JP2001502165A

JP2001502165A - クロマトグラフ泳動パターンの分析方法および装置

Info

Publication number: JP2001502165A
Application number: JP10514017A
Authority: JP
Inventors: マークス，アンディ，エフ．
Original assignee: ユニバーシティオブユタリサーチファウンデイション; マークス，アンディ，エフ．
Priority date: 1996-09-16
Filing date: 1997-09-16
Publication date: 2001-02-20
Also published as: WO1998011258A1; EP0944739A1; EP0944739A4; US6208941B1; AU4588297A

Abstract

(57)【要約】本発明は反復ブラインドデコンボルーションおよびファジー論理アルゴリズムを使用してクロマトグラフィックデータ内の情報包含信号を検出および分析する方法および装置を含む。本発明の方法により、ゲルおよび毛管電気泳動を含む広範なＤＮＡ配列情報源からのクロマトグラフィックデータが分析される。オートラジオグラム、単一フロオロ、４レーンおよび４フロオロ、単一レーン蛍光クロマトグラフィックデータが適切な未処理入力データ源である。本発明の塩基呼出し方法からの出力は呼び出した（同定された）配列データおよび呼び出した塩基に対する品質値を含んでいる。

Description

【発明の詳細な説明】クロマトグラフ泳動パターンの分析方法および装置Ｉ．発明の背景Ａ．発明の分野本発明は分子混合物に広く適用されるクロマトグラフ泳動（ミグレーション）パターンの信号検出および分析の分野に関する。特に、本発明はＤＮＡ配列決定に適用されるクロマトグラフ泳動パターンの信号検出および分析に関する。Ｂ．関連技術の説明クロマトグラフデータ内の情報包含信号を効率的かつ正確に検出し分析する能力は大量のデータを処理するのに重要である。このような能力は、大量の情報が発生されそれを分析および統合して人間の全体ゲノムの代表的な配列を発生しなければならない、ヒューマンゲノムプロジェクト等のプロジェクトにとって特に重要である。ＤＮＡ配列（シーケンス）情報の分析を促進するために、さまざまな方法が開発されている。例えば、クラークチベットの米国特許（第５，３６５，４５５号）にはＤＮＡ配列データの自動化された処理方法が開示されている。この特許はその全体が本開示の一部としてここに組み入れられている。このチベットの方法では入力データセットから得られる有益な変数から情報が引き出される。このような有益な変数には隣接信号間の相対強度、相対信号間隔およびパターン認識ファクターが含まれる。しかしながら、チベットの方法はクロマトグラフデータの量により制限される。チベットの方法は塩基同定（「呼出し」）（ｂａｓｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｃａｌｌｉｎｇ）”）システムを学習するクロマトグラフデータの再現性にある程度依存している。したがって、クロマトグラフデータを発生する装置はラン毎に一貫させてアルゴリズムを再学習することを回避する必要がある。クロマトグラフデータは情報包含信号を不明瞭にする背景ノイズや泳動収差を含むことが多いため、信号間隔に基づく分析により信号識別に誤差を生じることがある。同様に、信号強度は予測不能に変動することが多いため、強度に基づく信号識別によりやはり著しい同定誤差が生じることがある。トーマスストックハムおよびジェフアイベスの米国特許（第５，２７３，６３２号）にはブラインドデコンボルーション（ｂｌｉｎｄｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）（“ＢＤ”）を使用する塩基同定の別の方法が開示されている。この発明はその全体が本開示の一部としてここに組み入れられている。ストックハムおよびアイベスの方法はブラインドデコンボルーションを使用してクロマトグラフデータ内の情報包含信号を鮮明にするものである。しかしながら、この方法は下記のように著しく限定される。第１に、それは走査したオートラジオグラム画像データから引き出されるデータに依存する。第２に、この方法はＢＤフィルターバンド幅のユーザ入力およびプログラマーによるさまざまなしきい値に対する変更を必要とする。第３に、ストックハムおよびアイベスの方法はレーン（ｌａｎｅ）毎の移動度（モビリティ）の違いを適切に処理しない。第４に、挿入／削除および修正論理が単純すぎる。第５に、想定ピーク検出がしきい値に基づいているため、バンド振幅がしきい値よりも低下する場合にバンド検出を見逃すことがある。第６に、ストックハムおよびアイベスの方法は隣接サンプルセグメントを配列させ併合させる能力が欠けている。最後に、この方法には自動データルーティングおよび／もしくは配列アセンブリに有用なバンド品質測度が欠けている。 II．発明の要約および目的本発明はクロマトグラフデータ内の情報包含信号の検出および分析方法および装置を含んでいる。また、本発明はクロマトグラフデータ内の信号ピークを検出して鮮鋭化する方法および装置も含んでいる。広範な分離プロセスからのクロマトグラフデータを分析できることは本発明の利点である。限定はしないが、このような分離プロセスにはゲルおよび毛管電気泳動が含まれる。本発明は信号データを前処理し、連続するサンプルセグメントを読み出し、高品質配列のブロックを選択し、次にアラインされた高品質配列のトレースを発生するステップを含んでいる。クロマトグラフデータが多数のレーン内で分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）された単一フルオロ（ｆｌｕｏｒ）サンプルおよび単一レーン内で分別された多数のフルオロサンプルを含むことができることは本発明の利点である。背景ノイズのベースライン除去によりクロマトグラフデータを前処理する方法を提供することが本発明の目的である。ベースライン除去（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）方法を分析されるクロマトグラフデータのタイプに従って変えられることは本発明の利点である。さらに、前処理中に希薄なクロマトグラフデータを補間できることは本発明の利点である。連続サンプルセグメント内の前処理された信号を読み出すことが本発明の目的である。サンプルセグメントサイズを迅速かつ効率的に信号分析するのに十分な大きさにできることは利点である。クロマトグラフデータ内に均一に分布されていない情報包含信号を検出する方法および装置を提供するが本発明の目的である。この分析技術は反復ブラインドデコンボルーションを使用してサンプルセグメント内のバンド周波数を求める。前処理されたクロマトグラフデータ内の信号を最適に検出するように、フィルターバンド幅を反復中に自動的に変えられることは本発明の利点である。１つ以上の信号タイプ（例えば、“バンド−ライト（ｂａｎｄ−ｌｉｔｅ）”信号）が足りないセグメントを有するクロマトグラフデータから引き出された信号データを検出して修正することも本発明の機能である。移動度差を検出して修正する方法および装置を提供することが本発明の目的である。バンド位置や間隔情報ではなくモンテカルロアライメントを使用して移動度差を修正することは本発明の特徴である。モンテカルロアライメントが信号アライメントを最適化する反復プロセスであることは本発明の利点である。ファジー論理を使用してバンド検出を改善することが本発明の目的である。各ブロックが特定のデータ分析方法を提供するファジー論理ブロックを使用してバンド検出を実施することは本発明の特徴である。特定の分析機能に対して各ファジー論理ブロックを最適化できることが本発明の目的である。オプションとして各信号に対する品質メジャー（ｍｅａｓｕｒｅ）測度を提供できることが本発明の目的である。後続するアライメントステップ中に品質メジャーを利用できることが本発明の特徴である。品質メジャーは所与の品質メジャーよりも上のデータについて引き続く分析を制限するための左右カットオフ点を提供できることが本発明の利点である。当業者ならば、添付図を参照しながら本明細書を読めば本発明のこれらおよびその他の目的、特徴および利点が自明であるものと思われる。 