JP2001500479A

JP2001500479A - 細胞破壊のメディエーターとしての同種異系組織適合性複合体

Info

Publication number: JP2001500479A
Application number: JP10511007A
Authority: JP
Inventors: エヌ．アイゼン，ハーマン; エム．クランツ，デイビッド
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2001-01-16
Also published as: WO1998007441A1; EP0920328A1; CA2263871A1

Abstract

(57)【要約】インビボでT細胞媒介性破壊に対する被検体で選択された細胞を標的化するために、主要組織適合性複合体（MHC）結合ペプチドと複合体化され、そして標的化する分子に連結された融合形態の、未変性で切断された、MHCタンパク質の産生および使用の方法が開示されている。MHCタンパク質は、宿主に関して同種異系であるように選択され、そして標的化する分子は、標的細胞に選択的に結合するように選択される。標的化されるペプチド-MHC複合体を含む薬学的調製物もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】細胞破壊のメディエーターとしての同種異系組織適合性複合体発明の背景ドナーおよびレシピエントが遺伝的に同一でない場合、１個体から取り出された、および同じ種の別の個体へ移植された器官および細胞は、ほとんど例外なく破壊される。しばしば同種移植片と呼ばれる（ギリシャ語「allos」または「dlf ferent」から）移植片は、移植される細胞での組織適合性抗原の特定のセットに対する、レシピエントのTリンパ球の反応によって殺される。同じセットを示す同一の双子でない場合、これらの抗原は、２つの個体でない１種内で非常に多様である。同種異系反応または同種異系侵襲と呼ばれるこれらの抗原に対するT細胞応答は、既知の最も強力な細胞免疫反応であり、事実、レシピエント免疫系が抑制されない場合、移植された悪性ガン細胞でさえ生存できないほどに激烈である。一般的に、T細胞上の抗原特異的レセプターによって認識される抗原は、主要組織適合性複合体（MHC）として知られる遺伝子グループによってコードされるタンパク質とともに、短いペプチドによって形成される複合体である。通常の条件下で、個体のT細胞は、MHC成分が、その個体に対して内因性または同系（「自己」）である、ペプチド-MHC（pep-MHC）複合体に出会う。しかし、同種移植片では、MHC成分はドナーに対して内因性であるが、それらは、レシピエントに対して外因性または同種異系（「非自己」）である。従って、レシピエントの身体のT細胞は、同種異系MHC抗原を有する明白な「侵入」細胞に対して、激烈な攻撃を開始する。ヒトでは、MHC抗原は、とりわけそれらの構造特徴に基づいて広く２つのクラスに分類される。MHCクラスIタンパク質（MHC-I）は、MHC内に遺伝子によってコードされる約45kDα鎖が、MHC以外の遺伝子によってコードされる約12kD分子であるβ₂-ミクログロブリンと非共有的に会合される二量体分子である。各α遺伝子の多数の対立遺伝子変異体が存在するが、β₂-ミクログロブリン遺伝子に対しては１または２のみである。MHC-Iα鎖は、３つの球状ドメインおよび関連するこれらの２つ（α₁およびα₂）対立遺伝子変異体中の配列で異なり、そして抗原特異性を有する。第三ドメイン（α₃）は、ほとんど可変性はなく、細胞膜でのβ₂-ミクログロブリン結合およびMHC-Iタンパク質の固定に主に関与するようである。MHCクラスIIタンパク質（MHC-II）はまた、２つの非共有的に会合された鎖（αおよびβ）からなるが、これらの鎖の両方は、MHC内の遺伝子によってコードされ、両方は細胞膜に固定される。クラスII分子において、αおよびβの両鎖は、それらの遠位（Ｎ末端）端に２つの球状ドメインを有するが、それはより可変的であり、そして主に抗原特異性に関連するようである、より小さな（約 28kD）β鎖である。MCHクラスI分子とクラスII分子との間の明白な相違にも関わらず、これらのタンパク質の三次元構造の分析は、２つの球状ドメイン（クラス I分子でのα₁およびα₂；クラスII分子でのα₁およびβ₁）が、基礎を形成する βプリーツシートを有する２つのαらせん伸長間の裂け目を形成する、共通の構造モチーフを示す（例えば、Bjorkmanら、1987;Brownら、1988を参照のこと）。この裂け目は、小ペプチドを結合し得る：MHC-Iタンパク質に対しては8〜10アミノ酸長、そしてMHC-IIタンパク質に対しては10〜25アミノ酸長。部分的に分解または「プロセスされた」自己または非自己タンパク質から産生されたペプチドは、これらのタンパク質は細胞で産生されるように、MHC-IおよびMHC-II分子と会合するようになり、そして得られたpep-MHC複合体は、細胞表面で「提示され」、そこで、それら特定のT細胞レセプター（TCR）によって認識され得、T細胞媒介免疫応答を開始し得る。有効であるために、免疫系は、pep-MHC複合体に存在する外来（非自己）ペプチドに対して反応し得なければならないが、一方、またpep-MHC複合体に存在する自己ペプチドに寛容である。この寛容を産生するために、T細胞の発生中に、所定の個体の未成熟T細胞上のTCR分子の全ては、いわば、pep-synMHC複合体のプロセスされた自己ペプチドとの会合で、その個体自身の自己または同系MHC（「s ynMHC」）を認識する能力とともに刻印されると考えられる。この刻印に対する基礎は、T細胞の発生の研究から出現している（例えば、von Boehmer，1994によって総説される）。胸腺では、未成熟ダブルポジティブ（CD4+CD8+）胸腺細胞は刺激されて、胸腺細胞でのpep-synMHC複合体とそれらのTCRとの「弱い」相互作用を通して、シングルポジティブ（CD4+またはCD8+）T細胞へ成熟させ（ポジティブ選択）、一方、胸腺細胞でこれらの複合体と「強く」相互作用するダブルポジティブ細胞は、プログラム細胞死またはアポトーシスを受ける（ネガティブ選択）。この反応に関連するプロセシングされた自己ペプチドは、同定されていず、そして胸腺細胞での反応の動力学、親和性、および特異性は全て未知であるが、ポジティブ選択およびネガティブ選択に関連するMHCタンパク質は、必然的にs ynMHCである。興味深いことに、pep-synMHC複合体と比較的弱い相互作用で選択された、極めて同じの成熟T細胞は、同種のその他の個体に由来する異なる（非自己）MHCタンパク質（同種異系MHC、すなわち「alloMHC」）と、特異的かつ強力に反応し得る。これらの反応もはまた、synMHCによって制限される反応のようにpep-MHC複合体に対するTCR親和性は、一般的にpep-synMHC複合体に対するよりも強いことのいくつかの根拠がまた存在する（Sykulevら、1994）。なぜなら、synMHC成分に対するよりもalloMHC成分に対するより高いTCR親和性が存在するからである。免疫学者は、免疫応答はガン細胞破壊に関係されるかもしれない可能性に長らく興味を持っている。提案された種々のストラテジーは、以下を含む：(i)ワクチンとしての肺瘍ホモジネート；(ii)細胞障害性成分との複合体化をともなうかともなわない、腫瘍関連抗原（TAA）に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、および(iii)腫瘍細胞抗原に対する促進された免疫応答を刺激する、サイトカインを発現するように操作された腫瘍細胞。例えば、TAAに対する抗体は、化学療法剤ならびに植物トキシンおよび細菌トキシンと連結されている（例えば、Vitettaら、1987;Pastanら、1986を参照のこと）。抗TAA抗体はまた、T細胞レセプターに結合し、T細胞の細胞障害性を刺激するためのエフェクターとして役立つ他の抗体と結合されている（Liuら、1985）。代替アプローチにおいて、メラニン形成細胞刺激ホルモンのアナログが、それらのヒト黒色腫に対するそれらの特異性にもかかわらず、細胞障害性T細胞を標的化するために、抗CD3 抗体と結合されている（Liuら、1988）。 alloMHC抗原の使用もまた、標的化される細胞に対する免疫学的応答を刺激する方法として意図されている。pep-MHC複合体は通常細胞内で形成され、次いで、T細胞レセプターによって認識され得る形質膜へ輸送され、免疫学的応答を刺激するためにalloMHCタンパク質を使用する試みが、標的化される細胞内でalloM HC遺伝子の導入に焦点があてられている。したがって、この方法に従って、少なくとも１つのalloMHC鎖をコードする組み換えDNA構築物が、標的化された細胞内に導入される。例えば、クラスI alloMHC遺伝子は、対応するalloMHC鎖の産生をもたらし得、次いで、細胞内でβ₂-ミクログロブリンおよび自己または非自己ペプチドと複合体化されて、pep-alloMHC複合体を形成する。次に、この複合体は細胞表面へ輸送され、そこで、宿主T細胞レセプターによって外来物として認識され得、そして同種異系攻撃免疫応答を開始する。従って、Plautzら（1993）は、マウスにおける腫瘍内への直接注入によって外来MHC遺伝子を導入した。この著者は、DNA-リポソーム複合体を使用して、以前に移植可能なCT26マウスクローン結腸腺ガンまたはMCA 106線維芽腫を用いて注入されたマウス内へalloMHC遺伝子を送達した。alloMHC遺伝子は、細胞障害性T 細胞応答を誘導し、腫瘍増殖を弱め、そしてある場合には完全な腫瘍退行を引き起こすことが示された。ヒト臨床研究では、Nabelら（1993）は、メラノーマ患者５人に同様のアプローチを用いた。これらの試験では、HLA-B7 MHCクラスIタンパク質をコードする遺伝子は、直接注射によるかまたは肺カテーテル挿入法によって、HLA-B7ネガティブ患者へ導入された。再度、DNA-リポソーム複合体を、遺伝子導入を媒介するために使用した。alloMHCの発現は、PCRまたは免疫組織化学によって、５人の全患者において、注射部位の近くの１〜10%腫瘍細胞において示された。少なくとも１人の患者において、腫瘍小結節および転移病変の退行が認められた。別のアプローチにおいて、オーストラリア特許第AU-B-39005/89号は、特定細胞への細胞障害性T細胞活性を標的化するために、同種異系MHCクラスIα鎖のＮ末端またはＣ末端でのキャリア分子（例えば、抗体）の結合を開示した。この開示は、句「MHC抗原」を広範囲に使用するが、教示は結合されたMHCクラスIα鎖の使用のみに明確に指向される。