド および非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本 発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻害する方法 を提供することである。本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶ ＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含 む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、腫瘍 の増幅を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥ ＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合 物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体 を投与することにより、カポジ肉腫を阻害する方法を提供することである。本発 明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドお よ び非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明 の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、黄斑変性を阻害する方法を提 供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、または ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を 含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、糖 尿病性網膜症を阻害する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、療法用または診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび 親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることに より、ＶＥＧＦを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤を ターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧ Ｆ核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法を提供するこ とである。 これらおよび他の本発明の目的、ならびに本発明の性質、範囲および有用性は 、以下の記載および請求の範囲の記載から当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２ ７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ） 、ＮＸ３１８３８脂質アミド１(図１Ｆ)、ＮＸ３１８３８脂質アミド２(図１Ｇ) 、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥ Ｇ（図１Ｉ）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体(Ｎ Ｘ３１８３８ｄ０)(図１Ｊ)、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含むＮ Ｘ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ５ アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ） 、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコールリ ンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１Ｒ ）の分子の記述を示す。リガンドの５’ホスフェート基を図中に表示する。ｍＰ ＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下記 のも のを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フ ルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’ Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合 を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合から なる主鎖修飾を表す。 図２は、ＶＥＧＦに対する種々の核酸リガンドの結合性を示す。非修飾核酸リ ガンド（ＮＸ２１３、白丸）、そのジアルキルグリセロール修飾類似体（ＮＸ２ ７８、白菱形）およびリポソームＮＸ２７８（ＮＸ２７８−Ｌ、白四角）、なら びに配列スクランブル型（ｓｃ）対照（ｓｃＮＸ２１３、黒丸；ｓｃＮＸ２７８ 、黒菱形；およびｓｃＮＸ２７８−Ｌ、黒四角）の結合親和性を、競合電気泳動 移動度シフトアッセイにより測定した。 ＮＸ２１３は ｓｃＮＸ２１３は てある。32 Ｐ５＝末端標識ＮＸ−２１３（１．５ｎＭ）を結合用緩衝液（０．０１％ヒト 血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水）中、３７ＥＣで２０分間、ＶＥ ＧＦ（０．３３ｎＭ）および競合体オリゴヌクレオチド（５ｐＭ−０．３３：Ｍ ）の存在下でインキュベートした。32Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体を、遊 離32Ｐ ＮＸ−２１３から８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分 離した（１９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド、トリス−ボラート、 ８９ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡを走行緩衝液とする）。種々の競合体濃度での32Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体に対応するバンドの強度を、リン−イマージャー 分析（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）により定量した。競 合体の不在下で形成された複合体の量につき正規化したデータを、最小二乗法で 競合結合方程式に当てはめた。 図３は、種々の核酸リガンドがＶＥＧＦ誘発性の血管透過性増大に与える影響 を示す。予めエバンス・ブルー色素を注射したモルモットに、核酸リガンドを含 む、または含まないＶＥＧＦ（２０ｎＭ）を、皮内注射した。注射部位の皮膚が 吸収した光の相対量を測定することにより、色素の漏出量を定量した。 図４は、ＮＸ２７８−ＬがＫＳ細胞の増殖を阻害することを示す。種々の濃度 のＮＸ２１３、ＮＸ２７８−ＬおよびｓｃＮＸ２７８−Ｌの存在下でのＫＳＹ− １細胞の増殖。ＫＳＹ−１細胞を、０日目に２４ウェルプレートに１×１０4細 胞／ウェルの密度で接種した。１および３日目に、同様に処理した新鮮な培地と 交換した。培養５または６日目に細胞をトリプシン処理し、粒子クールター計数 器で細胞数を測定した。実験を三重に数回行った。示した結果は代表的実験の平 均とＳＥである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＮＸ２７８が無胸腺マウスにおいてＫＳ細胞の増殖を阻 害することを示す。１日目に無胸腺マウスの前足後方にＫＳ腫瘍を移植した。マ ウスを２日目から始めて１日１回５日間、腹腔内注射によりＮＸ２７８−Ｌ（５ ０：ｇ／日／マウス、図５Ａ、および１５０：ｇ／日／マウス、図５Ｂ）で処理 した。対照マウスを、核酸リガンド処理群と同量の脂質を用いて空のリポソーム で処理した。２週間にわたって腫瘍サイズを測定した。１４日目に腫瘍を摘出し て測定した。 図６には、ＮＸ３１８３８ ２０Ｋ ＰＥＧ（□）、４０Ｋ ＰＥＧ（■）、 およびＮＸ３１８３８（マイナスＰＥＧ）（▽）の血漿濃度に関するデータを、 ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。 図７には、ＮＸ３１８３８ ＰＬの血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射 後の時間の関数としてまとめる。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパク質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガ ンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を 示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透 視により測定した。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ Ｐ ＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３ １８３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を 示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。 分子の記述に関しては図１参照。 図９Ａ〜９Ｃは、核酸リガンドによるＶＥＧＦ誘発性角膜血管形成の減少につ いての評価を示す。０または３ｐｍｏｌのＶＥＧＦタンパク質をバイオポリマー （ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示し たように動物を１日２回５日間、ＰＢＳまたは核酸リガンドの静脈内投与により 処理した。パネルＡ、ＢおよびＣは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３ １８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、またはＮＸ３１８３８−ＰＬ核酸リガンドによる全 身処理が与える効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊は３ｐｍｏｌ ＶＥ ＧＦ＋ＰＢＳ群と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図１０には、ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧの血漿濃度（○、△）または硝 子体濃度（●、▲、■）に関するデータを、投与後の時間の関数としてまとめる 。 図１１は、４０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ＮＡＬ）で１日２回（ＢＩＤ）処 理したヌードマウスにおいて、皮下で増殖するヒトＡ６７３腫瘍の腫瘍増殖曲線 を示す。陰性対照は４０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与したスクランブルＶＥＧＦ核 酸リガンド配列ＮＸ３１９１７ＮＡＬ（分子の記述に関しては図１Ｒ参照）から なっていた。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノク ローナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。４ ０ｍｇ／ｋｇ投与群と１０ｍｇ／ｋｇ投与群の間に有意差はないように思われた ので、１４日後は４０ｍｇ／ｋｇ群の投与をそれ以上行わなかった。マウス８匹 の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹 腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。腫瘍の体積（ｍｍ3 として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１２は、ＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８核酸リガンド（ＮＡＬ）の異なる投与計 画（投与期間中１日２回（ＢＩＤ）と１日１回（ＱＤ）の比較）、４０Ｋ ＰＥ Ｇの各バツチ（ＮＸ３１８３８．０７バッチと新たなＮＸ３１８３８．０４バッ チの比較）、および異なる薬物配合物（リポソームＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８Ｐ Ｌ ＮＡＬとＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ＰＬ ＮＡＬ ４０Ｋ ＰＥＧの比較） の腫瘍増殖曲線を示す。マウス８匹の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍 細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験 期間中続けた。数群で腫瘍の増殖しない動物があり、したがって最終分析につき 、ある群では７匹(ＮＸ３１８３８．０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、およびＮ Ｘ３１８３８．０４ ３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ)または６匹(ＮＸ３１８３８．０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、およびＮＸ３１８３８．０７ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩ Ｄ)の動物しかいなかった。腫瘍の体積(ｍｍ3として表示)を次式により判定した ： 腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１３は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３ ８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ ＮＡＬ）による、皮下増殖 中のＡ６７３腫瘍の用量依存性阻害を示す。この力価測定(ｔｉｔｒａｔｉｏｎ) は無効果量に達せず、最低（０．０３ｍｇ／ｋｇ）用量でもなお腫瘍阻害がみら れた。マウス８匹の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し 、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。Ｎ Ｘ３１８３８ ＮＡＬ ３ｍｇ／ｋｇ群では腫瘍の増殖しない動物が２匹あり、 したがって６匹の動物しかいなかった。腫瘍の体積（ｍｍ3として表示）を次式 により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１４は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３ ８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＡＬ）による、皮下増殖中の樹立した（ｓ ｔａｇｅｄ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）Ａ６７３腫瘍の阻害を証明する増殖曲線 を示す。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノクロー ナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。マウス に１×１０7個のＡ６７３細胞を移植し、腫瘍を２００±１００ｍｍ3の体積にま で増殖させ、この時点で動物を体重により選別し、永久識別のため入れ墨をし、 被験化合物の腹腔内注射による処理を開始し、実験期間中続けた。各時点で平均 ８匹のマウスであった。腫瘍の体積（ｍｍ3として表示）を次式により判定した ：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１５には、ボーラス注射後のＮＸ２１３、ＮＸ２７８、ＮＸ２７８−リポソ ームの血漿濃度に関するデータをまとめる。 図１６は、ヌードマウスに皮下移植したＫＳＹ−１腫瘍の増殖曲線を示す。マ ウスを、実験期間中１日２回のＮＸ３１９１７ ４０Ｋ ＰＥＧまたはＮＸ３１ ８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの腹腔内注射により処 理した。ヌードマウスの後方側腹部に２×１０7個のＫＳＹ−１細胞を皮下移植 した後、０日目に処理を開始した。各群４匹のマウスを用いた。誤差はＳＥＭで ある。発明の詳細な記述 定義： “共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。 “非共有結合による相互作用”は、分子が共有結合以外の、イオン相互作用お よび水素結合を含めた相互作用により互いに保持されるという意味である。 “親油性化合物”は、脂質および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相 と結合するか、またはそれらに分配される傾向をもつ化合物であり、実質的に親 油性成分からなる構造体がこれに含まれる。親油性化合物には、脂質、ならびに 脂質（および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相）と結合する傾向をも つ非脂質含有化合物が含まれる。コレステロール、リン脂質、ならびにグリセロ 脂質、たとえばジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール、ならびに グリセロールアミド脂質は、親油性化合物の他の例である。本発明の好ましい１ 態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合する親油性化合物は、下記の構 造をもつグリセロ脂質である： 式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2− ；ならびにＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−、ＣＨ3 （ＣＨ2）nＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n （ＣＯ）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ− でなければならず、Ｘは独立して（ＰＯ4）、ＯおよびＣＨ2ＯＣ＝Ｏよりな る群から選択され、ここでｎ＝０〜３０、好ましくは１０〜２０である。ＲがＣ Ｈ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−である場合、親油性化合物はリン脂質で ある。ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−である場合、親油性化合物は グリセロールアミド脂質である。ＲがＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−、またはＣＨ3（ＣＨ2 ）nＯＣＨ2−である場合、親油性化合物はジアルキルグリセロ脂質である。Ｒ がＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−またはＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）Ｏ−であ る場合、親油性化合物はジアシルグリセロ脂質である。好ましい態様においては Ｒ3はＸ−である。 本明細書中で用いる“複合体”は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物に共有結合させることにより形成される分子を表す 。本発明の特定の態様において、複合体はＡ−Ｂ−Ｙとして示され、ここでＡは 本明細書に記載する親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物であり；Ｂは 任意であって１またはそれ以上のリンカーＺであり；ＹはＶＥＧＦ核酸リガンド である。 本発明に関し“脂質構築体”は、脂質、リン脂質、またはその誘導体を含有す る構造体であり、多様な構造様式を含む。これらの脂質は水性懸濁液中に受容さ れることが知られている。これらの構造体には脂質二重層小胞、ミセル、リポソ ーム、エマルション、脂質リボンまたはシートが含まれるが、これらに限定され ない。これらは、薬剤学的に許容しうることが知られている種々の薬物および成 分と複合体を形成していてもよい。好ましい態様において、脂質構築体はリポソ ームである。好ましいリポソームは単層であり、２００ｎｍ未満の相対サイズを もつ。脂質構築体の一般的な追加成分には、特にコレステロールおよびα−トコ フェロールが含まれる。脂質構築体は単独で、または個々の用途に望まれる特性 を備えていると当業者が認めるいかなる組合わせでも使用できる。さらに、脂質 構築体およびリポソーム形成の技術的観点は当業者に周知であり、当技術分野で 慣用されるいかなる方法も本発明に採用できる。 本明細書中で用いる“核酸リガンド”は、ターゲットに対し望ましい作用をも つ、天然には存在しない核酸である。本発明のターゲットはＶＥＧＦであり、し たがってこの語はＶＥＧＦ核酸リガンドである。望ましい作用には、ターゲット を結合すること、触媒作用によりターゲットを変化させること、ターゲットまた はターゲットの機能活性を修飾／変化させるようにターゲットと反応すること、 自殺阻害物質と同様にターゲットと共有結合すること、ターゲットと他の分子の 反応を促進することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様におい て、その作用はＶＥＧＦに対する特異的結合親和性であり、その際、この核酸リ ガンドはＶＥＧＦが結合する既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。 本発明の好ましい態様において、本発明の複合体および脂質構築体のＶＥＧＦ 核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。ＶＥＧＦ核酸リガンドは、候補 となる核酸混合物（核酸がＶＥＧＦのリガンドである）から下記の方法で同定さ れる：ａ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させる、その際、ＶＥＧＦに対し候補混 合物と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる ；ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そしてｃ ）これらの高親和性核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物を得る（米 国特許出願第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題“血管 内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチド”；米国特許出 願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題“血管内皮増殖 因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド”参照；これら を本明細書に援用する）。 “候補混合物”は、目的とするリガンドをそれから選択する、種々の配列の核 酸の混合物である。候補混合物源は、天然核酸もしくはそのフラグメント、化学 的に合成した核酸、酵素により合成した核酸、または以上の方法の組合わせによ り製造した核酸から得ることができる。好ましい態様において、増殖プロセスを 促進するために、それぞれの核酸はランダム領域を囲む固定配列を含む。 “核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのいかなる化 学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に 付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎ ａｌｉｔｙ）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定され ない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プ リン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５− ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、たとえばヌクレオシド間ホスホロチオエー ト結合、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチ ジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には 、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。 “非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない、約１０００ 〜１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約１０００〜５００，０００Ｄａ、 最も好ましくは約１０００〜２００，０００Ｄａの化合物である。本発明の目的 に関し、免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫 原性高分子量化合物の例には、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレング リコールが含まれる。本発明の好ましい１態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンド に共有結合した非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールであり、構 造Ｒ（Ｏ（ＣＨ2）x）nＯ−をもち、ここでＲは独立してＨおよびＣＨ3よりなる 群から選択され、ｘ＝２〜５であり、ｎはほぼポリアルキレングリコールの分子 量／１６＋１４ｘである。本発明の好ましい態様において、分子量は約１０〜８ ０ｋＤａである。最も好ましい態様において、ポリアルキレングリコールの分子 量は約２０〜４５ｋＤａである。最も好ましい態様において、ｘ＝２、ｎ＝９× １０2である。１またはそれ以上のポリアルキレングリコールが同一ＶＥＧＦ核 酸リガンドに結合して、分子量の和が好ましくは約１０〜８０ｋＤａ、最も好ま しくは約２０〜４５ｋＤａであってもよい。特定の態様においては、非免疫原性 高分子量化合物も核酸リガンドであってよい。 “脂質二重層小胞”は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をも つ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。 親水性部分はホスファト、グリセロホスファト、カルボキシ、スルファト、アミ ノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。非極性基の例は、飽和また は不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。小 胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ステ ロール類（たとえばコレステロール）および薬剤学的に許容しうる他の成分（α −トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。 “リポソーム”は脂質二重層小胞の集合体であり、主に、長い脂肪酸鎖から構 成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に 暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向 する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、二重膜を形成する。し たがって膜のそれぞれの側は親水性表面を提供し、一方、膜の内部は親油性媒質 を含む。これらの膜は、形成されたとき一般に内部水性空間の周りにタマネギの 層と似た様式で層間水相により分離された、閉じた同心膜の系として配列する。 これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、単膜小胞（ＵＶ）に変換す ることができる。 “カチオンリポソーム”は、生理学的ｐＨにおいて全体として正の電荷をもつ 脂質成分を含有するリポソームである。 “ＳＥＬＥＸ”法は、ターゲットと望ましい様式で相互作用する（たとえばタ ンパク質への結合）核酸リガンドの選択と、選択したこれらの核酸の増幅との組 合わせを伴うものである。選択／増幅の工程を反復循環することにより、きわめ て多数種類の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作用する１ 種類または少数の核酸を選択することができる。選択した目標に達するまで、こ の選択／増幅操作の循環を続ける。ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に記載さ れている。 “ターゲット”は、それに対するリガンドを得たいという関心のあるいかなる 化合物または分子であってもよい。ターゲットは、タンパク質（たとえばＶＥＧ Ｆ、トロンビンおよびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク 質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態の類 似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、増殖因子など、制限がない。本 発明の主なターゲットはＶＥＧＦである。 “改良された薬物動態特性”とは、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性 化合物に共有結合するか、または脂質構築体と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドが 、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に結合していない、または脂 質構築体と結合していない同−ＶＥＧＦ核酸リガンドと対比して、より長い循環 半減期をインビボで示すことを意味する。 “リンカー”は、２以上の分子を共有結合または非共有結合による相互作用に よ り連結し、これらの分子１またはそれ以上がもつ機能特性を保存する様式で分子 を空間的に分離しうる分子である。リンカーはスペーサーとしても知られる。リ ンカーの例には、図１Ｍ〜１Ｐに示す構造体が含まれるが、これらに限定されな い。 本明細書中で用いる“療法”には、治療および／または子防が含まれる。療法 という場合、これはヒトおよび他の動物について述べたものである。 本発明は、２’−修飾ヌクレオチドを含む、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド を包含する。本発明はさらに、表２〜６（配列番号：）に示す、ＶＥＧＦに対す るＲＮＡリガンドを包含する。より詳細には、本発明は表２〜６に示す特異的核 酸リガンドと実質的に相同な核酸配列、および実質的に同じＶＥＧＦ結合能をも つ核酸配列を包含する。実質的に相同とは、７０％以上、きわめて好ましくは８ ０％以上、さらに最も好ましくは９０％、９５％または９９％以上の一次配列相 同性の程度を意味する。本明細書に記載する相同％は、比較する配列中の一致す るヌクレオチド残基とアラインする２配列のうち小さい方にみられるヌクレオチ ドの％として計算される。その際、アラインメントを補助するために１０ヌクレ オチドの長さに１ギャップを導入できる。実質的に同じＶＥＧＦ結合能とは、そ の親和性が、本明細書に記載するリガンドの親和性の１桁または２桁以内である ことを意味する。ある配列 − 本明細書に具体的に記載したものと実質的に相 同 − が同じＶＥＧＦ結合能をもつか否かの判定は、当業者が容易になしうる 。 表２〜６（配列番号：）に示す、ＶＥＧＦの核酸リガンドの配列相同性をみる と、一次相同性をほとんど、または全くもたない配列が、実質的に同じＶＥＧＦ 結合能をもつ場合があることが分かる。これらの理由から、本発明は表２〜６に 示す核酸リガンドと実質的に同じ推定構造または構造モチーフおよびＶＥＧＦ結 合能をもつ核酸リガンドをも包含する。実質的に同じ構造または構造モチーフは 、ツッカーフォールド（Ｚｕｃｋｅｒｆｏｌｄ）プログラム（Ｚｕｃｋｅｒ（１ ９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２参照）を用いる配列アラインメン トにより推定できる。当技術分野で知られているように、二次構造および構造モ チーフを推定するために他のコンピユータープログラムを使用できる。溶液中ま た は結合構造体としての実質的に同じ推定構造または構造モチーフの核酸リガンド は、ＮＭＲそのほか、当技術分野で知られている技術を用いて推定することもで きる。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物また は親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸 混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）この候補混合物の員子をＶＥＧＦに対する 親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへの結 合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得るこ とにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガンド である）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。 本発明はの他の目的は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有 結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体をを提供するこ とである。このような複合体は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物 と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドに優る下記の利点１またはそれ以上をも つ：１）改良された薬物動態特性、および２）改良された細胞内送達能、または ３）改良されたターゲティング能。さらに脂質構築体と結合した複合体も同じ利 点をもつ。 複合体、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくは複合体を含む脂質構築体は、こ れらの利点のうち１、２または３つをもつであろう。本発明の脂質構築体は、た とえば下記のものからなる：ａ）リポソーム、ｂ）リポソームの内部に封入され た薬物、およびｃ）ＶＥＧＦ核酸リガンドと親油性化合物からなる複合体であっ て、複合体のＶＥＧＦ核酸リガンド成分が脂質構築体の外側と結合し、そこから 突出しているもの。そのような場合、複合体を含む脂質構築体は、１）改良され た薬物動態特性をもち、２）封入された薬物の細胞内送達能が増大し、かつ３） 外側に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドにより、ＶＥＧＦを発現している予め選択 された位置にインビボで特異的にターゲティングする。 他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ 核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与する方法を 提供する。本発明はさらに、この複合体を脂質構築体とさらに結合させることに より、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良する方法に関する。 他の態様において本発明の複合体は、親油性化合物、たとえばグリセロ脂質、 または非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合した、ＶＥＧＦ核酸リガンドからな る。これらの場合、複合体の薬物動態学的特性はＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比 較して向上するであろう。他の態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原 性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成し、この複 合体を脂質構築体とさらに結合させるか、あるいはＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質 構築体に封入すると、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性がＶＥＧＦ核酸 単独と比較して改良される。 多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互作用 のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が多重のＶＥＧＦ核酸リガン ドを含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動 態特性が改良されるであろう。脂質構築体が多重のＶＥＧＦ核酸リガンドまたは 複合体を含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体のみがある脂 質構築体と比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。 本発明の特定の態様において、本発明の複合体は他の核酸リガンド１つ（二量 体）またはそれ以上（多量体）に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む。この核 酸リガンドはＶＥＧＦに対するものであってもよく、異なるターゲットに対する ものであってもよい。多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦと の多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が１また はそれ以上の他のＶＥＧＦ核酸リガンドに結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む 本発明の態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動 態特性が改良されるであろう。 非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物をＶＥＧＦ核酸リガンドの多様 な位置に、たとえば塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位、プ リンヌクレオチドの８−位、ホスフェートのヒドロキシル基、またはＶＥＧＦ核 酸リガンドの５’もしくは３’末端のヒドロキシル基もしくは他の基に、共有結 合させることができる。親油性化合物がグリセロ脂質であるか、または非免疫原 性高分子量化合物がポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコールで ある態様では、それは好ましくはそのホスフェート基の５’もしくは３’ヒドロ キシル基に結合する。最も好ましい態様では、親油性化合物または非免疫原性高 分子量化合物は核酸のホスフェート基の５’ヒドロキシル基に結合する。ＶＥＧ Ｆ核酸リガンドへの非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の結合は、直 接に、またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行うことができる。脂質構築 体が複合体を含む態様またはＶＥＧＦ核酸リンカーがリポソームに封入された態 様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体と脂質構築体との非共有結合による 相互作用が好ましい。 核酸を療法に用いる際に生じる問題のひとつは、オリゴヌクレオチドがそれら のホスホジエステル形である場合、目的とする効果を表す前に、体液中で細胞内 および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによ って速やかに分解される可能性があることである。ＶＥＧＦ核酸リガンドのイン ビボ安定性を高めるために、またはＶＥＧＦ核酸リガンドの送達を向上もしくは 仲介するために、ＶＥＧＦ核酸リガンドの特定の化学修飾を行うことができる。 本発明において考慮するＶＥＧＦ核酸リガンド修飾には、ＶＥＧＦ核酸リガンド 塩基またはＶＥＧＦ核酸リガンド全体に、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素 結合、静電相互作用および流動性を取り込む他の基を供給するものが含まれるが 、これらに限定されない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミ ジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５ −ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートま たはアルキルホスフェート修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえば イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに 限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めるこ とができる。 核酸リガンドをＳＥＬＥＸ法により得る場合、修飾はＳＥＬＥＸ前または後、 いずれの修飾であってもよい。ＳＥＬＥＸ前修飾によれば、ＶＥＧＦに対する特 異性および改良されたインビボ安定性の両方を備えたＶＥＧＦ核酸リガンドが得 られる。２’−ＯＨ核酸リガンドにＳＥＬＥＸ後修飾を行うと、核酸リガンドの 結合能に不都合な影響を与えずに、改良されたインビボ安定性が得ることができ る。本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドの好ましい修飾は、５’および３’ホスホロ チオエートキャッピング、ならびに／あるいは３’末端の３’３’逆転ホスホジ エステル結合である。最も好ましい態様では、好ましいＶＥＧＦ核酸リガンド修 飾は３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合である。さらに、一部または 全部のヌクレオチドの２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ2 ）、および２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾が好ましい。 本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドと非免疫原性高分子量化合物ま たは親油性化合物の共有結合により、非免疫原性高分子量化合物または親油性化 合物と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性 （すなわち、より遅いクリアランス速度）が得られる。 本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物を含む複合体をさらに脂質構築体と会合させることができ る。この会合により、脂質構築体と会合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較 して改良された薬物動態特性が得られる。ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を 共有結合または非共有結合による相互作用により脂質構築体と会合させることが できる。他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドを共有結合または非共有結合によ る相互作用により脂質構築体と会合させることができる。好ましい態様において 、会合は非共有結合相互作用による。好ましい態様において、脂質構築体は脂質 二重層小胞である。最も好ましい態様において、脂質構築体はリポソームである 。 本発明に用いるリポソームは当技術分野で現在知られている種々の方法または 今後開発される方法のいずれによっても調製できる。一般にそれらはリン脂質、 たとえばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料、たとえ ば中性脂質（たとえばコレステロール）、および界面改質剤、たとえば正に荷電 した化合物（たとえばコレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノース またはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した化合物（たとえばリン酸 ジセチル、ホスフアチジルグリセロール）を含有してもよい。多重膜リポソーム は常法により、すなわち脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させて容 器の内側に薄膜を残留させて、適切な容器または器の内壁に選択した脂質を沈着 させるか、または噴霧乾燥することにより形成できる。次いで容器に水相を添加 し、回転運動または渦撹拌運動を与えると、ＭＬＶが生成する。次いでＭＬＶの ホモジナイゼーション、超音波処理または押出し（フィルターを通して）により 、ＵＶを形成できる。さらに、界面活性剤分離法によりＵＶを形成できる。 本発明の他の態様において脂質構築体は、脂質構築体の表面と結合したターゲ ティング用ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）および封入された療法薬 または診断薬を含む。好ましくは脂質構築体はリポソームである。予め形成した リポソームをＶＥＧＦ核酸リガンドと会合するように修飾してもよい。たとえば カチオン性リポソームは静電相互作用によりＶＥＧＦ核酸リガンドと結合する。 グリセロ脂質などの親油性化合物に共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを、予め 形成したリポソームに添加してもよく、これによりグリセロ脂質、リン脂質また はグリセロールアミド脂質がリポソーム膜と結合する。あるいはリポソーム形成 中にＶＥＧＦ核酸リガンドをリポソームと結合させてもよい。 リポソームが広範な療法薬または診断薬の封入または取込みに有利であること は当技術分野で周知である。多様ないかなる化合物もリポソーム内部の水性コン パートメントに収容できる。療法薬の具体例には、抗生物質、抗ウイルス性ヌク レオシド、抗真菌性ヌクレオシド、代謝調節薬、免疫モジュレーター、化学療法 薬、毒素解毒薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含ま れる。同様に、脂質二重層小胞に診断用放射性核種（たとえばインジウム１１１ 、ヨウ素１３１、イットリウム９０、リン３２またはガドリニウム）、ならびに 蛍光物質、またはインビトロおよびインビボ用途において検出できる他の物質を 装填することができる。療法薬または診断薬を水性内部にリポソーム壁により封 入できることを理解すべきである。あるいは保有された薬剤が小胞壁形成材料の 一部であってもよく、すなわちその材料に分散または溶解していてもよい。 リポソーム形成中に、水溶性キャリヤー物質を水和溶液に含有させることによ り水性内部に封入し、そして親油性分子を脂質配合物に含有させることにより脂 質二重層に取り込ませてもよい。特定の分子（たとえばカチオン性またはアニオ ン性の親油性薬物）の場合、予め形成したリポソーム中への薬物の装填は、たと えば米国特許第４，９４６，６８３号に記載された方法で達成できる。その開示 事項を本明細書に援用する。薬物封入後、リポソームをゲルクロマトグラフィー または限外ろ過などの方法で処理して、封入されていない薬物を除去することが できる。次いでリポソームを一般に無菌的にろ過して、懸濁液中に存在する可能 性のある微生物を除去する。微生物は無菌処理によっても除去できる。 大型の親水性分子をリポソームで封入したい場合、逆相蒸発法（ＲＥＶ）また は溶剤注入法などの方法で、比較的大きな単層小胞を形成できる。リポソーム形 成のための他の標準法は当技術分野で知られている。たとえば商業的なリポソー ム製造方法には、米国特許第４，７５３，７８８号に記載されたホモジナイゼー ション法、および米国特許第４，９３５，１７１号に記載された薄膜蒸発法が含 まれる。それらを本明細書に援用する。 療法薬または診断薬が脂質二重層小胞の表面と結合していてもよいことを理解 すべきである。たとえば薬物をリン脂質またはグリセリドに結合させることがで きる（プロドラッグ）。このプロドラッグのリン脂質またはグリセリドの部分を 脂質配合物に含有させることによりリポソームの脂質二重層に取り込ませるか、 または予め形成したリポソーム中へ装填することができる(米国特許第５，１９ ４，６５４号および第５，２２３，２６３号参照。それらを本明細書に援用する )。 個々のリポソーム調製法が、意図する用途、および二重膜形成に用いる脂質の 種類に依存することは当業者に自明である。 ＬｅｅおよびＬｏｗ（１９９４，ＪＢＣ，２６９：３１９８−３２０４）、な らびにＤｅＦｒｅｅｓら（１９９６，ＪＡＣＳ，１１８：６１０１−６１０４） は、リガンド−ＰＥＧ−脂質と脂質成分の同時配合物によりＰＥＧ−リガンドが 内側と外側の両方に面したリポソームが得られることを最初に示した。受動アン カリングはＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：１ １１−１１８）が、オリゴペプチドリガンドおよびオリゴ糖リガンドをもっぱら リポソーム外面にアンカリングする方法として概説した。彼らの報文に提示され た中心的概念は、リガンド−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製し、次いで既存 の脂質二重層中への脂質テイルの自然取込み（“アンカリング”）により、予め 形成したリポソーム中へ配合しうるというものである。脂質基は、その疎水性脂 質アンカーを水溶液から抜き出し、次いで疎水性脂質二重層中に配置することに よって、より低い自由エネルギー状態に達するために、この挿入を行う。