JP2001504488A

JP2001504488A - 虚血損傷の予防および治療方法

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Publication number: JP2001504488A
Application number: JP52376498A
Authority: JP
Inventors: シンプキンス、ジェームズ・ダブリュー
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・フロリダ・リサーチ・ファンデーション・インコーポレーテッド
Priority date: 1996-11-15
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2001-04-03
Also published as: EP0942736A1; ATE287717T1; CA2271273A1; US5877169A; EP0942736B1; WO1998022113A1; DE69732367D1; KR20000053321A

Abstract

(57)【要約】個体において虚血フォーカスに付随する細胞集団に細胞保護を与えるためにエストロゲン化合物を用いる方法を提供する。エストロゲン化合物は、細胞保護を与えるために虚血事象に近い時間に個体に投与することができる。エストロゲン化合物は、例えば脳血管疾患、クモ膜下出血、心筋梗塞、外科手術および外傷から生じるような虚血事象を処置するために用いることができる。エストロゲン化合物の例としてはα−アイソマーおよびβ−アイソマーが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】虚血損傷の予防および治療方法技術分野本発明は、保護しなければ虚血事象の結果として死ぬであろう細胞の保護に関する。背景技術虚血は、酸化血液を供給する血管の狭窄または遮断により引き起こされる、身体の部分への不適切な酸化血液の流れに付随する急性状態である。虚血は、組織への血流が臨界的レベルを下回る時に起こる。この血流の減少は、（ｉ）塞栓（凝血塊）による血管の遮断；(ii)アテローム性動脈硬化症による血管の遮断；（ iii）血管の破壊(出血発作)；(iv)血管痙攣の間に（そしておそらく一過性虚血発作（ＴＩＡ）およびその後のクモ膜下出血の間に）起こるもののような血管収縮による血管の遮断、の結果として起こり得る。虚血が起こる条件としては、さらに、（ｉ）心筋梗塞の間(心臓が停止したとき、器官への血流が減少し、虚血がもたらされる)；(ii)外傷；および（iii）心臓および神経の外科手術の間(外科手術の目的を達成するために、血流を減少させるか、停止させる必要がある) 、が挙げられる。虚血事象が起こる場合、虚血部位から生じる障害の漸次移行がある。血流制限の部位にある細胞は、壊死を起こし、病変のコアを形成する。そのコアの周囲に、半影（penumbra）が形成され、ここでは、障害は直ちに致死的ではないが、ゆっくりと細胞死に向かって進行する。この細胞死への進行は、虚血事象から短時間内の血流の再確立により逆行させ得る。病変の虚血（フォーカス虚血；focalischemia）は、脳血管疾患(卒中、発作； stroke)、クモ膜下出血(ＳＡＨ)、および外傷にわたる。卒中は、米国において第３位の死因であり、１年あたり５００,０００例を超える症例があり、そのうち年間１５０,０００人が死亡している。発作後の後遺症は、死亡および消耗性慢性神経合併症があり、これは、現在予防および治療が利用可能でない神経損傷によりもたらされる。発作後、コア領域は、細胞死の兆候を示すが、半影内の細胞は、機能不全ながらもなお生存し、数日のうちに壊死性のコアに類似する。半影内のニューロンは、地域的な血流に関して段階的な様式で機能不全になるようである。血流が涸渇するにしたがって、ニューロンは、電気的に静止状態に低下し、そのイオン勾配は崩壊し、細胞は脱分極し、その後細胞は死ぬ。脳の毛細血管の内皮細胞は、膨張し、毛細血管の内径が減少する。これらの事象に付随して、脳血液関門が破壊されるように見え、炎症応答がその後に続き、それがさらに血流および細胞の酸素へのアクセスを妨害する。ニューロンに対する発作の影響は、酸素の欠乏に付随するエネルギー源の涸渇からもたらされ、これが電気的シグナルおよび神経伝達物質の放出に関与する非常に重要なイオンポンプを破壊する。ナトリウム、塩素、水素、およびカルシウムイオンを細胞の外へ運び、カリウムイオンを細胞内へ運ぶ能動輸送を通じたイオン勾配を維持するためのＡＴＰ依存性イオン特異的ポンプの障害は、一連の不都合な生化学的事象をもたらす。例えば、細胞内カルシウムイオンレベルの増大は、（ｉ）脂質およびタンパク質に広範に損傷を与えるフリーラジカルの生成；（ii）Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソザゾレプロプリオン酸（ＡＭＰＡ）シナプスグルタミン酸レセプターのようなカルシウム感受性レセプターの破壊；(iii)イオンの異常な蓄積の結果としての水による細胞の膨張；および（iv）細胞内ｐＨの低減、をもたらす。細胞内での代謝の変化は、さらに、エネルギー源が涸渇するにつれて細胞内のイオンの蓄積をもたらす。例えば、乳酸を生成する嫌気的解糖が、ミトコンドリアにおける正常な好気的解糖経路に置き換わる。これは、細胞におけるさらなるカルシウムイオンの蓄積をもたらすアシドーシスを起こさせる。虚血（発作を含む）の出現の頻度にも拘らず、そして患者についての結果の深刻な性質にも拘らず、これらの状態の処置は、つかまえどころがないことがわかっていた。半影の細胞の変性を救済するために採用されてきた２つの基本的なアプローチがある。第一の、現在までのところ最も効果的なアプローチは、細胞への血流を制限する血管遮断物の迅速な除去をもたらす凝血塊溶解剤の同定である。