インビボまたはインビトロのいずれかでのこの構築物の同種異系攻撃応答を開始する能力に関して、報告された結果はない。発明の要旨本発明は、MHCタンパク質が被検体に対して同種である、三重pep-MHC複合体の外因的投与によって、選択細胞の「偽同種移植片」へのインビボ標的化転換に関する。適切な標的化する分子をこのようなpep-alloMHC複合体と連結することによって、その複合体は、標的化される細胞へ選択的に結合するように作製され得、それらによって、同種異系反応の細胞障害性Tリンパ球（CTL）を含む、同種反応T細胞に対する標的化へ転換する。このプロセスは、本明細書では「同種転換（alloconversion）」と呼ばれる。本開示は、外因的に供給されるpep-alloMHC 複合体が選択細胞に対してうまく標的化され、標的細胞特異細胞障害性を誘引することを示した、最初の例を報告すると考えられる。従って、本発明の１つの目的は、選択された細胞に対する同種異系反応応答を標的化する工程における使用のための薬学的調製物であって、そしてMHC重鎖、M HC軽鎖、およびMHC結合ペプチドを含むpep-MHC複合体を含む、調製物を提供することであり；少なくともMHC鎖の１つが、標的細胞型の二倍体(diploid)MHC遺伝子型に関して同種異系であり、標的細胞型に選択的に結合し得る少なくとも１つの標的化する分子へ連結される。さらに、このような薬学的調製物は、第二のpe p-MHC複合体の少なくとも１つのMHC鎖が第一のpep-MHC複合体の両MHC鎖とは異なる、少なくとも１つのその他のpep-MHC複合体を含むことが好ましい。詳細には、これは少なくとも１つのMHCタンパク質が任意の被検体に関して同種異系であることを保証するので、MHC成分で異なる３つより多いpep-MHC複合体の混合物が使用されることが好ましい。さらに、希なMHC成分が、任意の所定の被検体に対して同種異系抗原性の可能性を増大するために使用されることが好ましい。同様に、このような薬学的調製物が、第二のpep-MHC複合体のMHC結合ペプチドが、第一のpep-MHC複合体のMHC結合ペプチドとは異なる、少なくとも１つの他のpep-MH C複合体を含有することが好ましい。詳細には、多数の異なる高親和性MHC結合ペプチドの混合物が、同種異系抗原応答に関与するかなりの数のT細胞クローンを増加するために使用されることが好ましい。別の一連の実施態様において、上記のように、pep-MHC複合体は、重鎖および軽鎖を共有的に連結する可撓性分子リンカー、重鎖および結合ペプチド、ならびに／または軽鎖および結合ペプチドを含み得る。このような共有結合されたpep- MHC複合体は、その分子リンカーがペプチドである場合、より大きな安定性を有し、単一のMHC結合ペプチドのみによって産生され得、そして組換え的に都合良く産生され得る。上記の実施態様の各々において、標的化されるpep-MHC複合体の標的化する分子は、抗体（単鎖抗体および抗体フラグメントを含む）、ホルモン、成長因子、または非ホルモン、非成長因子細胞レセプターリガンドであり得る。好ましい実施態様において、標的化する分子は葉酸である。さらに、好ましい実施態様において、標的化する分子は、pep-MHC複合体に共有結合され、そして１つの好ましい実施態様において、標的化する分子は、カルボジイミド連結を介してpep-MHC 複合体に共有結合される。本発明の標的化されるpep-MHC複合体による破壊のために標的化されるべき細胞は、任意の細胞型であり得る。しかし、標的化される細胞がガン細胞であり、そして好ましい実施態様において、標的細胞が卵巣ガン細胞であることが特に意図される。従って、本発明の別の目的は、患者内で標的細胞集団に対する細胞障害性T細胞応答を惹起するために、本発明の標的化されるpep-MHC複合体の薬学的調製物を患者に投与することによって、患者の治療方法を提供することである。好ましくは、このような投与は非経口的である。これらの方法において、被検体が、本発明の標的化されるpep-MHC複合体を投与する前に、pep-MHC複合体のalloMHCタンパク質に対して免疫されることもまた好ましい。特に、この免疫が、alloMHC タンパク質を発現する患者の全細胞へ投与によることが好ましい。さらに、この免疫が、標的化されるpep-MHC複合体調製物の投与前の約１日と約20日との間に実施されることが好ましい。上記の実施態様のすべてにおいて、pep-MHC複合体はMHCクラスIα鎖、β₂-ミクログロブリン鎖、およびMHCクラスI結合ペプチドを含有するMHCクラスI複合体、またはMHCクラスIIα鎖、MHCクラスIIβ鎖、およびMHCクラスII結合ペプチドを含むMHCクラスII複合体であり得る。さらに、上記の全ての実施態様において、p ep-MHC複合体は、膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを欠如する短縮型タンパク質であるMHCタンパク質成分を含み得るか、または所望の抗原決定基、ポリペプチドタグもしくはリンカーを有する融合タンパク質であり得る。最後に、上記の全ての実施態様において、MHC成分は、全ての既知のMHCタンパク質とは異なり、それゆえ「普遍的な」同種異系抗原として作用するように、部位特異変異誘発または他の技術によって調製された、人工的または合成のMHC成分であり得る。発明の詳細な説明定義。請求される本発明の主題をより明白かつ簡潔に記載し、そして指摘するために、以下の定義が、以下の記載および添付の請求の範囲で使用されている特定の用語に対して、提供される。本明細書中で使用されるように、用語「主要組織適合性複合体」および略語「 MHC」は、ずべての脊椎動物に認められる遺伝子複合体を意味し、これは同種移植片の迅速な拒絶に最初に応答し、そして正常免疫応答において、リンパ球と抗原提示細胞との間のシグナル化に働くタンパク質をコードする。ヒトMHC領域または、HLAとも呼ばれ、そして第６染色体に認められ、クラスI領域（クラスIα 鎖遺伝子HLA-A、HLA-B、およびHLA-Cを含む）、およびクラスII領域（クラスII αおよびβ鎖遺伝子DP、DQ、およびDRのサブ領域を含む）を含む。本明細書中で使用されるように、用語「MHCタンパク質」は、MHCクラスIタンパク質および／またはMHCクラスIIタンパク質を意味する。本明細書中で使用されるように、用語「MHCクラスIタンパク質」または「クラスIタンパク質」は、MHCクラスIα鎖およびβ₂-ミクログロブリン鎖の共有的または非共有的に連結された複合体を意味する。本明細書中で使用されるように、用語「MHCクラスIα鎖」は、天然に存在するポリペプチド、またはHLA-A、HLA-B、もしくはHLA-C遺伝子の遺伝子産物の１つの少なくともα₁およびα₂ドメインに対応する、人工的に変異されたα遺伝子にコードされるポリペプチドを意味する。α₃ドメインは、主要な同種異系抗原部位を含まず、α鎖のＣ末端膜貫通部分および細胞質部分は、本発明の膜結合に必要ではないので、同種異系抗原性を維持する間に除去され得る。しかし、好ましくは、α₃ドメインは、β₂-ミクログロブリンと相互作用することによる、MHCクラスIタンパク質の安定化を助けるので、含まれる。さらに、用語「MHCクラスI α鎖」は、α₂ドメインの通常グリコシル化を有するかまたは有さない変異体を含むことが意図される。その用語は、クラスIα遺伝子の全ての対立遺伝子変異体、および、例えば、天然に存在する変異体の部位特異変異誘による、合成的または組み換え的に産生され得る変異体を含む任意の等価物を含むことが特に意図される。MHCクラスIα鎖もまた、本明細書中では「MHCクラスI重鎖」と呼ばれる。本明細書中で使用されるように、用語「β₂-ミクログロブリン」は、天然に存在するポリペプチド、またはβ₂-ミクログロブリン遺伝子の遺伝子産物に対応する、人工的に変異されたβ₂-ミクログロブリン遺伝子によってコードされるものを意味する。その用語は、β₂-ミクログロブリンの全ての対立遺伝子変異体、および、例えば、天然に存在する変異体の部位特異変異誘による、合成的または組み換え的に産生され得るものを含む、任意の等価物を含むことが特に意図される。用語「MHCβ鎖」は、その鎖がクラスIまたはクラスIIであるかどうかを特定することなく使用される場合、その用語は、β₂-ミクログロブリンおよびMHCクラスIIβ鎖を含むことが意図される。β₂-ミクログロブリンまたはMHCクラスIβ鎖もまた、本明細書中では「MHCクラスI軽鎖」と呼ばれ得る。本明細書中で使用されるように、用語「MHCクラスIIタンパク質」または「クラスIIタンパク質」は、MHCクラスIIα鎖およびMHCクラスIIβ鎖の共有的または非共有的に結合された複合体を意味する。本明細書中で使用されるように、「MHCクラスIIα鎖」は、天然に存在するポリペプチド、またはMHCクラスIIα遺伝子の遺伝子産物（例えば、DP、DQ、またはDRα遺伝子）の１つの少なくともα₁ドメインに対応する、人工的に変異されたα遺伝子によってコードされるポリペプチドを意味する。α₂ドメインは主要な同種異系抗原部位を含まず、α鎖のＣ末端膜貫通部分および細胞質部分は、本発明では膜結合に必要ではないので、同種異系抗原性を維持する間に除去され得る。しかし、好ましくは、それらは、α₂ドメインがβ鎖のβ₂ドメインと相互作用することによってMHCクラスIIタンパク質を安定化することを補助するので、含まれる。さらに、用語「MHCクラスIIα鎖」は、α₁およびα₂ドメインの通常グリコシル化を有するか有さない変異体を含むことを特に意図される。その用語は、クラスIIα遺伝子の全ての対立遺伝子変異体、および、例えば、天然に存在する変異体の部位得意変異誘発による、合成的または組み換え的に産生され得る任意等価物を含むことを意図される。MHCクラスIIα鎖はまた、本明細書中では「MHCクラスII重鎖」とも呼ばれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「MHCクラスIIβ鎖」は、天然に存在するポリペプチド、またはMHCクラスIIβ遺伝子の遺伝子産物（例えば、DP、DQ、またはDRβ遺伝子）の１つの少なくともβ₁ドメインに対応する、人工的に変異させたβ遺伝子によってコードされるものを意味する。β₂ドメインは主要な同種異系抗原部位を含まず、β鎖のＣ末端膜貫通部分および細胞質部分が本発明の膜結合に必要ではないので排除されるが、一方、同種抗原性は維持される。しかし好ましくは、β₂ドメインは、それがα鎖のα₂ドメインと相互作用することによってMHCクラスIIタンパク質の安定化を補助するので、含まれる。さらに、用語「MHCクラスIIβ鎖」は、β₁ドメインの通常グリコシル化を伴う変異体および伴わない変異体を含むことが意図される。