JP2001504685A

JP2001504685A - 糖質エピトープ低減用の改良された核酸

Info

Publication number: JP2001504685A
Application number: JP51018098A
Authority: JP
Inventors: サンドリン，マウロ，セルジオ; マッケンジー，イアン，ファークハー，キャンベル
Original assignee: ザオースティンリサーチインスティテュート
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2001-04-10
Also published as: EP0942963A4; US6399758B1; AUPO182396A0; WO1998007837A1; EP0942963A1; US20020031494A1; CA2264952A1; ZA977573B

Abstract

(57)【要約】本発明は、基質に関し第２の酵素と競合する第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸に関し、これにより第の酵素の産物の形成を低減する。この核酸は、抗原性が低下し移植用に使用できる細胞および組織を産生するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】糖質エピトープ低減用の改良された核酸本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ（glycosyltransferasc）をコード化し、他種のレシピエントへの移植に有用な種の組織や細胞の産生に有用な核酸に関する。特に、移植された組織の細胞に存在すると移植組織の抗体認識水準を低下させる核酸の産生に関する。組織の移植は、外科および他の技術の大いなる進歩によって可能となる。しかしながら移植用の適切なヒト組織の有効率は大きな問題であり、需要が供給を上回る。これが移植用非ヒト組織の利用可能性を研究させる原因となる。異種組織移植（xenotransplantation）は、ある種から異種の被移植者への組織の移植である。この様な場合における移植片の拒絶は、特にブタやヒツジの供与組織をヒトへ移植するように遠縁である場合に大きな問題となる。脈管系組織は、超急性拒絶反応（ＨＡＲ）による特別の困難性を示す。超急性拒絶反応は、抗体がドナーの内皮細部へ結合することでレシピエントの補体カスケードが開始される場合に起こる。超急性拒絶反応を防止する計画は、二つの方法に焦点を当てた。すなわち、補体形成システムの抑制によってホストの免疫システムを改良すること（１、２）、および抗体の枯渇（３、４）である。２つの方法は、一時的に異種移植片の生存の延長を示した。しかしながらこれらの方法は臨床的には実際的でなく、慢性免疫抑制治療を必要とする点で治療的に魅力あるものではない。それゆえ、超急性拒絶反応を抑制する最近の努力は、遺伝学的なドナー異種移植片の改良に焦点が当てられた。この様なある方法は、遺伝子工学によって血管新生ブタ組織中に種制限されたヒト補体抑制性タンパクを高水準に発現させることであった（５〜７）。この方法は、ブタ組織の生存が延長され、次いで抗体と血清が対抗(challen ge)する点で有用であることを証明した。遺伝子導入組織の生存の増加が観察されたが、長期間の移植片生存は達成されなかった（６）。これらの実験および構造的な補体枯渇で観察されるように、組織不全は急性抗体依存性脈管炎に関連するようである（１、５）。異種組織片の脈管内皮細胞表面上に補体活性をブロックすることを目的とする方法に加え、最近は、高力価ヒト自然抗体によって認識された優先種（predomin ant）異種移植片エピトープの同定に焦点が当てられている。これは、ガラクトシル残基末端、Gal-α(1,3)-Galが優性異種移植片エピトープであることを利用するものである（８〜１５）。α(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ(gal- transferase or GT)は旧世界霊長類（Old World primates）とヒトにおいて機能を有しないため、このエピトープはこれらには存在しない。ヒト遺伝子ＤＮＡ配列をマウス（１６、１７）、ウシ（１８）、ブタ（１２）のα(1,3)−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子と比較すると、ヒト遺伝子は２つのコード変異突然変異を有し、このため何等機能を有しない偽遺伝子であることが明らかになった（２０、２１）。その結果、ヒトおよび旧世界霊長類は、ドナー異種移植片エピトープとしてのGal-α(1,3)-Gal分子に対する発現前高力価抗体を有する。異なるグリコシルトランスフェラーゼは同じ基質と競合する。ゆえにα（１，２）−フコシルトランスフェラーゼまたはＨトランスフェラーゼ（ＨＴ）（２２）は、Gal-α(1,3)-Galの発現を抑制する好ましい酵素である。α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼとα（１，３）−ガラクトシルトランスフェザーゼの双方が、Ｎ−アセチルラクトサミンをアクセプター基質として使用するため、フコースまたはガラクトースの転移により各々フルコシル化されたＮ−アセチルラクトサミン（Ｈ基質）またはGal-α(1,3)-Gal を産生する。更に、殆どの動物のα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼはフルコシル化されたＮ−アセチルサクトサミンをガラクトース末端へ転移するアクセプターとして使用することができないが、Ｎ−アセチルラクトサミン残基には転移できる（２３）。我々は、二つのグリコシルトランスフェラーゼ、α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ（Ｈトランスフェラーゼ）とα（１，３）−ガラクトシルトランスフェザーゼの双方の同時発現が、各単糖の等しい合成を導くものでなく、α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼが（１，３）− ガラクトシルトランスフェザーゼ越えて優先され、その結果、Gal-α(1,3)-Gal が殆ど抑制されることを先に報告した（２４）。 α（１，３）−ガラクトシルトランスフェザーゼ（Ｇａｌトランススフェラーゼ）は二タイプの前駆体鎖：タイプ１：Ｇａｌβ（１，３）ＧａｃＮＡｃとタイプ２：Galβ(1,4)GlcNAcをガラクトシル化することができる。更に、これら二つの前駆体は二つのα（１，２）−フコシルトランスフェラーゼによって、Ｈ基質またはフコシル化されたβ−Ｄ−Ｇａｌに転移される（２５、２６）。これら二つのフコシルトランスフェラーゼはＨ−トランスフェラーゼまたはＦＵＴ１（２２）およびセクレター（Ｓｅ）トランスフェラーゼまたはＦＵＴ２である（２７）。一方、両酵素は双方の前駆体を使用することができ、ＦＵＴ１ＨＴは、優先的にタイプ２の前駆体鎖を利用し、ＦＵＴ２は優先的にＩ型を利用する（２８）。