III．図面の簡単な説明図１は塩基呼出方法のフロー図。図２は図１の前処理ステップのフロー図。図３は図１の塩基読出しステップのフロー図。図４は図３のエキストラ正規化（ｅｘｔｒａ−ｍｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）ステップのフロー図。図５は図３のピーク検出および細分ステップのフロー図。図６は図５のＯｍｉｔＯｋＮファジー論理ブロックのフロー図。図７は図６のＯＫＳｐＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図８は図６のＯｍｉｔＯｋＮＢａｄＳｐａｃｉｎｇＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図９は図６のＯｍｉｔＯｋＮＣｒｏｓｓＢａｎｄｉｎｇファジー論理ブロックのフロー図。図１０は図６のＯｍｉｔＯｋＮＨｅｉｇｈｔファジー論理ブロックのフロー図。図１１は図５のＧａｐＣｈｅｃｋファジー論理ブロックのフロー図。図１２は図１１のＧａｐＣｈｅｃｋＧａｐＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図１３は図１１のＧａｐＣｈｅｃｋＷｉｄｔｈＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図１４は図４のモンテカルロアライメント機能のフロー図。図１５は図１のＢａｓｅＱｕａｌファジー論理ブロックのフロー図。図１６は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＨｅｉｇｈｔＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図１７は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＣｒｏｓｓＢａｎｄｉｎｇＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図１８は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＷｉｄｔｈＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図１９は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＳｈａｐｅＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図２０は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＢａｓｅｌｉｎｅＢｕｚｚＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図２１は図１５のＢａｓｅＱｕａｌＯＫＳｐａｃｉｎｇＭｅｍｂｅｒｓｈｉｐファジー論理ブロックのフロー図。図２２は図２のＢａｓｅｌｉｎｅＳｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎアルゴリズムのフロー図。図２３は図１のＰｒｅ−ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＢｅｇｉｎ／ＥｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎのフロー図。 IV．好ましい実施例の詳細な説明本発明はクロマトグラフデータ内の情報包含信号の検出および分析方法および装置を提供する。好ましい実施例では、本発明はオートラジオグラム、４レーン −単一フルオロ（ｆｏｕｒｌａｎｅ−ｓｉｎｇｌｅｆｌｕｏｒ）、および単一レーン−４フルオロデータを含むさまざまなイメージング技術を利用するＤＮＡ配列分析機からのクロマトグラフデータを分析する。本発明は、さらに、発明の方法を実施する一般的および専用装置を含んでいる。最後に、本発明は本発明の方法と組み合わせる下記の構成要素の１つ以上を含むキットを含んでいる、ＤＮＡ配列装置、信号検出装置、分析前、分析中および分析後のクロマトグラフデータを保存する情報記憶装置、および分析した配列情報をディスプレイする出力装置。ＤＮＡ配列分析について、本発明の方法はＤＮＡ配列装置からの出力を入力として取り入れ呼び出した各塩基に対する呼び出した配列、配列されたトレース、およびバンドメトリクス（ｂａｎｄｍｅｔｒｉｃｓ）を戻す。各サンプルセグメントが読み出された後で、その呼び出した配列、配列されたトレース、およびバンドメトリクスは予め読み出されたセグメントと連結される。ラダー全体が読み出された後で、最終ステップにおいて呼び出した各塩基のメトリクスが分析され品質値が割り当てられる。品質値は高品質配列の最大ブロックを識別（同定）して左右カットオフ値を確立するのに使用される。“プリアンブル”配列が利用できる場合には、塩基呼出しソフトウェアは呼び出した配列内のプリアンブルを捜し出してそれを越える左カットオフ値を設定しようとする。このようなプリアンブル配列は収集データから除外されるプライマー配列や既知の配列を含むことができる。この後者のステップによりこのソフトウェアにより呼び出した配列が最小量の人間の介在と結合される機会が改善される。以下に本発明の方法の各機能の詳細な説明を行う。本発明の図示する実施例は後述する有用な特徴の応用を例示するものであり、各実施例の下記の検討においてこれらおよびその他の有用な新しい特徴がさらに参照される。これらの典型的な実施例は本発明の方法を実施するのに必要な方法および装置の範囲を限定するものではない。図１において、塩基呼出しソフトウェアは最初に入力データセット１０１について前処理ステップ１０２を実施する。前処理はスペクトル分離、背景除去および入力データセット１０１の補間を含むことができる。次に、前処理したデータセット１０３はステップ１０４−１０６へ入り、前処理したデータの連続するサンプルセグメントが読み出される。サンプルセグメント１０４は効率的な信号分析を提供する任意適切なサイズとすることができる。本発明の最も好ましい実施例では、第１のセグメントは２０４８走査線サンプルである。後続するセグメントも２０４８サンプルでちり、１４８サンプルが前のセグメントに重複している。以下の説明は最も好ましいサンプルセグメントサイズに基づいているが、本発明の範囲はそのセグメントサイズに限定されるものではない。各サンプルセグメント１０４は最初に粗いバンド間隔を推定するために分析される。その後、セグメント１０４は第２の時間において予測されたバンド間隔を細分するために分析される。バンド間隔によりブラインドデコンボルーション中に利用される再構成フィルターの選択が駆動される。バンド間隔およびバンド幅は逆関係である。２０４８走査線のサンプルセグメントが２度読み出され（細分化サンプルセグメント）その２０４８走査線セグメントについてそのバンド間隔が測定されて正規化されると、２０４８サンプルの次のサンプルセグメントが読み出される。次のサンプルセグメントは前のセグメントに１４８走査線（すなわち、およそ１５ヌクレオチド塩基）だけ重複して隣接セグメントのフレームおよび相対的位置決めを確立する。最終サンプルセグメント１０４に達するまで、後続するセグメント１０４は同様に処理される。元のデータセットにおいて２０４８よりも少ない走査線しか利用できない場合には、擬似ランダムノイズを発生して必要な２０４８サンプルへサンプルセグメントを補充する。非ランダムノイズはブラインドデコンボルーションおよびアライメントステップ中に不適切な処理を生じるため、擬似ランダムノイズは好ましい。全てのサンプルセグメントが処理される（２回読み出され、正規化されセグメントが配列される）と、処理され配列されたデータは３つのファジー論理ブロックにおいて分析される。ファジー論理では多値論理によりピーク検出が改善される。ファジー論理を使用することにより、ギャツプは“幾分大きく”なり、バンドは“それほど高くはなく”なる。また、ファジー論理により論理演算子（例えば、ＡＮＤ，ＯＲ，ＮＯＴ）が提供される。塩基呼出し方法における各論理ブロックはそのデータの特別な分析を提供する。論理ブロックは正規化された入力データを処理し、バンドの近傍バンドに基づく絶対的および相対的基準に基づいて各バンドを本質的に分類する。