この用語は、クラスIIβ遺伝子の全ての対立遺伝子変異体、および、例えば、天然に存在する変異体の部位特異変異誘発によって合成的または組み換え的に産生され得る任意の等価物を含むことが特に意図される。MHCクラスIIβ鎖はまた、本明細書中で「MHCクラスII軽鎖」とも呼ばれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「MHC結合ペプチド」または「結合ペプチド」は、MHCクラスI結合ペプチドおよび／またはMHCクラスII結合ペプチドを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「MHCクラスＩ結合ペプチド」は、特定されたMHCクラスＩタンパク質によって形成される結合裂け目内に選択的に結合し得て、三成分pep-MHCクラスＩ抗原複合体を形成するポリペプチドを意味する。M HCクラスＩ結合ペプチドは、プロセスされた自己もしくは非自己ペプチドであり得るか、または合成ペプチドであり得る。クラスＩ MHC抗原について、ペプチドは、最長で16または最短で２であり得るが、代表的には８〜10アミノ酸の長さである（Udakaら、1993;Vturinaら、準備中）。本明細書中で使用される場合、用語「MHCクラスII結合ペプチド」は、特定されたMHCクラスIIタンパク質によって形成される結合裂け目内に選択的に結合し得て、二成分pep-MHCクラスII抗原複合体を形成するポリペプチドを意味する。M HCクラスII結合ペプチドは、プロセスされた自己もしくは非自己ペプチドであり得るか、または合成ペプチドであり得る。クラスII MHC抗原につて、ペプチドは、より長いものおよびより短いものが効果的であり得るが、代表的には10〜25アミノ酸の長さである。本明細書中で使用される場合、用語「pep-MHC複合体」は、(a)MHCクラスＩタンパク質およびMHCクラスＩタンパク質に結合するMHCクラスＩ結合ペプチド、または(b)MHCクラスIIタンパク質およびMHCクラスIIタンパク質に結合するMHCクラスII結合ペプチドに、共有的または非共有的に連結された三成分複合体を意味する。同様に、用語「pep-alloMHC複合体」は、MHC成分が参照遺伝子型（例えば、それが導入される被検体の遺伝子型）に対して同種異系であるpep-MHC複合体を意味する。pep-MHC複合体はまた、「MHC抗原」とも呼ばれ得る。本明細書中で使用される場合、用語「可撓性分子リンカー」または「分子リンカー」は、３つの炭素−炭素結合に等しいかまたはそれを超える長さを有し、そしてこの長さにそって少なくとも１つの自由に回転する結合を含む、化学的部分を意味する。好ましくは、可撓性分子リンカーは１つ以上のアミノ酸残基から構成されるが、必ずしもこれは必要ではない。アミノ酸で構成されるときは、可動性分子は、好ましくは少なくとも３つ、またはより好ましくは少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。本明細書中で使用される場合、用語「標的化する分子」は、細胞表面分子の細胞外ドメインの部分、または選択された細胞型の特徴であるかもしくはそれと正に相関する部分もしくは決定基に、選択的に結合し得る分子または化学的部分を意味する。細胞表面分子、部分、または標的化する分子が選択的に結合する他の決定基は本明細書中で「細胞表面標的」と呼ばれ、そして代表的には、必須の膜タンパク質の細胞外ドメインまたは糖タンパク質を含む。標的化する分子は、本発明のpep-MHC複合体に非共有的または好ましくは共有的に結合され得る。標的化する分子は、選択された細胞型または標的化される細胞型の細胞表面の標的に選択的に結合し得るので、標的化する分子は、標的化される細胞型へ、本発明の pep-MHC複合体を選択的に会合または「送達」し得る。標的化する分子は、抗体、ホルモン、成長因子、および他の細胞レセプターリガンド、ならびに選択的結合能力を保持しているそれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「選択的結合」は、抗体が抗原に、またはリガンドがレセプターに電気特異的および立体特異的様式で結合し得ることを意味する。MHC結合ペプチドに関して、選択的結合は、pep-MHC複合体を形成するための、MHCタンパク質の結合の裂け目に形成される結合ポケット内のペプチドの特異的側鎖の非共有結合を必然的に伴う（例えば、Brownら、1993;Sternら、199 4を参照のこと）。標的化する分子に関して、選択的結合は、それらの標的を有する細胞型を標的を有さない細胞型から実質的に区別するように、１つ以上の特異的な細胞表面標的への結合を伴う。標的化する分子は、その細胞表面標的について固有の並行会合定数（K_A）（好ましくは約10⁵M^-1より大きい）を有するべきであり、そしてより大きな値が好ましい。より好ましいK_A値は10⁶M^-1より大きく、そして最も好ましくは10⁸M^-1より大きい。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に純粋」は、MHCタンパク質、MHC 結合ペプチド、および本発明の三成分pep-MHC複合体に関して、これらのタンパク質またはポリペプチドが、実用的にそしてそれらの意図された用途に適切な範囲に他の物質を本質的に含まないことを意味する。特に、タンパク質およびポリペプチドは十分に純粋であり、そして例えば、抗体産生または薬学的調製物の産生に有用であるように、それらの宿主細胞の他の生物学的構成要素を十分に含まない。本発明のタンパク質またはポリペプチドの実質的に純粋な調製物は、他の全てのタンパク質または細胞成分を全く含まない必要性はなく、そして投与の目的のためには比較的希釈され得る。当業者は、このような実質的に純粋な調製物を、HPLC、アフィニティークロマトグラフィー、および電気泳動的分離を含むがこれらに限定されない周知方法の適用または連続的な適用によって産生し得る。外因的に投与されたpep-alloMHC複合体による同種異系転換本発明は、MHCタンパク質が被検体に対して同種異系であるそれらを三成分pep -MHC複合体へ外因的に投与することによる、「偽同種移植片」への選択された細胞のインビボでの標的化された転換に関する。適切に標的化する分子をこのようなpep-alloMHC複合体に結合することによって、この複合体は、標的化される細胞へ選択的に結合するようにされ得、それらを同種反応性Ｔ細胞（同種反応性細胞障害性Tリンパ球（CTL）を含む）を標的するように転換する。このプロセスは、「同種異系転換」と呼ばれる。本開示は、外因的に供給されたpep-alloMHC複合体が選択された細胞に対して十分に標的化され、そして標的細胞特異細胞障害性を誘発することが示された最初の例を報告すると考えられる。本発明の成功は、pep-alloMHC複合体が標的細胞内では産生されず、そしてpep -MHC複合体の通常様式では存在しない点で驚くべきである。むしろ、本発明のpe p-alloMHC複合体は、標的細胞に対して高親和性を有しそして選択的に結合する標的化する分子との結合によって、標的細胞の表面に指向される。従って、本発明のpep-alloMHC複合体は、MHCタンパク質の正常な膜貫通ドメインによっては細胞膜に埋め込められないが、むしろ、標的化する分子とその細胞表面標的との相互作用によって細胞に非共有的に結合される。驚くべきことに、pep-alloMHC複合体と細胞膜との間の、標的化する分子および細胞表面標的の両方の介在によって生じる非天然の幾何学にもかかわらず、本発明のpep-alloMHC複合体は、標的細胞特異的Ｔ細胞の細胞障害性を誘発する能力がある。本発明は、標的化される細胞を選択的に破壊する従来の方法を上回る（特に、ガン治療の従来の方法を上回る）いくつかの利点を提供する。(i)上記のように、同種抗原に対するＴ細胞応答は、公知の最も激しい細胞性免疫応答である。例えば、それらは、免疫学的に「ナイーブな」個体（すなわち、以前に同種抗原に遭遇していない個体）からの末梢血単核細胞（PBMC）を用いて、インビボで日常的に誘発され得るもののみである。インビトロでPBMCを用いて他の抗原に対する応答を誘引するために、抗原での免疫または感染によって免疫または「プライム」されただけのPBMCドナーを有することが必要である。(ii)同種抗原の標的化する分子への付着は、標的化される組織に対する破壊的免疫応答を局在させ得、従って、照射または化学療法のような技術に好ましい。(iii)MHC遺伝子の膨大な多形性は、多数の別個のおよび希なMHCタンパク質を入手可能にし、そして部位特異的変異誘発が、全ての患者に対して同種異系である、完全に新規のクラスＩおよびクラスII MHC分子「万能（universal）同種異系抗原」の生成を可能にする。従って、多数の異なる患者が、同じMHC調製物で処置され得、そして同じ患者が、異なるalloMHC抗原で連続して処置され得る。(iv)pep-alloMHC複合体が大量に生成され得、そして多数の異なる患者に外因的に投与され得るので、高額経費および低効率の良好なトランスフェクションまたは形質転換を伴う、個々の患者の細胞への遺伝子導入の必要性はない。(v)本発明のpep-alloMHC複合体は、局所的または全身的に投与され得、従って、離れた転移および小さくて検出不可能なサテライト腫瘍に対して有効であり得る。MHC タンパク質の選択本発明のpep-alloMHC複合体は、MHC重鎖、MHC軽鎖、および重鎖および軽鎖によって形成されるMHC結合ドメインに選択的に結合するMHC結合ペプチドの三成分複合体を含む。従って、本発明のクラスI pep-alloMHC複合体は、MHCクラスＩα （重）鎖、MHCクラスＩ軽鎖（すなわち、β₂-ミクログロビリン）、ならびに特定の重鎖および軽鎖によって形成されるMHCクラスＩ結合ドメインに選択的に結合するMHCクラスＩ結合ペプチドの複合体を含む。同様に、本発明のクラスIIpep -alloMHC複合体は、MHCクラスIIα（重）鎖、MHCクラスIIβ（軽）鎖、ならびに特定の重鎖および軽鎖によって形成されるMHCクラスII結合ドメインに選択的に結合するMHCクラスII結合ペプチドの複合体を含む。 MHCクラスＩおよびクラスII遺伝子は、ヒトゲノム中で最も多形性であるので、本発明で使用され得る特定のMHC成分について有用な多数の選択が存在する。H LA-A2のようないくつかのMHC対立遺伝子は、非常に一般的であり（約50％の白人に存在する）；HLA-Xのような他の対立遺伝子は、極めてまれである（＜１％の白人に存在する）。任意の所定の患者に有効的であるために、本発明のpep-MHC 複合体のMHC成分は、患者に関して同種異系であるべきである。