組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）は、血栓発作において虚血を引き起こす凝血塊を溶解するための用途について連邦食品局（ＦＤＡ）により承認されている。それにも拘らず、ＴＰＡの使用には不都合な副作用が伴う。例えば、ＴＰＡ処置による凝血塊の分解の結果は、虚血により引き起こされた血管損傷によりもたらされる脳出血である。酸素が涸渇した変性しつつある細胞を処置するための第二の基本的なアプローチは、付随するエネルギー欠乏により蓄積する損傷から細胞を保護することである。この目的のために、グルタメートアンタゴニストおよびカルシウムチャンネルアンタゴニストが最も充分に研究されている。これらのいずれもが、実質的に効果的であることが証明されていないが、これらは、いまなお初期の臨床開発の段階にある。ＴＰＡ以外のいずれの処置も、卒中について現在承認されていない。フォーカス脳虚血の病理生理学および処置は、B.K.Seisjo 1992,J.Neurosurgery 77，169-184および337-354により総括されている。 Seisjo（1992）により記載された薬剤開発の標的に加えて、疫病学的研究により、エストロゲンおよびプロゲステロンを用いるホルモン置換療法を受けている女性は、心臓疾患の発病および重症度が軽減することが示されている。この相関は、さらに卒中についても研究され、混合した結果が得られている。Stampferら（New England Journal of Medicine 325,p.756）により報告された、４８,０００人の女性についての１０年間にわたる疫学的研究は、エストロゲンの使用と心臓冠状血管疾患の発病の減少との間には相関があったが、卒中の発病の減少は観察されなかった、と結論した。これとは対照的に、エストロゲンが動脈硬化および心筋梗塞のリスクを低減するか否かという質問に向けられた１００の論文を総説したWren（The Medical Journal of Australia，1992,vol.157,p.204）による報告は、ホルモン置換療法におけるエストロゲンは、心筋梗塞および卒中の発病を有意に低減させる、そしてこれは血管壁の部位で達成されている可能性がある、と結論した。この結論は、FalkebornらのArch．Intern．Med．vol．153，1201 (1993)により、さらに支持された。エストロゲン置換療法と卒中の発病との間の上述の相関は、疫学的データのみに依存する。これらの結論を解釈または支持するために、生化学的データはまったく解析されなかった。そのうえ、これらの研究は、長期のホルモン置換療法を受けている患者に限られていた。卒中の少し前に、その間に、またはその後に、初めてエストロゲンを投与された可能性がある患者に関しては、まったく研究が行われなかった。そのうえ、これらの研究は、エストロゲン置換療法において用いられるエストロゲン類に限られていた。男性を処置するために用いられ得る、性関連でないエストロゲン類に関しては、まったく研究が行われなかった。ステロイドの神経保護効果に関して研究が行われ、そのような研究において、例えばグルココルチコイドは脊髄損傷を減少させることにおいて陽性の効果を有するが、海馬の神経変性に対しては陰性の効果を有することが見出された。例えば、Hall〔J.Neurosurg.vol．76，13-22(1992)〕は、酸素フリーラジカル誘発性脂質過酸化反応の阻害に関与すると信じられているグルココルチコイドステロイド、メチルプレドニゾロンは、損傷後８時間以内に開始する集中的２４時間静脈内法において投与した場合、脊髄損傷を有する患者の６ケ月回復を改善し得ることを記した。しかし、このステロイドを海馬ニューロンの神経壊死の選択的保護について調べた場合、グルココルチコイドステロイド投薬によって海馬ニューロンの喪失が有意に悪化したことが見出され、このホルモンは急性脳虚血の処置のためには好適ではないことが示唆された。Hallは、２１ヒドロキシル官能基の代わりの非グルココルチコイドステロイド上の複合アミンの置換により、脂質抗酸化剤活性の増強がもたらされることを報告した。虚血事象の処置または脳のニューロンの神経保護におけるこの分子の挙動に関しては、まったくデータは提供されなかった。さらに、フリーラジカル掃去活性が、置換された２１ヒドロキシル官能基を有する別の非グルココルチコイドステロイドであるラザロイドについて報告されているが、現在まで、この化合物が卒中または他の形態の虚血の処置について有意に効果的であるという証拠はない。卒中および他の形態の虚血を起こし得る男性および女性に安全に予防的に投与してもよい、そしてさらに虚血事象により開始される進行性の変性から細胞を保護するために虚血が起こった後に用いてもよい、このような状態の効果的な処置に対する必要性がある。発明の概要本発明は、上述の必要性を満足するものである。エストロゲン化合物を用いる虚血損傷の予防および処置のための新規な方法を提供する。本発明の好ましい態様は、エストロゲン化合物を用意する工程；および少なくとも１用量を含むコースにわたってのその化合物の有効累積量を、細胞集団に保護を与えるように、虚血事象に有効に近接した時間内に投与する工程を含む、虚血事象の後の個体において、虚血フォーカスに付随する細胞集団に対し保護を与える方法を提供する。さらなる態様は、虚血事象に先立ってエストロゲンの有効用量を投与するための近い時間を選択することを含む。あるいは、エストロゲンは、虚血事象後の有効に近い時間内に投与してもよい。本発明の方法は、脳血管疾患、クモ膜下出血、心筋梗塞、外科手術、および外傷のいずれに適用してもよい。特に、虚血事象が卒中である場合には、保護される細胞としてはニューロンおよび内皮細胞の少なくとも１つを含む。本発明の方法は、経口、頬、直腸、筋内、経皮、静脈内、または皮下デリバリー経路の手段により、エストロゲンを投与する工程を含み、さらに、エストロゲン化学デリバリー系またはシラスティック(silastic)・ペレットにより例示される持続的制御放出手段を含んでいてもよい。