例えば、ファジー論理ブロック１０８は各塩基、その上流コンテキストを分析して呼び出した各バンド（塩基アイデンティティ）へ品質値を割り当てる。品質値の割当てに続いて、ファジー論理ブロック１０８は処理され配列されたデータ１０７内の高品質データの最大ブロックも識別する。高品質データブロックに対する右左カットオフ点は記録され左右カットオフ点として設定される。出力データセット１０９は完成したトレース、品質値を割り当てられた呼び出した塩基および示唆された左右カットオフ点を含んでいる。出力データセット１０９は、オプションとして、全てのバンドをほぼ同じバンド振幅へ正規化するように視覚的に改善して視覚的に改善されないトレースの鋸歯の様相を除去することができる。Ａ．前処理図２において、入力データセット２０１は２０４８ｘ４トレースマトリクスである。最初のステップは前記背景信号を含む最初の走査線およびこのような信号（トレース２０２ａ参照）を含む最終走査線について入力データセット２０１を分析することにより開始および終了点を確立することである。プライマーピーク等のアーチファクトによる大きい信号スパイクは除外される。図２３において、前処理開始／終了サブルーチンは信号振幅に基づいて開始および終了点を識別する。開始および終了点は後続操作に対して使用可能な信号を定義する。典型的に、使用可能信号は最大最左信号振幅（いわゆるプライマーピーク）のすぐ左で始まり、サンプルセグメントデータ終りもしくは最大信号振幅の別の領域に遭遇するまで続く。（典型的に、後者のピークはバイオストレプテーション（ｂｉｏｓｔｒｅｐｔａｔｉｏｎ）ピークと呼ばれる）。特に、ステップ２３０２から２３０５はサンプルセグメントをゾーンへ分割し各ゾーン内の最大信号振幅を求めることにより想定開始および終了点を識別する。ステップ２３０６は第２のプライマーピークが存在するかどうかを確認する。第２のピークが存在すれば、ステップ２３０６は第２のプライマーピークに開始点を設定する。ステップ２３０７および２３０８は開始および終了点の最終調整を行い、信号の前半の平均よりも低い振幅の第１のサンプルへ開始点を設定し、終了点を終りから３５０サンプル設定し戻す。図２において、次に前処理開始／終了データ２０２のベースラインがステップ２０３で求められる。前処理開始／終了データ２０２の各フロオロについて単一ベースラインが確立される。前処理開始／終了データ２０２からベースラインを減じてベースライン除去データセット２０３が発生される。例えば、ベースライン除去の後で、局所化データセット２０７はベースライン除去データセット２０８となる。本発明のより好ましい実施例では、単一ベースラインは全レーンからのデータに基づいて確立される。それにより１レーン内の１ランの不十分に分解能の塩基近くのベースラインが求められる。確実に共通ベースラインを有する２つのフロオロは無いため、現在利用できるＤＮＡ配列データはこの実施例を不可能にする。図２２において、ベースラインは前処理開始／終了２２０１のベースラインを推定して確立することができる。実施例では、各トレースレーンは増大する指数しきい値を使用して２回処理される。左から右へ１つのパスが行われ（１つのベースラインを確立する）（ステップ２２０２）、次のパスが右から左へ行われる（もう１つのベースラインを確立する）（ステップ２２０３）。２つのベースライン近似の幾何学的手段をとることにより、かなり自然な減数が作り出される。（サンプルトレース２２０５および２２０６参照）。増大する指数しきい値を使用してベースライン近似を確立するために、最初の１０サンプル内で見つかった最低点にしきい値が初期設定される。連続する各サンプルが考慮されると、上向きに緩やかに傾斜する指数によりしきい値が増分される。サブしきい値サンプルに遭遇すると、前のサブしきい値点と現在の点との間のベースラインが点間の線分として取り出される。しきい値は新しいサブしきい値サンプル値へリセットされプロセスは継続する。１００サンプル後にサブしきい値点が見つからなければ、ベースラインの１００点セグメントが計算され（ここでも、区分的に線形）、指数の増大率が増加する。指数は７５サンプルのスパンにわたって最も最近のサブしきい点の振幅の１／３だけ増大するように計算される。ベースライン除去に続いて、ベースライン除去されたデータセット２０３は好ましくはスペクトル分離または漏れ分離（ｌｅａｋａｇｅｓｅｐａｒａｔｅ）される。このステップにより毛管電気泳動データの品質が著しく改善される。信号対ノイズ比が２．０以下のスラブゲルについて、分離ステップ２０４によりデータ品質は著しく改善されて読出し不能データが読み出せるようになる。好ましくは、分離ステップ２０４は前処理中にユーザ入力なしで実施される。４フルオロ単一レーンデータについて、ベースライン除去データセット２０３がスペクトル分離されるっ単一フルオロ４レーンデータについて、データセット２０３は漏れ分離される。いずれかの分離について、分離アルゴリズム２０４は分離を実施するのに使用される特性マトリクス（ＣＨＭ）を形成する。スペクトル分離について、特性マトリクスは４フロオロデータ内のスペクトルクロストークを捕捉する。漏れ分離について、特性マトリクスは隣接レーン内の信号に対する問題とするレーンの中心の信号からの漏れの比率から発生される。毛管電気泳動データについて、この比率は“ピーク中心”において測定される。スラブゲルデータについては、特性マトリクスを発生するのに全データ点が使用される。分離マトリクスは次式に従って計算される。ＳＳＴ＝ｉｎｖ（ＣＨＭ^*ＣＨＭ^T）^-1 ここに、ＣＨＭのカラムは各レーンに対する比率を保持している。比率は各カラム内の最大要素が１の値を有するように正規化される。分離２０４の結果として分離されたデータセット２０４が得られる。バンド当たり少なくとも８走査線（サンプル）を含む前処理されたデータ２０６について処理ステップ１０４−１０６が最適に実施される。バンド当たり走査線数を増すために、ベースライン除去データセット２０３もしくは分離データセット２０４はオプションとして３次スプライン補間（ｃｕｂｉｃｓｐｌｉｎｅｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）２０５を使用してサンプル数を２倍もしくは３倍に増すことができる。Ｂ．読み出し図３において、例示した読出ステップは２０４８走査線のサンプルセグメント３０１を分析する。各サンプルセグメント３０１は最初にブラインドデコンボルーションを行って未知のローレンシアンブラーリング（Ｌａｕｒｅｎｔｉａｎｂｌｕｒｒｉｎｇ）機能の影響を相殺してトレースの振幅を正規化する。ブラインドデコンボルーションは、本開示の一部としてここに組み入れられている、ティ．ジー．ストッカムおよびジェー．ジー．アイベスの米国特許（第５，２７３，６３２号）に記載されている。本発明の方法にはストッカムおよびアイベスの方法を凌ぐ下記の改善が含まれている。最初の２０４８サンプルはフィルターバンド幅（“ＦＢＷ”）値に対する初期狭バンド推量によりブラインドデコンボルーションされる。狭バンド推量は初期読取値がサンプルセグメントに沿ったバンド密度を過大評価しないようにものとされる。バンド密度の伝統的な推定値が与えられると、それに続くより適したＦＢＷが選択され、それを使用してセグメントが再読出しされる。各セグメントの第２の読出しについて選択されるＦＢＷも引き続くセグメントの第１読出しに使用されるＦＢＷとして利用できる。最善ＦＢＷを求めるこの反復方法は実際上非常に貴重であることが判っており、バンド密度はおよそ６サンプル／バンドからおよそ５０サンプル／バンドまで変動することができ、所与のラダー内だけでなく配列ラン毎に行われる。本発明の実施例では、この方法は採択できる広範な入力に適合することができる。本発明の方法はブラインドデコンボルーション３０２中にフィルターバンド幅（ＦＢＷ）を選択する手段を含んでいる。実施例では、次式を使用してフィルターバンド幅に中央バンド間隔がマップされる。Ｋ＝２^*ｓｑｒｔ（ｌｎ（０．２３）／−０．５）ＦＢＷ＝０．５＋（Ｋ／ｍｅｄ＿ｂａｎｄ＿ｓｐａｃｉｎｇ）^* （２０４８／（２^*ｐｉ））ブラインドデコンボルーションステップ３０２は信号をデブラー（ｄｂｌｕｒ）又は鮮明にしてその振幅を正規化する。続くブラインドデコンボルーションでは、エキストラ正規化機能３０３がサンプル内の移動度差によるバンド間隔を調整する。