このよ うな系の重要な利点は、オリゴ脂質がもっぱら脂質二重層の外側にアンカリング することである。したがって、オリゴ脂質が内側に面した配向であることにより それらの生物学的ターゲットとの相互作用に利用されないため浪費されるという ことはない。 細胞へのＶＥＧＦ核酸リガンド送達効率は、リポソームと細胞膜の融合を促進 することが知られている脂質配合物および条件を採用することにより、最適化で きる。たとえば、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンなど 負に荷電した特定の脂質は、特に他の融合誘導物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）（たとえ ばＣａ2+など多価カチオン、遊離脂肪酸、ウイルス性融合タンパク質、短鎖ＰＥ Ｇ、リゾレシチン、洗浄剤および界面活性剤）の存在下で融合を促進する。ホス ファチジルエタノールアミンも、膜融合を高め、同時に細胞送達を促進するため に、リポソーム配合物に含有させることができる。さらに、たとえばカルボキシ ラート部分を含む遊離脂肪酸およびその誘導体を用いて、高いｐＨでは負に荷電 し、低いｐＨでは中性またはプロトン化しているｐＨ感受性リポソームを調製で きる。そのようなｐＨ感受性リポソームは、より高い融合傾向をもつことが知ら れている。 好ましい態様において、本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法で得ら れる。ＳＥＬＥＸは、米国特許出願第０７／５３６，４２８号、表題：指数的濃 縮による系統的リガンド進化、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３ １号、１９９１年６月１０日出願、表題：核酸リガンド、現在は米国特許第５， ４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１ ７日出願、表題：核酸リガンド、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際 特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）に記載されている。それぞれ本 明細書に援用するこれらの特許出願を、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。 ＳＥＬＥＸ法によれば、それぞれユニークな配列をもち、それぞれ目的とする ターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ核酸分子である一群 の生成物が得られる。ターゲット分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭 水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子も含めることができる。ＳＥＬＥ Ｘ法は、生物学的構造体、たとえば細胞表面またはウイルスを、その生物学的構 造体の一体部分である分子との特異的相互作用によりターゲティングするのにも 使用できる。 ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では下記の一連の工程により定義され る： １）候補となる、種々の配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に 固定配列の領域（すなわち候補混合物の各員子が同じ位置に同じ配列を含む）お よびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は以下のように選択される:（ａ ）後記の増幅工程を補助する、（ｂ）ターゲットに結合することが分かっている 配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の特定の構造様式の核酸の濃度を高 める。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいず れかの位置に見出す確率は１／４である）、または部分的にランダムであっても よい（たとえばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０〜１００％のいず れの水準でも選択できる）。 ２）ターゲットと候補混合物の員子の結合に好ましい条件下で、候補混合物を 選択されたターゲットと接触させる。これらの状況は、ターゲットと候補混合物 の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットに対し最も強い親和性 をもつ核酸の間に核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる。 ３）ターゲットに対し最も高い親和性をもつ核酸を、ターゲットに対しより低 い親和性をもつ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当す る配列はきわめて少数存在するにすぎない（おそらくわずか１分子の核酸）ので 、一般に分配に際し有意量の核酸（約５〜５０％）が保持されるように分配基準 を設定することが望ましい。 ４）分配に際し、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつとして選択された 核酸を、次いで増幅させて、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつ核酸が濃 縮された新たな候補混合物を形成する。 ５）上記の分配工程および増幅工程を反復することにより、新た形成された候 補混合物が含有するユニーク配列はいっそう少なくなり、ターゲットに対する核 酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にはＳＥＬＥＸ法は、最初の候補 混合物からターゲット分子に対し最も高い親和性をもつ核酸に相当する１または 少数の核酸を含有する候補混合物を与えるであろう。 多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。 たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願 、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動 と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択す ることが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年 ９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法 であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいは それらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法 が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月 ７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド” （現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子を識別しうる高特異 性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる方法が記載されて いる。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、 表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は米国特 許第５，５６７，５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリ ゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸ に基づく方法が記載されている。 米国特許出願第０７／９６４，６２４号、１９９２年１０月２１日出願、表題 “核酸リガンドの製造方法”（現在は米国特許第５，４９６，９３８号）には、 ＳＥＬＥＸによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。米国 特許出願第０８／４００，４４０号、１９９５年３月８日出願、表題“指数的濃 縮による系統的リガンド進化：化学ＳＥＬＥＸ”には、リガンドをそのターゲッ トに共有結合させる方法が記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性 などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和 性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／ またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。 ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米 国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌ クレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０， ９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化 学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載さ れている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２’−アミノ( ２’−ＮＨ2)、２’−フルオロ(２’−Ｆ)、および／または２’−Ｏ−メチル( ２’−ＯＭｅ)で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特 異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、 １９９４年６月２２日出願、表題“２’−修飾ピリミジンを製造するための新規 方法：分子内求核置換”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有するオリゴヌ クレオチドが記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレ オチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。 これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日 出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在 は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９ ９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進 化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴ ヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性およ び複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。 ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原 性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包 含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５ 月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。ＳＥＬＥＸ法はさらに、特 定のＶＥＧＦ核酸リガンドをジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロー ルなどの親油性化合物と結合させることを包含する。これはたとえば米国特許出 願第０８／７３９，１０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増 殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法 用複合体において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、ま たはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化 合物と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１ 号、１９９７年７月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合 体”に記載されている。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願 それそれを全体として本明細書に援用する。 ＳＥＬＥＸにより、高い親和性および卓越した特異性でターゲットと結合しう る核酸リガンドが同定される。これは核酸研究の分野で前例のない見事な成果で ある。これらの特性はもちろん当業者が療法用または診断用リガンドにおいて追 求する望ましい特性である。 薬剤として用いるのに望ましい核酸リガンドを得るために、核酸リガンドは好 ましくは（１）ターゲットに対し目的とする効果を達成しうる様式でターゲット に結合し；（２）目的効果を得るために可能な限り小さく；（３）可能な限り安 定であり；かつ（４）選択したターゲットに対し特異的リガンドである。大部分 の場合、核酸リガンドはターゲットに対し可能な限り最高の親和性をもつことが 好ましい。さらに、核酸リガンドは促進性をもつことができる。 同一出願人による米国特許出願第０７／９６４，６２４号、１９９２年１０月 ２１日出願（‘６２４）（現在は米国特許第５，４９６，９３８号）には、ＳＥ ＬＥＸによって改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。核酸リガ ンドの製造方法と題するこの‘６２４出願を本明細書に援用する。 ＳＥＬＥＸ法は、ランダム２’−アミノピリミジンＲＮＡライブラリーからＶ ＥＧＦに対する一群の高親和性ＲＮＡリガンドを同定し、ランダムｓｓＤＮＡラ イブラリーからｓｓＤＮＡリガンドを同定するために用いられた（米国特許出願 第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題：血管内皮増殖因 子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドの一部継続出願である、米 国特許出願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題：血管 内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド 参照；これら両者を本明細書に援用する；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：６８３−６９５も参照）。 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）がターゲティング能に作用しうる 態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドには、ＶＥＧＦ核酸リガンドがそのターゲ ットに結合しうるために保持しなければならない三次元構造がある。脂質構築体 が複合体を含み、この複合体のＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体の表面から突 出している態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、そのターゲット結合能が損 なわれないように脂質構築体の表面に対し適正に配向しなければならない。これ は、ＶＥＧＦ核酸リガンドをＶＥＧＦ核酸リガンドの結合用部分から離れた位置 で付着させることにより達成できる。この三次元構造および適正な配向は、前掲 のリンカーまたはスペーサーを用いることによっても保持できる。 複合体によりターゲティングする送達のために、多様な療法薬または診断薬の いずれも複合体に結合させることができる。さらに、脂質構築体によりターゲテ ィングする送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも前記の脂質構築 体に結合させ、封入し、または取り込ませることができる。 複合体がたとえばリポソームに会合した親油性化合物およびＶＥＧＦ核酸リガ ンドからなる態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、抗腫瘍薬（たとえばダウ ノルビシン）または造影剤（たとえば放射性標識）の送達のために、ＶＥＧＦを 発現している腫瘍細胞（たとえばカポジ肉腫）をターゲティングすることができ る。腫瘍の周囲の細胞や組織もＶＥＧＦを発現する可能性があり、これらの細胞 をターゲティングした抗腫瘍薬送達も有効であることを留意すべきである。 別態様において、ターゲット細胞へ送達すべき療法薬または診断薬が他の核酸 リガンドであってもよい。 本発明によればさらに、送達すべき薬剤（たとえばプロドラッグ、受容体アン タゴニスト、または治療もしくは造影のための放射性物質）をリポソームの外面 と結合するように複合体に取り込ませることができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと 同様に、これらの薬剤を共有結合または非共有結合による相互作用により結合さ せることができる。リポソームによりこれらの薬剤を細胞外からターゲティング 送達し、その際リポソームはリンカーとして作用する。 他の態様では、非免疫原性高分子量化合物（たとえばＰＥＧ）をリポソームに 結合させて、複合体の薬物動態特性を改良することができる。ＶＥＧＦ核酸リガ ンドをリポソーム膜に結合させるか、または非免疫原性高分子量化合物に結合さ せ、これを膜に結合させてもよい。この方法で複合体を血液タンパク質から遮蔽 し、こうしてＶＥＧＦ核酸リガンドがなおそのターゲットと接触して結合するの に十分な程度に露出した状態で、長期間循環させることができる。 本発明の他の態様では、２以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを同一リポソームの表 面に結合させる。これにより同じＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができ、 これを利用してＶＥＧＦ分子間に特異的相互作用を生じさせることができる。 本発明の別態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび異なるターゲットに対する 核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これによりＶＥＧＦを異な るターゲットに接近させることができ、これを利用してＶＥＧＦと他のターゲッ ト間に特異的相互作用を生じさせることができる。ターゲットを接近させる方法 としてリポソームを用いるほか、相互作用の強度を高めるためにリポソームに薬 剤を封入できる。 複合体を含む脂質構築体は、ＶＥＧＦに多くの結合相互作用をもたらすことが できる。これはもちろん複合体当たりのＶＥＧＦ数、および脂質構築体当たりの 複合体数、ならびにそれそれの膜中でのＶＥＧＦ核酸リガンドおよび受容体の移 動度に依存する。有効結合定数は各部位についての結合定数の積と共に増大する ので、多数の結合相互作用があることは実質的に有利である。すなわち、多数の ＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質構築体に結合させることにより、したがって多価を 形成することにより、ターゲットに対する多重複合体の有効親和性（すなわちア ビディティー）は、各部位についての結合定数の積と共に良好になるであろう。 本発明の特定の態様において、本発明の複合体はグリセロール脂質などの親油 性化合物に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドからなる。この場合、複合体の薬物動 態特性は、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して改良されるであろう。前記に述 べたように、グリセロール脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質を、Ｖ ＥＧＦ核酸リガンド上の多数の位置でＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合させるこ とができる。グリセロール脂質を用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドをホス ホジエステル結合により脂質に結合させることが好ましい。 本発明の他の態様では、脂質構築体がＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含 む。この態様において、グリセロ脂質は他の親油性化合物と結合する傾向をもつ ため、グリセロ脂質がリポソームへのＶＥＧＦ核酸リガンドの取込みを補助する ことができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと結合したグリセロ脂質を、配合物に含有 させることにより、または予め形成したリポソームに装填することにより、リポ ソームの脂質二重層に取り込ませることができる。グリセロ脂質は、ＶＥＧＦ核 酸リガンドがリポソームの内または外へ突出する様式で、リポソームの膜と結合 することができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソームの外へ突出する態様では 、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。脂質構築 体の薬物動態特性をさらに改良するために他の化合物を脂質構築体と結合させう ることを理解すべきである。たとえばＰＥＧを脂質構築体の膜の外側に面した部 分に結合させてもよい。 他の態様において、本発明の複合体は非免疫原性高分子量化合物、たとえばポ リアルキレングリコールまたはＰＥＧに共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドから なる。この態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して複合体の薬物動態特 性が改良される。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧをＶＥＧＦ核酸リガン ド上の種々の位置に共有結合させることができる。ポリアルキレングリコールま たはＰＥＧを用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドを５’ヒドロキシル基によ りホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。 特定の態様では、多数の核酸リガンドを単一の非免疫原性高分子量化合物、た とえばポリアルキレングリコールもしくはＰＥＧ、または親油性化合物、たとえ ばグリセロ脂質に結合させることができる。核酸リガンドはすべてがＶＥＧＦに 対するものであってもよく、ＶＥＧＦと他のターゲットに対するものであっても よい。多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互 作用のためアビディティーが増大する。さらに他の態様では、多数のポリアルキ レングリコール、ＰＥＧ、グリセロール脂質分子を互いに結合させることができ る。これらの態様では、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドまたはＶＥＧ Ｆおよび他のターゲットに対する核酸リガンドを、ポリアルキレングリコール、 ＰＥＧ、グリセロール脂質それそれに結合させることができる。これにより、同 様にターゲットに対するそれぞれの核酸リガンドのアビディティーが増大する。 多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセ ロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦ間に特異的相互作用を生じさせるため に、ＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができる。ＶＥＧＦおよび異なるター ゲットに特異的な多数の核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまた はグリセロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦおよび他のターゲット間に特 異的相互作用を生じさせるために、ＶＥＧＦおよび他のターゲツトを互いに接近 させることができる。さらに、ＶＥＧＦに対する核酸リガンドまたはＶＥＧＦお よび異なるターゲットに対する核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥ Ｇまたはグリセロール脂質に結合した態様では、薬物をポリアルキレングリコー ル、ＰＥＧまたはグリセロール脂質と結合させることもできる。したがって複合 体はその薬物をターゲティング送達し、その際ポリアルキレングリコール、ＰＥ Ｇまたはグリセロール脂質はリンカーとして作用する。 ＶＥＧＦ核酸リガンドはＶＥＧＦを選択的に結合する。したがってＶＥＧＦ核 酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体 、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくはその複合体を含む脂質構築体は、医薬ま たは診断薬として有用である。したがって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよ び非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＶＥ ＧＦ核酸リガンドを含むか、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分 子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を投与すること により、血管形成を阻止する方法を包含する。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合 体および脂質構築体を用いて、不適性なＶＥＧＦ産生を伴ういずれかの疾病状態 、特に血管形成を、治療、阻止、予防または診断できる。血管形成は月経周期お よび創傷治癒以外には、健康な成人で起きるのは稀である。しかし癌、糖尿病性 網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチ（これらに限定されない）を含 めた種々の疾病状態では、血管形成は主な特徴である。したがって本発明は、糖 尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチを、治療、阻止、予防ま たは診断する方法をも包含する（これらに限定されない）。さらに、ＶＥＧＦは 実 質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される。したがって本 発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性 化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではな いＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、癌 を治療、阻止、子防または診断する方法を包含する。癌の１タイプであるカポジ 肉腫（ＫＳ）では、細胞が多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥＧ Ｆ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用する。した がって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしく は親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一 部ではないＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することに より、カポジ肉腫を阻止する方法を包含する。 本発明の１態様において、脂質構築体はＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原 性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含み、さらに脂質構築 体に封入された、または脂質構築体の内側と結合した診断薬もしくは療法薬を含 む。好ましい態様において脂質構築体は脂質二重層小胞、より好ましくはリポソ ームである。療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒で ある薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対 し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。 リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもで き、これにより投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静 脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供で きる。 多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な 位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき 、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎と なりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲ ティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。 これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれら の投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であると い う理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取 込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス 速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。 リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内 および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違い が生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる ２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付 着させるものである。本発明の１態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソーム の外面に結合し、ターゲティング能に作用する。当業者に自明のとおり、リポソ ームの表面に抗体または特異的受容体リガンドなど、追加のターゲティング成分 を含有させてもよい。さらに、抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティン グさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、 第５，４３５，９８９号、および第５，４４１，７４５号参照。これらの代替タ ーゲティング法を採用するのは当業者に自明であろう。 ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物 を含む複合体、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは 親油性化合物からなる複合体を含む脂質構築体、ならびに複合体の一部ではない ＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものの、療法用または診断用組成 物を注射により非経口的に投与できる。ただし他の効果的な投与形態、たとえば 関節内注射、吸入ミスト、経口用配合物、経皮イオン導入または坐剤も想定され る。好ましいキャリヤーのひとつは、生理的食塩水であるが、薬剤学的に許容し うる他のキャリヤーの使用も考慮できる。１態様では、キャリヤーおよびＶＥＧ Ｆ核酸リガンド複合体が生理学的に適合する徐放性配合物を構成することが想定 される。このようなキャリヤー中の主な溶剤は、水性でも非水性でもよい。さら にキャリヤーは、配合物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌性 、安定性、溶解速度、または臭気を変更または維持するための、薬理学的に許容 しうる他の賦形剤を含有してもよい。キャリヤーは、ＶＥＧＦ核酸リガンドの安 定性、溶解、放出または吸収の速度を変更または維持するために、さらに他の薬 理学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、１回量形ま た は多数回量形の非経口投与用剤形を製造するのに普通に慣用されている物質であ る。 療法用および診断用組成物を配合した後、それを無菌バイアルに液剤、懸濁液 剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存で きる。このような配合物は、そのまま使用する形または投与直前に再構成する必 要のある形で保存できる。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含有する配合物を全身送達の ために投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、または膣もしくは直腸坐 剤による。 本発明の複合体および脂質構築体の利点には、下記のものが含まれる：ｉ）血 漿中での核酸リガンドの薬物動態が改良される；ｉｉ）核酸リガンドを、それら のターゲットとの相互作用のアビディティーを高めるために多価アレイで提示で きる；ｉｉｉ）異なる特異性をもつ提示核酸リガンド２以上を、同一リポソーム 粒子に組み合わせることができる；ｉｖ）リポソーム固有の腫瘍ターゲティング 特性を利用して、腫瘍への提示核酸リガンドの送達を高めることができる；およ びｖ）リポソーム内容物を特定のターゲットへ導くために、抗体のものに匹敵す る提示核酸リガンドの親和性と特異性を利用できる。大部分のタンパク質と異な り、熱、種々の分子変性剤および有機溶剤による提示核酸リガンドの変性は易可 逆性であるので、提示核酸リガンドは本明細書に記載する種類の製剤に好適であ る。 以下の実施例は本発明を説明し、具体的に示すために記載したものであり、本 発明を限定するものとみなすべきではない。以下の実施例に記載した核酸リガン ドの構造を図１に示す。実施例１には、核酸リガンドと脂質試薬の結合を記載す る。ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ２７８）−遊離リガンドとして、またはリポソ ームの二重層に取り込まれたもの（ＮＸ２７８−Ｌ）−のジアルキルグリセロー ル誘導体がインビトロおよびインビボでＶＥＧＦの活性を阻害する効力を、実施 例２に記載する。実施例３には、ＶＥＧＦに対する２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮ Ａリガンドを調製するための実験法を記載する。実施例４には、ＶＥＧＦに対す る２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡリガンドを記載する。実施例５には、グリセロ 脂質、リン脂質、およびグリセロールアミド脂質、ならびにＰＥＧ修飾した ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成を記載する。実施例６には、リン脂質（ＰＬ）およ びＰＥＧ修飾したＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態特性を記載する。実施例７に はＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製、実施例８〜１０にはＶＥＧＦ 核酸リガンド複合体のインビボ有効性を記載する。実施例１１には、ウサギにお けるＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの硝子体内薬物動熊を記載する。実施例１． ジアルキルグリセロール（1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロール ）修飾VEGF核酸リガンドの合成 本実施例においては、核酸リガンドと脂質試薬とのコンジュゲートを記載する 。（1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロール）修飾VEGF核酸リガンドの合成を 以下に示す。 スキーム１ テトラエチレングリコールモノトシル酸（2a）：テトラエチレングリコール(2 00mL,1.15mol)を500mLのピリジンに溶解し、０℃に冷却し、22.0g(0.115mol)の 塩化p-トルエンスルホン酸にて処理した。溶解が完結した後、反応混合液を冷却 装置内に一晩保存し、その後、減圧下で濃縮した。残渣を800mLのEtOAcに溶解し 、３ｘ600mLのH2Oにて抽出した。H2O画分をEtOAcにて戻し抽出し、合わせたEtOA c画分を飽和Na2HPO4水溶液にて抽出した。有機層 をMgSO4上で乾燥させ、無色の油になるまで濃縮した。800mLのシリカゲルを用い 、ヘキサン、25％ EtOAc-50％ EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％ MeOH-20％ MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにてその油を精製 し、純粋な生成物を23．7g（60％）、および少量の不純物を含む生成物を11％得 た。 テトラエチレングリコールモノフタルイミド（3a）：攪拌した31.96g（0.092m ol）の2aの400mL無水DMF溶液に、14.2ｇ（1.05当量）のフタルイミドおよび14.4 mL（1.05当量）の1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデク-7-エンを加えた。溶液 を70℃にて18時間熱し、その後減圧下で濃縮した。1600mLのシリカゲルを用い、 25％ EtOAc-50％ EtOAc-75％ EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％ MeOH-20％ MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗黄色油を精 製し、23.8ｇ（80％）の3aを油として得た。静置するとすぐに、3aは蝋状白色固 体になった。 化合物4aの合成:15g(0.0464mol)の3aの150mL THFおよび15mL DMF溶液を、Ar下 ０℃に冷却した。臭化アリル（6.0mL、1.5当量）を溶液に加え、1.76ｇ（1.5当 量）のＮａＨを固体として加えた。不透明な黄色の懸濁液を０℃にて30分間、そ の後室温で18時間攪拌した。MeOH（50-100mL）を加え濃縮し、その後混合液を減 圧下で濃縮した。1500mLのシリカゲルを用い、25％EtOAc-50％ EtOAc-75％ EtOA cのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フ ラッシュカラムにて粗物質を精製し、11.05ｇ（65％）の4aを黄色油として得た 。 1-ジメトキシトリチル-3-(フタルイミドテトラエチレングリコール)-sn-グリ セロール(9）：スキーム１に従い、化合物９を以下のように合成した。すなわち 、攪拌した4a（10.13ｇ、0.0279mol）の100mLアセトンおよび１mLH2O溶液に、3. 98ｇ（1.22当量）のN-メチルモルフォリン-N-オキシドを加えた。この懸濁液に 、1.75mL（0.005当量）の四酸化オスミウムを2.5％のiPrOH溶液として加えた。O sO4溶液の添加後、反応混合液は透明な黄色になった。4aの完全な変換（約16時 間）を示すTLC解析の後、反応混合液を1.5ｇのヒドロ亜硫酸ナトリウムおよび5. 0ｇのforisilにて処理し、30分間攪拌した。懸濁液をflorisilにて濾過し、濾液 を油にまで濃縮した。1.0ｇの4aから同様にして調製した別の群とこの粗生成物 を合わせた。100mLピリジン部分２つを、合わせたロットから共蒸発させ、残渣 を300mLピリジンに溶解した。溶液を0℃に冷却し、10.89ｇ（1.05当量）の塩化4 ,4'-ジメトキシトリチルを加えた。乾燥管をフラスコ内に挿入し、反応混合液を 室温で16時間攪拌した。溶液を20mLのMeOHにて処理し、減圧下、水浴の温度を40 ℃以下に保ちながら、濃縮した。1100mLのシリカゲル（3％トリエチルアミンの ヘキサン溶液を用いてカラムに湿装填した）を用い、10-100％ EtOAcのヘキサン 溶液（すべて3％トリエチルアミンを含む）にて溶出する、フラッシュカラムに て粗油を精製し、21.3g（2工程後、89％）の９を黄色油として得た。 1-ジメトキシトリチル-3-(アミノテトラエチレングリコール)-sn-グリセロー ル（10）：スキーム１に従い、化合物10を以下のように合成した。すなわち、化 合物９（5.2ｇ、7.2mol）を50mLの40％メチルアミンのH2O溶液に溶解し、10mLの メタノールを加えて出発物質を可溶化した。反応溶液を50℃にて５時間熱し、そ の後、減圧下で濃縮しトルエンと共蒸発させた。200mLのシリカゲルを用い、15 ％メタノールアンモニアのジクロロメタン溶液にて溶出する、フラッシュカラム にて粗物質を精製した。3.94ｇ（96％）の10を薄い黄色の油として回収した。 スキーム２ クロロホルム酸19：攪拌した３g（5.03mmol）の1,2-ジ-Oオクタデシル-sn-グ リセロール18の60mLトルエン溶液に、200mLの1.93Mホスゲン溶液を加えた。さら にホスゲン溶液（2X10mL；計15.4当量のホスゲン）を、アル コール出発物質が残らなくなるまで（濃縮した分注物の1H NMR解析による）加え た。過剰のホスゲンおよびHClをアスピレーターによって除き、反応混合液を減 圧下濃縮し、目的とするクロロホルム酸19を白色粉末として3.3g(98％)得た。 コンジュゲート20：攪拌した2.25ｇ（3.95mmol）の10の60mLピリジン溶液に、 2.6ｇのジステアリルグリセロールクロロホルム酸18を加えた。２時間後の濃縮 した分注物の1H NMR解析により、残っているクロロホルム酸がないことが明らか になり、混合液を減圧下濃縮した。0.5ｇ（0.88mmol）の10および0.58ｇのクロ ロホルム酸から同様に調製した物質と粗残渣を合わせ、200mLヘキサン、その後 、250mLのそれぞれ10-20および30％ EtOAcのヘキサン溶液、500mL40％ EtOAcの ヘキサン溶液、その後、それぞれ50-60-70および80％ EtOAcのヘキサン溶液、最 後に250mLのEtOAcにて溶出する、100mLのシリカゲル上のフラッシュシリカゲル カラム（2％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、合わせたロ ットを精製した。生成物を含む画分を濃縮し、3.3ｇ（57％）のコンジュゲート2 0を得た。 ホスホロアミダイト21：攪拌した3.8ｇ（3.26mmol）のコンジュゲートの25mL CH2Cl2溶液に、1.14mL（6.52mmol）のジイソプロピルエチルアミンエテン、その 後1.09mL（4.88mmol）の2-シアノエチルN,N-ジイロプロピルクロロ-ホスホロア ミダイトを加えた。２時間後、混合液をCH2Cl2にて希釈し、飽和NaHCO3溶液にて 洗い、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。100mLヘキサン、その後、250mLのそれぞ れ10および20％EtOAcのヘキサン溶液、500mL 30％EtOAcのヘキサン溶液、その後 、250mLの50％ EtOAcのヘキサン溶液にて溶出する、125mLのシリカゲル上のフラ ッシュシリカゲルカラム（2％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した） にて、粗残渣を精製した。生成物を含む 画分を濃縮して4.2g（95％）のホスホロアミダイト21を得た。31 PNMR(CDCl3)d151.52,151.08. VEGF核酸リガンド-1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロコンジュゲート ホスホロアミダイト21（スキーム2）を用い、1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリ セロ基をVEGF核酸リガンドNX213（図1A参照）とコンジュゲートさせた。得られ たコンジュゲートをNX278（図1B）と名付けた。NX278を逆相HPLCにより精製し、 その組成を電子スプレー質量分析器にて確認した（観測されたm/s＝11703”4、 算出したm/z＝11720）。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合をNX278内の８ つの位置（3'および5'末端）に用いたが、予想質量と観測質量間の16質量単位の 違いは、おそらく平均で１分子あたり予想よりも１つ少ないホスホロチオエート 結合をもたらす硫化剤による、不完全な酸化のためである。実施例２． 核酸リガンド-リポソーム複合体のin vitroおよびin vivoにおける効 力。リポソーム二重層内に埋め込まれたジアルキルグリセロール（DAG）修飾VEG F核酸リガンド（NX278） NX-278（１mg）（図1B;配列番号：2）を、噴霧乾燥したDSPC：コレステロール （50mg/ml;2:1、Mol:Mol）の混合物と、９％ショ糖を含む25ｍＭリン酸（pH7.4 ）緩衝液中でインキュベートし、プローブ型音波処理器を用いておよそ60度Ｃで 、乳光色の溶液が得られるまで15-30分間音波処理することにより、NX278-リポ ソーム複合体を調製した。リガンドNX278の配列を乱雑化した(scrambled)類似体 （scNX278）（図1C;配列番号：3）を含む、対照核酸リガンド-リポソーム複合体 を同様にして調製した。典型的な調製物において、平均直径が50nmで1/2高にお ける分布幅が20nmであるリポソームが得られた。リポソーム粒子のサイズは、粒 子解析装置(Leeds ＆ Northrup Model Microtrack UPA 150、Horsham，PA）で求 めた。比較可能なサイズ分布のリポソームを、同じ脂質組成だが脂質コンジュゲ ートした核酸リガンドなしで得た。50nmのリポソームは、二重層の両側に提示さ れた平均40の核酸リガンドを含むと期待される。計算は以下のように行った。コ レステロールに対して19C、ジステアリルホスファチジルコリンに対しては60Cと 、リポソーム内の表面積を仮定す ると、外径50nmで膜厚20Cの球状のリポソームに関してリポソームあたり3.13x104 という多数の脂質分子を得た。リポソームの組成物（2：1mol：molジステアリ ルホスファチジルコリン（MW＝790.2）:コレステロール（MW＝386.7））から、 脂質の均一な分布を仮定すると、リポソームの分子量2.1x107が計算された。 リポソームの内側と外側表面間の核酸リガンドの分配を決定するために、リポ ソーム製剤内のNX278の、T1リボヌクレアーゼに対する接近しやすさを調べた。 配列内の２つのリボグアノシン（Green et al．(19950 Chemistry and Biology2 :683-695)で、NX278はリボヌクレアーゼT1により効率よく切断される。NX278を 予め形成したリポソームで単にインキュベートすると、リボヌクレアーゼT1から 核酸リガンドを保護しない。しかし、NX278が音波処理によりリポソーム内に取 り込まれている場合は（NX278-リポソーム）、約1/3がヌクレアーゼから保護さ れる。ヌクレアーゼの活性に影響することなくリポソームを阻害する0.1％ trit on X-100をNX278-リポソームに加えると、それまで保護されていた核酸リガンド が切断にさらされる。これらの結果は、核酸リガンドが二重層の両側に分布して いるという概念と一致する。NX213 、NX278、およびNX278-リポソームの、VEGFに対する結合親和性 NX213、NX278、およびNX278-リポソームの、VEGFに対する結合親和性を、競合 電気泳動移動度シフト法(図2)を用いて調べた。VEGFに対するNX278の結合親和性 はNX213のものと同等であった。NX278-リポソームの見かけの結合親和性は、NX2 78と比較して３倍低かった。観察された親和性減少の一部は、核酸リガンド画分 のリポソーム内部への限局のためであるかもしれない。予想したように、配列を 乱雑化した類似体はVEGFに十分低い親和性で結合する（図2）。 NX213 、NX278、およびNX278-リポソームの血漿薬物動態学的特性 時間の関数としてのSprague Dawleyラットの血漿内のNX213、NX278、およびNX 278-リポソームの濃度を図15に示し、コンパートメント解析のパラメーターを表 １に要約する。NX213の大部分は、t1/2が７分かつ全体的なクリアラ ンス速度が6.8ml/kg/minで、α相において急速に除去される。核酸リガンドにリ ン脂質をコンジュゲートさせると、NX213と比較して増加したβ(t1/2)かつ幾分 遅い全体的なクリアランス速度（4.95ml/kg/min）で血中から極めて二相性なク リアランスという結果になる。NX278のリポソーム内への取り込みは、核酸リガ ンドの血漿からのクリアランスが実質的にさらに減少することを示す（1.88mg/k g/min）。 HUVEC 増殖および血管新生に対するNX278の効果 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）の増殖に対する、NX278-リポソーム、scN X278-リポソームおよびNX213の効果を調べた。