本発明の基礎となるこの研究において、発明者等は細胞表面上の不要の糖質エピトープを低減するに有用な核酸の創作を提案した。この核酸は、他種に移植する際に拒絶水準を低減された組織を生産するのに有用である。本発明者等は、驚いたことに、ブタ組織由来のグリコシルトランスフェラーゼが細胞における不要の糖質エピトープを低減するに有用であることを見いだした。この核酸によってコード化された酵素は、不要の糖質エピトープを産生するガラクトシルトランスフェラーゼと効果的に競合できる。この特別の研究において、本発明者らは、ブタ組織のセクレタートランスフェラーゼ（Ｓｅ）遺伝子のクローンを作成し、これが細胞において発現され、これらの細胞中の不要のエピトープレベルを低下することを示した。このセクレタートランスフェラーゼ（secretor transferase）を以後ブタセクレターという。発明の概要第１の概念において、本発明は、該第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞でその核酸が発現される場合に、基質に関し第２のグリコシルトランスファラーゼと競合することができ、該第２のグリコシルトランスフェラーゼからの産物の水準を低下させる、第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化した核酸を提供する。該核酸は、ＤＮＡまたはＲＡＮであり、単鎖または二本鎖でありまたは閉環である。これは、この核酸が好適な活性体と共にグリコシルトランスフェラーゼが産生されることを可能にする機能的遺伝子（またはその一部）をコードするものと解された。好ましくは、この核酸は、単離された形態であり、これは、核酸が少なくとも部分的に他の核酸またはタンパク質から単離されたものであることを意味する。好ましくは、この核酸は発現用、より好ましくは真核細胞における発現用の正確な配列を含有する。この核酸は、何れかの好ましいベヒクル、例えば、ｐｃＤＮＡ(Invitrogen)等の真核細胞発現ベクターに存在する。この核酸は真核細胞であるか否かを問わず、プラスミド、ファージ等の他のベヒクル上に存在してもよい。好ましくは第１のグリコシルトランスフェラーゼは、第２のグリコシルトランスフェラーゼよりも基質親和性が高い酵素であることが好ましい。より好ましくは、第１のグリコシルトランスフェラーゼはＩ型の基質に優先的に利用される。更に好ましくは、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、Ｓｅ（ＦＵＴ２として知られる）であることが好ましい。好ましくは、Ｓｅは、発現されることを意図する細胞と同種に由来し、同種から得られ、または同種に基づくものであることが好ましい。従って、この第１のグリコシルトランスフェラーゼとこの酵素が発現される細胞とは、同種の動物に源を発する。この様な種は、ブタ、新世界ザル、イヌまたは他の適当な種である。このＳｅをコード化する核酸は、天然遺伝子から直接に由来することは必要でない。このＳｅの核酸配列は、ＰＣＲによって製造でき、デノボまたはクローニングで製造できる。より好ましくは、Ｓｅはブタ由来であり、あるいはブタの酵素に基づいたものである。これは、酵素が野生のブタ（native porcine）のＳｅに由来するもの、同質であるもの、あるいは類似することを意味する。より好ましくは、Ｓｅをコードする核酸配列はブタの肝臓のゲノム由来の１. ３ｋｂＤＮＡに基づかれるか、あるいは類似である。より好ましくは、核酸配列は図１に示されるアミノ酸配列をコードする。さらに、より好ましくは、核酸配列は図１に示されるものである。Ｓｅ遺伝子は移植に対して、最初に関心のあるブタ組織に発現されないことは明らかである。このように、Ｓｅは例えば心臓、肝臓、腎臓及び膵臓で発現されない。このように、発明は正常に発現されない組織での遺伝子発現の準備を含む、そこで、発現は結果として、その組織での不要な糖質エピトープのレベルを低減し、その組織からなる器官を移植に対し、より適切にする。第２のグリコシルトランスフェラーゼは、関連のある細胞上に不要の糖質エピトープを産生する酵素であるかもしれない。これは、大抵Ｇａｌトランスフェラーゼ（Gal transferase）であろう。好ましくは、発明の核酸を発現する細胞は真核細胞である。より好ましくは、それは、哺乳動物細胞である。さらにより好ましくは新世界サル細胞である。更に、より好ましくは有蹄動物細胞（ブタ、ヒツジ、ヤギ、雌牛、ウマ、シカ、ラクダ等）あるいはイヌのような他の種からの細胞である。さらに、より好ましくは、細胞はブタの細胞である。関連する概念において、発明は核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞に発現されるとき、第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。その中で、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは一つ以上の基質を利用することができ、結果として、該第２のグリコシルトランスフェラーゼからの産物のレベルを低減する。第１のグリコシルトランスフェラーゼのより重要な基質特異性は、この酵素が基質を望まれる糖類により効率的に変換し、不要の糖質エピトープを産生する第２のグリコシルトランスフェラーゼの能力をより効果的に低減することを意味する。好ましくは、第１のグリコシルトランスフェラーゼはＳｅであり、さらにより好ましくは、Ｓｅは上記に述べられたものである。さらにより好ましくは、第１のグリコシルトランスフェラーゼは第２のグリコシルトランスフェラーゼより、一またはそれ以上の基質により高い親和性を有する。また、本発明は、該発明の核酸により産生された単離されたタンパク質におよぶ。さらにそれは、そのような蛋白質の生物学的にあるいは機能的に活性な断片におよぶ。もう一つの別の概念において、本発明は、該核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞で発現されるとき、基質に対して、第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を産生する方法を提供し、結果として、第２のグリコシルトランスフェラーゼからの産物のレベルを低減し、該方法は、第１のグリコシルトランスフェラーゼの発現を得るために、適切なベクターあるいは他の核酸に第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を実施可能につなげることからなる。当業者は、この核酸を産生する技術に気づくだろう。サンブルック等（Sambro ok）が述べるような標準的な技術が使われる。好ましくは、核酸配列は上記に記載される好ましい配列である。もう一つの別の概念において、発明は細胞表面上に示された糖質のレベルを低減する方法を提供する。該方法は細胞に発現される核酸を導く段階からなり、そこで、核酸は基質に対して、第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする。また、そこで、細胞は糖質を産生することができる第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する。