また、エキストラ正規化機能３０３は特に１つ以上のレーンが拡張領域に対してアークバンド−ライトであるモノ、ジもしくはトリ−ヌクレオチド反復の領域において、ブラインドデコンボルーションがスプリアスバンドを生成する傾向も修正する。図４において、エキストラ正規化３０３はブラインドデコンボルーションにより生成される２種のアーチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）を修正する。パス４０６−４１０はバンド−ライトレーン内で生成されるアーチファクトを相殺する。簡単にいえば、相対レーン信号強度および相対レーンバンド周波数を比較することによりブラインドデコンボルーションされたデータセット４０６がバンドーライトレーンに対して走査される。レーン信号強度分析に使用されるプロクシ（ｐｒｏｘｙ）はキャッシュレーンで見つけられる第９７番パーセント点信号振幅である。バンド周波数に使用されるプロクシは問題とするレーンが最大信号振幅を有する信号の割合である。サンプルセグメント内の４つの全レーン内で見つかる全バンドの１５％よりも少ないレーンであって、他のレーンに較べてバンド振幅が低ければ、そのレーン内のバンドの振幅は減衰される。バンド振幅が最低であれば、それらの振幅は半分に減衰される。最低よりも上のバンド振幅であれば、振幅は元のバンド振幅の３／４まで減衰される。それとは対照的に、Ａ，Ｇ，ＣおよびＴの周波数が等しい理想的な配列データでは、各トレースは時間の２５％を占めなければならな１い。エキストラ正規化パス４０１−４０３はレーン間の移動度差を修正して実際のバンド−ライト減衰４０４を実施する。簡単にいえば、ブラインドデコンボルーション４０１は過大もしくは一致バンドにより任意の領域を識別するように分析される。これらの領域はゼロ（ベースライン）に設定される。これらの領域がゼロに設定されなければ、モンテカルロアライメントアルゴリズム４０３はそれらを分離するように焦点を合わせた異常なアライメントを生じる。図１４において、移動度シフトはオートラジオグラフおよび特にゲルのエッジ近くの単一フルオロ４レーンデータで最も顕著である。前記したストッカムおよびアイベスの従来の方法では、バンド間隔をできる限りほぼ均一な値へ駆動してレーンをアラインするように試みるアルゴリズムが記載されている。適切にアライメントされないと、多くの真のバンドは他のバンドの蔭とされて検出されなくなるため、この方法は制限される。アルゴリズムは検出されたバンド間の間隔を正規化しようと試みはしたが、データ内に存在する大多数のバンドしか知らない。本発明はバンド位置や間隔情報を使用しないアルゴリズムを使用する。本発明では、ベースラインを共有する時のデータの４つのレーン全ての“包絡線”の積分を最大にしようとする。ｘ軸がＡおよびＧレーン間の関係を定義し、ｙ軸がＡＧ関係とＣレーン間の関係を定義し、ｚ軸がＡＧＣ関係とＴレーン間の関係を定義する３Ｄ空間のモンテカルロ探索を使用してアライメントが達成される。考えられるアライメントの初期集合（ｉｎｉｔｉａｌｓｅｔ）が選択され、各三つ組（ｔｒｉｐｌｅ）がアラインされるトレースに適用され、得られる包絡線の積分が計算される。次に、最大積分が得られる三つ組の部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）が細分される。最低積分を生じる三つ組は考慮する集合から除去される。それは最大積分を生じる三つ組のランダム変更から得られる三つ組と置換される。最大数の反復が生じるかあるいは高積分三つ組集合内の変動が適切な低い値に達すると、最大を生じる三つ組が考慮するセグメントに対するアライメントベクトルとして選択される。特に、ｘ軸がトレース₁とトレース₂間のオフセットを指定し、ｙ軸がトレース₁ ，₂レジストリとトレース₃間のオフセットを指定し、ｚ軸がトレース₁，₂，₃レジストリとトレース₄間のオフセットを指定する３次元空間内で探索が行われる（１４０１参照）。利用するアルゴリズムは元々ＴｈｅＣｏｍｐｕｔｅｒＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．４にダブリュエル．プライスが記載したものであり、本開示の一部としてここに組み入れられている。最初に、１組の想定アライメント解１４０１が発生される。空間内の点周りの６つの同心立方体の格子点のアドレスが初期アライメント解として使用される。初めて手順が使用される時、同心立方体格子の中心点は原点（ｘ₀＝０，ｙ₀＝０，ｚ₀＝０）である。後続する呼出しは格子を原点に中心合わせすることを継続するか、もしくは格子を前のアライメント解（ｘ_n-1，ｙ_n-1，ｚ_n-1）に中心合わせして探索をバイアスすることができる。各アライメント推量は４値のシフトベクトルへ変換され、１つの値はゼロである。マトリクス内の各トレースはシフトベクトル内に指定された量だけシフトされ、シフトされたトレースの包絡線が得られ（トレースに沿った各位置で見つかる４つのトレース値の最大値）合計される。和はアライメント推量により作り出される包絡線の積分を表す。低積分値は不十分なアライメントを表し（例えば、１４０２参照、そこではバンドは“肩を並べて”配置されるのではなく他の後ろに配列される）、高積分値は良好なアライメントに対応する（例えば、１４０７参照、そこでは全バンドが完全に露呈され“肩を並べて”配置される）。全てのアライメント推量が評価されると、最悪アライメント解が最善アライメント解１４０５の小さいランダム摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）により置換される。新しいアライメント解が評価され、プロセスが繰り返され、新しい最悪アライメントが新しい最善アライメントの摂動と置換される。最後に、３Ｄ空間内の１組の点が最善アライメント解１４０６の周りに収束する。図３において、続いてエキストラ正規化３０３、ステップ３０４、ピーク検出および細分が行われる。次に、アラインされたトレースの想定ピーク検出が行われる。図５において、ブラインドデコンボルーション、エキストラ正規化データセット５０１に想定ピーク検出５０２が実施される（無停止、減衰および相対移動度修正）。トレース包絡線が最初に求められる。ストッカムおよびアイベスの特許には基礎データから引き出されるしきい値により各トレース内のピークを別別に検出することが記載されている。本発明の方法では、トレース包絡線はピーク検出されしきい値は利用されない。ピークはその２つの近傍のいずれかよりも高いサンプルとして自由に定義される。後続する処理はこの自由に定義された想定ピークリストを抜粋する。このピーク検出形式はより高速（４ではなく１トレース）かつ誤差を受けにくい（サブしきい値ピークはない）。これに対して、ストッカムおよびアイベスの特許では、そのアライメントアルゴリズムがピーク位置情報を使用してレーンアライメントを求めようとするため、個別のトレースピーク検出を必要とする。挿入誤差を含む想定バンド検出５０２における誤差を識別（同定）するために、各想定ピークの瞬時間隔、クロスバンディング、高さ、および隣接バンドとの間隔が測定される（ステップ５０３）。これらの観察された間隔測定値は二次曲線に当てはめられる。この二次適合は全読出しセグメントに沿ったバンド間隔の期待値として使用される。期待されるバンド間隔を定義するこの方法は、間隔が極端に変化するセグメントだけでなく、ストッカムおよびアイベスの特許と同様に、平均間隔が適切な期待値であるセグメントも処理するのに十分な汎用性である。本発明の方法では、削除の挿入および領域を十分識別（同定）するのにより多くの情報が必要であることが判っており、その結果、本発明の方法は一連の挿入および削除を除去することができる。次に、３つのファジー論理ブロック５０４の最初のブロック、ＯｍｉｔＯｋＮＦｕｚｚｙＬｏｇｉｃ、を使用してバンド検出プロセスの最尤挿入アーチファクトであるバンドが識別される。このブロックは検出をＯＫ，ＡＭＢＩＧＵＯＵＳ，もしくはＯＭＩＴとして分類する。ＯＭＩＴ分類を与えた想定バンドは想定ピークセットから除去される。図６において、各バンドはその属性６０１をいくつかをその第１の論理ブロックにより調べている。バンドがその近傍にいずれかについてあるべきところにあれば、変数ｏｋＳｐが設定される（ステップ６０２）。