すなわち、患者の二倍体遺伝子型によってコードされる対応のMHC鎖の両方とは異ならなくてはならない。MHCクラスＩ抗原に関して、軽鎖は、ヒト集団での実質的な変異体でありそして同種抗原性に関連しないようである、β₂-ミクログロブリン鎖である。従って、好ましい実施態様では、本発明のクラスI alloMHC抗原は、患者の二媒体遺伝子型によってコードされる両方のクラスＩ重鎖とは異なる、クラスＩ重（ α）鎖を含む。逆に、MHCクラスII抗原に関して、軽（β）鎖は、主要な同種抗原部位を含むと考えられ、従って、好ましい実施態様では、本発明のクラスII a lloMHC抗原は、患者の二倍体遺伝子型によってコードされる両方のクラスIIβ鎖とは異なる、クラスII軽（β）鎖を含む。適切なalloMHCタンパク質の選択は、当業者の裁量および知識内で十分である。いくつかの実施態様では、当該患者はMHC遺伝子型であり得、そしてその患者に対して同種異系である任意のMHC鎖が使用され得る。あるいは、患者は、特定のMHC対立遺伝子と不安定に連結されている他の遺伝子座に関して遺伝子型化され得るか、または「品種」もしくはalloMHCタンパク質の選択を補助する他の集団遺伝子基準によって特徴づけられ得る。本発明のpep-MHC複合体の商業目的および大量生産のためには、このような複合体が高い割合の患者で有用性を有するので、比較的まれなMHC対立遺伝子変異体が産生されることが好ましい。さらに、２つ以上のMHC対立遺伝子変異体を含む、pep-MHC複合体の混合物が、このような混合物がなお集団の高い割合で有用性を有するので、商業的な量で生産され得ることが意図される。実際、２つの希少な（例えば、＜2％）pep-MHC複合体の混合物は、実質的に全ての患者で有効的であるべきである。さらに、MHC鎖が希少な対立遺伝子変異体を示すかどうかに関わらず、３つ以上のMHC対立遺伝子変異体を含む３つ以上のpep-MHC複合体の混合物は、定義により、任意の二倍体遺伝子型に対して同種異系であるMHC鎖を含む少なくとも１つのpep-MHC複合体を含む。表１および２は、ヒトMHCクラスＩおよびクラスII遺伝子の多数の認識されたサブタイプの部分的な列挙を示す。表は、クラスＩおよびクラスII対立遺伝子変異体が、関連する集団中で５％未満の対立遺伝子頻度で見出され得ることを示す。このような対立遺伝子変異体の各々は、関連する集団の95％より多くを処置するために有効である。ハーディー−ワインベルグ（Hardy-Weinberg）方程式を仮定して、２つのこのような変異体の混合物は、本発明のpep-MHC複合体へ組み込まれる場合、関連集団の99.75％より多くの処置に有用である。無論のこと、所定の患者について、適切なpep-alloMHCが、患者の遺伝子型に基づいて選択され得る。そして、任意の所定の患者に対しては、上記のように３つの対立遺伝子pep- MHC複合体の任意の混合物が、少なくとも１つのpep-alloMHC複合体を含む。さらに、天然に存在しないpep-MHC複合体が、本発明で使用され得る。すなわち、天然のMHCクラスＩまたはクラスII鎖の変異体が、例えば、部位特異的変異誘発技術によって、合成的または組み換え的に産生され得る。このような変異体は、特に、MHCクラスＩα鎖のα1およびα2ドメイン同種異系抗原部位に対応する位置、またはMHCクラスIIβ鎖の対応するドメインの同種抗原部位で置換、挿入、または欠失したアミノ酸残基を含み得る。このような部位として、例えば、それらの対立遺伝子を区別するこれらのタンパク質の既知の多形部位が挙げられる（例えば、MarshおよびBodmer、1995を参照のこと）。他の部位での置換、挿入、または欠損もまた、無論のこと、新規の同種抗原を導き、そしてこれらがまた意図される。このような天然に存在しないMHC鎖をコードする組み換え遺伝子の産生は、部位特異的変異誘発のような標準的な方法を使用して当業者の能力内で十分であり、そして次いで、組み換えMHCタンパク質およびpep-MHC複合体は、以下および他に記載されているように産生され得る。このような合成のpep-allo MHC複合体の抗原性は、例えば、混合されたリンパ球反応においてPBMCによってインビトロで応答を誘発するそれらの能力を試験することによって容易に確認され得る。最後に、クラスＩ MHC抗原はCD8+ Ｔ細胞による抗原認識を制限し、従って、クラスII MHC抗原（これはCD4+ Ｔ細胞による抗原認識を制限する）よりも細胞障害性Ｔ細胞免疫応答においてより強く示され得ることが注意されるべきである。従って、クラスＩ pep-alloMHC複合体による同種異系転換が、CD8+ Ｔ細胞媒介細胞障害性を直接誘引するはずである。しかし、クラスII MHC同種異系抗原に対する同種応答は、それらが引き起こす炎症に起因して例外的に強烈であり、従って、クラスIIpep-alloMHC複合体による同種異系転換もまた予想される。もちろん、クラスＩ pep-alloMHC複合体とクラスII pep-alloMHC複合体との混合物が好まれ得る。MHC 結合ペプチドの選択最近の数年の間に、pep-MHC複合体の構造、および特に、MHC抗原へのペプチド結合についての多数の情報が明らかにされている。特定のMHCタンパク質に結合する多数のペプチドが、例えば以下を含む種々の手段によって同定された：単離されたpep-MHC複合体に結合されたペプチドの酸溶出（例えば、Buusら、1988;R 細胞溶解物からのMHC免疫沈降（Cerundoloら、1991）、またはトランスフェクトされた細胞もしくは形質転換細胞から精製された「空の（empty）」MHCタンパク質へのインビトロ結合（Matsumuraら、1992;Saitoら、1993;Boydら、1992:Ojciu sら、1993;Fahnestockら、1994）、その後の得られるペプチド混合物のアミノ酸配列分析。さらに、多数のアミノ酸配列「モチーフ」が解明され、これは、特定のMHCタンパク質へ選択的に結合し得るペプチドのサブセットを特徴づける。任意の所定のMHCタンパク質と会合されたサブセットは、代表的には、MHC結合部位の「ポケット」内に結合する２「アンカー」位置で、同じアミノ酸を共有する 5）を参照のこと）。これらの研究の結果として、本発明での特定のMHCタンパク質との使用に適切である多数のMHC抗原結合ペプチドは、当業者にすでに周知である。同様に、ペプチドモチーフを結合し、従って、特定のMHCタンパク質との使用に適度に適切である可能性を有することによって定義される多くのクラスのペプチドは、すでに当該分野で周知である。さらに、そして最も重要なのは、ペプチドの多数の異なる配列変異体が同種反応性Ｔ細胞応答を誘発する能力についておおくのことが最近明らかにされており、これは、変異体ペプチドが、MHCタンパク質に結合し、そしてそれを安定化する経過を提供する。従って、同系pep- MHC複合体に対する応答が結合するペプチド配列中に多数の配列変異をなお可能にするが、同種応答では交差反応がはるかに多い。これはおそらく、synMHC成分に対してよりもalloMHCに対してより大きな親和性を有する傾向があるＴ細胞レセプターの結果である。すなわち、TCRによって認識される三成分pep-MHC複合体において、同種異系応答ではペプチドは比較的少なく寄与し、そしてalloMHC成分が比較的多く寄与するようであり、一方、同系応答では、ペプチドが比較的多く寄与し、そしてsynMHC成分は比較的少なく寄与するようである。結果として、１つは、選択されたペプチドの配列によって大きくは制限されず、従って、任意の所定のMHCに対するアンカーを構成する少数（代表的には２）の残基によってのみ制限されるペプチドの比較的小さなライブラリーが、本発明の三成分pep-al loMHC複合体を形成するために使用され得る。結合ペプチドまたは結合モチーフがまだ特徴づけられていない、クラスＩまたはクラスII MHCタンパク質について、過度の実験を伴わずに適切な結合ペプチドの同定を可能にする標準的な方法が利用可能である。一般的な様式として、天然 MHC結合ペプチドが、上記で参照された技術の１つによって、または任意の実質的に等価な技術によって、任意の特定のMHCタンパク質について同定され得る。あるいは、多数の候補ペプチド（例えば、ランダムに生成されたペプチドの「ライブラリー」、または適切な配列モチーフに一致するペプチド）が、精製された MHC抗原の調製物を変性条件に供し、変性したMHC抗原を候補ペプチドサンプルと混合し、そして、その混合物を再生条件に供することによってスクリーニングされ得る（適切な条件については、例えば、Garbocziら、1992を参照のこと）。次いで、37℃で安定であるpep-MHC複合体がこの混合物から単離され得（例えば、F PLCまたはゲル濾過による）、そしてMHC抗原中のペプチド結合は、HPLCおよび標準的な配列分析によって同定され得る。この方法は、最も強力であるかまたは最も安定なpep-MHC複合体を形成するペプチドが、再生されたpep-MHC複合体中で不均衡に提示されるはずであるという特定の利点を有する。再度、所定のMHCタンパク質が、Ｔ細胞に結合して何千もの異なるペプチドを提示し得、そして種々のMHCタンパク質がペプチドの異なる（しかし重複する）セットに結合することは注目されるべきである。従って、本発明のalloMHCタンパク質は、好ましくは、選択的にそのタンパク質に結合するペプチドの混合物またはライブラリーと組み合わせて投与され得る。ライブラリーの相違は、所定の alloMHCを認識し得る同種反応性Ｔ細胞の大きな割合と関係するためのに十分に大きいはずであるが、それぞれの個々のペプチドが、有効であるためには低すぎる濃度で存在する程には大きくない。ここでは、より大きいおよびより小さいライブラリー（または単一ペプチドでさえ）も使用され得るが、alloMHCあたり約1 00ペプチドのライブラリーが最も有効であり得ることが意図される。標的化分子本発明のpep-alloMHC複合体は、標的細胞の表面に存在する少なくとも１つの分子、部分、または他の決定基の細胞外ドメインに選択的に結合することにより、選択または標的化された細胞に同種異系抗原を「指向させる」種々の標的化分子に共有結合的または非共有結合的に結合され得る。標的化分子の選択は、標的細胞の性質およびこれらの細胞上の潜在的な細胞表面の標的に、部分的に依存する。好ましくは、標的化分子は、標的細胞型に特徴的であるか、または正に相関する細胞表面の標的に選択的に結合するように選択される。従って、細胞表面の標的は標的細胞により選択的に発現され、標的細胞に選択的に結合するか、またはそうでなければ標的細胞に正に相関し、そして少なくとも統計学的に、投与の領域における他の細胞から、標的細胞を同定するか実質的に識別する分子、部分または他の決定基であり得る。