細胞は、上記に記載されるように好ましく適切な細胞である。また、発明は、上記の方法で産生される細胞、及び細胞からなる器官におよぶ。 PCT/US95/07554に開示されたもの、あるいはオースチンリサーチインスチチュートの名において、１９９６年８月２日に出願されたオーストラリア仮出願ＰＯ１４０２に基づく国際出願されたもののように、本発明の核酸は、細胞の表面の不要の糖質の産生を低く制御するもう一つの別の核酸構造物と共に細胞内に存在する。もう一つの別の概念において、本発明は、レシピエントである別の種を免疫学的に受け入れることができる細胞であるドナーのようなある種からの細胞を産生する方法を提供し、レシピエントの種により非自己と認識する該細胞上の糖質のレベルを低減する段階を含む。該方法は、核酸を該細胞上に発現することを含み、該核酸は基質に対して、第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードし、および、細胞は、糖質を産生することができる第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する。この細胞は、上記記載の何れかからなる。好ましくはこの細胞は、新世界霊長類またはブタ由来である。より好ましくは、細胞はブタ由来である。また、本発明は、本発明の核酸を含有する非ヒト遺伝子導入動物におよぶ。もう一つの別の概念において、本発明は、本発明の核酸を発現するレトロウイルスパッケジング細胞あるいはレトロウイルスを含むカセット、レトロウイルスコンストラクトあるいはレトロウイルス産生細胞のような発現ユニットを提供し、結果として、糖質は動物により非自己と認識されるため、その表面上の糖質のレベルを低減するごとにより、免疫学的に動物に許容される。好ましくは、動物はヒトであり、類人猿あるいは旧世界ザルである。レトロウイルスパッケジング細胞あるいはレトロウイルス産生細胞は、より免疫学的に宿主に許容されるために細胞表面上の糖質のレベルを低減することが望まれるあらゆる動物由来の細胞であり得る。そのような細胞はイヌ科の種、齧歯類あるいは反芻動物及びそのような哺乳類から誘導され得る。また、本発明は、キメラ酵素が産生される条件下で本発明の核酸をレトロウイルス産生細胞またはレトロウイルスパッケジング細胞にトランスフォーム／トランスフェクトすることを含む、低減した糖質レベルを細胞表面上に有するレトロウイルスパッキング細胞またはレトロウイルス産生細胞の製造方法を含み、ここにおいて糖質が動物により非自己と認識される。「chimeric enzyme」の用語は、発明の核酸によりコードされた酵素を意味する。「nucleic acid」の用語は、天然のまたは合成プリン及びピリミジンを含む核酸を指す。「originates」、「based on」、または「derived from」の用語は、酵素がその種由来の酵素と同質であるか、あるいは類似であることを意味する。「glycosyltransferase」の用語は、糖質をある分子を他に転移する能力を有するポリペプチドに関与する。「operably linking」の用語は、機能蛋白質が転写及び翻訳できる核酸配列が結合されることを意味する。「reducing the level of a carbohydrate」の用語は、細胞表面上に示された糖質の量を低くし、減少し、あるいは、ある場合には除去することを指す。好ましくは、該糖質は、本発明の第１のグリコシルトランスフェラーゼには存在せず、動物の免疫系による「非自己」としての細胞の認識を刺激することができる。それゆえ、そのような糖質の低減により細胞あるいは該細胞からなる器官は移植状況あるいは遺伝子治療状況において、動物の免疫系から許容されるようになる。「causing a nuelcic acid to be expressed」の用語は、核酸が細胞に誘導され（例えば、形質転換／トランスフェクションあるいは他の適当な方法）、細胞の発現を可能にする適切なシグナルを含むことを意味する。「immunologically acceptable」の用語は、ある種からの野生細胞としての他の種における免疫応答反応を同程度に生じない、多数の細胞から作成された組織または細胞を製造することに関与する。従って、細胞は移植器官のようなものを保持するために低レベルの免疫抑制治療のみを必要とし、免疫応答反応を小さくし得え、あるいは免疫抑制治療は必要でないかもしれない。本発明の核酸は、オースチンリサーチインスチチュート名で、１９９６年８月２日に出願されたオーストラリア仮出願ＰＯ１４０２に基づく出願に開示されたキメラ核酸の産生に有用で有り得ることが予期される。レトロウイルスパッケジング細胞及び／あるいは産生細胞は遺伝子治療の応用に使用され得る。そのような細胞の使用を含む一般的な方法はＰＣＴ／ＵＳ９５／０７５５４に述べられており、及びその点について、参照文献で討論されている。発明の詳細な説明次に、本発明は、以下の非限定的な図面および実施例を参照することによって詳述される。図１は、ブタのセクレター(porcine secretor)の核酸配列および相当するアミノ酸配列を示すものである。それぞれのパネルにおける列は、頂部から底部へ、ブタ、ヒトおよびウサギＦＵＴ２、並びにブタ、ヒトおよびウサギＦＵＴ１を表す。図２は、ブタ、ヒトおよびウサギのグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を示すものである。図３は、α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼを発現するブタ内皮細胞の代表的なＦＡＣＳプロフィールを示すものである。図４は形質導入構築物を注入されたマウスの６匹の子孫におけるα（１，２） −フコシルトランスフェラーゼの存在を示すドットブロットである。以下に示される研究は、本発明者らがヒトのセクレターをクローン化(clone) することを以前試みたが失敗に終わった点で驚くべきことである。セクレターに関する非機能的ヒト偽遺伝子(non-functional human pseudogene)がクローン化された。これは、例えばブタのようなその他の種が、セクレターに関する機能的遺伝子を有しているか否かとの疑問を生じさせるものであった。本発明者らが、ブタのセクレターの遺伝子を成功裡にクローン化することができ、かつこれを不要のエピトープを低く制限するために用いたという事実は驚くべきことである。ブタとヒトとの間の血液型抗原の相違ゆえに、ブタが分泌抗原を有しているか否かは知られていなかった。機能遺伝子(functional gene)のクローニングは、ブタが分泌膠(secretor glue)によって産出されるエピトープを必ず有するものであることを示している。さらにまた、ＦＵＴ１はクローン化されていたものの、単離されるべきブタセクレター遺伝子をもたらすものではなかった。ＦＵＴ１の配列に基づくプローブがＦＵＴ２のそれとハイブリッド化しないという点で、ＦＵＴ１とＦＵＴ２とは顕著に異なるものである。実施例１ブタのセクレターのクローニングクローニングヒトセクレター遺伝子（Ｓｅｃ２）（２７）に関する配列をコード化する遺伝子が、公表された配列、プライマーおよび条件に従い、ＰＣＲ法を用いてヒトゲノムＤＮＡからクローン化された。