図７において、ＯｍｉｔＯｋＮＯｋＳｐａｃｉｎｇファジー論理ブロックに対するメンバーシップ関数の目的は期待された間隔の整数倍である間隔測定値を“受け入れる”ことである。したがって、観察された間隔は期待された間隔に対するその関係を使用して〔０．．１〕の間隔の値へ正規化される（ステップ７０２）。ブロック７０２に示す例では、０．３の正規化された間隔が０．７の真値によりＯＫであることが判る（ステップ７０２および例７０４）。バンド移動、圧縮、バンド形状（したがって、バンドピーク位置）、および他のファクターの経過が与えられると、期待された間隔が１３である時にその近傍から１７間隔を取られたピークは理想的でも酷いものでもない。図８において、ＯｍｉｔＯｋＮＢａｄＳｃａｐｉｎｇファジー論理ブロックについて、メンバーシップ関数の目的は期待された間隔の整数倍ではない間隔測定値を“咎める”ことである。したがって、観察された間隔は期待された間隔に対するその関係を使用して〔０．．１〕の間隔へ正規化される（ステップ８０２）。ステップ８０２−０３および例８０４に示す例では、０．３の正規化された間隔が０．５の真値によりＢＡＤであることが判り、この間隔はそれほど良い間隔ではない。バンドがその近傍のいずれかに対してあるべき所になければ、変数ａｂＳｐが “真”に設定される（ステップ６０３）。“クロスバンディング”の量（すなわち、読出セグメントの特別の領域に対する２つのバンドによる競合<ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ>量）が高ければ、変数ｂａｄＸｂが“真”に設定される（ステップ６０４）。同様に、クロスバンディングが無視できる場合には、変数ｎｅｇｌＸｂが“真”に設定される。図９において、クロスバンディングは検出されたバンドの基底にある走査線に対する競合量を指定する。疑わしい性質のバンドはその頂点がベースラインに近いため広範なクロスバンド比を有する。しかしながら、有意振幅の圧縮および停止によりそれらのクロスバンディングを測定させることができる。クロスバンディングメンバーシップ関数はＯＫもしくはＡＭＢＩＧＵＯＵＳバンドを識別するのに最もよく使用される。提供した図では（例９０１）、第１の複体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は同じ位置を張り合う２つのバンドを有し、２番目に大きいバンドは最大の半分の振幅である。クロスバンディング比（ステップ９０２）は次に大きいバンド、ここではＸｂ＝２、で除した最大バンドの振幅である。１つのバンドは明らかに選択したバンドである第２の複体では、この比率は無限大に近づく。クロスバンディング比が１．５であるステップ９０３の例では、ｂａｄＸｂメンバーシップは０．２５であり、ネグリジブル（ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅ）Ｘｂメンバーシップは１．０である、すなわち、１．５の比率は無視できることが判るがバンドの正当性が問題となる。バンド高さも極小かｏｋか分類される（ステップ６０５）。図１０において、高さメンバーシップ関数に対して、メンバーシップ集合はデータを提供するマシンから観察される一般的な信号品質について最善にカスタマイズされる。実施例では、バンドが交差する所で測定した振幅の中間（メデイアン）値の関数により高さメンバーシップ関数中断点が求められる。特に、ｔｉｎｙＨｔ関数は０．４^* ｍｅｄ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ＿ｐｔで中断し、１．１^*ｍｅｄ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ＿ｐｔでゼロである。同様に、ｏｋＨｔ関数は０．５^*ｍｅｄ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ＿ｐｔでゼロとなり、１．５^*ｍｅｄ＿ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ＿ｐｔで１．０に平坦化される。ブラインドデコンボルーションプロセスはバンド振幅を〔０．．１〕間隔へ正規化し、大概のバンドは０．１を越える高さを有する。この例は高さが０．０７よりも低くなる時にその高さに基づいてバンドを咎め始める点で典型的である。ステップ１００２に示す例では、測定されたバンド高さは０．１であり１．０のｏｋＨｔ内および０．０のｔｉｎｙＨｔ内にメンバーシップを有している。この集合の例に従って、バンドは十分な高さを有する。次に、これら６つの変数はファジー組合せ論理への入力となる。ファジー論理の著しい利点はこれらの変数を含むルール間の矛盾を協調して除去できることである。ＯＫとして分類されるバンドはクロスバンディングを無視することができＯＫ高さもしくはＯＫ間隔を有するものである（ステップ６０６）。曖昧として分類されるバンドは悪いクロスバンディングを示し、ＯＫ高さもしくはＯＫ間隔であり僅かな高さである（ステップ６０７）。典型的に、曖昧なバンドは十分な振幅で正しく配置されるがクロスバンディングが著しいバンドである（ステップ６０７）。明確な挿入として分類される、したがって省かれる、バンドは無視できる高さを特徴とする（ステップ６０８）。通常クロスバンディング測定値が信頼できないベースラインの非常に近くで挿入が行われるため、バンドを省くべきかを判断する時にクロスバンディングは考慮されない。次に、ルールファイヤリング（ｒｕｌｅｆｉｒｉｎｇ）の強度を使用して出力集合が校正又はスケール処理される（ステップ６０９）。図示する例では（６１０）、出力集合ＯＫは振幅１．０で校正され、出力集合Ｎ（曖昧）は０．２５で校正され、集合ＯＭＩＴは０．０で校正される。逆ファジー化（ｄｅｆｕｚｚｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、すなわち出力ルール集合からきっぱりした（結論）値を得る、ことは得られる“マス（ｍａｓｓ）”の重心を計算して達成される。本例では、バンドはＯＫであるという結論に達する（ステップ６１１）。図５において、ファジー論理ブロック５０４に続いて、各ピークの瞬時間隔、瞬時バンド幅、その左近傍への間隔（左間隔）、バンド幅および呼び出した塩基が再測定される（ステップ５０５）。これらの観察されたバンド間隔は２次曲線に当てはめられ、それは読出しセグメントに沿った期待された間隔として利用できる。同様に、観察されたバンド幅測定値も２次曲線に当てはめられ、それは読出しセグメントに沿った期待された間隔として利用できる。次に、第２のファジー論理ブロック５０６、ＧａｐＣｈｅｃｋＦｕｚｚｙＬｏｇｉｃ、はバンドもしくはバンド間のギャップを識別し、２次適合により予測されるバンド間隔を達成するために１つ以上のバンドを挿入する必要がある。このブロックは検出をＮＯＲＭＡＬ，ＳＰＬＩＴもしくはＳＵＦＦＥＲＩＮＧＦＲＯＭＵＰＳＴＥＡＭＴＵＲＢＵＬＥＮＣＥとして分類する。ギャップが分裂され適切な数のバンドが挿入される（ステップ５０７）。ＳＰＬＩＴ分類を与えるバンドが適切な回数分裂され、分割点は分裂される間隔の重心である。重心はＳＰＬＩＴバンドとその左近傍間の溝（ｔｒｏｕｇｈ）の底部ではなく、不十分に規定されたバンドの肩部上に挿入を配置するのに使用される。サイズ間隔および期待されたバンド間隔に応じて、１つ以上の挿入を作ることができる。各挿入は規定されたＢｅｇｉｎ，ＭｉｄｄｌｅおよびＥｎｄ走査線値を有する。図１１をより詳細に調べると、ファジー論理ブロックＧａｐＣｈｅｃｋにより考慮される各バンド対は測定されるいくつかの属性を有している（ステップ１１０１）。特に、期待された間隔曲線、曲線幅曲線、バンド幅、左ギャップ（最左近傍とのギャップ）および配列が求められる。上流配列にはＧＣ−リッチネスの測度が割り当てられる（ステップ１１０２）。これらの測定値は左へ５バンドの配列のＧＣリッチネスと結び付けると、左へ付加バンドを必要とするバンドの識別に有益である。このギャップは期待された間隔に関して間隔［−１．．無限大］上へ正規化される（ステップ１１０３）。あるべき所にバンドが配置されているかどうかを確認する（その絶対間隔には関係なく間隔曲線がどれだけ離れているかに焦点を合わせる）ＯｍｉｔＯｋＮ論理とは異なり、ＧａｐＣｈｅｃｋ論理ブロックではバンドのその左近傍からの絶対距離が関心事である。