本発明の方法は、エストロゲン化合物のα−アイソマーおよびβ−アイソマーを含むエストロゲン化合物を用いる。異なるアイソマーの例は、エストロゲン化合物が１７α−エストラジオールおよび１７β−エストラジオールからなる群から選択される場合に提供される。本発明の好ましい態様においては、虚血事象の間またはその後に変性から個体中の細胞を保護する方法が提供される。本発明の方法の工程は、虚血を起こし得る患者を同定し、虚血事象の前に有効量の性関連でないエストロゲン化合物を提供し、そしてそうしない場合にそのエストロゲン化合物の不在下で起こる変性から細胞を保護する工程を含む。本発明のさらなる態様においては、個体において卒中を処置する方法が提供される。その方法は、医薬中の有効量のエストロゲン化合物を用意し、その製剤を卒中の悪影響を軽減するために個体に投与する工程を含む。本発明者らは、エストロゲン化合物が、個体において細胞集団中のニューロンを保護し得、米国特許第５,５５４,６０１号にしたがって神経変性性障害を処置するために用い得ることを示した。上記の特許は、参照により本明細書に援用する。図面のリスト本発明のこれらのおよび他の特徴、側面および利点は、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および付随する図面を参照することにより、よりよく理解される。図面については以下のとおりである。図１は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により誘発した虚血の２４時間前に開始した１７β−エストラジオールでの卵巣摘出ラットの前処置の効果を示す。ここで、１７β−エストラジオールは、５ｍｍシラスティック・インプラント（Ｅ２）またはエストラジオール化学デリバリー系（Ｅ２−ＣＤＳ）(１ｍｇ／ｋｇ体重)として皮下投与し、対照を設けた〔偽（シャム）ペレット〕。値は、３つの脳スライス中の虚血面積％について平均±ＳＥＭとして示す。^*＝ｐ＜０.０５対シャム群。２４時間および７日間にわたる各処置の生存者の総数を合計した。試料の数は、シャム群＝６、１７β−エストラジオール群＝８、およびＥ２−ＣＤＳ群＝１０であった。図２は、ＭＣＡＯにより誘発した虚血の２時間前に１７β−エストラジオールでの卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットの処置の効果を示す。ここで、１７β−エストラジオール（１００μg／kgE₂）は、油媒体中で皮下注射した。エストロゲンなしの油媒体からなる対照を含めた。ラットは、ＭＣＡＯの２４時間後に断頭した。ラット脳を、ＭＣＡＯの２４時間後、領域Ａ〜Ｅとして冠状に解体した。値は、平均±ＳＥＭとして示す。ここで、ＯＶＸ＋Ｅ₂群についてはｎ＝８、およびＯＶＸ群（対照）についてはｎ＝６であった。^*＝ｐ＜０.０５対対応する媒体対照群。図３は、ＭＣＡＯにより誘発した虚血の２４時間前に開始した１７α−エストラジオールでの卵巣摘出ラットの前処置の効果を示す。ここで、１７α−エストラジオールは、５ｍｍシラスティック（silastic）チューブ中で投与し、陰性対照は、エストロゲンなしの５ｍｍシラスティック・チューブ（シャム）とした。ＭＣＡＯの２４時間後にラットを断頭した。値は、５つの脳スライス中の虚血面積％について平均±ＳＥＭとして示す。Ａ〜Ｅは、尾から嗅球（olfactory bulb ）の距離を表し、Ａ＝５ｍｍ、Ｂ＝７ｍｍ、Ｃ＝９ｍｍ、Ｄ＝１１ｍｍ、およびＥ＝１３ｍｍである。^*＝ｐ＜０.０５対同等の脳スライスについてのシャム群。シャムについてはｎ＝１０、１７α−エストラジオール群についてはｎ＝１３であった。図４は、ＭＣＡＯの開始後４０分（ａ）および９０分（ｂ）での、対照（ＨＰＣＤ）または１７β−エストラジオールでの卵巣摘出ラットの後処置の効果を示す。１７β−エストラジオールは、１mg／kg体重の濃度でエストラジオール化学デリバリー系中に製剤化し(Ｅ２−ＣＤＳ)、静脈経路で注射した。ＭＣＡＯの２４時間後にラットを断頭した。値は、５つの脳スライス中の虚血面積％について平均±ＳＥＭとして示す。Ａ〜Ｅは、尾から嗅球の距離を表し、Ａ＝５ｍｍ、Ｂ＝７ｍｍ、Ｃ＝９ｍｍ、Ｄ＝１１ｍｍ、およびＥ＝１３ｍｍである。^*＝ｐ＜０. ０５対同じ脳スライスについてのＨＰＣＤ群。媒体についてはｎ＝９、Ｅ２−ＣＤＳ群についてはｎ＝１３であった。図５は、２４時間の低血糖症の後の脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）の死亡に対する１７β−エストラジオール（２nM）の効果を示す。対照は、エタノール媒体のみからなっていた。細胞培地中のグルコース濃度は、グルコース無含有培地に適切な量のＤ−（＋）−グルコースを添加することにより、２０ｍｇ％〜２００ｍｇ％に調整した。ＢＣＥＣは、２４時間（ａ）および４８時間（ｂ）インキュベートした。トリパンブルー染色を用いて、死んだ細胞から生きている細胞を区別した。２つの異なる血球計区画での２つの細胞カウントを平均した。平均± ＳＥＭを示す(ｎ＝８〜１２)。^*＝ｐ＜０.０５対対応する媒体対照。図６は、酸素欠乏症の後のＢＣＥＣの死亡に対する１７β−エストラジオールの効果を示す。対照は、エストロゲンなしのエタノール媒体からなっていた。細胞培地は、２００ｍｇ％のグルコースを含有していた。ＢＣＥＣを含む培養皿を、窒素充填室に４時間置いた。トリパンブルー染色を用いて、死んだ細胞から生きている細胞を区別した。２つの異なる血球計区画での２つの細胞カウントを平均した。平均±ＳＥＭを示す(ｎ＝８〜１２)。^*＝ｐ＜０.０５対対応する媒体対照。図７は、酸素欠乏症および低血糖症の組み合わせの後の対照(エタノール媒体) と比較したＢＣＥＣ死亡に対する１７β−エストラジオールの効果を示す。細胞培地は、１００ｍｇ％または２００ｍｇ％のグルコースを含有していた。ＢＣＥＣを含む培養皿を、インキュベーターまたは窒素充填室のいずれかに２時間置いた。トリパンブルー染色を用いて、死んだ細胞から生きている細胞を区別した。