ＥＭＢＬ−３（クロネテックラボラトリーズ(Clonetech Laboratories，Palo Alto，Ca))のブタゲノム肝臓ライブラリーが、このヒトクローンを用いてスクリーニングされた。５×１０⁵プラークをスクリーニングした後に、９つのクローンが得られた。これらのうちの２つが、更なる実験のために無作為に選出された。限定的な制限地図作製(limited restricti on mapping)は、ヒト（Ｓｅｃ２ α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ）プローブと特異的にハイブリッド化する３．３ｋｂＰｓｔＩフラグメントを有する同一なバンドパターンを、双方のクローンに関して示した。このフラブメント（ＰＳｅ１６．１）は、ＡＢＩ自動シーケンサー(ABI automated sequencer)を用いて配列決定された。機能的研究のため、ゲノミッククローンのコーディングセグメントが発現ベクター中にサブクローニングされた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および上記で得られたブタＳｅ配列を利用して、１０４８ｂｐ遺伝子産物が、プライマー群：５’ＵＴＲ：５’ＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＧＣ（下線を付した配列は非反復ＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む。）に相同する５’ プライマー、および３’ＵＴＲ：５’−５’−ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＡＡＧＧＡＧＴＧＧ（下線を付した配列はＰｓｔＩサイトを含む。）に相同する３’プライマーを用いて誘導された。このＰＣＲ産物は上述したようにして精製され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで切断され、同様に切断されたｐｃＤＮＡ１（インビトロゲンコーポレーション(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)）とつなげられ、ＭＣ１０６１／Ｐ３を形質転換するために用いられた。ｐＰＳｅＴと命名された１つのクローンが、トランスフェクションのために選択された。ブタ α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（１９）に関するｃＤＮＡをコード化するｐＰＧＴ、およびブタ”Ｈ”α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ（３３）に関するｃＤＮＡをコード化するｐＰＨＴもまた用いられた。トランスフェクションＣＯＳ細胞が、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagles Medium)（ＤＭＥＭ）（サイトシステムズパーティリミテッド(Cytos ystems Pty．Ltd.，Castle Hill，NSW，Australia)）において維持された。ＣＯＳ細胞は、Foctal Clone II（ハイクローンユタ(Hy clone Utah)）を追補したＤＭＥＭを用い、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてトランスフェクションされ、４８時間後の細胞が細胞表面発現を調べられた。血清学細胞表面糖質エピトープの直接蛍光染色が、ＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣ接合レクチン類を用いて行われた：グリッフォニア・シンプリシフォリア(Griffonia s implicifolia)より単離されたＩＢ４レクチン（シグマ(Sigma，St．Louis，MO) ）は、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌを検出し、またウレックス・ユーロパエウス(Ulex europaeus)から単離されたＵＥＡＩレクチン（シグマ、およびイーワイラボラトリーズインコーポレーテッド(EY Laboratories Inc.，San Mateo， CA)）が、Ｈ物質(H substance)を検出する。Ｈ物質はまた、ＡＲＩで開発（deve loped）されたＨ−エピトープ(ASH-1952)に対し特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、およびマウス抗体結合を検出するために用いられていたＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ザイムドラボラトリーズ(Zymed Laboratories，San Fra ncisco，CA)）を用いる非直接的免疫蛍光法によっても検知された。エンザイムアッセイ細胞は、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄され、そして１％トリトンＸ１００(Triton X100)／１００ｍＭトリス(Tris)ｐＨ７．０または１％トリトンＸ１００／１００ｍＭカコジル酸ナトリウムｐＨ６．５／２５ｍＭＭｎＣｌ₂のいずれか中で、４℃で３０分間溶解(lyse)され、溶解産物が遠心分離されそして、上澄み液が集められ、−７０℃で貯蔵された。タンパク質濃度が、標準としてウシ血清アルブミンを用いた、ブラッドフォードテスト(B radford test)により測定され、細胞抽出物５〜２０μｇがトランスフェラーゼアッセイ毎に用いられた。α−１，２フコシルトランスフェラーゼに関するアッセイは、細胞抽出物と、５０μｌの５０ｍＭＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルホン酸(3−[N−Morpholino]propanesulphonic acid)）ｐＨ６．５；２０ｍＭＭｎＣｌ₂；５ｍＭＡＴＰ；３μＭＧＤＰ［¹⁴Ｃ］−Ｆｕｃ（特異活性２８７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、アメルシャムインターナショナルピーエルシー(Amersham International plc，Amcrsham，UK)）中のアクセプター（７５ｍＭフェニル−β−Ｄガラクトシド（シグマ））との混合、および３７℃ で２時間のインキュベーションを包含するものであった。反応は、エタノールの添加によって終止され、そしてＳｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（ウォーターズ−ミリポア(Waters-Millipore，Millford，MA)）における分離の後に、取り込まれた¹⁴Ｃ−Ｆｕｃが、液体シンチレーション計数によって測定された。特異的な取り込みの計算を許容するために、全ての場合において、アクセプター分子を添加しない並発反応が行われた。