HUVECをVEGF（10ng/ml）存在下、 10％胎児ウシ血清（FCS）およびヘパリン（45:g/ml）を含むIMDM:Ham's F12(1:1 )培地中で培養した。細胞を24穴ゼラチンコートした24穴プレートに１穴あたり2 0,000細胞の密度で０日目にまき、0.1nMから１:Mのあいだの濃度の上記リガンド で、１、２、および３日目に処理した（リガンドを加えた培地と置き換える）。 NX278-リポソームはHUVECの増殖を〜300nMのIC50(核酸リガンド成分の濃度)で阻 害し;scNX278-リポソームおよびNX213は有意に低い効果（IC50＞1:μM）であっ た。 VEGFはトリ尿膜（CAM）アッセイにおいて血管新生を誘導し、このアッセイは 血管新生を阻害する化合物を研究するのに用い得る。VUGFに浸したフィルターデ ィスクをCAM上に置くことによりアッセイを行い、新血管の発生を定量化し得る 。NX278-リポソームはVEGFが誘導する血管新生を効果的に阻害した（データは示 さず）が、一方、NX213、NX278およびscNX278-リポソームは効果がなかった。こ れらの研究はともに、NX278がin vitroにおけるVEGFが誘導する内皮細胞の増殖 およびin vivoにおける新血管形成の特異的阻害剤であることを証明する。 VEGF が誘導する毛細血管透過性に対するNX278の効果 VEGFは、毛細血管の透過性を一過性に増強する既知の唯一の血管新生因子であ る。NX278-リポソームの、in vivoにおけるVEGFの血管透過性活性を阻 害する能力を調べた。血管透過性アッセイ（Milesアッセイ（Miles，A．A．and Miles，E.M．（1952）J.Physiol.（London）118:228）として知られている）を 、本来記載されているように（Senger，R.S.et al，(1983)Science 219:983）モ ルモットにおいて行った。１μMの濃度のNX278-リポソーム、NX278、およびNX21 3をVEGF（20nM)とともに、あらかじめエバンスブルー色素を注入しておいたモル モットの皮内に注入した。VEGFに応答して、血管透過性の上昇のためにアルブミ ンに結合したエバンスブルー色素が管外溢出し、注入部位に青い斑点を生じる結 果となる。有機溶媒抽出による色素回収率は一般的に非常に低いため、皮膚を透 過する光の吸収を測定する定量方法が開発された。NX213、NX278、NX278-リポソ ームおよびVEGFに対する中和モノクローナル抗体は、図３に示すようにVEGFが誘 導する透過性をすべて有意に阻害した。核酸リガンドの中で、NX278-リポソーム はもっとも強力なアンタゴニストであるとみられた。これらの化合物の配列を乱 雑化した類似体は阻害性ではなかった。この違いは目視観察で劇的かつ顕著であ った。 NX278-L はin vitroにおいてカポジ肉腫細胞株を阻害する VEGFの阻害剤は、腫瘍の進行および転移が新血管形成に依存する悪性腫瘍を含 め、様々な疾患において有益である可能性がある。ほとんどの種類の腫瘍はVEGF を産生すると知られているが、機能するVEGF受容体を発現していることが示され たものはこれまでに一つもない。最近、カポジ肉腫（KS）細胞が大量のVEGFを産 生するのみならず、機能するVEGF受容体をも発現しており、それゆえVEGFを自己 分泌性(autocrine)増殖に用いていることが示された。したがって、KS細胞株はN X278の、自己分泌性VEGF増殖活性を阻害する能力を調べる唯一の機会を提供する 。 KS細胞の増殖に対するNX278-リポソーム、scNX278リポソームおよびNX213の効 果を調べた。KS細胞株KSY-1を、ゼラチンコートした24穴プレートに１穴あたり7 ,500-10,000細胞の密度で、２％FCS，L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプ トマイシンを補ったRPMI 1640を含む培地中、０日目にまいた。核酸リガンドを1 、2、および３日目に新鮮な培地中に0.1nMから１μMのあいだの濃度で加え、細 胞計数を４日目に行った。NX278-リポソームはKS 細胞の増殖を100nMのIC50で阻害し、１μMのNX278-リポソームではこれらの細胞 の増殖は完全に阻害された。scNX278-リポソームおよびNX213は>１μMのIC50値 を示した（図4）。 NX278- リポソームはin vivoにおいてKS細胞の増殖を阻害する VEGFはKS細胞の増殖因子であるため、in vivoにおけるKS腫瘍に対するVEGFアン タゴニストの効果は２倍、すなわち腫瘍とともにいる内皮細胞に対するVEGFの傍 分泌性(paracrine)増殖効果の阻害および腫瘍細胞に対する自己分泌性増殖効果 の阻害であるとみられる。KS細胞はしたがって、VEGFアンタゴニストに対して特 に感受性であり得る。核酸リガンドのin vivoにおける活性を試すために、腫瘍 トロカール（3mm3）を無胸腺のマウスに１日目に移植し、２日目から開始して50 、100または150μg/日/マウスで５日続けて処理した。腫瘍増殖の速度を２週間 ごとに測定した。NX278-リポソームは用量依存的に、50μg/日/マウス用量とい うもっとも低い投与量で極めてわずかな腫瘍増殖阻害を示し（図5A）、100およ び150μg/日/マウス投与量の両方で腫瘍増殖阻害を示した(図5B、150μg/日/マ ウスを示す)。空のリポソーム(図5A、B)、scNX278-リポソームも、NX213およびN X278と同様に調べたすべての用量で無効果だった。加えて、NX278-リポソームは VEGFが誘導する血管からの液体漏出を阻害した。 実施例３．VEGFに対する2'-フルオロピリミジン修飾RNAリガンドに関する 実験手順 本実施例は、VEGFに対する2'-フルオロ修飾核酸リガンドの開発に関する実施例 ４に続き、援用されている一般的な手順を提供する。 材料 昆虫細胞株Sf21から精製した組み換えヒトVEGF165を、キャリアーのない凍結 乾燥粉末としてR ＆ DSystemsより購入した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩 水に、10μMの濃度になるように再懸濁し、少量に分注して使用するまで-20℃に て保存した。分注物を融解後４週間まで４℃で保存した。Sf 21発現させ たマウスVEGF164および大腸菌発現させたヒトVEGF121、VEGF/PIGFヘテロ二量体 、およびPIGFも、キャリアーのない凍結乾燥調製物としてR ＆ D Systemより購 入した。 オリゴヌクレオチドはOperon Technologies，Inc.から購入したか、あるいはA pplied Biosystems Model 394オリゴヌクレオチド合成機を用い、最適化された プロトコールにしたがって合成した。2'-F-および2'-OMe-リボヌクレオチドホス ホロアミダイトはJBL Scientific，Inc．(San Luis Obispo，CA)により調製され た。2'-F-ピリミジンNTPもJBLから購入した。2'-OH-プリンNTPおよびdNTPはPhar macia Biotech,Piscataway,NJより購入した。 T.aquaticus耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）をPerkinElmer-Cetus 、（Foster City,CA）から購入し；AMV逆転写酵素（AMV RT）をLife Science,In c.から；クレノーDNAポリメラーゼをNew England Biolabs,Beverly,MAより購入 した。T7 RNAポリメラーゼをEnzyco,Inc.(Denver,CO)から購入した。sequenase DNAポリメラーゼはUnited States Biochemical Corp．(Cleveland,OH)により生 産されたものである。 α-[32P]-ATPおよびγ-[32P]-ATPはNew England Nuclear(Boston,MA)より得た 。 SELEXプロトコール SELEX手順はSELEX特許出願に詳細に記載されている。化学的に合成したDNAオ リゴヌクレオチドライブラリー（"30N7"および"40N7"）を、共通の5'および3'固 定配列（5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG(30または40Ｎ)CAGACGACTCGCCCG A-3';配列番号：）が両側に接している、30または40ヌクレオチドの無作為化し た領域により調製した。各鋳型の5'末端のイタリック体にしてあるヌクレオチド はT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列と一致する。鋳型の調製と増幅、および 逆転写において使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーも合成した。すな わち、5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'（“3N7”；配列番号：）および5'-TAATACGACTCA CTATAGGGAGGACGATGCGG-3'(“5N7”；配列番号：)。 プライマー3N7を30N7または40N7ライブラリーにアニールさせ、クレノー DNAポリメラーゼまたはAMV RTを用いてプライマーを伸長させることにより、二 本鎖DNA鋳型を調製した。AMV RTに用いたより高いインキュベーション温度（37 ℃よりもむしろ45℃）は、高次構造をとった鋳型オリゴヌクレオチドにもかかわ らず完全な伸長をより促進し得る。T7 RNAポリメラーゼを、各１mM2'-OH-ATPお よびGTP、各３mM 2'-F-CTPおよびUTP、および50μCiα-32P-ATPの存在下用いて ライブラリーを転写した。RNAを含むゲルスライスを切り出し、粉砕し、２mM ED TAに長時間浸すことにより、RNAを変性ポリアクリルアミドゲルから精製した。 親和性選別し、その後選別したプールを増幅するというSELEXの過程は、詳細 に記載されている（SELEX特許出願参照）。簡潔に述べると、選別と増幅の一巡 を以下のように行った。すなわち、VEGFを5-または10-倍過剰のRNAと、１mM MgC l2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSM）中で（30N7および40N7ライブラリー）あ るいはトリス緩衝生理食塩水、１mM MgCl2、１mM CaCl2（TBSMC）中で（30N7 ラ イブラリーのみ）混合し、続いて混合物を３倍に希釈した。37℃にて15分間イン キュベーションした後、混合物を0.45μ Type HAフィルター（Millipore）に通 し、VEGFとRNAの複合体を回収した。2:1フェノール、pH７：７M尿素中でインキ ュベートすることにより、選別したフィルターからRNAを溶出した。水層から精 製した後、RNAをプライマー3N7にアニールさせ、AMV RTを用いて逆転写した。3N 7および5N7プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼを用いた15サイクルのポリメ ラーゼ連鎖反応（PCR）により、得られたcDNAを増幅した。PCR産物の転写により 、VEGFに親和性を有する配列に富んだ新しいライブラリーが得られた。４巡目に 、VEGF非存在下におけるかなりのバックグラウンドフィルター結合シグナルが、 選別した３つのうちのすべてのRNAプールに出現した。フィルターに結合したRNA のプールを除くため、５巡および６巡目は、非結合分子からVEGF結合RNAを分離 するための代替計画で行った。すなわち、RNAプールを増殖因子とインキュベー トした後、各混合物を8％ポリアクリルアミド、非変性ゲルにのせ、10Wで45-60 分間、4℃にて電気泳動した。VEGF/RNA複合体はこの系において非結合のRNAより も上方に移動し、ゲルにＸ線フィルムを感光させることにより 可視化された。これらの巡目では、上に記載したように粉砕および浸漬法により 、選別したRNAを精製した。選別および増幅を12巡した後、選別したプール内の 個々の分子を、Stratagene(La Jolla，CA)のpCR-Script Direct Cloning kitを 用いてクローン化した。アルカリ溶解法（PERFECTprep Plasmid DNA kit,5Prime →3Prime,Boulder，CO）を用いてプラスミドを精製し、Perkin Elmer(Foster Ci ty，CA)より入手可能なDye Terminator Cycle Sequencingkitを用いて、クロー ン化した領域の配列を得た。蛍光の配列を決定するラダーを国立ユダヤ人センタ ー、Brain Kotzin研究室、Denver、COにて読んだ。配列をファミリーに分類し、 目で整列させた。 結合親和性の測定 転写の際のα-32P-ラベルされたNTPの取り込みにより、あるいはγ-32P-ATPお よびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成した後に放射標識された核酸リガ ンドを、低濃度で様々な濃度のVEGFまたは他の増殖因子と、37℃にて15分間イン キュベートした。インキュベーションはTBS、PBS、またはHEPES緩衝生理食塩水 （HBS）、pH7.4中で、補足の二価の陽イオンを添加するか、あるいは添加せずに であった。あらかじめ洗っておいた0.45μm Type HAフィルター（Millipore）に 試料を通し、続いて結合バッファーにより5-10ml洗いを行った。フィルターをシ ンチラントに浸し、計数して各フィルターに保持されているタンパク結合RNAの 量を見積もった。特異的なタンパク質に結合している核酸リガンドの平衡解離定 数（KD）をGreen et al．(1996)Biochem．35;14413-14424に記載のデータ点から 算出した。 核酸リガンド断片の親和性選別 10pmolの内部放射標識された、高親和性VEGF核酸リガンドの転写産物を、S7ヌ クレアーゼにより部分的に切断し、放射標識された断片の混合物を作った。断片 化されたRNAの1/10を、ニトロセルロースを通す濾過の前に、10pM VEGFと45ml結 合バッファー中でインキュベートした。フィルターから回収された選別した断片 を、高分離能変性ポリアクリルアミドゲル上で無選別の断片のプー ルをのせたレーンの隣で泳動した。最小の選別したバンドをそれぞれゲルから精 製し、5'末端をポリヌクレオチドキナーゼでさらに標識して比活性を増加させた 。試料の1/2をもとの転写産物のcDNAとアニールさせ、Sequence DNAポリメラー ゼを用いて鋳型の末端まで伸長した。精製された断片およびその伸長産物の移動 度と標準の配列決定ラダーとの比較を用い、選別された断片のもっともらしいサ イズおよびもとの転写産物内における位置を決定した。親和性選別された断片と 配列上一致する合成オリゴヌクレオチドを調製し、端を一部切断した核酸リガン ドがVEGFに対する親和性を保持しているかどうか確かめた。 2'-0Me-置換 実質的にGreen et al．(1995)Chem．Biol．2:683-695に記載されているように して、2’-OMe-置換実験を行った。５または６つの2'-OH-プリン位が部分的に2' -OMe-置換されている、３または４つのライブラリーを、端を一部切断したリガ ンド３つ（t22、t2、t44）のそれぞれについて調製した。各プリン位はライブラ リーのうちのただ一つにおいて部分的に2'-OMe-修飾されていた。各5'-放射標識 されたライブラリーをVEGFとインキュベートし、タンパク質と結合した置換オリ ゴヌクレオチドをニトロセルロースフィルター上に回収した。選別したプールお よび開始の無選別のライブラリーをアルカリによって部分的に加水分解し、生成 物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。選別したプール内のその位置 における加水分解から得られたホスホロイメジ（phosphorimage）シグナルを、 無選別のライブラリー内の同じ位置に関して得られたシグナルで除すことにより 、“バンド強度比”を各プリン位に対して決定した。特定の位置に対する範囲よ りも十分に下がったバンド強度比は、親和性選別したプール中の2'-OHの（2'-OM eに対する）偏りを示す。 結合速度定数 少量（典型的には１pmolより少ない）の5'-放射標識された核酸リガンドを、 二価の陽イオンを補った１mlの緩衝生理食塩水中で、１nM VEGFと37℃にてイン キュベートした。時間“ゼロ”の時点で、50μlをニトロセルロースに通 して濾過し、タンパク質に結合したRNAの画分を決定し、その後、過剰（別々の 実験において100または500nM）の非標識核酸リガンドを加え、50μl分注物をそ の後の時点で濾過した。フィルターをシンチラント中で計数し、各時点でVEGFに 依然として結合している放射標識されたRNAの量を求めた。結合したRNAの画分（ f）対時間としてプロットしたデータを、指数減少に関する等式に当てはめた。 すなわち、 式中、f0は時間ゼロの時点で結合していたRNAの画分であり、ｋは解離速度定数 （kd）であり、ｂは実験の終わりの時点でのフィルターに対する、放射標識され たRNAの残留結合（事実上、タンパク質の非存在下）である。以下の等式： にしたがい、測定したｋdおよびKD値から会合速度定数（kas）を算出した。 実施例４．VEGFに対する2'-フルオロ-修飾RNAリガンド リガンドの選別 30または40の無作為なヌクレオチドを含む2'-F-ピリミジン修飾RNAのライブラ リーから、VEGFに対するリガンドを３つの独立したSELEX実験にて単離した。選 別は、１mM MgCl2を補ったPBS(30Nおよび40Nライブラリー)あるいは１mM MgCl2 および１mM CaCl2を含むトリス緩衝生理食塩水(30Nライブラリーのみ)中で行っ た。およそ1014の独特な配列を各実験の最初の選別サイクルに含めた。10サイク ル後、VEGFと各RNAプールの間の親和性は、開始プールと比較しておよそ1000倍 に改善された。さらに２サイクル後、結合親和性に関してさらなる改善が観察さ れたなかったため、12巡目のプールの個々の要素をクローン化し、各選別から約 50個の配列を決定した。 VEGF165に対するオリゴヌクレオチドリガンドを３つの独立な SELEX実験にて 単離した。個々のクローンを単離し、配列を決定し、共通な一次構造モチーフに 基づいて配列をファミリーに分類した（表2）。各リガンドの名前は、標的（V=V EGF）、選別バッフアー（P=PBS；T=TBS）、ライブラリー内の無作為化した領域 の長さ（30または40ヌクレオチド）およびクローン番号（小数点 以下）を示す。ある配列が解析したクローン内に現れる頻度は括弧内に示し、た だ一ヌクレオチドだけ異なる配列は共通の前駆体のPCR突然変異のためであると し、適切な記号（Y=UまたはC）で配列内に示してある不定な塩基と一緒に分類し た。すべてのリガンドに共通な固定配列を、一番上のロアーケース内の文字で示 す。個々のクローンについて、可変領域の配列をアパーケース内に示す。いくつ かのリガンドに関しては、可能性として考えられる二次構造に寄与する、ロアー ケース内の固定領域配列を可変領域配列に追加してある。VEGFに対する結合の高 親和性Kdを各リガンドについて示す。各ファミリーのうちの一つのリガンドを、 さらなる解析のために選んだ（灰色の囲み）。 解析した台計143クローンのうち、１ヌクレオチド以上異なる76個の配列を得 た。これらの配列のうちの44個は、保存された一次構造モチーフに基づいた３つ の主要なファミリーに分類することができた（表2）。５またはそれ以下の要素 の少数ファミリーに分類し得る配列および単離したものの中で唯一であった“孤 児(orphan)”配列を表６に示す。ファミリー１および２により定義される一次構 造モチーフを含むリガンドは、３つの親和性選別のすべてにおいて現れた。両フ ァミリーの保存されている一次構造間の類似性は、それらが同様の二次構造をも 共有し得ること、および/またはそれらが同様の接触領域を用いてVEGFを阻害し 得ることを示唆している。ファミリー２のメンバーは、大“ループ”内の保存さ れた配列モチーフを囲む、塩基対になった短い軸を形成する可能性を共通に有し ている（表２中の下線）。閉鎖したA/U塩基対を除き、予想される軸領域内の配 列同一性は保存されていない。一次構造よりはむしろ二次構造を保存している塩 基のこのような“共-変異(co-variation)”は、予想される軸の存在を支持して おり、この構造がこのファミリーのVEGFリガンドの高親和性立体構造にとって重 要であり得るということを示唆している。ファミリー１配列間には、同様に保存 された塩基対相互作用は一つも検出されなかった。リガンドの第３のファミリー は、TBSMC（ファミリー３、表2）中で行った選別においてのみ現れた。非常に保 存された一次構造モチーフに加えて、このファミリーのすべてのメンバーにおい て、保存された領域の3'の配列は、5'固定領域内のヌクレオチドに相補的な塩基 対を共通に有している（表２中の下線）。リガンドのほとん どに関しては、予想される軸の5'側の塩基はその塩基対形成相手と共に変化する とは言えないため、この観察は共通の二次構造をさほど予言するようなものでは ないが、それにもかかわらず、このファミリーに由来する最小の高親和性配列に 関する当初の推測（以下に記載する）は、このモチーフの強力な保存によって導 かれた。VEGFに対する個々のRNAリガンドの親和性を、その相互作用のKDの単一 決定に基づいて見積もった。わずかな例外を除き、リガンドは増殖因子に対して 、KDが５と50pMの間という、非常に高い親和性を示した。 最小のリガンド 各配列ファミリーを定義する共通の一次および二次構造モチーフは、VEGFに対 する高親和性結合に必要な最小配列要素をほのめかしている。各ファミリー由来 の典型的なリガンドの、入れ子した端切断（nested truncation）（表２中の灰 色の囲みで示す）を、化学合成により作り、VEGFに対するそれらの相対的な親和 性を求めた（表3）。リガンドVP30.22、VP30.2およびVT30.44の端を切断した版 を化学合成により調製し、VEGFに対するそれらの親和性を、実施例３に記載のよ うに求めた。最初の端切断（t22、t2、t44）を、5'および/または3'末端から欠 けている塩基を加えてオリゴヌクレオチドを合成することにより、さらに精製し た。化学合成を始めるために、リガンドのいくつかの最も3'のヌクレオチドを、 2-OH-シチジンを2'-F-シチジンに置換すること（下線）により、あるいは3'-3'- 結合デオキシチミジン“キャップ”を加えること（星印）により修飾した。各オ リゴヌクレオチドの長さ（引くキャップ）およびVEGFに対する結合の高親和性KD を示す。 クローンVP30.22（ファミリー1）由来の最小配列に関する当初の予測は、精製 した、全長のリガンドの親和性選別した断片の末端のマッピングにより行った（ 実施例３参照）。この29ヌクレオチド分予（“t22”）は、全長のリガンドと比 較してVEGFに対する結合親和性の点でおよそ３倍の喪失を示した。この分子の3' 末端のさらなる端切断は、親和性の点で険しい喪失をもたらしたが、さらに６個 までのヌクレオチドを、ほとんど、あるいは全く無影響で5'末端から除き得た（ 表3）。ファミリー２由来のクローンVP30.2およびファミリー３ 由来のクローンVT30.44について、予想される５塩基対軸およびすべての保存さ れた配列モチーフを含む、端切断したリガンド“t2”および“t44”を合成した 。端切断したいずれのリガンドも全長分子のほとんど全ての結合活性を保持して いた。一回に一つの予想塩基対（リガンドの各末端から１ヌクレオチド）を欠失 させることによるさらなる端切断は、親和性を徐々に喪失させた。したがって、 これらの配列に関しては、可能性としてあり得る二次構造に基づいた端切断は、 最小の高親和性リガンドを非常によく予測た。さらに、予想される軸がこれらの リガンドの高親和性立体構造に寄与するという仮説を支持する。 2'-OMe修飾 RNAオリゴヌクレオチドの2'-OH位の2'OMeによる置換は、ラット尿中にも他の 生物分泌液中にも存在するヌクレアーゼに対する安定性を改善することが観察さ れている。ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性は、治療または診 断剤としてのそれらの成功にとって重大であるとみられる。運悪く、2'-OMe-修 飾ヌクレオシド三リン酸は、一般的には標準的な反応条件下ではRNAポリメラー ゼに基質として受け取られない。しかし、2'-OMeプリンは化学合成によって特異 的なオリゴヌクレオチド内に導入し得る。いくつかの高親和性2'-OHプリンRNAリ ガンドが、驚くべきことに標的タンパク質に対する親和性をわずかに失うだけで 高い割合の2'-OMeプリン置換を受けるであろうということが観察されている。2' -OMe置換がVEGFに対する高親和性結合に影響しないようなプリン位を同定するた めに、１回あたり５または６個のプリンを修飾ヌクレオチドで部分置換してリガ ンドt2、t22およびt44のいくつかの合成を調製した（実施例３に記載）。各部分 置換ライブラリーの親和性選別を用い、VEGFに対する十分な親和性を保持した分 子を単離した。そのような親和性選別したプールにおいて、置換を許容しない位 置は2'-OHに偏っており、したがって、無選別のライブラリー内の同じ位置に比 較して、アルカリによる加水分解に対してより高い感受性を示す。5'-放射標識 された、無選別および親和性選別したプールをアルカリにより部分的に加水分解 し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。リガンドt22におい てはG10およびA12が、親和性選別したプ ール内の2'OHにかなりの偏りを示し、リガンドt2においてはA6およびG21が、そ してリガンドt44においてはA5およびA6がそうであった。前述の解析により2'OMe ヌクレオチドによる置換を許容しないと見られる位置を同定されるが、これらの データからは、他のすべてのプリンの同時修飾がいかに結合親和性に影響するか は予想し得ない。実際、G10、A2およびG22（これらは2'-OHに対してぎりぎりの 優先を示した）を除きすべて2'-OMe-プリンで合成したリガンドt22は、すべて2' -OH-プリン配列よりよいわけではないとしても、それと同等の親和性でVEGFに対 して結合した（表４）。 端切断したオリゴヌクレオチド（t22、t2、およびt44）を、１、２または３個 以外はすべてのプリン位を2'-OMe-プリンで置換して、化学的に合成した。残っ ている2'-OH-プリンを、各リガンド名の中に示し、リガンド配列中に太字で示す 。各置換リガンドのVEGFに対するKDを示す。G22におけるさらなる置換は、VEGF に対する結合にわずかしか影響しなかったが、予想されたように、G10またはA12 に2'-OMeを導入するのは、結合親和性にとって不利益だった。同様に、リガンド t2およびt44は、VEGFに対する核酸リガンドの親和性に３から４倍の影響で、２ 個以外はすべてのプリンにおける2'-OMe-置換を許容した(表4)。 置換端切断体の結合の親和性および速度定数 最小の長さの、非常に2'-置換されたVEGF核酸リガンドの同定を期待して、結 合を劇的には減少させなかったすべての2'-OMe置換を、端切断したリガンドt22 、t2a、およびt44a（表３参照）に導入した。2'OHヌクレオチドを太字で示し、2 'OMeヌクレオチドを無修飾の文字で示す。得られた核酸リガンド、t22-OMeおよ びt44-OMeは、VEGFに対してKDがそれぞれ67pMおよび49pMで結合したが、一方で リガンドt2OMeはKDがおよそ140pMで結合した（表５）。これらのKDは、NX-213（ KD=140pM）、以前記載されている（本明細書中で参考文献として援用されている 、アメリカ合衆国特許出願No．08/447.169参照）VEGFに対する2'-NH2-ピリミジ ン-、2'-OMe-プリン-置換オリゴヌクレオチド阻害剤に、有利に匹敵する。端切 断された2'-OMe-置換オリゴヌクレオチドのそ れぞれが、VEGFに対する結合に関してNX213と、そしてお互いに競合することが わかった。 ３つの2'-OMe-置換リガンドのそれぞれについて、大過剰の非標識リガンドを 加えた際に、放射標識したリガンドとVEGF間の完成した複合体が失われるのを追 跡することにより、解離速度定数（kd）を決定した。リガンドt22-OMeは半減期 がおよそ60秒で、最も速い解離速度を示した。リガンドt2-OMeおよびt44-OMeは 、それぞれ半減期が170および90秒のオーダーで、わずかに遅い解離速度を示し た。会合速度定数（ka）は、平衡解離定数と解離速度定数から算出され（KD=kd/ ka）、３x107から２x108M-1sec-1の範囲であった（表5）。このような会合速度 は、これらのリガンドとVEGF間の、近接した移動が限られた結合相互作用を示唆 しており、他の標的に対するSELEX由来核酸リガンドに関して観察された会合速 度定数と一致している。 二価の陽イオン依存性 ファミリー１および２のリガンドは、マグネシウム陽イオンの存在下で選別し たが、ファミリー３リガンドはマグネシウムとカルシウムの両方を含むバッファ ー中で選別した。二価の陽イオンは、高親和性RNA構造の非特異的または特異的 な安定化を介してRNA/タンパク質相互作用に寄与し得るため、VEGFに対する典型 的なリガンドの高親和性結合にマグネシウムおよび/またはカルシウムが必要で あるかどうか検討した。核酸リガンドt22-OM2およびt2-0Me（それぞれファミリ ー１および２由来）の親和性は、補足の二価の陽イオンあるいはキレート剤EDTA の非存在または存在下で変わらなかった（データは示さず）。しかし、ファミリ ー３リガンドは、リガンドt44-OMeに代表されるように、VEGFに対する高親和性 に関してカルシウム存在に対して絶対的な依存性を示した。結合バッファー中の 二価の陽イオンをEGTAによって置き換えると、結合は劇的に減少した（KD>10-7 ）。二価の陽イオンを除いた結合バッファーに過剰のMgCl2を加えても、結合親 和性に改善はみられなかったが、CaCl2は、EGTAよりも２倍モル過剰で、結合活 性を完全に元に戻した。同様の結合挙動が無修飾のリガンドt44についても観察 された（データは示さず）。 タンパク質特異性 本明細書中で記載のオリゴヌクレオチドは、この増殖因子の２つの拡散性アイ ソフォームのうちの大きい方である、VEGF165に対する親和性に基づいて選別さ れた。小さい方のアイソフォームであるVEGF121は、VEGF165内の１つのエキソン を欠いており、後者と異なりヘパリンに結合しない。３つの端切断された2'-OMe -置換オリゴヌクレオチドのいずれも、VEGF121に対して測定できるほどの親和性 で結合しなかった。さらに、オリゴヌクレオチドとインキュベートする前にタン パク質をDTTにて還元すると、いかなる結合も観察されないため、VEGF165の天然 の構造は３つの核酸リガンドのすべての結合に必須である。 VEGFは種間で非常に保存されたタンパク質であり、ヒトVEGF165およびマウスV EGF164アイソフォームは88％の配列同一性を示す。端切断された、2'-OMe置換リ ガンドはヒトおよびマウスVEGFに対して同等によく結合した。しかし、保存され た血小板由来増殖因子様ドメイン間でVEGFと53％の配列同一性を有する胎盤由来 タンパク質であるPIGFのホモ二量体に対するいかなるリガンドについても、結合 は観察されなかった。VEGFとPIGFのヘテロ二量体が最近、正常および腫瘍由来細 胞株の両方の上清から単離され、そのようなヘテロ二量体は、高親和性VEGF受容 体２つのうちの１つに対する結合に関して、および培養内皮細胞における誘導性 の応答に関して活性を示す。VEGFIPIGFヘテロ二量体の生物学的な関連は未知で ある。親和性は大幅に減少したが、十分な結合がVEGF/PIGFヘテロ二量体につい て観察された。これらのデータは、核酸リガンドが二量体をとる２つのサブユニ ット間の中間面またはその近傍で結合すること、およびPIGFは高親和性結合に必 要な接触部位のすべてに存在するわけではないということを示唆し得る。あるい は、核酸リガンド結合表面に必然的なひずみをもってPIGFとのヘテロ二量体に参 加することにより、VEGFサブユニットの構造が変えられている可能性がある。 実施例５．リン脂質、グリセロールアミド脂質及びＰＥＧ−修飾ＶＥＧＦ核酸リ ガンドの合成 各種親油性化合物／核酸リガンド複合体の合成に以下の３つの異なる製剤（fo rmulation）を用いた： １．ＰＬ製剤の合成のためのＣ−１８ホスホロアミダイト Ｃ−１８ホスホロアミダイト調製の概略をスキームＩに示す。１−オクタデカ ノールを標準条件でリン酸化した。反応混合物を処理した後、残渣をシリカゲル カラムでヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（９０：１０：５）を用いて 精製して純粋生成物２１．５ｇ（５７％収率）を得た。 ＩＩ．脂質アミド１の合成 このホスホロアミダイトは前記ＰＬとは異なり、アミド結合をもつ。この脂質 をコンジュゲートすることから得られるオリゴの構造を以下に示す。いくつかの 実験から、有機溶媒中への化合物２の高い不溶性がＮＭＲとＭＳによる性状決定 と、化合物２のＤＡＧアミド１へのさらなるホスフィチル化を不可能にしている ことを示している。しかしながら、脂質−スペーサーアミダイト調製（スキーム Ｉ）の結果から、混合物を還流したらクロロ-(2-シアノエトキシ)-N,N-ジイソプ ロピルアミノ-ホスフィンによる化合物２のホスフィル化（phsphylation）が進 行すると期待した。ＤＡＧアミダイトを製造するこのアプローチをスキームＩＩ に示す。 スキームII N,N'-ビス（ステアロイル)-1,3-ジアミノプロパノール-2（２） ClCH2CH2Cl(50mL)中の塩化ステアロイル(6.789g，22.41mmol）の溶液を、ClCH2 CH2Cl(100.0mL)とTEA(2.896g，22.41mmol)中の1,3-ジアミノ-2-ヒドロプロパン （1.0g，11.10mmol）の溶液中に室温で攪拌しながら滴下した。添加終了後、一 晩混合物を７０℃に加熱すると透明溶液が生成し、この溶液を室温に冷却、濾過 し、固体をCH2CH2、CH3OH、5％ NaHCO3及びエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥 すると２（6.40g,93％収率）を白色固体として得た。N,N'-ビス（ステアロイル）-O-(ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスフ ィニル)-1,3-ジアミノプロパノール-2（１） 一晩真空乾燥した化合物２（5.80g，9.31mmol）を無水CH2Cl2（150.0mL）に入 れて、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（4.2mL,18.62mmol）を注入した。混合 物を氷水浴で冷却しクロロー(2-シアノエトキシ)-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホ スフィン(8.6mL，0.47mmol)を注入した。30分攪拌後、混台物を60℃に90分加熱 した。室温に冷却後、不溶性物質を濾過し溶液を５％ＮａＨＣＯ3及びブライン で洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をＣＨ3ＣＮから沈殿させ ると純粋生成物(4.65g,61％収率）を白色固体として得た。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ3，ppm）：154.04 Ｉ．ＤＡＧ−スペーサーアミダイト、脂質アミド２の合成 ジアミド化合物２（これは脂質アミダイト１の直接の中間体である）の溶解性 を緩和するために脂質アミダイト中にヘキサ（エチレングリコール）を導入した 。脂質−スペーサーアミダイト３の調製の概略をスキームＩに示す。THF中での 化合物５と1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンとｔ−ブトキシドカリウムとの カップリング工程は良好に進行せず、収率は約２０％にとどまった。収率を改良 する一つの試みとして５とジアミド２を反応させたが、所望の生成物は検出でき なかった。(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコール（４） 無水ピリジン（400mL）中に溶解したヘキサ（エチレングリコール）（18.93g ，67.05mmol）を無水ピリジン（3x50mL）と共蒸留し、０℃に冷却した後、ピリ ジン（50mL）中のDMTrCl（23.85g，70.40mmol）をアルゴン雰囲気下に攪拌しな がら３０分かけて滴下した。反応混合物を一晩室温に維持した。高真空でピリジ ンを除去し、残渣をCH2Cl2に溶解し、これを5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2 SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーで酢酸エチル、次いでCH2Cl2及び0.5％ TEAを含むメタノ ール（９５／５）のグラジエントを用いて精製した。適切な分画を 集めて蒸発させ、真空乾燥すると４（26.1g，66.6％収率）が明るい黄色オイル として得られた。(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコールトシレート（５） 無水ピリジン（50mL）中の４の氷冷（O℃）溶液に、ピリジン（30mL）中のト ルエンスルホニルクロリド溶液を加えた。室温で２時間後に、溶液を蒸発させて 明るい黄色オイルを得た。残渣をCH2Cl2に取り、これを5％NaHCO3及びブライン で洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。生成物をウエットフラッシュシリカゲ ルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルを用いて溶出して精製すると生成物（ 4.08g,93％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。 2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコール-1,3-ジアミノ プロパン（６） 無水THF中の1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン（747mg，8.28mmol）とｔ− ブトキシドカリウム（2.78g，24.84mmol）の混合物を７０℃で２時間加熱し、次 いで室温に冷却した。THF中の化合物５（4.08g,5.25mmol）を注入し、TLCで確認 して５が残っていなくなるまで混合物を一晩７０℃で攪拌した。溶液を室温に冷 却した後、THFを真空除去してCH2Cl2（25mL）と水（25mL）を加えた。CH2Cl2層 を分離して水層をCH2Cl2で抽出した。CH2Cl2溶液を集め てNa2SO4で乾燥し、減圧蒸留した。粗製生成物（2.43g）をさらに精製すること なく次の反応に直接用いた。N,N'-ビス（ステアロイル）-2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレ ングリコール-1,3-ジアミノプロパン（７） ClCH2CH2Cl中の塩化ステアロイル（3.363g，11.1mmol）の溶液を、ClCH2CH2Cl とTEA(1.9mL，11.1mmol)中の６の溶液に室温で攪拌しながら加えた。混合物を室 温で２時間維持し、次いで一晩混合物を７０℃に加熱した。溶液を室温に冷却し た後、溶液を5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。 粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸エ チルとCH2Cl2（５０／５０）、次いで酢酸エチルとメタノール（５０／５０）の グラジエントを用いて精製した。第２分画を集めて、蒸発させ、真空乾燥すると ７（640mg）が明るい黄色オイルとして得られた。 N,N'-ビス（ステアロイル）-2-ヘキサエチレングリコール-1,3-ジアミノプロパ ン（８） 化合物７（640mg）、CH2Cl2（5mL）中の2.5％DCA及びトリヘキシルシラン（2m L）の混合物を、オレンジ色力情白くなるまで室温で攪拌した。CH2Cl2を除去し た後、残渣をヘキサンから繰り返し沈殿させると明るい黄色固体（210mg,63％収 率）が得られた。 N,N'-ビス（ステアロイル）-2-(ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスフ ィニル-ヘキサエチレングリコール)-1,3-ジアミノプロパン（３） 真空で一晩乾燥した化合物８（210mg，0.237mmol）を無水CH2Cl2（5.0mL）に 溶解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（218μL，1.25mmol）を加えた。溶液 を氷水浴で冷却しクロロ-(2-シアノエトキシ)-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホス フィン（106μL，0.47mmol）を注入した。３０分撹拌した後、反応混合物をCH2C l2で希釈し、5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮すると31 P NMR（CDCl3,ppm）：154.04を得た。 ＶＥＧＦ核酸リガンドへの２０Ｋ又は４０Ｋ ＰＥＧ ＮＨＳエステルのコンジ ュゲート 一般的方法：ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドをトリエチルアンモニウム塩に変換し て凍結乾燥した。粗製オリゴヌクレオチドを100mMホウ酸ナトリウムバッファー （pH9）に60mg/ml濃度に溶解した。２当量のＰＥＧ ＮＨＳエステル（Shearwat er Polymers，Inc.）を乾燥ＤＭＦに溶解し（ホウ酸：ＤＭＦの比率＝1：１）、 混合物を温めてＰＥＧ ＮＨＳエステルを溶解した。オリゴヌクレオチド溶液を ＰＥＧ溶液に素早く加えて、混台物を室温で１０分激しく撹拌した。約９０％の オリゴヌクレオチドがＰＥＧ ＮＨＳエステルとコンジュゲートした。図１Ｈ及 び１Ｉを参照のこと。 ２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成 図１Ｊ,Ｋ及びＬに示す２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドを以下のように作製した 。1,3-ジピバロイル-2-O-ジメトキシトリチルグリセロール３の合成 McGeeetal．(1988，Synthetic Communication，1651)に従って調製した化合物 ２（ピリジン200ml中、７０％純度の生成物を62g，200mmol）の撹拌ピリジン溶 液に、ジメトキシトリチルクロリド（84g，240mmol，1.2倍過剰）を加えて、反 応物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣をCH2Cl2（IL） に取り、水で洗浄、乾燥（MgSO4）して濃縮した。粗製混合物（130g）をそのま ま次の反応に用いた。 2-O-ジメトキシトリチルグリセロール４の合成 粗製化合物２（130g）、NaOMe（28g）及びメタノール（900ml）の混合物を５ ０℃で１６時間加熱した。反応終了後（TLC）、混合物を濃縮乾燥して残渣を水 とCH2Cl2（１：１）に溶解した。有機層を分離して水層を飽和NH4Cl、水及びブ ラインで洗浄、乾燥（MgSO4）した。溶媒を蒸発させるとガム状化合物が得られ 、これをシリカゲルカラムでヘキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸エチル（１：１）を 用いて精製すると、化合物４を７５％収率で得た。ピスアミダイト５の合成 CH2Cl2（125ml)とジイソプロピルエチルアミン（58ml，320mmol）中にアル コール４（16.2g，41.1868mmol）を溶解した氷冷撹拌溶液に、ホスフィチル化剤 試薬（20.5ml，90.62mmol）を加え、溶液をゆっくり室温まで温めて同じ温度で ２時間撹拌した。反応混合物を砕いた氷の中にゆっくりと注ぎ、CH2Cl2で抽出し 、5％NaHCO3、水及びブラインで洗浄して乾燥した。溶媒を蒸発後に得られた残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーでへキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸エチ ル（１：１）を用いて精製すると、化合物５を７０％収率で得た。 31Ｐ Ｄ3ＰＯ4を外部標準として153.64＆153.39(2S) ＶＥＧＦ２量体の調製 ＶＥＧＦ２量体の合成は８８００自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で行った。ＮＸ３ １８３８を調製し、ここではｒＡはアデノシンを意味し、ｍＧとｍＡはそれぞれ 2'-O-メチルグアノシンとアデノシンを、そしてｆＣとｆＵは2'-デオキシ-2'フ ルオロシチジンと2'-フルオロウリジンを意味し、[3'-3']は3',3'-ヌクレオチド 間結合を意味する。合成は、5'-DMT-2'-O-メチル-N6-tert-ブチルフェノキシア セチルアデノシン、5'-DMT-2'-O-TBDMS-N2-tert-ブチルフェノキシアセチルグア ノシン、5'-DMT-2'-O-TBDMS-N6-tert-ブチルフェノキシアセチルアデノシン3'-N ,N-ジイソプロピル-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイト及び2'-デオキシ-2-フ ルオロ-5'-DMT-N4-アセチルシチジン及び2'-デオキシ-2'-フルオロ-5'-DMT-ウリ ジン3'-N,N-ジイソプロピル-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイトを用いて、Mm ipore8800自動合成機で行った。合成サイクルは以下のようであった。活性化剤 の組 成は表に記載する通りである。合成は600A孔径、80-120メッシュのＣＰＧサポー トを使用し、及び5-スクシニルチミジンを用いる60-70μmol/g装填で行った。カ ップリングサイクルは表１２に示す。 実施例６．リン脂質（ＰＬ）及びＰＥＧ修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学 的特性 表２に示す配列のうち、配列ＶＴ３０．４４を選んでさらに研究し、ＮＸ３１ ８３８と命名し直した。２０及び４０Ｋ ＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ 核酸リガンドＮＸ３１８３８の薬物動態学的特性をスプラーグ・ドーレイラット で試験した（分子性状についての記載は図１を参照）（配列番号：）。同様の研 究をＰＬ脂質とコンジュゲートしたＮＸ３１８３８について、リポソーム製剤と 遊離医薬として行った（分子性状についての記載は図１を参照)(配列番号：)。 各研究において、260nmにおけるＵＶ吸収と吸光係数0.037μｇオリゴ/mlに基づ いて溶液濃度1.0mg/mlでオリゴヌクレオチドをＰＢＳに希釈した。全ての研究で ９匹のラットにボーラス尾静脈注射によって1.0mgオリゴヌクレオチド/kg動物体 重を投与し、２分から２４時間の様々な時間で血漿サンプルを採取した。血漿サ ンプル及び品質対照サンプルをハイブリダイゼーションアッセイにより分析した 。ハイブリダイゼーションアッセイでは、酸化鉄（ＦｅＯ）ビーズにコンジュゲ ートしたＶＥＧＦ核酸リガンドの5'-末端に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌク レオチド（ＦｅＯ−スペーサー-3'-d(GCC TTA GTC ACT T-5')(配列番号：)ここ でスペーサー＝(dT)8）と、５’−末端にビオチン２分子を含む検出オリゴヌク レオチド（ビオチン−ビオチン−5'-d(スペーサー-CGG ATG TAT AAG CA-3'）こ こでスペーサー＝(dT)8)(配列番号：)を用いた。ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１ ８３８を含む血漿サンプルと一緒に捕捉及び検出プローブをインキュベートした 後、ビーズにハイブリダイズしたビオチンオリゴヌクレオチドの量を、発光基質 としてCSPD-Sapphireを用いるストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ で定量した。 ボーラス注射後の時間を関数とする遊離、ＰＥＧ２０Ｋ及びＰＥＧ４ＯＫ Ｖ ＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）（配列番号：）の血漿濃度のデータを 図６にまとめた。４０Ｋ ＰＥＧコンジュゲートは３６０分の単指数関数的（mo noexponential）ｔ1/2で浄化されたが、２０Ｋ ＰＥＧ型ははるかに迅速に浄化 され、核酸リガンドの９５％が４９分のアルファｔ1/2で浄化され、５％が１９ ２分のベータｔ1/2で浄化された。これはサイズが浄化値（clearance）とって重 要であることを示している。ＰＥＧ−コンジュゲートした核酸リガンドと比較し て、遊離（非コンジュゲート）ＮＸ３１８３８は数分のｔ1/2で非常に迅速に血 漿から浄化された。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、オリゴ ヌクレオチドに適切な官能基を導入することにより有意に増加した。 ボーラス注射後の時間を関数とするリポソーム付き又はリポソーム無しで調製 されたＰＬ脂質コンジュゲート化ＶＥＧＦ核酸リガンド（配列番号：）の血漿濃 度のデータを図７にまとめた。リポソームは実施例７Ａに記載の方法で核酸の存 在下に音波処理して作製し、内側と外側にオリゴヌクレオチドを含む。リポソー ム製剤は遊離の薬剤よりもはるかにゆっくりと浄化され、ベータｔ1/2はそれぞ れ１１６１分及び１３１分であった。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血 漿濃度はリポソーム製剤によって有意に増加した。 実施例７．ＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製 Ａ．薄層化（filming）によるリポソーム調製 コレステロール１モルに対してＤＳＰＣ２モルの割合で脂質を組み合わせた。 水に溶解したＮＸ３１８３８ＰＬを脂質に１：５０（ｗ／ｗ）の割合で加えた。 クロロホルム：メタノール：水（１：３：１）の溶液で溶媒和とすることによっ て物質を組み合わせた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去すると脂質と混 台されたＮＸ３１８３８ＰＬの不均一フィルムが残った。このフィルムを９％ス クロース溶液中に脂質ベースで50mg/mLで水和し、２５ｍＭリン酸ナトリウムで ｐＨ７．４にバッファー化した。溶液を激しく混合し、６５℃に加熱し、得られ る白色ミルク様溶液を７５ｍＬアリコートで音波処理して脂質を単膜（unilamel lar）リポソームに組み立てた。