好ましくは、本発明の標的化分子は、10⁵M^-1以上の細胞表面標的に対する固有の平衡定数K_Aを有するはずであり、より高い値がさらに好ましい。より好ましいK_A値は、10⁶M^-1より大きく、そして最も好ましくは、10⁸M^-1より大きい。重要なことに、標的化分子のオリゴマー化、または各pep- alloMHC複合体に結合した標的化分子の多重度は、標的化分子当りの有効な結合定数（または「アビディティー」）を増加させ得る。本発明で有用な標的化分子は、抗体、ホルモン、成長因子、および他の細胞レセプターリガンド、ならびに選択的結合能力を保持するこれらのフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の標的細胞に特徴的であるかもしくはそれらに結合する抗原を検出するか、またはこれらに選択的に結合する抗体（FabまたはF(ab')₂のような活性抗体フラグメント、およびscFab抗体のような単鎖抗体を含む）が、すでに開発されている。このような抗体、または抗体フラグメント、およびまだ開発されていない他のものは、本発明による標的化分子として使用し得る。抗体フラグメントは、その縮小された大きさのために組織内への浸透の妨げ、またはT細胞認識への立体障害の生成をしにくく、それゆえ、好ましい。適切な抗体、または抗体フラグメントの例には、ガングリオシドGD2（黒色腫細胞に特徴的）に特異的な抗体、上皮細胞成長因子レセプター（神経芽細胞腫に特徴的）、または任意の他の腫瘍に関連する抗原（TAA）が含まれる。ホルモン（またはそれらのアナログ）もまた、適切なホルモンレセプターを有する細胞に同種変換を引き起こすために本発明の標的化分子として使用され得る。例えば、メラニン形成細胞促進ペプチドホルモン（MSH）およびMSHレセプター（黒色腫に特徴的）、アンドロゲンおよびアンドロゲンレセプター（前立腺ガン細胞に特徴的）、黄体形成ホルモン（LH）およびLHレセプター（卵巣ガン細胞に特徴的）、ならびに卵胞刺激ホルモン（FSH）およびFSHレセプター（卵巣ガン細胞に特徴的）である。さらに、他の非ホルモン、非成長因子細胞レセプターリガンド（またはそのアナログ）も標的化分子として用いられ得る（例えば、葉酸、メトトレキセート）。例として、葉酸または葉酸(folate)は、細胞表面上の高親和性葉酸レセプターの１方または両方のイソ型（FR-αおよびFR-β）を発現する種々の細胞型に対する標的化分子として使用され得る。詳細には、葉酸の高親和性レセプターは、ヒト卵巣ガンの80％（Miottiら、1987；Weitmanら、1992）；子宮ガン（Rossら、1 994）；精巣絨毛ガン（Rossら、1994）；腎細胞ガン（Weitmanら、1992）；結腸ガン、乳ガン、リンパ腫（非ホジキンおよび非バーキットを含む）、線維性組織球腫、骨肉腫、およびウィルムス腫瘍（Rossら、1994）；ならびに上衣腫、髄膜腫、巨大細胞星状細胞腫、若年性毛様細胞性星状細胞腫、および高度のCNS肉腫（Weitmanら、1992；Rossら、1994；Coneyら、1991；Weitmanら、1994）を含む脳腫瘍のいくつかの型に存在する。そのような細胞には、葉酸（またはメトトレキサート、CB-3717、またはICI-198,583のような葉酸アナログ）は簡単な、魅力的な標的化成分である。好ましくは、本発明の標的化分子は、組織中への浸透を増加させ、TCR結合での立体障害の可能性を減少させ、そして標的細胞膜に近接させてpep-alloMHCを配置させるために、比較的小さな（例えば、１kD未満）分子であるが、必ずしもそうでなくてよい。しかし、ペプチドホルモン、成長因子、または抗体（140〜1 90kD）のようなより大きい分子（例えば、１〜500kD）もまた、本発明で用いられ得る。さらに、以下に記載のように、可撓性分子リンカーを用いてpep-alloMH C複合体に本発明の標的化分子を付着し得る。これは、pep-alloMHC複合体が、標的細胞表面に関して種々の配置をとり得ることを可能にし、それによって立体障害の可能性を減少させ、効果的なTCR接触および細胞障害性応答の誘発の可能性を増大させる。pep-MHC 複合体の産生本発明のpep-MHC複合体は、当該分野で公知の任意の種々の手段を用いて、所望のMHC成分を発現するヒト細胞、またはヒトハイブリッド細胞株から得られ得る。例えば、MHC分子の細胞外ドメインは、パパインを用いてインタクトな細胞の表面から剥ぎ取られ得、膜貫通および細胞質ドメインを後に残す。あるいは、界面活性剤を用いて溶解した細胞の膜画分から、MHCタンパク質を抽出され得る（例えば、Nicolleら、1994を参照のこと）。次いで、可溶性MHCタンパク質は、元の細胞由来の結合ペプチド付加物の多様なセットと共に単離され得る（例えば、免疫沈降法によって）。弱く結合したペプチドは、MHC結合ドメインから（例えば、精製MHCを37℃にて24時間インキュベートすることにより）解離され得、強固に結合したペプチド分子を有するMHCタンパク質分子のみを残す。あるいは、MHCタンパク質を変性させ、結合ペプチドを除去することにより（例えば、酸溶出により）、本質的に全ての結合ペプチドを除去し得る。次いで、選択した結合ペプチドでMHCタンパク質を再折り畳みし得る。好ましい実施態様において、組換えDNA技術を用いてMHC鎖（短縮MHC鎖またはM HC融合タンパク質を含む）をコードする核酸をいくつかの十分に樹立されたタンパク質発現系の任意のひとつの細胞に導入する。これらのアプローチにおいて、組換え配列は、好ましくはMHC鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを除去するように操作されるが、必ずしもそうされる必要なはい。組換え産生MHC分子を精製し、そしてMHC結合ペプチドを導入するために、種々の公知の手順を採用し得る。例えば、E ．coliにおいてクラスＩタンパク質を産生するには、一つの培養物中で重鎖を、そして別の培養物中で軽鎖（すなわち、β₂-ミクログロブリン）を発現させ得る。両タンパク質は、封入体として単離され、洗浄され、可溶化され（例えば、高濃度尿素中で）、適切なMHC結合ペプチドと混合され、そして再生条件に供されて（例えば、尿素を除去するための透析）、MHC鎖の折り畳みおよびpep-MHC複合体の形成を可能にする（例えば、Garbocz1ら、1992を参照のこと）。別の例として、MHCの重鎖および軽鎖の構築物（好ましくは、膜貫通および細胞質ドメインを欠く）は、Drosophila細胞においても同時発現し得る。これらの重鎖と軽鎖の構築物は、これらの昆虫細胞中に適切に折り畳まれ得、そして「空の」MHC分子として分泌され得る。なぜなら、Drosophila細胞には、脊椎動物細胞が小胞体中で新生のMHC分子にペプチドをプロセシングし、そして結合させるために用いる細胞性機構がないからである。次いで、これらの空のMHC分子を回収し、そして選択した１つ以上のペプチドと共に装填される（例えば、SternおよびWiley、1992；Kozonoら、1994；Wallnyら、1995；米国特許第5,314,813号を参照のこと）。組換え技術はまた、本発明で使用するための変異MHCタンパク質の産生を可能にする。上記のように、例えば、部位特異的変異誘発を用いて、全ての公知のMH C対立因子とは異なる、新たなMHCタンパク質を生成し得、それゆえ全ての患者において同種異系MHC成分として有用である。さらに、特定のアミノ酸残基を置換または添加して（例えば、Ｃ末端または短縮Ｃ末端に）、標的化部分の共有結合を促進し得る。従って、例えば特定の化学反応を受ける側鎖を有する残基（例えば、システイン）を添加して、標的化分子の付着点として使用し得る。本発明のpep-MHC複合体の安定性を増大するために、MHCタンパク質とペプチドが可撓性分子リンカーにより共有結合することが望ましいことであるり得る。そのようなリンカーには、短いペプチド鎖が含まれるが、これに限定されない。そして、任意の比較的小さい（例えば、5kD未満）有機化学部分で、末端間に少なくとも１つの単結合を含み、その辺りで自由に回転する点において可撓性であるものを含み得る。従って、例えば、５〜15アミノ酸の短いポリペプチド（好ましいくは、多数の小さな残基（例えば、アラニン、グリシン、またはセリン）を含む）を使用し得る。あるいは、低級アルキル鎖の二官能基分子（例えば、α,ω- ジカルボン酸またはα,ω-ジアミン）を使用し得、そしてそのような可撓性分子リンカーは、タンパク質／ペプチドのＮまたはＣ末端と、またはアミノ酸側鎖の反応基と反応し得る。他の多数の架橋剤がもちろん、当該分野で周知であり、実質的な等価物として使用し得る。最後に、組換え技術を用いて、MHCタンパク質の産生、またはpep-MHC複合体ですら、一本鎖ポリペプチドとして、産生が現在可能である。従って、例えば、組換えDNA構築物を一つの人工遺伝子として産生し得る。これは、タンデムに結合したMHCタンパク質の重鎖および軽鎖の両方をコードし、所望のMHC結合ペプチドに結合したMHCの重鎖をコードし、所望のMHC結合ペプチドに結合したMHCの軽鎖をコードし、またはMHC抗原の重鎖および軽鎖の両方ならびに所望のMHC結合ペプチドが全て一緒に結合したものをコードする単一の人工遺伝子として産生し得る。そのような組換えタンパク質は、構造ドメイン間の可撓性分子リンカーをコードする配列（すなわち、重鎖、軽鎖、および／またはペプチド）を含み得、pep- MHC複合体の適切な折り畳みを可能にし得る。この組換え構築物はまた、「配列タグ」（例えば、ポリHisテールまたは抗原決定基）を含み得、これはタンパク質精製を助ける（例えば、Kozonoら、1994；Mottezら、1995を参照のこと）。標的化pep-MHC複合体の産生多くの方法の任意の様式で、本発明のMHC抗原に本発明の標的化分子を結合し得る。ポリペプチドである標的化分子については、MHCタンパク質またはMHC結合ペプチドの末端の一結合する標的化分子をコードする組換え構築物を産生し得る。非ポリペプチドリンカーを用いる実施態様について、標的化分子をMHC鎖に共有結合するために、種々の周知の化学反応を用い得る。標的化分子がポリペプチドでない場合の実施態様について、種々の標準的な技術を用いて、標的化分子を本発明のpep-MHC複合体に共有結合させ得る。末端アミンおよびカルボキシル基の反応性を利用して、またはMHC鎖を含む残基のいくつかの側鎖（例えば、システイン、リジン）の反応性を利用して、標的化分子を MHC鎖のＮ末端またはＣ末端に結合させるためにこれらの技術を用い得る。当業者に明白なように、標的化分子またはMHC鎖のどちらかは、それらを共に反応させる前に反応基を導入またはブロックする１つ以上の化学反応による修飾がし得る。