結果ブタＦＵＴ２（Ｓｅ）のクローニングＥＭＢＬ−３（クロネテックラボラトリーズ(Clonetech Labora tories，Palo Alto，Ca)）のブタゲノム肝臓ライブラリーの５×１０⁵プラークを、完全な長さのヒトＦＵＴ２（２７）をコード化するｃＤＮＡフラグメントを用いてスクリーニングした後に、２つのクローンが得られた。限定的な制限地図作製は、ヒトＦＵＴ２プローブと特異的にハイブリッド化する３．３ｋｂＰｓｔＩフラグメントを有する、同一なバンドパターンを双方のクローンに関して示した。このフラグメントは、配列決定されたクローンＰＳｅ１６．１を生成するためにサブクローン化された。ブタＦＵＴ２ＤＮＡの完全ヌクレオチド配列は、１２６９ｂｐのヌクレオチド配列（図１）：８ｂｐの５’非翻訳（ＵＴ）領域、９番目のヌクレオチドである開始コドンを有する３４０個のアミノ酸のタンパク質をコード化する１０６０ｂｐの転写解読枠、およびこれに続く１５６ｂｐの３’ＵＴを含むものである。ブタＦＵＴ２の予測されたタンパク質配列は、その他のグルコシルトランスフェラーゼを代表する、タイプ２の細胞膜内タンパク質を示唆している。予測されたタンパク質の３つの明確な構造的特徴がある：（ｉ）短い（４つのアミノ酸）アミノ末端基細胞質尾部(amino-terminal cytoplas mic tail)；（ｉｉ）荷電アミノ酸残基がいずれかの側面に置かれた、２１個の疎水性アミノ酸（５〜２６番目の残基）からなる推定上の膜内外領域；（ｉｉｉ）３つの潜在的Ｎ−結合グリコシレーションサイト(potential N-linked glycos ylation site)を含む３１４個のアミノ酸のカルボキシル末端領域。ブタＦＵＴ２と、ヒト（２２，２７）およびウサギ（２９）α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼとの比較は、ＨトランスフェラーゼよりもＳｅトランスフェラーゼと高い同一性を示す（図２）：ブタＦＵＴ２は、ヒトＦＵＴ２と８３．２％の同一性を示し、ウサギＦＵＴ２と７４．１％の同一性を示し、ブタＦＵＴ１と５８．５％の同一性を示し、ヒトＦＵＴ１と５７．１％の同一性を示し、そしてウサギＦＵＴ１と５８．８％の同一性を示す。我々は、最高の配列同一性が、触媒領域(catalytic domain)（３０）を含む、分子のカルボキシル部位に存在していることに留意している。ブタＦＵＴ２ヌクレオチド配列は、ヒトＦＵＴ１と約３６％の相同性(humolog y)を有する。ブタＦＵＴ２をトランスフェクトした後のＨ物質の発現このコーディング配列を含む１．３ｋｂのＰｓｔＩフラグメントが、ＣＯＳ細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ（インビトロゲンコーポレーション(Invitorogen Corporation，SanDicgo，CA)）でサブクローンニングされた。ブタＦＵＴ２をコード化するクローン化ゲノミックＤＮＡをトランスフェクトされたＣＯＳ細胞は、Ｈ物質（３１）を検知するフルオレセイン化ＵＥＡＩレクチンの染色で示されるようにＨ物質を発現した（表１に示すように約６５％陽性）。ブタＦＵＴ１ｃＤＮＡクローンでのトランスフェクションの後に、同様の染色が観察されたが、ブタα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ（１９）に関するｃＤＮＡをトランスフェクションされたＣＯＳ細胞上における該試薬での染色は見られなかった。対照的に、Ｇａｌα（１，３）Ｇａｌ（３２）を検知するフルオレセイン化ＩＢ４レクチンでの染色は、ブタα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼをトランスフェクションされたＣＯＳ細胞において検出されたが、ブタＦＵＴ１またはＦＵＴ２ＤＮＡをトランスフェクションされたＣＯＳ細胞においては検出されなかった。表１トランスフェクションされたＣＯＳ細胞の細胞表面染色１．用いられたブタＦＵＴ１、ＦＵＴ２およびＧＴをコード化するｃＤＮＡ酵素的研究ｐＦＵＴ２及びｐＦＵＴ１でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から調製された細胞溶解産物について、α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ活性を検定した。モックでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞を用いて基準活性（１．１ナノモル／時間／ｍｇ）を示すことにより、有意なα（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ活性がｐＦＵＴ２（１５１．１ナノモル／時間／ｍｇ）及びｐＦＵＴ１（１４０．０ナノモル／時間／ｍｇ）でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞双方由来の溶解産物において観察されたが、ｐｐＧＴでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞（６．７ナノモル／時間／ｍｇ）では観察されなかった。これらの溶解産物において測定された酵素活性は、実施例２で示されるように細胞表面上のＨ物質の発現を反映する。ＣＯＳ細胞のコトランスフェクション(cotransfection) ブタのα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡクローンでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞は、ＩＢ４レクチンとの反応性によって示される際にＧａｌ−α（１，３）−Ｇａｌを発現した（細胞の６５％が反応性あり）（表１）。ＣＯＳ細胞はまた、ブタのＦＵＴ２またはＦＵＴ１クローンのいずれかによるトランスフェクション後にＵＡＥＩレクチンで染色される際に、Ｈ物質を発現することもできた（それぞれ、６８及び７５％の細胞が反応性あり）（表１）。しかしながら、ＣＯＳ細胞をブタのα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡクローン及びブタのＦＵＴ２またはブタのＦＵＴ１のいずれかで同時にトランスフェクションし、いずれかの炭水化物の細胞表面染色に関して調べたところ、細胞は、細胞の８％がＧａｌα（１，３）−Ｇａｌを発現（表１）したのに比べると、顕著にＨ物質を発現した（細胞の７２％が陽性、表１）。ブタのＦＵＴ２及びブタのＦＵＴ１双方をブタのα（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼｃＤＮＡと共にコトランスフェクションさせると、一Ｈ物質のみが検出され（７６％）、Ｇａｌα（１，３）−Ｇａｌは＜１％であった（表１）。ＦＵＴ１またはＦＵＴ２いずれかのみについて２倍量のＤＮＡを使用してもＧａｌα（１，３）−Ｇａｌの発現には何等効果がなかったため、ＦＵＴ１及びＦＵＴ２を用いて観察されたこのような低減は特異的であり、トランスフェクションに使用されるＤＮＡの量によるものではなかった。したがって、ＦＵＴ２及びＦＵＴ１双方の発現によって、Ｇａｌα（１，３）−Ｇａｌの発現が大きく低減した。