リポソーム形成の進行は、溶液が透明になるこ とを目で観察し、次に粒子分析機（Leeds ＆ Northrup Microtrack UPA150,Hors ham,PA）を用いる動的光散乱による粒子サイズ測定により追跡 できる。リポソームのサイズは５０−７０ｎｍ（容積重量分布法による）の範囲 にある。 Ｂ．受動アンカーリングによるリポソーム調製 あらかじめ形成された（“空の（empty）”）リポソーム中にｓｃＮＸ−２８ ７（分子性状については図１Ｃ参照）が自然に導入されるか試験した。ＤＥＡＥ アッセイ（遊離の核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の除去のため）を用い る予備試験の結果、以下の２つの重要な知見が示唆された：１）装填が達成され た；そしてさらに重要なことは、２）室温、２４時間で核酸リガンド／グリセロ ール脂質複合体の実質的に完全な装填が観察された。装填に及ぼす温度の影響を 決定するために更に詳しい研究を行った。温度は導入率に劇的な影響を及ぼすこ とが観察された。室温、２４時間で完全な装填が達成されたが、高温（６７℃） ではたった数分で完全な導入が達成された。これは、予め形成したリポソーム中 に核酸リガンド／親油性化合物複合体を迅速かつ効率よく導入する方法であるこ とが判明した。 次にゲル濾過クロマトグラフィーによってリポソーム会合型から遊離のｓｃＮ Ｘ−２７８を分離した。”空の”２：１ ＤＳＰＣ：コレステロールリポソーム 中へのｓｃＮＸ−２７８の装填を用いて予備試験を行った。２２℃でSuperdex S -200カラムを用いてクロマトグラムを作った。２２時間にわたって、空のリポソ ーム集団中へのｓｃＮＸ−２７８の漸次的導入がピーク領域のシフトとして観察 された（データ示さず）。この結果はＤＥＡＥアッセイのデータとよく関連する 。 追加のｓｃＮＸ−２７８が音波処理したオリゴ−リポソーム中に装填されるか 試験するためにさらに研究を行った。オリゴ−脂質を脂質と共溶解し、２つを一 緒に共音波処理することによってｓｃＮＸ−２７８の音波処理製剤を調製した。 得られるリポソームはｓｃＮＸ−２７８を完全に導入したことを示した。この音 波処理製剤を次に、追加の遊離ｓｃＮＸ−２７８で受動アンカーリングを２回実 施してそれ以上のｓｃＮＸ−２７８が導入されるかを観察した。１回目の受動ア ンカーリングでは６５℃、１時間のインキュベーション後に遊離のｓｃＮＸ−２ ７８の全てがリポソーム中に受動アンカーリングされた。追加のｓｃＮＸ−２７ ８を受動アンカーリングさせる２回目の試みは不完全装填に終わった。 これらの実験から得られる鍵となる知見は、核酸リガンド／親油性化合物複合 体は音波処理したオリゴーリポソーム中に高濃度で受動アンカーリングされうる が、追加の核酸リガンド／親油性化合物複合体を吸収するリポソームの容量（ca pacity）を越えうるということである。２回の受動装填（約3mg脂質−オリゴ／5 0mg脂質まで）の後に、いくらかの遊離の脂質−オリゴが残っているのでリポソ ームは明らかに追加のオリゴ−脂質を吸収する”容量”に達する。これらのデー タはＤＥＡＥスピン−カラム分析で確認した（データ示さず）。以下の結論が導 かれる：１）音波処理したリポソームは核酸リガンド／親油性化合物複合体を導 入する追加の容量をもっている；そして２）１００％核酸リガンド導入が音波処 理によって達成できる。 ＮＸ３１８３８ＰＬ（分子性状については図１Ｅを参照）で次の研究を行った 。ＮＸ３１８３８はリポソーム中に導入されると、ＶＥＧＦターゲットに対する 薬物動態学的（実施例６参照）及び生物分布が改良されるので極めて興味深い。 受動アンカーリングによるＮＸ３１８３８のリポソーム中への導入をよりよく理 解するためにいくつかの研究を行った。 ＮＸ３１８３８ＰＬの動力学的研究によると、この分子の受動アンカーリング はあまりに速いので文献公知のいかなるクロマトグラフィー法（これらはいずれ も最低数分の作動時間を必要とする）によっても測定不能であると考えられるこ とを示唆していた。 ＮＸ３１８３８ＰＬ分子の方向性を決定する（すなわち、核酸リガンド成分が リポソームから外側へ向かって進むのか、あるいはリポソームの水性中心に向か って進むのか）ために、外部から導入したＲＮａｓｅを用いてリポソームから外 側へ進んでいる核酸リガンド成分を全て選択的に切断した。受動アンカーリング したＮＸ３１８３８ＰＬリポソームの場合、全ての核酸リガンドがＲＮａｓｅに さらされた。Triton X-100処理の後には追加の消化は全く観察されなかった。こ れらの結果は、受動装填されたＮＸ３１８３８ＰＬは、核酸リガンド成分がリポ ソームから外側へ向けて進むように方向付けられていることを示唆する。もしも 受動アンカーリングされたＮＸ３１８３８ＰＬリポソームをＲＮａｓｅＩで前 消化し、次いでＤＥＡＥカラムにかけると、約９９％の核酸リガンドがカラムに 捕捉されるが、一方同じサンプルをＲＮａｓｅＩで前インキュベーションせずに ＤＥＡＥにかけると、ほぼ１００％のオリゴがＤＥＡＥに結合することなくカラ ムを通過することができる。リポソームがＤＥＡＥからオリゴを保護するのであ る。リポソームは核酸リガンドと高い親和性で会合してＤＥＡＥ基にさらされる のを大きく減少するので、ＤＥＡＥから核酸リガンド成分を保護するように作用 する。 最後に、リポソームアンカーリング型から遊離の核酸リガンド／親油性化合物 複合体を分離するための新規方法を開発する一部として、ＮＸ３１８３８．０５ ＰＬをＲＮａｓｅＩで消化した。切断されたオリゴは脂質尾部を除去した後、ゲ ル濾過クロマトグラフィー（S-1000樹脂）を用いて容易に分離できるが、完全な 核酸リガンド／親油性化合物複合体は同じ条件下でリポソームと共溶出される。 このデータは、核酸リガンド／親油性化合物複合体が溶液中で遊離状態のときに は多分ミセルを形成していることを示唆する。このためカラムの空間容積（void volume）中でリポソームと共溶出する結果となる。脂質尾部の除去により、ゲル 濾過媒体中への侵入が可能になり、サイズ分画されて適切に貯蔵される。 実施例８．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のin vivo有効性−皮膚血管透過性アッ セイ ＮＸ３１８３８核酸リガンドのいくつかの異なる製剤が皮膚血管の透過性にお いてＶＥＧＦで誘発された変化を弱くさせる（attenuate）能力をもつかを上述 した方法（Sengeretal.,(1986)Cancer Research 46:5629-5632）を少し修飾して 行った（マイルスアッセイ）。簡単に述べると、成人雌モルモット（３匹／実験 ）をイソフルランで麻酔して、背側と側方後ろ領域の毛をクリッパーで除去した 。エバンスブルー染料（2.5mg／モルモット）を静脈内投与した。注射溶液（Ｐ ＢＳ、ＶＥＧＦ、ＮＸ３１８３８製剤、及び抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体） を３０分前に調製し、表記の最終濃度で指示する場合には共混合した。各溶液を 毛を刈った領域に描いた格子状パターン内にランダムに皮内注射した（二重に注 射／モルモット；40μl／部位）。モルモットを麻酔から快復させ、皮内注射の 完了３０分後にＣＯ2にさらして殺した。皮膚を回収して皮下組織を除いて、透 視した。カラーＣＣＤカメラ（Hitachi Denshi KP-50U，Japan）とImage-Pro Pl usソフトウエア（Version3.1，Media Cybernetics，Silver Springs，MD）を用 いて画像を得た。各皮膚サンプルについて、光学密度と関連領域について、分析 する各注射部位の強度を正規化した。 図８のパネルＡ−Ｃは、実施例７Ａで記載したリポソーム製剤中でのＮＸ３１ ８３８−２０Ｋ ＰＥＧ，ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ，ＮＸ３１８３８− ＰＬについて、ＶＥＧＦ−誘導された血管漏出（vascular leakage）の核酸リガ ンド弱体化（attenuation）の結果を示す。全ての製剤は１００ｎＭという低濃 度でＰＢＳ対照レベルまで、又はこの近くのレベルまで血管漏出を有意に減少す ることができた。３０ｎＭでは、核酸リガンドのブロック効果は失われた。ＮＸ ３１８３８−ＰＬリポソーム製剤はこの濃度で評価しなかったが、１００ｎＭに おけるブロック効果を減少したようであった。このモデル系で抗−ＶＥＧＦモノ クローナル抗体も評価したところ（データ示さず）、１００ｎＭまで同様に有効 であり、３０ｎＭでは活性を失った。従って、このモデル系では試験した各種製 剤形のＮＸ３１８３８がＶＥＧＦタンパク質の機能的効果の１つをブロックする という点において抗体と等しく有効であることを示唆している。 実施例９．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のin vivo有効性−角膜ポケットモデル ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）製剤のＶＥＧＦ−誘導した角膜脈管 形成減少能を正常駆血ラット角膜で試験した。簡単に述べると、９５％エタノー ル中の１２％バイオポリマーにタンパク質又は担体溶液を加えることによって、 約３０時間前にバイオポリマー（Hydon）ペレット±ＶＥＧＦタンパク質（3pmol ）を調製した。塩酸ケタミン（50mg/kg）及びキシラジン（10mg/kg）を腹腔内注 射して成人スプラーグ・ドーレイラット（200-240g）を麻酔した。次に左目に塩 酸テトラカインを局所投与して局部麻酔し、希釈ポビドン−ヨウ素液を適用し、 次いで等張食塩溶液でリンスした。中央角膜（mid-cornea）に垂直部分厚さの切 開を行った。中央間質ポケットを縁の１．５ｍｍ内に至るまで側方眼角に向けて 後ろ側に切り取った。次いでペレットを挿入してポケットの後ろ 端に押しやった。残っている空気を穏やかにマッサージしてポケットから除去し た。クロラムフェニコール眼科用溶液を目に１滴入れた。動物をひっくり返して 右目にこの処置を繰り返して同じタイプのペレットを挿入した。それぞれの目に ペレットの挿入が完了したら、各動物にＰＢＳ（核酸リガンド製剤群と匹敵する 容積）又は核酸リガンド（10mg/kg）を指示通り１日２回静脈内投与した。５日 目に、各動物を麻酔して、解剖顕微鏡（KAPS，Germany）にセットした３５ｍｍ カメラ（Minolta X9）で写真を撮った。血管成長の最大長さ（０−５）、移植ペ レット近くの血管成長密度（１−４）及び血管形成を起こした目の円周（０−１ ）を測定することによって血管形成応答について各目を評価した。長さ＊密度＊ 円周の結果で血管形成インデックスを決定した。 核酸リガンド製剤がＶＥＧＦ−誘導した血管形成をブロックする能力を図９の パネルＡ−Ｃに示す。血管透過性変化のブロックにおいてはその他の製剤と等し く有効であったにもかかわらず、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧは正常駆血角 膜における血管形成応答の弱体化では無効であった。しかしながら、ＮＸ３１８ ３８−４０Ｋ ＰＥＧ及びリポソームＮＸ３１８３８−ＰＬはいずれも６５−７ ０％で血管形成レベルを有意に減少した。この違いは核酸リガンドそれぞれの薬 物動態学プロフィールによるものと思われる。 統計学的分析：マイルス（Miles）アッセイ及び角膜血管形成モデルの群はDun nett比較を用いるRank ANOVAによって比較した。 実施例１０．腫瘍モデルにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドのin vivo有効性 ヒト腫瘍異種移植モデル：ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥ Ｇが固形腫瘍増殖に及ぼす能力を、ヌードマウスの皮下腫瘍モデルで試験した。 Ａ６７３ヒト横紋筋肉腫腫瘍細胞を組織培養で増殖し、回収して、ヌードマウス の脇腹の腋領域近くに１ｘ１０7個の生細胞を皮下移植した。試験化合物による 処置は１２時間後に開始し、実験の間中続けた。化合物は１日２回１０及び40mg /kgで腹腔内投与した。陰性対照は乱雑化アプタマー（scrambled aptamer）配列 であるＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ（分子性状については図１Ｒ参照）を１ 日２回40mg/kg投与からなり、陽性対照は抗−ＶＥＧＦ抗体Ｍａｂ．２６ ５０３．１１（R＆D Systems,Lot#LD03）を100μg／マウスを週に２回投与から なっていた。核酸リガンドー処置群及び抗体処置群はいずれも乱雑化配列陰性対 照群と比べて腫瘍増殖を有意に遅らせた（図１１）。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ） は、40mg/kg及び10mg/kg ＢＩＤ群では７５％及び８０％であり、モノクローナ ル抗体処置群では８３％であった（表８）。40mg/kg投与群と10mg/kg投与群では 有意な差がなかったので、１４日以後は40mg/kgの投与を行わなかった。図１１ に見られるように、投与終了の数日後に腫瘍増殖は速くなり、陰性対照群の増殖 速度と同様になったが、10mg/kg核酸リガンド群及び抗体処置群は低い速度で増 殖し続けた。 同じ腫瘍モデルを使ってさらに研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンド ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの新しいバッチ（ＮＸ３１８３８．０４及びＮ Ｘ３１８３８．０７と命名）を比較し、また投与量を10mg/kg BIDから少なくし て3mg/kg BID及び1mg/kg BIDとした滴定（titration）実験を行った。１日１回1 0mg/kgについても同様に実験を行い、またＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８ −ＰＬのリポソーム形を10mg/kg BIDで行った。図１２及び表９に見られるよう に、いずれの実験でも同程度の腫瘍増殖阻害が達成された。ＶＥＧＦ核酸リガン ドのいずれのバッチも１日２回の投与スケジュールで比較したときは同等であり 、旧バッチと新バッチのＴＧＩ値はそれぞれ６１％及び７０％であった。さらに 、１日１回投与（ＳＩＤ）は１日２回投与と同様に有効であった。しかしながら 、この実験で用いた滴定スキームでは有効投与量に達しなかった。 ＶＥＧＦ核酸リガンドのさらに下方滴定が腫瘍増殖に関して用量応答関係を示 すかどうかについて第３の実験を行った。この実験ではＶＥＧＦ核酸リガンドを 0.03mg/kgという無効用量近くまで下方滴定した。相対的腫瘍増殖阻害を図１３ に示し、表１０にまとめた。 ３つの期に達していない（unstaged）腫瘍研究に加えて、期に達した（staged ）腫瘍研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンドによる処置の開始前に腫瘍 を樹立して２００±１００ｍｍ3に達せさせた。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥ Ｇ（10mg/kg）とｍＡｂ２６５０３（Ｒ＆Ｄ Systems）（１週２回100μg）の投 与群ではそれぞれ５９％及び６９％の腫瘍増殖阻害を達成した（図１４、表１１ ）。 これらの集積的研究では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがＡ６７３腫瘍の樹立を遅らせ ること、ならびにいったん腫瘍が樹立されたら腫瘍増殖を阻害できることを示し ている。 カポジ肉腫モデル：ヌードマウスにおけるカポジ肉腫セルラインＫＳＹ−１の皮 下増殖に及ぼすＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの効果を試験した。ＫＳＹ−１ 細胞は培養においてＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるという点でユニ ークな腫瘍セルラインである。ＫＳＹ−１細胞を培養で増殖し、集めて、これを マウスの後ろ脇腹に皮下注射した（２ｘ１０7個細胞／マウス）。３群のマウス （１群４匹）をＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（30mg/kg）、ＮＸ３１９１７ −４０Ｋ ＰＥＧ（30mg/kg）（分子性状については図１Ｒ参照）又はＰＢＳの いずれかを実験の間中、１２時間毎に腹腔内注射して処置した。処置は腫瘍細胞 移植の１日後に開始した。ＰＢＳ−処置群とＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ− 処置群の腫瘍増殖は同等であったが、腫瘍増殖のかなりの阻害がＮＸ３１８３８ −４０Ｋ ＰＥＧ−処置群で観察された(図１６)。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ Ｐ ＥＧはＫＳＹ−１腫瘍の増殖を実験終了時（２２日目）に６５％（ＰＢＳ−処置 群と比較して）又は６９％（ＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ−処置群と比較し て）阻害した。 実施例１１：ウサギにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８＋４０Ｋ Ｐ ＥＧの硝子体内薬物動態学 ニュージーランド白ウサギに、４０ｍＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ核 酸リガンドＮＸ３１８３８を０．５ｍｇ／目で硝子体内投与することによって処 置した。４０Ｋ ＰＥＧは実施例５に記載の方法でＶＥＧＦ核酸リガンドにコン ジュゲートし、得られる複合体は図１Ｈに示すものである（配列番号：）。ウサ ギはそれぞれの目にＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧを硝子体内投与した。動物 毎の投与間の時間は１５分を超えなかった。血液及び硝子体サンプルを表７に記 載するように採取した。 血漿及び硝子体サンプルの分析は二重ハイブリダイゼーションアッセイを用い て行った。このアッセイでは、９６ウエルプレートに付着した捕捉プローブとビ オチン化した検出プローブの２つのハイブリダイゼーションプローブを用いる。 捕捉プローブは核酸リガンドの５’末端とハイブリッドを形成する。このアッセ イは全長核酸リガンドに対して極めて特異的かつ感受性であり、陽性シグナルを 生じる。現在の定量限界は血漿５μｌ中で約２ｆｍｏｌｅである。 ％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。腫瘍増殖遅延 **注：ＶＥＧＦ核酸リガンド40mg/kgの投与は１４日目に終了した。％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。 ％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ） *当量はＣＰＧ−結合3'−末端ヌクレオシドのモル数にに基づいている。** アクチベーター当量はヌクレオシドホスホロアミダイトのモル数に基づいてい る。 ２量体合成の一般的方法 他の全てのホスホロアミダイトは、グリセロールアミダイト以外は上述したのと 同じ方法でカップリングした。
【手続補正書】 【提出日】平成１１年５月１８日（１９９９．５．１８） 【補正内容】 明細書 血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体発明の分野 本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオ ロ（２’−Ｆ）ピリミジン系ＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リガン ドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これはＳｙｓ ｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏ ｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（指数的濃縮による系統的リガンド進化 ）の頭字語である。本発明はさらに、ＳＥＬＥＸ法によりＶＥＧＦ核酸リガンド を同定し、このＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性 化合物と共有結合させることにより、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高 分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用複合体を調製する 方法を包含する。本発明はさらに、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドお よび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる療法用または診断用 複合体を包含する。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、Ｖ ＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさら に、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体（ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ）、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油 性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を使用することにより、ＶＥＧＦ核酸リ ガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。本発明はさらに、療法用ま たは診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性高 分子量化合物を含む複合体と結合させることにより、ＶＥＧＦを発現している生 物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤をターゲティングする方法であって 、複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧＦ核酸リガンドがさらにその脂質 構築体の外側と結合している方法に関する。発明の背景 Ａ．ＳＥＬＥＸ 核酸は主に情報の役割をもつというのが長年の定説であった。指数的濃縮によ る系統的リガンド進化（ＳＥＬＥＸと呼ばれる）として知られる方法によって、 核酸はタンパク質と異なる三次元構造多様性をもつことが明らかになった。ＳＥ ＬＥＸは高い特異性でターゲット分子に結合する核酸分子をインビトロ進化させ る方法であり、下記に記載されている：米国特許出願第０７／５３６，４２８号 、１９９０年６月１１日出願、表題”指数的濃縮による系統的リガンド進化”、 現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３１号、１９９１年６月１０日出 願、表題“核酸リガンド”、現在は米国特許第５，４７５，０９６号；米国特許 出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１７日出願、表題“核酸リガン ドの同定法”、現在は米国特許第５，２７０，１６３号（国際特許出願公開第Ｗ Ｏ９１／１９８１３号も参照）；これらをそれぞれ本明細書に援用する。これら の各特許出願（本明細書においてはこれらをまとめてＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ ）には、目的とするいずれかのターゲット分子に対する核酸リガンドを調製する ための、基本的には新規な方法が記載されている。ＳＥＬＥＸ法によれば、核酸 リガンドと呼ばれる一群の生成物が得られる。これらのリガンドはそれぞれユニ ークな配列をもち、目的とするターゲット化合物または分子に特異的に結合する 特性をもつ。ＳＥＬＥＸにより同定された核酸リガンドはそれぞれ、特定のター ゲット化合物または分子に特異的なリガンドである。ＳＥＬＥＸは、核酸が実質 的にいかなる化合物（モノマーであってもポリマーであっても）についてもリガ ンドとして作用する（特異的結合対を形成する）のに十分な多様な二次元および 三次元構造の形成能、ならびにそれに十分な化学的多能性をそれらのモノマー内 にもつという、新しい洞察に基づく。いかなるサイズまたは組成の分予も、ター ゲットとすることができる。 ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択、ならびに同じ一 般的選択方式を用いた結合、分配、および増幅の段階的反復を行って、実質的に いかなる目的基準の結合親和性および選択性も達成するものである。ＳＥＬＥＸ 法は、好ましくはランダム配列のセグメントを含む核酸混合物から出発し、結合 に好ましい条件下で混合物をターゲットと接触させ、ターゲット分子に特異的に 結合した核酸から結合しなかった核酸を分配し、この核酸−ターゲット複合体を 解離させ、核酸−ターゲット複合体から解離した核酸を増幅させて核酸リガンド 濃縮混合物となす工程を含み、次いで結合、分配、解離および増幅の各工程を目 的に応じたサイクル数で再反復して、ターゲット分子に対し特異性の高い高親和 性核酸リガンドを得る。 本発明により認識されるように、ＳＥＬＥＸ法は、核酸が化合物として広範な 形状、サイズおよび立体配置のアレイを形成することができ、生物学的系内で核 酸が示すよりはるかに広いレパートリーの結合その他の機能を示しうることを証 明する。 本発明者らは、いずれか特定のターゲットに対する核酸リガンドを同定しうる ものと類似の様式で、ＳＥＬＥＸまたはＳＥＬＥＸ様方法を利用していずれか特 定の反応を促進しうる核酸を同定できることを認識した。理論的には、核酸約１ ０13〜１０18の候補混合物内に、多様な物理的および化学的相互作用のそれぞれ を促進するのに適した形状をもつ核酸が少なくとも１つ存在すると本発明者らは 仮定する。 多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。 たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願 、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動 と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択す ることが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年 ９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法 であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいは それらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法 が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月 ７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド” （現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子（非ペプチド系であ ってもよい）を識別しうる高特異性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬ ＥＸ（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法が記載されている。米国特 許出 願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、表題“指数的濃縮 による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は来国特許第５，５６７， ５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリゴヌクレオチドと 低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸに基づく方法が記 載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性 などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和 性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／ またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。 ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米 国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌ クレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０， ９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化 学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載さ れている。前掲の米国特許出願第０８／１３４,０２８号には、２’−アミノ(２ ’−ＮＨ2)、２’−フルオロ(２’−Ｆ)、および／または２’−Ｏ−メチル（２ ’−ＯＭｅ）で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特異 性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、１ ９９４年６月２２日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２’−ヌク レオチドを製造するための新規方法”には、種々の２’−修飾ピリミジンを含有 するオリゴヌクレオチドが記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレ オチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。 これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日 出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在 は米国特許第５，６３７，４５９号）、および米国特許出願第０８／２３４，９ ９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進 化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴ ヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性およ び複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。 ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原 性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包 含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５ 月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体 中において、親油性化合物、たとえばジアシルグリセロールまたはジアルキルグ リセロールと結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／７３９， １０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ） 核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法用複合体中において 、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、またはグリセロリン 脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化合物と結合したＶ ＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１号、１９９７年７ 月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合体”に記載されて いる。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願それぞれを全体と して本明細書に援用する。 Ｂ．脂質構築体 脂質二重層小胞は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をもつ個 々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。親水 性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート、ア ミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。親油性基の例は、飽和ま たは不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基である。 小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために、ス テロール類（たとえばコレステロール）および他の薬剤学的に許容しうる佐剤（ α−トコフェロールのような酸化防止剤を含む）が含有されてもよい。 リポソームはこれらの二重層小胞の集合体であり、主に、脂肪酸鎖から構成さ れる２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に暴露 されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向する 極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、球状二重膜を形成する。し たがって膜のそれぞれの側は親水性表面となり、一方、膜の内部は親油性媒質を 含む。これらの膜を、内部水性空間の周りにタマネギの層と似た様式で薄い水の 層で分離された一連の同心球状膜として配置させることができる。これらの多重 膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、小さな小胞、または単膜小胞（ＵＶ）に 変換することができる。 療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒である薬物の 送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対し感受性の 組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。リポソーム は長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもでき、これに より投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静脈内送達に 適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供できる。 多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な 位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき 、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎と なりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲ ティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。 これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれら の投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であると いう理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに 取込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアラン ス速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。 リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内 および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違い が生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる ２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付 着させるものである。抗体はそれらの対応する抗原に対し高い特異性をもつこと が知られており、リポソームの表面に付着されたが、多くの場合、結果は成功と はいえなかった。しかし抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティングさせ る幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、第５， ４４１，７４５号、または第５，４３５，９８９号参照。 研究者らが積極的に追求している領域の開発は、特定の細胞タイプのみでなく 、細胞の細胞質中へ、さらには核中へ薬剤を送達することである。これは、ＤＮ Ａ、ＲＮＡ、リボザイムおよびタンパク質など、生物学的薬剤の送達に特に重要 である。この領域の有望な療法の試みは、アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡオリ ゴヌクレオチドを疾病の処置に用いるものである。しかしアンチセンス法の有効 適用に際し生じる重大な問題のひとつは、ホスホジエステル形のオリゴヌクレオ チドがターゲット細胞に達する前に体液中で、細胞内および細胞外酵素、たとえ ばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによって速やかに分解されるこ とである。静脈内投与によっても腎臓により血流から速やかにクリアランスされ 、有効な細胞内薬物濃度を生じるのには取込みが不十分である。リポソーム封入 は分解酵素からオリゴヌクレオチドを保護し、循環半減期を延長し、リポソーム が食作用されるため取込み効率を高める。こうしてオリゴヌクレオチドをインビ ボでそれらの目的ターゲットに到達させ、細胞に送達することができる。 研究者らがアンチセンスオリゴヌクレオチドを親油性化合物または非免疫原性 高分子量化合物に付着させた数例が報告されている。しかしアンチセンスオリゴ ヌクレオチドは細胞内薬剤として有効であるにすぎない。上皮増殖因子（ＥＧＦ ）受容体をターゲティングするアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが 、ポリエチレングリコールスペーサーによりフォレートに結合させたリポソーム （フォレート−ＰＥＧ−リポソーム）に封入され、フォレート受容体仲介エンド サイトーシスにより培養ＫＢ細胞中へ送達された(Ｗａｎｇら、(1995)Proc.Natl .Acad.Sci.USA，９２：３３１８−３３２２)。さらに、アルキレンジオールがオ リゴヌクレオチドに結合された（Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，２４５，０２２ 号）。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させた親油性化合物 が文献に示されている（欧州特許第４６２ １４５Ｂ１号）。 リポソームへの生物学的薬剤の装填は、脂質配台物への含有または予め形成し たリポソームへの装填により達成できる。オリゴペプチドおよびオリゴ糖リガン ドをリポソームの外面に受動的にアンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）させるこ とが記載されている（Ｚａｌｉｐｓｋｙら（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃ ｈｅｍ．８：１１１：１１８）。 Ｃ．ＶＥＧＦ 既存の内皮からの新たな血管の増殖（血管形成）は、健康な成人では正および 負の調節因子の対抗する作用によって厳密に制御されている。増殖性網膜症、慢 性関節リウマチ、乾癬および癌を含めた特定の病的状態では正の調節因子が支配 し、血管形成が疾病の進行の一因となる（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９５）Ｎａｔｕ ｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：２７−３１に概説）。癌の場合、血管形成が腫瘍 の増殖および転移の律速段階となるという考え（Ｆｏｌｋｍａｎ（１９７１）Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２−１１８６）が、現在かなりの 実験的証拠により支持されている（Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎら（１９９３）Ｃａ ｎｃｅｒ ７１：１３６８−１３８３；ＦｉｄｌｅｒおよびＥｌｌｉｓ（１９９ ４）Ｃｅｌｌ ７９：１８５−１８８；Ｆｏｌｋｍａｎ（１９９０）Ｊ．Ｎａｔ ｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６に概説）。 腫瘍組織の血管量は、胸部癌（Ｗｅｉｄｎｅｒら（１９９２）Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７）、前立腺癌（Ｗｅｉｄｎ ｅｒら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：４０１−４０９）、脳腫 瘍（Ｌｉら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４４：８２−８６）、および黒色腫（ Ｆｏｓｓら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：２９００−２９０３）に おける強い負の予後指標である。 現在までに多数の血管形成性増殖因子が報告されており、それらのうち血管内 皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が生理学的および病的血管形成の正の調節因子として重 要な役割を果たしていると思われる（Ｂｒｏｗｎら（１９９６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修） に概説、ビルクハウゼル、バーゼル、印刷中；Ｔｈｏｍａｓ（１９９６）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６０３−６０６に概説）。ＶＥＧＦは、内皮細胞を 選択的に刺激して増殖、移動させ、マトリックス分解酵素を産生する、分泌型ジ スルフィド結合ホモ二量体である（Ｃｏｎｎら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１３２３−１３２７；Ｆｅｒｒａｒａおよ び Ｈｅｎｚｅｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ ｕｎ．１６１：８５１−８５８；Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚｅｔら（１９８９ ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３１１−７３１５；Ｐｅ ｐｐｅｒら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ ｎ．１８１：９０２−９０６；Ｕｎｅｍｏｒｉら（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．１５３：５５７−５６２）。これらはすべて新たな血管の形成に 必要なプロセスである。ＶＥＧＦは既知の唯一の内皮細胞特異性マイトジェンで あるほか、それが高分子に対する一過性の血管透過性増大を誘発する効力をもつ 点で、血管形成性増殖因子のうちで独特である（したがってその最初の別名は、 血管透過性因子、ＶＰＦである）（Ｄｖｏｒａｋら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１２２：１６６−１７４；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５；Ｓｅｎｇｅｒら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６：５６２９−５６３２）。血管透過性増大とその結果起きる血管外空間での 血漿タンパク質沈着が、内皮細胞の移動のための一時マトリックスを提供するこ とによって新たな血管形成を助成する（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。実際、透過性過剰は腫瘍に伴う ものを含めて新生血管の特徴である（Ｄｖｏｒａｋら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐ ａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９）。さらに、組織低酸素により誘発さ れる代償性血管形成がＶＥＧＦにより仲介されることは、現在分かっている（Ｌ ｅｖｙら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４６−２７５３；Ｓｈｗｅ ｉｋｉら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５９：８４３−８４５）。 ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ遺伝子のオータナティブスプライシングの結果、４形態 （ＶＥＧＦ−１２１、ＶＥＧＦ−１６５、ＶＥＧＦ−１８９、ＶＥＧＦ−２０６ ）で生じる（Ｈｏｕｃｋら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．５：１８０ ６−１８１４；Ｔｉｓｃｈｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６ ：１１９４７−１１９５４）。小さい方の２形態は拡散可能であるが、大きい方 の２形態はそれらがヘパリンに対し高い親和性をもつため主に細胞膜に局在した ままである。ＶＥＧＦ−１６５もヘパリンに結合し、最も豊富な形態である。ヘ パリンに結合しない唯一の形態であるＶＥＧＦ−１２１は、受容体に対する親和 性 がより低く（Ｇｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：５５１９−５５２３）かつマイトジェン効力も低い（Ｋｅｙら（１９９ ６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８−７７９５）ように思われる。 ＶＥＧＦの生物学的作用は、その発現が内皮由来の細胞に著しく限定された２種 類のチロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−１およびＦｌｋ−１／ＫＤＲ）により仲 介される（ｄｅＶｒｉｅｓら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９ ９１；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：８３５−８４６；Ｔｅ ｒｍａｎら（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：５１９−５２４）。高親和性結 合にはこれら両方の機能性受容体の発現が必要であるが、内皮細胞における走化 性およびマイトジェン性のシグナル発生は、主にＫＤＲ受容体により起きると思 われる（Ｐａｒｋら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６ −２５６５４；Ｓｅｅｔｈａｒａｍら（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０：１ ３５−１４７；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２６９８８−２６９９５）。血管の発生にＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体が 重要であることは、ＶＥＧＦ遺伝子の１つの対立遺伝子を欠如するマウス（Ｇａ ｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒ ｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４３９−４４２）またはＦｌｔ −１の両方の対立遺伝子を欠如するもの（Ｆｏｎｇら（１９９５）３７６：６６ −７０）またはＦｌｋ−１遺伝子を欠如するもの（Ｓｈａｌａｂｙら（１９９５ ）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：６２−６６）において最近証明された。それぞれの場 合、明らかに異常な血管形成がみられ、その結果、胚が死に至る。 ＶＥＧＦは、実質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌され る（Ｂｒｏｗｎら（１９９７）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｉｏｇｅｎ ｅｓｉｓ（ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＲｏｓｅｎ監修）、ビルクハウゼル、バーゼ ル、ｐｐ．２３３−２６９）。ＶＥＧＦおよびその受容体が腫瘍の増殖の一因で あることの直接的な証拠が、ＶＥＧＦに対する中和抗体により（Ｋｉｍら（１９ ９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４）、優性ネガティブＶＥＧＦ受容 体ｆｌｋ−１の発現により（Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒ ｅｓ．