JP2001502066A - 被観察ボリュームの光学測定のための共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 光源と、ダイクロイックミラーと、機械的開口を含む対物レンズ配列（24）と、観察用光学品配列とを含む被観察ボリュームの光学検知のための共焦点顕微鏡。ダイクロイックミラーと対物レンズ配列（24）との間に、標準位置を中心として振動するように配列された対物レンズ側平面偏向ミラー（34）を有する偏向ミラー配列が配置されている。偏向ミラー（34）は、対物レンズ側ミラー（34）の振動によって、反射されたそれぞれの励起光の光軸が、対物レンズ配列（24）の機械的開口の領域にある、実質的に共通の交点で交わり、対物レンズ側偏向ミラー（34）の振動軸（40）が、対物レンズ側偏向ミラー（34）が標準位置にある場合に、対物レンズ側偏向ミラー（34）を含む平面（44）と、反射された励起光の光軸の共通の交点を通るとともに反射光の光軸に垂直である平面（46）とが交差する線分に一致する。

Description

【発明の詳細な説明】 被観察ボリュームの光学測定のための共焦点顕微鏡 本発明は、特に蛍光分光法において使用されるような、被観察ボリュームの光 学検知のための共焦点顕微鏡に関する。 被観察ボリュームで生じている一連の過程の光学測定に適用される共焦点顕微 鏡はPCT/EP94/00117号公報により周知である。周知の顕微鏡は、特に蛍光相関分 光法（FCS：fluorescence correlation spectroscopy）に使用される。周知の顕 微鏡は光源を含み、この光源は、特にレーザ光線を発生するレーザ光源である。 レーザ光線は、おそらく、レンズ配列によって調整された後で、機械的な開口を 有し、観察室に光の焦点を合わせる対物レンズ配列に向けて光線を反射するダイ クロイックミラーに照射される。観察室に入射したレーザ光は、その組成に応じ て、被観察ボリュームの中の、例えば生物試料の中に蛍光を励起する。結果とし て生じた蛍光は対物レンズ配列に到達し、そこからダイクロイックミラーを通過 して観察用光学配列に照射される。この観察用光学配列によって、被観察ボリュ ームの中の一連の過程を光学的に測定することができる。 周知の共焦点顕微鏡は、一般的に、実用には十分であった。しかし、研究すべ き試料によっては、試料の中の蛍光の発生を観察し、また試料の中で生じている 過程の定量評価を考慮するのに十分な量の（光学的）データを得るために、比較 的長い試験時間を必要とする。 本発明の目的は、蛍光分光法に使用されるべき、被観察ボリュームの光学検知 のための共焦点顕微鏡の提供にあり、この顕微鏡は、より短時間での試料の光学 検知を考慮している。 本発明によれば、 励起光を発生するための光源と、 光源から照射された励起光を反射するダイクロイックミラーと、 ダイクロイックミラーにより反射された励起光を受光し、被観察ボリュームに この光の焦点を合わせる、機械的開口を有する対物レンズ配列と、 被観察ボリュームから来てダイクロイックミラーを通過した光を受光する観察 用レンズ配列と を備えた共焦点顕微鏡により目的が達成される。 本発明によれば、この共焦点顕微鏡は、 ダイクロイックミラーと対物レンズ配列との間に、対物レンズ側に平面偏向ミ ラーを有する偏向ミラー配列が位置し、このミラーは標準位置を中心として振動 するように配置されているので、 対物レンズ側のミラーの振動によって、反射励起光のそれぞれの光軸が、対物 レンズ配列の機械的開口の領域における実質的に共通の交点で交差し、 対物レンズ側偏向ミラーが標準位置にある場合、対物レンズ側の偏向ミラーの 振動軸が、対物レンズ側偏向ミラーが含まれる平面の交差線に一致し、この平面 は反射励起光の光軸の共通の交点を通って広がり、反射光の光軸に垂直である ことを特徴とする。 本発明の共焦点顕微鏡は、少なくとも１つの偏向ミラー（対物レンズ側）を含 む偏向ミラー配列を備える。この対物レンズ側偏向ミラーは標準位置を中心とし て振動するように配列されている。この偏向ミラーを振動させると、励起光が対 物レンズ配列に照射する角度が変化する。ここで、本発明は、励起光を対物レン ズ配列の開口の中で移動させるので、励起光の光線は、いかなる入射角度の場合 でも開口の中心に存在する。言い換えれば、対物レンズ側の偏向ミ ラーの振動によって、反射された励起光のそれぞれの光軸は、機械的開口の領域 の中であって、特に励起光の伝播方向においては対物レンズ配列の後ろに位置す る、実質的に共通の交点で交差する。ここで、対物レンズ側偏向ミラーがそれを 中心として振動する軸は、対物レンズ側の平面偏向ミラーの存在する平面が交差 する線に一致する。この平面は、対物レンズ側偏向ミラーが標準位置にある場合 は、反射されたそれぞれの励起光の光軸の共通の交点を通り、反射された励起光 の光軸に垂直である。 本発明の顕微鏡を用いて、より大径の、広がった光線を、入射角が変化した時 にも励起光線の側面側の部分が削られることなく、対物レンズ配列に入射させる ことができる。