実施例２酵素の動態ｐＦＵＴ２（ブタのＳｅ）、ｐＦＵＴ１（ブタのＨトランスフェラーゼ）で、またはベクターのみで実施例１で記載されるのと同様にしてトランスフェクションされたＣＯＳ細胞から調製された細胞溶解産物について、α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ活性を検定し、動態値(kinetic value)を算出した。ｐＦＵＴ１、及びｐＦＵＴ２について得られたＫｍ値（基質に対する親和性を反映）を表２に示す。これらの値は、既に報告されたヒト及びウサギの同族体の値と一致した。様々な基質を用いてｐＦＵＴ１、及びｐＦＵＴ２に関して得られた代表的なＫｍ値は下記のとおりである：（ａ）Ｇａｌβ（１，３）ＧｌｃＮＡｃ（Ｉ型）：ｐＦＵＴ１では６．０ｍＭおよびｐＦＵＴ２では１．３ｍＭ。ウサギのＦＵＴ１及びウサギのＦＵＴ２で報告されたＫｍ値は、それぞれ、３．１ｍＭ及び１．５ｍＭ（３４）であり、ヒトのＦＵＴ１及びヒトのＦＵＴ２では、それぞれ、２ｍＭ及び１ｍＭ（３５）であった。（ｂ）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃ（ＩＩ型）：ｐＦＵＴ１では３．７ｍＭおよびｐＦＵＴ２では４．４ｍＭ。ウサギのＦＵＴ１及びウサギのＦＵＴ２で報告されたＫｍ値は、それぞれ、４．２ｍＭ及び６．７ｍＭ（３４）であり、ヒトのＦＵＴ１及びヒトのＦＵＴ２では、それぞれ、１．９ｍＭ及び５．７ｍＭ（３７）であった。（ｃ）Ｇａｌβ（１，３）ＧａｌＮＡｃ（ＩＩＩ型）：ｐＦＵＴ１では１４ｍＭおよびｐＦＵＴ２では０．２ｍＭ。ウサギのＦＵＴ１及びウサギのＦＵＴ２で報告されたＫｍ値は、それぞれ、５．８ｍＭ及び１ｍＭ（３４）であった。（ｄ）Ｇａｌβ（１，４）Ｇａｌ：ｐＦＵＴ１およびｐＦＵＴ２で、それぞれ、４．２ｍＭおよび１．５ｍＭ。（ｅ）Ｇａｌβ（１，４）Ｇｌｃ：ｐＦＵＴ１およびｐＦＵＴ２で、それぞれ、１．９ｍＭおよび７．４ｍＭ。したがって、ｐＦＵＴ１は、基質選択性(preference)に基づいてｐＦＵＴ２と区別できる；ｐＦＵＴ１はＩＩ型及びＩＶ型の基質に対して比較的特異的であるが、ｐＦＵＴ２（および他のセクレター同族体）は、Ｉ型及びＩＩＩ型のアクセプターに対してより大きな親和性を有するものの、他の基質を使用するであろう。表２ｐＦＵＴ１及びｐＦＵＴ２の酵素動態様々な基質を用いて得られた、ブタのα（１，２）−フコシルトランスフェラーゼ、ｐＦＵＴ１（Ｈ型）及びｐＦＵＴ２（セクレター型）の見かけのＫｍ実施例３キメラα（１，２）−フコシルトランスフェラーゼを発現するブタの内皮細胞の形成セクレター型α（１，２）−フコシルトランスフェラーゼを発現するブタの内皮細胞系ＰＩＥＣは、ｐＦＵＴ２プラスミドＤＮＡ（２０μｇ）及びｐＳＶ２ＮＥＯ（２μｇ）をリポフェクタミン(lipofectamine)でトランスフェクションすることによって産生された。安定した組み込みを有する細胞を、トランスフェクションされたＰＩＥＣをＧ４１８（５００ｕｇ／ｍｌ；ギブコービーアールエル (Gibco-BRL)、ガイザースブルグ、エムデイー(Gaithersburg，MD)）を含む培地中で生育させることによって選択した。１４個の独立したクローンを、ＵＥＡ−１レクチンによる染色によってＨ物質の細胞表面での発現について調べた。それぞれの上記クローンの９５％超の細胞が陽性であることが分かった：図３は、これらのクローンについて得られた代表的なＦＡＣＳプロフィールを示すものである。実施例４形質転換構築物の製造、精製およびマイクロインジェクション全長のｐＦＵＴ２をコード化する、１０２３ｂｐのＮｒｕＩ／ＮｏｔｌＤＮＡフラグメントを、下記プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応及びｐｈＨＴプラスミド（３６）を利用して形成した：５’ＵＴＲに相同する５’プライマー： 5'−CATGCGGCCGCTCAGTGCTTAAGGAGTGGGGAC−3' 下線が付された配列は単一のＮｒｕＩ部位を含む；３’ＵＴＲに相同する３’プライマー： 5'−GAGTCGCGAATGCTCAGCATGCAGGCATCTTTC−3' 下線が付された配列はＮｏｔＩ部位を含む。このＤＮＡを、電気溶出する前にゲルで精製し、ＮｒｕＩ／ＮｏｔＩで切断されたゲノムＨ−２Ｋ^bを含むベクター（３８）中にサブクローニングすることによって、マウスのＨ−２Ｋ^b遺伝子のエクソン１中に同方向に(directionally)クローニングされたｐＦＵＴ２遺伝子をコード化するプラスミドクローン（ｐＨ− ２Ｋ^b−ｐＦＵＴ２）を得た。これは、Ｈ−２Ｋ^b転写開始部位で始まり、ｐＦＵＴ２ｃＤＮＡ挿入物を通して連続する転写産物を産生した。この構築物は、翻訳がｐＦＵＴ２ｃＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）で始まり、かつ１０２３ｂｐ下流の停止コドン（ＴＧＡ）で終結するように操作された。マイクロインジェクション用のＤＮＡを、ｐＨ−２Ｋ^b−ｐＦＵＴ２をＸｈｏＩで消化し、Ｈ−２Ｋ^b−ｐＦＵＴ２ＤＮＡをアガロースゲルでの電気泳動分離によってベクターから精製した後、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿してＤＮＡを除染することによって、調製した。注入を、２〜５ｎｇ／μｌの濃度で（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＳＪＬ）Ｆ₁接合体の前核膜に行った後、これらの接合体を偽妊娠（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＳＪＬ）Ｆ₁メスに移入した。トランスジーンのスクリーニング生きた子孫におけるトランスジーンの存在をドットブロッティングによって検出した。５μｇのゲノムＤＮＡをナイロンフィルターに転移し、６８℃で０．１ ×ＳＳＣ／１％ＳＤＳを含む最終洗浄液を用いて、ｐＦＵＴ２由来の挿入物とハイブリッド形成させた。図４は、１６匹の生きた子孫の試験結果を示すものであり、これらのうち６匹がゲノム中に組み込まれた形質転換構築物を有することが分かった。形質転換タンパク質の発現を血球凝集及びフコシルトランスフェラーゼ活性によって調べる。本発明を明らかにするため及び理解するためにやや詳細に説明してきたが、本明細書中に開示される発明の概念の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された実施態様及び方法に対して様々な修飾及び変更がなされることは当業者には明らかであろう。本明細書中に引き合いに出された引用文献を以下の頁で列挙し、上記引用により本明細書中に取り入れる。引用文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年７月２日（１９９８．７．２）【補正内容】請求の範囲１．