例えば、MSH抗CD3結合体の作製に際して、Liuら（1988）によって用いられた方法と同様の標準的な方法に従って、ジスルフィド結合を作成し得る。あるいは、葉酸抗TCR結合体の作製においてKranzら（1995）に用いられた方法と同様の標準的な方法により、カルボキシル基とアミン基との間にカルボジイミド結合を形成し得る。当業者は、本発明に従ってさらなる指示なしに、これらおよび他の方法を用い得る。一般的に、多数の標的化分子が各pep-MHC複合体に結合することが好ましい。これは特に、TCR認識に対して立体障害を作りにくい比較的小さな標的化分子に当てはまる。実際、結合は比較的非選択的（例えば、リジン残基の一級アミン基への葉酸の結合）であり得、そしてpep-MHC複合体当り平均５〜10標的化分子を生じる。より大きな標的化分子については、pep-MHC複合体に対するより低い標的化分子のモル比が望ましく、そしてさらに、標的化分子のより選択的な結合が所望され得る。従って、比較的大きな標的化分子については、MHC鎖のＣ末端またはその近辺の位置に１または２個の標的分子のみを選択的に結合することが望ましくあり得る。上記のように、これは、特定の反応残基（例えば、システイン、リジン）が（完全または短縮型の）重鎖または軽鎖のＣ末端またはその近辺に導入された組換えMHC鎖の使用により容易にされ得る。最後に、TCRの接触の立体障害を避けるために、標的化分子がpep-MHC複合体のペプチド部分に共有結合しないことが好ましいことにもまた注意すべきである（しかし、MHCクラスII結合ペプチドの、より長い、露出した末端への標的化分子のＮ末端またはＣ末端結合は、T細胞認識を妨げないかもしれない）。従って、いくつかの好ましい実施態様において、標的化分子はMHC結合ペプチド非存在下およびpep-MHC複合体形成の前にMHC鎖に共有結合している。あるいは、ペプチドおよびMHCタンパク質のアミノ酸配列が許容する場合には、MHCタンパク質鎖の側鎖上に存在するが、ペプチドの側鎖に存在しない反応基を利用する反応を選択し得る。処置方法宿主に同種異系であり、そしてpep-alloMHC複合体に共有結合する標的化分子によって標的細胞に選択的に結合するpep-MHC複合体を用いることによって、哺乳動物宿主における標的細胞の選択的な破壊を引き起こすために、本発明の方法を用い得る。宿主がヒト患者であり、そして標的化される細胞がガン性または他の腫瘍細胞であることが特に意図される。しかし、非ヒト哺乳動物の処置において、本明細書中で論議するヒトMHCタンパク質をヒトMHCタンパク質のその種の等価物に単に置き換えることにより、実質的な、または過度の改変をせずに、本発明を用い得ることが強調されるべきである。本発明の標的細胞は、ガン性または他の新生物細胞である必要はないか、むしろ理由はどうであれ、所望されない、そしてそれについて十分に選択的な分子標的が得られる任意の細胞であり得ることもまた強調されるべきである。従って、例えば本発明は、全体的な治療的利益がプラスと考えられる場合にはいつでも、またはある細胞全体型を根絶することが所望される場合（例えば、骨髄外移植／再移植技術の間）には、健康な細胞および悪性細胞に関し得る。タンパク質の非経口投与に適切な、薬剤的に受容し得るキャリア（例えば、生理食塩水溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲル溶液、乳酸化リンゲル溶液、デキストロース／生理食塩水、グルコース溶液、など）中の薬学的調製物として、本発明のpep-MHC複合体を処方し得る。薬学的調製物は、無菌および非発熱性であるべきであり、薬剤師または主治医により決定されるように、張度調節剤、湿潤剤、殺菌剤、防腐剤、安定剤などを含み得る。例えば、Remi ngton's Pharmaceutical Sciences ，Mack Publishing Company，Philadelphia， PA,第17版（1985）を参照のこと。あるいは、輸送および貯蔵の目的で、薬学的に受容可能なキャリア溶液を調製するための指示を用いて凍結乾燥した形でpep- MHC複合体を処方し得る。調製物は、所定の患者に対して同種異系らしいpep-MHC 調製物を選択するにおいて医師を補佐するために、pep-MHC複合体に含まれるMHC 鎖の対立形質に関して同定され得るか、または調製物が所定の集団について十分に寡少の対立形質を含む場合には、最も有効と予想される集団に関して同定され得る。医師は、患者のMHC遺伝子型決定を実施し、そしてその患者に対して同種異系のpep-MHC複合体を含む調製物を選択し得るか、または単に、寡少なMHC対立改変体を有する１以上のpep-MHC複合体を含む調製物を用い得る。特に、調製物が、天然に存在することが知られていない新規の抗原性を有する組換え産生されたMH C鎖を含む場合、または調製物が少なくとも３個の対立形質を含む場合、種の全てのメンバーに有用であることが予想され、そして患者の遺伝子型を決定せずに使用し得ることを示すラベルを付し得る。Pep-MHC複合体は、非常に多様な異なる標的化分子と結合し得、そしておのおのについて、それらが指向される組織および／または細胞に対して、パッケージされた調製物を同定し得る。好ましくは、本発明のpep-alloMHC複合体は、標的細胞が最も密であることが既知または予想される領域に注射、灌流、カテーテルにより投与される。従って、腹膜中に悪性細胞が広がることが一般的である卵巣ガンについては、腹腔内注射が好ましい。あるいは、固形腫瘍部位は、本発明のpep-alloMHC複合体で直接注射され得、そしてリンパガンの治療には、リンパ節を注入またはかん流し得る。しかし、本発明は、標的化分子がpep-alloMHC複合体の標的細胞への選択的な結合を可能にする点で、特に有用である。従って、本発明には、同種変換およびその結果起こる転移細胞、小さな検出されない衛星腫瘍、または組織全体に拡散的に広がるガン性細胞（例えば、脳組織）の破壊に特別な有用性を有する。そのような処置には、静脈内または心室内投与を含む、pep-alloMHC複合体のより全身性の投与が好ましくあり得る。同種変換した標的細胞に対する、最も効果的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起するために、患者をまずpep-alloMHC抗原で免疫し、alloMHCに対して患者の免疫系をプライム（prime）することが望ましい。好ましい処置では、任意のそのような免疫化を、標的pep-alloMHC処理の開始の約１〜20日前、より好ましくは約５〜15日前に実施するべきである。この免疫化を達成するために、患者中に標的化分子なしでpep-alloMHC複合体を導入し得る。好ましくは、pep-alloMHC抗原を発現する細胞全体を患者に導入して、alloMHC抗原に対して免疫する。好ましい実施態様では、導入細胞は、Ｂ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のような抗原提示細胞（APC）である。例えば、alloMHC抗原を発現するEBV形質転換Ｂ細胞を患者に導入し得る。細胞全体がAPCでなければ、それらをまた好ましくは、形質転換またはトランスフェクトして、抗原提示に関連する同時刺激因子であるB7 を発現させる。便宜上、その細胞表面上で抗原を発現する哺乳動物細胞から、本発明のMHC抗原が得られる場合、pep-alloMHC複合体を産生するのに使用される同一の細胞または細胞株もまた、患者を免疫し、そして細胞傷害性応答をプライムするために使用され得る。これは、これらの細胞がAPCである場合は特に好ましい。効果的であるために、alloMHC抗原またはpep-alloMHC複合体の免疫用量には、免疫原的に有効な量のalloMHC抗原が含まれるべきである。好ましくは、そのような免疫原的に有効な用量は、輸血に含まれているような適度の数のAPC（例えば、少なくとも10⁵で、より好ましくは約10⁷〜10⁹細胞）により提供される。本発明のpep-alloMHC複合体を、１用量で、または数用量で、１〜数週間の間隔をおいて投与し得る。生検またはCATスキャンのような標準的な技術による標的細胞（例えば、腫瘍）の応答のモニタリングに加えて、処置が細胞傷害性Ｔ細胞をインビボで活性化する能力を以下により評価し得る：（a）免疫化に使用したものと異なるAPCにより提示されるpep-alloMHCとの患者のＴ細胞反応性を測定すること、および／または（b）患者から末梢血単核細胞（PMBC）を採取し、そして患者に投与されたalloMHC抗原、好ましくはpep-alloMHC複合体を発現する細胞とのインキュベーションに対応してのそれらのインビトロでの細胞傷害性活性、または増殖を試験すること。処置の後に、患者が投与されたpep-alloMHCに対して体液性応答を発達させ得ることに留意すべきである。この応答は、pep-alloMHCがその標的細胞に到達および結合する前にリンパまたは血漿からいくらかのpep-alloMHCを除去することにより、処置の効果を減少させ得る。従って、体液性応答の発達後、または処置の数週間後は当然のこと、さらなる処置は、必要に応じて、同一のalloMHC抗原に関連する異なるペプチドもしくはペプチドの組のいずれかを用いること、またはより好ましくは、標的化pep-alloMHC複合体中の異なるalloMHC抗原を用いることが推奨される。以前の通り、この２回目の処置の前に患者を免疫して、予想された細胞傷害性応答を増強することが好ましい。必要に応じて、標的細胞の破壊の所望のレベルが達成されるまで、常に異なるpep-alloMHC複合体を用いてさらなる回の処置が実施され得る。実施例本発明の実施に用いられ得るいくつかの適用および方法を例示するため、および本発明の予想される有用性を実証するため、以下の非制限的実験実施例を提供する。当業者に明らかなように、以下の実施例で用いられる特定の技術、試薬および／または細胞は、他の実質的に等価な技術、試薬および／または細胞で自由に置き換えられ得る。細菌における組換えMHCタンパク質の発現およびインビトロでのpep-MHC複合体形成マウスK^bの重鎖（膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有さない）またはβ₂ -ミクログロブリン（「β₂m」）のいずれかをコードする発現ベクターで、E ．c oli 細菌を形質転換した。（封入体として産生される）組換えタンパク質を単離するため、以下の一般的なプロトコルを用いた： K^bまたはβ₂m細菌の１コロニーを選択し、そして200ml LB+0.1mlカルベニシリン（100mg/mlストック）で37℃にて一晩シェーカー中で増殖させた。