本発明によれば、単に平面偏向ミラーを備えるだけで、即ち、精 巧な光学要素を必要とせずにこのことが達成される。偏向ミラー配列の偏向ミラ ーは振動駆動機構を有し、標準位置の両側に、好ましくは５°まで振動し、好ま しくは、３°まで、特に望ましくは２°ずつ振動する。適した振動駆動機構は、 技術上、広く周知である。 本発明の顕微鏡では、被観察ボリュームとダイクロイックミラーとの間の励起 用光学品は、ダイクロイックミラーの後ろに配列されている観察用光学品配列に より完全なものになる検知用光学品の部分も構成している。従って、本発明の顕 微鏡は、確実に共焦点システムである。 むしろ、本発明の共焦点顕微鏡の偏向ミラー配列は、既存の共焦点顕微鏡のバ ックアップ用光学品であるので、既存の共焦点顕微鏡の光学的な構成の邪魔にな らずに、これらに付け加えられ得る。一般に、既存の共焦点顕微鏡の励起光は、 偏向ミラー配列を介して対物レンズに直接、入射される広がった平行光である。 この目的のために、偏向ミラー配列は、固定された顕微鏡の（筒）の開口の中に 、 単にねじ込むだけでよい。既存の顕微鏡の対物レンズ配列は、偏向ミラー配列そ のものに直接的に搭載されている。 偏向ミラーの使用は、対物レンズ配列により反射された励起光を一次元の逆方 向に、即ち、試料を通して線状に、前後に動かすことを可能にする。被観察ボリ ューム（即ち、焦点を絞った励起光）を、試料を通して二次元的に動かすために 、本発明の好適な一実施例は、対物レンズ側偏向ミラーとダイクロイックミラー との間に配列された、１つの光源側偏向ミラーの追加使用に備える。光源側偏向 ミラーもまた、標準位置を中心として振動するので、光源側偏向ミラーが振動し た場合、反射されたそれぞれの励起光の光軸は、対物レンズ側偏向ミラーの平面 の領域にある、実質的に共通の交点でほぼ交差する。両方の偏向ミラーは互いに 直角の振動軸を中心として振動する。光源側偏向ミラーの振動軸は、光源側偏向 ミラーの平面と、光源側偏向ミラーが標準位置にある場合に、反射された励起光 の光軸の共通の交点を通るとともに、反射光の光軸に垂直である平面とが交わる 線分と一致する。互いに垂直な軸を中心として振動する２つの偏向ミラーを使用 することにより、焦点を絞られた光は、試料を通って面状に、即ち二次元的に移 動することができる。 本発明の共焦点顕微鏡の本質的な特徴は、２つの偏向ミラーの振動軸の独特な 配列により、いかなる入射角の励起光も、部分的に削られることなく、対物ライ ト配列の機械的開口に入射することが実現される。本発明によれば、平面偏向ミ ラー、即ち単純な構造のミラーだけが使用されている。これらの偏向ミラーは円 形であっても楕円形であってもよい。後者の場合、ふちは丸めてあっても、多角 形でもよい。それぞれのミラーが、長軸と、長軸に対して垂直な直交軸とを有す るような楕円形の偏向ミラーが使用される場合、２つの偏向ミラーは、両方の長 軸が互いに90°をなし、また45°で交わ るように、位置をずらして配列されることが好ましい。 以下、本発明の一実施例を、図とともに詳細に説明する。 図１は、試料を通して被観察ボリュームを動かすことによって検査対象の試料 を試験する偏向ミラー配列を有する共焦点顕微鏡の光源、被観察ボリューム、及 び検知器の間の光路の概略図、 図２は、被観察ボリュームを一次元的に動かす偏向ミラーの配列を説明するた めの、偏向ミラー配列の簡略図、 図３は、２つの偏向ミラー、及び対物レンズ配列の斜視図である。 図１は、共焦点顕微鏡10における光路の概略図である。共焦点顕微鏡10は、励 起光14を発するレーザ光源12を含む。励起光14は、励起光線を広げ、また平行に する調整用光学品16に入射する。調整用光学品16の後ろで、励起光線は、励起光 14の光軸に対して45°の角度に配されているダイクロイックミラー18に照射され る。ダイクロイックミラー18は、図２及び３に関連付けて後述される偏向ミラー 配列20に向けて励起光を反射する。励起光14は、偏向ミラー配列20から、対物レ ンズ配列24の機械的開口22を通り、これにより被観察ボリューム26の中に絞り込 まれる。被観察ボリューム26の中で、励起光14は検査対象の試料の中に蛍光を励 起する。この蛍光は、対物レンズ配列24及び偏向レンズ配列20の中を進んでダイ クロイックミラー18に達し、これを通過して観察用光学品配列28に入射する。観 察用光学品配列28はレンズ配列30と、検出器32とを含む。 偏向ミラー配列20の構成を、図２及び３を参考にして以下に説明する。偏向ミ ラー配列20は２つの偏向ミラー34，36を含み、偏向ミラー34は光路上の対物レン ズ24に面しており（対物レンズ側偏向ミラー）、一方偏向ミラー36はダイクロイ ックミラー18と対物レンズ側偏向ミラー34との間に配置されている（光源側偏向 ミラー）。図２は、図３の矢符IIの方向から見た側面図であって、光源側偏向ミ ラー36は簡略のため図示されていない。