第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸であって、第２のグリコシルトランスフェラーゼより高親和性を有しＩ型の基質に利用でき、これにより該核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞で発現される場合に、第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質に関して競合し、結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである核酸。２．該第１のグリコシルトランスフェラーゼはＳｅ（ＦＵＴ２）である請求項１記載の核酸。３．Ｓｅをコード化する核酸配列は、ブタゲノム肝臓由来の１．３ｋｂＤＮＡ断片を基礎とするかそれに類似するものである請求項２記載の核酸。４．図１に示されるアミノ酸配列をコード化する請求項３記載の核酸。５．図１に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載の核酸。６．該第２のグリコシルトランスフェラーゼは細胞上の不要な糖質エピトープを産生する酵素である請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸。７．該第２のグリコシルトランスフェラーゼはＧａｌトランスフェラーゼである請求項６記載の核酸。８．該第１のグリコシルトランスフェラーゼおよび／または該細胞は、霊長類、有蹄類およびイヌからなる群より選ばれた哺乳動物に由来するものである請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸。９．哺乳動物はブタである請求項１〜８の何れか１項に記載の核酸。１０．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、一つ以上の基質を利用することができ結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである請求項１〜９の何れか１項に記載の核酸。１１．第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞で発現したとき該第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸であって、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは一つ以上の基質を利用でき結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである核酸。１２．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、一つまたはそれ以上の基質に対し、該第２のグリコシルトランスフェラーゼより高い親和性を有するものである請求項１１記載の核酸。１３．該第１のグリコシルトランスフェラーゼはＳｅである請求項１２記載の核酸。１４．請求項１〜１３の何れか１項に記載の核酸からなり、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ、プラスミドおよびファージからなる群より選ばれたベクター。１５．該核酸を原核生物または真核生物で発現可能にする請求項１４記載のベクター。１６．請求項１〜１３の何れか１項に記載の核酸の発現により産生された分離蛋白質またはその機能的活性断片。１７．グリコシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子を該遺伝子が正常に発現しない組織内で発現させる方法であって、該組織の細胞内に該遺伝子を導入し、それによって発現が該組織内で低減された水準の不要な糖質エピトープを生じ該組織から構成された器官を移植に適したものにすることからなる方法。１８．該遺伝子はＳｅ遺伝子であり、該組織はブタの心臓、肝臓、腎臓および膵臓からなる群より選ばれたものである請求項１７記載の方法。１９．第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸の製造方法であって、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、該核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞内で発現したとき該第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することができ結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものであり、該製造方法は、該第１のグリコシルトランスフェラーゼの発現を得るために第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸配列をベクターまたは核酸に操作可能に結合することからなる方法。２０．細胞の表面に表われた糖質の水準を低減させる方法であって、該方法は、核酸を該細胞内で発現させることからなり、該核酸は、第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化するものであり、該細胞は、該糖質を産生することができる該第２のグリコシルトランスフェラーゼを産出するものである方法。２１．請求項２０記載の方法により産生された細胞または器官。２２．さらに該細胞の表面上の不要の糖質の産生をも抑制する核酸構造を含有する請求項１〜１３の何れか１項に記載の核酸。２３．受容体種に非自己と認識される細胞上の糖質の水準を低減させることからなる、受容体種に免疫学的に受容可能な細胞をドナー種から産出する方法であって、該方法は核酸を該細胞内で発現させることからなり、該核酸は第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することのできる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化するものであり、該細胞は該糖質を産生することのできる該第２のグリコシルトランスフェラーゼを産出するものである方法。２４．請求項１〜１３の何れか１項に記載の核酸からなる非ヒト遺伝子導入動物。２５．細胞の表面上に低減された水準の糖質を有し該糖質が動物に非自己と認識される結果として、動物に免疫学的に受容可能な細胞を生ずるものである請求項１〜１３記載の核酸を発現する発現ユニット。２６．レトロウイルスパッケジング細胞、レトロウイルスパッケージングカセット、レトロウイルス構造およびレトロウイルス産生細胞からなる群より選ばれる請求項２５記載の発現ユニット。２７．細胞表面上に低減された水準の糖質を有し該糖質が動物に非自己と認識されるものである請求項２６記載のレトロウイルスパッケジング細胞またはレトロウイルス産生細胞の製造方法であって、核酸によりコード化されたキメラ酵素が産生される条件下で該細胞を請求項１〜１３の何れか１項に記載の核酸に形質変換または形質移入することからなる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マッケンジー，イアン，ファークハー，キャンベルオーストラリア国，ビクトリア州 3056, ブルンスウィック，ブルンスウィックロード 359

Claims