２つの異なる血球計区画での２つの細胞カウントを平均した。平均±ＳＥＭを示す (ｎ＝８.１２)。^*＝ｐ＜０.０５対対応する媒体対照。発明の詳細な説明本発明は、虚血事象により開始される進行性の変性から細胞を保護するように男性および女性に安全に投与してもよい、卒中および他の形態の虚血のための効果的な処置を提供する。エストロゲン化合物は、本明細書および特許請求の範囲において、参照によりここに援用されるSteraloid Inc.,Wilton,N.H.の「Steroids(ステロイド)」(第１１版)に記載されている任意の構造と定義される。この定義に含まれるものとしては、上述の文献に記載されている非ステロイド性エストロゲン類が挙げられる。この定義に含まれる他のエストロゲンとしては、エストロゲン誘導体、アイソマー、エストロゲン代謝物、エストロゲン前駆体、およびこれらのものの修飾物、ならびに、細胞関連エストロゲンレセプターに結合することができる分子、ならびに、その結合の結果が特徴的なエストロゲン効果を誘発する他の分子が挙げられる。また、２以上のエストロゲンの混合物もまた含まれる。 β−エストロゲンおよびα−エストロゲンは、エストロゲンのアイソマーである。「エストラジオール」という用語は、具体的に同定されているのでない限り、１７α−または１７β−エストラジオールを指す。「Ｅ２」という用語は、β−エストラジオール、１７β−エストラジオール、Ｅ₂、およびβ−Ｅ₂と同義である。「動物個体」は、本明細書および特許請求の範囲において、ヒトを含む高等生物と定義される。「性関連でない（非性）ホルモン」という用語は、本明細書および特許請求の範囲において、個体に対して性関連の効果を実質的に有さないホルモンと定義される。エストロゲン化合物は、本明細書において、虚血病変の半影において変性から細胞を保護することが示されている(例１および２)。エストロゲン化合物は、さらに、神経細胞および内皮細胞を含む複数の細胞タイプについて保護的であることが示されている(例１〜３)。本発明にしたがえば、エストロゲン化合物は、酸素欠乏およびグルコース欠乏の影響から細胞を保護し、結果として虚血に付随するエネルギー欠乏から細胞を保護するために用いてもよい。本発明のある態様においては、卒中が起こる前または起こった後のいずれかに有効量のエストロゲンを投与することを包含する、ヒトの男性および女性個体に好適な処置方法が提供される。本発明にしたがったある種の状況においては、予測された虚血事象に先立ってエストロゲンを投与することが望ましい。このような状況は、例えば、個体が既に卒中を経験していた場合に生じる。この場合には、個体は、第二の卒中を経験する確率が増大している。一過性の虚血発作を起こし得る個体もまた、卒中のリスクが増大している。クモ膜下出血を患う個体は、血管を収縮させる血管痙攣により誘発される虚血事象をさらに経験し得る。脳のような器官に外傷を受けた個体もまた、虚血事象を起こし得る。上述のような場合は、エストロゲン化合物による前処置の恩恵を受けるであろう状況を例示する。このような前処置は、短期間（例えばその事象前の２４時間以内）で投与された場合(例１)、または投与が卒中のような事象の直後に開始され、延長された期間にわたって予防的に継続されるような長期間で投与された場合に、将来の虚血事象の悪影響を軽減することにおいて有益であり得る。予防的用途のための投与の時間の一例は、個人の特定の感受性プロフィールに依存して、数日から数ケ月にわたり得る。これらの状況においては、少なくとも１用量のエストロゲンのコースを、その個体において有効量が維持されるように投与してもよい。短期間の処置に関しては、用量のデリバリーの１つの代替法として、以下に特定する任意の経路により非経口投与を用いてもよい。予防的用途のためのエストロゲン化合物の有効量は、１０〜１０００pg／mlの血漿濃度のエストロゲン化合物を提供するべきである。より具体的には、投与されたエストロゲン化合物の血漿濃度は、５０〜５００pg／mlであってもよい。これらの状況においては、α−アイソマーのような性関連でないエストロゲン化合物の使用は、ホルモンの性関連機能が回避されるので、男性および女性において特に有用である。本発明の態様にしたがえば、エストロゲン化合物は、脳血管疾患、クモ膜下出血、または外傷のような虚血事象の悪影響を軽減させることにおいて効果的である。したがって、本発明の化合物は、事象の開始後なるべく早く、好ましくは事象後の１０時間以内に、より具体的には５時間以内に投与される。エストロゲン化合物の増大した濃度は、血漿中において虚血事象の後少なくとも数時間〜数日の間維持されることが望ましい。エストロゲン化合物の増大した濃度は、血漿中のエストロゲン化合物の１０〜１０００pg／mlの範囲内であるべきである。より具体的には、投与されたエストロゲン化合物の血漿濃度は、５０〜５００pg／ml であってもよい。本発明は、エストロゲンによる前処置またはエストロゲン化合物の初期の後処置が、虚血事象の後の壊死領域のサイズを有意に減少させることができることを、最初に明らかにしたものである。エストロゲン前処置のこの効果は、エストロゲン化合物のアイソマー型および投与経路には依存しない。エストロゲンのα− アイソマーは、虚血の影響から細胞を保護することにおいてエストロゲンのβ− アイソマーと同様に効果的であることが示された。例１、および図１および２に例示した方法は、エストロゲン化合物の保護活性がホルモンの性関連の活性（エストロゲン性；estrogenicity)に依存しないことを確認している。エストロゲン化合物のα−アイソマーは、性関連の活性を実質的に有さないようであるが、それでもこれらの化合物は、β−アイソマーのように虚血事象に対して脳を保護することについて効果的である。そのうえ、例１は、同じエストロゲン化合物を皮下インプラントとして投与した場合とＥ２−ＣＤＳの静脈内注射として投与した場合とで保護効果が同様であることから、１７β−エストラジオールで処置した場合の卵巣摘出ラットの観察された死亡率の低下が、投与経路に依存しないことをさらに明らかにしている。