200mlの培養物を約4.0LのLB＋カルベニシリンに移し換えた。この時点で、O.D.600nmは0.2 未満であった。次いで培養物をインキュベートし、はじめは毎時間、そしてO.D. 600nmが約0.7に達してからは15〜30分ごとに吸光度をチェックした。K^b培養物においてO.D.が約0.8、またはβ₂m培養物において1.2に達した時、IPTG（0.5Mストック）を１ml/Lで添加した。次いで、細菌培養物をさらに３〜3.5時間インキュベートしたが、O.D.は1.8と2.5との間にとどまっていた。２〜4000rpmにて30分間４℃にての遠心分離により細菌を採取し、そしてペレットの重量を測定した。細菌溶解緩衝液（1g/ml）、リゾチーム（100μｇ/ml）およびPMSF（50μｇ/ml）中にペレットを再懸濁した。次いで、サンプルを、Fre nch Pressに100〜1200psiにて３回通過させた。RNAse T1（130ユニット/ml）およびDNAse Ｉ（40μｇ/ml）を添加し、そしてサンプルを室温にて15分間インキュベートした。次いで、サンプルを、1200rpmで20分間、４℃にて遠心分離した。溶解緩衝液および0.5％Triton X100で、外観が灰色および砂色になるまでペレットを洗浄した。全容量約10.5ml中に8.0M尿素、50mM２-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（pH6.5）、0.1mM EDTA、および0.1mM DTTを含む変性緩衝液にペレットを再懸濁した。次いで、この懸濁液を1200rpmで20分間遠心分離した。単離し、そして精製したK^bおよびβ₂mタンパク質を、再折り畳み緩衝液中でSV 9ペプチド（以下を参照のこと）の存在下で10℃にて36時間で再折り畳みさせた。詳細には、約18.6mgのK^bタンパク質、14.4mgのβ₂mタンパク質、および6mgのS V9ペプチドを、100mM Tris HCl(pH8)、400mM L-アルギニンHCl、2mM EDTA、5mM 還元型グルタチオン、0.5mM酸化型グルタチオン、0.5mM PMSF（イソプロパノール中の100mMストック）、および全容量600mlまでのdH₂O中で再折り畳みさせた。次いで、サンプルを、Amicron濃縮器を用いて200μｌに濃縮した。外部から供給されたpep-MHC複合体により媒介される細胞の標的破壊細胞傷害性Tリンパ球（CTL）が、標的化分子および細胞表面の標的を介して外来性のpep-MHC複合体が結合する標的細胞を溶解し得るかどうかを決定するために、標的細胞のCTL媒介性特異的溶解のインビトロでのアッセイを用いた。 F2-MTX^rA（「F2-MTX」）と称されるマウス白血病細胞株を、標的細胞として選択した。F2-MTXは、低葉酸培地（Brigleら、1994）における増殖により、FRβ葉酸レセプターの増大した発現について選択されたL1210マウス白血病細胞株由来のメトトレキセート耐性サブ株である。従って、本実験では、葉酸レセプターを細胞表面の標的として用いた。 pep-MHC複合体については、組換えヒトHLA-A2クラスＩタンパク質を本質的にはGarbocziら（1992）に記載の通りにE ．coliにおいて産生した。組換えHLA-A2 を単離し、そしてヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の逆転写酵素由来のペプチドILKEPVHGV（「IV9」、配列番号１）の存在下で再折り畳みさせ、可溶性pep-MH C複合体「A2-IV9」を形成させた。複合体をHPLCにより単離したところ、複合体は、天然の正確に折り畳みされているA2-ペプチド複合体に特異的な抗A2抗体に非常に応答性が高かった。葉酸を、F2-MTX細胞の表面で発現されるFRβタンパク質に選択的に結合させるための標的化分子として用いた。従って、葉酸を、A2-IV9pep-MHC複合体に以下のように結合させた：約６mMの葉酸溶液をDMSO（約2.6mg/ml）中で調製し、そして約５倍モル過剰の塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC、約6.4mg/ml）で30分間、暗黒下で室温にて活性化させた。約６倍モル過剰の活性化葉酸（6.0×10^-3Mにて約5.0μｌ）をアミン非含有緩衝液（MOPS）中の組換えA2-IVPpep-MHC複合体（0.5×10^-5Mにて約100μｌ)と1.25時間、暗黒下で室温にて、および中性pHにおいて反応させた。葉酸標的化pep-MHC複合体（「葉酸-A2-IV9」）を遊離葉酸から分離するため、混合物をPBS中でSephadex G25カラムに通すか、または10kDaのカットオフを有するCentriconメンブレンを通す限外ろ過にかけるかのいずれかとした。本手順により、各pep-MHC複合体に対して約４〜５個の葉酸標的化分子の結合が得られたと評価される。最後に、A2-IV9pep-MHC複合体を認識する細胞傷害性Tリンパ球（CTL）クローン＃2175をエフェクター細胞として用いて、葉酸-A2-IV9標的化F2-MTX細胞の選択的殺傷を研究した。＃2175クローンは、ヒトHLA-A2トランスジーンを発現する H-2^bマウスに由来した。マウスは、フロイント不完全アジュバントとともに尾の基部に注入されたIV9ペプチドであらかじめ免疫されていた。標準的な細胞溶解アッセイを、96個のウェルプレート中で、⁵¹Crで標識したF2 -MTX細胞を標的細胞として用いて実施した。次いで、CTLの存在下または非存在下での⁵¹Crの放出、葉酸-A2-IV9標的化pep-MHC複合体、および／またはモル過剰（約10^-4〜10^-6M）の遊離葉酸を使用して以下のように定義される「特異的溶解パーセント」を評価した：特異的溶解％＝（a-b）/(t-b)、ここで、a=葉酸-A2-IV9標的化F2-MTX細胞および#2175 CTLを含むウェル中に放出された⁵¹Cr、b=CTLの非存在下で葉酸-A2-IV9標的化F2-MTXから自然に放出された⁵¹ Cr、およびt=界面活性剤（0.1％NP40）で溶解させたF2-MTX細胞から放出された全⁵¹Crである。全ての場合に、各ウェルに全容量0.2ml中に同数のMTX腫瘍細胞（約5000）を含んでいた。存在する場合には、10倍過剰のCTL（約50,000）が各ウェルに含まれていた。（５％CO₂の雰囲気中で）37℃にて４時間の後、各ウェルから培養上清を取り出し、そして0.05mlアリコートをγスペクトロメーターで計数して放出された⁵¹Crを測定した。コントロールは、代表的には三連または四連で実施し、そして実験を二連または三連で実施した。この同様の細胞溶解アッセイをまた、以下の実施例で使用した。以下の表に要約される結果から、MHCのH-2^d型マウス細胞であり、そしてヒトH LA-A2クラスＩ MHCを欠くF2-MTX標的細胞は、葉酸-A2-IV9が存在する場合にのみ A2-IV9ペプチド複合体を認識するCTLにより特異的に溶解されることが示される。約１×10^-5Mの濃度での遊離葉酸の存在は、葉酸に対する標的細胞の高親和性レセプターへの葉酸-A2-IV9の結合をブロックすることにより、細胞溶解を完全に阻害した。 ⁵¹Cr-F2-MTX＋CTL#2175＋特異的溶解％葉酸-A2-IV9、希釈せず 57 葉酸-A2-IV9、1:10希釈 27 葉酸-A2-IV9、1:100希釈 11 葉酸-A2-IV9、希釈せず＋遊離葉酸０葉酸-A2-IV9、1:10希釈＋遊離葉酸０葉酸-A2-IV9、1:100希釈＋遊離葉酸０本発明の標的pep-MHC複合体の別の試験として、H-2^dマウス由来のCTLを用いてマウス同種異系MHCクラスＩ成分K^bで標的化したF2-MTX細胞（H-2^dも）の破壊を媒介させた。これらの実験において、CTLエフェクターは、マウスK^b同種抗原を発現する生きた細胞（「T2-K^b」）で免疫したH-2^dマウス（「dm2」）に由来した。簡潔にいえば、K^b結合センダイウイルスノナペプチドSV9を装填したK^bを発現する生きた細胞（「T2-K^b-SV9細胞」）をdm2マウスに注入することにより、同種反応性CD8＋T細胞株を産生させた。これらの免疫T2-K^b細胞は、マウスK^b遺伝子でトランスフェクトしたヒトTAP-TXB細胞の株に由来した。免疫の１週間後、マウスから脾臓を取り出し、そして脾臓細胞を照射したT2-K^b-SV9細胞と共に培養し、そして次いでこれらの細胞および増殖因子（すなわち、IL-2を含むリンホカイン）に１週間ごとに曝露することにより維持した。得られた「抗K^b」Ｔ細胞を、以下の実験でエフェクタ−CTLとして用いた。これらの実験で、上記の通り、特異的溶解を測定するために、標的細胞の内在性⁵¹Cr標識を、ウェル当たり同数の標的細胞（約5,000）およびCTL（約50,000）とともに用いて標準的な細胞溶解アッセイを実施した。マウスK^bの重鎖（膜貫通ドメインおよび細胞質領ドメインを有さない）および β₂mを上記の通りに産生および単離し、そしてセンダイウイルス由来のペプチド FAPGNYPAL（「SV9」、配列番号２）の存在下で再折り畳みさせて可溶性pep-MHC 複合体「K^b-SV9」を形成させた。次いで、このpep-MHC複合体を、葉酸（K^b当たり約５個の葉酸基）と本質的に上記の通りに結合させ、標的化pep-MHC複合体を形成させ、これらを種々の濃度で用いてF2-MTX細胞を標的化した。コントロールとして、（高親和性葉酸レセプターを欠く）マウス赤白血病細胞（「MEL」）を標的細胞として試験した。以下に示す結果は、葉酸-K^b-SV9標的化pep-alloMHC複合体が用量依存性様式でCTL媒介性溶解について、効果的かつ特異的にF2-MTX細胞を標的化したが、MEL細胞を標的化しなかったことを実証する。葉酸-K^b-SV9濃度(M/L) 特異的溶解％ F2-MTX細胞 MEL細胞０ 10 １ 10^-14 ９０ 10^-13 11 ０ 10^-12 15 ２ 10^-11 26 １ 10^-10 39 １本実験の反復でより高い特異的溶解の割合を得たが、用量依存性は見られなかった。葉酸-K^b-SV9濃度(M/L) 特異的溶解％ F2-MTX細胞 MEL細胞０５ − 10^-13 32 ４ 10^-12 32 ２ 10^-11 35 ２ 10^-10 31 ２ 10^-9 30 ２次に、F2-MTX細胞の選択的溶解が葉酸（標的化分子）とこれらの細胞上の高親和性葉酸レセプター（細胞表面の標的）との間の結合に依存したことを実証するため、遊離葉酸が葉酸-K^b-SV9標的化溶解を阻害する能力を測定した。