ギャップが間隔曲線の整数倍であれば（例えば、その左近傍から３間隔）、その左へ２つのバンドを挿入して適切な間隔を確立する。対内のバンド間のギャップの他に、この論理はバンドの幅も考慮する。バンド幅は間隔［−１．．無限大］上へ正規化される（ステップ１１０４）。通常、バンド分解能が減少して観察されたトレース内の領域に含まれるピークが所要数よりも少なければ、対内の一方もしくは両方のバンドは本来の幅よりも広い。バンド間のギャップは限界に近くしてバンド幅を決定要因とすることができる。最後に、大きいギャップおよびバンド幅は上流ＧＣ−リッチネスの存在下ではより非攻撃的に調べなければならない。バンド対内の各バンドの正規化された左ギャップは大（ステップ１１０５）、中（ステップ１１０６）もしくは小（ステップ１１０７）として分類される。図１２はＧａｐＣｈｅｃｋバンドギャップメンバーシップ関数の詳細を示す。簡単にいえば、メンバーシップ関数は期待値（ｅｇｐ）とは異なる場合の観察されたギャップ測定値（ｏｇｐ）を特徴とする。ギャップはＢ_nおよびＢ_n-1間で測定される（ステップ１２０１）。観察されたギャップは式ｎｇｐ＝ｏｇｐ／ｅｇｐ− １．０により間隔［−１．．無限大］へ正規化される。ステップ１２０３の例では、０．１の正規化されたギャップは全ての集合内に０．０メンバーシップを有する、すなわち、ギャップは期待値に合致し小、中もしくは大ではない（ステップ１２０３）。図１１では、ステップ１１０８においてバンド対内の各バンドの正規化され幅は大として分類される。図１３はＧａｐＣｈｅｃｋバンド幅メンバーシップ関数の詳細を示す。このメンバーシップ関数は期待値（ｅｗｄ）を越える場合の観察されたバンド幅測定値（ｏｗｄ）を特徴ずける。幅はＢ_nの開始点および終了点で測定される（ステップ１３０１）。ステップ１３０３の例では、０．２の正規化されたギャップは０．２のＢｉｇＷｉｄｔｈ内にメンバーシップを有し、バンドはその幅ではないが期待されたものよりも広い（ステップ１３０４）。図１１では、ＲＵＬＥＮＯＲＭ（ステップ１１０９）において、下記のいずれかが真であればバンド_nはその左ギャップ分裂（ｓｐｉｉｔ）が必要とマークされることはない。ａ）大きいギャップ（ｂｉｇＧａｐ_n）があるが上流配列はＧＣ−リッチである、ｂ）対内の第１のバンドとのギャップは小（ｓｍｌＧａｐ_n-1）であり２つのバンドは広くない（！ｂｉｇＷｉｄ_nおよび！ｂｉｇＷｉｄ_n-1）（すなわち、バンド間ギャップは無視）、あるいは、ｃ）２つのバンド間ギャップは大ではない（！ｂｉｇＧａｐ_n）。ステップ１１１０において、ＲＵＬＥＳＰＬＩＴは下記のいずれかが真であればバンド_nをその左ギャップ分裂が必要であるとマークする、ａ）２つのバンド間ギャップが大であり（ｂｉｇＧａｐ_n）第１および／もしくは第２のバンドが広い（ｂｉｇＷｉｄ_n-1もしくはｂｉｇＷｉｄ_n）、あるいは、ｂ）２つのバンド間ギャップが大であり（ｂｉｇＧａｐ_n）第１のバンドの左のギャップは小ではなく（！ｓｍｌＧａｐ_n-1）上流配列はｇｃ−リッチではない（！ｇｃｒｉｃｈ）。ＲＵＬＥＳＰＬＩＴ（ａ）は広いおよび正規のバンドの組合せを検出し（いずれかの順序）、ＲＵＬＥＳＰＬＩＴ（ｂ）は大きいギャップにより分離される一続きの広いバンドを選択する。次に、ルールファイヤリングの強度を使用して出力集合を校正又はスケール処理する（ステップ１１１１）。１１１２の例では、出力集合ＮＯＲＭＡＬは振幅１．０により校正され出力集合ＳＰＬＴは０．２５で校正される。得られる“マス”の重心を計算して結論が形成される。１１１２の例では、バンドはＮＯＲＭＡＬであるという結論に達する。想定ピーク挿入誤差を識別するために、ステップ５０７においてクロスバンディング、瞬時間隔、バンド高さ、バンド振幅、および隣接バンドとの間隔（左右ギャップ）が再計算される。観察されたバンド間隔測定値は２次曲線でフィットされるか又はこれに当てはめられる。この２次適合は全読出しセグメントに沿ったバンド間隔の期待値として使用される。次に、ＯｍｉｔＯｋＮＦｕｚｚｙ論理ブロック（ステップ５０８）を使用してバンド検出プロセスの最尤挿入アーチファクトであるバンドが識別される。任意の全てのこのようなバンドが想定ピーク集合から除去される。新たに提示される挿入はこのステップにおいて削除することができる。ファジー論理バンド細分ステージは、リーダーが信号脱落の２，３の塩基領域に遭遇する時に、挿入および削除を低減して任意のバンド呼出しを防止するという重要な利点を付加する。挿入検出の詳細については図６および添付文を参照されたい。この処理を乗り切る想定ピークの集合は考慮する読出しセグメントに対するバンドとして記録される（ステップ５０９）。Ｃ．処理およびアライメント図１において、読出し機能１０４−１０６は全ての入力データセット１０１が分析されるまでサンプルセグメントを連続的に処理する。各サンプルセグメント１０４は所定の量だけ前のサンプルセグメントに重複するため、読み出されアラインされた各サンプルセグメント１０６の相対的位置決めは既知である。ステップ１０７は読み出されアラインされた全サンプルセグメント１０６を組み立てて、処理され再組立てられたサンプルセグメント１０７を形成する。Ｄ．後処理編集本発明の実施例では、最終プロセスが１組の測定されたバンド特徴を第３のファジー論理ブロック、ＢａｓｅＱｕａｌファジー論理ブロック１０９により分析する。このブロックは品質測度を呼び出した各バンドへ割り当てる。このブロックはバンド高さ、幅、形状、左右ギャップ、クロスバンディングおよびベースライン“バズ（ｂｕｚｚ）”に基づいて評価する。この品質値は間隔（０．０から１．０）で後続する配列アライメント／併合（ｍｅｒｇｉｎｇ）ステップ中に使用することができる。本発明は品質値を使用して他の配列とアライメントおよび併合させて大きなＤＮＡ配列とすると考えられる高品質配列の最長ブロックを選択する。左右カットオフ点を選択するアルゴリズムは表面を発生し、ｘ軸にはＭＯＶＩＮＧＡＶＥＲＡＧＥＦＩＬＴＥＲＷＩＤＴＨとラベルがつけられ、ｙ軸にはＴＨＲＥＳＨＯＬＤとラベルがつけられ、ｚ軸にはＲＥＡＤＬＥＮＧＴＨとラベルがつけられる。品質値は６個の移動平均フィルターにより濾波され、濾波されたデータは９つのしきい値と比較される。前記しきい値濾波された品質値の最長隣接ブロックは特定のフィルター幅、しきい値対に対する表面の読出した長さ値を与える。最後に、この表面は広域フィルターおよび低しきい値読出し長さにわたって狭域フィルターおよび高しきい値読出し長さが有利であるように校正される。次に、表面最大ｚ値が読出し長さとして選択され、関連する前記最初および最後のしきい値濾波品質値指標は、それぞれ、左および右のカットオフ点として利用できる。このＥＤＩＴステージに“プリアンブル”配列が提出され、かつ確立された左カットオフ点を越えて配列が見つかる場合には、カットオフ点はさらに左へ移されて“プリアンブル”配列は除外される。図１５において、ＢａｓｅＱｕａｌファジー論理アルゴリズムは呼び出した塩基の品質を評価する。ある配列アセンブリアルゴリズムは正しくない配列の領域を含む配列の組立てができず、他の配列アセンブリアルゴリズムは各塩基がその品質（あるいは逆に、その誤差の確率）の品質を伴う場合しか配列の組立てをできないことが経験から判っている。前者の場合、正しくない配列領域がアセンブリプログラムにより考慮されなくされると、良好な配列の大部分がうまく組み立てられる。後者の場合、低品質領域が識別されると、全体塩基呼出しプロダクトが組み立てられる。いすれの場合も、孤立して遭遇する正しくない配列は通常経験のある技師により外観検査で識別される。このプロセスは時間を消費し単調で微妙な誤差は検出されないことがある。しかしながら、一般的に正しくない塩基呼出しは基礎データトレースが限界に近い所でなされる。ＢａｓｅＱｕａｌルーチンは呼び出した各塩基の多数の特徴を測定および分析することにより品質評価を自動化する（ステップ１５０１）。ファジー論理を使用してあるバンドプレゼンテーションパターンを識別しそれらに品質のレベルが割り当てられる。これらのバンド特徴にはバンド高さ、クロスバンディング、バンド幅、バンド形状、バンドの小ギャップおよびバンドの大ギャップが含まれる。バンド高さ変動は多くの分類において有益である。