投与の経路またはエストロゲン化合物の製剤に関係なく、エストロゲンは、虚血事象を耐えて生存する動物の能力に対して顕著な効果を有する。虚血領域内の細胞の保護においてエストロゲンが有効であるという証明は、中脳動脈（ＭＣＡ）を実験的に閉塞したラット動物モデルを用いて以下の例において明らかにされている。この動物モデルは、人体において起こり得るようなインビボの虚血事象を反復することが当業界で周知である。ＭＣＡの実験的閉塞は、典型的には脳幹神経節、および前頭、頭頂および側頭皮質領域を包含する一側性の大きい虚血領域を引き起こす〔Menzies et al.，Neurosurgery 31，100-106(1 992)〕。虚血病変は、ＭＣＡによって灌流された部位の小さいコアから始まって、時間とともに広がる。このコア梗塞の周囲の半影領域は、閉塞の間に副行循環により灌流された状態に維持される組織へのコアから外側への病変の進行によりもたらされると信じられている。虚血事象のコアを取り囲む半影に対する治療剤の効果は、動物から脳スライスが得られる場合に調べることができる。ＭＣＡは、前頭葉、頭頂葉および側頭葉の皮質表面ならびに脳幹神経節および内包に血液を供給する。脳のスライスは、最大の虚血事象が起こっている領域の周囲で採取する。これらの領域は、例１および２において領域Ｂ、Ｃ、およびＤとして同定されている。これらの領域は、領域ＡおよびＥのように別の供給源からの血流によって容易に補償されない。これは、ＭＣＡが末端の動脈であり、この動脈に、ＭＣＡ分布領域に供給する側副動脈のレース（lace）が依存しており、それによってＭＣＡ閉塞により誘発された虚血が補償され得ないものとなるためである。これに対して、領域ＡのＭＣＡと前頚動脈（ＡＣＡ）との間および領域ＥのＭＣＡと後頚動脈（ＰＣＡ）との間の吻合（例１および２）は、本研究において観察されたようにＭＣＡ閉塞により誘発された虚血を補償し得る。虚血事象の後の病変の進行に対するエストロゲンの効果を研究するために、ラットを卵巣摘出し(ＯＶＸ)、２週間後に、ＭＣＡ閉塞の前または後に種々のエストロゲン調製物に暴露した(例１および２)。脳を標的としたＥ２−ＣＤＳまたは１７β−エストラジオール（E2）それ自体での前処置は、死亡率を、ＯＶＸラットにおける６５％から、Ｅ２処置ラットでは２２％へ、Ｅ２−ＣＤＳ処置ラットでは１６％へ、低減させた。この顕著な死亡率の低減には、脳の虚血領域の、ＯＶＸラットの２５.６±５.７％から、Ｅ２移植ラットでの９.８±４.０％、Ｅ２ −ＣＤＳ処置ラットでの９.１±４.２％への減少が伴っていた。同様に、不活性と予想されたエストロゲン（１７α−エストラジオール）での前処置は、虚血領域を５５〜８１％低減した(例１)。ＭＣＡ閉塞の４０分後または９０分後に投与した場合、Ｅ２−ＣＤＳは、虚血領域を、それぞれ４５〜９０％または３１％低減させた(例２)。これらの結果は、虚血事象の後の脳のエストロゲンの神経保護効果を証明するものである。エネルギー代謝のための利用可能な酸素およびグルコースの低減は、虚血事象の特徴である。これは、閉塞が逆転された場合に栄養素を供給するために必要となりうる血管に負のインパクトを与える。虚血後の血管に対する負の影響は、この事象に付随する長期間の損傷を増大させる。この影響は、例３に記載したようにインビトロで再現することができる。これらの状況においては、エストロゲン化合物が、そうでなければ起こる虚血事象の間の低グルコース血症および酸素欠乏症の間に起こる細胞死から脳毛細血管内皮細胞を保護することが本研究で示された(図５〜７)。この保護の結果として、虚血事象後の脳の再灌流に続いて血流および輸送機能が再び生じるように、血管の供給および脳血液関門の完全性がエストロゲン化合物によって保存される。エストロゲン化合物は、異なるデリバリー方法を用いて同等の活性を有することが、本研究において示された(例１および２)。本明細書において記載した持続性デリバリーの例としては、シラスティック・ペレットの手段による皮下デリバリーおよび化学デリバリー系による静脈内デリバリーが挙げられる。皮下注射によりデリバリーされたエストロゲンもまた、効果的であることが見出された(例１)。結果として、エストロゲンのデリバリーの方法は、虚血部位での効率にしたがって制限されるべきではなく、全体的な利便性に影響する因子にしたがって選択されるべきである。このような因子としては、血液および中枢神経系へのエストロゲン化合物の取り込みの速度が含まれ得る。虚血の影響に対して細胞を保護するためのエストロゲン化合物の投与の経路には、皮下、経皮、経口、直腸、頬、筋内、または静脈内の任意の方法または当業界においてエストロゲンのデリバリーのために一般に用いられる任意の代替法が含まれる。さらに、デリバリーは、持続性制御デリバリー装置の手段または注射によっても行い得る。例例１：虚血に対するエストロゲン化合物での前処置の効果の測定実験モデルとしてラットを用いて、虚血に対する保護におけるエストロゲンの効果を試験した。天然に生じるエストロゲンの供給源を除去するため、卵巣摘出手術を、虚血の誘発の前に行った。卵巣摘出手術に続いて、ラットを、ＭＣＡ閉塞の２４時間前の皮下デリバリーまたは静脈内デリバリーのいずれかによって、以下のようにエストロゲン化合物で処置した。持続性皮下デリバリー：１７β−または１７α−エストラジオールを、Mohamm ed et al.,Ann.Neurol．18，705-711（1985）の方法にしたがって、長さ５ｍｍのシラスティック（SILASTIC；登録商標）チューブ（Dow-Corning,Midland，MI ）に充填した。シャム（空）ペレットを、エストロゲン陰性対照として同様に調製した。これらのペレットをＭＣＡ閉塞の２４時間前に卵巣摘出したラットに皮下（ｓｃ）移植した。エストロゲンを含有する５ｍｍのシラスティック・チューブは、１００〜２００pg／mlの血漿レベルのエストロゲンをもたらした。