以下に示す結果は、溶解が非常に特異的であること、および遊離葉酸が用量依存性な様式で特異的溶解を阻害することを実証する。遊離葉酸（M/L）特異的溶解％０ 26 10^-11 24 10^-10 23 10^-9 23 10^-8 20 10^-7 15 10^-6 10 10^-5 ８ 10^-4 １Ｔ細胞はペプチド付加物によらずに同種異系MHCタンパク質を認識する pep-alloMHC複合体における特定ペプチドへのＴ細胞応答の特異性の試験として、T2-K^b-SV9細胞に対して惹起された抗K^bＴ細胞を、以下の３つペプチドのうちの１個を装填したT2-K^b細胞を溶解させる能力について試験した：（１）センダイウイルス由来のペプチドFAPGNYPAL（「SV9」、配列番号２）、（２）水泡性口内炎ウイルス由来のペプチドRGYVYQGL（「VSV」、配列番号３）、または（３）卵白アルブミン由来のペプチドSIINFEKL（「OVA」、配列番号４）。従って、抗K^bCTLを用いて、K^b結合ペプチドSV9、VSV、またはOVAの１種を添加してまたは添加せずに、T2-K^b細胞を標的細胞として用いた。以下に示す結果は、Ｔ細胞応答を引き起こすのは、これらの標的細胞により提示されるpep-alloMH C複合体のK^b成分であり、そしてpep-alloMHC複合体において提示される特異的ペプチドでないことを実証する。従って、抗K^bCTLがT2-K^b-SV9細胞に対して惹起されたという事実にもかかわらず、標的細胞の特異的溶解は、SV9ペプチドの添加により増加しない。さらなるコントロールとして、T2（しかしK^bでトランスフェクトされない）またはT2-L^d（K^bでなくL^dでトランスフェクトされたT2）のいずれかである⁵¹Cr標識標的細胞を試験した。T2標的細胞もT2-L^d標的細胞も実質的に溶解されなかった（約５％）。このことは、溶解がpep-alloMHC複合体のK^b 成分の存在に依存することを示す。 ⁵¹Cr-T2-K^b＋抗K^bCTL＋特異的溶解％ペプチド添加せず 71 SV9ペプチド５μｇ/ml 71 SV9ペプチド0.5μｇ/ml 72 VSVペプチド５μｇ/ml 73 VSVペプチド0.5μｇ/ml 75 OVAペプチド５μｇ/ml 73 OVAペプチド0.5μｇ/ml 71 外部から供給されたpep-alloMHC複合体により媒介される細胞のインビボでの標的化破壊本発明の方法のさらなる試験として、標的細胞が移植可能な腫瘍細胞であるような非ヒト動物モデルを用い得る。従って、例えば、F2-MTX^rA（「F2-MTX」）マウス白血病細胞（Brigleら、1994）をDBA/2マウス中に移植し得る。F2-MTX細胞株はDBA/2マウス（MHCサブタイプH-2^d）から生じたので、それゆえこの腫瘍細胞は拒絶されない。モデル値およびコントロール値を確立するため、動物に種々の数の腫瘍細胞を腹腔内注入し、各用量についての生存曲線を決定し、そして／または所望の実験期間（例えば、３〜６週間）内に確実に死なせるのに必要とされるおおまかな細胞数を決定する。腫瘍細胞の注入と死との間の時間の予想期間は十分長期であるので、腫瘍細胞を動物に注入し、次いでalloMHCタンパク質に対して動物を免疫し得る。上記の通り、本免疫化は、被験体の免疫系を本発明の標的化pep-alloMHC複合体について「プライムする」ことを意図する。この工程における免疫原は、好ましくは、 alIoMHCタンパク質を発現する無傷細胞（例えば、マウスRMA-S細胞（H-2^d）、K^b 遺伝子でトランスフェクトされたヒトT2細胞、K^b遺伝子およびβ₂m遺伝子の両方でトランスフェクトされたDrosophila細胞）からなり、そしていくつかの標準的な経路（例えば、腹腔内、皮下）のどれによっても投与され得る。上記の通り、同種異系応答におけるペプチドおよびMHC成分のTCR結合に対する相対的寄与のため、免疫するalloMHCタンパク質には標的化pep-MHC複合体で用いられるものと同一のペプチドを装填する必要はないが、これは所望され得る。免疫の１〜２週間後、被験体に本発明の標的化pep-alloMHC複合体を腹腔内注入する。例えば、被験体がDBA/2マウス（H-2^d）であり、そして標的細胞がF2-MTX腫瘍細胞株（H-2^d ）由来である場合、MHCクラスＩサブタイプK^bタンパク質は、同種異系である。従って上記の通り、可溶性K^bおよびβ₂mは組換えにより産生され得、適切なMHC 結合ペプチド（例えば、単一の免疫優性ペプチド、または好ましくは強力に結合するペプチドのライブラリー）の存在下で再折り畳みされ得、そして標的細胞に選択的に結合する標的化分子（例えば、F2-MTX細胞上のFRβ葉酸レセプターを結合する葉酸）に結合され得る。次いで、被験体は、同一の、または異なる標的化 pep-alloMHC複合体での追加免疫注入を受けるかまたは受けず、そしてこの処置の生存への影響が測定される。あるいは、腫瘍細胞の注入と死との間の時間の予想期間が短すぎる（例えば、３〜４週間）場合、腫瘍細胞の注入の１〜２週間前に所望のalloMHCタンパク質に対して被験体を免疫し得る。そのようなプロトコルは、免疫応答が同種抗原に対して惹起され得る前の被験体の早発の死を回避するが、他の点では結果の解釈に不都合な影響を及ぼさない。最後に、さらなるコントロールとして、腫瘍細胞の注入の前または後に、しかし本発明の標的化pep-alloMHC複合体でのそれに引き続く処置をせずに、alloMHC タンパク質に対して被験体を免疫し得る。そのような実験において、同種異系応答は腫瘍細胞に対して選択的に指向されないので、非標的化alloMHCでの免疫化は生存に影響がないはずである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アイゼン，ハーマンエヌ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02168，ウェイバン，ホームステッドストリート９ (72)発明者クランツ，デイビッドエム. アメリカ合衆国イリノイ 61821，チャンペイン，オドネルドライブ 22202

Claims

【特許請求の範囲】１．標的細胞型に対する同種異系反応応答を標的化する使用での薬学的調製物であって、以下、 MHC重鎖、MHC軽鎖、およびMHC結合ペプチドを含む第一のpep-MHC複合体であって；ここで、該MHC鎖の少なくとも１つが、該標的細胞型の二倍体MHC遺伝子型に関して同種異系である、複合体；および、該標的細胞型に選択的に結合し得る少なくとも１つの標的化する分子であって；ここで、該標的化する分子が、該pep-MHC複合体に結合されている、分子；を含む、薬学的調製物。２．請求項１に記載の薬学的調製物が、さらに、以下、 MHC重鎖、MHC軽鎖、およびMHC結合ペプチドを含む第二のpep-MHC複合体であって；ここで、該MHC鎖の少なくとも１つが、前記標的細胞型の二倍体MHC遺伝子型に関して同種異系である、複合体；および、該標的細胞型に選択的に結合し得る少なくとも１つの第二の標的化する分子であって；ここで、該第二の標的化する分子は、該第二のpep-MHC複合体に結合されており；そして、ここで該第二のpep-MHC複合体の少なくとも１つのMHC鎖が、該第一のpep-MHC複合体の両MHC鎖と異なる、分子；を含む、薬学的調製物。３．請求項１に記載の薬学的調製物であって、さらに以下、 MHC重鎖、MHC軽鎖、およびMHC結合ペプチドを含む第二のpep-MHC複合体であって；ここで、該MHC鎖の少なくとも１つが、前記標的細胞型の二倍体MHC遺伝子型に関して同種異系である、複合体；および、該標的細胞型に選択的に結合し得る少なくとも第二の標的化する分子であって、該第二の標的化する分子が、該第二のpep-MHC複合体に結合されており；そして、ここで、該第二のpep-MHC複合体の該MHC結合ペプチドが、該第一のpep-MHC 複合体の該MHC結合ペプチドと異なる、分子；を含む、薬学的調製物。４．請求項１に記載の薬学的調製物であって、前記pep-MHC複合体がさらに、(1) 前記重鎖および前記軽鎖、(2)前記重鎖および前記結合ペプチド、ならびに(3)前記軽鎖および前記結合ペプチドからなる群より選択されるペアーを、共有結合する可撓性分子リンカーを含む、薬学的調製物。５．前記重鎖が、MHCクラスIα鎖であり；前記軽鎖が、β₂-ミクログロブリン鎖であり；そして、前記結合ペプチドが、MHCクラスI結合ペプチドである、請求項１に記載の薬学的調製物。６．前記重鎖が、MHCクラスIIα鎖であり；前記軽鎖が、MHCクラスIIβ鎖であり；そして、前記結合ペプチドが、MHCクラスII結合ペプチドである、請求項１に記載の薬学的調製物。７．前記標的化する分子が、抗体、ホルモン、成長因子、および非ホルモン、非成長因子細胞レセプターリガンドからなる群より選択される、請求項１に記載の薬学的調製物。８．前記標的化する分子が、葉酸である、請求項７に記載の薬学的調製物。９．前記標的化する分子が、前記pep-MHC複合体に共有結合されている、請求項１に記載の薬学的調製物。１０．前記標的化する分子が、前記pep-MHC複合体にカルボジイミド結合を介して共有結合されている、請求項１に記載の薬学的調製物。１１．前記患者内の標的細胞集団に対する細胞障害性T細胞応答を標的化して患者を処置する方法であって、請求項１に記載の薬学的調製物を、該患者へ該集団内で細胞のT細胞媒介破壊を引き起こすに十分な量で投与する工程を包含する、方法。１２．前記投与が、非経口的である、請求項１１に記載の方法。１３．請求項１１に記載の方法が、さらに、前記調製物を投与する前に、前記pe p-MHC複合体のalloMHCタンパク質に対して前記患者を免疫する工程を包含し、ここで、該免疫が、該患者への、免疫学的有効量の該alloMHCタンパク質の投与する工程を包含する、方法。１４．前記免疫が、前記alloMHCタンパク質を発現する全細胞を前記患者へ投与する工程を包含する、請求項１３に記載の方法。１５．前記免疫が、前記調製物を投与する前に、約１日から約20日の間実施される、請求項１３に記載の方法。１６．前記標的細胞が、ガン細胞である、請求項１１に記載の方法。１７．前記標的細胞が、卵巣ガン細胞である、請求項１６に記載の方法。１８．前記標的化する分子が、葉酸、葉酸アナログ、卵胞刺激ホルモン（FSH）、卵胞刺激ホルモンアナログ、黄体形成ホルモン、および黄体形成ホルモンアナログからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。１９．前記標的細胞が、脳腫瘍細胞であり、そして、前記標的化する分子が、葉酸および葉酸アナログからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。