５６：１６１５−１６２０；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９４）Ｎａｔｕｒ ｅ ３６７：５７６−５７９）、Ｆｌｋ−１チロシンキナーゼ活性の低分子量阻 害薬により（Ｓｔｒａｗｎら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３５４ ０−３５４５）、またはＶＥＧＦ ｍＲＮＡに対するアンチセンス配列の発現に より（Ｓａｌｅｈら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３９３−４０１ ）、ヌードマウスにおいてヒト腫瘍異種移植片の増殖を阻止できるという証明に より得られた。重要なのは、腫瘍の転移発生率もＶＥＧＦアンタゴニストによっ て著しく低下することが認められた点である（Ｃｌａｆｆｅｙら（１９９６）Ｃ ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：１７２−１８１）。 ＶＥＧＦ阻害薬は抗癌薬としての使用のほか、過度の血管形成を特徴とする多 様な増殖性疾患にも有用であり、これには乾癬、眼障害、膠原病および慢性関節 リウマチが含まれる。大部分のタイプの腫瘍はＶＥＧＦを産生することが知られ ているが、機能性ＶＥＧＦ受容体を発現することは最近まで示されていなかった 。カポジ肉腫（ＫＳ）細胞は多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥ ＧＦ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用すること が示された。カポジ肉腫は一般に、慣用される代謝拮抗性薬物を用いて治療され る。しかしＫＳ患者に化学療法を採用することの主な欠点は、これに伴って免疫 抑制が誘導されることであり、これは免疫系が既に低下している患者には重大な 結果をもたらす。代替療法の必要性は、ＫＳ病変が出現し始めているが他の点で は患者はかなり健康であると感じている疾病初期に特に大きい。これに関し、ダ ウノルビシンなどの化学療法薬をリポソームに封入するのは、抗腫瘍効力を維持 しつつ化学療法の副作用を最小限にする有望な方法であることが、最近証明され た。内皮由来の活性化した細胞、たとえば本明細書に記載する核酸リガンドＶＥ ＧＦアンタゴニストに選択的にターゲティングする低毒性薬物は、ＫＳの処置に きわめて有益であろう。 ＶＥＧＦ核酸リガンドに関する他の領域の臨床用途の可能性は、過度の血管形 成を特徴とする眼障害である。そのような障害の例は、黄斑変性および糖尿病性 網膜症である。黄斑変性の場合、黄斑（最高視力に関係する網膜部分）下の進行 性脈絡膜血管形成が視覚を妨害する。糖尿病性網膜症の場合、網膜における血管 形成が視覚を妨害する。黄斑変性および糖尿病性網膜症における血管増殖を開始 する最初の刺激は現在分かっていないが、ＶＥＧＦは重要な血管形成誘発因子で あると思われる（Ｌｏｐｅｚ，Ｐ．Ｆ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔ ｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，８５５−８６８；Ｋｌｉ ｆｆｅｎ，Ｍ．ら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．８１，１５４ −１６２；Ｋｖａｎｔａ，Ａ．ら（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍ ｏｌ．Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７，１９２９−１９３４；Ｐａｑｕｅ ｓ．ら（１９９７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２３：１２ ５−１３０）。したがってＶＥＧＦの阻害薬は黄斑変性において血管形成を減少 させるのに有用となりうる。発明の概要 本明細書には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性２’−フルオ ロ（２’−Ｆ）−修飾ピリミジンＲＮＡリガンドを記載する。このような核酸リ ガンドを同定するために本発明で用いる方法はＳＥＬＥＸと呼ばれる。これは指 数的濃縮による系統的リガンド進化の頭字語である。本明細書に記載するリガン ドは、３０または４０の隣接位置でランダム化された当初約１０14ＲＮＡ分子の プールから選択された。本明細書には図２〜６に示す進化したリガンドが含まれ る。本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物ま たは親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核 酸混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）候補となる混合物の員子をＶＥＧＦに対 する親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへ の結合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得 ることにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガ ントである）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高 分子量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または 親油性化合物からなる複合体を含む。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含む脂質構築体を包含 する。本発明はさらに、複合体を含む脂質構築体の製造方法であって、複合体が ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化合物からなる方法に関する。 他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ 核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与することに 関する。本発明はさらに、この複合体をさらに脂質構築体と結合させることによ り、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良することに関する。 本発明の目的は、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性 化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体、およ びそれを製造する方法を提供することである。本発明の他の目的は、複合体を含 む脂質構築体を提供することである。本発明の他の目的は、改良された薬物動態 学的特性を備えた、１またはそれ以上の非免疫原性高分子量化合物または親油性 化合物と結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを提供することであ る。 ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物を含む複合体を目的と する本発明の態様において、非免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコ ール、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい 。より好ましくは、ＰＥＧは約１０〜８０Ｋの分子量をもつ。最も好ましくは、 ＰＥＧは約２０〜４５Ｋの分子量をもつ。ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび親油性化 合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、親油性化合物はグリセロ リン脂質であることが好ましい。本発明の好ましい態様において、脂質構築体は 好ましくは脂質二重層小胞、最も好ましくはリポソームである。好ましい態様に おいて、ＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）に共有結合した非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物を含む複合体を目的とする本発明の態様において、 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）はターゲティング能に作用すること ができる。 さらにＶＥＧＦ核酸リガンドは、複合体の一部ではない脂質構築体と共有結合 または非共有結合による相互作用により結合することができる。 さらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む脂質構築体または非免疫原性高分子量化 合物もしくは親油性化合物／ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を含む脂質構築体を目 的とする本発明の態様であって、脂質構築体が内部コンパートメントを定める膜 を備えたタイプのもの（たとえば脂質二重層小胞）である場合、脂質構築体と会 合したＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体は脂質構築体の膜と結合するか、また はコンパートメント内に封入されていてもよい。ＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構 築体の膜と結合した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドは膜の内側に面した部分 または外側に面した部分と結合し、これによりＶＥＧＦ核酸リガンドが小胞の内 側または外側へ突出していてもよい。特定の態様では、予め形成した脂質構築体 の外側にＶＥＧＦ核酸リガンド複合体を受動的に装填することができる。核酸リ ガンドが脂質構築体から突出した態様の場合、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲテ ィング能に作用することができる。 脂質構築体のＶＥＧＦ核酸リガンドがターゲティング能に作用する場合、脂質 構築体はさらに療法用または診断用薬剤と結合していてもよい。１態様において 、療法用または診断用薬剤は脂質構築体の外側に結合している。他の態様におい ては、療法用または診断用薬剤は脂質構築体に封入されているか、または脂質構 築体の内側に結合している。さらに他の態様において、療法用または診断用薬剤 は複合体と結合している。１態様において、療法用薬剤は薬物である。他の態様 において、療法用または診断用薬剤は１またはそれ以上の他の核酸リガンドであ る。 本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドお よび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発 明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、血管形成を阻害する方法を 提供することである。本発明の他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥ ＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分予量化合物もしくは親油性化合物を含む 複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、腫瘍の 増幅を阻害する方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧ Ｆ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物 もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を 投与することにより、カポジ肉腫を阻害する方法を提供することである。本発明 のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよ び非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、または本発明 の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、黄斑変性を阻害する方法を提 供することである。本発明のさらに他の目的は、ＶＥＧＦ核酸リガンド、または ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を 含む複合体、または本発明の複合体を含む脂質構築体を投与することにより、糖 尿病性網膜症を阻害する方法を提供することである。 本発明の他の目的は、療法用または診断用薬剤をＶＥＧＦ核酸リガンドおよび 親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物を含む複合体と結合させることに より、ＶＥＧＦを発現している生物学的ターゲットに療法用または診断用薬剤を ターゲティングする方法であって、複合体がさらに脂質構築体と結合し、ＶＥＧ Ｆ核酸リガンドがさらにその脂質構築体の外側と結合している方法を提供するこ とである。 これらおよび他の本発明の目的、ならびに本発明の性質、範囲および有用性は 、以下の記載および請求の範囲の記載から当業者に明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｑは、ＮＸ２１３（図１Ａ）、ＮＸ２７８（図１Ｂ）、ｓｃＮＸ２ ７８（図１Ｃ）、ｓｃＮＸ２１３（図１Ｄ）、ＮＸ３１８３８−ＰＬ（図１Ｅ） 、ＮＸ３１８３８脂質アミド１（図１Ｆ）、ＮＸ３１８３８脂質アミド２（図１ Ｇ）、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（図１Ｈ）、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ（図１１）、リンカーを含まないＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体 (ＮＸ３１８３８ｄ０)(図１Ｊ)、Ｃ５リンカー１個を含むＮＸ３１８３８ ４０ Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ１）（図１Ｋ）、Ｃ５リンカー２個を含む ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ二量体（ＮＸ３１８３８ｄ２）（図１Ｌ）、Ｃ ５アミノリンカー（図１Ｍ）、グリセロールビスホスフェートリンカー（図１Ｎ ）、１８原子スペーサーリンカー（図１Ｏ）、アミノテトラエチレングリコール リンカー（図１Ｐ）、３’３’−ｄＴ（図１Ｑ）、およびＮＸ３１９１７（図１ Ｒ）の分子の記述を示す。リガンドの５’ホスフェート基を図中に表示する。ｍ ＰＥＧはメチルポリエチレングリコールを表す。ヌクレオチドの前の小文字は下 記のも のを示す：ｍ＝２’−Ｏ−メチル、ａ＝２’−アミノ、ｒ＝リボ、ｆ＝２’−フ ルオロ。ヌクレオチドの前に文字がないのは、デオキシリボヌクレオチド（２’ Ｈ）を示す。３’３’−ｄＴは、３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合 を示す。ヌクレオチドの後のＳは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合から なる主鎖修飾を表す。 図２は、ＶＥＧＦに対する種々の核酸リガンドの結合性を示す。非修飾核酸リ ガンド（ＮＸ２１３、白丸）、そのジアルキルグリセロール修飾類似体（ＮＸ２ ７８、白菱形）およびリポソームＮＸ２７８（ＮＸ２７８−Ｌ、白四角）、なら びに配列スクランブル型（ｓｃ）対照（ｓｃＮＸ２１３、黒丸；ｓｃＮＸ２７８ 、黒菱形；およびｓｃＮＸ２７８−Ｌ、黒四角）の結合親和性を、競合電気泳動 移動度シフトアッセイにより測定した。 ＮＸ２１３は ｓｃＮＸ２１３はである。32 Ｐ５＝末端標識ＮＸ−２１３（１．５ｎＭ）を結合用緩衝液（０．０１％ヒト 血清アルブミンを含むリン酸緩衝化生理食塩水）中、３７℃で２０分間、ＶＥＧ Ｆ（０．３３ｎＭ）および競合体オリゴヌクレオチド（５ｐＭ−０．３３μM） の存在下でインキュベートした。32Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体を、遊離32 Ｐ ＮＸ−２１３から８％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離 した（１９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド、トリスーボラート、８ ９ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡを走行緩衝液とする）。種々の競合体濃度での32Ｐ ＮＸ−２１３／ＶＥＧＦ複合体に対応するバンドの強度を、リン−イマージヤー 分析（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）により定量した。競 合体の不在下で形成された複合体の量につき正規化したデータを、最小二乗法で 競合結合方程式に当てはめた。 図３は、種々の核酸リガンドがＶＥＧＦ誘発性の血管透過性増大に与える影響 を示す。予めエバンス・ブルー色素を注射したモルモットに、核酸リガンドを含 む、または含まないＶＥＧＦ（２０ｎＭ）を、皮内注射した。注射部位の皮膚が 吸収した光の相対量を測定することにより、色素の漏出量を定量した。 図４は、ＮＸ２７８−ＬがＫＳ細胞の増殖を阻害することを示す。種々の濃度 のＮＸ２１３、ＮＸ２７８−ＬおよびｓｃＮＸ２７８−Ｌの存在下でのＫＳＹ− １細胞の増殖。ＫＳＹ−１細胞を、０日目に２４ウェルプレートに１×１０4細 胞／ウェルの密度で接種した。１および３日目に、同様に処理した新鮮な培地と 交換した。培養５または６日目に細胞をトリプシン処理し、粒子クールター計数 器で細胞数を測定した。実験を三重に数回行った。示した結果は代表的実験の平 均とＳＥである。 図５Ａおよび５Ｂは、ＮＸ２７８が無胸腺マウスにおいてＫＳ細胞の増殖を阻 害することを示す。１日目に無胸腺マウスの前足後方にＫＳ腫瘍を移植した。マ ウスを２日目から始めて１日１回５日間、腹腔内注射によりＮＸ２７８−Ｌ（５ ０μg／日／マウス、図５Ａ、および１５０μg／日／マウス、図５Ｂ）で処理し た。対照マウスを、核酸リガンド処理群と同量の脂質を用いて空のリポソームで 処理した。２週間にわたって腫瘍サイズを測定した。１４日目に腫瘍を摘出して 測定した。 図６には、ＮＸ３１８３８ ２０Ｋ ＰＥＧ（□）、４０Ｋ ＰＥＧ（■）、 およびＮＸ３１８３８（マイナスＰＥＧ）（▽）の血漿濃度に関するデータを、 ボーラス注射後の時間の関数としてまとめる。 図７には、ＮＸ３１８３８ ＰＬの血漿濃度に関するデータを、ボーラス注射 後の時間の関数としてまとめる。 図８Ａ〜８Ｄは、表示したＶＥＧＦタンパタ質（０．８ｐｍｏｌ）±核酸リガ ンド／モノクローナル抗体の皮内注射により引き起こされる血管透過性の変化を 示す。注射の３０分後、エバンス・ブルー色素の局所溢出を、採取した皮膚の透 視により測定した。図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ 、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ，ＮＸ３１８３８−ＰＬ、またはＮＸ３１８ ３８ｄ２−４０Ｋ ＰＥＧとタンパク質を注射の３０分前に混和した効果を示す 。 数値は平均±ＳＥＭである。＊はＶＥＧＦ単独と比較してＰ＜０．０５。分子の 記述に関しては図１参照。 図９Ａ〜９Ｃは、核酸リガンドによるＶＥＧＦ誘発性角膜血管形成の減少につ いての評価を示す。０または３ｐｍｏｌのＶＥＧＦタンパク質をバイオポリマー （ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））に取り込ませ、角膜支質に埋め込んだ。図示し たように動物を１日２回５日間、ＰＢＳまたは核酸リガンドの静脈内投与により 処理した。図Ａ、ＢおよびＣは、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８ ３８−４０Ｋ ＰＥＧ、またはＮＸ３１８３８−ＰＬ核酸リガンドによる全身処 理が与える効果を示す。数値は平均±ＳＥＭである。＊は３ｐｍｏｌ ＶＥＧＦ ＋ＰＢＳ群と比較してＰ＜０．０５。分子の記述に関しては図１参照。 図１０には、ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧの血漿濃度（○、△）または硝 子体濃度（●、▲、■）に関するデータを、投与後の時間の関数としてまとめる 。 図１１は、４０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ＮＡＬ）で１日２回（ＢＩＤ）処 理したヌードマウスにおいて、皮下で増殖するヒトＡ６７３腫瘍の腫瘍増殖曲線 を示す。陰性対照は４０ｍｇ／ｋｇで１日２回投与したスクランブルＶＥＧＦ核 酸リガンド配列ＮＸ３１９１７ＮＡＬ（分子の記述に関しては図１Ｒ参照）から なっていた。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノク ローナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。４ ０ｍｇ／ｋｇ投与群と１０ｍｇ／ｋｇ投与群の間に有意差はないように思われた ので、１４日後は４０ｍｇ／ｋｇ群の投与をそれ以上行わなかった。マウス８匹 の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植し、被験化合物の腹 腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。腫瘍の体積（ｍｍ3 として表示）を次式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１２は、ＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８核酸リガンド（ＮＡＬ）の異なる投与計 画（投与期間中１日２回（ＢＩＤ）と１日１回（ＱＤ）の比較）、４０Ｋ ＰＥ Ｇの各バッチ（ＮＸ３１８３８．０７バッチと新たなＮＸ３１８３８．０４バッ チの比較）、および異なる薬物配合物（リポソームＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８Ｐ Ｌ ＮＡＬとＶＥＧＦ ＮＸ３１８３８ＰＬ ＮＡＬ ４０Ｋ ＰＥＧの比較） の腫瘍増殖曲線を示す。マウス８匹の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍 細胞を皮下移植し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験 期間中続けた。数群で腫瘍の増殖しない動物があり、したがって最終分析につき 、ある群では７匹(ＮＸ３１８３８．０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、およびＮ Ｘ３１８３８.０４ ３ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ)または６匹(ＮＸ３１８３８.０４ １０ｍｇ／ｋｇ ＱＤ、およびＮＸ３１８３８．０７ １０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ )の動物しかいなかった。腫瘍の体積（ｍｍ3として表示）を次式により判定した ：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１３は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３ ８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８ ＮＡＬ）による、皮下増殖 中のＡ６７３腫瘍の用量依存性阻害を示す。この力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ）は無効果量に達せず、最低（０．０３ｍｇ／ｋｇ）用量でもなお腫瘍阻害がみ られた。マウス８匹の群に０日目に１×１０7個のＡ６７３腫瘍細胞を皮下移植 し、被験化合物の腹腔内注射による処理を１日目に開始し、実験期間中続けた。 ＮＸ３１８３８ ＮＡＬ ３ｍｇ／ｋｇ群では腫瘍の増殖しない動物が２匹あり 、したがって６匹の動物しかいなかった。腫瘍の体積（ｍｍ3として表示）を次 式により判定した：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１４は、ヌードマウスにおいて、１日１回投与したＶＥＧＦ ＮＸ３１８３ ８ ４０Ｋ ＰＥＧ核酸リガンド（ＮＡＬ）による、皮下増殖中の樹立した（ｓ ｔａｇｅｄ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）Ａ６７３腫瘍の阻害を証明する増殖曲線 を示す。陽性対照は１００μｇ／マウスで週２回投与した抗ＶＥＧＦモノクロー ナル抗体ｍＡｂ２６５０３．１１（Ｒ＆Ｄシステムズ）からなっていた。マウス に１×１０7個のＡ６７３細胞を移植し、腫瘍を２００±１００ｍｍ3の体積にま で増殖させ、この時点で動物を体重により選別し、永久識別のため入れ墨をし、 被験化合物の腹腔内注射による処理を開始し、実験期間中続けた。各時点で平均 ８匹のマウスであった。腫瘍の体積（ｍｍ3として表示）を次式により判定した ：腫瘍体積＝Ｌ×Ｗ2／２ 図１５には、ボーラス注射後のＮＸ２１３、ＮＸ２７８、ＮＸ２７８−リポソ ームの血漿濃度に関するデータをまとめる。 図１６は、ヌードマウスに皮下移植したＫＳＹ−１腫瘍の増殖曲線を示す。マ ウスを、実験期間中１日２回のＮＸ３１９１７ ４０Ｋ ＰＥＧまたはＮＸ３１ ８３８ ４０Ｋ ＰＥＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳの腹腔内注射により処 理した。ヌードマウスの後方側腹部に２×１０7個のＫＳＹ−１細胞を皮下移植 した後、０日目に処理を開始した。各群４匹のマウスを用いた。誤差はＳＥＭで ある。発明の詳細な記述 定義： “共有結合”は、電子の共有により形成される化学結合である。 “非共有結合による相互作用”は、分子が共有結合以外の、イオン相互作用お よび水素結合を含めた相互作用により互いに保持されるという意味である。 “親油性化合物”は、脂質および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相 と結合するか、またはそれらに分配される傾向をもつ化合物であり、実質的に親 油性成分からなる構造体がこれに含まれる。親油性化合物には、脂質、ならびに 脂質（および／または比誘電率の低い他の物質もしくは相）と結合する傾向をも つ非脂質含有化合物が含まれる。コレステロール、リン脂質、ならびにグリセロ 脂質、たとえばジアルキルグリセロールおよびジアシルグリセロール、ならびに グリセロールアミド脂質は、親油性化合物の他の例である。本発明の好ましい１ 態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合する親油性化合物は、下記の構 造をもつグリセロ脂質である： 式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2− ；ならびにＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−、ＣＨ3 （ＣＨ2）nＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n （ＣＯ）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ− でなければならず、Ｘは独立して（ＰＯ4）、ＯおよびＣＨ2ＯＣ＝Ｏ よりなる群から選択され、ここでｎ＝０〜３０、好ましくは１０〜２０である。 ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−である場合、親油性化合物はリン 脂質である。ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−である場合、親油性化 合物はグリセロールアミド脂質である。ＲがＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−、またはＣＨ3 （ＣＨ2）nＯＣＨ2−である場合、親油性化合物はジアルキルグリセロ脂質であ る。ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−、またはＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ） Ｏ−である場合、親油性化合物はジアシルグリセロ脂質である。好ましい態様に おいてはＲ3はＸ−である。 本明細書中で用いる“複合体”は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物に共有結合させることにより形成される分子を表す 。本発明の特定の態様において、複合体はＡ−Ｂ−Ｙとして示され、ここでＡは 本明細書に記載する親油性化合物または非免疫原性高分子量化合物であり；Ｂは 任意であって１またはそれ以上のリンカーＺであり；ＹはＶＥＧＦ核酸リガンド である。 本発明に関し“脂質構築体”は、脂質、リン脂質、またはその誘導体を含有す る構造体であり、多様な構造様式を含む。これらの脂質は水性懸濁液中に受容さ れることが知られている。これらの構造体には脂質二重層小胞、ミセル、リポソ ーム、エマルション、脂質リボンまたはシートが含まれるが、これらに限定され ない。これらは、薬剤学的に許容しうることが知られている種々の薬物および成 分と複合体を形成していてもよい。好ましい態様において、脂質構築体はリポソ ームである。好ましいリポソームは単層であり、２００ｎｍ未満の相対サイズを もつ。脂質構築体の一般的な追加成分には、特にコレステロールおよびα−トコ フェロールが含まれる。脂質構築体は単独で、または個々の用途に望まれる特性 を備えていると当業者が認めるいかなる組合わせでも使用できる。さらに、脂質 構築体およびリポソーム形成の技術的観点は当業者に周知であり、当技術分野で 慣用されるいかなる方法も本発明に採用できる。 本明細書中で用いる“核酸リガンド”は、ターゲットに対し望ましい作用をも つ、天然には存在しない核酸である。本発明のターゲットはＶＥＧＦであり、し たがってこの語はＶＥＧＦ核酸リガンドである。望ましい作用には、ターゲット を結合すること、触媒作用によりターゲットを変化させること、ターゲットまた はターゲットの機能活性を修飾／変化させるようにターゲットと反応すること、 自殺阻害物質と同様にターゲットと共有結合すること、ターゲットと他の分子の 反応を促進することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様におい て、その作用はＶＥＧＦに対する特異的結合親和性であり、その際、この核酸リ ガンドはＶＥＧＦが結合する既知の生理学的機能をもつ核酸ではない。 本発明の好ましい態様において、本発明の複合体および脂質構築体のＶＥＧＦ 核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法により同定される。ＶＥＧＦ核酸リガンドは、候補 となる核酸混合物（核酸がＶＥＧＦのリガンドである）から下記の方法で同定さ れる：ａ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させる、その際、ＶＥＧＦに対し候補混 合物と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる ；ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配する；そしてｃ ）これらの高親和性核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物を得る（米 国特許出願第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題“血管 内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチド”；米国特許出 願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題“血管内皮増殖 因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド”参照；これら を本明細書に援用する）。 “候補混合物”は、目的とするリガンドをそれから選択する、種々の配列の核 酸の混合物である。候補混合物源は、天然核酸もしくはそのフラグメント、化学 的に合成した核酸、酵素により合成した核酸、または以上の方法の組合わせによ り製造した核酸から得ることができる。好ましい態様において、増殖プロセスを 促進するために、それぞれの核酸はランダム領域を囲む固定配列を含む。 “核酸”は、一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそのいかなる化 学修飾体をも意味する。修飾には、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に 付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用および流動性（ｆｌｕｘｉｏｎ ａｌｉｔｙ）を取り込む他の基を供給するものが含まれるが、これらに限定され ない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミジン修飾、８−位プ リン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５− ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾、たとえばヌクレオシド間ホスホロチオエー ト結合、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえばイソ塩基であるイソシチ ジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに限定されない。修飾には 、キャッピングのような３’および５’修飾も含めることができる。 “非免疫原性高分子量化合物”は、一般に免疫原応答を生じない、約１０００ 〜１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約１０００〜５００，０００Ｄａ、 最も好ましくは約１０００〜２００，０００Ｄａの化合物である。本発明の目的 に関し、免疫原応答は、生物に抗体タンパク質を産生させるものである。非免疫 原性高分子量化合物の例には、ポリアルキレングリコールおよびポリエチレング リコールが含まれる。本発明の好ましい１態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンド に共有結合した非免疫原性高分子量化合物はポリエチレングリコールであり、構 造Ｒ（Ｏ（ＣＨ2）x）nＯ−をもち、ここでＲは独立してＨおよびＣＨ3よりなる 群から選択され、ｘ＝２〜５であり、ｎはほぼポリアルキレングリコールの分子 量／１６＋１４ｘである。本発明の好ましい態様において、分子量は約１０〜８ ０ｋＤａである。最も好ましい態様において、ポリアルキレングリコールの分子 量は約２０〜４５ｋＤａである。最も好ましい態様において、ｘ＝２、ｎ＝９× １０2である。１またはそれ以上のポリアルキレングリコールが同−ＶＥＧＦ核 酸リガンドに結合して、分子量の和が好ましくは約１０〜８０ｋＤａ、最も好ま しくは約２０〜４５ｋＤａであってもよい。特定の態様においては、非免疫原性 高分子量化合物も核酸リガンドであってよい。 “脂質二重層小胞”は、主に極性（親水性）部分と非極性（親油性）部分をも つ個々の分子から形成される、閉じた、流体に満たされた顕微鏡的球体である。 親水性部分はホスフェート、グリセロホスフェート、カルボキシ、サルフェート 、アミノ、ヒドロキシ、コリンその他の極性基を含みうる。非極性基の例は、飽 和または不飽和炭化水素、たとえばアルキル、アルケニルまたは他の脂質基であ る。小胞の安定性を改良するために、または他の望ましい特性を付与するために 、ステロール類（たとえばコレステロール）および薬剤学的に許容しうる他の成 分(αートコフェロールのような酸化防止剤を含む)が含有されてもよい。 “リポソーム”は脂質二重層小胞の集合体であり、主に、長い脂肪酸鎖から構 成される２つの疎水性テイルを含むリン脂質分子からなる。これらの分子は水に 暴露されると自然に整列し、各層の分子の親油性末端が膜の中心で会合し、対向 する極性末端が二重膜の内面と外面をそれぞれ形成した、二重膜を形成する。し たがって膜のそれぞれの側は親水性表面を提供し、一方、膜の内部は親油性媒質 を含む。これらの膜は、形成されたとき一般に内部水性空間の周りにタマネギの 層と似た様式で層間水相により分離された、閉じた同心膜の系として配列する。 これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）に剪断力を付与して、単膜小胞（ＵＶ）に変換す ることができる。 “カチオンリポソーム”は、生理学的ｐＨにおいて全体として正の電荷をもつ 脂質成分を含有するリポソームである。 “ＳＥＬＥＸ”法は、ターゲットと望ましい様式で相互作用する（たとえばタ ンパク質への結合）核酸リガンドの選択と、選択したこれらの核酸の増幅との組 合わせを伴うものである。選択／増幅の工程を反復循環することにより、きわめ て多数種類の核酸を含有するプールから、ターゲットと最も強く相互作用する１ 種類または少数の核酸を選択することができる。選択した目標に達するまで、こ の選択／増幅操作の循環を続ける。ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に記載さ れている。 “ターゲット”は、それに対するリガンドを得たいという関心のあるいかなる 化合物または分子であってもよい。ターゲットは、タンパク質（たとえばＶＥＧ Ｆ、トロンビンおよびセレクチン）、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク 質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態の類 似体、補因子、阻害物質、薬物、色素、栄養素、増殖因子など、制限がない。本 発明の主なターゲットはＶＥＧＦである。 “改良された薬物動態特性”とは、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性 化合物に共有結合するか、または脂質構築体と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドが 、非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物に結合していない、または脂 質構築体と結合していない同−ＶＥＧＦ核酸リガンドと対比して、より長い循環 半減期をインビボで示すことを意味する。 “リンカー”は、２以上の分子を共有結合または非共有結合による相互作用に よ り連結し、これらの分子１またはそれ以上がもつ機能特性を保存する様式で分子 を空間的に分離しうる分子である。リンカーはスペーサーとしても知られる。リ ンカーの例には、図１Ｍ〜ＩＰに示す構造体が含まれるが、これらに限定されな い。 本明細書中で用いる“療法”には、治療および／または予防が含まれる。療法 という場合、これはヒトおよび他の動物について述べたものである。 本発明は、２’−修飾ヌクレオチドを含む、ＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド を包含する。本発明はさらに、表２〜６（配列番号：１５−１３２）に示す、Ｖ ＥＧＦに対するＲＮＡリガンドを包含する。より詳細には、本発明は表２〜６に 示す特異的核酸リガンドと実質的に相同な核酸配列、および実質的に同じＶＥＧ Ｆ結合能をもつ核酸配列を包含する。実質的に相同とは、７０％以上、きわめて 好ましくは８０％以上、さらに最も好ましくは９０％、９５％または９９％以上 の一次配列相同性の程度を意味する。本明細書に記載する相同％は、比較する配 列中の一致するヌクレオチド残基とアラインする２配列のうち小さい方にみられ るヌクレオチドの％として計算される。その際、アラインメントを補助するため に１０ヌクレオチドの長さに１ギャップを導入できる。実質的に同じＶＥＧＦ結 合能とは、その親和性が、本明細書に記載するリガンドの親和性の１桁または２ 桁以内であることを意味する。ある配列 − 本明細書に具体的に記載したもの と実質的に相同 − が同じＶＥＧＦ結合能をもつか否かの判定は、当業者が容 易になしうる。 表２〜６（配列番号：１５−１３２）に示す、ＶＥＧＦの核酸リガンドの配列 相同性をみると、一次相同性をほとんど、または全くもたない配列が、実質的に 同じＶＥＧＦ結合能をもつ場合があることが分かる。これらの理由から、本発明 は表２〜６に示す核酸リガンドと実質的に同じ推定構造または構造モチーフおよ びＶＥＧＦ結合能をもつ核酸リガンドをも包含する。実質的に同じ構造または構 造モチーフは、ツッカーフォールド（Ｚｕｃｋｅｒｆｏｌｄ）プログラム（Ｚｕ ｃｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２参照）を用いる配列 アラインメントにより推定できる。当技術分野で知られているように、二次構造 および構造モチーフを推定するために他のコンピュータープログラムを使用でき る。溶液中または結合構造体としての実質的に同じ推定構造または構造モチーフ の核酸リガンドは、ＮＭＲそのほか、当技術分野で知られている技術を用いて推 定することもできる。 本発明はさらに、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物また は親油性化合物からなる複合体を調製する方法であって、（ａ）候補となる核酸 混合物をＶＥＧＦと接触させ、（ｂ）この候補混合物の員子をＶＥＧＦに対する 親和性に持づいて分配し、そして（ｃ）選択した分子を増幅してＶＥＧＦへの結 合に関し比較的高い親和性をもつ核酸配列につき濃縮された核酸混合物を得るこ とにより、候補となる核酸混合物から核酸リガンド（核酸がＶＥＧＦのリガンド である）を同定し、同定したこれらのＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子 量化合物または親油性化合物と共有結合させることを含む方法を包含する。 本発明はの他の目的は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物に共有 結合した１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合体をを提供するこ とである。このような複合体は、非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物 と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドに優る下記の利点１またはそれ以上をも つ：１）改良された薬物動態特性、および２）改良された細胞内送達能、または ３）改良されたターゲティング能。さらに脂質構築体と結合した複合体も同じ利 点をもつ。 複合体、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくは複合体を含む脂質構築体は、こ れらの利点のうち１、２または３つをもつであろう。本発明の脂質構築体は、た とえば下記のものからなる：ａ）リポソーム、ｂ）リポソームの内部に封入され た薬物、およびｃ）ＶＥＧＦ核酸リガンドと親油性化合物からなる複合体であっ て、複合体のＶＥＧＦ核酸リガンド成分が脂質構築体の外側と結合し、そこから 突出しているもの。そのような場合、複合体を含む脂質構築体は、１）改良され た薬物動態特性をもち、２）封入された薬物の細胞内送達能が増大し、かつ３） 外側に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドにより、ＶＥＧＦを発現している予め選択 された位置にインビボで特異的にターゲティングする。 他の態様において本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成することにより、ＶＥＧＦ 核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良し、この複合体を患者に投与する方法を 提供する。本発明はさらに、この複合体を脂質構築体とさらに結合させることに より、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性を改良する方法に関する。 他の態様において本発明の複合体は、親油性化合物、たとえばグリセロ脂質、 または非免疫原性高分子量化合物、たとえばポリアルキレングリコールまたはポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合した、ＶＥＧＦ核酸リガンドからな る。これらの場合、複合体の薬物動態学的特性はＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比 較して向上するであろう。他の態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原 性高分子量化合物または親油性化合物と共有結合させて複合体を形成し、この複 合体を脂質構築体とさらに結合させるか、あるいはＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質 構築体に封入すると、ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学的特性がＶＥＧＦ核酸 単独と比較して改良される。 多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互作用 のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が多重のＶＥＧＦ核酸リガン ドを含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動 態特性が改良されるであろう。脂質構築体が多重のＶＥＧＦ核酸リガンドまたは 複合体を含む態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体のみがある脂 質構築体と比較して複合体の薬物動態特性が改良されるであろう。 本発明の特定の態様において、本発明の複合体は他の核酸リガンド１つ（二量 体）またはそれ以上（多量体）に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む。この核 酸リガンドはＶＥＧＦに対するものであってもよく、異なるターゲットに対する ものであってもよい。多重のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦと の多重結合相互作用のためアビディティーが増大する。さらに、複合体が１また はそれ以上の他のＶＥＧＦ核酸リガンドに結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを含む 本発明の態様では、１つのＶＥＧＦ核酸リガンドのみと比較して複合体の薬物動 態特性が改良されるであろう。 非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物をＶＥＧＦ核酸リガンドの多様 な位置に、たとえば塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５−位、プ リンヌクレオチドの８−位、ホスフェートのヒドロキシル基、またはＶＥＧＦ核 酸リガンドの５’もしくは３’末端のヒドロキシル基もしくは他の基に、共有結 合させることができる。親油性化合物がグリセロ脂質であるか、または非免疫原 性高分子量化合物がポリアルキレングリコールまたはポリエチレングリコールで ある態様では、それは好ましくはそのホスフエート基の５’もしくは３’ヒドロ キシル基に結合する。最も好ましい態様では、親油性化合物または非免疫原性高 分子量化合物は核酸のホスフェート基の５’ヒドロキシル基に結合する。ＶＥＧ Ｆ核酸リガンドへの非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物の結合は、直 接に、またはリンカーもしくはスペーサーを用いて行うことができる。脂質構築 体が複合体を含む態様またはＶＥＧＦ核酸リンカーがリポソームに封入された態 様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体と脂質構築体との非共有結合による 相互作用が好ましい。 核酸を療法に用いる際に生じる問題のひとつは、オリゴヌクレオチドがそれら のホスホジエステル形である場合、目的とする効果を表す前に、体液中で細胞内 および細胞外酵素、たとえばエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによ って速やかに分解される可能性があることである。ＶＥＧＦ核酸リガンドのイン ビボ安定性を高めるために、またはＶＥＧＦ核酸リガンドの送達を向上もしくは 仲介するために、ＶＥＧＦ核酸リガンドの特定の化学修飾を行うことができる。 本発明において考慮するＶＥＧＦ核酸リガンド修飾には、ＶＥＧＦ核酸リガンド 塩基またはＶＥＧＦ核酸リガンド全体に、付加的な電荷、分極率、疎水性、水素 結合、静電相互作用および流動性を取り込む他の基を供給するものが含まれるが 、これらに限定されない。このような修飾には、２’−位糖修飾、５−位ピリミ ジン修飾、８−位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５ −ブロモまたは５−ヨードーウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエートま たはアルキルホスフェート修飾、メチル化、異例の塩基対合組合わせ、たとえば イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるが、これらに 限定されない。修飾には、キャッピングのような３’および５’修飾も含めるこ とができる。 核酸リガンドをＳＥＬＥＸ法により得る場合、修飾はＳＥＬＥＸ前または後、 いずれの修飾であってもよい。ＳＥＬＥＸ前修飾によれば、ＶＥＧＦに対する特 異性および改良されたインビボ安定性の両方を備えたＶＥＧＦ核酸リガンドが得 られる。２’−ＯＨ核酸リガンドにＳＥＬＥＸ後修飾を行うと、核酸リガンドの 結合能に不都合な影響を与えずに、改良されたインビボ安定性が得ることができ る。本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドの好ましい修飾は、５’および３’ホスホロ チオエートキャッピング、ならびに／あるいは３’末端の３’３’逆転ホスホジ エステル結合である。最も好ましい態様では、好ましいＶＥＧＦ核酸リガンド修 飾は３’末端の３’３’逆転ホスホジエステル結合である。さらに、一部または 全部のヌクレオチドの２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−アミノ（２’−ＮＨ2 ）、および２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾が好ましい。 