静脈内（ｉｖ）デリバリー:Brewster et al.,Reviews in the Neurosciences2 ,241-285(1990)およびEstes et al.,Life Sciences 40:1327-1334（1987）に記載されているように、エストロゲンデリバリー系（Ｅ２−ＣＤＳ）を用いて、１７β−エストラジオールを静脈内デリバリーのために調製した。Ｅ２−ＣＤＳは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ）と複合体を形成させた〔Brewster et al.,J.ParenteralScience and Technology 43:231-240(1989 )〕。達成された複合体は、１gのＨＰＣＤあたり３２mgのＥ２−ＣＤＳであった。最初の研究においては、Ｅ２−ＣＤＳ（１mg/kg体重）の単回静脈内注射をＭＣＡ閉塞の２４時間前に投与した。対照は、ＨＰＣＤ単独であった。化学デリバリー系は、エストロゲンがキャリアからゆっくりと放出されるように処方した。このデリバリー系は、持続された様式でエストロゲンを効果的に脳にデリバリーすることが示された。実際、例１および２において用いたＥ２−ＣＤＳの用量（１０００mg／kg)は、投与後２４時間の時点で１０００pg／gm脳組織を提供するのに充分であった。卵巣摘出手術の７〜８日後、Longaら(1989)，Stroke，vol.20，84-91およびNa gasawaら（1989）Stroke,vol.20，1037-1043の方法を以下のように改変して用いて、ラットに中頚動脈を閉塞する方法を施した。動物を、塩酸ケタミン（６０mg／kg、ｉｐ）およびキシラジン（１０mg／kg、腹腔内）を用いて麻酔した。直腸温度をモニタリングし、手順の間を通して熱源ランプを用いて３６.５℃と３７.０℃との間に維持した。左の頚動脈を、中線頚部切開を通して露出した。左の胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、顎二腹筋（後筋）および肩甲舌骨筋を分割して収縮させた。舌骨の大角の部分を切断して、遠位外頚動脈（ＥＣＡ）の露出を容易にした。総頚動脈（ＣＣＡ）、ＥＣＡ、および内頚動脈（ＩＣＡ）を、隣接する神経から切り離した。遠位ＥＣＡおよびその分岐、ＣＣＡおよびPterygopalatine動脈を、完全に凝集させた。微小血管クリップを、頭蓋底付近でＩＣＡ上に置いた。動きやすさおよび血管内腔の遮断のために、２ .５ｃｍの長さの３−０単フィラメントナイロン縫合糸を加熱して、小球を作った。これを、穿孔を通してＥＣＡ内腔に導入した。縫合糸を、クリップを着けた位置に達するまで静かに遠位ＩＣＡに進ませた。次に、微小血管クリップをはずし、縫合糸を抵抗が感じられるまで挿入した。ＣＣＡ分岐と抵抗位置との間の距離は、約１.８ｃｍであった。この手術手順は、出血を伴わずに１０分以内に完了した。予め決めた閉塞時間（４０分）の後、縫合糸をＩＣＡから引き出し、直ちに遠位ＩＣＡを焼灼した。予定した屠殺時間まで生き残った動物を断頭により殺した。予定した虚血後屠殺は、ＭＣＡＯ後６時間、２４時間および１週間に行った(表１)。６時間試料については、動物は、継続的にモニタリングした。２４時間試料については、動物を、約４時間観察し、その後檻に戻した。同様に、虚血後１週間に屠殺を予定した動物については、手術後の最初の４時間モニタリングし、その後は毎日モニタリングした。断頭した頭部から脳を取り出し、以下に（ａ）および（ｂ）について記載したように３〜５片の冠状組織スライスにスライスし、次にへマトキシリンおよびエオシンで染色して、虚血領域の範囲を決定した。染色されたスライスを写真撮影し、続いて、虚血病変の横断面積を評価するために、イメージ1.47(Image1.47) ソフトウェア・プログラムを備えたマッキントッシュ・カドレ８００（Macintos h Cadre 800）コンピュータを用いて画像処置した。これらの画像および算出された虚血損傷の面積は、後に取り出してデータ還元するためにプログラム中に保存した。異なる処置群（シャム、Ｅ２ペレットおよびＥ２−ＣＤＳ）の間の死亡率の差異の有意性を、χ２乗解析を用いて決定した。異なる投与経路および異なるアイソマー型のエストロゲン化合物を用いて得られた結果を、以下に示す。（a）持続性皮下デリバリーによる、または制御された静脈内デリバリーによる、虚血事象前２４時間でのエストロゲン（１７β−エストラジオール）の投与は、脳病変のサイズおよび死亡の減少を引き起こす。３つの冠状スライスを、嗅球の１、５、および７ｍｍ後部で作製した。対照( シャム処置)動物の３５％しか、予定された虚血後屠殺時間まで生き残らなかった(表１)。これに対し、ＳＣインプラント（５ｍｍシラスティック・チューブ）中の１７β−エストラジオールまたは注射によるＥ２−ＣＤＳ（１mg／kg）のいずれかでＭＣＡ閉塞の２４時間前に処置した７８％および８４％の動物が、６時間、１日および１週間の予定された虚血後屠殺時間まで生き残った。上昇したエストロゲンレベルは、屠殺時にすべての試料で検出された。エストロゲン前処置群における死亡の減少は、ＭＣＡ閉塞の１日後および１週間後に最も顕著であった(表１)。さらに、エストロケン処置ラットにおける減少した死亡は、予定された虚血後屠殺時間である１日または１週間まで生き残った動物における虚血面積の減少と相関していた(図１)。対照（シャム処置）ラットは、評価した脳切片の横断面積の２５.６±５.７％を占める虚血病変を有していた(図１)。これとは対照的に、１７β−エストラジオールまたはＥ２−ＣＤＳで処置したラットは、評価した脳面積のそれぞれ９.８±４.０および９.１±４.２％のみを占める虚血病変を有していた。群の間の差異の有意性は、偏差（分散）解析（ＡＮＯＶＡ）により決定し、フィッシャー（Fischer）の試験を用いてその後の比較を行った。曲線下面積の決定は、３つの脳スライスしか採取しなかったため、ここでは行わなかった。