図２に示すように、励起光14は実質的に 45°で、励起光を対物レンズ配列24に向けて反射する対物レンズ側偏向ミラー34 に照射され、そこで開口22を通過する。対物レンズ側偏向ミラー34は平面ミラー であり、振動軸40を中心として前後に振動するアーム38の上に配置されている。 標準位置（入射した励起光14に対して45°の方向）を中心とした偏向ミラー34の 約±２°ずつの振動によって、励起光の偏向が変化し、反射されたそれぞれの励 起光の光軸が交点42で交わる。この交点42は対物レンズ配列24の開口22のすぐ後 ろに位置している。これを実現するために、振動軸40は、平面ミラー34により規 定される平面46の中に位置している。さらに、振動軸40は、偏向ミラー34が標準 位置にある場合に、励起光48に垂直な方向に広かる平面46の中にある。言い換え れば、振動軸40は平面44と46とが交わる線に一致する。 光源側ミラー36は、ミラー34と全く同様にして配置されている。このことは、 偏向ミラー36が振動軸52を中心として振動するアーム50の上に搭載されているこ とを意味している。この振動軸52は、平面偏向ミラー34により規定される平面54 と、偏向ミラー36が標準位置にある場合に、偏向ミラー36が振動した時に反射さ れる光の共通の交点を通るとともに、反射光60に垂直である平面56とが交差する 線分である。言い換えれば、振動軸52は、平面54と56とが交わる線分に一致する 。 偏向ミラー配列20の２つの偏向ミラー34及び36は、円形であっても、またふち のかどが残っているか、又はふちが丸められた楕円形であってもよい。２つの偏 向ミラー34及び36は、特に、線形倍振動（例えば正弦波形、長方形、三角形、鋸 歯形）により駆動される。このような駆動機構はそれ自体が周知である。２つの 偏向ミラー34及び36が振動するための周波数、振幅、及び位相関係は別々に調整 することができる。これらのパラメターが何らかの関係で変化すると、検査対象 の全領域（試料）を走査するリサージュの図形が生成される。これらの図形は、 まったく数学的正確さで資料を提供し、分析のために考慮に入れることができる 。 アーム38，50の相対的な寸法と、２つの振動軸40及び52の配列及び間隔とは、 図３に示された距離によって表されており、同じ長さの間隔及び距離には同一参 照符号が付されている。以下の関係が当てはまる。 Ｌ１Ａ＝Ｌ１Ｂ Ｌ１Ａ＝Ｌ３Ｂ Ｌ３Ｂ＝Ｌ１Ｂ＋Ｌ２

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年６月２３日（１９９８．６．２３） 【補正内容】 特許請求の範囲 １．励起光（14）を発生する光源（12）と、 光源（12）から照射された励起光（14）を反射するダイクロイックミラー（18 ）と、 ダイクロイックミラー（18）により反射された励起光（14）を受光し、該光を 被観察ボリューム（26）に焦点を絞り込む、機械的開口（22）を有する対物レン ズ配列（24）と、 被観察ボリューム（26）から、ダイクロイックミラー（18）を通過してきた光 を受光する観察用レンズ配列（28）とを備えた、被観察ボリュームの光学検知の ための共焦点顕微鏡において、 光源（12）とダイクロイックミラー（18）との間に、励起光（14）を平行光に して広げるための調整用光学品（16）が配列されており、 ダイクロイックミラー（18）と対物レンズ配列（24）との間に、標準位置を中 心として振動するように配列された対物レンズ側の平面偏向ミラー（34）を有す る偏向ミラー配列（20）が配置されており、これにより、 対物レンズ側ミラー（34）の振動によって、反射されたそれぞれの励起光の光 軸が、対物レンズ配列（24）の機械的開口（22）の領域に存在する実質的に共通 の交点（42）で交わり、 対物レンズ側偏向ミラー（34）の振動軸（40）が、対物レンズ側偏向ミラー（ 34）がその標準位置にある場合に、対物レンズ側偏向ミラー（34）が含まれる平 面（44）と、反射された励起光の光軸の共通の交点（42）を通るとともに、反射 光（48）の光軸に垂直である平面（46）とが交差する線分に一致する ことを特徴とする被観察ボリュームの光学検知のための共焦点顕微鏡。 ２．偏向ミラー配列（20）は、標準位置を中心として振動するよ うに配列された光源側の平面偏向ミラー（36）を含み、これにより、 光源側ミラー（36）の振動によって、反射されたそれぞれの励起光の光軸が、 対物レンズ側偏向ミラー（34）により規定される平面（44）の領域にある実質的 に共通の交点（58）で交差し、 光源側偏向ミラー（36）の振動軸（52）が、光源側偏向ミラー（36）がその標 準位置にある場合に、光源側偏向ミラー（36）により規定される平面（54）と、 反射された励起光の光軸の共通の交点（58）を通るとともに、反射光の光軸に垂 直である平面（56）とが交差する線分に一致する ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。 ３．