本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドと非免疫原性高分子量化合物ま たは親油性化合物の共有結合により、非免疫原性高分子量化合物または親油性化 合物と結合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較して改良された薬物動態特性 （すなわち、より遅いクリアランス速度）が得られる。 本発明の他の態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合 物または親油性化合物を含む複合体をさらに脂質構築体と会合させることができ る。この会合により、脂質構築体と会合していないＶＥＧＦ核酸リガンドと比較 して改良された薬物動態特性が得られる。ＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を 共有結合または非共有結合による相互作用により脂質構築体と会合させることが できる。好ましい態様において、会合は非共有結合相互作用による。好ましい態 様において、脂質構築体は脂質二重層小胞である。最も好ましい態様において、 脂質構築体はリポソームである。 本発明に用いるリポソームは当技術分野で現在知られている種々の方法または 今後開発される方法のいずれによっても調製できる。一般にそれらはリン脂質、 たとえばジステアロイルホスファチジルコリンから調製され、他の材料、たとえ ば中性脂質（たとえばコレステロール）、および界面改質剤、たとえば正に荷電 した化合物（たとえばコレステロールのステリルアミンまたはアミノマンノース またはアミノマンニトール誘導体）または負に荷電した化合物（たとえばリン酸 ジアセチル、ホスファチジルグリセロール）を含有してもよい。多重膜リポソー ムは常法により、すなわち脂質を適切な溶剤に溶解し、次いで溶剤を蒸発させて 容器の内側に薄膜を残留させて、適切な容器または器の内壁に選択した脂質を沈 着させるか、または噴霧乾燥することにより形成できる。次いで容器に水相を添 加し、回転運動または渦撹拌運動を与えると、ＭＬＶが生成する。次いでＭＬＶ のホモジナイゼーション、超音波処理または押出し（フィルターを通して）によ り、ＵＶを形成できる。さらに、界面活性剤分離法によりＵＶを形成できる。 本発明の他の態様において脂質構築体は、脂質構築体の表面と結合したターゲ ティング用ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）および封入された療法薬 または診断薬を含む。好ましくは脂質構築体はリポソームである。予め形成した リポソームをＶＥＧＦ核酸リガンドと会合するように修飾してもよい。たとえば カチオン性リポソームは静電相互作用によりＶＥＧＦ核酸リガンドと結合する。 グリセロ脂質などの親油性化合物に共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドを、予め 形成したリポソームに添加してもよく、これによりグリセロ脂質、リン脂質また はグリセロールアミド脂質がリポソーム膜と結合する。あるいはリポソーム形成 中にＶＥＧＦ核酸リガンドをリポソームと結合させてもよい。 リポソームが広範な療法薬または診断薬の封入または取込みに有利であること は当技術分野で周知である。多様ないかなる化合物もリポソーム内部の水性コン パートメントに収容できる。療法薬の具体例には、抗生物質、抗ウイルス性ヌク レオシド、抗真菌性ヌクレオシド、代謝調節薬、免疫モジュレーター、化学療法 薬、毒素解毒薬、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含ま れる。同様に、脂質二重層小胞に診断用放射性核種（たとえばインジウム１１１ 、ヨウ素１３１、イットリウム９０、リン３２またはガドリニウム）、ならびに 蛍光物質、またはインビトロおよびインビボ用途において検出できる他の物質を 装填することができる。療法薬または診断薬を水性内部にリポソーム壁により封 入できることを理解すべきである。あるいは保有された薬剤が小胞壁形成材料の 一部であってもよく、すなわちその材料に分散または溶解していてもよい。 リポソーム形成中に、水溶性キャリヤー物質を水和溶液に含有させることによ り水性内部に封入し、そして親油性分子を脂質配合物に含有させることにより脂 質二重層に取り込ませてもよい。特定の分子（たとえばカチオン性またはアニオ ン性の親油性薬物）の場合、予め形成したリポソーム中への薬物の装填は、たと えば米国特許第４，９４６，６８３号に記載された方法で達成できる。その開示 事項を本明細書に援用する。薬物封入後、リポソームをゲルクロマトグラフィー または限外ろ過などの方法で処理して、封入されていない薬物を除去することが できる。次いでリポソームを一般に無菌的にろ過して、懸濁液中に存在する可能 性のある微生物を除去する。微生物は無菌処理によっても除去できる。 大型の親水性分子をリポソームで封入したい場合、逆相蒸発法（ＲＥＶ）また は溶剤注入法などの方法で、比較的大きな単層小胞を形成できる。リポソーム形 成のための他の標準法は当技術分野で知られている。たとえば商業的なリポソー ム製造方法には、米国特許第４，７５３，７８８号に記載されたホモジナイゼー ション法、および来国特許第４，９３５，１７１号に記載された薄膜蒸発法が含 まれる。それらを本明細書に援用する。 療法薬または診断薬が脂質二重層小胞の表面と結合していてもよいことを理解 すべきである。たとえば薬物をリン脂質またはグリセリドに結合させることがで きる（プロドラッグ）。このプロドラッグのリン脂質またはグリセリドの部分を 脂質配合物に含有させることによりリポソームの脂質二重層に取り込ませるか、 または予め形成したリポソーム中へ装填することができる（米国特許第５，１９ ４，６５４号および第５，２２３，２６３号参照。それらを本明細書に援用する ）。 個々のリポソーム調製法が、意図する用途、および二重膜形成に用いる脂質の 種類に依存することは当業者に自明である。 ＬｅｅおよびＬｏｗ（１９９４，ＪＢＣ，２６９：３１９８−３２０４）、な らびにＤｅＦｒｅｅｓら（１９９６，ＪＡＣＳ，１１８：６１０１−６１０４） は、リガンド−ＰＥＧ−脂質と脂質成分の同時配合物によりＰＥＧ−リガンドが 内側と外側の両方に面したリポソームが得られることを最初に示した。受動アン カリングはＺａｌｉｐｓｋｙら（１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８：１ １１−１１８）が、オリゴペプチドリガンドおよびオリゴ糖リガンドをもっぱら リポソーム外面にアンカリングする方法として概説した。彼らの報文に提示され た中心的概念は、リガンド−ＰＥＧ−脂質コンジュゲートを調製し、次いで既存 の脂質二重層中への脂質テイルの自然取込み（“アンカリング”）により、予め 形成したリポソーム中へ配合しうるというものである。脂質基は、その疎水性脂 質アンカーを水溶液から抜き出し、次いで疎水性脂質二重層中に配置することに よって、より低い自由エネルギー状態に達するために、この挿入を行う。このよ うな系の重要な利点は、オリゴ脂質がもっぱら脂質二重層の外側にアンカリング することである。したがって、オリゴ脂質が内側に面した配向であることにより それらの生物学的ターゲットとの相互作用に利用されないため浪費されるという ことはない。 細胞へのＶＥＧＦ核酸リガンド送達効率は、リポソームと細胞膜の融合を促進 することが知られている脂質配合物および条件を採用することにより、最適化で きる。たとえば、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルセリンなど 負に荷電した特定の脂質は、特に他の融合誘導物質（ｆｕｓｏｇｅｎ）（たとえ ばＣａ2+など多価カチオン、遊離脂肪酸、ウイルス性融合タンパク質、短鎖ＰＥ Ｇ、リゾレシチン、洗浄剤および界面活性剤）の存在下で融合を促進する。ホス ファチジルエタノールアミンも、膜融合を高め、同時に細胞送達を促進するため に、リポソーム配合物に含有させることができる。さらに、たとえばカルボキシ ラート部分を含む遊離脂肪酸およびその誘導体を用いて、高いｐＨでは負に荷電 し、低いｐＨでは中性またはプロトン化しているｐＨ感受性リポソームを調製で きる。そのようなｐＨ感受性リポソームは、より高い融合傾向をもつことが知ら れている。 好ましい態様において、本発明のＶＥＧＦ核酸リガンドはＳＥＬＥＸ法で得ら れる。ＳＥＬＥＸは、米国特許出願第０７／５３６，４２８号、表題：指数的濃 縮による系統的リガンド進化、現在は放棄；米国特許出願第０７／７１４，１３ １号、１９９１年６月１０日出願、表題：核酸リガンド、現在は米国特許第５， ４７５，０９６号；米国特許出願第０７／９３１，４７３号、１９９２年８月１ ７日出願、表題：核酸リガンドの同定法、現在は米国特許第５，２７０，１６３ 号（国際特許出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号も参照）に記載されている。そ れぞれ本明細書に援用するこれらの特許出願を、まとめてＳＥＬＥＸ特許出願と 呼ぶ。 ＳＥＬＥＸ法によれば、それぞれユニークな配列をもち、それぞれ目的とする ターゲット化合物または分子に特異的に結合する特性をもつ核酸分子である一群 の生成物が得られる。ターゲット分子は好ましくはタンパク質であるが、特に炭 水化物、ペプチドグリカンおよび多様な小分子も含めることができる。ＳＥＬＥ Ｘ法は、生物学的構造体、たとえば細胞表面またはウイルスを、その生物学的構 造体の一体部分である分子との特異的相互作用によりターゲティングするのにも 使用できる。 ＳＥＬＥＸ法は、その最も基本的な形態では下記の一連の工程により定義され る： １）候補となる、種々の配列の核酸の混合物を調製する。候補混合物は一般に 固定配列の領域（すなわち候補混合物の各員子が同じ位置に同じ配列を含む）お よびランダム配列の領域を含む。固定配列領域は以下のように選択される：（ａ ）後記の増幅工程を補助する、（ｂ）ターゲットに結合することが分かっている 配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の特定の構造様式の核酸の濃度を高 める。ランダム配列は完全にランダムであってもよく（すなわちある塩基をいず れかの位置に見出す確率は１／４である）、または部分的にランダムであっても よい（たとえばある塩基をいずれかの位置に見出す確率は、０〜１００％のいず れの水準でも選択できる）。 ２）ターゲットと候補混合物の員子の結合に好ましい条件下で、候補混合物を 選択されたターゲットと接触させる。これらの状況は、ターゲットと候補混合物 の核酸との相互作用により、ターゲットとそのターゲットに対し最も強い親和性 をもつ核酸の間に核酸−ターゲット対を形成するものと考えることができる。 ３）ターゲットに対し最も高い親和性をもつ核酸を、ターゲットに対しより低 い親和性をもつ核酸から分配する。候補混合物中には最高親和性の核酸に相当す る配列はきわめて少数存在するにすぎない（おそらくわずか１分子の核酸）ので 、一般に分配に際し有意量の核酸（約５〜５０％）が保持されるように分配基準 を設定することが望ましい。 ４）分配に際し、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつとして選択された 核酸を、次いで増幅させて、ターゲットに対し比較的高い親和性をもつ核酸が濃 縮された新たな候補混合物を形成する。 ５）上記の分配工程および増幅工程を反復することにより、新た形成された候 補混合物が含有するユニーク配列はいっそう少なくなり、ターゲットに対する核 酸の平均親和度は一般に高まるであろう。極端にはＳＥＬＥＸ法は、最初の候補 混合物からターゲット分子に対し最も高い親和性をもつ核酸に相当する１または 少数の核酸を含有する候補混合物を与えるであろう。 多数の特定の目的を達成するように、基本的ＳＥＬＥＸ法が変更されている。 たとえば米国特許出願第０７／９６０，０９３号、１９９２年１０月１４日出願 、表題“構造に基づいて核酸を選択する方法”には、ＳＥＬＥＸをゲル電気泳動 と併用し、特定の構造特性をもつ核酸分子、たとえば折れ曲がりＤＮＡを選択す ることが記載されている。米国特許出願第０８／１２３，９３５号、１９９３年 ９月１７日出願、表題“核酸リガンドの光選択”には、ＳＥＬＥＸに基づく方法 であって、ターゲット分子に結合および／または光架橋し、ならびに／あるいは それらの分子を光不活性化しうる光反応性基を含む核酸リガンドを選択する方法 が記載されている。米国特許出願第０８／１３４，０２８号、１９９３年１０月 ７日出願、表題“テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド” （現在は米国特許第５，５８０，７３７号）には、近縁分子を識別しうる高特異 性核酸リガンドを同定するための、対抗ＳＥＬＥＸと呼ばれる方法が記載されて いる。米国特許出願第０８／１４３，５６４号、１９９３年１０月２５日出願、 表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：溶液ＳＥＬＥＸ”（現在は米国特 許第５，５６７，５８８号）には、ターゲット分子に対し高い親和性をもつオリ ゴヌクレオチドと低い親和性をもつものとを高い効率で分配しうる、ＳＥＬＥＸ に基づく方法が記載されている。米国特許出願第０７／９６４，６２４号、１９ ９２年１０月２１日出願、表題“ＨＩＶ−ＲＴ及びＨＩＶ−１Ｒｅｖに対する核 酸リガンド”（現在は米国特許第５，４９６，９３８号）には、ＳＥＬＥＸによ って改良された核酸リガンドを得る方法が記載されている。米国特許出願第０８ ／４００，４４０号、１９９５年３月８日出願、表題“指数的濃縮による系統的 リガンド進化：化学ＳＥＬＥＸ”には、リガンドをそのターゲットに共有結合さ せる方法が記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、たとえば改良されたインビボ安定性または改良された送達性 などの改良された特性をリガンドに与える修飾ヌクレオチドを含有する、高親和 性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例には、リボースおよび／ またはホスフェートおよび／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。 ＳＥＬＥＸにより同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米 国特許出願第０８／１１７，９９１号、１９９３年９月８日出願、表題“修飾ヌ クレオチドを含有する高親和性核酸リガンド”（現在は米国特許第５，６６０， ９８５号）に記載されており、そこにはピリミジン類の５−および２’−位が化 学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有する、オリゴヌクレオチドが記載さ れている。前掲の米国特許出願第０８／１３４，０２８号には、２’−アミノ( ２’−ＮＨ2)、２’−フルオロ(２’−Ｆ)、および／または２’−Ｏ−メチル( ２’−ＯＭｅ)で修飾された１またはそれ以上のヌクレオチドを含有する、高特 異性核酸リガンドが記載されている。米国特許出願第０８／２６４，０２９号、 １９９４年６月２２日出願、表題“分子内求核置換による公知及び新規２’−修 飾ヌクレオチドを製造するための新規方法：”には、種々の２’−修飾ピリミジ ンを含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。 ＳＥＬＥＸ法は、選択したオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレ オチドおよび非オリゴヌクレオチド官能性単位と組み合わせることを包含する。 これらはそれぞれ米国特許出願第０８／２８４，０６３号、１９９４年８月２日 出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進化：キメラＳＥＬＥＸ”（現在 は米国特許第５，６３７，４５９号）、および来国特許出願第０８／２３４，９ ９７号、１９９４年４月２８日出願、表題“指数的濃縮による系統的リガンド進 化：ブレンドＳＥＬＥＸ”に記載されている。これらの特許出願により、オリゴ ヌクレオチドの広範な形状その他の特性のアレイならびに効率的な増幅特性およ び複製特性を、他の分子の望ましい特性と組み合わせることが可能になる。 ＳＥＬＥＸ法はさらに、選択した核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原 性高分子量化合物とを組み合わせて、診断用または療法用複合体にすることを包 含する。これはたとえば米国特許出願第０８／４３４，４６５号、１９９５年５ 月４日出願、表題“核酸複合体”に記載されている。ＳＥＬＥＸ法はさらに、特 定のＶＥＧＦ核酸リガンドをジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロー ルなどの親油性化合物と結合させることを包含する。これはたとえば米国特許出 願第０８／７３９，１０９号、１９９６年１０月２５日出願、表題“血管内皮増 殖因子（ＶＥＧＦ）核酸リガンド複合体”に記載されている。診断用または療法 用複合体において、ポリエチレングリコールなどの高分子量非免疫原化合物、ま たはグリセロリン脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質などの親油性化 合物と結合したＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許出願第０８／８９７，３５１ 号、１９９７年７月２１日出願、表題“血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）核酸複合 体”に記載されている。基本的ＳＥＬＥＸ法の変更につき記載した上記特許出願 それぞれを全体として本明細書に援用する。 ＳＥＬＥＸにより、高い親和性および卓越した特異性でターゲットと結合しう る核酸リガンドが同定される。これは核酸研究の分野で前例のない見事な成果で ある。これらの特性はもちろん当業者が療法用または診断用リガンドにおいて追 求する望ましい特性である。 薬剤として用いるのに望ましい核酸リガンドを得るために、核酸リガンドは好 ましくは（１）ターゲットに対し目的とする効果を達成しうる様式でターゲット に結合し；（２）目的効果を得るために可能な限り小さく；（３）可能な限り安 定であり；かつ（４）選択したターゲットに対し特異的リガンドである。大部分 の場合、核酸リガンドはターゲットに対し可能な限り最高の親和性をもつことが 好ましい。さらに、核酸リガンドは促進性をもつことができる。 同一出願人による米国特許出願第07/964,624号、１９９２年１０月２１日出願 （‘６２４）（現在は米国特許第5,496,938号）には、ＳＥＬＥＸによって改良 された核酸リガンドを得る方法が記載されている。HIV-RT及びHIV-1 Revに対す る核酸リガンドと題するこの‘６２４出願を本明細書に援用する。 ＳＥＬＥＸ法は、ランダム２’−アミノピリミジンＲＮＡライブラリーからＶ ＥＧＦに対する一群の高親和性ＲＮＡリガンドを同定し、ランダムｓｓＤＮＡラ イブラリーからｓｓＤＮＡリガンドを同定するために用いられた（米国特許出願 第０８／２３３，０１２号、１９９４年４月２５日出願、表題：血管内皮増殖因 子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌタレオチドの一部継続出願である、米 国特許出願第０８／４４７，１６９号、１９９５年５月１９日出願、表題：血管 内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド 参照；これら両者を本明細書に援用する；Ｇｒｅｅｎら（１９９５）Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：６８３−６９５も参照）。 ＶＥＧＦ核酸リガンド（１またはそれ以上）がターゲティング能に作用しうる 態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドには、ＶＥＧＦ核酸リガンドがそのターゲ ットに結合しうるために保持しなければならない三次元構造がある。脂質構築体 が複合体を含み、この複合体のＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体の表面から突 出している態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、そのターゲット結合能が損 なわれないように脂質構築体の表面に対し適正に配向しなければならない。これ は、ＶＥＧＦ核酸リガンドをＶＥＧＦ核酸リガンドの結合用部分から離れた位置 で付着させることにより達成できる。この三次元構造および適正な配向は、前掲 のリンカーまたはスペーサーを用いることによっても保持できる。 複合体によりターゲティングする送達のために、多様な療法薬または診断薬の いずれも複合体に結合させることができる。さらに、脂質構築体によりターゲテ ィングする送達のために、多様な療法薬または診断薬のいずれも前記の脂質構築 体に結合させ、封入し、または取り込ませることができる。 複合体がたとえばリポソームに会合した親油性化合物およびＶＥＧＦ核酸リガ ンドからなる態様において、ＶＥＧＦ核酸リガンドは、抗腫瘍薬（たとえばダウ ノルビシン）または造影剤（たとえば放射性標識）の送達のために、ＶＥＧＦを 発現している腫瘍細胞（たとえばカポジ肉腫）をターゲティングすることができ る。腫瘍の周囲の細胞や組織もＶＥＧＦを発現する可能性があり、これらの細胞 をターゲティングした抗腫瘍薬送達も有効であることを留意すべきである。 別態様において、ターゲット細胞へ送達すべき療法薬または診断薬が他の核酸 リガンドであってもよい。 本発明によればさらに、送達すべき薬剤（たとえばプロドラッグ、受容体アン タゴニスト、または治療もしくは造影のための放射性物質）をリポソームの外面 と結合するように複合体に取り込ませることができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと 同様に、これらの薬剤を共有結合または非共有結合による相互作用により結合さ せることができる。リポソームによりこれらの薬剤を細胞外からターゲティング 送達し、その際リポソームはリンカーとして作用する。 他の態様では、非免疫原性高分子量化合物（たとえばＰＥＧ）をリポソームに 結合させて、複合体の薬物動熊特性を改良することができる。ＶＥＧＦ核酸リガ ンドをリポソーム膜に結合させるか、または非免疫原性高分子量化合物に結合さ せ、これを膜に結合させてもよい。この方法で複合体を血液タンパク質から遮蔽 し、こうしてＶＥＧＦ核酸リガンドがなおそのターゲットと接触して結合するの に十分な程度に露出した状態で、長期間循環させることができる。 本発明の他の態様では、２以上のＶＥＧＦ核酸リガンドを同一リポソームの表 面に結合させる。これにより同じＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができ、 これを利用してＶＥＧＦ分子間に特異的相互作用を生じさせることができる。 本発明の別態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび異なるターゲットに対する 核酸リガンドを同一リポソームの表面に結合させる。これによりＶＥＧＦを異な るターゲットに接近させることができ、これを利用してＶＥＧＦと他のターゲッ ト間に特異的相互作用を生じさせることができる。ターゲットを接近させる方法 としてリポソームを用いるほか、相互作用の強度を高めるためにリポソームに薬 剤を封入できる。 複合体を含む脂質構築体は、ＶＥＧＦに多くの結合相互作用をもたらすことが できる。これはもちろん複合体当たりのＶＥＧＦ数、および脂質構築体当たりの 複合体数、ならびにそれぞれの膜中でのＶＥＧＦ核酸リガンドおよび受容体の移 動度に依存する。有効結合定数は各部位についての結合定数の積と共に増大する ので、多数の結合相互作用があることは実質的に有利である。すなわち、多数の ＶＥＧＦ核酸リガンドを脂質構築体に結合させることにより、したがって多価を 形成することにより、ターゲットに対する多重複合体の有効親和性（すなわちア ビディティー）は、各部位についての結合定数の積と共に良好になるであろう。 本発明の特定の態様において、本発明の複合体はグリセロール脂質などの親油 性化合物に結合したＶＥＧＦ核酸リガンドからなる。この場合、複合体の薬物動 態特性は、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して改良されるであろう。前記に述 べたように、グリセロール脂質、リン脂質またはグリセロールアミド脂質を、Ｖ ＥＧＦ核酸リガンド上の多数の位置でＶＥＧＦ核酸リガンドに共有結合させるこ とができる。グリセロール脂質を用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドをホス ホジエステル結合により脂質に結合させることが好ましい。 本発明の他の態様では、脂質構築体がＶＥＧＦ核酸リガンドまたは複合体を含 む。この態様において、グリセロ脂質は他の親油性化合物と結合する傾向をもつ ため、グリセロ脂質がリポソームへのＶＥＧＦ核酸リガンドの取込みを補助する ことができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドと結合したグリセロ脂質を、配合物に含有 させることにより、または予め形成したリポソームに装填することにより、リポ ソームの脂質二重層に取り込ませることができる。グリセロ脂質は、ＶＥＧＦ核 酸リガンドがリポソームの内または外へ突出する様式で、リポソームの膜と結合 することができる。ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソームの外へ突出する態様では 、ＶＥＧＦ核酸リガンドはターゲティング能に作用することができる。脂質構築 体の薬物動態特性をさらに改良するために他の化合物を脂質構築体と結合させう ることを理解すべきである。たとえばＰＥＧを脂質構築体の膜の外側に面した部 分に結合させてもよい。 他の態様において、本発明の複合体は非免疫原性高分子量化合物、たとえばポ リアルキレングリコールまたはＰＥＧに共有結合したＶＥＧＦ核酸リガンドから なる。この態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンド単独と比較して複合体の薬物動態特 性が改良される。ポリアルキレングリコールまたはＰＥＧをＶＥＧＦ核酸リガン ド上の種々の位置に共有結合させることができる。ポリアルキレングリコールま たはＰＥＧを用いる態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドを５’ヒドロキシル基によ りホスホジエステル結合を介して結合させることが好ましい。 特定の態様では、多数の核酸リガンドを単一の非免疫原性高分子量化合物、た とえばポリアルキレングリコールもしくはＰＥＧ、または親油性化合物、たとえ ばグリセロ脂質に結合させることができる。核酸リガンドはすべてがＶＥＧＦに 対するものであってもよく、ＶＥＧＦと他のターゲットに対するものであっても よい。多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがある態様では、ＶＥＧＦとの多重結合相互 作用のためアビディティーが増大する。さらに他の態様では、多数のポリアルキ レングリコール、ＰＥＧ、グリセロール脂質分子を互いに結合させることができ る。これらの態様では、１またはそれ以上のＶＥＧＦ核酸リガンドまたはＶＥＧ Ｆおよび他のターゲットに対する核酸リガンドを、ポリアルキレングリコール、 ＰＥＧ、グリセロール脂質それぞれに結合させることができる。これにより、同 様にターゲットに対するそれぞれの核酸リガンドのアビディティーが増大する。 多数のＶＥＧＦ核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまたはグリセ ロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦ間に特異的相互作用を生じさせるため に、ＶＥＧＦ分子を互いに接近させることができる。ＶＥＧＦおよび異なるター ゲットに特異的な多数の核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥＧまた はグリセロール脂質に結合した態様では、ＶＥＧＦおよび他のターゲット間に特 異的相互作用を生じさせるために、ＶＥＧＦおよび他のターゲットを互いに接近 させることができる。さらに、ＶＥＧＦに対する核酸リガンドまたはＶＥＧＦお よび異なるターゲットに対する核酸リガンドがポリアルキレングリコール、ＰＥ Ｇまたはグリセロール脂質に結合した態様では、薬物をポリアルキレングリコー ル、ＰＥＧまたはグリセロール脂質と結合させることもできる。したがって複合 体はその薬物をターゲティング送達し、その際ポリアルキレングリコール、ＰＥ Ｇまたはグリセロール脂質はリンカーとして作用する。 ＶＥＧＦ核酸リガンドはＶＥＧＦを選択的に結合する。したがってＶＥＧＦ核 酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体 、またはＶＥＧＦ核酸リガンドもしくはその複合体を含む脂質構築体は、医薬ま たは診断薬として有用である。したがって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよ び非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体、あるいはＶＥ ＧＦ核酸リガンドを含むか、またはＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分 子量化合物もしくは親油性化合物を含む複合体を含む脂質構築体を投与すること により、血管形成を阻止する方法を包含する。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含む複合 体および脂質構築体を用いて、不適性なＶＥＧＦ産生を伴ういずれかの疾病状態 、特に血管形成を、治療、阻止、予防または診断できる。血管形成は月経周期お よび創傷治癒以外には、健康な成人で起きるのは稀である。しかし癌、糖尿病性 網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチ（これらに限定されない）を含 めた種々の疾病状態では、血管形成は主な特徴である。したがって本発明は、糖 尿病性網膜症、黄斑変性、乾癬および慢性関節リウマチを、治療、阻止、予防ま たは診断する方法をも包含する（これらに限定されない）。さらに、ＶＥＧＦは 実 質的にすべての腫瘍細胞により種々の量で産生および分泌される。したがって本 発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは親油性 化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一部ではな いＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することにより、癌 を治療、阻止、予防または診断する方法を包含する。癌の１タイプであるカポジ 肉腫（ＫＳ）では、細胞が多量のＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能性ＶＥＧ Ｆ受容体をも発現し、したがってＶＥＧＦをオートクリン増殖に利用する。した がって本発明は、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしく は親油性化合物を含む複合体、この複合体を含む脂質構築体、または複合体の一 部ではないＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものを投与することに より、カポジ肉腫を阻止する方法を包含する。 本発明の１態様において、脂質構築体はＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原 性高分子量化合物もしくは親油性化合物からなる複合体を含み、さらに脂質構築 体に封入された、または脂質構築体の内側と結合した診断薬もしくは療法薬を含 む。好ましい態様において脂質構築体は脂質二重層小胞、より好ましくはリポソ ームである。療法用としてのリポソームの使用には、遊離の形では普通は有毒で ある薬物の送達が含まれる。リポソームの形で有毒薬物を密閉し、その薬物に対 し感受性の組織からそれて、選択した領域へターゲティングすることができる。 リポソームは長期間にわたって薬物を放出させるために療法に使用することもで き、これにより投与回数を減らすことができる。さらにリポソームは、普通は静 脈内送達に適さない疎水性または両親媒性薬物の水性分散液の調製方法を提供で きる。 多くの薬物および造影剤は、療法能または診断能をもつためには体内の適正な 位置へ送達されることが必要である。したがって、リポソームは容易に注入でき 、特定の細胞タイプまたは身体部分へ持続放出および薬物送達するための基礎と なりうる。封入された薬物を、感受性組織からそれて宿主の特定の組織へターゲ ティングさせるためにリポソームを使用するには、幾つかの方法を採用できる。 これらの方法には、リポソームのサイズ、それらの正味表面電荷、およびそれら の投与経路を操作することが含まれる。ＭＬＶは、主として比較的大型であると い う理由で、通常は細網内皮系（原則として肝臓および脾臓）によって速やかに取 込まれる。これに対しＵＶは、ＭＬＶと比べて長い循環時間、低いクリアランス 速度、および広い生体内分布を示すことが認められた。 リポソームの受動送達には、種々の投与経路、たとえば静脈内、皮下、筋肉内 および局所を用いることができる。各投与経路により、リポソーム局在性の違い が生じる。選択したターゲット領域へリポソームを能動的に向けるために用いる ２つの一般的方法は、リポソームの表面に抗体または特異的受容体リガンドを付 着させるものである。本発明の１態様では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがリポソーム の外面に結合し、ターゲティング能に作用する。当業者に自明のとおり、リポソ ームの表面に抗体または特異的受容体リガンドなど、追加のターゲティング成分 を含有させてもよい。さらに、抗体を用いずに腫瘍にリポソームをターゲティン グさせる幾つかの試みが成功した。たとえば米国特許第５，０１９，３６９号、 第５，４３５，９８９号、および第５，４４１，７４５号参照。これらの代替タ ーゲティング法を採用するのは当業者に自明であろう。 ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分予量化合物もしくは親油性化合物 を含む複合体、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物もしくは 親油性化合物からなる複合体を含む脂質構築体、ならびに複合体の一部ではない ＶＥＧＦ核酸リガンドが脂質構築体と会合したものの、療法用または診断用組成 物を注射により非経口的に投与できる。ただし他の効果的な投与形態、たとえば 関節内注射、吸入ミスト、経口用配合物、経皮イオン導入または坐剤も想定され る。好ましいキャリヤーのひとつは、生理的食塩水であるが、薬剤学的に許容し うる他のキャリヤーの使用も考慮できる。１態様では、キャリヤーおよびＶＥＧ Ｆ核酸リガンド複合体が生理学的に適合する徐放性配合物を構成することが想定 される。このようなキャリヤー中の主な溶剤は、水性でも非水性でもよい。さら にキャリヤーは、配合物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、透明度、色、無菌性 、安定性、溶解速度、または臭気を変更または維持するための、薬理学的に許容 しうる他の賦形剤を含有してもよい。キャリヤーは、ＶＥＧＦ核酸リガンドの安 定性、溶解、放出または吸収の速度を変更または維持するために、さらに他の薬 理学的に許容しうる賦形剤を含有してもよい。このような賦形剤は、１回量形ま た は多数回量形の非経口投与用剤形を製造するのに普通に慣用されている物質であ る。 療法用および診断用組成物を配合した後、それを無菌バイアルに液剤、懸濁液 剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、または脱水もしくは凍結乾燥した散剤として保存で きる。このような配合物は、そのまま使用する形または投与直前に再構成する必 要のある形で保存できる。ＶＥＧＦ核酸リガンドを含有する配合物を全身送達の ために投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、または膣もしくは直腸坐 剤による。 本発明の複合体および脂質構築体の利点には、下記のものが含まれる：ｉ）血 漿中での核酸リガンドの薬物動態が改良される；ｉｉ）核酸リガンドを、それら のターゲットとの相互作用のアビディティーを高めるために多価アレイで提示で きる；ｉｉｉ）異なる特異性をもつ提示核酸リガンド２以上を、同一リポソーム 粒子に組み合わせることができる；ｉｖ）リポソーム固有の腫瘍ターゲティング 特性を利用して、腫瘍への提示核酸リガンドの送達を高めることができる；およ びｖ）リポソーム内容物を特定のターゲットへ導くために、抗体のものに匹敵す る提示核酸リガンドの親和性と特異性を利用できる。大部分のタンパク質と異な り、熱、種々の分子変性剤および有機溶剤による提示核酸リガンドの変性は易可 逆性であるので、提示核酸リガンドは本明細書に記載する種類の製剤に好適であ る。 以下の実施例は本発明を説明し、具体的に示すために記載したものであり、本 発明を限定するものとみなすべきではない。以下の実施例に記載した核酸リガン ドの構造を図１に示す。実施例１には、核酸リガンドと脂質試薬の結合を記載す る。ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ２７８）−遊離リガンドとして、またはリポソ ームの二重層に取り込まれたもの（ＮＸ２７８−Ｌ）−のジアルキルグリセロー ル誘導体がインビトロおよびインビボでＶＥＧＦの活性を阻害する効力を、実施 例２に記載する。実施例３には、ＶＥＧＦに対する２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮ Ａリガンドを調製するための実験法を記載する。実施例４には、ＶＥＧＦに対す る２’−Ｆピリミジン修飾ＲＮＡリガンドを記載する。実施例５には、グリセロ 脂質、リン脂質、およびグリセロールアミド脂質、ならびにＰＥＧ修飾した ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成を記載する。実施例６には、リン脂質（ＰＬ）およ びＰＥＧ修飾したＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態特性を記載する。実施例７に はＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製、実施例８〜１０にはＶＥＧＦ 核酸リガンド複合体のインビボ有効性を記載する。実施例１１には、ウサギにお けるＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの硝子体内薬物動態を記載する。実施例１ ．ジアルキルグリセロール（1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロール ）修飾VEGF核酸リガンドの合成 本実施例においては、核酸リガンドと脂質試薬とのコンジュゲートを記載する 。 （1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロール）修飾VEGF核酸リガンドの合成を以 下に示す。 スキーム１ テトラエチレングリコールモノトシル酸（2a）：テトラエチレングリコール(2 00mL,1.15mol)を500mLのピリジンに溶解し、0℃に冷却し、22.0g(0.115mol)の塩 化p-トルエンスルホン酸にて処理した。溶解が完結した後、反応混合液を冷却装 置内に一晩保存し、その後、減圧下で濃縮した。残渣を800mLのEtOAcに溶解し、 ３x600mLのH2Oにて抽出した。H2O画分をEtOAcにて戻し抽出し、合わせたEtOAc画 分を飽和Na2HPO4水溶液にて抽出した。有機層 をMgSO4上で乾燥させ、無色の油になるまで濃縮した。800mLのシリカゲルを用い 、ヘキサン、25％ EtOAc-50％ EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％ MeOH-20％ MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにてその油を精製 し、純粋な生成物を23.7g（60％）、および少量の不純物を含む生成物を11％得 た。2a： テトラエチレングリコールモノフタルイミド（3a）：攪拌した31.96g（0.092m ol）の2aの400mL無水DMF溶液に、14.2g（1.05当量）のフタルイミドおよび14.4m L（1.05当量）の1,8-ジアザビシクロ［5.4.0］ウンデク-7-エンを加えた。溶液 を70℃にて18時間熱し、その後減圧下で濃縮した。1600mLのシリカゲルを用い、 25％ EtOAc-50％ EtOAc-75％ EtOAcのヘキサン溶液、その後EtOAc、その後10％ MeOH-20％ MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラッシュカラムにて粗黄色油を精 製し、23.8g（80％）の3aを油として得た。静置するとすぐに、3aは蝋状白色固 体になった。 化合物4aの合成:15g(0.0464mol)の3aの150mL THFおよび15mL DMF溶液を、Ar下 0℃に冷却した。臭化アリル（6.0mL、1.5当量）を溶液に加え、1.76g（1.5当量 ）のNaHを固体として加えた。不透明な黄色の懸濁液を０℃にて30分間、その後 室温で18時間攪拌した。MeOH（50-100mL）を加え濃縮し、その後混合液を減圧下 で濃縮した。1500mLのシリカゲルを用い、25％ EtOAc-50％ EtOAc-75％ EtOAcの へキサン溶液、その後EtOAc、その後10％ MeOHのEtOAc溶液にて溶出する、フラ ッシュカラムにて粗物質を精製し、11.05g（65％）の4aを黄色油として得た。 1-ジメトキシトリチル-3-(フタルイミドテトラエチレングリコール)-sn-グリ セロール（9）：スキーム１に従い、化合物９を以下のように合成した。すなわ ち、攪拌した4a（10.13g、0.0279mol）の100mLアセトンおよび１mLH2O溶液に、3 .98g（1.22当量）のN-メチルモルフォリン-N-オキシドを加えた。この懸濁液に 、1.75mL（0.005当量）の四酸化オスミウムを2.5％のiPrOH溶液として加えた。O sO4溶液の添加後、反応混合液は透明な黄色になった。4aの完全な変換（約16時 間）を示すTLC解析の後、反応混合液を1.5gのヒドロ亜硫酸ナトリウムおよび5.0 gのflorisilにて処理し、30分間攪拌した。懸濁液をklorisilにて濾過し、濾液 を油にまで濃縮した。1.0gの4aから同様にして調製した別の群とこの粗生成物を 合わせた。100mLピリジン部分２つを、合わせたロットから共蒸発させ、残渣を3 00mLピリジンに溶解した。溶液を0℃に冷却し、10.89g（1.05当量）の塩化4,4'- ジメトキシトリチルを加えた。乾燥管をフラスコ内に挿入し、反応混合液を室温 で16時間攪拌した。溶液を20mLのMeOHにて処理し、減圧下、水浴の温度を40℃以 下に保ちながら、濃縮した。1100mLのシリカゲル（3％トリエチルアミンのヘキ サン溶液を用いてカラムに湿装填した）を用い、10-100％ EtOAcのヘキサン溶液 （すべて3％トリエチルアミンを含む）にて溶出する、フラッシュカラムにて粗 油を精製し、21.3g（2工程後、89％）の９を黄色油として得た。 1-ジメトキシトリチル-3-(アミノテトラエチレングリコール)-sn-グリセロー ル（10）：スキーム１に従い、化合物10を以下のように合成した。すなわち、化 合物９（5.2ｇ、7.2mol）を50mLの40％メチルアミンのH2O溶液に溶解し、10mLの メタノールを加えて出発物質を可溶化した。反応溶液を50℃にて５時間熱し、そ の後、減圧下で濃縮しトルエンと共蒸発させた。200mLのシリカゲルを用い、15 ％メタノールアンモニアのジクロロメタン溶液にて溶出する、フラッシュカラム にて粗物質を精製した。3.94g（96％）の10を薄い黄色の油として回収した。 スキーム２ クロロホルム酸19：攪拌した３g（5.03mmol）の1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グ リセロール18の60mLトルエン溶液に、200mLの1.93Mホスゲン溶液を加えた。さら にホスゲン溶液（2×10mL；計15.4当量のホスゲン）を、アル コール出発物質が残らなくなるまで（濃縮した分注物の1H NMR解析による）加え た。過剰のホスゲンおよびHClをアスピレーターによって除き、反応混合液を減 圧下濃縮し、目的とするクロロホルム酸19を白色粉末として3.3g(98％)得た。 コンジュゲート20：攪拌した2.25g（3.95mmol）の10の60mLピリジン溶液に、2 .6gのジステアリルグリセロールクロロホルム酸18を加えた。２時間後の濃縮し た分注物の1H NMR解析により、残っているクロロホルム酸がないことが明らかに なり、混合液を減圧下濃縮した。0.5g（0.88mmol）の10および0.58gのクロロホ ルム酸から同様に調製した物質と粗残渣を合わせ、200mLヘキサン、その後、250 mLのそれぞれ10-20および30％ EtOAcのヘキサン溶液、500mL40％ EtOAcのヘキサ ン溶液、その後、それぞれ50-60-70および80％ＥｔＯＡｃのへキサン溶液、最後 に250mLのEtOAcにて溶出する、100mLのシリカゲル上のフラッシュシリカゲルカ ラム（2％トリエチルアミンを含むヘキサン中に装填した）にて、合わせたロッ トを精製した。生成物を含む画分を濃縮し、3.3g（57％）のコンジュゲート20を 得た。 ホスホロアミダイト21：攪拌した3.8g（3.26mmol）のコンジュゲートの25mL C H2Cl2溶液に、1.14mL（6.52mmol）のジイソプロピルエチルアミンエテン、その 後1.09mL（4.88mmol）の2-シアノエチルN,N-ジイロプロピルクロロ-ホスホロア ミダイトを加えた。２時間後、混合液をCH2Cl2にて希釈し、飽和NaHCO3溶液にて 洗い、Na2SO4上で乾燥させ、濃縮した。100mLヘキサン、その後、250mLのそれぞ れ10および20％EtOAcのヘキサン溶液、500mL30％EtOAcのヘキサン溶液、その後 、250mLの50％ EtOAcのヘキサン溶液にて溶出する、125mLのシリカゲル上のフラ ッシュシリカゲルカラム（2％トリエチルアミンを含むへキサン中に装填した） にて、粗残渣を精製した。生成物を含む 画分を濃縮して4.2g（95％）のホスホロアミダイト21を得た。 VEGF核酸リガンド-1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセロコンジュゲート ホスホロアミダイト21（スキーム2）を用い、1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリ セロ基をVEGF核酸リガンドNX213（図1A参照）とコンジュゲートさせた。 得られたコンジュゲートをNX278（配列番号：２）（図1B）と名付けた。NX278を 逆相HPLCにより精製し、その組成を電子スプレー質量分析器にて確認した（観測 されたm/s=11703±4、算出したm/z=11720）。ホスホロチオエートヌクレオシド 間結合をNX278内の８つの位置（3'および5'末端）に用いたが、予想質量と観測 質量間の16質量単位の違いは、おそらく平均で１分子あたり予想よりも１つ少な いホスホロチオエート結合をもたらす硫化剤による、不完全な酸化のためである 。実施例２. 核酸リガンド-リポソーム複合体のin vitroおよびin vivoにおける効 力。リポソーム二重層内に埋め込まれたジアルキルグリセロール（DAG）修飾VEG F核酸リガンド（NX278） NX-278（１mg）（図1B;配列番号：2）を、噴霧乾燥したDSPC:コレステロール （50mg/ml;2:1、Mol:Mol）の混合物と、9％ショ糖を含む25mMリン酸（pH7.4）緩 衝液中でインキュベートし、プローブ型音波処理器を用いておよそ60度Cで、乳 光色の溶液が得られるまで15-30分間音波処理することにより、NX278-リポソー ム複合体を調製した。リガンドNX278の配列を乱雑化した(scrambled)類似体（sc NX278）（図1C;配列番号：3）を含む、対照核酸リガンド-リポソーム複合体を同 様にして調製した。典型的な調製物において、平均直径が50nmで1/2高における 分布幅が20nmであるリポソームが得られた。 リポソーム粒子のサイズは、粒子解析装置(Leeds & Northrup Model Microtrack UPA 150、Horsham、PA)で求めた。比較可能なサイズ分布のリポソームを、同じ 脂質組成だが脂質コンジュゲートした核酸リガンドなしで得た。50nmのリポソー ムは、二重層の両側に提示された平均40の核酸リガンドを含むと期待される。計 算は以下のように行った。コレステロールに対して19Å、ジステアリルホスファ チジルコリンに対しては60Åと、リポソーム内の表面積を仮定す ると、外径50nmで膜厚20Åの球状のリポソームに関してリポソームあたり3.13x1 04という多数の脂質分子を得た。リポソームの組成物（2:1mol:molジステアリル ホスファチジルコリン（ＭＷ=790.2）:コレステロール（ＭＷ=386.7））から、 脂質の均一な分布を仮定すると、リポソームの分子量2.1x107が計算された。 リポソームの内側と外側表面間の核酸リガンドの分配を決定するために、リポ ソーム製剤内のNX278の、T1リボヌクレアーゼに対する接近しやすさを調べた。 配列内の２つのリボグアノシン(Green et al.(19950 Chemistry and Biology 2: 683-695)で、NX278はリボヌクレアーゼT1により効率よく切断される。NX278を予 め形成したリポソームで単にインキュベートすると、リボヌクレアーゼT1から核 酸リガンドを保護しない。しかし、NX278が音波処理によりリポソーム内に取り 込まれている場合は（NX278-リポソーム）、約1/3がヌクレアーゼから保護され る。ヌクレアーゼの活性に影響することなくリポソームを阻害する0.1％ Triton X-100をNX278-リポソームに加えると、それまで保護されていた核酸リガンドが 切断にさらされる。これらの結果は、核酸リガンドが二重層の両側に分布してい るという概念と一致する。 NX213 、NX278、およびNX278-リポソームの、VEGFに対する結合親和性 NX213、NX278、およびNX278-リポソームの、VEGFに対する結合親和性を、競合 電気泳動移動度シフト法(図2)を用いて調べた。VEGFに対するNX278の結合親和性 はNX213のものと同等であった。NX278-リポソームの見かけの結合親和性は、NX2 78と比較して３倍低かった。観察された親和性減少の一部は、核酸リガンド画分 のリポソーム内部への限局のためであるかもしれない。予想したように、配列を 乱雑化した類似体はVEGFに十分低い親和性で結合する（図2）。 