（b）脳病変サイズに対する、虚血事象の２時間前の１７β−エストラジオール（１００μg／ml)の皮下注射の効果ラットを卵巣摘出し、上述したように卵巣摘出術の１４日後かつ虚血事象（ＭＣＡ）の２時間前に、ＳＣ注射によって単一用量の１７β−エストラジオール（１００μg／kg）で処置した。この注射は、閉塞時に２５０pg／mlの血漿濃度を達成するのに充分であった。２４時間の時点で動物を殺し、脳を抽出した。図２に示す結果は、組織スライスＡ〜ＤにおけるＥ２の有意な保護効果を明らかにしている。ＯＶＸラットにおけるＥ２置換は、領域ＣおよびＤの全冠状切片の虚血病変サイズをそれぞれ４６．３％および４４.１％（ｐ＜０.０５）減少させた(図２)。これらの領域は、尾から嗅球へ９および１１ｍｍで採取した切片に相当する。（c）脳病変サイズおよび死亡に対する、虚血事象の２４時間前に開始された１７α−エストラジオールの持続性皮下デリバリーの効果卵巣摘出されたラットをＭＣＡＯの２４時間前に１７α−エストラジオールを含有する５ｍｍシラスティック・ペレットで処置した。ＭＣＡＯ後２４時間の時点で動物を殺し、脳を抽出した。５つの、２ｍｍ厚の冠状切片を嗅球の５、７、９、１１および１３ｍｍ後部で作製した。次に、これらのスライスを、生理食塩水中２％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）溶液（Sigma Ch emical Corp.,St.Louis,MO）中で３７℃で３０分インキュベートした。シャム処置したラットは、予想された虚血病変を示し、最大の虚血領域（２４.１±２.４％）がスライスＣ（嗅球の９ｍｍ後部）において起こり、これより小さい病変がより吻側および尾側のスライスにおいて起こっていた(図３)。１７α−エストラジオールで前処置した動物は、評価したすべてのスライスにおいてシャム処置した動物と比較して小さい虚血領域を示した(図３、Ａ〜Ｅ)。特に、スライスＣ、ＤおよびＥ（嗅球の７、９、および１１ｍｍ後部で採取した切片）では、虚血領域はそれぞれ５５％、６６％および８１％有意に低減された(図３)。シャム処置群および１７α−エストラジオール（Ｅ２）群についての虚血病変曲線下面積は、スチューデント（Student）ｔ試験を用いて、それぞれ８.１±０.８および３. ７±１.３であった(表２)。シャム処置群およびステロイド処置群の間の差異の有意性をかくして決定し、２つの群からのデータを各実験について比較した。ある処置についての病変曲線下面積を決定するために、台形法（Trapezoidalmetho d）を用いた。各動物について算出した面積をグループ分けし、グループ間の差異をスチューデントｔ試験により決定した。例２：虚血事象後に投与したエストロゲン化合物の効果の測定閉塞の開始後に有効なエストロゲン処置の範囲を試験するために、卵巣摘出したラットに、Ｅ２−ＣＤＳまたは対照（ＨＰＣＤ媒体）のいずれかの持続性放出により、静脈内処置を行った。陽性試料は、投与２４時間後、１０００pg／gmエストロゲンのエストロゲンの脳組織濃度を起こした。このエストロゲン化合物は、ＭＣＡ閉塞の開始後４０分および９０分に投与し(図４ａおよびｂ、表２）、ＭＣＡ閉塞後２４時間に動物を殺した。５つの２ｍｍ厚の冠状切片を、例１に記載したように、嗅球の５、７、９、１１および１３ｍｍ後部で作製した。４０分の時点での後処置：図４ａに示すように、対照（ＨＰＣＤ処置）ラットは、試料としたすべてのスライスにおいて大きな虚血領域を有しており、最大の虚血領域はスライスＣにおいて観察された２５.６±２.７％であった。Ｅ２−ＣＤＳ処置は、試料としたすべてのスライスにおいて虚血領域を減少させた(図４) 。虚血領域の低減の程度は、スライスＡ（嗅球の５ｍｍ後部）における９０％からスライスＣ（嗅球の９ｍｍ後部）における４５％までにわたった(図４ａ)。虚血病変曲線下の総面積は、媒体処置（ＨＰＣＤ処置）ラットについては１０．１ ±１.６であり、Ｅ２−ＣＤＳ動物については４.５±０.９であった(表２)。９０分の時点での後処置：ラットを、閉塞の開始後にE２−ＣＤＳまたはＨＰＣＤ媒体で処置した(図４ｂおよび表２)。この場合にも、ＨＰＣＤ処置した動物は、試料としたすべてのスライスにおいて大きな虚血病変を示し、最大の虚血領域はスライスＣにおいて見られた(スライス面積の２０.５±３.１％)。Ｅ２−ＣＤＳでの処置は、調べたすべてのスライスにおける平均虚血面積を低減させたが、その差異は統計的に有意ではなかった。２つの群についての虚血曲線下面積の評価により、Ｅ２−ＣＤＳ処置が８.２±１.７（ＨＰＣＤ処置動物）から５.２ ±１.７（Ｅ２−ＣＤＳ処置動物）へ、３７.１％虚血領域を低減させたことが明らかになった。これらのデータは、エストロゲン化合物による虚血事象の処置の効果は、事象後の処置の時間が増すにつれて減少することを示す。例３：エストロゲン化合物はフォーカス虚血に付随する状態下で脳毛細血管内皮細胞を保護するラット脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）一次培養を、Goldstein，J.Neurochem istry vol．25，715-717（1975）の方法にしたがって調製した(前記文献は参照によりここに援用する)。低血糖症実験を行った。１７β−エストラジオール（２nM）または対照（エタノール媒体）をＢＣＥＣ培養に添加した。次に、培地のグルコース濃度を、適量のＤ−（＋）−グルコースをグルコース無含有培地に添加することにより、２０ｍｇ％〜２００ｍｇ％まで調整し、グルコースおよびＬ−ラクテート分析機（YS I model 2300 STAT plus,YSI,Inc.Yellow Springs,OH）によりモニタリングした。低グルコース培養を、トリパンブルーで染色する前に２４時間または４８時間維持した。２nMの１７β−エストラジオールをを含有する、または含有しない、ＢＣＥＣを含む培養皿を、モジュラー・インキュベーター・チャンバー（Modular Incuba tor Chamber;Billups-Rothenberg,Inc.,Delmar,CA）に置くことにより、低酸素環境を作った。