【特許請求の範囲】１．第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸であって、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、該核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞で発現したとき該第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することができ結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである核酸。２．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、該第２のグリコシルトランスフェラーゼよりも高い基質親和性を有する酵素である請求項１記載の核酸。３．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、タイプ１の基質を優先的に利用するものである請求項１または２記載の核酸。４．該第１のグリコシルトランスフェラーゼはＳｅ（ＦＵＴ２）である請求項３記載の核酸。５．Ｓｅをコード化する核酸配列は、ブタゲノム肝臓由来の１．３ｋｂＤＮＡ断片を基礎とするかそれに類似するものである請求項４記載の核酸。６．図１に示されるアミノ酸配列をコード化する請求項５記載の核酸。７．図１に示されるアミノ酸配列を有する請求項６記載の核酸。８．該第２のグリコシルトランスフェラーゼは細胞上の不要な糖質エピトープを産生する酵素である請求項１〜７の何れか１項に記載の核酸。９．該第２のグリコシルトランスフェラーゼはＧａｌトランスフェラーゼである請求項８記載の核酸。１０．該第１のグリコシルトランスフェラーゼおよび／または該細胞は、霊長類、有蹄類およびイヌからなる群より選ばれた哺乳動物に由来するものである請求項１〜９の何れか１項に記載の核酸。１１．哺乳動物はブタである請求項１〜１０の何れか１項に記載の核酸。１２．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、一つ以上の基質を利用することができ結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである請求項１〜１１の何れか１項に記載の核酸。１３．第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞で発現したとき該第２のグリコシルトランスフェラーゼと競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸であって、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは一つ以上の基質を利用でき結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものである核酸。１４．該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、一つまたはそれ以上の基質に対し、該第２のグリコシルトランスフェラーゼより高い親和性を有するものである請求項１３記載の核酸。１５．該第１のグリコシルトランスフェラーゼはＳｅである請求項１４記載の核酸。１６．請求項１〜１５の何れか１項に記載の核酸からなり、発現ベクター、ｐｃＤＮＡ、プラスミドおよびファージからなる群より選ばれたベクター。１７．該核酸を原核生物または真核生物で発現可能にする請求項１６記載のベクター。１８．請求項１〜１５の何れか１項に記載の核酸の発現により産生された分離蛋白質またはその機能的活性断片。１９．グリコシルトランスフェラーゼをコード化する遺伝子を該遺伝子が正常に発現しない組織内で発現させる方法であって、該組織の細胞内に該遺伝子を導入し、それによって発現が該組織内で低減された水準の不要な糖質エピトープを生じ該組織から構成された器官を移植に適したものにすることからなる方法。２０．該遺伝子はＳｅ遺伝子であり、該組織はブタの心臓、肝臓、腎臓および膵臓からなる群より選ばれたものである請求項１９記載の方法。２１．第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化する核酸の製造方法であって、該第１のグリコシルトランスフェラーゼは、該核酸が第２のグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞内で発現したとき該第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することができ結果として該第２のグリコシルトランスフェラーゼから低減された水準の産生物を生じるものであり、該製造方法は、該第１のグリコシルトランスフェラーゼの発現を得るために第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化ずる核酸配列をベクターまたは核酸に操作可能に結合することからなる方法。２２．細胞の表面に表われた糖質の水準を低減させる方法であって、該方法は、核酸を該細胞内で発現させることからなり、該核酸は、第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することができる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化するものであり、該細胞は、該糖質を産生することができる該第２のグリコシルトランスフェラーゼを産出するものである方法。２３．請求項２２記載の方法により産生された細胞または器官。２４．さらに該細胞の表面上の不要の糖質の産生をも抑制する核酸構造を含有する請求項１〜１５の何れか１項に記載の核酸。２５．受容体種に非自己と認識される細胞上の糖質の水準を低減させることからなる、受容体種に免疫学的に受容可能な細胞をドナー種から産出する方法であって、該方法は核酸を該細胞内で発現させることからなり、該核酸は第２のグリコシルトランスフェラーゼと基質を競合することのできる第１のグリコシルトランスフェラーゼをコード化するものであり、該細胞は該糖質を産生することのできる該第２のグリコシルトランスフェラーゼを産出するものである方法。２６．請求項１〜１５の何れか１項に記載の核酸からなる非ヒト遺伝子導入動物。２７．細胞の表面上に低減された水準の糖質を有し該糖質が動物に非自己と認識される結果として、動物に免疫学的に受容可能な細胞を生ずるものである請求項１〜１５記載の核酸を発現する発現ユニット。２８．レトロウイルスパッケジング細胞、レトロウイルスパッケージングカセット、レトロウイルス構造およびレトロウイルス産生細胞からなる群より選ばれる請求項２７記載の発現ユニット。２９．細胞表面上に低減された水準の糖質を有し該糖質が動物に非自己と認識されるものである請求項２８記載のレトロウイルスパッケジング細胞またはレトロウイルス産生細胞の製造方法であつて、核酸によりコード化されたキメラ酵素が産生される条件下で該細胞を請求項１〜１５の何れか１項に記載の核酸に形質変換または形質移入することからなる方法。