NX213 、NX278、およびNX278-リポソームの血漿薬物動態学的特性 時間の関数としてのSprague Dawleyラットの血漿内のNX213、NX278、およびNX 278-リポソームの濃度を図15に示し、コンパートメント解析のパラメーターを表 １に要約する。NX213の大部分は、t1/2が７分かつ全体的なクリアラ ンス速度が6.8ml/kg/minで、α相において急速に除去される。核酸リガンドにリ ン脂質をコンジュゲートさせると、NX213と比較して増加したβ(t1/2)かつ幾分 遅い全体的なクリアランス速度（4.95ml/kg/min）で血中から極めて二相性なク リアランスという結果になる。NX278のリポソーム内への取り込みは、核酸リガ ンドの血漿からのクリアランスが実質的にさらに減少することを示す（1.88mg/k g/min）。 HUVEC 増殖および血管新生に対するNX278の効果 ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）の増殖に対する、NX278-リポソーム、scN X278-リポソームおよびNX213の効果を調べた。HUVECをVEGF（10ng/ml）存在下、 10％胎児ウシ血清（FCS）およびヘパリン（45μg/ml）を含むIMDM:Ham's F12(1: 1)培地中で培養した。細胞を24穴ゼラチンコートした24穴プレートに１穴あたり 20,000細胞の密度で０日目にまき、0.1nMから１μMのあいだの濃度の上記リガン ドで、１、２、および３日目に処理した(リガンドを加えた培地と置き換える)。 NX278-リポソームはHUVECの増殖を〜300nMのIC50(核酸リガンド成分の濃度)で阻 害し;scNX278-リポソームおよびNX213は有意に低い効果（IC50>1:μM）であった 。 VEGFはトリ尿膜（CAM）アッセイにおいて血管新生を誘導し、このアッセイは 血管新生を阻害する化合物を研究するのに用い得る。VEGFに浸したフィルターデ ィスクをCAM上に置くことによりアッセイを行い、新血管の発生を定量化し得る 。NX278-リポソームはVEGFが誘導する血管新生を効果的に阻害した（データは示 さず）が、一方、NX213、NX278およびscNX278-リポソームは効果がなかった。こ れらの研究はともに、NX278がin vitroにおけるVEGFが誘導する内皮細胞の増殖 およびin vivoにおける新血管形成の特異的阻害剤であることを証明する。 VEGF が誘導する毛細血管透過性に対するNX278の効果 VEGFは、毛細血管の透過性を一過性に増強する既知の唯一の血管新生因子であ る。NX278-リポソームの、in vivoにおけるVEGFの血管透過性活性を阻 害する能力を調べた。血管透過性アッセイ（Milesアッセイ（Miles,A．A．and M iles,E．M．(1952)J.Physiol.(London)118:228）として知られている）を、本来 記載されているように(Senger,R.S.et al.,(1983)Science 219:983）モルモット において行った。１μMの濃度のNX278-リポソーム、NX278、およびNX213をVEGF （20nM）とともに、あらかじめエバンスブルー色素を注入しておいたモルモット の皮内に注入した。VEGFに応答して、血管透過性の上昇のためにアルブミンに結 合したエバンスブルー色素が管外溢出し、注入部位に青い斑点を生じる結果とな る。有機溶媒抽出による色素回収率は一般的に非常に低いため、皮膚を透過する 光の吸収を測定する定量方法が開発された。NX213、NX278、NX278-リポソームお よびVEGFに対する中和モノクローナル抗体は、図３に示すようにVEGFが誘導する 透過性をすべて有意に阻害した。核酸リガンドの中で、NX278-リポソームはもっ とも強力なアンタゴニストであるとみられた。これらの化合物の配列を乱雑化し た類似体は阻害性ではなかった。この違いは目視観察で劇的かつ顕著であった。 NX278-L はin vitroにおいてカポジ肉腫細胞株を阻害する VEGFの阻害剤は、腫瘍の進行および転移が新血管形成に依存する悪性腫瘍を含 め、様々な疾患において有益である可能性がある。ほとんどの種類の腫瘍はVEGF を産生すると知られているが、機能するVEGF受容体を発現していることが示され たものはこれまでにーつもない。最近、カポジ肉腫（KS）細胞が大量のVEGFを産 生するのみならず、機能するVEGF受容体をも発現しており、それゆえVEGFを自己 分泌性(autocrine)増殖に用いていることが示された。したがって、KS細胞株はN X278の、自己分泌性VEGF増殖活性を阻害する能力を調べる唯一の機会を提供する 。 KS細胞の増殖に対するNX278-リポソーム、scNX278リポソームおよびNX213の効 果を調べた。KS細胞株KSY-1を、セラチンコートした24穴プレートに１穴あたり7 ,500-10,000細胞の密度で、2％ FCS、L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプ トマイシンを補ったRPMI 1640を含む培地中、０日目にまいた。核酸リガンドを １、２、および３日目に新鮮な培地中に0.1nMから１μMのあいだの濃度で加え、 細胞計数を４日目に行った。NX278-リポソームはKS 細胞の増殖を100nMのIC50で阻害し、１μMのNX278-リポソームではこれらの細胞 の増殖は完全に阻害された。scNX278-リポソームおよびNX213は>１μMのIC50値 を示した（図4）。 NX278- リポソームはin vivoにおいてKS細胞の増殖を阻害する VEGFはKS細胞の増殖因子であるため、in vivoにおけるKS腫瘍に対するVEGFアン タゴニストの効果は２倍、すなわち腫瘍とともにいる内皮細胞に対するVEGFの傍 分泌性(paracrine)増殖効果の阻害および腫瘍細胞に対する自己分泌性増殖効果 の阻害であるとみられる。KS細胞はしたがって、VEGFアンタゴニストに対して特 に感受性であり得る。核酸リガンドのin vivoにおける活性を試すために、腫瘍 トロカール（3mm3）を無胸腺のマウスに１日目に移植し、２日目から開始して50 、100または150μg/日/マウスで５日続けて処理した。腫瘍増殖の速度を２週間 ごとに測定した。NX278-リポソームは用量依存的に、50μg/日/マウス用量とい うもっとも低い投与量で極めてわずかな腫瘍増殖阻害を示し（図5A）、100およ び150μg/日/マウス投与量の両方で腫瘍増殖阻害を示した(図5B、150μg/日/マ ウスを示す)。空のリポソーム(図5A、B)、scNX278-リポソームも、NX213およびN X278と同様に調べたすべての用量で無効果だった。加えて、NX278-リポソームは VEGFが誘導する血管からの液体漏出を阻害した。 実施例３．VEGFに対する2'-フルオロピリミジン修飾RNAリガンドに関する 実験手順 本実施例は、VEGFに対する2'-フルオロ修飾核酸リガンドの開発に関する実施例 ４に続き、援用されている一般的な手順を提供する。 材料 昆虫細胞株Sf21から精製した組み換えヒトVEGF165を、キャリアーのない凍結 乾燥粉末としてR & D Systemsより購入した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩 水に、10μMの濃度になるように再懸濁し、少量に分注して使用するまで-20℃に て保存した。分注物を融解後４週間まで４℃で保存した。Sf21発現させ たマウスVEGF164および大腸菌発現させたヒトVEGF121、VEGF/PIGFヘテロ二量体 、およびPIGFも、キャリアーのない凍結乾燥調製物としてR & D Systemより購入 した。 オリゴヌクレオチドはOperon Technologies，Inc.から購入したか、あるいはA pplied Biosystems Model 394オリゴヌクレオチド合成機を用い、最適化された プロトコールにしたがって合成した。2'-F-および2'-OMe-リボヌクレオチドホス ホロアミダイトはJBL Scientific,Inc.(San Luis Obispo，CA)により調製された 。2'-F-ピリミジンNTPもJBLから購入した。2'-OH-プリンNTPおよびdNTPはPharma cia Biotech,Piscataway,NJより購入した。 T ．aquaticus耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）をPerkin Elmer-Cet us、（Foster City，CA）から購入し；AMV逆転写酵素（AMV RT）をLifeScience, Inc.から；クレノーDNAポリメラーゼをNew England Biolabs,Beverly,MAより購 入した。T7RNAポリメラーゼをEnzyco,Inc.(Denver,CO)から購入した。sequenase DNAポリメラーゼはUnited States Biochemical Corp.(Cleveland,OH)により生 産されたものである。 α-［32P］-ATPおよびγ-［32P］-ATPはNew England Nuclear(Boston,MA)より 得た。 SELEXプロトコール SELEX手順はSELEX特許出願に詳細に記載されている。化学的に合成したDNAオ リゴヌクレオチドライブラリー（"30N7"および"40N7"）を、共通の5'および3'固 定配列（5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG(30または40N)CAGACGACTCGCCCGA -3';配列番号：１３３及び１３４）が両側に接している、30または40ヌクレオチ ドの無作為化した領域により調製した。各鋳型の5'末端のイタリック体にしてあ るヌクレオチドはT7 RNAポリメラーゼプロモーター配列と一致する。鋳型の調製 と増幅、および逆転写において使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーも 合成した。すなわち、5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'(“3N7”；配列番号：１３５)お よび5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3'(“5N7”；配列番号：１３６)。 プライマー3N7を30N7または40N7ライブラリーにアニールさせ、クレ ノーDNAポリメラーゼまたはAMV RTを用いてプライマーを伸長させることにより 、二本鎖DNA鋳型を調製した。AMV RTに用いたより高いインキュベーション温度 （37℃よりもむしろ45℃）は、高次構造をとった鋳型オリゴヌクレオチドにもか かわらず完全な伸長をより促進し得る。T7 RNAポリメラーゼを、各１mM 2'-OH-A TPおよびGTP、各３mM 2'-F-CTPおよびUTP、および50μCi α-32P-ATPの存在下用 いてライブラリーを転写した。RNAを含むゲルスライスを切り出し、粉砕し、２m M EDTAに長時間浸すことにより、RNAを変性ポリアクリルアミドゲルから精製し た。 親和性選別し、その後選別したプールを増幅するというSELEXの過程は、詳細 に記載されている（SELEX特許出願参照）。簡潔に述べると、選別と増幅の一巡 を以下のように行った。すなわち、VEGFを5-または10-倍過剰のRNAと、１mM MgC l2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBSM）中で（30N7および40N7ライブラリー）あ るいはトリス緩衝生理食塩水、１mM MgCl2、１mM CaCl2（TBSMC）中で（30N7ラ イブラリーのみ）混合し、続いて混合物を３倍に希釈した。37℃にて15分間イン キュベーションした後、混合物を0.45μType HAフィルター（Millipore）に通し 、VEGFとRNAの複合体を回収した。2:1フェノール、pH７：７M尿素中でインキュ ベートすることにより、選別したフィルターからRNAを溶出した。水層から精製 した後、RNAをプライマー3N7にアニールさせ、AMV RTを用いて逆転写した。3N7 および5N7プライマーおよびTaq DNAポリメラーゼを用いた15サイクルのポリメラ ーゼ連鎖反応（PCR）により、得られたcDNAを増幅した。PCR産物の転写により、 VEGFに親和性を有する配列に富んだ新しいライブラリーが得られた。４巡目に、 VEGF非存在下におけるかなりのバックグラウンドフィルター結合シグナルが、選 別した３つのうちのすべてのRNAプールに出現した。フィルターに結合したRNAの プールを除くため、５巡および６巡目は、非結合分子からVEGF結合RNAを分離す るための代替計画で行った。すなわち、RNAプールを増殖因子とインキュベート した後、各混合物を8％ポリアクリルアミド、非変性ゲルにのせ、10Wで45-60分 間、4℃にて電気泳動した。VEGF/RNA複合体はこの系において非結合のRNAよりも 上方に移動し、ゲルにＸ線フィルムを感光させることにより 可視化された。これらの巡目では、上に記載したように粉砕および浸漬法により 、選別したRNAを精製した。選別および増幅を12巡した後、選別したプール内の 個々の分子を、Stratagene(La Jolla，CA)のpCR-Script Direct Cloning kitを 用いてクローン化した。アルカリ溶解法（PERFECTprep Plasmid DNA kit,5Prime →3 Prime,Boulder,CO）を用いてプラスミドを精製し、Perkin Elmer(Foster Ci ty，CA)より入手可能なDye Terminator Cycle Sequencing kitを用いて、クロー ン化した領域の配列を得た。蛍光の配列を決定するラダーを国立ユダヤ人センタ ー、Brain Kotzin研究室、Denver、COにて読んだ。配列をファミリーに分類し、 目で整列させた。 結合親和性の測定 転写の際のα-32P-ラベルされたNTPの取り込みにより、あるいはγ-32P-ATPお よびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成した後に放射標識された核酸リガ ンドを、低濃度で様々な濃度のVEGFまたは他の増殖因子と、37℃にて15分間イン キュベートした。インキュベーションはTBS、PBS、またはHEPES緩衝生理食塩水 （HBS）、pH7.4中で、補足の二価の陽イオンを添加するか、あるいは添加せずに であった。あらかじめ洗っておいた0.45μm Type HAフィルター（Millipore）に 試料を通し、続いて結合バッファーにより5-10ml洗いを行った。フィルターをシ ンチラントに浸し、計数して各フィルターに保持されているタンパク結合RNAの 量を見積もった。特異的なタンパク質に結合している核酸リガンドの平衡解離定 数（KD）をGreen et al.(1996)Biochem．35;14413-14424に記載のデータ点から 算出した。 核酸リガンド断片の親和性選別 10pmolの内部放射標識された、高親和性VEGF核酸リガンドの転写産物を、S7ヌ クレアーゼにより部分的に切断し、放射標識された断片の混合物を作った。断片 化されたＲＮＡの1/10を、ニトロセルロースを通す濾過の前に、10pM VEGFと45m l結合バッファー中でインキュベートした。フィルターから回収された選別した 断片を、高分離能変性ポリアクリルアミドゲル上で無選別の断片のプー ルをのせたレーンの隣で泳動した。最小の選別したバンドをそれぞれゲルから精 製し、5'末端をポリヌクレオチドキナーゼでさらに標識して比活性を増加させた 。試料の1/2をもとの転写産物のcDNAとアニールさせ、Sequence DNAポリメラー ゼを用いて鋳型の末端まで伸長した。精製された断片およびその伸長産物の移動 度と標準の配列決定ラダーとの比較を用い、選別された断片のもっともらしいサ イズおよびもとの転写産物内における位置を決定した。親和性選別された断片と 配列上一致する合成オリゴヌクレオチドを調製し、端を一部切断した核酸リガン ドがVEGFに対する親和性を保持しているかどうか確かめた。 2'-OMe-置換 実質的にGreen et al.(1995)Chem.Biol.2:683-695に記載されているようにし て、2-OMe-置換実験を行った。５または６つの2'-OH-プリン位が部分的に2'-OMe -置換されている、３または４つのライブラリーを、端を一部切断したリガンド ３つ（t22、t2、t44）のそれぞれについて調製した。各プリン位はライブラリー のうちのただーつにおいて部分的に2'-OMe-修飾されていた。各5'-放射標識され たライブラリーをVEGFとインキュベートし、タンパク質と結合した置換オリゴヌ クレオチドをニトロセルロースフィルター上に回収した。選別したプールおよび 開始の無選別のライブラリーをアルカリによって部分的に加水分解し、生成物を 高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。選別したプール内のその位置にお ける加水分解から得られたホスホロイメジ（phosphorimage）シグナルを、無選 別のライブラリー内の同じ位置に関して得られたシグナルで除すことにより、“ バンド強度比”を各プリン位に対して決定した。特定の位置に対する範囲よりも 十分に下がったバンド強度比は、親和性選別したプール中の2'-ＯＨの（2'-OMe に対する）偏りを示す。 結合速度定数 少量（典型的には１pmolより少ない）の5'-放射標識された核酸リガンドを、 二価の陽イオンを補った１mlの緩衝生理食塩水中で、１nM VEGFと37℃にてイン キュベートした。時間“ゼロ”の時点で、50μlをニトロセルロースに通 して濾過し、タンパク質に結合したRNAの画分を決定し、その後、過剰（別々の 実験において100または500nM）の非標識核酸リガンドを加え、50μl分注物をそ の後の時点で濾過した。フィルターをシンチラント中で計数し、各時点でVEGFに 依然として結合している放射標識されたRNAの量を求めた。結合したRNAの画分（ f）対時間としてプロットしたデータを、指数減少に関する等式に当てはめた。 すなわち、 f(t)=fOe-kt＋b, 式中、fOは時間ゼロの時点で結合していたRNAの画分であり、kは解離速度定数（ kd）であり、bは実験の終わりの時点でのフィルターに対する、放射標識されたR NAの残留結合（事実上、タンパク質の非存在下）である。以下の等式： ka=kd/KD にしたがい、測定したkdおよびKD値から会合速度定数(kaS)を算出した。 実施例４．VEGFに対する2'-フルオロ-修飾RNAリガンド リガンドの選別 30または40の無作為なヌクレオチドを含む2'-F-ピリミジン修飾RNAのライブラ リーから、VEGFに対するリガンドを３つの独立したSELEX実験にて単離した。選 別は、１mM MgCl2を補ったPBS(30Nおよび40Nライブラリー)あるいは１mM MgCl2 および１mM CaCl2を含むトリス緩衝生理食塩水(30Nライブラリーのみ)中で行っ た。およそ1014の独特な配列を各実験の最初の選別サイクルに含めた。10サイク ル後、VEGFと各RNAプールの間の親和性は、開始プールと比較しておよそ1000倍 に改善された。さらに２サイクル後、結合親和性に関してさらなる改善が観察さ れたなかったため、12巡目のプールの個々の要素をクローン化し、各選別から約 50個の配列を決定した。 VEGF165に対するオリゴヌクレオチドリガンドを３つの独立なSELEX実験にて単 離した。個々のクローンを単離し、配列を決定し、共通な一次構造モチーフに基 づいて配列をファミリーに分類した（表2）。各リガンドの名前は、標的（V=VEG F）、選別バッファー（P=PBS；T=TBS）、ライブラリー内の無作為化した領域の 長さ（30または40ヌクレオチド）およびクローン番号（小数点 以下）を示す。ある配列が解析したクローン内に現れる頻度は括弧内に示し、た だ一ヌクレオチドだけ異なる配列は共通の前駆体のPCR突然変異のためであると し、適切な記号（Y=UまたはC）で配列内に示してある不定な塩基と一緒に分類し た。すべてのリガンドに共通な固定配列を、一番上のロアーケース内の文字で示 す。個々のクローンについて、可変領域の配列をアパーケース内に示す。いくつ かのリガンドに関しては、可能性として考えられる二次構造に寄与する、ロアー ケース内の固定領域配列を可変領域配列に追加してある。VEGFに対する結合の高 親和性Kdを各リガンドについて示す。各ファミリーのうちの一つのリガンドを、 さらなる解析のために選んだ（灰色の囲み）。 解析した合計143クローンのうち、１ヌクレオチド以上異なる76個の配列を得 た。これらの配列のうちの44個は、保存された一次構造モチーフに基づいた３つ の主要なファミリーに分類することができた（表2）。５またはそれ以下の要素 の少数ファミリーに分類し得る配列および単離したものの中で唯一であった“孤 児(orphan)”配列を表６に示す。ファミリー１および２により定義される一次構 造モチーフを含むリガンドは、３つの親和性選別のすべてにおいて現れた。両フ ァミリーの保存されている一次構造間の類似性は、それらが同様の二次構造をも 共有し得ること、およびｌまたはそれらが同様の接触領域を用いてVEGFを阻害し 得ることを示唆している。ファミリー２のメンバーは、大“ループ”内の保存さ れた配列モチーフを囲む、塩基対になった短い軸を形成する可能性を共通に有し ている（表２中の下線）。閉鎖したA/U塩基対を除き、予想される軸領域内の配 列同一性は保存されていない。一次構造よりはむしろ二次構造を保存している塩 基のこのような“共-変異(co-variation)”は、予想される軸の存在を支持して おり、この構造がこのファミリーのVEGFリガンドの高親和性立体構造にとって重 要であり得るということを示唆している。ファミリー１配列間には、同様に保存 された塩基対相互作用は一つも検出されなかった。リガンドの第３のファミリー は、TBSMC（ファミリー3、表2）中で行った選別においてのみ現れた。非常に保 存された一次構造モチーフに加えて、このファミリーのすべてのメンバーにおい て、保存された領域の3'の配列は、5'固定領域内のヌクレオチドに相補的な塩基 対を共通に有している（表２中の下線）。リガンドのほとん どに関しては、予想される軸の5'側の塩基はその塩基対形成相手と共に変化する とは言えないため、この観察は共通の二次構造をさほど予言するようなものでは ないが、それにもかかわらず、このファミリーに由来する最小の高親和性配列に 関する当初の推測（以下に記載する）は、このモチーフの強力な保存によって導 かれた。VEGFに対する個々のRNAリガンドの親和性を、その相互作用のKDの単一 決定に基づいて見積もった。わずかな例外を除き、リガンドは増殖因子に対して 、KDが５と50pMの間という、非常に高い親和性を示した。 最小のリガンド 各配列ファミリーを定義する共通の一次および二次構造モチーフは、VEGFに対 する高親和性結合に必要な最小配列要素をほのめかしている。各ファミリー由来 の典型的なリガンドの、入れ子した端切断（nested truncation）（表２中の灰 色の囲みで示す）を、化学合成により作り、VEGFに対するそれらの相対的な親和 性を求めた（表3）。リガンドVP30.22、VP30.2およびVT30.44の端を切断した版 を化学合成により調製し、VEGFに対するそれらの親和性を、実施例３に記載のよ うに求めた。最初の端切断（t22、t2、t44）を、5'および/または3'末端から欠 けている塩基を加えてオリゴヌクレオチドを合成することにより、さらに精製し た。化学合成を始めるために、リガンドのいくつかの最も3'のヌクレオチドを、 2'-OH-シチジンを2'-F-シチジンに置換すること（下線）により、あるいは3'-3' -結合デオキシチミジン“キャップ”を加えること（星印）により修飾した。各 オリゴヌクレオチドの長さ（引くキャップ）およびVEGFに対する結合の高親和性 KDを示す。 クローンVP30.22（ファミリー1）由来の最小配列に関する当初の予測は、精製 した、全長のリガンドの親和性選別した断片の末端のマッピングにより行った（ 実施例３参照）。この29ヌクレオチド分子（“t22”）は、全長のリガンドと比 較してVEGFに対する結合親和性の点でおよそ３倍の喪失を示した。この分子の3' 末端のさらなる端切断は、親和性の点で険しい喪失をもたらしたが、さらに６個 までのヌクレオチドを、ほとんど、あるいは全く無影響で5'末端から除き得た（ 表3）。ファミリー2由来のクローンVP30.2およびファミリー3 由来のクローンVT30.44について、予想される５塩基対軸およびすべての保存さ れた配列モチーフを含む、端切断したリガンド“t2”および“t44”を合成した 。端切断したいずれのリガンドも全長分子のほとんど全ての結合活性を保持して いた。一回に一つの予想塩基対（リガンドの各末端から１ヌクレオチド）を欠失 させることによるさらなる端切断は、親和性を徐々に喪失させた。したがって、 これらの配列に関しては、可能性としてあり得る二次構造に基づいた端切断は、 最小の高親和性リガンドを非常によく予測た。さらに、予想される軸がこれらの リガンドの高親和性立体構造に寄与するという仮説を支持する。 2'-OMe修飾 RNAオリゴヌクレオチドの2'-OH位の2'OMeによる置換は、ラット尿中にも他の 生物分泌液中にも存在するヌクレアーゼに対する安定性を改善することが観察さ れている。ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性は、治療または診 断剤としてのそれらの成功にとって重大であるとみられる。運悪く、2'-OMe-修 飾ヌクレオシド三リン酸は、一般的には標準的な反応条件下ではRNAポリメラー ゼに基質として受け取られない。しかし、2'-OMeプリンは化学合成によって特異 的なオリゴヌクレオチド内に導入し得る。いくつかの高親和性2'-OHプリンRNAリ ガンドが、驚くべきことに標的タンパク質に対する親和性をわずかに失うだけで 高い割合の2'-OMeプリン置換を受けるであろうということが観察されている。2' -OMe置換がVEGFに対する高親和性結合に影響しないようなプリン位を同定するた めに、１回あたり５または６個のプリンを修飾ヌクレオチドで部分置換してリガ ンドt2、t22およびt44のいくつかの合成を調製した（実施例３に記載）。各部分 置換ライブラリーの親和性選別を用い、VEGFに対する十分な親和性を保持した分 子を単離した。そのような親和性選別したプールにおいて、置換を許容しない位 置は2'-OHに偏っており、したがって、無選別のライブラリー内の同じ位置に比 較して、アルカリによる加水分解に対してより高い感受性を示す。5'-放射標識 された、無選別および親和性選別したプールをアルカリにより部分的に加水分解 し、生成物を高分離能ポリアクリルアミドゲル上に示した。リガンドt22におい てはG10およびA12が、親和性選別したプ ール内の2'OHにかなりの偏りを示し、リガンドt2においてはA6およびG21が、そ してリガンドt44においてはA5およびA6がそうであった。前述の解析により2'OMe ヌクレオチドによる置換を許容しないと見られる位置を同定されるが、これらの データからは、他のすべてのプリンの同時修飾がいかに結合親和性に影響するか は予想し得ない。実際、G10、A2およびG22（これらは2'-OHに対してぎりぎりの 優先を示した）を除きすべて2'-OMe-プリンで合成したリガンドt22は、すべて2' -OH-プリン配列よりよいわけではないとしても、それと同等の親和性でVEGFに対 して結合した（表4）。 端切断したオリゴヌクレオチド（t22、t2、およびt44）を、１、２または３個 以外はすべてのプリン位を2'-OMe-プリンで置換して、化学的に合成した。残っ ている2'-OH-プリンを、各リガンド名の中に示し、リガンド配列中に太字で示す 。各置換リガンドのVEGFに対するKDを示す。G22におけるさらなる置換は、VEGF に対する結合にわずかしか影響しなかったが、予想されたように、G10またはA12 に2'-OMeを導入するのは、結合親和性にとって不利益だった。同様に、リガンド t2およびt44は、VEGFに対する核酸リガンドの親和性に３から４倍の影響で、２ 個以外はすべてのプリンにおける2'-OMe-置換を許容した（表4）。 置換端切断体の結合の親和性および速度定数 最小の長さの、非常に2-置換されたVEGF核酸リガンドの同定を期待して、結合 を劇的には減少させなかったすべての2'-OMe置換を、端切断したリガンドt22、t 2a、およびt44a（表３参照）に導入した。2'OHヌクレオチドを太字で示し、2'OM eヌクレオチドを無修飾の文字で示す。得られた核酸リガンド、t22-OMeおよびt4 4-OMeは、VEGFに対してKDがそれぞれ67pMおよび49pMで結合したが、一方でリガ ンドt2OMeはKDがおよそ140pMで結合した（表5）。これらのKDは、NX-213（KD=14 0pM）、以前記載されている（本明細書中で参考文献として援用されている、ア メリカ合衆国特許出願No．08/447.169参照）VEGFに対する2'-NH2-ピリミジン-、 2'-OMe-プリン-置換オリゴヌクレオチド阻害剤に、有利に匹敵する。端切断され た2'-OMe-置換オリゴヌクレオチドのそ れぞれが、VEGFに対する結合に関してNX213と、そしてお互いに競合することが わかった。 ３つの2'-OMe-置換リガンドのそれぞれについて、大過剰の非標識リガンドを 加えた際に、放射標識したリガンドとVEGF間の完成した複合体が失われるのを追 跡することにより、解離速度定数（kd）を決定した。リガンドt22-OMeは半減期 がおよそ60秒で、最も速い解離速度を示した。リガンドt2-OMeおよびt44-OMeは 、それぞれ半減期が170および90秒のオーダーで、わずかに遅い解離速度を示し た。会合速度定数（kd）は、平衡解離定数と解離速度定数から算出され（KD=kd/ ka）、３x107から２x108M-1sec-1の範囲であった（表5）。このような会合速度 は、これらのリガンドとVEGF間の、近接した移動が限られた結合相互作用を示唆 しており、他の標的に対するSELEX由来核酸リガンドに関して観察された会合速 度定数と一致している。 二価の陽イオン依存性 ファミリー１および２のリガンドは、マグネシウム陽イオンの存在下で選別し たが、ファミリー３リガンドはマグネシウムとカルシウムの両方を含むバッファ ー中で選別した。二価の陽イオンは、高親和性RNA構造の非特異的または特異的 な安定化を介してRNA/タンパク質相互作用に寄与し得るため、VEGFに対する典型 的なリガンドの高親和性結合にマグネシウムおよび/またはカルシウムが必要で あるかどうか検討した。核酸リガンドt22-OM2およびt2-OMe（それぞれファミリ ー１および２由来）の親和性は、補足の二価の陽イオンあるいはキレート剤EDTA の非存在または存在下で変わらなかった（データは示さず）。しかし、ファミリ ー３リガンドは、リガンドt44-OMeに代表されるように、VEGFに対する高親和性 に関してカルシウム存在に対して絶対的な依存性を示した。結合バッファー中の 二価の陽イオンをEDTAによって置き換えると、結合は劇的に減少した(KD>10-7) 。二価の陽イオンを除いた結合バッファーに過剰のMgCl2を加えても、結合親和 性に改善はみられなかったが、CaCl2は、EDTAよりも２倍モル過剰で、結合活性 を完全に元に戻した。同様の結合挙動が無修飾のリガンドt44についても観察さ れた（データは示さず）。 タンパク質特異性 本明細書中で記載のオリゴヌクレオチドは、この増殖因子の２つの拡散性アイ ソフォームのうちの大きい方である、VEGF165に対する親和性に基づいて選別さ れた。小さい方のアイソフォームであるVEGF121は、VEGF165内の１つのエキソン を欠いており、後者と異なりヘパリンに結合しない。３つの端切断された2'-OMe -置換オリゴヌクレオチドのいずれも、VEGF121に対して測定できるほどの親和性 で結合しなかった。さらに、オリゴヌクレオチドとインキュベートする前にタン パク質をDTTにて還元すると、いかなる結合も観察されないため、VEGF165の天然 の構造は３つの核酸リガンドのすべての結合に必須である。 VEGFは種間で非常に保存されたタンパク質であり、ヒトVEGF165およびマウスV EGF164アイソフォームは88％の配列同一性を示す。端切断された、2'-OMe置換リ ガンドはヒトおよびマウスVEGFに対して同等によく結合した。しかし、保存され た血小板由来増殖因子様ドメイン間でVEGFと53％の配列同一性を有する胎盤由来 タンパク質であるPIGFのホモニ量体に対するいかなるリガンドについても、結合 は観察されなかった。VEGFとPIGFのヘテロ二量体が最近、正常および腫瘍由来細 胞株の両方の上清から単離され、そのようなヘテロ二量体は、高親和性VEGF受容 体２つのうちの１つに対する結合に関して、および培養内皮細胞における誘導性 の応答に関して活性を示す。VEGF/PIGFヘテロ二量体の生物学的な関連は未知で ある。親和性は大幅に減少したが、十分な結合がVEGF/PIGFヘロ二量体について 観察された。これらのデータは、核酸リガンドが二量体をとる２つのサブユニッ ト間の中間面またはその近傍で結合すること、およびPIGFは高親和性結合に必要 な接触部位のすべてに存在するわけではないということを示唆し得る。あるいは 、核酸リガンド結合表面に必然的なひずみをもってPIGFとのヘテロ二量体に参加 することにより、VEGFサブユニットの構造が変えられている可能性がある。 実施例５．リン脂質、グリセロールアミド脂質及びＰＥＧ−修飾ＶＥＧＦ核酸リ ガンドの合成 各種親油性化合物／核酸リガンド複合体の合成に以下の３つの異なる製剤（form ulation）を用いた： １．ＰＬ製剤の合成のためのＣ−１８ホスホロアミダイト Ｃ−１８ホスホロアミダイト調製の概略をスキーム３に示す。１−オクタデカ ノールを標準条件でリン酸化した。反応混合物を処理した後、残渣をシリカゲル カラムでヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（９０：１０：５）を用いて 精製して純粋生成物２１．５ｇ（５７％収率）を得た。 スキーム３ ＩＩ．脂質アミド１の合成 このホスホロアミダイトは前記ＰＬとは異なり、アミド結合をもつ。この脂質 をコンジュゲートすることから得られるオリゴの構造を以下に示す。いくつかの 実験から、有機溶媒中への化合物２２の高い不溶性がＮＭＲとＭＳによる性状決 定と、化合物２２のＤＡＧアミド２３へのさらなるホスフィチル化を不可能にし ていることを示している。しかしながら、脂質−スペーサーアミダイト調製（ス キーム１）の結果から、混合物を還流したらクロロ-(2-シアノエトキシ)-N,N-ジ イソプロピルアミノ−ホスフィンによる化合物２２のホスフィル化（phsphylati on）が進行すると期待した。ＤＡＧアミダイトを製造するこのアプローチをスキ ーム４に示す。 スキーム４ N,N'-ピス（ステアロイル）-1,3-ジアミノプロパノール-2（２２） ClCH2CH2Cl(50mL)中の塩化ステアロイル（6.789g,22.41mmol）の溶液を、ClCH2 CH2Cl(100.0mL)とTEA(2.896g，22.41mmol)中の1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロ パン（1.0g，11.10mmol）の溶液中に室温で攪拌しながら滴下した。添加終了後 、一晩混合物を７０℃に加熱すると透明溶液が生成し、この溶液を室温に冷却、 濾過し、固体をCH2CH2、CH3OH、5％ NaHCO3及びエチルエーテルで洗浄し、真空 乾燥すると２２（6.40g,93％収率）を白色固体として得た。 N,N'-ピス（ステアロイル）-O-(ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホスフ ィニル)-1,3-ジアミノ-2-プロパノール-2（２３） 一晩真空乾燥した化合物２２（5.80g，9.31mmol）を無水CH2Cl2（150.0mL）に 入れて、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（4.2mL,18.62mmol）を注入した。混 合物を氷水浴で冷却しクロロ-(2-シアノエトキシ)-N,N-ジイソプロピルアミノ- ホスフィン（8.6mL，0.47mmol）を注入した。３０分攪拌後、混合物を６０℃に ９０分加熱した。室温に冷却後、不溶性物質を濾過し溶液を5％ NaHCO3及びブラ インで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をCH3CNから沈殿させ ると純粋生成物（4.65g,61％収率）を白色固体として得た。31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤ Ｃｌ3，ppm）：154.04 Ｉ．ＤＡＧ−スペーサーアミダイト、脂質アミド２の合成 ジアミド化合物２２（これは脂質アミダイト２３の直接の中間体である）の不 溶性を緩和するために脂質アミダイト中にヘキサ（エチレングリコール）を導入 した。脂質−スペーサーアミダイト２９の調製の概略をスキーム５に示す。THF 中での化合物２５と1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパンとｔ−ブトキシドカリ ウムとのカップリング工程は良好に進行せず、収率は約２０％にとどまった。収 率を改良する一つの試みとして２５とジアミド２２を反応させたが、所望の生成 物は検出できなかった。 スキーム５ (4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコール（２４） 無水ピリジン（400mL）中に溶解したヘキサ（エチレングリコール）（18.93g, 67.05mmol）を無水ピリジン（3x50mL）と共蒸留し、０℃に冷却した後、ピリジ ン（50mL）中のDMTrCl（23.85g，70.40mmol）をアルゴン雰囲気下に攪拌しなが ら３０分かけて滴下した。反応混合物を一晩室温に維持した。高真空でピリジン を除去し、残渣をCH2Cl2に溶解し、これを5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2S O4で乾燥し、減圧濃縮した。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラム クロマトグラフィーで酢酸エチル、次いでCH2Cl2及び0.5％ TEAを含むメタノー ル（９５／５）のグラジエントを用いて精製した。適切な分画を 集めて蒸発させ、真空乾燥すると２４（26.1g，66.6％収率）が明るい黄色オイ ルとして得られた。(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコールトシレート（２５ ） 無水ピリジン（50mL）中の２４の氷冷（０℃）溶液に、ピリジン（30mL）中のト ルエンスルホニルクロリド溶液を加えた。室温で２時間後に、溶液を蒸発させて 明るい黄色オイルを得た。残渣をCH2Cl2に取り、これを5％NaHCO3及びブライン で洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。生成物をウエットフラッシュシリカゲ ルカラムクロマトグラフィーで酢酸エチルを用いて溶出して精製すると生成物（ 4.08g,93％収率）が明るい黄色オイルとして得られた。 2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチレングリコール-1,3-ジアミノ プロパン（２６） 無水THF中の1,3-ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン（747mg，8.28mmol）とｔ− ブトキシドカリウム（2.78g，24.84mmol）の混合物を７０℃で２時間加熱し、次 いで室温に冷却した。THF中の化合物２５（4.08g,5.25mmol）を注入し、TLCで確 認して２５が残っていなくなるまで混合物を一晩７０℃で攪拌した。溶液を室温 に冷却した後、THFを真空除去してCH2Cl2（25mL）と水（25mL）を加えた。CH2Cl2 層を分離して水層をCH2Cl2で抽出した。CH2Cl2溶液を集め てNa2SO4で乾燥し、減圧蒸留した。粗製生成物（2.43g）をさらに精製すること なく次の反応に直接用いた。 N,N'-ビス（ステアロイル）-2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)-ヘキサエチ レングリコール-1,3-ジアミノプロパン（２７） ClCH2CH2Cl中の塩化ステアロイル（3.363g，11.1mmol）の溶液を、ClCH2CH2Cl とTEA(1.9mL，11.1mmol)中の２６の溶液に室温で攪拌しながら加えた。混合物を 室温で２時間維持し、次いで一晩混合物を７０℃に加熱した。溶液を室温に冷却 した後、溶液を5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した 。粗製生成物をウエットフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで酢酸 エチルとCH2Cl2（５０／５０）、次いで酢酸エチルとメタノール（５０／５０） のグラジエントを用いて精製した。第２分画を集めて、蒸発させ、真空乾燥する と２７（640mg）が明るい黄色オイルとして得られた。 N,N'-ビス（ステアロイル）-2-ヘキサエチレングリコール-1,3-ジアミノプロ パン（２８） 化合物２７（640mg）、CH2Cl2（5mL）中の2.5％ DCA及びトリヘキシルシラン （2mL）の混合物を、オレンジ色が青白くなるまで室温で攪拌した。CH2Cl2を除 去した後、残渣をヘキサンから繰り返し沈殿させると明るい黄色固体（210mg,63 ％収率）が得られた。 N,N'-ビス（ステアロイル）-2-(ジイソプロピルアミノ-2-シアノエトキシホス フィニル−ヘキサエチレングリコール)-1,3-ジアミノプロパン（２９） 真空で一晩乾燥した化合物２８（210mg,0.237mmol）を無水CH2Cl2(5.0mL)に溶 解し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（218μL，1.25mmol）を加えた。溶液を 氷水浴で冷却しクロロ-(2-シアノエトキシ)-N,N-ジイソプロピルアミノ-ホスフ ィン（106μL，0.47mmol）を注入した。３０分撹拌した後、反応混合物をCH2Cl2 で希釈し、5％ NaHCO3及びブラインで洗浄、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮して化合 物２９を得た。31Ｐ ＮＭＲ（CDCl3,ppm）：154.04。 ＶＥＧＦ核酸リガンドへの２０Ｋ又は４０Ｋ ＰＥＧ ＮＨＳエステルのコンジ ュゲート 一般的方法：ＶＥＧＦオリゴヌクレオチドをトリエチルアンモニウム塩に変換し て凍結乾燥した。粗製オリゴヌクレオチドを100mMホウ酸ナトリウムバッファー （pH9）に60mg/ml濃度に溶解した。２当量のＰＥＧ ＮＨＳエステル（Shearwat er Polymers，Inc.）を乾燥ＤＭＦに溶解し（ホウ酸：ＤＭＦの比率＝１：１） 、混合物を温めてＰＥＧ ＮＨＳエステルを溶解した。オリゴヌクレオチド溶液 をＰＥＧ溶液に素早く加えて、混合物を室温で１０分激しく撹拌した。約９０％ のオリゴヌクレオチドがＰＥＧ ＮＨＳエステルとコンジュゲートした。図１Ｈ 及び１１を参照のこと。 ２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドの合成 図１Ｊ,Ｋ及びＬに示す２量体ＶＥＧＦ核酸リガンドを以下のように作製した 。1,3-ジピバロイル-2-O-ジメトキシトリチルグリセロール３２の合成 McGee et al.(1988，Synthetic Communication，1651)に従って調製した化合 物３１（ピリジン200ml中、７０％純度の生成物を62g，200mmol）の撹拌ピリジ ン溶液に、ジメトキシトリチルクロリド（84g，240mmol，1.2倍過剰）を加えて 、反応物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して残渣をCH2Cl2(1 L)に取り、水で洗浄、乾燥(MgSO4)して濃縮した。粗製混合物(130g)をそのまま 次の反応に用いた。 2-O-ジメトキシトリチルグリセロール３３の合成 粗製化合物３２（130g）、NaOMe（28g）及びメタノール（900ml）の混合物を ５０℃で１６時間加熱した。反応終了後（TLC）、混合物を濃縮乾燥して残渣を 水とCH2Cl2（１：１）に溶解した。有機層を分離して水層を飽和NH4Cl、水及び ブラインで洗浄、乾燥（MgSO4）した。溶媒を蒸発させるとガム状化合物が得ら れ、これをシリカゲルカラムでヘキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸エチル（１：１） を用いて精製すると、化合物３３を７５％収率で得た。ビスアミダイト３４の合成 CH2Cl2（125ml）とジイソプロピルエチルアミン（58ml，320mmol ）中にア ルコール３３（16.2g，41.1868mmol）を溶解した氷冷撹拌溶液に、ホスファチル 化剤試薬（20.5ml，90.62mmol）を加え、溶液をゆっくり室温まで温めて同じ温 度で２時間撹拌した。反応混合物を砕いた水の中にゆっくりと注ぎ、CH2Cl2で抽 出し、5％ NaHCO3、水及びブラインで洗浄して乾燥した。溶媒を蒸発後に得られ た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーでヘキサン／２％ＴＥＡ含有酢酸 エチル（１：１）を用いて精製すると、化合物３４を７０％収率で得た。 31Ｐ Ｄ3ＰＯ4を外部標準として153.64 & 153.39(2S)。 ＶＥＧＦ２量体の調製 ＶＥＧＦ２量体の合成は８８００自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で行った。ＮＸ３ １８３８を調製し、ここではｒＡはアデノシンを意味し、mGとmAはそれぞれ2'-O -メチルグアノシンとアデノシンを、そしてｆＣとｆＵは2'-デオキシ-2'ワルオ ロシチジンと2'-フルオロウリジンを意味し、[3'-3']は3',3'-ヌクレオチド間結 合を意味する。合成は、5'-DMT-2-O-メチル-N6-tert-ブチルフェノキシアセチル アデノシン、5'-DMT-2'-O-TBDMS-N2-tert-ブチルフェノキシアセチルグアノシン 、5'DMT-2'-O-TBDMS-N6-tert-ブチルフエノキシアセチルアデノシン3'-N,N-ジイ ソプロピル-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイト及び2'-デオキシ-2'-フルオロ -5'-DMT-N4-アセチルシチジン及び2'-デオキシ-2'-フルオロ-5'-DMT-ウリジン3' -N,N-ジイソプロピル-(2-シアノエチル)ホスホロアミダイトを用いて、Millipor e 8800自動合成機で行った。合成サイクルは以下のようであった。活性化剤の組 成は表１２に記載する通りである。合成は600Å孔径、80-120メッシュのＣＰＧ サポートを使用し、及び5'-スクシニルチミジンを用いる60-70μmol/g装填で行 った。カップリングサイクルは表１２に示す。 実施例６．リン脂質（ＰＬ）及びＰＥＧ修飾ＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態学 的特性 表２に示す配列のうち、配列ＶＴ３０．４４を選んでさらに研究し、ＮＸ３１ ８３８と命名し直した。２０及び４ＯＫ ＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ 核酸リガンドＮＸ３１８３８の薬物動態学的特性をスプラーグ・ドーレイラット で試験した（分子性状についての記載は図１を参照）（配列番号：８及び９）。 同様の研究をＰＬ脂質とコンジュゲートしたＮＸ３１８３８について、リポソー ム製剤と遊離医薬として行った（分子性状についての記載は図１Ｈを参照）（配 列番号：８及び９）。各研究において、260nmにおけるＵＶ吸収と吸光係数0.037 μgオリゴ/mlに基づいて溶液濃度1.0mg/mlでオリゴヌクレオチドをＰＢＳに希釈 した。全ての研究で９匹のラットにボーラス尾静脈注射によって1.0mgオリゴヌ クレオチド/kg動物体重を投与し、２分から２４時間の様々な時間で血漿サンプ ルを採取した。血漿サンプル及び品質対照サンプルをハイブリダイゼーションア ッセイにより分析した。ハイブリダイゼーションアッセイでは、酸化鉄（ＦｅＯ ）ビーズにコンジュゲートしたＶＥＧＦ核酸リガンドの５'-末端に相補的な配列 を含む捕捉オリゴヌクレオチド(ＦｅＯ−スペーサー-3'-d(GCC TTA GTCACT T-5' )(配列番号：１３７)ここでスペーサー＝(dT)8)と、５'-末端にビオチン２分子 を含む検出オリゴヌクレオチド（ビオチン−ビオチン−５'-d(スペーサー-CGG A TG TAT AAG CA-3'）ここでスペーサー＝(dT)8)（配列番号：１３８）を用いた。 ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８を含む血漿サンプルと一緒に捕捉及び検出 プローブをインキュベートした後、ビーズにハイブリダイズしたビオチンオリゴ ヌクレオチドの量を、発光基質としてCSPD-Sapphireを用いるストレプトアビジ ン結合アルカリホスファターゼで定量した。 ボーラス注射後の時間を関数とする遊離、ＰＥＧ２０Ｋ及びＰＥＧ４０Ｋ Ｖ ＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）（配列番号：８及び９）の血漿濃度のデ ータを図６にまとめた。４０Ｋ ＰＥＧコンジュゲートは３６０分の単指数関数 的（monoexponential）ｔ1/2で浄化されたが、２０Ｋ ＰＥＧ型ははるかに迅速 に浄化され、核酸リガンドの９５％が４９分のアルファｔ1/2で浄化され、５％ が１９２分のベータｔ1/2で浄化された。これはサイズが浄化値（clearance）と って重要であることを示している。ＰＥＧ−コンジュゲートした核酸リガンドと 比較して、遊離（非コンジュゲート）ＮＸ３１８３８は数分のｔ1/2で非常に迅 速に血漿から浄化された。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、 オリゴヌクレオチドに適切な官能基を導入することにより有意に増加した。 ボーラス注射後の時間を関数とするリポソーム付き又はリポソーム無しで調製 されたＰＬ脂質コンジュゲート化ＶＥＧＦ核酸リガンド（配列番号：５）の血漿 濃度のデータを図７にまとめた。リポソームは実施例７Ａに記載の方法で核酸の 存在下に音波処理して作製し、内側と外側にオリゴヌクレオチドを含む。リポソ ーム製剤は遊離の薬剤よりもはるかにゆっくりと浄化され、ベータｔ1/2はそれ ぞれ１１６１分及び１３１分であった。時間を関数とするオリゴヌクレオチドの 血漿濃度はリポソーム製剤によって有意に増加した。 実施例７．ＮＸ３１８３８ＰＬ−リポソーム複合体の調製 Ａ．薄層化（filming）によるリポソーム調製 コレステロール１モルに対してＤＳＰＣ２モルの割合で脂質を組み合わせた。 水に溶解したＮＸ３１８３８ＰＬを脂質に１：５０（ｗ／ｗ）の割合で加えた。 クロロホルム：メタノール：水（１：３：１）の溶液で溶媒和とすることによっ て物質を組み合わせた。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去すると脂質と混 合されたＮＸ３１８３８ＰＬの不均一フィルムが残った。このフィルムを９％ス クロース溶液中に脂質ベースで50mg/mLで水和し、２５ｍＭリン酸ナトリウムで ｐＨ７．４にバッファー化した。溶液を激しく混合し、６５℃に加熱し、得られ る白色ミルク様溶液を７５ｍＬアリコートで音波処理して脂質を単膜（unilamel lar）リポソームに組み立てた。