窒素ガスを流入させ、チャンバー内の酸素を置き換えた。チャンバーをシールし、非低グルコース培養については４時間、低グルコース培養については２時間、インキュベーター内に置いた。トリパンブルー染色法を用いて細胞の死亡をカウントした。細胞死のパーセンテージを、死細胞／生細胞×１００（％）として算出した。統計学偏差の２方向分析を適用し、実験群間の差異の有意性を決定した。パーセンテージで表したデータについては、クラスカル−ワリス（Kruskal-Wallis）非パラメータ解析（nanparametric analysis）を用いた。Kruskal-Wallis解析により群間の有意性が示された場合には、マン−ホイットニー（Mann-Whitney）のＵ試験を用いた。ｐ＜０.０５を有意と考えた。グルコースを涸渇させた細胞についての結果を、図５ａおよび５ｂに示す。培地中の正常のグルコース濃度は２００ｍｇ％であり、エストロゲン添加物の含有・無含有の培養間でほとんど細胞死のパーセンテージに差がない。しかし、培地のグルコースを１００ｍｇ％、４０ｍｇ％および２０ｍｇ％に低減させると、細胞死が引き起こされ、１７β−エストラジオールにより、対応する対照群と比較してそれぞれ３５.９％、２８.４％および２３.％の細胞損失が救済された(ｐ＜０ .０５)。さらに、浮遊細胞が存在したことが注目された。これは、Ｅ２処置群よりも対照群により多くの死細胞が存在することを意味する。これらの細胞は、細胞死亡率をカウントする場合には除外されていたので、Ｅ２の保護効果は、低く評価されている可能性がある。同様の有益な効果は、２４時間および４８時間の低グルコース処置についても観察された(図５ａおよびｂ)。図６に、２００ｍｇ％グルコースを含有する培地中の細胞について示すように、低酸素症は、細胞生存率においてさらに劇的な効果を有していた。低酸素症は、対照において４８.８％および３９.８％もの多くの細胞死を誘発し、Ｅ２は、低酸素傷害の１時間で２８.４％（ｐ＜０.０５）および４時間で１８.４％（ｐ＜０.０５）の細胞死を低減させた。細胞を低グルコース症(１００ｍｇ％低グルコース)および低酸素状態(２時間) の両方に暴露した場合、１７β−エストラジオールは、両状態の累積的効果からＢＣＥＣ培養細胞を保護することにおいて有効であった(図７)。このインビトロアッセイは、ＢＢＢ内皮細胞への酸素およびグルコースの供給が低減する、ＭＣＡの閉塞により誘発されるような虚血に続く事象の代表的なものである。表１：中脳動脈閉塞後の死亡に対する１７β−エストラジオールまたはエストラジオール化学デリバリー系（Ｅ２−ＣＤＳ）を用いた前処置の効果 ^*χ２乗解析によるｐ＜０.０５対同じ時点でのシャム対照群表２：卵巣摘出ラットにおける虚血病変曲線下面積に対するエストロゲンの効果 ^*スチューデントｔ試験によるｐ＜０.０２対シャム対照

Claims

【特許請求の範囲】１．虚血事象後に個体において、虚血フォーカスに付随する細胞集団に保護を与える方法であって、（a）エストロゲン化合物を用意し；（b）前記細胞集団に保護を与えるように、虚血事象に有効に近接した時間内での少なくとも１用量を含むコースにわたっての前記化合物の有効累積量を投与することを含むことを特徴とする方法。２．近接した時間が、虚血事象の前である、請求項１記載の方法。３．近接した時間が、虚血事象の後である、請求項１記載の方法。４．近接した時間が、１０時間以内である、請求項３記載の方法。５．虚血事象が、脳血管疾患、クモ膜下出血、心筋梗塞、外科的手術および外傷からなる群から選択される、請求項１記載の方法。６．虚血事象が、卒中である、請求項１記載の方法。７．細胞が、ニューロンである、請求項６記載の方法。８．細胞が、内皮細胞である、請求項６記載の方法。９．上記エストロゲン化合物を、経口、頬、直腸、筋内、経皮、静脈内および皮下からなる経路の群から選択されるいずれかにより投与することをさらに含む、請求項１記載の方法。 10．制御放出手段中の前記化合物を投与することをさらに含む、請求項９記載の方法。 11．エストロゲン化合物が、エストロゲンのα−アイソマーおよびβ−アイソマーからなる群から選択される、請求項１記載の方法。 12．エストロゲン化合物が、１７α−エストラジオールおよび１７β−エストラジオールからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。 13.個体において虚血事象の最中またはその後の変性から細胞を保護する方法であって、（a）保護の必要がある個体を同定し；（b）性関連でないエストロゲン化合物の有効量を虚血事象の前に提供し；および（c）そうしない場合にエストロゲン化合物の不在下で起こる変性から細胞を保護することを含むことを特徴とする方法。 14．個体において卒中を処置する方法であって、（a）医薬製剤中のエストロゲン化合物の有効量を用意し；（b）前記製剤を、卒中の悪影響を軽減するように個体に投与することを含むことを特徴とする方法。 15．虚血事象に供される細胞集団に保護を与えるために使用する製剤であって、少なくとも１用量のコースにわたってのエストロゲンの累積量が細胞を変性から保護するように、虚血事象に有効に近接した時間内に虚血部で細胞に接触するために有効な量のエストロゲン化合物を含むことを特徴とする製剤。 16．エストロケン化合物が、実質的でない性関連活性を有する、請求項１５記載の製剤。 17．エストロゲン化合物が、エストロゲンのα−アイソマーおよびβ−アイソマーから選択される、請求項１６記載の製剤。 18．虚血部が、卒中に付随するものである、請求項１５記載の製剤。 19．虚血部が、塞栓、アテローム性硬化症または血管痙攣のいずれかによりもたらされる、請求項１５記載の製剤。 20．虚血部の細胞が、血管系または心臓の任意の細胞である、請求項１５記載の製剤。 21．虚血部の細胞が、ニューロンである、請求項１５記載の製剤。