６つのファジー変数を使用してバンドの高さが分類される［極小（ｔｉｎｙ）、小（ｓｍａｌｌ）、中（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、正規（ｎｏｒｍａｌ）、高（ｔａｌｌ）および集約的に、ＯＫ］（ステップ１５０２）。ＢａｓｅＱｕａｌ高さメンバーシップ関数の詳細を示す図１６では、メンバーシップ関数は観察されたバンド高さ測定値を特徴とする。“極小”もくしは“小”の高さを有するバンドは通常疑わしく、極小バンドは単なる小よりもさらに疑わしい。中位高さのバンドおよび高いバンドも厳密な調査が必要である。高いバンドはアミド（ａｍｉｄ）停止、圧縮中に、スラブゲル、アヘチファクト（ａｒｔｉｆａｃｔｓ）上で見つかるために疑わしい。ステップ１６０２の例では、０．１８のバンド高さは１．０のＮｏｒｍａｌＨｅｉｇｈｔ内にメンバーシップを有する、すなわちバンドの高さは公差内であることが判る（例１６０３参照）。ステップ１５０３において、トレースの同じ領域に対する２つのトレースによる競合の測度であるクロスバンディングも有益である。図１７において、ＢａｓｅＱｕａｌクロスバンディングメンバーシップ関数は観察されたバンドのクロスバンディング測定値を特徴とする。クロスバンディング測定値は支配的なトレースの次の支配的なトレースに対する比率である。１．５よりも高い比率は無視できるクロスバンディングと考えられ、より低い比率（考えられる最低比率は１．０）は疑わしい。図１７０２の例に戻って、１．３５のクロスバンディング比は０．３３のｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅＸｂ内（および、否定！ｎｅｇｌｉｇｉｂｌｅＸｂ内の０．６７）にメンバーシップを有することが判る。ステップ１５０４において、バンド幅（観察されたバンド幅の２次適合（ｑｕａｄｉａｔｉｃｆｉｔ）に基づいて正規化された）はもう１つの有益な変数である。図１８において、ＢａｓｅＱｕａｌバンド幅メンバーシップ関数は、バンドの観察された幅が期待されたバンド幅に対してて正規化される。メンバーシップ関数の目的は正規化されたバンド幅がどれだけ正規であるかを確認することである。ステップ１８０２の例では、０．２の正規化された幅は１．０の正規集合内にメンバーシッブを有する（１８０３の例参照）。ステップ１５０５において、バンド形状、バンドの２次適合係数と理想的バンドの２次適合係数との間の線形相関係数は、異常な形状のバンドを識別する。ＢａｓｅＱｕａｌバンド形状メンバーシップ関数は塩基呼出しの品質を決定するのに有益である。ラン内で観察されるバンド高さと幅の範囲は著しく変動する。１実施例では、サンプルレート変換により観察されたバンド幅が正規化され、バンド振幅は１．０に正規化され、次に結果が理想的なガウス鐘（ベル）形状バンドと比較された。この方法は計算費用が高くつき、観察された形状に関する多くの情報がモルフィング（ｍｏｒｐｈｉｎｇ）プロセスを介して放棄される。より好ましい実施例では、各バンドの高さ値は２次曲線でフィットされるか又はこれに当てはめられる。同様に、理想的バンド形状が２次曲線に当てはめられる。（理想的バンド形状は正規の高さおよび期待された幅を有するように規定される）。この方法により各サンプル集合は同数の点へ換算される。これら２つのサンプル集合の線形相関係数として形状メトリック（ｍｅｔｒｉｃ）が取られる。この形状メトリックが０．５よりも小さければバンドの形状は“異常”であることが経験的に判っている。ステップ１９０２の例において、０．６の形状メトリックは１．０のＧｏｏｄＳｈａｐｅ内にメンバーシップを有することが判る（例１９０３参照）。ステップ１５０６において、他の２つの比率の比として定義された“ベースラインバズ（ｂａｓｅｌｉｎｅｂｕｚｚ）”は呼び出したバンドの領域（ドメイン）に対するいくつかのトレースによる競合があるトレース領域リージョン（通常は終端）を識別するのを助ける。トレースの限界（マージン）に向かってベースラインは極めてビジー（ｂｕｓｙ）となることがあり、それが基礎（アンダーライ）データの品質を処理してその上で読出しが行われると、疑わしくなる。ベースラインバズは正しくない信号処理、もくしは正しい処理を拒むほど誤差の多い基礎データから生じる。いずれの場合も、呼び出した配列は疑わなければならない。図２０において、バズ測定値が０．２よりも上であれば問題のある配列であるシグナルが開始される。ステップ２００３および例２００４において、０．２８のバズ測定値は０．６３のｏｋＢｕｚ内（および否定！ｏｋＢｕｚ内の０．３７）にメンバーシップを有する。この場合、バンドの品質が間題となる。ステップ１５０７において、バンドの左右近傍とのギャップはさらにバンド品質の評価における情報を与える変数である。これらの測定値は、前の全ての努力がその逆であるにもかかわらず、好ましい位置に近すぎるか遠すぎる位置に留まるバンドを識別するのを助ける。ＢａｓｅＱｕａｌバンド間隔メンバーシップ関数の詳細に関する図２１において、バンドの観察された間隔が期待された間隔に関して正規化される。メンバーシップ関数の目的は正規化されたバンド間隔がどれほど正規であるかを確認することである。ブロック２１０２および２１０３に示す例では、０．２の正規化された間隔は０．１のＯＫＳｐａｃｉｎｇ内のメンバーシップにより無条件（ｕｎｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ＯＫを受信する。ステップ１５０８において、いくつかの変数［例えば、バズ（ｂｕｚｚ）、幅（ｗｉｄｔｈ）、形状（ｓｈａｐｅ）、および間隔（ｓｐａｃｉｎｇ）］の論理的組合せがバンドへ品質値を割り当てるルールを追跡（ｔｒａｃｔａｂｌｅ）可能に維持するのを助ける。変数１Ｂａｄは１つの測度が公差（トーレランス）外であったことを示す。同様に、変数２Ｂａｄ，３Ｂａｄおよび４Ｂａｄは２つ、３つもくしは全ての測定値が公差外であることを示す。最後に、変数４Ｏｋは４つの全ての測定値が公差内であることを示す。続いて、一連の９つのルールを適用して品質評価が求められる。ＲＵＬＥＱＵＡＬ１０において、最低品質評価は高さが極小で不正確に配置位置づけされたバンドにより構成される（ステップ１５０９）。このルールにある程度一致するバンドについて、このルールは０付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。第２の品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ２０、は短く、クロスバンディングの兆候を示し、不正確に配置されたバンドにより構成される（ステップ１５１０）。このルールにある程度一致するバンドについて、このルールは１３付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。第３の品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ３０、は高さが極小で不正確に配置されたバンドにより構成される（ステップ１５１１）。このルールにある程度一致するバンドは２５付近に重心を有する出力集合への非ゼロ校正値を割り当てられる（ステップ１５１９）。第４の品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ４０、は小もくしは中の高さを有しクロスバンディングの兆候を示すかあるいは３Ｂａｄもくしは４Ｂａｄ属性を有するバンドにより構成される（ステップ１５１２）。このルールにある程度一致するバンドは３８付近に重心を有する出力集合への非ゼロ校正値を割り当てられる（ステップ１５１９）。第５の品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ５０、は小もくしは中の高さを有しある程度のクロスバンディングを示すかあるいは２Ｂａｄもくしは３Ｂａｄ属性を有するバンドにより構成される（悪い属性が１つ少ない点で品質クラス４よりも幾分良い）（ステップ１５１３）。このルールにある程度一致するバンドは５０付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。