リポソーム形成の進行は、溶液が透明になるこ とを目で観察し、次に粒子分析機（Leeds & Northrup Microtrack UPA 150,Hors ham,PA）を用いる動的光散乱による粒子サイズ測定により追跡 できる。リポソームのサイズは５０−７０ｎｍ（容積重量分布法による）の範囲 にある。 Ｂ．受動アンカーリングによるリポソーム調製 あらかじめ形成された（“空の（empty）”）リポソーム中にｓｃＮＸ−２８ ７（分子性状については図ＩＣ参照）が自然に導入されるか試験した。ＤＥＡＥ アッセイ（遊離の核酸リガンド／グリセロール脂質複合体の除去のため）を用い る予備試験の結果、以下の２つの重要な知見が示唆された：１）装填が達成され た；そしてさらに重要なことは、２）室温、２４時間で核酸リガンド／グリセロ ール脂質複合体の実質的に完全な装填が観察された。装填に及ぼす温度の影響を 決定するために更に詳しい研究を行った。温度は導入率に劇的な影響を及ぼすこ とが観察された。室温、２４時間で完全な装填が達成されたが、高温（６７℃） ではたった数分で完全な導入が達成された。これは、予め形成したリポソーム中 に核酸リガンド／親油性化合物複合体を迅速かつ効率よく導入する方法であるこ とが判明した。 次にゲル濾過クロマトグラフィーによってリポソーム会合型から遊離のｓｃＮ Ｘ−２７８を分離した。”空の”２：１ ＤＳＰＣ：コレステロールリポソーム 中へのｓｃＮＸ−２７８の装填を用いて予備試験を行った。２２℃でSuperdexS- 200カラムを用いてクロマトグラムを作った。２２時間にわたって、空のリポソ ーム集団中へのｓｃＮＸ−２７８の漸次的導入がピーク領域のシフトとして観察 された（データ示さず）。この結果はＤＥＡＥアッセイのデータとよく関連する 。 追加のｓｃＮＸ−２７８が音波処理したオリゴーリポソーム中に装填されるか 試験するためにさらに研究を行った。オリゴー脂質を脂質と共溶解し、２つを一 緒に共音波処理することによってｓｃＮＸ−２７８の音波処理製剤を調製した。 得られるリポソームはｓｃＮＸ−２７８を完全に導入したことを示した。この音 波処理製剤を次に、追加の遊離ｓｃＮＸ−２７８で受動アンカーリングを２回実 施してそれ以上のｓｃＮＸ−２７８が導入されるかを観察した。１回目の受動ア ンカーリングでは６５℃、１時間のインキュベーション後に遊離のｓｃＮＸ−２ ７８の全てがリポソーム中に受動アンカーリングされた。追加のｓｃＮＸ−２７ ８を受動アンカーリングさせる２回目の試みは不完全装填に終わった。 これらの実験から得られる鍵となる知見は、核酸リガンド／親油性化合物複合 体は音波処理したオリゴーリポソーム中に高濃度で受動アンカーリングされうる が、追加の核酸リガンド／親油性化合物複合体を吸収するリポソームの容量（ca pacity）を越えうるということである。２回の受動装填（約3mg脂質−オリゴ／5 0mg脂質まで）の後に、いくらかの遊離の脂質−オリゴが残っているのでリポソ ームは明らかに追加のオリゴ−脂質を吸収する”容量”に達する。これらのデー タはＤＥＡＥスピン一カラム分析で確認した（データ示さず）。以下の結論が導 かれる：１）音波処理したリポソームは核酸リガンド／親油性化合物複合体を導 入する追加の容量をもっている；そして２）１００％核酸リガンド導入が音波処 理によって達成できる。 ＮＸ３１８３８ＰＬ（分子性状については図１Ｅを参照）で次の研究を行った 。ＮＸ３１８３８はリポソーム中に導入されると、ＶＥＧＦターゲットに対する 薬物動態学的（実施例６参照）及び生物分布が改良されるので極めて興味深い。 受動アンカーリングによるＮＸ３１８３８のリポソーム中への導入をよりよく理 解するためにいくつかの研究を行った。 ＮＸ３１８３８ＰＬの動力学的研究によると、この分子の受動アンカーリング はあまりに速いので文献公知のいかなるクロマトグラフィー法（これらはいずれ も最低数分の作動時間を必要とする）によっても測定不能であると考えられるこ とを示唆していた。 ＮＸ３１８３８ＰＬ分子の方向性を決定する（すなわち、核酸リガンド成分が リポソームから外側へ向かって進むのか、あるいはリポソームの水性中心に向か って進むのか）ために、外部から導入したＲＮａｓｅを用いてリポソームから外 側へ進んでいる核酸リガンド成分を全て選択的に切断した。受動アンカーリング したＮＸ３１８３８ＰＬリポソームの場合、全ての核酸リガンドがＲＮａｓｅに さらされた。Triton X-100処理の後には追加の消化は全く観察されなかった。こ れらの結果は、受動装填されたＮＸ３１８３８ＰＬは、核酸リガンド成分がリポ ソームから外側へ向けて進むように方向付けられていることを示唆する。もしも 受動アンカーリングされたＮＸ３１８３８ＰＬリポソームをＲＮａｓｅＩで前 消化し、次いでＤＥＡＥカラムにかけると、約９９％の核酸リガンドがカラムに 捕捉されるが、一方同じサンプルをＲＮａｓｅＩで前インキュベーションせずに ＤＥＡＥにかけると、ほぼ１００％のオリゴがＤＥＡＥに結合することなくカラ ムを通過することができる。リポソームがＤＥＡＥからオリゴを保護するのであ る。リポソームは核酸リガンドと高い親和性で会合してＤＥＡＥ基にさらされる のを大きく減少するので、ＤＥＡＥから核酸リガンド成分を保護するように作用 する。 最後に、リポソームアンカーリング型から遊離の核酸リガンド／親油性化合物 複合体を分離するための新規方法を開発する一部として、ＮＸ３１８３８．０５ ＰＬをＲＮａｓｅＩで消化した。切断されたオリゴは脂質尾部を除去した後、ゲ ル濾過クロマトグラフィー（S-1000樹脂)を用いて容易に分離できるが、完全な 核酸リガンド／親油性化合物複合体は同じ条件下でリポソームと共溶出される。 このデータは、核酸リガンド／親油性化合物複合体が溶液中で遊離状態のときに は多分ミセルを形成していることを示唆する。このためカラムの空間容積（void volume）中でリポソームと共溶出する結果となる。脂質尾部の除去により、ゲル 濾過媒体中への侵入が可能になり、サイズ分画されて適切に貯蔵される。 実施例８．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のin vivo有効性一皮膚血管透過性アッ セイ ＮＸ３１８３８核酸リガンドのいくつかの異なる製剤が皮膚血管の透過性にお いてＶＥＧＦで誘発された変化を弱くさせる（attenuate）能力をもつかを上述 した方法（Senger et al.,(1986)Cancer Research 46:5629-5632）を少し修飾し て行った（マイルスアッセイ）。簡単に述べると、成人雌モルモット（３匹／実 験）をイソフルランで麻酔して、背側と側方後ろ領域の毛をクリッパーで除去し た。エバンスブルー染料（2.5mg/モルモット）を静脈内投与した。注射溶液（Ｐ ＢＳ、ＶＥＧＦ、ＮＸ３１８３８製剤、及び抗−ＶＥＧＦモノクローナル抗体） を３０分前に調製し、表記の最終濃度で指示する場合には共混合した。各溶液を 毛を刈った領域に描いた格子状パターン内にランダムに皮内注射した（二重に注 射／モルモット；40μl／部位）。モルモットを麻酔から快復させ、皮内注射の 完了３０分後にＣＯ2にさらして殺した。皮膚を回収して皮下組織を除いて、透 視した。カラ−ＣＣＤカメラ（Hitachi Denshi KP-50U，Japan）とImage-Pro Pl usソフトウエア（Version 3.1，Media Cybernetics，Silver Springs，ＭＤ）を 用いて画像を得た。各皮膚サンプルについて、光学密度と関連領域について、分 析する各注射部位の強度を正規化した。 図８Ａ−Ｃは、実施例７Ａで記載したリポソーム製剤中でのＮＸ３１８３８− ２０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ、ＮＸ３１８３８−ＰＬにつ いて、ＶＥＧＦ−誘導された血管漏出（vascular leakage）の核酸リガンド弱体 化（attenuation）の結果を示す。全ての製剤は１００ｎＭという低濃度でＰＢ Ｓ対照レベルまで、又はこの近くのレベルまで血管漏出を有意に減少することが できた。３０ｎＭでは、核酸リガンドのブロック効果は失われた。ＮＸ３１８３ ８−ＰＬリポソーム製剤はこの濃度で評価しなかったが、１００ｎＭにおけるブ ロック効果を減少したようであった。このモデル系で抗−ＶＥＧＦモノクローナ ル抗体も評価したところ、１００ｎＭまで同様に有効であり、３０ｎＭでは活性 を失った。従って、このモデル系では試験した各種製剤形のＮＸ３１８３８がＶ ＥＧＦタンパク質の機能的効果の１つをブロックするという点において抗体と等 しく有効であることを示唆している。 実施例９．ＶＥＧＦ核酸リガンド複合体のin vivo有効性−角膜ポケットモデル ＶＥＧＦ核酸リガンド（ＮＸ３１８３８）製剤のＶＥＧＦ−誘導した角膜脈管 形成減少能を正常駆血ラット角膜で試験した。簡単に述べると、９５％エタノー ル中の１２％バイオポリマーにタンパク質又は担体溶液を加えることによって、 約３０時間前にバイオポリマー（Hydon）ペレット±ＶＥＧＦタンパク質（3pmol ）を調製した。塩酸ケタミン（5Omg/kg）及びキシラジン（10mg/kg）を腹腔内注 射して成人スプラーグ・ドーレイラット（200-240g）を麻酔した。次に左目に塩 酸テトラカインを局所投与して局部麻酔し、希釈ポビドン−ヨウ素液を適用し、 次いで等張食塩溶液でリンスした。中央角膜（mid-cornea）に垂直部分厚さの切 開を行った。中央間質ポケットを縁の１．５ｍｍ内に至るまで側方眼角に向けて 後ろ側に切り取った。次いでペレットを挿入してポケットの後ろ 端に押しやった。残っている空気を穏やかにマッサージしてポケットから除去し た。クロラムフェニコール眼科用溶液を目に１滴入れた。動物をひっくり返して 右目にこの処置を繰り返して同じタイプのぺレットを挿入した。それぞれの目に ぺレットの挿入が完了したら、各動物にＰＢＳ（核酸リガンド製剤群と匹敵する 容積）又は核酸リガンド（10mg/kg）を指示通り１日２回静脈内投与した。５日 目に、各動物を麻酔して、解剖顕微鏡（KAPS，Germany）にセットした３５ｍｍ カメラ（Minolta X9）で写真を撮った。血管成長の最大長さ（０−５）、移植ぺ レット近くの血管成長密度（１−４）及び血管形成を起こした目の円周（０−１ ）を測定することによって血管形成応答について各目を評価した。長さ＊密度＊ 円周の結果で血管形成インデックスを決定した。 核酸リガンド製剤がＶＥＧＦ−誘導した血管形成をブロックする能力を図９Ａ −Ｃに示す。血管透過性変化のブロックにおいてはその他の製剤と等しく有効で あったにもかかわらず、ＮＸ３１８３８−２０Ｋ ＰＥＧは正常駆血角膜におけ る血管形成応答の弱体化では無効であった。しかしながら、ＮＸ３１８３８−４ ０Ｋ ＰＥＧ及びリポソームＮＸ３１８３８−ＰＬはいずれも６５−７０％で血 管形成レベルを有意に減少した。この違いは核酸リガンドそれぞれの薬物動態学 プロフィールによるものと思われる。 統計学的分析：マイルス（Miles）アッセイ及び角膜血管形成モデルの群はDun nett比較を用いるRank ANOVAによって比較した。 実施例10．腫瘍モデルにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドのin vivo有効性 ヒト腫瘍異種移植モデル：ＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥ Ｇが固形腫瘍増殖に及ぼす能力を、ヌードマウスの皮下腫瘍モデルで試験した。 Ａ６７３ヒト横紋筋肉腫腫瘍細胞を組織培養で増殖し、回収して、ヌードマウス の脇腹の腋領域近くに１ｘ１０7個の生細胞を皮下移植した。試験化合物による 処置は12時間後に開始し、実験の間中続けた。化合物は１日２回10及び40mg/kg で腹腔内投与した。陰性対照は乱雑化アプタマー(scrambled aptamer)配列であ るＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ（分子性状については図ＩＲ参照）を１日２ 回40mg/kg投与からなり、陽性対照は抗−ＶＥＧＦ抗体Ｍａｂ．２６ ５０３．１１(R & DSystems,Lot＃LD03）を100μg／マウスを週に２回投与から なっていた。核酸リガンドー処置群及び抗体処置群はいずれも乱雑化配列陰性対 照群と比べて脛瘍増殖を有意に遅らせた（図１１）。脛瘍増殖阻害率（ＴＧＩ） は、40mg/kg及び10mg/kgＢＩＤ群では７５％及び８０％であり、モノクローナル 抗体処置群では８３％であった（表８）。40mg/kg投与群と10mg/kg投与群では有 意な差がなかったので、１４日以後は40mg/kgの投与を行わなかった。図１１に 見られるように、投与終了の数日後に腫瘍増殖は速くなり、陰性対照群の増殖速 度と同様になったが、10mg/kg核酸リガンド群及び抗体処置群は低い速度で増殖 し続けた。 同じ腫瘍モデルを使ってさらに研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンド ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの新しいバッチ（ＮＸ３１８３８．０４及びＮ Ｘ３１８３８．０７と命名）を比較し、また投与量を10mg/kg BIDから少なくし て3mg/kg BID及び1mg/kg BIDとした滴定（titration）実験を行った。１日１回1 0mg/kgについても同様に実験を行い、またＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８ −ＰＬのリポソーム形を10mg/kg BIDで行った。図１２及び表９に見られるよう に、いずれの実験でも同程度の腫瘍増殖阻害が達成された。ＶＥＧＦ核酸リガン ドのいずれのバッチも１日２回の投与スケジュールで比較したときは同等であり 、旧バッチと新バッチのＴＧＩ値はそれぞれ６１％及び７０％であった。さらに 、１日１回投与（ＳＩＤ）は１日２回投与と同様に有効であった。しかしながら 、この実験で用いた滴定スキームでは有効投与量に達しなかった。 ＶＥＧＦ核酸リガンドのさらに下方滴定が腫瘍増殖に関して用量応答関係を示 すかどうかについて第３の実験を行った。この実験ではＶＥＧＦ核酸リガンドを 0.03mg/kgという無効用量近くまで下方滴定した。相対的腫瘍増殖阻害を図１３ に示し、表１０にまとめた。 ３つの期に達していない（unstaged）腫瘍研究に加えて、期に達した（staged ）瘍研究を行った。ここではＶＥＧＦ核酸リガンドによる処置の開始前に腫瘍を 樹立して２００±１００ｍｍ3に達せさせた。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ （10mg/kg）とｍＡｂ２６５０３（R & D Systems）（１週２回100μg）の投与群 ではそれぞれ５９％及び６９％の腫瘍増殖阻害を達成した（図１４、表１１）。 これらの集積的研究では、ＶＥＧＦ核酸リガンドがＡ６７３腫瘍の樹立を遅らせ ること、ならびにいったん腫瘍が樹立されたら腫瘍増殖を阻害できることを示し ている。 カポジ肉腫モデル：ヌードマウスにおけるカポジ肉腫セルラインＫＳＹ−１の皮 下増殖に及ぼすＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧの効果を試験した。ＫＳＹ−１ 細胞は培養においてＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるという点でユニ ークな腫瘍セルラインである。ＫＳＹ−１細胞を培養で増殖し、集めて、これを マウスの後ろ脇腹に皮下注射した（２ｘ１０7個細胞／マウス）。３群のマウス （１群４匹）をＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧ（30mg/kg）、ＮＸ３１９１７ −４０Ｋ ＰＥＧ（30mg/kg）（分子性状については図ＩＲ参照）又はＰＢＳの いずれかを実験の間中、１２時間毎に腹腔内注射して処置した。処置は腫瘍細胞 移植の１日後に開始した。ＰＢＳ−処置群とＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ− 処置群の腫瘍増殖は同等であったが、腫瘍増殖のかなりの阻害がＮＸ３１８３８ −４０Ｋ ＰＥＧ−処置群で観察された（図１６）。ＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧはＫＳＹ−１腫瘍の増殖を実験終了時（２２日目）に65%(PBS−処置群と 比較して）又は６９％（ＮＸ３１９１７−４０Ｋ ＰＥＧ−処置群と比較して） 阻害した。 実施例１１：ウサギにおけるＶＥＧＦ核酸リガンドＮＸ３１８３８＋４０Ｋ Ｐ ＥＧの硝子体内薬物動態学 ニュージーランド白ウサギに、４０ｍＰＥＧとコンジュゲートしたＶＥＧＦ核 酸リガンドＮＸ３１８３８を０．５ｍｇ／目で硝子体内投与することによって処 置した。４０Ｋ ＰＥＧは実施例５に記載の方法でＶＥＧＦ核酸リガンドにコン ジュゲートし、得られる複合体は図１Ｈに示すものである（配列番号：８）。ウ サギはそれぞれの目にＮＸ３１８３８−４０Ｋ ＰＥＧを硝子体内投与した。動 物毎の投与間の時間は１５分を超えなかった。血液及び硝子体サンプルを表７に 記載するように採取した。 血漿及び硝子体サンプルの分析は二重ハイブリダイゼーションアッセイを用い て行った。このアッセイでは、９６ウエルプレートに付着した捕捉プローブとビ オチン化した検出プローブの２つのハイブリダイゼーションプローブを用いる。 捕捉プローブは核酸リガンドの５’末端とハイブリッドを形成する。このアッセ イは全長核酸リガンドに対して極めて特異的かつ感受性であり、陽性シグナルを 生じる。現在の定量限界は血漿５μｌ中で約２ｆｍｏｌｅである。 ％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。 **注：ＶＥＧＦ核酸リガンド40mg/kgの投与は１４日目に終了した。％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはx時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗｃはx時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。 ％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。％ＴＧＩ＝１００（１−Ｗt／Ｗc）；ここでＷtはｘ時間における処置群の平均 腫瘍容積；Ｗcはｘ時間における対照群の平均腫瘍容積である。 ４２％ＴＧＩ又はそれ以上が有意である。 *当量はＣＰＧ−結合３’−末端ヌクレオシドのモル数にに基づいている。** アクチベーター当量はヌクレオシドホスホロアミダイトのモル数に基づいてい る。 ２量体合成の一般的方法 他の全てのホスホロアミダイトは、グリセロールアミダイト以外は上述したのと 同じ方法でカップリングした。 請求の範囲 １．ＶＥＧＦに対する精製および単離した、天然に存在しないＲＮＡリガンド であって、２’フルオロ（２’Ｆ）−修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡリガンド。 ２．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：１５−１３２）よりなる群 から選択される、請求項１記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ３．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：１５−１３２）よりなる群 から選択されるリガンドと実質的に相同であり、かつ実質的に同じＶＥＧＦ結合 能を有する、請求項２記載のＲＮＡリガンド。 ４．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：１５−１３２）よりなる群 から選択されるリガンドと実質的に同じ構造および実質的に同じＶＥＧＦ結合能 を有する、請求項２記載のＲＮＡリガンド。 ５．下記を含む方法： ａ）候補となるＲＮＡ混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し 候補混合物と比較して高い親和性をもつＲＮＡを候補混合物の残りのものから分 配でき； ｂ）これらの高親和性ＲＮＡを候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性ＲＮＡを増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する ＲＮＡにつき濃縮されたＲＮＡ混合物を得て；これによりＶＥＧＦのＲＮＡリガ ンドを調製する により同定された、請求項１記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ６．下記を含む方法： ａ）候補となるＲＮＡ混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し 候補混合物と比較して高い親和性をもつＲＮＡを候補混合物の残りのものから分 配でき； ｂ）これらの高親和性ＲＮＡを候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性ＲＮＡを増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する ＲＮＡにつき濃縮されたＲＮＡ混合物を得て；これによりＶＥＧＦのＲＮＡリガ ンドを調製する により同定された、請求項２記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ７．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性 高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体。 ８．リガンドと非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物との間にさらに リンカーを含む、請求項７記載の複合体。 ９．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項７ 記載の複合体。 １０．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項９ 記載の複合体。 １１．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項１ ０記載の複合体。 １２．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項１ ０記載の複合体。 １３．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １４．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １５．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １６．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １７．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １８．親油性化合物がグリセロール脂質である、請求項７記載の複合体。 １９．親油性化合物が次式の構造を有するグリセロール脂質：［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2 −；ならびにＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−ＣＨ3 （ＣＨ2）nＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n（ ＣＯ）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ−で なければならず、Ｘは独立して（ＰＯ4）、ＯおよびＣＨ2ＯＣ＝Ｏよりなる群か ら選択され、ここでｎ＝０〜３０、好ましくは１０〜２０である］ である、請求項１８記載の複合体。 ２０．グリセロール脂質は、ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−で あるリン脂質である、請求項１９記載の複合体。 ２１．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−であり、Ｒ2がＣＨ3（Ｃ Ｈ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−であり、かつＲ3がＸ−であり、そしてｎ＝１７ である、請求項２０記載の複合体。 ２２．ＸがＰＯ4である、請求項２１記載の複合体。 ２３．グリセロール脂質は、ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であ るグリセロールアミド脂質である、請求項１９記載の複合体。 ２４．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2 ）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であり、かつＲ3がＸ−であり、そしてｎ＝１６であ る、請求項２３記載の複合体。 ２５．ＸがＰＯ4である、請求項２４記載の複合体。 ２６．ＸがＯである、請求項２４記載の複合体。 ２７．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2）nＯＣＨ2−で あり、かつＲ3がＣＨ2Ｏ（ＣＯ）であり、そしてｎ＝１７である、請求項１９記 載の複合体。 ２８．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）Ｏ−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2）n（Ｃ Ｏ）ＯＣＨ2−であり、かつＲ3がＣＨ2Ｏ（ＣＯ）であり、そしてｎ＝１７であ る、請求項１９記載の複合体。 ２９．請求項７記載の複合体を含む脂質構築体。 ３０．請求項１９記載の複合体を含む脂質構築体。 ３１．請求項２０記載の複合体を含む脂質構築体。 ３２．請求項２１記載の複合体を含む脂質構築体。 ３３．請求項２２記載の複合体を含む脂質構築体。 ３４．複合体が下記のものである、請求項３３記載の脂質構築体： ３５．請求項２３記載の複合体を含む脂質構築体。 ３６．請求項２４記載の複合体を含む脂質構築体。 ３７．請求項２５記載の複合体を含む脂質構築体。 ３８．複合体が下記のものである、請求項３７記載の脂質構築体： ３９．請求項２６記載の複合体を含む脂質構築体。 ４０．複合体が下記のものである、請求項３９記載の脂質構築体： ４１．請求項２７記載の複合体を含む脂質構築体。 ４２．複合体が下記のものである、請求項４１記載の脂質構築体： ４３．ＶＥＧＦ核酸リガンドが、候補となる核酸混合物から、下記を含む方法 ： ａ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し候補混合物と 比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配でき； ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性核酸を増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する核 酸につき濃縮された核酸混合物を得て；これによりＶＥＧＦの核酸リガンドを調 製する により同定された、請求項７記載の複合体。 ４４．該方法がさらに工程ｂ）およびｃ）を反復することを含む、請求項４３ 記載の複合体。 ４５．薬剤学的に有効な量の、２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸 リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を 投与することを含む、ＶＥＧＦ仲介による疾病または医学的状態を処置する方法 。 ４６．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ４５記載の方法。 ４７．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項４ ６記載の方法。 ４８．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項４ ７記載の方法。 ４９．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項４ ７記載の方法。 ５０．複合体が下記の構造を有する、請求項４９記載の方法： ５１．親油性化合物がグリセロール脂質である、請求項４５記載の方法。 ５２．複合体がさらに脂質構築体と結合している、請求項５１記載の方法。 ５３．複合体が下記の構造を有する、請求項５２記載の方法： ５４．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原 性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体の製造方法であって： ａ）ＶＥＧＦ核酸リガンドを、候補となる核酸混合物から、下記を含む方法で 同定し： ｂ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し候補混合物 と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる； ｃ）これらの高親和性ＶＥＧＦ核酸を候補混合物の残りのものから分配する ； ｅ）これらの高親和性ＶＥＧＦ核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混 合物を得る；そして ｆ）同定されたＶＥＧＦ核酸リガンドを、非免疫原性高分子量化合物または親 油性化合物と結合させる ことを含む方法。 ５５．複合体がさらに脂質構築体と結合している、請求項５４記載の方法。 ５６．脂質構築体がリポソームである、請求項５５記載の方法。 ５７．複合体が核酸リガンドおよび親油性化合物からなり、該複合体か下記を 含む工程： ａ）リポソームを形成し；そして ｂ）核酸リガンドおよび親泊性化合物からなる複合体を工程ａ）のリポソーム と混合し、これにより複合体の核酸リガンド成分がリポソームの二重層と結合し 、脂質二重層の外側から突出する によりリポソームの二重層と受動的に結合する、請求項５６記載の方法。 ５８．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ５４記載の方法。 ５９．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項５ ８記載の方法。 ６０．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項５ ９記載の方法。 ６１．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項６ ０記載の方法。 ６２．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６３．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６４．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６５．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６６．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６７．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ６８．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ６９．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ７０．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ７１．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態特性 を改良する方法であって： ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有 結合させて、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油 性化合物からなる複合体を形成し；そして該複合体を患者に投与する ことを含む方法。 ７２．患者においてＶＥＧＦを発現している特異的な予め定めた生物字的ター ゲットに療法薬または診断薬をターゲティングする方法であって： 療法薬または診断薬を、２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガン ドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体と共有結 合させ、そして該複合体を患者に投与する ことを含む方法。 ７３．ＶＥＧＦにより仲介される血菅形成を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７４．腫瘍の増殖を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７５．腫瘍、または該腫瘍の周囲の細胞もしくは組織がＶＥＧＦを発現してい る、請求項７４記載の方法。 ７６．腫瘍、または該腫瘍の周囲の細胞もしくは組織がＶＥＧＦ受容体を発現 している、請求項７４記載の方法。 ７７．腫瘍がカポジ肉腫細胞からなる、請求項７６記載の方法。 ７８．黄斑変性を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７９．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ７８記載の方法。 ８０．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項７ ９記載の方法。 ８１．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項８ ０記載の方法。 ８２．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項８ ０記載の方法。 ８３．複合体が下記の構造を有する、請求項８２記載の方法： ８４．眼適用に際し核酸リガンドの滞留時間を延長する方法であって、非免疫 原性高分子量化合物を核酸リガンドに結合させて複合体を形成し、そして該複合 体を眼に投与することを含む方法。 【図１】【図１】【図１】【図１】【図１】【図１】【図１】【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ０７Ｈ 21/02 // Ｃ０７Ｈ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/22 (31)優先権主張番号 ０８／８９７，３５１ (32)優先日 平成９年７月21日(1997．7．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シュッミット，ポール・ジー アメリカ合衆国コロラド州80544，ニウォ ット，ピーオー・ボックス 1125 (72)発明者 ヴァーギース，チャンドラ アメリカ合衆国コロラド州80233，ソーン トン，イースト・ワンハンドレッドアンド セブンティーンス・アベニュー 5295 (72)発明者 ウィリス，マイケル アメリカ合衆国コロラド州80027，ルイス ビル，ウエスト・ファー・コート 786

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．ＶＥＧＦに対する精製および単離した、天然に存在しないＲＮＡリガンド であって、２’フルオロ(２’Ｆ)一修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡリガンド。 ２．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：）よりなる群から選択され る、請求項１記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ３．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：）よりなる群から選択され るリガンドと実質的に相同であり、かつ実質的に同じＶＥＧＦ結合能を有する、 請求項２記載のＲＮＡリガンド。 ４．リガンドが表２〜６に示した配列（配列番号：）よりなる群から選択され るリガンドと実質的に同じ構造および実質的に同じＶＥＧＦ結合能を有する、請 求項２記載のＲＮＡリガンド。 ５．下記を含む方法： ａ）候補となるＲＮＡ混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し 候補混合物と比較して高い親和性をもつＲＮＡを候補混合物の残りのものから分 配でき； ｂ）これらの高親和性ＲＮＡを候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性ＲＮＡを増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する ＲＮＡにつき濃縮されたＲＮＡ混合物を得て；これによりＶＥＧＦのＲＮＡリガ ンドを調製する により同定された、請求項１記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ６．下記を含む方法： ａ）候補となるＲＮＡ混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し 候補混合物と比較して高い親和性をもつＲＮＡを候補混合物の残りのものから分 配でき； ｂ）これらの高親和性ＲＮＡを候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性ＲＮＡを増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する ＲＮＡにつき濃縮されたＲＮＡ混合物を得て；これによりＶＥＧＦのＲＮＡリガ ンドを調製する により同定された、請求項２記載のＶＥＧＦに対するＲＮＡリガンド。 ７．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性 高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体。 ８．リガンドと非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物との間にさらに リンカーを含む、請求項７記載の複合体。 ９．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項７ 記載の複合体。 １０．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項９ 記載の複合体。 １１．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項１ ０記載の複合体。 １２．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項１ ０記載の複合体。 １３．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １４．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １５．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １６．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １７．複合体が下記のものである、請求項１０記載の複合体： １８．親油性化合物がグリセロール脂質である、請求項７記載の複合体。 １９．親油性化合物が次式の構造を有するグリセロール脂質：［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立して、ＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2 −；ならびにＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−、Ｃ Ｈ3（ＣＨ2）nＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）ＯＣＨ2−、ＣＨ3（ＣＨ2）n （ＣＯ）Ｏ−およびＸ−よりなる群から選択され、その際少なくとも１つはＸ −でなければならず、Ｘは独立して（ＰＯ4）、ＯおよびＣＨ2ＯＣ＝Ｏよりなる 群から選択され、ここでｎ＝０〜３０、好ましくは１０〜２０である］ である、請求項１８記載の複合体。 ２０．グリセロール脂質は、ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−で あるリン脂質である、請求項１９記載の複合体。 ２１．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−であり、Ｒ2がＣＨ3（Ｃ Ｈ2）n−Ｏ（ＰＯ3）−ＣＨ2−であり、かつＲ3がＸ−であり、そしてｎ＝１７ である、請求項２０記載の複合体。 ２２．ＸがＰＯ4である、請求項２１記載の複合体。 ２３．グリセロール脂質は、ＲがＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であ るグリセロールアミド脂質である、請求項１９記載の複合体。 ２４．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2 ）n−ＣＯＮＨ2−ＣＨ2−であり、かつＲ3がＸ−であり、そしてｎ＝１６であ る、請求項２３記載の複合体。 ２５．ＸがＰＯ4である、請求項２４記載の複合体。 ２６．ＸがＯである、請求項２４記載の複合体。 ２７．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）nＯ−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2）nＯＣＨ2−で あり、かつＲ3がＣＨ2Ｏ（ＣＯ）であり、そしてｎ＝１７である、請求項１９記 載の複合体。 ２８．Ｒ1がＣＨ3（ＣＨ2）n（ＣＯ）Ｏ−であり、Ｒ2がＣＨ3（ＣＨ2）n（Ｃ Ｏ）ＯＣＨ2−であり、かつＲ3がＣＨ2Ｏ（ＣＯ）であり、そしてｎ＝１７であ る、請求項１９記載の複合体。 ２９．請求項７記載の複合体を含む脂質構築体。 ３０．請求項１９記載の複合体を含む脂質構築体。 ３１．請求項２０記載の複合体を含む脂質構築体。 ３２．請求項２１記載の複合体を含む脂質構築体。 ３３．請求項２２記載の複合体を含む脂質構築体。 ３４．複合体が下記のものである、請求項３３記載の脂質構築体： ３５．請求項２３記載の複合体を含む脂質構築体。 ３６．請求項２４記載の複合体を含む脂質構築体。 ３７．請求項２５記載の複合体を含む脂質構築体。 ３８．複合体が下記のものである、請求項３７記載の脂質構築体： ３９．請求項２６記載の複合体を含む脂質構築体。 ４０．複合体が下記のものである、請求項３９記載の脂質構築体： ４１．請求項２７記載の複合体を含む脂質構築体。 ４２．複合体が下記のものである、請求項４１記載の脂質構築体： ４３．ＶＥＧＦ核酸リガンドが、候補となる核酸混合物から、下記を含む方法 ： ａ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し候補混合物と 比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配でき； ｂ）これらの高親和性核酸を候補混合物の残りのものから分配し；そして ｃ）これらの高親和性核酸を増幅して、ＶＥＧＦに対し高い親和性を有する核 酸につき濃縮された核酸混合物を得て；これによりＶＥＧＦの核酸リガンドを調 製する により同定された、請求項７記載の複合体。 ４４．該方法がさらに工程ｂ）およびｃ）を反復することを含む、請求項４３ 記載の複合体。 ４５．薬剤学的に有効な量の、２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸 リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体を 投与することを含む、ＶＥＧＦ仲介による疾病または医学的状態を処置する方法 。 ４６．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ４５記載の方法。 ４７．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項４ ６記載の方法。 ４８．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項４ ７記載の方法。 ４９．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項４ ７記載の方法。 ５０．複合体が下記の構造を有する、請求項４９記載の方法： ５１．親油性化合物がグリセロール脂質である、請求項４５記載の方法。 ５２．複合体がさらに脂質構築体と結合している、請求項５１記載の方法。 ５３．複合体が下記の構造を有する、請求項５２記載の方法： ５４．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原 性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体の製造方法であって： ａ）ＶＥＧＦ核酸リガンドを、候補となる核酸混合物から、下記を含む方法で 同定し： ｂ）候補混合物をＶＥＧＦと接触させ、その際、ＶＥＧＦに対し候補混合物 と比較して高い親和性をもつ核酸を候補混合物の残りのものから分配できる； ｃ）これらの高親和性ＶＥＧＦ核酸を候補混合物の残りのものから分配する ； ｅ）これらの高親和性ＶＥＧＦ核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混 合物を得る；そして ｆ）同定されたＶＥＧＦ核酸リガンドを、非免疫原性高分子量化合物または親 油性化合物と結合させる ことを含む方法。 ５５．複合体がさらに脂質構築体と結合している、請求項54記載の方法。 ５６．脂質構築体がリポソームである、請求項５５記載の方法。 ５７．複合体が核酸リガンドおよび親油性化合物からなり、該複合体が下記を 含む工程： ａ）リポソームを形成し；そして ｂ）核酸リガンドおよび親油性化合物からなる複合体を工程ａ）のリポソーム と混合し、これにより複合体の核酸リガンド成分がリポソームの二重層と結合し 、脂質二重層の外側から突出する によりリポソームの二重層と受動的に結合する、請求項５６記載の方法。 ５８．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ５４記載の方法。 ５９．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項５ ８記載の方法。 ６０．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項５ ９記載の方法。 ６１．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項６ ０記載の方法。 ６２．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６３．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６４．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６５．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６６．複合体が下記の構造を有する、請求項６１記載の方法： ６７．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ６８．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ６９．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ７０．複合体が下記のものである、請求項５５記載の方法： ７１．２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドの薬物動態特性 を改良する方法であって： ＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物と共有 結合させて、ＶＥＧＦ核酸リガンドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油 性化合物からなる複合体を形成し；そして該複合体を患者に投与する ことを含む方法。 ７２．患者においてＶＥＧＦを発現している特異的な予め定めた生物学的ター ゲットに療法薬または診断薬をターゲティングする方法であって： 療法薬または診断薬を、２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガン ドおよび非免疫原性高分子量化合物または親油性化合物からなる複合体と共有結 合させ、そして該複合体を患者に投与する ことを含む方法。 ７３．ＶＥＧＦにより仲介される血管形成を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７４．腫瘍の増殖を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７５．腫瘍、または該腫瘍の周囲の細胞もしくは組織がＶＥＧＦを発現してい る、請求項７４記載の方法。 ７６．腫瘍、または該腫瘍の周囲の細胞もしくは組織がＥＧＦ受容体を発現し ている、請求項７４記載の方法。 ７７．腫瘍がカポジ肉腫細胞からなる、請求項７６記載の方法。 ７８．黄斑変性を阻害する方法であって： ２’Ｆ−修飾ヌクレオチドを含むＶＥＧＦ核酸リガンドを非免疫原性高分子量 化合物または親油性化合物に共有結合させて複合体を形成し；そして該複合体を 患者に投与する ことを含む方法。 ７９．非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコールである、請求項 ７８記載の方法。 ８０．ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項７ ９記載の方法。 ８１．ポリエチレングリコールが約１０〜８０Ｋの分子量を有する、請求項８ ０記載の方法。 ８２．ポリエチレングリコールが約２０〜４５Ｋの分子量を有する、請求項８ ０記載の方法。 ８３．複合体が下記の構造を有する、請求項８２記載の方法： ８４．眼適用に際し核酸リガンドの滞留時間を延長する方法であって、非免疫 原性高分子量化合物を核酸リガンドに結合させて複合体を形成し、そして該複合 体を眼に投与することを含む方法。
JP52055398A 1996-10-25 1997-10-17 血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）核酸リガンド複合体 Expired - Lifetime JP3626503B2 (ja)

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