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）は、それぞれ標準位置の両 側に、５°ずつまで、好ましくは３°ずつまで、最も好ましくは２°ずつ振動す ることができることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。 ４．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）は、それぞれ、長軸と長軸 に垂直な直交軸とを有し、丸いふち又は多角形のふちを有する楕円形に設計され ており、２つの楕円形の偏向ミラー（34，36）が、２つの楕円の長軸が互いに90 °ずれるとともに、45°で交差するように配列されていることを特徴とする請求 項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。 ５．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）が、それぞれ円形であるこ とを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。 ６．光源（14）がレーザ光源であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれ かに記載の共焦点顕微鏡。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．励起光（14）を発生する光源（12）と、 光源（12）から照射された励起光（14）を反射するダイクロイックミラー（18 ）と、 ダイクロイックミラー（18）により反射された励起光（14）を受光し、該光を 被観察ボリューム（26）に焦点を絞り込む、機械的開口（22）を有する対物レン ズ配列（24）と、 被観察ボリューム（26）から、ダイクロイックミラー（18）を通過してきた光 を受光する観察用レンズ配列（28）とを備えた、被観察ボリュームの光学測定の ための共焦点顕微鏡において、 ダイクロイックミラー（18）と対物レンズ配列（24）との間に、標準位置を中 心として振動するように配列された対物レンズ側の平面偏向ミラー（34）を有す る偏向ミラー配列（20）が配置されており、これにより、 対物レンズ側ミラー（34）の振動によって、反射されたそれぞれの励起光の光 軸が、対物レンズ配列（24）の機械的開口（22）の領域に存在する実質的に共通 の交点（42）で交わり、 対物レンズ側偏向ミラー（34）の振動軸（40）が、対物レンズ側偏向ミラー（ 34）がその標準位置にある場合に、対物レンズ側偏向ミラー（34）が含まれる平 面（44）と、反射された励起光の光軸の共通の交点（42）を通るとともに、反射 光（48）の光軸に垂直である平面（46）とが交差する線分に一致する ことを特徴とする被観察ボリュームの光学測定のための共焦点顕微鏡。 ２．偏向ミラー配列（20）は、標準位置を中心として振動するように配列され た光源側の平面偏向ミラー（36）を含み、これにより、 光源側ミラー（36）の振動によって、反射されたそれぞれの励起 光の光軸が、対物レンズ側偏向ミラー（34）により規定される平面（44）の領域 にある実質的に共通の交点（58）で交差し、 光源側偏向ミラー（36）の振動軸（52）が、光源側偏向ミラー（36）がその標 準位置にある場合に、光源側偏向ミラー（36）により規定される平面（54）と、 反射された励起光の光軸の共通の交点（58）を通るとともに、反射光の光軸に垂 直である平面（56）とが交差する線分に一致する ことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。 ３．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）は、それぞれ標準位置の両 側に、５°ずつまで、好ましくは３°ずつまで、最も好ましくは２°ずつ振動す ることができることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。 ４．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）は、それぞれ、長軸と長軸 に垂直な直交軸とを有し、丸いふち又は多角形のふちを有する楕円形に設計され ており、２つの楕円形の偏向ミラー（34，36）が、２つの楕円の長軸が互いに90 °ずれるとともに、45°で交差するように配列されていることを特徴とする請求 項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。 ５．偏向ミラー配列（20）の偏向ミラー（34，36）が、それぞれ円形であるこ とを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。 ６．光源（14）がレーザ光源であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれ かに記載の共焦点顕微鏡。