第６の品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ６０、はＯＫ高さを有しベースラインバズ、無視できないクロスバンディングの兆候を示すか、２Ｂａｄ属性を有するバンドへ適用される（ステップ１５１４）。このルールにある程度一致するバンドは６３付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。より高度の品質を有するバンドは第７から第９の品質評価を満たす。第７品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ７０、は３つの一般的クラスの中の１つのバンドから構成されている（ステップ１５１５）。１つのクラスのバンドはＯＫ高さ、僅かなベースラインバズ、無視できるクロスバンディングを有し、属性は２Ｂａｄである。もう１つのクラスのバンドは無視できるクロスバンディングを示し、ＯＫ高さを有し、ベースラインバズがなく、正しく配置されるが、幅が異常で形状が悪い（ｒｕｎｆｉｌと呼ばれるこのクラスは分解能の悪いランのバンド内へバンドが挿入されることを特徴とする）。最終クラスのバンドは４ＯＫ属性を有するが、高さが低く恐らくはあるパーセントのクロスバンディングを有する。このルールにある程度一致するバンドは７５付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。第８品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ８０、はＯＫ高さ、僅かなベースラインバズ、無視できるクロスバンディングを有するバンドにより構成されるが、属性は１Ｂａｄである（ステップ１５１６）。このルールにある程度一致する（多くがそうである）バンドは８８付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（例１５１９）。最高品質評価、ＲＵＬＥＱＵＡＬ９０、は外観上絶対的に何も悪くないバンドにより構成される（ステップ１５１７）。このルールにある程度一致する（やはり良い品質入力、多くがそうである）バンドは１００付近に重心を有する出力集合へ非ゼロ校正値を割り当てる（ステップ１５１９）。最後に、他の全てのファジー論理ブロックと同様に、出力集合は各ルールファイヤリングの強度により校正され、重心を計算して最終品質評価が求められる。Ｅ．最終配列アセンブリＢａｓｅＱｕａｌＦｕｚｚｙＬｏｇｉｃ分析からの最終品質評価は最終配列１０９の長さを制御する。高品質配列データが所望される場合、品質評価決定は最終配列の呼出し長さを制限することができる。長い呼出し長さが所望され、低品質配列が受け入れられる場合、品質評価が支援できることは他の配列分析から得られる配列データを相関させることである。例えば、重複する配列が得られる場合、品質評価はどの塩基呼出しがより信頼できるかを決定することができる。同様に、ＤＮＡの両方のストランドを利用できる場合、品質評価はより高い確率の塩基呼出しの同定を支援する。Ｆ．塩基呼出しソフトウェアのコンピュータによる実施本発明による塩基呼出しソフトウェアはＰｅｎｔｉｕｍ−および４８６−内蔵ＰＣ等の標準デスクトップコンピュータ上で実施することができる。プロセッサがそれほど強力ではないコンピュータも適切ではあるが、各入力データセットに対する全体処理時間は遅くなる。好ましくは、このようなコンピュータは少なくとも中央処理装置ダイナミックメモリおよび処理された情報を出力する装置を含む。本発明による塩基呼出しソフトウェアはコンピュータディスケット、着脱自在媒体、ハードドライプ、ＣＤ、磁気テープおよび同様な電子記憶手段を含む任意適切な記憶媒体上に格納することができる。本発明は数々の特定実施例と共に記載され図解されたが、ここに図解され記載された発明原理から逸脱せずに修正変更が可能であることを当業者は理解するであろう。本発明はその精神または主要特性から逸脱せずに、他の特定形態で実施し得る。上記実施例は全ての点で図解のためであって拘束するためではないと考えられるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マークス，アンディ，エフ. アメリカ合衆国84101 ユタ州，ソルトレイクシティ，サウスウエストテンプルナンバー 530，175

Claims

【特許請求の範囲】 1. 未処理核酸配列データ内の塩基アイデンティティの決定方法であって、該方法は、未処理核酸配列データを含む未処理入力データを受信するステップと、前記入力データを前処理して前処理されたデータを発生するステップと、前記前処理データのブラインドデコンボルーションによりブラインドデコンボルーションされたデータを発生するステップと、前記ブラインドデコンボルーションされたデータをエキストラ正規化してエキストラ正規化されたデータを発生するステップと、ピーク検出手段を使用して前記エキストラ正規化されたデータ内のピークを検出して処理されたデータを発生するステップと、ファジー論理編集手段を使用して前記処理されたデータの品質を編集して呼び出したヌクレオチド配列および前記呼び出した配列に対する少なくとも１つの品質値を発生するステップと、を含む塩基アイデンティティ決定方法。 2. ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を決定する方法であって、該方法は、ＤＮＡ配列分析を行うＤＮＡ分子の泳動パターンを符号化して入力データを発生する１組のレーン信号を与えるステップと、前記入力データを前処理して前処理されたデータを発生するステップであって、開始および終了点を同定するステップと、ベースラインノイズを除去するステップと、分離マトリクスを使用して前記入力データをスペトル分離してスペトルクロストークを修正するステップと、分離マトリクスを使用して前記入力データを漏れ分離してレーン漏れを修正するステップと、の少なくとも１つを含む前処理データ発生ステップと、前記前処理されたデータのブラインドデコンボルーションによりブラインドデコンボルーションされたデータを発生ステップであって、前記ブラインドデコンボルーションは前記前処理されたデータ内の信号をデブラーリングして信号振幅を正規化し、前記ブラインドデコンボルーションは反復フィルターバンド幅アルゴリズムを使用するブラインドデコンボルーションステップと、前記ブラインドデコンボルーションされたデータをエキストラ正規化してエキストラ正規化されたデータを発生するステップであって、モンテカルロアライメントを使用して相対信号移動度差を修正するステップと、ブラインドデコンボルーションにより強調された信号を減衰するステップと、の少なくとも１つを含むエキストラ正規化データ発生ステップと、前記エキストラ正規化されたデータ内のピークを検出してピーク検出データを発生するステップと、ファジー論理挿入検出アルゴリズムを使用して前記ピーク検出データ内の挿入を同定し除去するステップと、ファジー論理ギャップチェックアルゴリズムを使用して前記ピーク検出データ内のギャップを同定して充填するステップと、処理された配列データを発生するステップと、を含む配列決定方法。 3. 未処理核酸配列データ内のＤＮＡ配列を同定する方法を実行するようにプログラムされたデジタルコンピュータシステムであって、該デジタルコンピュータシステムは、中央処理装置と、ダイナミックメモリと、データ出力手段と、を含み、前記方法は、未処理核酸配列データを含む未処理入力データを受信するステップと、前記入力データを前処理して前処理されたデータを発生するステップと、前記前処理データのブラインドデコンボルーションによりブラインドデコンボルーションされたデータを発生するステップと、前記ブラインドデコンボルーションされたデータをエキストラ正規化してエキストラ正規化されたデータを発生するステップと、前記エキストラ正規化されたデータ内のピークを検出してピーク検出データを発生するステップと、ファジー論理挿入検出アルゴリズムを使用して前記ピーク検出データ内の挿入を同定して除去するステップと、ファジー論理ギャップチェックアルゴリズムを使用して前記ピーク検出データ内のギャップを同定して充填するステップと、処理された配列データを発生するステップと、ファジー論理編集手段を使用して前記処理されたデータの品質を編集して呼び出したヌクレオチド配列を発生して前記呼び出した配列に対する少なくとも１つの品質値を発生するステップと、を含むデジタルコンピュータシステム。